JP2015534954A

JP2015534954A - イベルメクチンおよびその誘導体の使用

Info

Publication number: JP2015534954A
Application number: JP2015537115A
Authority: JP
Inventors: リー、ヨン; ジン、リファ; フォン、シューホイ
Original assignee: ロイヴァントヘパトロジーリミテッド
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-12-07
Also published as: RU2015118579A; AU2013330877A1; EP2918274A1; CA2889047A1; CN103356687B; US10052340B2; BR112015008908A2; CN103356687A; MX2015004884A; CN105473148A; KR20150081433A; CN102872066B; US20150306123A1; WO2014059797A1; CN102872066A

Abstract

【解決手段】本発明は、イベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、ドラメクチンなどの駆虫剤の新しい使用、および前記新しい使用に向けた前記誘導体のデザイン法に関する。マクロライドのアバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、ドラメクチン、およびその誘導体を含む前記化合物は、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、肥満などの哺乳類の代謝関連疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患の治療に用いる薬物の製造に利用することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、駆虫剤と比較し、イベルメクチン、ドラメクチン、およびアバメクチン／アベルメクチン、およびその誘導体など、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の有効な新規リガンドの新しい使用、および前記新しい使用に向けて前記誘導体をデザインおよび最適化する方法に関する。

核内受容体はリガンドで活性化される転写因子である。ＦＸＲはヒトにおいて非常に重要な４８核内受容体の中の１つであり、代謝、炎症、腫瘍などの重篤な疾患、および関連生理的機能の制御において重要な役割を果たす。ＦＸＲリガンドを介した薬理作用の原理は、前記リガンドがＦＸＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合することで、下流の標的遺伝子を制御する様々な活性化補助因子（または補抑制体）を動員することである。体内では、胆汁酸がＦＸＲの内因性リガンドであり、ＦＸＲの活性化により、肝臓および小腸における正常な胆汁酸の循環と恒常性を維持することができ、その一方で、サッカライド、脂質、およびコレステロール値を制御することができる。ＦＸＲは代謝に関係する多数のシグナル経路に関与し、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、肥満、胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、およびアテローム性動脈硬化症などの代謝性疾患治療薬の注目すべき標的分子となった。最近、ＦＸＲが肝臓の再生を制御する可能性があり、マウスでＦＸＲをノックアウトすると、肝臓癌が発症する可能性があることが分かった。ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡと略される）は胆汁酸の一種であり、ＦＸＲに結合、これを活性化し、胆石の治療に利用できる可能性がある。ＦＸＲに結合することができるリガンドの中で、ＣＤＣＡは臨床的に使用されている唯一の薬物である。しかし、ＣＤＣＡのＦＸＲに対する親和性はＦＸＲの合成リガンドであるＧＷ４０６４よりもはるかに低く、さらに、ＣＤＣＡは胆汁酸結合タンパク質（Ｉ−ＢＡＢＰ）、胆汁酸トランスポーターなどのタンパク質にも結合するため、ＣＤＣＡはＦＸＲを特異的に標的とする薬物ではない。既存の薬物の約１３％が核内受容体を標的としており、ＦＸＲが制御する重要な生理作用に基づき、ＦＸＲを標的とする新規リガンド薬物をスクリーニングし、そのリガンド薬物を最適化、デザイン、および開発することには重要な応用上の価値がある。

イベルメクチンおよびドラメクチンは、放線菌が産生するマクロライドのアバメクチン／アベルメクチン誘導体であり、非常に効果が高く、広域スペクトルの抗寄生虫作用を有し、イベルメクチン、ドラメクチン、およびアバメクチン／アベルメクチンは主に家畜の寄生虫管理とヒトのフィラリア感染治療に利用されている。無脊椎動物におけるイベルメクチンの標的は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体およびグルタミン酸塩素イオンチャネル型受容体（ＧｌｕＣｌＲ）などの受容体であると指摘した報告は複数ある。しかし、哺乳類において、高い親和性および特異性でアバメクチン／アベルメクチンおよびその誘導体の標的があることを示した報告は、まだ今のところない。

本発明の目的は、イベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチン、およびその誘導体の使用を提供することである。

（構造式Ｉで示される）前記イベルメクチンは、放線菌が産生するマクロライドのアバメクチン／アベルメクチン誘導体であり、非常に効果が高く、広域スペクトルの抗寄生虫作用を有し、主に家畜の寄生虫管理とヒトのフィラリア感染治療に利用されている。

前記イベルメクチンは、前記抗寄生虫作用とは全く異なる新しい機能を有する。前記機能は、ファルネソイドＸ受容体が、イベルメクチンが哺乳類で特異的に結合する標的タンパク質であることが初めて提案されたことで特徴付けられる。イベルメクチンはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）に高い親和性で結合し、哺乳類の血清サッカライド、脂質、およびコレステロール代謝を制御し、糖尿病動物モデルの血清サッカライド、脂質、およびコレステロール値を効果的に低下させ、対応する症状を改善する。イベルメクチンはファルネソイドＸ受容体を介して炎症反応も抑制することができる。したがって、イベルメクチンおよびその誘導体は、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満などの哺乳類の代謝関連疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患の治療薬を調製する上で、応用上の見込みが高い。

アバメクチン／アベルメクチン（構造式ＩＩ）およびドラメクチン（構造式ＩＩＩ）などの前記イベルメクチン誘導体または類似体は、イベルメクチンと類似の性質および使用を有する。

アバメクチン／アベルメクチンはイベルメクチンの構造式のＣ２２−Ｃ２３位に二重結合を有する。我々は、アバメクチン／アベルメクチンが高い親和性でＦＸＲに特異的に結合することができ、ＦＸＲのリガンドでもあり、高脂肪食を与えたマウス血清中のサッカライド、脂質、およびコレステロール値、および精巣上体脂肪体重量を効果的に低下させることができることを見出している。したがって、アバメクチン／アベルメクチンは、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満などの哺乳類の代謝関連疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患の治療に新たに使用することができる。

ドラメクチンはイベルメクチンの構造式のＣ２２−Ｃ２３位に二重結合を有し、Ｃ２５位がベンゼン環側鎖で置換されている。我々は、ドラメクチンが高い親和性でＦＸＲに特異的に結合することができ、ＦＸＲのリガンドでもあり、高脂肪食を与えたマウス血清中のサッカライド、脂質、およびコレステロール値、および精巣上体脂肪体重量を効果的に低下させることができることを見出している。したがって、ドラメクチンは、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満などの哺乳類の代謝関連疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患の治療に新たに使用することができる。

アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体であるドラメクチンの構造および機能について請求されるとおり、ＦＸＲに結合することができるアバメクチン／アベルメクチンおよびイベルメクチンの他の構造類似体または誘導体も、同様の機能および使用を有すると推定することができる。

２０年以上、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体は主に家畜の寄生虫管理とヒトのフィラリア感染治療に利用され、作用機序は、無脊椎動物の神経および筋肉細胞において、これらがグルタミン酸塩素イオンチャネル型受容体に選択的に結合し、筋細胞への神経インパルスの伝達を妨害することで、寄生虫を致命的に麻痺させるか、または体内から駆除する、というものである。イベルメクチンおよびその誘導体はγ−アミノ酪酸受容体にも結合し、同様に機能することができる。しかし、哺乳類にグルタミン酸塩素イオンチャネル型受容体が存在することを示した報告はなく、哺乳類のγ−アミノ酪酸受容体は中枢神経系に存在するに過ぎないが、哺乳類には血液脳関門があり、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体が前記中枢神経系に到達するのを効果的に防いでいる可能性があるため、正常なケースでは、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体は哺乳類における安全係数が高い。アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体は、ヒトにおいて２０年以上臨床に応用されてきたため、ヒトでの安全性は保証されており、本発明では、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体が哺乳類の血清中のサッカライド、脂質、およびコレステロール代謝を効果的に制御でき、動物モデルの血清サッカライド、インスリン、トリグリセリド、およびコレステロール値を効果的に低下できることが分かっており、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体は、例えば糖代謝および脂質代謝などにより、ファルネソイドＸ受容体性疾患を治療する見込みが高い。

本発明は、哺乳類の代謝性疾患など、ファルネソイドＸ受容体関連疾患の治療において、十分にアバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体の新規性、安全性、有効性、高い薬物産生量、低コスト、大きな社会的価値および経済的利益を証明している。さらに、本発明は、Ｘ線結晶回折により原子レベルでイベルメクチンのファルネソイドＸ受容体結合の独特な構造パターンを提供し、安全なリーディング薬物としての小分子および薬物の最適化構造鋳型およびデザイン方法とともに、ファルネソイドＸ受容体を標的としたリガンド薬物デザインを提供する。

ファルネソイドＸ受容体とイベルメクチンが結合した３次元結晶構造に従い（付録１）、構造的基礎としてイベルメクチンの構造式（例えば、構造式Ｉ）を用い、薬物デザイン、薬物合成、薬物スクリーニングの方法を以下の具体的手順で行う：構造的基礎として構造式Ｉを用い、前記構造式のＣ３−Ｃ４、Ｃ８−Ｃ９、Ｃ１０−Ｃ１１、およびＣ１４−Ｃ１５炭素−炭素二重結合を修飾し、Ｃ５、Ｃ７、およびＣ４’’位のヒドロキシル基を修飾し、Ｃ４、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ２４、およびＣ２５位の側鎖を修飾し、Ｃ１３位のグリコシルを加水分解し、他の官能基を置換などにより修飾する。上記の方法は、単一の修飾または上記の様々な修飾の併用を高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満などの哺乳類の代謝関連疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患を調製および治療するために利用できることを特徴とする。

高速大量処理スクリーニングにより得られた駆虫剤のイベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチンは、ＦＸＲの特異的リガンドである。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける形質移入実験のルシフェラーゼレポーター遺伝子活性解析に基づき、分子構造レベルでの受容体とリガンドとの選択的認識について示され；マウスモデルにおけるマウス肝細胞の初代培養により、イベルメクチン投与後の関連標的遺伝子の発現と関連シグナル経路の制御状態が検出され、下流シグナル経路に対する影響が示され；対応するシグナル経路の変化に関連して発病分子メカニズムを示すように、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびドラメクチンを投与したマウスモデルで様々な生化学的指標の変化が検出され；高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、または肥満などの哺乳類における疾患のかかる治療薬の有効性、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、およびアテローム性動脈硬化症などのファルネソイドＸ受容体性代謝関連疾患の治療における使用を決定するように、糖尿病および肥満マウスモデルにアバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびドラメクチンが投与される。炎症反応の治療におけるイベルメクチンの使用については、炎症反応標的遺伝子を制御することで決定する。

同様に、いずれも高脂肪食を与えた野生型マウスとＦＸＲノックアウトマウスに、それぞれアバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびドラメクチンを注射し、これらの誘導体が、野生型マウスの精巣上体脂肪体／体重比、および血清グルコース、トリグリセリド、およびコレステロール値を効果的に低下できることが分かっている。したがって、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満などの哺乳類の疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症などのファルネソイドＸ受容体性疾患の治療において、ＦＸＲを介してアバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびドラメクチンを使用できると判断することができる。

ＦＸＲおよびイベルメクチンは錯体として調製し、前記錯体の結晶化、Ｘ線結晶回折、および構造解析は結晶解析により行うことで、原子レベルでＦＸＲのイベルメクチンへの独特な結合パターンを示し、安全なリーディング薬物小分子と、前記分子構造をテンプレートとして用いた誘導体の薬物デザインおよび合成法を用い、哺乳類において前記疾患の治療用ＦＸＲ標的薬のデザインを提供する。

図１は、ＦＸＲへの結合後、アバメクチン、イベルメクチン、およびドラメクチンによる共調節因子ＳＲＣ１の動員活性を示す。ＧＷ４０６４をＦＸＲ活性化因子の陽性対照として用いている。図２は、０．５μＭのイベルメクチンによるＦＸＲ受容体の特異的転写活性化を示す。ＣＯＳ−７細胞に、ＦＸＲなど異なる核受容体の全長発現プラスミド、および異なる核受容体の対応する内因性結合要素により構成された受容体遺伝子を同時形質移入している。形質移入後、細胞にＤＭＳＯ、０．５μＭのイベルメクチン、または前記核受容体に特異的なアゴニストをそれぞれ処理している。図３は、ＦＸＲタンパク質とイベルメクチンとの結合錯体の結晶回折構造図を示す。ＦＸＲのＬＢＤリガンドポケットに結合しているイベルメクチンを格子構造で示している。ＮＣｏＲ２は、ＦＸＲおよびイベルメクチンと錯体を形成する共調節因子ＮＣｏＲｓの中で、ポリペプチドとＦＸＲの結合配列を示している。図４は、ＦＸＲに結合したイベルメクチンの電子雲図を示す。図５は、イベルメクチンおよびＧＷ４０６４によるＦＸＲの転写活性の活性化が、イベルメクチンと相互作用するＦＸＲの重要なアミノ酸の変異による影響を受けることを示す。ＣＯＳ−７細胞に、全長ＦＸＲ（ｗｔ）を発現した発現プラスミド、または対応する部位の変異およびＥｃＲＥレポーター遺伝子を同時形質移入し、イベルメクチンおよびＧＷ４０６４を処理し、２４時間後に転写活性を検討している。横軸は、野生型ＦＸＲ（ｗｔ）および４つのアミノ酸部位に変異を持つＦＸＲ変異型を示す。図６は、アバメクチンおよびドラメクチンは野生型およびＦＸＲノックアウトマウスの食餌摂取量に影響しないが、野生型マウスの血清グルコース値を低下させることを示す。＊＊はｐ<０．０１であることを意味する。図７は、イベルメクチンの投与後、高脂肪食を与えた野生型マウス（ＷＴ）の血清サッカライド、インスリン、およびコレステロール値がそれぞれ低下していることを示す。ＦＸＲノックアウトマウス（ＫＯ）では、これらの指標が薬物投与の影響を受けていない。＊はｐ<０．０５、＊＊はｐ<０．０１であることを意味する。図８は、イベルメクチン投与後、マウス体内のコレステロール値がダウンレギュレートされることを示し、これは高密度リポタンパク質および低密度／超低密度リポタンパク質コレステロールを有する。ＦＸＲノックアウトマウス（ＫＯ）では、これらの指標が薬物投与の影響を受けていない。＊はｐ<０．０５、＊＊はｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<は０．００１であることを意味する。図９は、アバメクチンおよびドラメクチン投与後、高脂肪食を与えた野生型マウスの血清コレステロール値が低下することを示し、これは高密度リポタンパク質および低密度／超低密度リポタンパク質コレステロールを有する。＊はｐ<０．０５、＊＊＊はｐ<０．００１であることを意味する。図１０は、アバメクチンおよびドラメクチンの投与後、高脂肪食を与えた野生型マウスの血清トリグリセリド値および精巣上体脂肪体／体重比が低下することを示す。＊はｐ<０．０５、＊＊＊はｐ<０．００１であることを意味する。図１１は、イベルメクチンを投与した野生型マウスのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ活性に影響がないことを示す。図１２は、イベルメクチンの投与後、野生型マウスの肝組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、イベルメクチンが肝臓を損傷していないことを示す。溶媒は、薬物なしで注射した対照を示す。図１３は、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ法を用い、イベルメクチン投与野生型マウスの肝臓において、ＦＸＲ標的遺伝子およびサッカライド、トリグリセリド、およびコレステロール代謝と関連した遺伝子を検出しているところを示す。＊はｐ<０．０５、＊＊はｐ<０．０１であることを意味する。図１４は、イベルメクチン投与はＫＫ−Ａｙ糖尿病モデルマウスの食餌摂取量に影響しないが、その体重を減少させることを示す。＊はｐ<０．０５であることを意味する。図１５は、イベルメクチンの投与後、ＫＫ−Ａｙマウスの血清グルコースおよびインスリン値が低下していることを示す。＊＊はｐ<０．０１であることを意味する。図１６は、イベルメクチンの投与後、ＫＫ−Ａｙマウスの血清コレステロール、トリグリセリド、および遊離脂肪酸値が低下していることを示す。＊＊はｐ<０．０１であることを意味する。図１７は、アバメクチンおよびドラメクチン投与後、ＫＫ−Ａｙマウスの食餌摂取量に影響がなく、高脂肪食を与えたＫＫ−Ａｙマウスの相対的体重と血清グルコース値が低下していることを示す。＊＊＊はｐ<０．００１であることを意味する。図１８は、アバメクチンおよびドラメクチン投与後、高脂肪食を与えたＫＫ−Ａｙマウスの血清コレステロール値（高密度リポタンパク質および低密度／超低密度リポタンパク質コレステロールを有する）および血清トリグリセリド値が低下していることを示す。＊はｐ<０．０５、＊＊はｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<は０．００１であることを意味する。図１９は、イベルメクチンがＬＰＳにより誘導される炎症反応関連遺伝子（ｉＮＯＳ、ＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびＭＩＰ−１ａを有する）の発現を抑制できることを示す。＊はｐ<０．０５、＊＊はｐ<０．０１であることを意味する。

タンパク質の精製
１．クローニング
（１）ヒトＦＸＲ発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＦＸＲ）を鋳型として、０．５μｌの５０ｍＭフォワードプライマー５’ＧＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣおよび０．５μｌの５０ｍＭリバースプライマー３’ＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＡＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣをプライマーとして用い、４μｌの１０倍ＰＣＲ緩衝液、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、および５Ｕｐｆｕの酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用いたＰＣＲ反応を行い、水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）を用いて最高５０μｌの系を作成し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩの２つの制限酵素消化部位を含むヒトＦＸＲＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）（アミノ酸残基数が２４３〜４７２）のＰＣＲ生成物を得る。ＰＣＲの手順は、９４℃２分、９４℃３０秒、５８℃１分、７２℃１分を３０サイクルと７２℃１０分として行う。

（２）酵素消化はＰＣＲにより得られたＤＮＡフラグメントと原核細胞発現ベクターｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で行い、前記ＰＣＲ生成物とｐＥＴ２４ａベクターはＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化する。前記酵素消化系はＦＸＲＬＢＤＰＣＲ生成物またはｐＥＴ２４ａベクター１μｇ（１０μｌ）、ＢａｍＨＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）０．５μｌ、ＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）０．５μｌ、１０倍酵素消化緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）４μｌ、およびｄｄＨ_２Ｏ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）２５μｌを有する。前記系は３７℃で１．５時間インキュベートする。前記消化されたＰＣＲ生成物およびｐＥＴ２４ａベクターはＳＹＢＲＤＮＡ色素を用いた１％アガロースゲルで分離し、ＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａゲル抽出キットにより回収する。

（３）回収したフラグメントとベクターはモル比３：１で連結する。前記連結系はＦＸＲＬＢＤＤＮＡフラグメント２μｌ、ｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクター２μｌ、５倍連結緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μｌ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μｌを有し、ｄｄＨ_２Ｏにより最高１０μｌとする。前記系は室温で３０分反応させる。

（４）前記連結生成物２μｌを５０μｌのＴｒａｎｓ１０９適格細胞に形質転換し、３０分間氷浴に入れた後、４２℃で３０秒間熱ショックをかける。抗生剤を含まない２５０μｌのＬＢ液体培地を加え、２２５ｒｐｍ、３７℃で４０分間予め振盪した後、１５０μｌの形質転換生成物を採取し、これを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともにＬＢ固形培地プレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。翌日、コロニー１つを選び、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に入れ、３７℃で１０時間振盪培養する。

（５）ＱｉａｇｅｎＭｉｎｉＰｒｅｐＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔを用い、前記振盪した細菌液でプラスミドを抽出する。

（６）前記抽出したプラスミドは酵素消化により同定する。前記酵素消化同定系は、プラスミド１μｇ（２μｌ）、ＢａｍＨＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）０．５μｌ、ＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）０．５μｌ、１０倍酵素消化緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）２μｌ、およびｄｄＨ_２Ｏ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）１５μｌを有する。前記発現ベクターへの標的フラグメントの挿入が成功したかを判断するため、前記系は３７℃で３０分間、インキューベーター中で酵素消化反応を行い、１％アガロースゲルで検出する。最後に、得られたプラスミドを配列決定により同定する。ヘキサヒスチジン標識したヒト核受容体ＦＸＲＬＢＤの発現プラスミドが得られ、ｐＥＴ２４ａ−Ｈｉｓ６−ＦＸＲＬＢＤと表記する。

２．標的タンパク質の発現と精製
（１）形質転換。ｐＥＴ２４ａ−Ｈｉｓ６−ＦＸＲＬＢＤはＢＬ２１（ＤＥ３）適格細胞に形質転換する。プラスミド１μｌを取り、５０μｌのＢＬ２１適格細胞に形質転換し、３０分間氷浴に入れた後、４２℃で３０秒間、水浴で熱ショックをかける。抗生剤を含まない２５０μｌのＬＢ液体培地を加え、２２５ｒｐｍ、３７℃で４０分間予め振盪した後、１５μｌの生成物を採取し、これを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともにＬＢ固形培地プレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。

（２）培地の振盪。翌日、コロニー１つを選び、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ液体培地に入れ、３７℃で８時間予め振盪し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１．５ｌのＬＢ液体培地に移し、ＯＤ_６００がおよそ１．０に達した時点で、０．１ｍＭＩＰＴＧを加え、１６℃の低温で発現を誘導する。

（３）誘導された標的タンパク質を含む細菌細胞を回収する。一晩で誘導および発現された細菌液１．５ｌを３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心分離して前記細菌を回収し、前記細菌液は１００ｍｌの精製緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、２５ｍＭイミダゾール）で再懸濁し、−８０℃で凍結保存する。

（４）タンパク質の抽出。ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＳｏｎｉｃＤｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ超音波細胞破壊器を用い、振動幅６０％、５秒運転、１０秒休憩の頻度で１０分間、超音波処理を行う。生成物は２０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した後、上清を採取する。

（５）タンパク質の精製。前記上清を５ｍｌのニッケルイオン交換カラム（ＮｉＳＯ４−ｌｏａｄｅｄＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、前記ニッケルカラムに標的タンパク質を充填させる。ＧＥＣｏ．のＡＫＴＡタンパク質精製系とＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアを操作に用いる。ポンプの洗浄：ポンプは最初に水、次に緩衝液で洗う。操作方法：ＳｙｓｔｅｍＣｏｎｔｒｏｌウインドウでＭａｎｕａｌ→Ｐｕｍｐ→Ｐｕｍｐｗａｓｈｂａｓｉｃ→ＰｕｍｐＡとし、続いてＰｕｍｐＢ→Ｏｎ→Ｅｘｃｕｔｅを選択する。クロマトグラフィーカラムの連結：まずシステムポンプを運転し、溶液が流れ出てきたら、クロマトグラフィーカラムを系に動的に連結し、流出したタンパク質のピーク値をＵＶで検出できるようにし、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアを開いてタンパク質溶出の手順を編集する：２０ｍｌの溶出緩衝液でカラムを平衡化し；２５〜５００ｍＭの勾配でイミダゾールを用いてカラムに競合的に結合させることで標的タンパク質を溶出させ；１５ｍｌの緩衝液でカラムを平衡化する。タンパク質の溶出：カラム上のタンパク質は、溶出緩衝液ＡおよびＢ（溶出緩衝液Ａの成分：２５ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、および１０％グリセリン、ｐＨ７．５、溶出緩衝液Ｂの成分：２５ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭイミダゾール、および１０％グリセリン、ｐＨ７．５）により勾配溶離にかけ、イミダゾールと同様の構造でヒスチジン標識を含む標的タンパク質は、イミダゾールの濃度勾配を２５〜５００ｍＭで変化させて管理することで、適切な濃度で競合させて溶出することができる。ニッケルイオン交換カラムから溶出した標的タンパク質溶液は、Ｈｉｌｏａｄ２６分子篩クロマトグラフィーカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、異なる分子量で請求される通り、標的タンパク質をさらに精製し、手順は以下の通りとする：ニッケルカラムから回収したタンパク質溶液をＡＫＴＡサンプル充填リングにシリンジで注入した後、上記と同じ方法でプログラムを実行開始する。前記タンパク質溶出緩衝液は、１０ｍＭＮａＣｌを含む溶出緩衝液Ｃに変更する（溶出緩衝液Ｃ：２５ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）。

（６）タンパク質錯体の調製。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔおよびＦＸＲＬＢＤタンパク質から生産した合成ＮｃｏＲ２ポリペプチド（ＰＡＳＮＬＧＬＥＤＩＩＲＫＡＬＭＧＳ）は、以下の通り錯体の調製に使用する：分子篩クロマトグラフィーから得られたタンパク質２０ｍｌ、ＮｃｏＲ２ポリペプチド、およびイベルメクチンを１：１：１のモル比で混合し、１０ｋＤのＭＩＬＬＩＰＯＲＥ１５ｍｌ濃縮試験管に加え、濃縮し、４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離をかけ、濃縮し、前記タンパク質を最終濃度１０ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮する。

３．タンパク質の結晶化、結晶データの収集、および構造解析
水滴法により結晶化スクリーニングを行い、ＦＸＲ／イベルメクチン／ＮｃｏＲ２錯体を室温の条件とし、水滴法の成分は上述のタンパク質ポリペプチドリガンド錯体溶液１．０μｌと結晶化緩衝液１．０μｌ（５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．０、３．５Ｍギ酸ナトリウム）の混合物とする。十分に成長した結晶を液体窒素で急速に凍結保存する。上海放射光施設のＢＬ１７Ｕ１ラインステーションでデータを得る。Ｘ線による放射線処理後、得られた回折データをＨＫＬ２０００ソフトウェアで処理し、各非対称ユニットが２つの分子を有するようにし、結晶空間群はＩ２１２１２１（ａ＝５３．０１、ｂ＝１６１．７６、ｃ＝１６９．０２、α＝９０°、β＝９０°、およびγ＝９０°）、空間構造解析はＭｏｌｒｅｐ、Ｐｈａｓｅｒなどを用い、ＣＣＰ４ソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｐ４．ａｃ．ｕｋ）にて行い、これにより、一般構造モデルを分子置換を通して決定することができ、Ｃｏｏｔの人工モデルの微細構成およびＲＥＦＭＡＣとｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅによりさらに修正を数サイクル行うことで、最終的なタンパク質錯体構造を得ることができ、この構造モデルのＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅはそれぞれ２５．４％および２８．２％、分解能は２．８１Åである。具体的な３次元結晶構造の空間要素は、付録１で参照することができる。

４．補因子結合実験
核受容体を誘導して様々なタイプの共調節因子を動員するために利用されるリガンドの結合能は、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ解析法により、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎニッケルキレート検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出する。この実験の反応系５０μｌは、２０ｎＭの融合ヒスチジン標識受容体ＬＢＤタンパク質、２０ｎＭビオチン標識補因子ポリペプチド、ドナー、および受容体ビーズ（５μｇ／ｍｌ）、および緩衝液（５０ｍＭＭＯＰＳ、５０ｍＭＮａＦ、０．０５ｍＭＣＨＡＰＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）を有し、前記反応系は室温で１時間、３８４ウェルプレート中で反応させた後、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ検出器を用い、６８０ｎｍの励起光および５２０〜６２０ｎｍの放射限度でシグナルを読む。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ解析でのビオチン標識ポリペプチドはＳＲＣ１−２、その配列はＳＰＳＳＨＳＳＬＴＥＲＨＫＩＬＨＲＬＬＱＥＧＳＰである。

５．一時的形質移入実験
１．プラスミド：
（１）ＦＸＲ全長プラスミド：ヒトＦＸＲ全長ｃＤＮＡ発現配列を、古典的なクローニング法によりｐＣＭＸ発現ベクターにクローニングする。

（２）重要な結合部位に点突然変異があるＦＸＲの発現ベクターを得る。Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を突然変異に利用し、突然変異反応系は、野生型プラスミドｐＣＭＸ−ＦＸＲ（５０ｎｇ）０．５μｌ、変異プライマー（１００μＭ）０．２μｌ、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（２Ｕ）１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、１０倍ＰＣＲ緩衝液５μｌ、ｄｄＨ_２Ｏ４３μｌとする。ＰＣＲの手順は、９４℃２分、９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃７分を１５サイクルとして行う。２０μｌのＰＣＲ生成物をＤｐｎＩメチラーゼで消化した後、２μｌの消化生成物を採取、大腸菌Ｔｒａｎｓ１０９適格細胞に形質転換し、氷浴に３０分、４２℃で３０秒間熱ショックをかける。抗生剤を含まない２５０μｌのＬＢ液体培地を加え、２２５ｒｐｍ、３７℃で４０分間予め振盪した後、１５０μｌの生成物を採取し、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとともにＬＢ固形培地プレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。翌日、コロニー１つを選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ液体培地に入れ、３７℃で一晩培養する。ＱｉａｇｅｎＭｉｎｉＰｒｅｐＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔを用い、前記振盪した細菌液でプラスミドを抽出する。プラスミドを配列決定により同定する。

２．形質移入：
サル腎臓上皮細胞のＣＯＳ−７細胞の培養に１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を用い、形質移入の前日、ＣＯＳ−７細胞を２４ウェルプレートに播種し（播種密度は５×１０^４細胞／ウェル）、翌日、形質移入する。形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一時的に行う。レポーター遺伝子の解析実験では、２００ｎｇの核受容体全長発現プラスミドまたはその変異体の発現プラスミド、２００ｎｇの内在性プロモーターレポーター遺伝子、および３０ｎｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発現プラスミドを同時形質移入に用いる。５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを各ウェルに加え、５時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで希釈したリガンド薬物を加えて対応する濃度とし、１８時間処理する。使用する様々な核受容体および対応するレポーター遺伝子は、ヒトＦＸＲ、ＥｃＲＥ−Ｌｕｃ；ヒトＰＰＡＲｓ（α、β、およびγ）、ＰＰＲＥ−Ｌｕｃ；ヒトＲＯＲｓ（α、β、およびγ）、Ｐｃｐ２／ＲＯＲＥ−Ｌｕｃ；ヒトＧＲ、およびＰＲ、ＭＭＴＶ−Ｌｕｃ；ヒトＲＡＲαおよびＲＡＲβ、およびβＲＥ−Ｌｕｃである。

３．受容体遺伝子の解析：
前記形質移入後４〜６時間にて、前記形質移入法で処理した細胞にリガンド薬物を追加し、レポーター遺伝子解析の全イベルメクチン濃度は、前記実施例では０．５μＭである。図２では、各核受容体に特異的なリガンドおよびその濃度が、ＦＸＲ、０．５μＭＧＷ４０６４；ＰＰＡＲα、１μＭＧＷ５９０７３５；ＰＰＡＲδ、１μＭＧＷ０４７２；ＰＰＡＲγ、１μＭロシグリタゾン；グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、０．１μＭデキサメタゾン；プロゲステロン受容体（ＰＲ）、０．１μＭプロゲステロン；ＲＡＲおよびＲＡＲβ、１μＭオールトランス型レチノイン酸；ＰＸＲ、１０μＭリファンピシン；ＣＡＲ、５μＭＣＩＴＣＯ（（６−（４−クロロフェニル）イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール−５−ホルムアルデヒド−Ｏ−（３，４−ジクロロベンジル）エチルケトキシム）である。前記リガンド薬物を１８時間処理後、ＰｒｏｍｅｇａＣｏのダブルルシフェラーゼレポーター遺伝子解析キットを用い、前記レポーター遺伝子の活性解析を行う。ルシフェラーゼ検出実験用に細胞を溶解し、溶解した細胞１０μｌを９６ウェルプレートに移し、ルシフェラーゼ反応液５０μｌを加えた後、ＥｎＳｐｉｒｅ（商標）２３００ＭｕｌｔｉｍｏｄｅＲｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて５６０ｎｍの発光シグナルを検出し、前記ルシフェラーゼの反応を停止させるためにＳｔｏｐ & Ｇｌｏ（登録商標）反応液を加え、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を検出する。ウミシイタケ活性をレポーター遺伝子活性の内部標準として用いる。

６．マウス試験
９〜１０週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと、背景が同一のＦＸＲ遺伝子欠失ホモ接合性マウス（ＦＸＲ−／−）および糖尿病および肥満マウスモデルのマウス（ＫＫ−Ａｙ）を使用し、厦門大学の実験動物施設にあるＳＰＦ級飼育室で高脂肪食（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ、Ｄ１２４９２）を給餌し、水は自由に摂取させる。マウスは、対照群、イベルメクチンまたはその誘導体投与群、および／またはＧＷ４０６４投与群に分け、対照溶液（４０％ＨＢＣ（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン））、対照溶液で希釈したイベルメクチンまたはその誘導体（注入量は薬物重量／マウス体重で計算すると１．３ｍｇ／ｋｇ）、および対照溶液で希釈したＧＷ４０６４（３０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ腹腔内注射する。腹腔内注射は毎朝９時に１回行い、１４日間継続し、２日ごとにマウスの体重と食餌摂取量を測定する。１４日目の最後にマウスに自由に水を摂取させ、６時間飢餓状態とした後、マウスの体重を測定、注射試験処置前の初期体重と比較した最終体重の割合がマウスの体重変化を示している。次に、眼球から採血を行い、血清を分取する。血清の成分は、それぞれ糖−オキシダーゼ法（ＢｅｉｊｉｎｇＡｐｐｌｙｇｅｎ）；インスリン（ＣｒｙｓｔａｌＣｈｅｍ．Ｉｎｃ．、米国）；総コレステロールおよび高／低密度リポタンパク質コレステロール（ＢｉｏａｓｓａｙＳｙｓｔｅｍｓ、米国）；トリグリセリド（ＢｅｉｊｉｎｇＡｐｐｌｙｇｅｎおよび和光純薬工業、日本）；遊離脂肪酸（ＢｉｏａｓｓａｙＳｙｓｔｅｍｓ、米国）；およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏｓｉｎｏＢｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．、中国北京）のキットにより検出する。マウス肝臓を採取し、その一部をパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色し、また一部を蛍光定量ＰＣＲにより遺伝子発現測定用のＲＮＡ抽出に使用するため、液体窒素で凍結保存する。

７．蛍光定量ＰＣＲによる遺伝子発現の測定
肝組織は対照（４０％ＨＢＣ）またはイベルメクチンを投与した野生型マウス、およびＦＸＲノックアウトマウスモデルから、また対照、ＧＷ４０６４、またはイベルメクチンを投与したＫＫ−Ａｙマウスモデルから採取し、次に−８０℃の冷凍庫で凍結保存する。ＲＮＡ抽出キット（ＯｍｅｇａＢｉｏ−Ｔｅｋ、ＧＡ）を用い、組織から全ＲＮＡを抽出する。ＴＡＫＡＲＡ逆転写キットを用いて逆転写を行い、ＣＦＸ（商標）９６（ＢＩＯ−ＲＡＤ）リアルタイムモニタリングシステムとＳＹＢＲ緑色蛍光色素を用いて蛍光定量ＰＣＲを行い、遺伝子発現レベルを分析できるようにする。アクチン遺伝子の発現レベルを結果の内部標準として用いる。反応系はＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（２×）１２．５μｌ、ＰＣＲフォワードプライマー（１０μＭ）１μｌ、ＰＣＲリバースプライマー（１０μＭ）１μｌ、ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、および滅菌蒸留水８．５μｌを有し、全量を２５μｌとする。２段階増幅ＰＣＲ法は、変性前に９５℃３０秒、ＰＣＲ反応は９５℃５秒、６０℃４０秒とし、４０サイクル行う。

特定の実施例を以下に提供する。

イベルメクチンは、高い親和性と高い特異性を持つ新規ＦＸＲリガンドであることが証明されている。

リガンドはＦＸＲを誘導し、ＦＸＲ結合後に共調節因子を動員することができるため、ＦＸＲに対する親和性を検査することができる。ＦＸＲの特異的リガンドはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎによりスクリーニングし、イベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチンのＦＸＲに対する親和性が合成ＧＷ４０６４の親和性とは１桁未満異なることが分かり、ＧＷ４０６４のＦＸＲに対する親和性の５０％効果濃度（ＥＣ５０）は１４０ｎＭであり、この実験におけるイベルメクチン、ドラメクチン、およびアバメクチン／アベルメクチンのＥＣ５０はそれぞれ４００ｎＭ、５００ｎＭ、１．２５μＭである（図１）。イベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチンは非常に高い親和性でＦＸＲに結合することが示唆される。イベルメクチンがＦＸＲに特異的に結合できることを証明するため、我々は、ＦＸＲの内因性レポーター遺伝子ＥｃＲＥとプラスミド発現全長ＦＸＲを用い、ＣＯＳ−７細胞を同時形質移入する。この結果は、検出された異なる核受容体について、イベルメクチンがＦＸＲの転写活性を特異的に活性化させることができ、他の検出された核受容体には作用しないことを示す（図２）。このことは、ＦＸＲリガンドとしてのイベルメクチンの特異性が高いことを示す。

ＦＸＲ／イベルメクチン錯体の結晶構造解析
分子レベルでのイベルメクチンとＦＸＲ間の認識および結合の分子的メカニズムを明らかにするため、ＦＸＲ／イベルメクチンにより形成した錯体および補抑制体ＮＣｏＲの核受容体結合モチーフの結晶構造を解析し、分解能は２．８である（付録１および図３）。前記構造は、イベルメクチンとＦＸＲリガンドの結合ドメインが古典的な「サンドイッチ」構造に一致することを示す。電子雲の図から、イベルメクチンがＦＸＲのリガンド結合ポケットに明らかに存在していることを確認することができる（図４）。前記構造から、イベルメクチンが結合することで、ＦＸＲカルボキシ末端ＡＦ−２の古典的らせん構造が変化していることを確認でき（図３）、これは、ＦＸＲを誘導し、活性化補助因子および補抑制体を動員、結合するという点で、イベルメクチンが合成ＦＸＲリガンドＧＷ４０６４とは異なる機能様式を有し、イベルメクチンが独特の結合様式でＦＸＲの機能を制御している可能性があることを示している。ＦＸＲのイベルメクチンへの結合パターンに関する具体的な情報については、付録１を参照することができる。

ＦＸＲリガンド結合ポケットの独特なイベルメクチン結合部位
イベルメクチンが直接結合することのできるＦＸＲリガンド結合ポケットのアミノ酸部位を検証するため、ＦＸＲ−イベルメクチン錯体の構造に従い、ＦＸＲのイベルメクチンへの結合に重要な部位を点突然変異させ、イベルメクチンのＦＸＲに対する結合に対するこれらの結合部位の重要性を決定するため、前記リガンドにより制御される変異したＦＸＲの転写活性の変化を検出する。

２９１位のアラニン（Ａ）は、ＦＸＲリガンド結合ドメインのサイズを制御する重要な役割を果たす。Ａ２９１をトリプトファン（Ｗ）に変異させると、アラニンよりもはるかに大きいトリプトファンの側鎖官能基が前記リガンド結合ポケットの空間を占めることで、ＦＸＲリガンド結合ポケットが小さくなり、ＦＸＲリガンドの結合に影響するようになる。予想と一致し、レポーター遺伝子の解析実験結果は、Ａ２９１Ｗが変異したことでＧＷ４０６４となり、イベルメクチンはＦＸＲの転写活性を活性化させることができないことを示している（図５）。これは、ＦＸＲの２９１位のアラニン残基がＧＷ４０６４またはイベルメクチンの結合とＦＸＲの転写活性の活性化に非常に重要であることを示している。

疎水性鎖２８４位のフェニルアラニン（Ｆ）は、それぞれＧＷ４０６４およびイベルメクチンと疎水性相互作用を形成することができ、前記リガンドと受容体の結合を安定化させる。Ｆ２８４がヒスチジン（Ｈ）に変異すると、これら２種類の疎水性相互作用が消失する。しかし、他の態様では、ＧＷ４０６４についてヒスチジンへの変異後、ヒスチジン側鎖がＧＷ４０６４と塩素による結合相互作用を形成する可能性があるため、疎水性相互作用が消失することで、イベルメクチンがＦＸＲの転写活性を活性化することができなくなるが、ＧＷ４０６４の活性化能力に影響はない（図５）。これは、イベルメクチンのＦＸＲリガンド結合ポケットへの結合パターンが独特であり、ＧＷ４０６４とは異なっていることを示している。

さらに、Ｌ２８７ＴおよびＨ４４７Ｆの変異はＧＷ４０６４を介したＦＸＲの転写活性を有意に低下させるが、イベルメクチンによるＦＸＲ転写活性の活性化を有意に亢進させる（図５）。これも、ＧＷ４０６４とイベルメクチンはＦＸＲに対する結合様式が大きく異なっていることを示しており、ＦＸＲ機能の制御も大幅に異なる。

イベルメクチンは哺乳類のサッカライドおよび脂質の代謝を効果的に制御することができる。

重要な核受容体としてのＦＸＲは、肝臓および小腸における胆汁酸の循環と平衡状態を制御する、胆汁酸の受容体として最初に利用されている。最近、ＦＸＲは微生物のサッカライドおよび脂質の代謝を制御できることが分かった。合成ＦＸＲリガンドのＧＷ４０６４はＦＸＲを介して血中の脂質およびコレステロール値を低下させることができるが、ＧＷ４０６４には細胞毒性と有効性の限界があるため、臨床的には使用できず、さらに、ＧＷ４０６４は高血糖および肥満を軽減することができることを示した報告があるが、同時に、ＧＷ４０６４は体内の血糖値に有意な効果を示さないと提示している論文もあり、ＧＷ４０６４を長期的に摂取すると、マウスでは肥満になると示唆した報告さえある。したがって、ＧＷ４０６４による血糖値の制御については議論されている。ＦＸＲの新規リガンド薬物を見つける方が重要で意味のあることであるかもしれない。

イベルメクチンによるマウスモデルの生理的制御機能を検出するため、野生型およびＦＸＲノックアウトマウスを用い、試験を行う。高脂肪食を与えたマウスに腹腔内注射を行った後、特定の実施形態で説明したとおり、２週間、対照薬、イベルメクチン、またはその誘導体を使用し、前記薬物がマウスの食餌摂取量に影響を与えない場合（図６）、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体のドラメクチンの投与が野生型マウス血清のグルコース（図６および７）およびコレステロール（図７、８、および９）値を有意に低下させるが、ＦＸＲノックアウトマウスでは有意な変化が生じないことが分かっている。イベルメクチンの投与は野生型マウスの血清インスリン値を有意に低下させるが（図７）、これは、イベルメクチンがインスリン感受性を上昇させることで、血糖値を低下させる作用を持つことを示している。ただし、ＦＸＲノックアウトマウスでは、前記薬物の投与により血糖値、インスリン値、およびコレステロール値に有意な変化はなく、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体のドラメクチンがＦＸＲを介して血清の血糖値、インスリン値、およびコレステロール値を制御していることを示している。アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体のドラメクチンはマウスの血清コレステロール値をダウンレギュレートし、これには高密度リポタンパク質コレステロール値の有意なダウンレギュレートだけでなく、低密度および超低密度リポタンパク質コレステロール値のダウンレギュレートも含む。さらに、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体のドラメクチンは野生型マウスの血清トリグリセリド（Ｔｇ）値も有意に低下させる（図１０）。重要なことに、アバメクチン／アベルメクチンおよびドラメクチンを投与したマウス体内の精巣上体脂肪体特有の重量も有意に減少し（図１０）、これは肥満に対する治療効果を示している。血清アラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性の検出は（図１１）、イベルメクチンがトランスアミナーゼ活性に影響しないことを示している。イベルメクチンを投与したマウスの肝臓をパラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色するが（図１２）、これは、イベルメクチンが肝細胞を損傷しないことを示している。

リガンド薬物を投与したマウス肝臓におけるサッカライド、脂質、およびコレステロール代謝と関連した遺伝子の発現を、蛍光定量リアルタイムＰＣＲで検出する。この結果は、サッカライド、脂質、およびコレステロール代謝に関連した遺伝子の発現制御と一致し、イベルメクチンが血糖値、血中脂質、およびコレステロール低下の生理的機能を達成できることを示しており（図１３）、イベルメクチンがＦＸＲを介して代謝関連遺伝子の発現を制御でき、生理的機能を制御できることを示している。これらの結果は、イベルメクチンがＦＸＲの特異的リガンドであることを示しており、また、ｉｎｖｉｖｏでのイベルメクチンによる生理的機能の制御がＦＸＲにより達成されることも証明している。

アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体のドラメクチンの糖尿病マウスモデルにおける作用
アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体のドラメクチンは、ＦＸＲのリガンドとして正常なマウス体内の代謝制御に重要な役割を果たしている可能性があり、問題は、病的マウスでも治療効果の改善を示す可能性があるか否かである。アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、およびその誘導体のドラメクチンの糖尿病および肥満マウスモデル体内における有効性を検出するため、糖尿病および肥満マウスモデルであるＫＫ−Ａｙマウスを被験動物として選択している。上記マウスは約８〜１２週齢で重大な高血糖および糖尿病症状を示すことができる。実験では、９〜１０週齢のＫＫ−Ａｙマウスを使用し、高脂肪食を与え、１４日間薬物を腹腔内注射し、マウスの食餌摂取量に影響がなければ（図１４）、イベルメクチンおよびＧＷ４０６４は血清コレステロール、トリグリセリド、および遊離脂肪酸の内容量を有意に低下させているが（図１６）、血糖値の態様では、イベルメクチンは血清サッカライドおよびインスリン値を有意に低下させており、これは、イベルメクチンがインスリン感受性の亢進により血糖値を低下させる作用を発揮していることを示しており、この態様では、イベルメクチンはＦＸＲリガンドとしての機能がＧＷ４０６４よりも有意に優れている（図１５）。さらに、イベルメクチンの投与はＫＫ−Ａｙマウスの体重を有意に低下させ、この点もＧＷ４０６４より明らかに優れていることを示している（図１４）。これらの結果は、イベルメクチンが血糖値、血中脂質、およびコレステロールを平衡化し、糖尿病および肥満モデルマウスの体重増加を抑制する優れた作用を持ち、合成リガンドのＧＷ４０６４よりも機能および治療効果が優れていることを示している。

アバメクチン／アベルメクチンおよびドラメクチンに関する同様の試験をＫＫ−Ａｙマウスで行い、マウスの食餌摂取量に影響がなければ（図１７）、アバメクチン／アベルメクチンおよびドラメクチンはＫＫ−Ａｙマウス血清のグルコース値（図１７）、高密度リポタンパク質および低密度／超低密度リポタンパク質コレステロール、およびトリグリセリド（図１８）を有意に低下させることもでき、肥満マウスの相対的体重も有意に低下できることが分かっている。これらのデータは、イベルメクチンおよびその誘導体が糖尿病および肥満に良好な治療効果を持つことを示している。

イベルメクチンはＦＸＲを介してＬＰＳ誘導性炎症性反応を阻害する
最近、一部の報告で、イベルメクチンがＬＰＳ誘導性炎症性反応を阻害し、過剰なＬＰＳにより誘導されるマウスの死亡を抑制することができることが示された。一方で、イベルメクチンはアレルギー性喘息の治療に有意な治療効果を示すが、具体的な作用機序は分かっていない。イベルメクチンおよびＬＰＳは、野生型およびＦＸＲノックアウトマウス肝細胞の治療に使用される。野生型マウス肝細胞では、イベルメクチンが例えばｉＮＯＳ、ＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびＭＩＰ−１ａなどの炎症性因子の発現を明らかに抑制する可能性があるが（図１９）、ＦＸＲノックアウトマウスの肝細胞では明らかな変化は認められない。この結果は、イベルメクチンによるＬＰＳ誘導性炎症性反応の抑制は、ＦＸＲを介して達成されることを示している。

ＦＸＲ／イベルメクチン錯体の構造に基づくイベルメクチン誘導体の薬物デザイン
上記の例から、イベルメクチンは駆虫剤とは全く異なる機能を有し、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満などの哺乳類の代謝関連疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患の治療に新しい使用を有することが分かる。さらに、ＦＸＲがイベルメクチンに結合したところを構造解析した３次元結晶構造パターンに従い（付録１）、イベルメクチンを安全なリーディング化合物として、イベルメクチンの分子構造を薬物デザインの鋳型として、イベルメクチンとＦＸＲの結合部位とともに、またその構造機能関係を補助に用い、一部のイベルメクチンの官能基を適切に修飾することで、前記リガンドと受容体との結合親和性および特異性が改善する可能性があり、最適な有効性を達成し、リガンド薬物の量を最小限として最適な薬剤治療効果を達成し、細胞および微生物体に対する薬物の毒性を低下させるようにする。イベルメクチンの構造式は以下の通りである。

前記構造式を構造的基礎として用い、前記構造式のＣ３−Ｃ４、Ｃ８−Ｃ９、Ｃ１０−Ｃ１１、およびＣ１４−Ｃ１５炭素−炭素二重結合を修飾し、Ｃ５、Ｃ７、およびＣ４’’位のヒドロキシル基を修飾し、Ｃ４、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ２４、およびＣ２５位の側鎖を修飾し、Ｃ１３位のグリコシルを加水分解し、他の官能基を置換などにより修飾する。単一の修飾または上記の様々な修飾の併用は、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満など、哺乳類の代謝関連疾患、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患を治療する上で、応用上の価値を有する可能性がある。上記のデザインの法則に従い、アバメクチン／アベルメクチン、ドラメクチンなどは前記法則と一致した誘導体でもあり、マウスの試験では、これらの化合物が哺乳類のサッカライドおよび脂質代謝において、良好な制御機能および治療効果を有することも証明されている。

産業上の適用性
本発明は、高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、および肥満などの哺乳類の代謝関連疾患治療薬、および胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌などのファルネソイドＸ受容体性疾患の治療薬調製における、アバメクチン／アベルメクチン、イベルメクチン、ドラメクチンおよび他の誘導体またはこれらのいずれか１つを含む組成物の使用について提供する。

出願日前の本発明に関連した参考資料
１．中国特許ＣＮ１９３３８５６
２．中国特許ＣＮ１７７７４３３

付録１

Claims

ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の活性を制御する化合物または組成物を調製する際のイベルメクチンおよびその誘導体の使用であって、前記イベルメクチンは下記構造式を有する使用。
請求項１記載のイベルメクチンおよびその誘導体の使用において、前記誘導体または構造類似体が式ＩＩの化合物である構造を有するアバメクチン／アベルメクチンであることを特徴とする使用。
請求項１記載のイベルメクチンおよびその誘導体の使用において、前記誘導体が式ＩＩＩの化合物である構造を有するドラメクチンであることを特徴とする使用。
請求項１、２または３記載の使用において、前記化合物または組成物がイベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチンの誘導体を有することを特徴とする使用。
請求項１、２または３記載の使用において、代謝関連疾患、胆汁うっ滞、胆石、非アルコール性脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、炎症、および癌を有するファルネソイドＸ受容体関連疾患を治療するための薬剤を調製する際に、前記イベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチンを使用することを特徴とする使用。
請求項１、２または３記載の使用において、哺乳類における代謝関連疾患を治療するための薬剤を調製する際に使用することを特徴とする使用。
請求項６記載の使用において、前記代謝関連疾患が高血糖、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、糖尿病、または肥満を有することを特徴とする使用。
請求項６記載の使用において、前記代謝関連疾患が糖代謝関連疾患を有することを特徴とする使用。
請求項６記載の使用において、前記代謝関連疾患が脂質代謝関連疾患を有することを特徴とする使用。
請求項５〜９記載の使用において、前記誘導体がイベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチンを基にデザインおよび合成された新規誘導体であることを特徴とする使用。
請求項１０記載の新規誘導体をデザインおよび合成する方法であって、特に、この方法では、イベルメクチン、アバメクチン／アベルメクチン、およびドラメクチンの構造式が構造的基礎として利用され、前記構造式のＣ３−Ｃ４、Ｃ８−Ｃ９、Ｃ１０−Ｃ１１、Ｃ１４−Ｃ１５、およびＣ２２−Ｃ２３の炭素−炭素二重結合が修飾され、Ｃ５、Ｃ７、およびＣ４’’位のヒドロキシル基が修飾され、Ｃ４、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ２４、およびＣ２５位の側鎖が修飾され、Ｃ１３位のグリコシルが加水分解され、他の官能基が置換により修飾されることを特徴とする方法。
請求項１０記載の新規誘導体をデザインおよび合成する方法であって、特に、前記新規誘導体が高い親和性を有するファルネソイドＸ受容体に特異的に結合することによってデザインおよび合成されることを特徴とする方法。
請求項１１または１２記載の新規誘導体をデザインおよび合成する方法において、前述の任意の単一の修飾および様々な修飾の組み合わせを有することを特徴とする方法。
請求項１〜１０のいずれか１つに記載の使用において、請求項１〜３および１０〜１２に記載される化合物の薬学的に許容される塩を有することを特徴とする使用。
請求項１〜１０のいずれか１つに記載の使用において、請求項１〜３および１０〜１２に記載される化合物の薬学的に許容される賦形剤を有することを特徴とする使用。