KR20150081433A

KR20150081433A - 이베르멕틴 및 이의 유도체의 용도

Info

Publication number: KR20150081433A
Application number: KR1020157012948A
Authority: KR
Inventors: 융 리; 리화 진; 쉬후이 펑
Original assignee: 로이반트 헤파톨로지 리미티드
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-07-14
Also published as: RU2015118579A; AU2013330877A1; EP2918274A1; CA2889047A1; CN103356687B; US10052340B2; BR112015008908A2; JP2015534954A; CN103356687A; MX2015004884A; CN105473148A; CN102872066B; US20150306123A1; WO2014059797A1; CN102872066A

Abstract

본 발명은, 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴, 도라멕틴 등과 같은 항기생충제의 신규한 용도, 및 상기 신규한 용도를 위한 상기 유도체들의 디자인 방법에 관한 것이다. 마크롤라이드 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴, 도라멕틴 및 이의 유도체들을 포함하는 상기 화합물들은, 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간 질환, 죽상동맥경화증, 염증, 암 등과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 치료하는 데 사용하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.

Description

이베르멕틴 및 이의 유도체의 용도 {USE OF IVERMECTIN AND DERIVATIVES THEREOF}

본 발명은, 항기생충제와 관련된, 파르네소이드 X 수용체(FXR: Farnesoid X receptor)의 신규한 효과적인 리간드들, 예를 들면 이베르멕틴, 도라멕틴, 및 아바멕틴/아베르멕틴 및 이의 유도체들의 신규한 용도, 및 상기 신규한 용도를 위해 상기 유도체들을 디자인하고 최적화시키는 방법에 관한 것이다.

핵 수용체는 리간드-활성화된 전사 인자이다. FXR는, 심각한 대사 질환, 염증, 종양 등 및 이와 관련된 생리학적 기능에서 중요한 조절 역할을 하는, 사람에서의 48개의 핵 수용체들의 매우 중요한 구성원이다. FXR 리간드에 의해 매개되는 약리학적 작용 원리는, 리간드가 FXR의 리간드 결합 도메인(LBD)에 결합하고, 이에 의해 각종 보조활성제(coactivator)(또는 보조억제자(corepressor))들을 모집하여 다운스트림 표적 유전자들을 조절하는 것이다. 체내에서, 담즙산은 FXR의 내인성 리간드이며, FXR의 활성화는 간 및 소장에서의 담즙산의 정상적인 순환 및 항상성을 유지시킬 수 있고, 그동안에 당류, 지질 및 콜레스테롤의 수준을 조절할 수 있다. FXR은 대사와 관련된 다수의 신호 경로들에 관여하며, FXR은 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병, 비만, 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간 및 죽상동맥경화증과 같은 대사 질환들을 치료하기 위한 약제의 주목할 만한 표적 분자가 되었다. 최근, FXR은 간의 재생을 조절할 수 있고, 마우스에서 FXR 유전자의 넉아웃은 간암의 발병을 초래할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 케노데옥시콜산(CDCA로 약칭됨)은 FXR에 결합하여 FXR을 활성화시킬 수 있는 담즙산의 일종이며 담석 치료에 사용될 수 있다. FXR에 결합할 수 있는 리간드들 중, CDCA는 임상적으로 사용되는 유일한 약제이다. 그러나, FXR에 대한 CDCA의 친화도는 FXR의 합성 리간드인 GW4064의 친화도보다 훨씬 더 낮으며, 또한 CDCA는 담즙산 결합 단백질(I-BABP), 담즙산 수송체 및 기타 단백질들에도 결합할 수 있고; 이에 따라, CDCA는 또한 FXR을 특이적으로 표적화하는 약제가 아니다. 기존 약제들 중의 약 13%는 핵 수용체들을 표적화하며, FXR에 의해 조절되는 중요한 생리학적 작용에 기초하여, FXR을 표적화하는 신규한 리간드 약제들을 스크리닝하고, 상기 리간드 약제들을 최적화하고 디자인하고 개발하는 것은 중요한 적용 가치를 갖는다.

이베르멕틴 및 도라멕틴은 스트렙토마이세트에 의해 생성되는 마크롤라이드 아바멕틴/아베르멕틴의 유도체들이며, 매우 효과적이고 광범위한 항기생충 효과를 갖고, 이베르멕틴, 도라멕틴 및 아바멕틴/아베르멕틴은 주로 가축의 기생충을 억제하고 사람의 사상충 감염을 치료하는 데 사용된다. 무척추동물에서 이베르멕틴의 표적들은 γ-아미노부틸산(GABA) 수용체 및 글루탐산 매개된 클로라이드 이온 채널 수용체(GluClR)와 같은 수용체들임을 시사하는 보고들이 존재한다. 포유동물에서 높은 친화도 및 특이도를 갖는 아바멕틴/아베르멕틴 및 이의 유도체들의 표적이 존재한다는 것은 아직까지 보고되지 않았다.

본 발명은, 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴 및 이의 유도체들의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 이베르멕틴(구조식 I로 나타냄)은 스트렙토마이세트에 의해 생성되는 마크롤라이드 아바멕틴/아베르멕틴의 유도체이며, 매우 효과적이고 광범위한 항기생충 효과를 갖고, 주로 가축의 기생충을 억제하고 사람의 사상충 감염을 치료하는 데 사용된다.

구조식 I

상기 이베르멕틴은 항기생충 효과와는 완전히 상이한 새로운 기능을 갖는다. 상기 기능은, 첫째로, 포유동물에서 이베르멕틴이 특이적으로 결합하는 표적 단백질이 파르네소이드 X 수용체라는 것을 고려한다는 것이 특징이다. 이베르멕틴은 높은 친화도로 파르네소이드 X 수용체(FXR)에 특이적으로 결합하여, 포유동물의 혈청내 당류, 지질 및 콜레스테롤의 대사를 조절하고, 당뇨병 동물 모델의 혈청내 당류, 지질 및 콜레스테롤의 수준을 효과적으로 감소시키며, 상응하는 증상들을 개선시킨다. 이베르멕틴은 또한 파르네소이드 X 수용체의 매개를 통해 염증 반응을 억제할 수 있다. 따라서, 이베르멕틴 및 이의 유도체들은 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 치료하기 위한 약제의 제조에서 우수한 적용 가능성을 갖는다.

이베르멕틴의 상기 유도체들 및 유사체들, 예를 들면 아바멕틴/아베르멕틴(구조식 II) 및 도라멕틴(구조식 III)은 이베르멕틴과 유사한 성질들 및 용도를 갖는다.

구조식 II

구조식 III

아바멕틴/아베르멕틴은 이베르멕틴의 구조식에서 C22-C23 위치에 이중 결합을 갖는다. 본 발명자들은, 아바멕틴/아베르멕틴은 높은 친화도로 FXR에 특이적으로 결합할 수 있고, 또한 FXR의 리간드이며, 고지방식이 공급된 마우스의 혈청내 당류, 지질 및 콜레스테롤의 수준 및 부고환 주위 지방의 중량을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 아바멕틴/아베르멕틴은 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 치료하기 위한 신규한 용도를 갖는다.

도라멕틴은 이베르멕틴의 구조식에서 C22-C23 위치에 이중 결합을 갖고, C25 위치는 벤젠 환의 측쇄에서 치환된다. 본 발명자들은, 도라멕틴은 높은 친화도로 FXR에 특이적으로 결합할 수 있고, 또한 FXR의 리간드이며, 고지방식이 공급된 마우스의 혈청내 당류, 지질 및 콜레스테롤의 수준 및 부고환 주위 지방의 중량을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 도라멕틴은 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 치료하기 위한 신규한 용도를 갖는다.

아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴의 구조 및 기능에 있어서 주장되는 바와 같이, FXR에 결합할 수 있는 아바멕틴/아베르멕틴 및 이베르멕틴의 기타 구조적 유사체들 또는 유도체들도 유사한 기능들과 용도를 가질 수 있는 것으로 고려될 수 있다.

20여 년 동안, 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 이의 유도체들은 주로 가축의 기생충을 억제하고 사람의 사상충 감염을 치료하는 데 사용되어 왔으며, 작용 메커니즘은, 이들이 무척추동물의 신경 및 근육 세포에서 글루탐산 매개된 클로라이드 이온 채널 수용체들에 선택적으로 결합하여, 근육 세포에 대한 신경 충동의 전달을 방해함으로써, 기생충을 치명적으로 마비시키거나 체내로부터 방출시키는 것이다. 이베르멕틴 및 이의 유도체들은 또한 γ-아미노부틸산 수용체들에 결합하여 동일한 역할을 할 수 있다. 그러나, 포유동물에서의 글루탐산 매개된 클로라이드 이온 채널 수용체들, 포유동물에서의 γ-아미노부틸산 수용체들의 존재는 오로지 중추 신경계에만 존재함에도 불구하고, 포유동물은 혈액 뇌 장벽을 가져, 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 이의 유도체들이 중추 신경계에 도달하는 것을 효과적으로 방지할 수 있으며; 이에 따라, 정상적인 경우, 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 이의 유도체들은 포유동물에서 높은 안전성 인자를 갖는다는 것을 시사하는 보고는 존재하지 않는다. 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 이의 유도체들은 20여 년 이상 사람에게 임상 적용되어 왔기 때문에 인체 안정성이 보장되며, 본 발명은, 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 이의 유도체들이 포유동물의 혈청내 당류, 지질 및 콜레스테롤의 대사를 효과적으로 조절할 수 있고, 동물 모델의 혈청내 당류, 인슐린, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 밝혀내었고, 이는, 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 이의 유도체가, 예를 들면 당 대사 및 지질 대사와 관련된 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들의 치료에서 우수한 가능성을 갖는다는 것을 시사한다.

본 발명은, 포유동물에서의 대사 질환들과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 관련 질환들의 치료에서의 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 이의 유도체들의 신규성, 안전성, 효율성, 높은 약물 생산성, 낮은 비용, 및 커다란 사회적 가치 및 경제적 이익을 충분히 입증한다. 또한, 본 발명은, x-선 결정 회절을 통해 원자 수준에서의 파르네소이드 X 수용체에 대한 이베르멕틴 결합의 독특한 구조 패턴을 제공하고, 안전 유도 약물 소분자들 및 약물 최적화 구조 템플레이트들을 사용하는, 파르네소이드 X 수용체 표적화 리간드 약물 디자인, 및 디자인 방법을 제공한다.

파르네소이드 X 수용체가 이베르멕틴과 결합하는 3차원 결정 구조 패턴에 따라(부록 1), 이베르멕틴의 구조식(예를 들면, 구조식 I)을 구조 기반으로 사용하여, 약물 디자인, 약물 합성 및 약물 스크리닝 방법들을 다음의 특정 단계들로 수행한다: 구조식 I을 구조 기반으로 사용하여, 상기 구조식 중의 C3-C4, C8-C9, C10-C11 및 C14-C15의 탄소-탄소 이중 결합들을 개질(modification)시키는 단계; C5, C7 및 C4" 위치의 하이드록실 그룹들을 개질시키는 단계; C4, C12, C14, C24 및 C25 위치의 측쇄들을 개질시키는 단계; 및 C13 위치의 글리코실을 가수분해하고, 다른 그룹들을 예를 들면 치환을 통해 개질시키는 단계. 상기 방법들은, 위에 언급된 임의의 단일 변형 및 각종 변형들의 조합이, 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 처치 및 치료하는 데 사용될 수 있음을 특징으로 한다.

본 발명의 기술적 해법:

고속 대량 스크리닝(high throughput screening)으로부터 수득되는 항기생충제 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴은 FXR의 특이적 리간드들이다.

시험관내 형질감염 실험에서의 루시퍼라제 리포터 유전자 활성 분석에 기초하여, 상기 수용체와 상기 리간드들 간의 선택적 인지를 분자 구조 수준에서 나타내고; 이베르멕틴으로 처리된 후의 관련된 표적 유전자의 발현 및 관련된 신호 경로의 조절 상태를, 마우스 모델에서 마우스의 간 세포의 1차 배양을 통해 검출하여, 다운스트림 신호 경로에 대한 효과를 나타내고; 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 도라멕틴으로 처리된 마우스 모델에서의 각종 생화학적 지표들의 변화를 검출하여, 상응하는 신호 경로의 변화와 관련하여 병원성 분자 메커니즘을 나타내고; 당뇨병 및 비만 마우스 모델을 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 도라멕틴 약제들로 처리하여, 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 질환들을 치료하기 위한 상기 약제들의 효능, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간 및 죽상동맥경화증과 같은 대사와 관련된 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 치료하기 위한 용도를 결정한다. 염증 반응 치료에서의 이베르멕틴의 용도는 염증 반응 표적 유전자의 조절을 통해 결정한다.

동일한 방식으로, 고지방식이 공급된 야생형 마우스 및 FXR 넉아웃 마우스를 각각 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 도라멕틴 주사로 처리하여, 이들 유도체가 야생형 마우스의 부고환 주위 지방/체중 비 및 혈청내 포도당, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증과 같은 대사와 관련된 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들의 치료에서 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 도라멕틴의 사용은 FXR을 통해 달성됨을 알 수 있다.

FXR과 이베르멕틴을 복합체로서 제조하고, 상기 복합체에 대해 결정학을 사용하여 결정화, x-선 결정 회절 및 구조 분해(structural resolution)를 수행하고, 이에 의해 이베르멕틴에 대한 FXR의 독특한 결합 패턴을 원자 수준에서 나타내어, 안전 유도 약물 소분자들을 사용하는, 포유동물에서의 상기 질환들을 위한 FXR 표적화 치료 약제들의 디자인을 제공하고, 상기 분자 구조들을 템플레이트로서 사용하는 유도체들의 약물 디자인 및 합성 방법을 제공한다.

도 1은, FXR에 결합한 후의 아바멕틴, 이베르멕틴 및 도라멕틴에 의한 보조조절자(coregulator) SRC1 모집 활성을 나타낸다. GW4064는 FXR 활성제 양성 대조물로서 사용된다.
도 2는, 0.5μM 이베르멕틴에 의한 FXR 수용체의 특이적 전사 활성을 나타낸다. COS-7 세포를, FXR과 같은 상이한 핵 수용체들의, 그리고 상이한 핵 수용체들의 상응하는 내인성 결합 성분들로 구성된 리포터 유전자의, 전장 발현 플라스미드로 동시 형질감염시킨다. 형질감염 후, 세포들을 각각, DMSO, 0.5μM 이베르멕틴 또는, 각각의 핵 수용체들에 대한 특이적 작용제로 처리한다.
도 3은, FXR 단백질과 이베르멕틴의 결합 복합체의 결정 회절 구조 다이어그램을 나타낸다. FXR의 LBD 리간드 포켓에서 결합한 이베르멕틴은 막대 구조로 나타난다. NCoR2는, FXR과 이베르멕틴의 복합체를 형성하는 보조조절자 NCoR들 중에서 FXR 결합 시퀀스를 갖는 폴리펩타이드를 나타낸다.
도 4는, FXR에 결합한 이베르멕틴의 전자 구름 다이어그램을 나타낸다.
도 5는, 이베르멕틴 및 GW4064에 의한 FXR의 전사 활성의 활성화는, 이베르멕틴과 상호작용하는 FXR의 핵심 아미노산의 돌연변이에 의해 영향을 받는다는 것을 나타낸다. COS-7 세포를, 전장 FXR(wt)을 발현하는 발현 플라스미드로 동시 형질감염시키거나, 상응하는 부위들 및 EcRE 리포터 유전자에서의 돌연변이들로 동시 형질감염시키고, 이베르멕틴 및 GW4064로 처리하고, 24시간 후에 전사 활성에 대해 조사한다. 횡좌표는 야생형 FXR(wt) 및 4개의 아미노산 부위들에서의 돌연변이들을 갖는 FXR 돌연변이체를 나타낸다.
도 6은, 아바멕틴 및 도라멕틴 처리는 야생형 마우스 및 FXR 넉아웃 마우스의 먹이 섭취에 대해 어떠한 효과도 발생시키지 않지만, 야생형 마우스에서 혈청 포도당 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸다. **는 p < 0.01를 의미한다.
도 7은, 이베르멕틴 처리 후, 고지방식이 공급된 야생형 마우스(WT)의 혈청내 당류, 인슐린 및 콜레스테롤의 수준이 각각 감소한다는 것을 나타낸다. FXR 넉아웃 마우스(KO)에서, 이들 지표는 약물 처리에 의해 영향을 받지 않는다. *는 p < 0.05를 의미하고, **는 p < 0.01를 의미한다.
도 8은, 이베르멕틴 처리 후, 고밀도 지단백질 및 저밀도/극저밀도 지단백질 중의 콜레스테롤을 포함하여, 마우스 체내의 콜레스테롤의 수준이 하향조절된다는 것을 나타낸다. FXR 넉아웃 마우스(KO)에서, 이들 지표는 약물 처리에 의해 영향을 받지 않는다. *는 p < 0.05를 의미하고, **는 p < 0.01를 의미하며, ***는 p < 0.001을 의미한다.
도 9는, 아바멕틴 및 도라멕틴 처리 후, 고지방식이 공급된 야생형 마우스에서, 고밀도 지단백질 및 저밀도/극저밀도 지단백질 중의 콜레스테롤을 포함하여, 혈청 콜레스테롤 수준이 감소한다는 것을 나타낸다. *는 p < 0.05를 의미하고, ***는 p < 0.001을 의미한다.
도 10은, 아바멕틴 및 도라멕틴 처리 후, 고지방식이 공급된 야생형 마우스에서 혈청 트리글리세라이드의 수준 및 부고환 주위 지방/체중 비가 감소한다는 것을 나타낸다. *는 p < 0.05를 의미하고, ***는 p < 0.001을 의미한다.
도 11은, 이베르멕틴으로 처리된 야생형 마우스에서 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 활성이 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다.
도 12는, 이베르멕틴 처리 후, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 야생형 마우스의 간 조직 부분은, 이베르멕틴이 간 손상을 야기하지 않는다는 것을 보여준다는 것을 나타낸다. 비히클은 약제 없이 주입된 바탕 대조군을 나타낸다.
도 13은, 실시간 형광 정량 PCR 방법을 사용하여, 이베르멕틴 처리된 야생형 마우스의 간내 당류, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 대사와 관련된 유전자 및 FXR 표적화 유전자의 발현을 검출한 것을 나타낸다. *는 p < 0.05를 의미하고, **는 p < 0.01을 의미한다.
도 14는, 이베르멕틴 처리는 KK-Ay 당뇨병 모델 마우스의 먹이 섭취에는 영향을 주지 않지만 상기 마우스의 체중을 감소시킨다는 것을 나타낸다. *는 p < 0.05를 의미한다.
도 15는, 이베르멕틴 처리 후, KK-Ay 마우스의 혈청내 포도당 및 인슐린의 수준이 감소한다는 것을 나타낸다. **는 p < 0.01을 의미한다.
도 16은, 이베르멕틴 처리 후, KK-Ay 마우스의 혈청내 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 유리 지방산의 수준이 감소한다는 것을 나타낸다. **는 p < 0.01을 의미한다.
도 17은, 아바멕틴 및 도라멕틴 처리 후, KK-Ay 마우스의 먹이 섭취는 영향을 받지 않으며, 고지방식이 공급된 KK-Ay의 상대적 체중 및 혈청 포도당 수준은 감소한다는 것을 나타낸다. ***는 p < 0.001을 의미한다.
도 18은, 아바멕틴 및 도라멕틴 처리 후, 고지방식이 공급된 KK-Ay 마우스의 혈청 콜레스테롤(고밀도 지단백질 및 저밀도/극저밀도 지단백질 중의 콜레스테롤을 포함함) 및 혈청 트리글리세라이드의 수준이 감소하는 것을 나타낸다. *는 p < 0.05를 의미하고, **는 p < 0.01을 의미하고, ***는 p < 0.001을 의미한다.
도 19는, 이베르멕틴은 LPS에 의해 유도된 염증 반응과 관련된 유전자들(iNOS, TNFa, IL-6 및 MIP-1a을 포함함)의 발현을 억제할 수 있음을 나타낸다. *는 p < 0.05를 의미하고, **는 p < 0.01을 의미한다.

특정 양태

단백질 정제

1. 클로닝

(1) 템플레이트로서의 사람 FXR 발현 플라스미드(pCMX-FXR), 프라이머로서의 0.5㎕ 50mM 정방향 프라이머 5'GATATGGATCCAATCCAGAGTCCGCTGACCTC 및 0.5㎕ 50mM 역방향 프라이머 3'GATATCTCGAGCTAGTACAAGTCCTTGTAGATC, 4㎕ 10× PCR 완충액, 1㎕ 10mM dNTP, 및 5U pfu 효소(인비트로겐(Invitrogen))(이는, 물을 갖는 50㎕ 시스템(Milli-Q)으로 구성된다)를 사용하여 PCR 반응을 수행하여, BamH I 및 Xho I의 2개의 제한 효소 절단 부위(restriction enzyme digestion site)들을 함유하는 사람 FXR LBD(리간드 결합 도메인)(아미노산 잔기 번호는 243-472이다)의 PCR 생성물을 수득한다. PCR 절차는 다음과 같이 수행한다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분, 30 사이클; 및 72℃에서 10분.

(2) PCR로부터 수득된 DNA 단편들 및 원핵 세포 발현 벡터 pET24a(노바겐(Novagen)) 상에서 효소 절단을 수행하여, 상기 PCR 생성물들 및 pET24a 벡터를 BamH I 및 Xho I로 절단한다. 상기 효소 절단 시스템은 1㎍(10㎕)의 FXR LBD PCR 생성물들 또는 pET24a 벡터, 0.5㎕의 BamH I(Thermo), 0.5㎕의 Xho I(Thermo), 4㎕의 10× 효소 절단 완충액(Thermo), 및 25㎕의 ddH₂O(Milli-Q)를 포함한다. 상기 시스템을 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리한다. 상기 절단된 PCR 생성물들 및 pET24a 벡터를 SYBR DNA 염료를 갖는 1% 아가로스 겔에 의해 분리시키고, 프로메가(Promega) 겔 추출 키트에 의해 DNA를 회수한다.

(3) 상기 회수된 단편들 및 벡터를 3:1의 몰 비로 결찰한다. 상기 결찰 시스템은 2㎕의 FXR LBD DNA 단편들, 2㎕의 pET24a(노바겐) 벡터, 2㎕의 5× 결찰 완충액(인비트로겐), 및 0.5㎕의 T4 DNA 리가아제(인비트로겐)(이는 ddH₂O로 10㎕로 구성된다)를 포함한다. 상기 시스템을 실온에서 30분 동안 반응시킨다.

(4) 2㎕의 상기 결찰된 생성물을 50㎕ Trans109 컴피턴트 세포(competent cell)로 변형시키고, 30분 동안 얼음욕에 적용시킨 다음 42℃에서 30초 동안 열 충격시킨다. 항생제를 갖지 않는 250㎕의 LB 액체 배지를 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 225rpm으로 예비진탕시킨 다음, 150㎕의 변형 생성물들을 취하고, 이들을 50㎍/㎖의 카나마이신을 갖는 LB 고체 배지 플레이트 상에 펼쳐놓고 37℃에서 밤새 배양한다. 다음 날, 단일 콜로니를 골라내어 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 2㎖ LB 액체 배지에 넣고, 진탕하에 37℃에서 10시간 동안 배양한다.

(5) 상기 진탕된 세균 용액에 대해 퀴아겐 미니프레프(Qiagen MiniPrep) 플라스미드 미니프레퍼레이션(minipreparation) 키트를 사용하여 플라스미드 추출을 수행한다.

(6) 효소 절단을 사용하여, 상기 추출된 플라스미드를 확인한다. 상기 효소 절단 확인 시스템은 1㎍(2㎕)의 플라스미드, 0.5㎕의 BamH I(Thermo), 0.5㎕의 Xho I(Thermo), 2㎕의 10× 효소 절단 완충액(Thermo) 및 15㎕의 ddH₂O(Milli-Q)를 포함한다. 상기 시스템을 37℃의 인큐베이터에서 30분 동안 효소 절단 반응시키고, 1% 아가로스 겔로 검출하여, 상기 발현 벡터에 대한 표적 단편의 성공적인 삽입을 확정한다. 마지막으로, 상기 수득된 플라스미드를 시퀀싱에 의해 확인한다. 헥사히스틴으로 태그된 사람 핵 수용체 FXR LBD의 발현 플라스미드를 수득하여 pET24a-His6-FXR LBD로서 나타낸다.

2. 표적 단백질 발현 및 정제

(1) 변형. pET24a-His6-FXR LBD를 BL21(DE3) 컴피턴트 세포로 변형시킨다. 1㎕의 플라스미드를 취하여 50㎕ BL21 컴피턴트 세포로 변형시키고, 30분 동안 얼음욕에 둔 다음 42℃ 수조에서 30초 동안 열 충격시킨다. 항생제를 갖지 않는 250㎕의 LB 액체 배지를 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 225rpm으로 예비진탕시킨 다음, 15㎕의 생성물들을 취하고, 이들을 50㎍/㎖의 카나마이신을 갖는 LB 고체 배지 플레이트 상에 펼쳐놓고 37℃에서 밤새 배양한다.

(2) 배양물 진탕. 다음 날, 단일 콜로니를 골라내어 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 50㎖ LB 액체 배지에 넣고, 37℃에서 8시간 동안 예비진탕시키고, 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 1.5ℓ LB 액체 배지로 옮기고, OD₆₀₀이 약 1.0에 도달할 때, 0.1mM IPTG를 첨가하여 16℃의 저온에서 발현을 유도한다.

(3) 유도된 표적 단백질을 함유하는 세균 세포들을 수집한다. 밤새 유도되고 발현된 1.5ℓ의 세균 용액을 4℃에서 10분 동안 3,000rpm으로 원심분리하여 세균을 수집하고, 상기 세균 용액을 100㎖의 정제 완충액(20mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 10% 글리세롤, 25mM 이미다졸)으로 재현탁시키고 -80℃에서 저온보존한다.

(4) 단백질 추출. 피셔 사이언티픽 소닉 디스멤브레이터(Fisher Scientific Sonic Dismembrator) 초음파 세포 분쇄기(disruptor)를 사용하여 60%의 진폭, 5초 작업 및 10초 휴식의 빈도로 초음파 프로세싱을 10분 동안 수행한다. 상기 생성물을 4℃에서 30분 동안 20,000rpm으로 원심분리한 다음 상등액을 취한다.

(5) 단백질 정제. 상기 상등액을 5㎖ 니켈 이온 교환 컬럼(NiSO₄-부하된 HisTrap HP 컬럼, GE Healthcare)에 통과시켜 상기 표적 단백질이 니켈 컬럼에서 충분히 풍부해지도록 한다. 지이 컴퍼니(GE Co.)로부터의 AKTA 단백질 정제 시스템 및 UNICORN 소프트웨어를 상기 작업에 사용한다. 펌프 세척: 펌프를 먼저 물로 세척한 다음 완충액으로 세척한다. 상기 작업 절차는 다음을 포함한다: 시스템 컨트롤 윈도우에서, Manual→Pump→Pumpwashbasic→PumpA, PumpB→On→Excute를 순차적으로 선택한다. 크로마토그래피 컬럼의 연결: 상기 시스템 펌프를 먼저 활성화시키고, 유동 배출되는 용액이 존재할 때, 상기 크로마토그래피 컬럼을 상기 시스템에 동적으로 연결하여, 유동된 단백질의 피크 값을 UV를 통해 검출할 수 있고, UNICORN 소프트웨어를 개방하여 단백질 용리 절차를 에디팅한다: 20㎖ 용리 완충액을 사용하여 컬럼 평형화를 수행하고; 25 내지 500mM 이미다졸을 구배로 사용하여 상기 컬럼에 대한 경쟁적 결합을 수행하여 표적 단백질을 용리시키고; 15㎖ 완충액으로 컬럼 평형화를 수행한다. 단백질 용리: 상기 컬럼 상의 단백질을 용리 완충액 A 및 B(용리 완충액 A의 성분: 25mM Tris, 150mM NaCl, 25mM 이미다졸 및 10% 글리세린, pH 7.5; 용리 완충액 B의 성분: 25mM Tris, 150mM 이미다졸 및 10% 글리세린, pH 7.5)를 사용하여 구배 용리시키며; 이미다졸 농도 구배를 25mM로부터 500mM로 변화되도록 조절함으로써 적합한 농도들의 경쟁하에 이미다졸과 유사한 구조를 갖는 히스티딘-태그 함유 표적 단백질을 용리해 낼 수 있다. 상이한 분자 질량에서 요구되는 Hiload26 분자체 크로마토그래피 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여, 상기 니켈 이온 교환 컬럼으로부터 용리된 표적 단백질 용액을, 상기 표적 단백질에 대해 다음과 같은 단계들로 추가로 정제한다: 니켈 컬럼에 의해 수집된 단백질 용액을 시린지에 의해 AKTA 샘플 부하 고리에 주입한 다음, 상기와 동일한 방법으로 프로그램 실행을 시작한다. 단백질 용리 완충액은 10mM NaCl을 함유한 용리 완충액 C(용리 완충액 C: 25mM Tris, pH 7.5)로 바꾼다.

(6) 단백질 복합체의 제조. 진스크립트(GenScript)로부터 맞춤제작된 합성 NcoR2 폴리펩타이드(PASNLGLEDIIRKALMGS) 및 FXR LBD 단백질을 다음과 같이 복합체 제조에 사용한다: 상기 분자체 크로마토그래피로부터 수득된 20㎖의 단백질, NcoR2 폴리펩타이드 및 이베르멕틴을 1:1:1의 몰 비로 혼합하고, 10kD MILLIPORE 15㎖ 농축 튜브에 첨가하여 농축시키고, 4℃에서 4,000rpm으로 원심분리하여 농축시키고, 상기 단백질을 10㎎/㎖의 최종 농도에 도달하도록 농축시킨다.

3. 단백질 결정화, 결정 데이터 수집 및 구조 분해

결정화 스크리닝은 현적법(hanging drop method)을 사용하여 수행하고, FXR/이베르멕틴/NcoR2 복합체는 실온 조건에 두며, 현적 용액의 성분은 1.0㎕의 상기 언급된 단백질 폴리펩타이드 리간드 복합 용액 및 1.0㎕의 결정화 완충액(50mM HEPES pH 7.0, 3.5M 포름산나트륨)의 혼합물을 포함한다. 숙성 성장된 결정을 액체 질소를 사용하여 신속하게 저온보존한다. 데이터는 상하이 싱크로트론 방사광 시설(Shanghai Synchrotron Radiation Facility)의 BL17U1 라인 스테이션에 의해 획득한다. X-선으로 방사선 처리한 후, 수득된 회절 데이터를 HKL2000 소프트웨어로 가공하여, 각각의 비대칭 유닛이 2개의 분자들을 포함하고, 결정 공간 그룹이 I 21 21 21(a = 53.01, b = 161.76, c = 169.02, α = 90°, β = 90° 및 γ = 90°)임을 보장하며, 분자 대체를 통해 일반적인 구조 모델을 측정할 수 있는 CCP4 소프트웨어 패키지(http://www.ccp4.ac.uk)에서 Molrep, Phaser 등을 사용하여 특정한 구조 분해를 수행하고, 쿠트(Coot)의 인공 모델의 미세 구성 및 REFMAC 및 phenix.refine에 의한 다수의 추가 개질 사이클에 의해 최종 단백질 복합 구조를 수득할 수 있으며, 여기서, 이러한 구조 모델의 Rwork 및 Rfree는 각각 25.4% 및 28.2%이고, 2.81Å의 분해능을 갖는다. 특정한 3차원 결정 구조 공간 성분들에 대해서는 부록 1을 참조할 수 있다.

4. 보조인자 결합 실험

핵 수용체들을 유도하여 각종 타입의 보조조절자들을 모집하는 데 사용되는 리간드들의 결합 능력을 알파 스크린(Alpha Screen) 니켈 킬레이트 검출 키트(퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 알파스크린 분석 방법(Alphascreen analysis method)을 통해 검출한다. 이러한 실험에서 50㎕의 반응 시스템은 20nM 융합 히스티딘 태그된 수용체 LBD 단백질, 20nM 비오틴 태그된 보조인자 폴리펩타이드, 5㎍/㎖의 도너 및 수용체 비드, 및 완충액(50mM MOPS, 50mM NaF, 0.05mM CHAPS 및 0.1㎎/㎖ 소 혈청 알부민, pH 7.4)을 포함하며, 상기 반응 시스템을 384-웰 플레이트에서 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, 알파스크린 검출기로 680㎚에서의 여기 광의 신호 및 520 내지 620㎚에서의 방출 광의 신호를 판독한다. 상기 비오틴 태그된 폴리펩타이드 및 알파스크린 분석을 위한 시퀀스는 각각 SRC1-2 및 SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP이다.

5. 일시적 형질감염 실험

1. 플라스미드:

(1) FXR 전장 플라스미드: 사람 FXR 전장 cDNA 발현 시퀀스를 통상적인 클로닝 방법을 사용하여 pCMX 발현 벡터에 클로닝한다.

(2) 핵심 결합 부위들에서 점 돌연변이들을 갖는 FXR의 발현 벡터가 수득된다. 퀵-체인지 부위-지시된 돌연변이 유발 키트(Quick-Change site-directed mutagenesis kit)(Stratagene)가 돌연변이에 사용되며, 상기 돌연변이 반응 시스템은 다음과 같다: 0.5㎕의 야생형 플라스미드 pCMX-FXR(50ng), 0.2㎕의 돌연변이 프라이머(100μM), 1㎕의 pfu DNA 폴리머라제(인비트로겐)(2U), 1㎕의 10mM dNTPs, 5㎕의 10× PCR 완충액, 및 43㎕의 ddH₂O. PCR 절차는 다음과 같이 수행한다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 7분, 15 사이클. 20㎕ PCR 생성물을 Dpn I 메틸라제로 절단한 다음, 2㎕의 절단 생성물을 취하고 이것을 이. 콜라이 Trans 109 컴피턴트 세포로 변형시키고, 30분 동안 얼음욕에 두고 42℃에서 30초 동안 열 충격시킨다. 항생제를 갖지 않는 250㎕의 LB 액체 배지를 첨가하고, 37℃에서 40분 동안 225rpm으로 예비진탕시킨 다음, 150㎕의 생성물을 취하고, 이들을 100㎍/㎖의 암피실린을 갖는 LB 고체 배지 플레이트 상에 펼쳐놓고 37℃에서 밤새 배양한다. 다음 날, 단일 콜로니를 골라내어 100㎍/㎖의 암피실린을 함유한 2㎖ LB 액체 배지에 넣고 37℃에서 밤새 배양한다. 상기 진탕된 세균 용액에 대해 퀴아겐 미니프레프 플라스미드 미니프레퍼레이션 키트를 사용하여 플라스미드 추출을 수행한다. 상기 플라스미드를 시퀀싱에 의해 확인한다.

2. 형질감염:

10% 소 태아 혈청을 함유한 DMEM 배지를 사용하여 원숭이 신장 상피 세포 COS-7 세포의 배양을 수행하고, COS-7 세포를 형질감염 전날에 5×10⁴개 세포/웰의 접종 밀도로 24-웰 플레이트 상에 접종하고, 다음 날 형질감염시킨다. 상기 형질감염은 Lipofectamine 2000(인비트로겐)을 사용하여 수행되는 일시적 형질감염이다. 리포터 유전자 분석 실험에서, 200ng의 핵 수용체 전장 발현 플라스미드 또는 이의 돌연변이체의 발현 플라스미드, 200ng의 내인성 프로모터 리포터 유전자, 및 30ng의 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 발현 플라스미드를 동시 형질감염에 사용한다. 500㎕의 Opti-MEM을 각각의 웰에 첨가하고 5시간 동안 배양한 다음, Opti-MEM에 희석된 리간드 약제를 첨가하여 상응하는 농도에 도달시키고, 18시간 동안 처리한다. 사용되는 각종 핵 수용체들 및 상응하는 리포터 유전자는 다음과 같다: 사람 FXR, EcRE-Luc; 사람 PPAR(α, β 및 γ), PPRE-Luc; 사람 ROR(α, β 및 γ), Pcp2/RORE-Luc; 사람 GR 및 PR, MMTV-Luc; 사람 RARα 및 RARβ 및 βRE-Luc.

3. 리포터 유전자 분석:

형질감염 후 4 내지 6시간에 상기 형질감염 방법으로 처리된 세포에 리간드 약제를 첨가하며, 실시예에서 리포터 유전자 분석을 위한 이베르멕틴의 모든 농도는 0.5μM이다. 도 2에서, 각각의 핵 수용체에 대한 특정한 리간드 및 이의 농도는 다음과 같다: FXR, 0.5μM GW4064; PPARα, 1μM GW590735; PPARδ, 1μM GW0472; PPARγ, 1μM 로시글리타존; 글루코코르티코이드 수용체(GR), 0.1μM 덱사메타손; 프로게스테론 수용체(PR), 0.1μM 프로게스테론; RAR 및 RARβ, 1μM 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid); PXR, 10μM 리팜피신; CAR, 5μM CITCO((6-(4-클로로페닐)이미다조[2,1-b][1,3]티아졸-5-포름알데하이드-O-(3,4-디클로로벤질)에틸 케톡심). 상기 리간드 약제를 18시간 동안 처리한 후, 프로메가 컴퍼니(Promega Co.)로부터의 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 키트를 사용하여 리포터 유전자 활성 분석을 수행한다. 세포를 루시퍼라제 검출 실험을 위해 용해시키고, 10㎕의 용해된 세포를 96-웰 플레이트로 옮기고, 50㎕의 루시퍼라제 반응 용액을 첨가한 다음, EnSpire™ 2300 다중모드 판독기(퍼킨엘머)를 사용하여 560㎚에서 방출 광의 신호를 검출하고, Stop & Glo® 반응 용액을 첨가하여 루시퍼라제 반응을 중단시키고, 레닐라 루시퍼라제 활성을 검출한다. 상기 레닐라 활성은 리포터 유전자의 활성에 대한 내부 기준으로서 사용된다.

6. 마우스 실험

동일한 배경을 갖는 9 내지 10주령의 야생형 C57BL/6J 마우스, 및 FXR 유전자 결실 동형(deletion homozygous) 마우스(FXR^-/-) 및 당뇨병 및 비만 마우스 모델 마우스(KK-Ay)를 사용하여, 실험 동물 센터 샤먼 유니버시티(Xiamen University)의 SPF 등급 동물 수용실에서, 물에 자유롭게 접근하도록 하면서 고지방식(Research Diets, D12492)을 공급한다. 마우스를, 각각의 군에 6마리씩, 대조군, 이베르멕틴 또는 이의 유도체 처리군 및/또는 GW4064 처리군으로 나누고, 각각 대조 용액(40% HBC(2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린)), 상기 대조 용액으로 희석된 이베르멕틴 또는 이의 유도체(주사량은 약제 질량/마우스 체중에 따라 산출된 1.3㎎/㎏이다), 및 상기 대조 용액으로 희석된 GW4064(30㎎/㎏)를 복강내 주사한다. 복강내 주사는 매일 오전 9시에 1회 수행하고, 14일 동안 지속하고, 마우스를 이틀마다 체중 및 먹이 섭취에 대해 측정한다. 14일이 지난 후, 마우스를 물에 자유롭게 접근하도록 하고 6시간 동안 절식시킨 후, 마우스 체중을 측정하고, 주사 처리 실험 이전의 초기 체중에 대한 최종 체중의 퍼센티지를 마우스 체중의 변화로서 나타낸다. 그런 다음, 안구로부터 혈액을 샘플링하고, 분리에 의해 혈청을 수득한다. 혈청내 성분들을 각각 다음의 키트들에 의해 검출한다: 당-옥시다제 방법(sugar-oxidase method)(베이징 어플리겐(Beijing Applygen)); 인슐린(미국 소재의 크리스탈 케미칼 인코포레이티드.(Crystal Chem. Inc.)); 총 콜레스테롤 및 고밀도 및 저밀도 지단백질 중 콜레스테롤(미국 소재의 바이오어세이 시스템스(Bioassay Systems)); 트리글리세라이드(베이징 어플리겐(Beijing Applygen) 및 일본 소재의 와코 케미컬스 인코포레이티드.(WAKO Chemicals Inc.)); 유리 지방산(미국 소재의 바이오어세이 시스템스(Bioassay Systems)); 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(중국 베이징 소재의 바이오시노 바이오-테크놀로지 앤드 사이언스 인코포레이티드.(Biosino Bio-technology and Science Inc.)). 마우스의 간을 적출하고, 이의 일부를 파라포름알데하이드로 고정시키고, 파라핀으로 매립하고, 절편화하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 이의 일부를 형광 정량 PCR을 사용하는 유전자 발현 측정을 위한 RNA 추출에 사용하기 위해 액체 질소로 저온보존한다.

7. 형광 정량 PCR을 사용하는 유전자 발현의 측정

대조물(40% HBC) 또는 이베르멕틴으로 처리된 야생형 마우스, 및 FXR 넉아웃 마우스 모델, 및 상기 대조물, GW4064 또는 이베르멕틴으로 처리된 KK-Ay 마우스 모델로부터 간 조직을 수득한 후 -80도의 냉각장치에서 저온보존한다. RNA 추출 키트(오메가 바이오-테크(Omega Bio-Tek), 미국 조지아주)를 사용하여 상기 조직으로부터 전체 RNA를 추출한다. 역전사를 위해 TAKARA 역전사 키트를 사용하고, SYBR 녹색 형광 염료를 사용하여 CFX™ 96(BIO-RAD) 실시간 모니터링 시스템으로 형광 정량 PCR을 수행하여 유전자 발현 수준을 분석한다. 액틴 유전자의 발현 수준을 상기 결과들에 대한 내부 기준으로 사용한다. 상기 반응 시스템은 12.5㎕의 SYBR Premix Ex Taq(2×), 1㎕의 PCR 정방향 프라이머(10μM), 1㎕의 PCR 역방향 프라이머(10μM), 2㎕의 cDNA 템플레이트, 및 8.5㎕의 멸균성 증류수를 포함하여 총 25㎕를 포함한다. 2단계 증폭 PCR 절차는 다음과 같다: 95℃에서 30초 동안 예비-변성시키고, 95℃에서 5초 동안 그리고 60℃에서 40초 동안 PCR 반응시킴. 40 사이클.

특정 실시예가 아래에 제공된다:

실시예 1. 이는, 이베르멕틴이 높은 친화도 및 높은 특이도를 갖는 신규한 FXR 리간드임을 입증한다

리간드는 FXR에 결합한 후에 FXR을 유도하여 보조조절자들을 모집할 수 있기 때문에, 리간드를 FXR에 대한 친화도에 대해 시험할 수 있다. FXR의 특정 리간드들은 알파스크린에 의해 스크리닝되며, FXR에 대한 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴의 친화도는 합성 GW4064의 친화도와는 한자릿수 미만 차이가 나는 것으로 밝혀졌으며, 여기서, 상기 실험에서, FXR에 대한 GW4064의 친화도 절반 유효 농도(EC50)는 140nM이고, 이베르멕틴, 도라멕틴 및 아바멕틴/아베르멕틴의 EC50은 각각 400nM, 500nM 및 1.25μM(도 1)이다. 이는, 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴은 매우 높은 친화도로 FXR에 결합한다는 것을 시사한다. 이베르멕틴은 FXR에 특이적으로 결합할 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 FXR의 내인성 리포터 유전자 EcRE, 및 전장 FXR을 발현하는 플라스미드를 사용하여, COS-7 세포들을 동시형질감염(cotransfection)시켰다. 상기 결과들은, 검출된 상이한 핵 수용체들에 대해 이베르멕틴이 유일하게 특이적으로 FXR의 전사 활성을 활성화시킬 수 있고, 다른 검출된 핵 수용체들에 대해서는 어떠한 효과도 발생시키지 않는다는 것을 시사한다(도 2). 이는 FXR 리간드로서의 이베르멕틴의 높은 특이도를 나타낸다.

실시예 2. FXR / 이베르멕틴 복합체의 결정 구조 분해

분자 수준에서의 이베르멕틴 및 FXR 사이의 인지 및 결합의 분자 메커니즘을 밝히기 위해, 본 발명자들은 FXR/이베르멕틴에 의해 형성된 복합체 및 보조억제자 NCoR 핵 수용체 결합 모티프의 결정 구조를 2.8Å의 분해능으로 분해하였다(부록 1, 및 도 3). 상기 구조는, 이베르멕틴과 FXR 리간드 결합 도메인의 결합은 전형적인 "샌드위치" 형태에 부합한다는 것을 나타낸다. 상기 전자 구름 다이어그램으로부터, 이베르멕틴은 FXR의 리간드 결합 포켓 내에 명백하게 존재한다는 것을 알 수 있다(도 4). 상기 구조로부터, 이베르멕틴의 결합은 FXR 카복시-말단 AF-2의 전형적인 나선형 구조의 변화를 초래한다는 것을 알 수 있으며(도 3), 이는, 이베르멕틴은 FXR를 유도하여 보조활성제 및 보조억제자를 모집하고 결합하다는 측면에 있어서 합성 FXR 리간드 GW4064와는 상이한 기능 방식을 갖고, 이베르멕틴은 독특한 결합 방식으로 FXR의 기능을 조절할 수 있음을 시사한다. 이베르멕틴에 대한 FXR의 결합 패턴에 관한 특정한 정보에 대해서는 부록 1을 참조할 수 있다.

실시예 3. FXR 리간드 결합 포켓 내의 이베르멕틴의 독특한 결합 부위

이베르멕틴이 직접 결합할 수 있는 FXR 리간드 결합 포켓 내의 아미노산 부위들을 확인하기 위해, 본 발명자들은 FXR-이베르멕틴 복합체의 구조에 따라 이베르멕틴에 대한 FXR의 결합을 위한 핵심 부위들 상에서의 점 돌연변이를 수행하고, 상기 리간드에 의해 조절되는 돌연변이된 FXR의 전사 활성의 변화를 검출하여, FXR에 대한 이베르멕틴의 결합을 위한 이들 결합 부위들의 중요성을 확정하였다.

291 위치의 알라닌(A)은 FXR 리간드 결합 도메인의 크기를 조절하는 데 중요한 역할을 한다. A291이 트립토판(W)으로 돌연변이되는 경우, 알라닌의 측쇄 그룹보다 훨씬 더 큰 트립토판의 측쇄 그룹이 상기 리간드 결합 포켓의 공간을 점유하고, 이에 의해 FXR 리간드 결합 포켓이 작아지게 되어 FXR 리간드의 결합에 영향을 준다. 예상된 바와 같이, 리포터 유전자 분석 실험 결과들은, A291W의 돌연변이는 GW4064 및 이베르멕틴이 FXR의 전사 활성을 활성화시킬 수 없도록 한다는 것을 시사한다(도 5). 이는, FXR의 291 위치의 알라닌 잔기는 GW4064 또는 이베르멕틴의 결합 및 FXR 전사 활성의 활성화를 위해 매우 중요하다는 것을 시사한다.

상기 소수성 쇄에서 284 위치의 페닐알라닌(F)은 각각 GW4064 및 이베르멕틴과의 소수성 상호작용을 형성하여 리간드와 수용체의 결합을 안정화시킬 수 있다. F284가 히스티딘(H)으로 돌연변이된 경우, 이들 2가지 타입의 소수성 상호작용은 소멸된다. 그러나, 다른 측면에서, GW4064의 경우, 히스티딘으로의 돌연변이 후, 히스티딘의 측쇄 그룹들이 GW4064와의 염소 결합 상호작용을 형성할 수 있고, 따라서 소수성 상호작용의 소멸은 이베르멕틴이 FXR의 전사 활성을 활성화시키지 못하도록 하는 반면, GW4064의 활성화 능력은 영향을 받지 않는다(도 5). 이는, FXR 리간드 결합 포켓에 대한 이베르멕틴의 결합 패턴은 독특하며 GW4064의 결합 패턴과는 상이하다는 것을 시사한다.

또한, L287T 및 H447F의 돌연변이는 GW4064 매개된 FXR의 전사 활성을 현저하게 감소시키는 반면, 이베르멕틴에 의한 FXR 전사 활성의 활성화를 현저하게 증가시킨다(도 5). 이는 또한, FXR에 대한 GW4064 및 이베르멕틴의 결합 방식이 크게 상이하며, FXR 기능의 조절도 또한 현저하게 다르다는 것을 시사한다.

실시예 4. 이베르멕틴은 포유동물의 당류 및 지질의 대사를 효과적으로 조절할 수 있다

중요한 핵 수용체로서의 FXR은 먼저 담즙산의 수용체로서 사용되어 간 및 소장에서의 담즙산의 순환 및 평형화를 조절한다. 최근, FXR은 유기체의 당류 및 지질의 대사를 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 합성 FXR 리간드 GW4064는 FXR을 통해 혈중 지질 및 콜레스테롤의 수준을 감소시킬 수 있지만, GW4064의 세포독성 및 효능 한계로 인해 이는 임상적으로 사용될 수 없으며; 추가로, GW4064는 고혈당증 및 비만을 완화시킬 수 있음을 시사하는 보고가 있지만, 동시에 몇몇 문헌들은 또한, GW4064는 체내 혈당에 현저한 영향을 갖지 않는다는 것을 제안하며, 심지어 GW4064의 장기적인 획득은 마우스를 비만으로 만든다는 것을 시사하는 보고가 존재한다. 따라서, GW4064에 의한 혈당 조절에 있어서 약간의 논란이 존재한다. FXR를 위한 새로운 리간드 약제들을 발견하는 것이 더욱 중요하고 의미있을 것이다.

이베르멕틴에 의한 마우스 모델의 생리학적 조절 기능을 검출하기 위해, 본 발명자들은 야생형 마우스 및 FXR 넉아웃 마우스를 사용하여 실험을 수행하였다. 고지방식이 공급된 마우스를, 상기 특정 양태에서 설명된 바와 같이, 2주 동안 대조물 제제, 이베르멕틴 또는 이의 유도체들로 복강내 주사한 후, 상기 약제들이 마우스의 먹이 섭취에 대해 어떠한 효과도 발생시키지 않는 경우(도 6), 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴 처리는 야생형 마우스의 혈청내 포도당(도 6 및 도 7) 및 콜레스테롤(도 7, 도 8 및 도 9)의 수준을 현저하게 감소시키지만, FXR 넉아웃 마우스에서는 어떠한 현저한 변화도 발생시키지 않음을 밝혀내었다. 이베르멕틴 처리는 야생형 마우스의 혈청 인슐린 수준을 현저하게 감소시키며(도 7), 이는, 이베르멕틴이 인슐린 감도의 증가를 통해 혈당 감소 효과를 달성할 수 있음을 시사한다. 그러나, FXR 넉아웃 마우스에서, 상기 약제 처리는 혈당, 인슐린 및 콜레스테롤 수준의 어떠한 현저한 변화도 발생시키지 않으며, 이는, 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴이 FXR을 통해 혈청내 혈당, 인슐린 및 콜레스테롤을 조절한다는 것을 시사한다. 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴은 고밀도 지단백질 중의 콜레스테롤 수준을 현저하게 하향조절하는 것 뿐만 아니라, 저밀도 및 극저밀도 지단백질 중의 콜레스테롤 수준을 하향조절하는 것도 포함하여, 마우스에서의 혈청 콜레스테롤 수준을 하향조절한다(도 8 및 9). 추가로, 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴은 또한 야생형 마우스에서 혈청 트리글리세라이드(Tg) 수준을 현저하게 감소시킨다(도 10). 중요하게는, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴으로 처리된 마우스의 체내 부고환 주위 지방의 비중량이 또한 현저하게 감소하며(도 10), 이는 비만에 대한 이들의 치료 효과를 시사한다. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제의 활성의 검출(도 11)은, 이베르멕틴은 트랜스아미나제 활성에 영향을 주지 않는다는 것을 시사한다. 이베르멕틴으로 처리된 마우스의 간을 파라핀으로 매립하고, 절편화하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하는데(도 12), 이는, 이베르멕틴은 간 세포에 대한 손상을 야기하지 않는다는 것을 나타낸다.

리간드 약제들로 처리된 마우스의 간내 당류, 지질 및 콜레스테롤 대사와 관련된 유전자의 발현을 형광 정량 실시간 PCR에 의해 검출한다. 상기 결과들은, 당류, 지질 및 콜레스테롤 대사와 관련된 유전자의 발현 조절과 일관되게, 이베르멕틴은 혈당, 혈중 지질 및 콜레스테롤을 감소시키는 생리학적 기능을 달성할 수 있음을 시사하며(도 13), 이는, 이베르멕틴은 FXR을 통해 대사 관련 유전자의 발현을 조절하여 생리학적 기능의 조절을 달성할 수 있음을 시사한다. 이들 결과들은, 이베르멕틴은 FXR의 특이적 리간드라는 것을 시사하며, 또한 생체내 이베르멕틴에 의한 생리학적 기능의 조절은 FXR을 통해 달성됨을 입증한다.

실시예 5. 당뇨병 마우스 모델에서의 아바멕틴 / 아베르멕틴 , 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴의 효과

FXR의 리간드로서의 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴은 정상적인 마우스의 체내 대사 조절에서 중요한 역할을 할 수 있으며, 따라서 문제는, 이들이 병리학적 마우스에서 개선된 치료 효과를 가질 수 있는가이다. 당뇨병 및 비만 마우스 모델의 체내 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴 및 유도체 도라멕틴의 효능을 검출하기 위해, 본 발명자들은 당뇨병 및 비만 마우스 모델의 마우스, KK-Ay 마우스를 실험 대상으로서 선택하였다. 이러한 마우스는 약 8주 내지 12주에 현저한 고혈당증 및 비만 증상들을 나타낼 수 있다. 상기 실험에서, 9 내지 10주령의 KK-Ay 마우스를 사용하여 고지방식을 공급하고 14일 동안 약제들의 복강내 주사를 수행하였는데, 마우스의 먹이 섭취가 영향을 받지 않는 경우(도 14), 이베르멕틴 및 GW4064는 둘 다 혈청 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 유리 지방산의 함량을 현저하게 감소시킨 반면(도 16); 혈당 측면에서, 이베르멕틴은 혈청 당류 및 인슐린의 수준을 현저하게 감소시켰으며, 이는, 이베르멕틴은 인슐린 감도의 증가를 통해 혈당을 감소시키는 효과를 달성할 수 있고, 이러한 측면에서 이베르멕틴은 FXR의 리간드로서의 기능에 있어서 GW4064보다 훨씬 우월하다는 것을 시사한다(도 15). 추가로, 이베르멕틴 처리는 KK-Ay 마우스의 체중을 현저하게 감소시켰는데, 이 또한 GW4064에 비해 명백한 우월성을 나타낸다(도 14). 이들 결과는, 이베르멕틴은 혈당, 혈액 지질 및 콜레스테롤을 평형화시키고 당뇨병 및 비만 모델 마우스에서 체중 증가를 억제하는 데 우수한 효과를 가지며, 합성 리간드 GW4064에 비해 우월한 기능 및 치료 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴의 동일한 실험을 KK-Ay 마우스에서 수행하였으며, 마우스의 먹이 섭취가 영향을 받지 않는 경우(도 17), 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴은 또한 KK-Ay 마우스의 혈청내 포도당의 수준(도 17), 고밀도 지단백질 및 저밀도/극저밀도 지단백질 중의 콜레스테롤, 및 트리글리세라이드의 수준(도 18)을 현저하게 감소시킬 수 있고, 비만을 갖는 마우스의 상대적 체중을 현저하게 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 17). 이들 데이터는, 이베르멕틴 및 이의 유도체들은 당뇨병 및 비만을 위한 우수한 치료 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

실시예 6. 이베르멕틴은 FXR 의 매개를 통해 LPS 유도된 염증 반응을 억제한다

최근, 이베르멕틴은 LPS 유도된 염증 반응을 억제할 수 있고, 과잉의 LPS에 의해 유도된 마우스의 사망율을 감소시킬 수 있음을 시사하는 몇몇 보고가 있다. 한편, 이베르멕틴은 알러지성 천식의 치료를 위한 현저한 치료 효과를 갖지만, 특정한 작용 메커니즘은 명백하지 않다. 이베르멕틴 및 LPS를 사용하여 야생형 마우스 및 FXR 넉아웃 마우스의 간 세포를 처리한다. 야생형 마우스의 간 세포에서, 이베르멕틴은 염증 인자들, 예를 들면, iNOS, TNFa, IL-6 및 MIP-1a의 발현을 명백하게 억제할 수 있지만(도 19), FXR 넉아웃 마우스의 간 세포에서는 뚜렷한 변화가 관찰되지 않는다. 상기 결과는, 이베르멕틴에 의한 LPS 유도된 염증 반응의 억제는 FXR을 통해 달성된다는 것을 시사한다.

실시예 7. FXR / 이베르멕틴 복합체의 구조에 기초한 이베르멕틴 유도체의 약제 디자인

상기 실시예로부터, 이베르멕틴은 항기생충제의 기능과는 완전히 상이한 기능을 가지며, 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 치료하기 위한 신규한 용도를 갖는다는 것을 알 수 있다. 또한, FXR이 이베르멕틴에 결합하는 상기 분해된 3차원 결정 구조 패턴(부록 1)에 따라, 안전 유도 화합물로서의 이베르멕틴, 약물 디자인 템플레이트로서의 이베르멕틴의 분자 구조를 사용하여, 이베르멕틴과 FXR의 결합 부위들 및 지지체로서의 이의 구조-기능 상관관계에 대하여, 이베르멕틴 중의 몇몇 그룹들을 적합하게 개질시키고, 이에 의해 가능하게는 리간드와 수용체 사이의 결합 친화도 및 특이도를 개선시키고, 최적의 효능을 달성하여, 최소 리간드 약제의 양으로 최적의 약제학적 치료 효과를 달성하고, 세포 및 유기체 신체에 대한 약제의 독성을 감소시킨다. 이베르멕틴의 구조식은 다음과 같다:

상기 구조식을 구조 기반으로 사용하여, 상기 구조식에서 C3-C4, C8-C9, C10-C11, 및 C14-C15의 탄소-탄소 이중 결합들을 개질시키고; C5, C7 및 C4" 위치의 하이드록실 그룹들을 개질시키고; C4, C12, C14, C24 및 C25 위치의 측쇄들을 개질시키고; C13 위치의 글리코실을 가수분해하고, 다른 그룹들을 예를 들면 치환을 통해 개질시킨다. 위에 언급된 임의의 단일 개질 및 각종 개질들의 조합은 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들의 치료에 있어서 적용 가치를 가질 수 있다. 상기 디자인 원리에 따르면, 아바멕틴/아베르멕틴, 도라멕틴 등도 또한 상기 원리에 부합하는 유도체들이며, 상기 마우스 실험은, 이들 화합물들은 또한 포유동물에서 당류 및 지질 대사에서의 우수한 조절 기능 및 치료 효과를 갖는다는 것을 입증한다.

산업상 이용 가능성

본 발명은, 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 및 비만과 같은 포유동물의 대사 관련 질환들, 및 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암과 같은 파르네소이드 X 수용체 매개된 질환들을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 아바멕틴/아베르멕틴, 이베르멕틴, 도라멕틴 및 기타 유도체들 또는 상기 화합물들 중 어느 하나를 함유하는 조성물의 용도를 제공한다.

출원일 이전의 본 발명과 관련된 참조 문헌

1. 중국 특허 CN 제1933856호

2. 중국 특허 CN 제1777433호

부록 1

Claims

파르네소이드 X 수용체(FXR: Farnesoid X receptor)의 활성을 조절하기 위한 화합물 또는 조성물의 제조에 있어서의 이베르멕틴 및 이의 유도체의 용도로서, 상기 이베르멕틴은 하기 구조식을 갖는, 이베르멕틴 및 이의 유도체의 용도.
구조식 I
제1항에 있어서, 상기 유도체 또는 구조적 유사체는 구조식 II의 화합물의 구조를 갖는 아바멕틴/아베르멕틴임을 특징으로 하는, 이베르멕틴 및 이의 유도체의 용도.
구조식 II
제1항에 있어서, 상기 유도체는 구조식 III의 화합물의 구조를 갖는 도라멕틴임을 특징으로 하는, 이베르멕틴 및 이의 유도체의 용도.
구조식 III
제1항 또는 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물은 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴의 유도체들을 포함함을 특징으로 하는, 용도.
제1항 또는 제2항 또는 제3항에 있어서, 대사 관련 질환들, 담즙정체, 담석증, 비알코올성 지방간, 죽상동맥경화증, 염증 및 암을 포함하는 파르네소이드 X 수용체 관련된 질환들을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 상기 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴의 용도임을 특징으로 하는, 용도.
제1항 또는 제2항 또는 제3항에 있어서, 포유동물의 대사 관련 질환들을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 용도임을 특징으로 하는, 용도.
제6항에 있어서, 상기 대사 관련 질환들은 고혈당증, 인슐린 저항증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 또는 비만을 포함함을 특징으로 하는, 용도.
제6항에 있어서, 상기 대사 관련 질환들은 당대사 관련 질환들을 포함함을 특징으로 하는, 용도.
제6항에 있어서, 상기 대사 관련 질환들은 지질 대사 관련 질환들을 포함함을 특징으로 하는, 용도.
제5항 내지 제9항에 있어서, 상기 유도체들은 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴에 기초하여 디자인되고 합성된 신규한 유도체들임을 특징으로 하는, 용도.
제10항의 신규한 유도체들을 디자인하고 합성하는 방법으로서, 구체적으로는, 상기 방법에서, 이베르멕틴, 아바멕틴/아베르멕틴 및 도라멕틴의 구조식을 구조 기반으로 사용하여, 상기 구조식에서 C3-C4, C8-C9, C10-C11, C14-C15, 및 C22-C23의 탄소-탄소 이중 결합들을 개질(modification)시키고; C5, C7 및 C4" 위치의 하이드록실 그룹들을 개질시키고; C4, C12, C14, C24 및 C25 위치의 측쇄들을 개질시키고; C13 위치의 글리코실을 가수분해하고, 다른 그룹들을 치환을 통해 개질시킴을 특징으로 하는, 제10항의 신규한 유도체들을 디자인하고 합성하는 방법.
제10항의 신규한 유도체들을 디자인하고 합성하는 방법으로서, 구체적으로는, 상기 신규한 유도체들을 높은 친화도로 파르네소이드 X 수용체에 특이적으로 결합시킴으로써 디자인하고 합성함을 특징으로 하는, 제10항의 신규한 유도체들을 디자인하고 합성하는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 언급된 임의의 단일 개질 및 각종 개질들의 조합을 포함함을 특징으로 하는, 신규한 유도체들을 디자인하고 합성하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제3항 및 제10항 내지 제12항의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 포함함을 특징으로 하는, 용도.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제3항 및 제10항 내지 제12항의 화합물의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함함을 특징으로 하는, 용도.