KR20150098850A - 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 은방울꽃 추출물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 은방울꽃 추출물은 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 세포사멸을 유도하는 효과가 우수하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{Composotion containing Convallaria keiskei extract for preventing or treating cancer}

본 발명은 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

암은 문명의 발달과 더불어 증가하고 있는 질병중의 하나로, 이를 치료하는 방법으로는 외과적 수술, 방사선 치료, 항암 물질 투여에 의한 화학 요법 등이 있다. 그러나, 이들 치료방법들은 대부분 초기 암환자나 특정암의 치료에만 국한되어 있어 암으로 인한 사망이 꾸준히 증가하고 있고, 특히 방사선 치료법이나 화학 요법은 많은 부작용을 유발하는 등의 문제점이 있다. 이에 부작용을 최소화하면서 제암율을 높일 수 있는 항암제의 개발이 요구되고 있고, 이러한 이유로 천연물, 특히 생약재로부터 항암제를 개발하려는 시도가 지속적으로 이루어지고 있다. 비록 항암제에 관한 연구가 발전해왔음은 분명하지만, 현재 사용되고 있는 항암물질의 경우, 여러 가지 원인에 의해 치료에 실패하거나 항암제 내성, 그리고 부작용과 같은 문제점을 안고 있다. 따라서, 합성된 화학물질보다는 부작용이 적을 것으로 예상되는 천연물을 이용하여 치료보다는 예방에 초점을 맞추는 것이 필요한 시점이다.

구강암은 입술, 혀, 뺨의 안쪽 표면, 경구개, 잇몸 등에서 발생할 수 있으며, 구강암의 대부분은 편평세포암종으로 구강 표면 세포의 성장이 적절하게 조절되지 않을 때 발생한다. 현재 암 치료에 있어 수술 치료 외에 방사선 치료나 항암제와의 복합 치료요법이 개발되어 좋은 효과를 보이고 있으나, 구강암의 경우 다른 암에 비하여 그 예후가 좋지 못한 실정이이다. 구강암이 다른 암에 비하여 예후가 좋지 못하고 높은 사망률을 보이는 이유는, 진단시 주변 조직으로 파급된 진행암인 경우가 많아 예후가 불량하고, 근치적 수술 이후라도 재발이나 이차 원발암(second primary cancer),이 이비인후과 영역의 다른 암(후두암, 상악동암)보다 상대적으로 많기 때문이다. 그러나 구강암의 이러한 특성상 구강암에 대한 근치적 수술, 방사선 치료, 항암제 치료 등의 복합요법 후에 암을 억제할 수 있는 화학적 암억제제 또는 암예방제(chemopreventine agents)의 투여가 구강암 환자의 생존율을 높이는데 중요한 역할을 하게 된다. 그러므로 구강암 치료에 있어 효과적이고 안정적인 암예방제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 은방울꽃은 전국 각처의 산에 분포하는 다년생 초본으로,옆으로 뻗어나가는 땅속줄기와 많은 잔뿌리를 가지고 있고, 2~3장의 넓은 타원 꼴의 잎이 뿌리로부터 자라나오며, 잎 곁에서 꽃줄기가 자라나 7~8 송이의 꽃이 일정한 간격으로 같은 방향을 향해 피어난다. 꽃의 생김새는 방울과 같고 빛깔이 희기 때문에 은방울꽃이라고 한다. 꽃의 지름은 5 mm 안팎이고 끝 부분이 여섯 갈래로 갈라져 있다.

은방울꽃은 영란, 초옥란, 초옥령이라고도 불리우며, 뿌리를 포함한 모든 부분을 약재로 쓴다. 또한, 은방울꽃은 콘발라마린(Convallamarin), 콘발라톡신(Convallatoxin), 콘발라린(Convallarin), 크산토필(Xanthophyll) 등의 알칼로이드를 함유하고 있으며, 독성식물의 하나이다. 강심, 이뇨 등의 효능이 있고 혈액의 순환을 돕는 효과가 있어, 심장쇠약, 부종, 소변이 잘 나오지 않는 증세, 타박상, 염좌 등의 치료에 쓰인다.

본 발명자들은 암을 예방 또는 치료하는 효과가 우수한 약물을 개발하기 위하여 천연물 및 이로부터 분리된 화합물에 관하여 연구하던 중, 은방울꽃 추출물이 항암효과가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 은방울꽃 추출물은 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 세포사멸을 유도하는 효과가 우수하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 은방울꽃 추출물의 처리 농도에 따른 MC3 세포의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 2는 은방울꽃 추출물의 처리 농도에 따른 HN22 세포의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 3은 은방울꽃 추출물을 처리한 MC3 세포에서 DNA 분절화현상(fragmentation)이 일어나 세포 핵이 손상된 정도를 나타낸 도이다.
도 4는 은방울꽃 추출물을 처리한 HN22 세포에서 DNA 분절화현상(fragmentation)이 일어나 세포 핵이 손상된 정도를 나타낸 도이다.
도 5는 은방울꽃 추출물을 처리한 MC3 세포에서 클리브드-카스파제-3(cleaved-caspase-3)의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 6은 은방울꽃 추출물을 처리한 MC3 세포에서 클리브드-피에이알피(cleaved-PARP)의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 7은 은방울꽃 추출물을 처리한 MC3 세포에서 Mcl-1 단백질의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 8은 은방울꽃 추출물을 처리한 MC3 세포에서 세포기질 내 시토크롬c의 농도를 나타낸 도이다.
도 9는 은방울꽃 추출물을 처리한 MC3 세포에서 eIF4E 및 4EBP1의 인산화 정도를 나타낸 도이다.

본 발명은 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

본 발명의 유효성분인 은방울꽃 추출물은 통상적인 방법으로 추출하여 얻을 수 있고, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 통상적인 추출방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 은방울꽃 추출물을 하기와 같은 방법으로 추출하여 얻을 수 있다.

먼저, 은방울꽃을 건조하여 잘게 자른 후, 추출 용매에 냉침, 페르콜레이션(percolation), 온침 등의 임의의 방법에 의해 침출 처리하여 유효 성분을 함유한 추출물을 얻는다. 상기 추출 용매는 이에 제한되지 않으나, 물, C₁~C₄ 의 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올이다. 상기 은방울꽃 추출물을 여과한 후, 용매를 증발시켜 농축하여, 최종 은방울꽃 추출물을 수득한다.

본 발명의 은방울꽃 추출물은 암세포의 세포사멸을 유도하고, 암세포의 세포증식을 억제하는 효과가 우수하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 구강암은 구강편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암, 타액선암, 턱뼈 또는 안면부의 근육 등에 발생하는 육종, 구강점막의 악성 흑색종 및 구강 내에 발생한 림프종 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 은방울꽃 추출물과 함께 암의 예방 또는 치료의 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 은방울꽃 추출물은 1일 1 mg/ kg 내지 1000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, "건강기능식품"이란, 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야 한다.

본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 은방울꽃 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 은방울꽃 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 은방울꽃 추출물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 은방울꽃 추출물의 제조

은방울꽃 메탄올 추출물(Methanol extract of Convallaria keiskei, MECK)을 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행에서 구입하여, 이후 실험에 이용하였다.

실험예 1. 본 발명의 은방울꽃 추출물의 암세포에 대한 세포독성 확인

본 발명의 은방울꽃 추출물의 암세포에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 이하 실험에서는, 상기 실시예 1.에서 수득한 은방울꽃 메탄올 추출물을 DMSO에 용해시켜 사용하였다.

1-1. 구강암 세포의 준비 및 배양

인간 구강암 세포주인 MC3 세포를 중국 Fourth military medical university로부터 제공받았으며, 또 다른 인간 구강암 세포주인 HN22 세포를 단국대학교로부터 제공받았다. 상기 세포를 10% FBS 및 100 U/MI의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지에 처리한 후, 5% CO₂, 37℃의 배양조건 하에서 배양하였다.

1-2. 은방울꽃 추출물이 구강암 세포의 세포 생존에 미치는 영향 확인

본 발명의 은방울꽃 추출물의 암세포 사멸효과를 확인하기 위하여, 상기 1-1.과 같이 배양하여 준비한 인간 구강암 세포주인 MC3 세포와 HN22 세포에 은방울꽃 추출물을 처리한 후, 헤모사이토미터(heamocytometer)를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

구체적으로는, 상기 인간 구강암 세포주인 MC3 세포와 HN22 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 50 내지 60 % 정도 세포가 증식되도록 배양하였다. 이와 같이 배양된 MC3 세포에 은방울꽃 추출물을 2, 4 및 8 ㎍/㎖ 로 각 처리하고, HN22 세포에도 은방울꽃 추출물을 5 및 10 ㎍/㎖ 로 각 처리하였으며, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리하였다. 각 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 0.04% 트리판 블루(trypan blue)를 첨가하였다. 헤마토사이토미터(heamocytometer)를 이용하여 살아있는 세포수를 측정함으로써, 본 발명의 은방울꽃 추출물의 암세포 사멸효과를 확인하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 인간 구강암 세포는 은방울꽃 추출물의 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소한 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 은방울꽃 추출물은 구강암 세포의 세포사멸을 유도함으로써, 우수한 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 2. 본 발명의 은방울꽃 추출물에 의한 아폽토시스(apoptosis) 유도 효과 확인

2-1. 은방울꽃 추출물에 의한 DNA 분절화현상(fragmentation) 확인

본 발명의 은방울꽃 추출물의 구강암 세포에 대한 아폽토시스(apoptosis) 유도 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 구강암 세포에서 DNA의 분절화현상(fragmentation)이 나타났는지 여부를 관찰하였다.

구체적으로는, 상기 1-2.와 같이 은방울꽃 추출물을 처리한 세포를 수거하여, 4,000 rpm, 4℃ 에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고, PBS로 2회 세척 후, 100% 메탄올로 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 4,000 rpm, 4℃ 에서 5분간 원심 분리하여 고정 용액을 제거하고, 200 ㎕의 PBS에 세포를 다시 현탁시킨 후, 상기 세포 현탁액 50 ㎕를 슬라이드 글라스 위에 떨어뜨리고, 2 mg/ml 농도의 DAPI(4'-6-diamidino-2-phenylindole) 용액 60 ㎕를 첨가하여 상온에서 염색하였다. 형광 현미경(fluorescence microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 세포의 핵의 DNA의 형태를 관찰하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 구강암 세포는 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 은방울꽃 추출물의 농도에 의존적으로 핵의 DNA가 분절화된 세포의 수가 증가하였음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 은방울꽃 추출물은 세포의 DNA를 손상시킴으로써, 구강암세포에서 아폽토시스를 유도하여 우수한 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.

2-2. 은방울꽃 추출물의 클리브드-카스파제-3(cleaved-caspase-3)와 클리브드-피에이알피(cleaved-PARP) 발현 억제 효과 확인

본 발명의 은방울꽃 추출물이 암세포의 아폽토시스(apoptosis) 유도에 미치는 작용 기전을 확인하기 위하여, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 암세포에서 아폽토시스 유도시 발현되는 중요한 전사인자인 클리브드-카스파제-3(cleaved-caspase-3) 및 클리브드-피에이알피(cleaved-PARP)의 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 상기 1-1.에서 준비한 인간 구강암 세포주인 MC3 세포와 HN22 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 50 내지 60 % 정도 세포가 증식되도록 배양하였다. 이와 같이 배양된 MC3 세포에 은방울꽃 추출물을 2, 4 및 8 ㎍/㎖ 로 각 처리하고, HN22 세포에도 은방울꽃 추출물을 5 및 10 ㎍/㎖ 로 각 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하고 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 4℃에서 20분 동안 반응 후, 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상층액을 취하였다. 브래드포드 어쎄이(Bradford assay)로 단백질을 정량하여, 약 30㎍의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 전기영동을 실시하였다. 전기영동에 의하여 크기별로 분리한 단백질을 니트로셀룰로즈막(nitrocellulose membrane)에 옮긴 후, 5% 탈지유가 포함된 TBST를 사용하여 실온에서 1시간 30분 동안 고정하였다. 이를 일차항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다시 TBST로 세척한 후, HRP(horse radishperoxidase)가 부착된 이차항체로 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응이 모두 끝난 후, TBST로 세척한 후, 웨스턴 블롯팅 루미놀 시약을 단백질을 옮겨놓은 상기 막에 도포하고, LAS-500을 사용하여 감광하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 구강암 세포는 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 은방울꽃 추출물의 농도에 의존적으로 클리브드-카스파제-3(cleaved-caspase-3)의 발현 정도가 증가하였음을 확인하였다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 구강암 세포는 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 은방울꽃 추출물의 농도에 의존적으로 클리브드-피에이알피(cleaved-PARP)의 발현 정도가 증가하였음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 은방울꽃 추출물은 구강암 세포에서 아폽토시스를 유도하여 우수한 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.

2-3. 은방울꽃 추출물의 Mcl-1 단백질 발현 억제 효과 확인

본 발명의 은방울꽃 추출물이 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 억제하는 인자에 대한 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 암세포에서 Mcl-1 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 상기 1-1.에서 준비한 인간 구강암 세포주인 MC3 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 50 내지 60 % 정도 세포가 증식되도록 배양하였다. 이와 같이 배양된 MC3 세포에 은방울꽃 추출물을 2, 4 및 8 ㎍/㎖ 로 각 처리하고, 24시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하여 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 4℃에서 20분 동안 반응 후, 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상층액을 취하였다. 브래드포드 어쎄이(Bradford assay)로 단백질을 정량하여, 약 30㎍의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 전기영동을 실시하였다. 전기영동에 의하여 크기별로 분리한 단백질을 니트로셀룰로즈막(nitrocellulose membrane)에 옮긴 후, 5% 탈지유가 포함된 TBST를 사용하여 실온에서 1시간 30분 동안 고정하였다. 일차항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다시 TBST로 세척한 후, HRP(horse radishperoxidase)가 부착된 이차항체로 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응이 모두 끝난 후, TBST로 세척한 후, 웨스턴 블롯팅 루미놀 시약을 단백질을 옮겨놓은 상기 막에 도포하고, LAS-500을 사용하여 감광하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 구강암 세포는 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 은방울꽃 추출물의 농도에 의존적으로 Mcl-1 단백질의 발현 정도가 감소하였음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 은방울꽃 추출물은 구강암세포에서 아폽토시스의 진행을 지연시키는 Mcl-1 유전자를 억제함으로써, 구강암세포의 아폽토시스를 촉진하여 우수한 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.

2-4. 은방울꽃 추출물의 세포기질 내 시토크롬c(Cytochrome c) 농도에 대한 영향 확인

시토크롬c는 아폽토시스의 조절인자로서, 아폽토시스 유도 자극에 반응하여 미토콘드리아 내막에서 세포 기질 내로 방출된 후, 카스파제 9를 활성화시키고 연쇄적으로 카스파제 3 및 7을 활성화하여 아폽토시스가 일어나도록 한다. 본 발명의 은방울꽃 추출물의 아폽토시스 유도 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 암세포에서의 세포기질 내 시토크롬c의 농도를 측정하였다.

구체적으로, 상기 1-1.에서 준비한 인간 구강암 세포인 MC3 세포를 60mm 플레이트에 분주하여 배양한 후, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 0, 2, 4 및 8 ㎍/㎖ 로 각 처리한 후, 세포를 회수하여 원형질막 추출 완충액(plasma membrane extraction buffer)에 현탁시켰다. 여기에 0.05% 디기토닌(digitonin)을 첨가하여 실온에서 1분간 반응시킨 후, 13,000 rpm, 4℃ 에서 5분간 원심분리하여 상층액(세포기질 분획)을 취하였다. 브래드포드 어쎄이(Bradford assay)로 단백질을 정량하여, 약 30㎍의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 전기영동을 실시하였다. 전기영동에 의하여 크기별로 분리한 단백질을 니트로셀룰로즈막(nitrocellulose membrane)에 옮긴 후, 5% 탈지유가 포함된 TBST를 사용하여 실온에서 1시간 30분 동안 고정하였다. 이를 일차항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다시 TBST로 세척한 후, HRP(horse radishperoxidase)가 부착된 이차항체로 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응이 모두 끝난 후, TBST로 세척한 후, 웨스턴 블롯팅 루미놀 시약을 단백질을 옮겨놓은 상기 막에 도포하고, LAS-500을 사용하여 감광하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 구강암 세포는 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 은방울꽃 추출물의 농도에 의존적으로 세포기질 내 시토크롬c의 농도가 증가하였음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 은방울꽃 추출물은 구강암 세포에서 아폽토시스를 유도하여 우수한 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 3. 본 발명의 은방울꽃 추출물의 종양 억제 효과 확인

본 발명의 은방울꽃 추출물의 종양 억제 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 암세포에서 eIF4E 및 4EBP1의 인산화 정도를 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 상기 1-1.에서 준비한 인간 구강암 세포주인 MC3 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 50 내지 60 % 정도 세포가 증식되도록 배양하였다. 이와 같이 배양된 MC3 세포에 은방울꽃 추출물을 2, 4 및 8 ㎍/㎖ 로 각 처리하고, 24시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하여 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 4℃에서 20분 동안 반응 후, 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상층액을 취하였다. 브래드포드 어쎄이(Bradford assay)로 단백질을 정량하여, 약 30㎍의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 전기영동을 실시하였다. 전기영동에 의하여 크기별로 분리한 단백질을 니트로셀룰로즈막(nitrocellulose membrane)에 옮긴 후, 5% 탈지유가 포함된 TBST를 사용하여 실온에서 1시간 30분 동안 고정하였다. 이를 일차항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다시 TBST로 세척한 후, HRP(horse radishperoxidase)가 부착된 이차항체로 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응이 모두 끝난 후, TBST로 세척한 후, 웨스턴 블롯팅 루미놀 시약을 단백질을 옮겨놓은 상기 막에 도포하고, LAS-500을 사용하여 감광하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리한 세포는 본 발명의 은방울꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 농도의존적으로 eIF4E 및 4EBP1의 인산화 정도가 감소되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 은방울꽃 추출물은 구강암 세포에서 종양 억제 효과를 나타내므로, 암의 치료에 효과적임을 알 수 있다.

이하 본 발명의 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

은방울꽃 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

2. 정제의 제조

은방울꽃 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

3. 캡슐제의 제조

은방울꽃 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

4. 주사제의 제조

은방울꽃 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4·2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

5. 액제의 제조

은방울꽃 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 제제의 제조

1. 건강식품의 제조

은방울꽃 추출물 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 g

비타민 C 10 mg

비오틴 10 g

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 g

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강음료의 제조

은방울꽃 추출물 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 은방울꽃 추출물은 은방울꽃을 물, C₁-C₄의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 얻은 것임을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 은방울꽃 추출물은 은방울꽃 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 구강암은 구강편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암, 타액선암, 턱뼈에 발생하는 육종, 안면부의 근육에 발생하는 육종, 구강점막의 악성 흑색종 및 구강 내에 발생하는 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 은방울꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
   

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