KR20150077447A - Abd 결합 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ABD 결합 모티프 BM을 포함하고, 상기 모티프는 EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D로부터 선택되는 아미노산 서열 및 이와 적어도 89% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 ABD 결합 폴리펩티드를 제공한다.

Description

ABD 결합 폴리펩티드{ABD BINDING POLYPEPTIDE}
본 발명은 알부민 결합 도메인, ABD에 결합하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 예를 들면 분리기술에서 친화성 리간드로서 또는 분자진단에서 검출제로서 사용하기 위한 다양한 산업 및 약학적 용도를 갖는다.
혈청 알부민은 포유동물 혈청중에서 가장 풍부한 단백질(인간에서, 35-50 g/l, 즉 0.53-0.75 mM)이며, 혈청 알부민과의 생체내 관련이 가능한 캐리어 단백질에 펩티드 또는 단백질을 공유결합시키기 위한 여러가지 전략들은 예를 들어 WO91/01743, WO01/45746 및 Dennis et al (J Biol Chem 277:35035-43, 2002)에 기술되어 있다. WO91/01743은 다른 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 연쇄상구균 단백질 G(SpG)로부터 유래된 알부민 결합 펩티드 또는 단백질의 용도가 특히 기술되어 있다. 이의 발상은 혈액으로부터 빠르게 제거되는 것으로 밝혀진 치료상 흥미로운 펩티드/단백질을 박테리아 유래된, 알부민 결합 펩티드/단백질로 융합하는 것이다. 생성된 융합 단백질은 생체 내에서 혈청 알부민에 결합하고, 융합된 치료상 관심있는 펩티드/단백질의 전체 반감기를 증가시키는, 더 긴 반감기로 인해 이득을 얻는다. 혈청 알부민의 반감기는 동물의 크기에 정비례하는데, 예를 들면 인간 혈청 알부민(HSA)은 19일의 반감기를 갖고, 토끼 혈청 알부민은 약 5일의 반감기를 가진다(McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004).
연쇄상구균 단백질 G(SpG)는 연쇄상구균의 특정 균주의 표면 상에 존재하는 이중-기능성 수용체이며, IgG 및 혈청 알부민 모두에 결합될 수 있다(Bjorck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). 구조는 매우 반복적이며, 여러가지의 구조적 및 기능적으로 상이한 도메인을 포함하는데(Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), 더욱 정확하게는 3개의 Ig-결합 도메인 및 3개의 혈청 알부민 결합 도메인을 포함한다(Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987). 3중-나선 번들 폴드를 보이는, SpG 내에 3개의 혈청 알부민 결합 도메인 중 하나의 구조가 결정되었다(Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002). 46개의 아미노산 모티프는 ABD(알부민 결합 도메인)로서 정의하고, 이어서 G148-GA3(단백질 G-연관 알부민 결합에 대한 GA 및 유래된 연쇄상구균의 균주로부터의 G148)로 명명되었다.
인간 혈청 알부민을 위해 매우 개선된 친화성을 갖는 GA3-G148의 인공 변이체가 개발되었고 (Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008; WO2009/016043), 뿐만 아니라 감소된 면역 자극 특성을 갖는 고 친화성 변이체가 조작되었다(WO2012/004384). 후자는 몇몇 T세포 및 B 세포 에피토프가 GA3-G148 내에서 실험적으로 확인되었으며(Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003), 이것이 인간 투여를 위한 약학 조성물에서 사용하기에 이러한 도메인을 덜 적합하게 만든다는 사실로 인해 동기부여되었다. 본 발명의 명세서 전반에 걸쳐, GA3-G148 뿐만 아니라 WO2009/016043 및 WO2012/004384에 존재하는 이의 다양한 조작된 유도체들을 총칭하여 "ABD"로서 부른다. 따라서, 본 발명에서, "ABD"는 특정한 아미노산 서열을 갖는 특정한 폴리펩티드를 나타내기 보다는, 이들 부류의 알부민 결합 폴리펩티드를 지칭한다.
알부민 결합 도메인을 치료 또는 진단 조성물 내로 포함시키는데 있어서의 관심이 증가함에 따라, 예를 들면, 원핵세포 또는 진핵세포 시스템에서 재조합 발현에 의해, 또는 ABD에 직접적인 화학 접합에 의해 생산된, ABD에 공유적으로 연결된 분자의 분리를 위한, 저비용의 효율적인 정제 전략의 필요성이 증가되고 있다. 재조합적으로 발현된 단백질의 정제를 위한 일반적인 전략은 폴리히스티딘 태그, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그 또는 FLAG-태그와 같은 통상적으로 사용되는 친화성 태그를 포함할 것이고, 각각의 태그에 대해 특이적으로 개발된 상업적 수지를 사용하는 전통적인 친화성 분리가 수행될 것이다. 그러나, 특정한 적용의 경우, 및 특히 치료제로서 사용될 분자의 경우, 최종 생성물은 균질해야한다. 태그는 예를 들면 효소 또는 화학 분해에 의해 제거될 필요가 있기 때문에, 균질한 생성물을 얻기 위해 완전한 분해를 보장될 필요가 있거나, 또는 불완전하게 분해된 생성물을 제거하는 경우 수율의 감소를 겪을 수 있다. 이들 두 사안 모두는 생성물의 생산 비용을 높이게 된다. 그러므로, 더욱 의욕적인 전략은 정제 태그로서 ABD 모이어티 그 자체를 사용하는 것일 것이다. 이의 하나의 예는 고체 지지체에 재조합 알부민을 커플링시키는 것일 것이다(참고, 예를 들면 Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008; Andersen et al, J Biol Chem 286:5234-41, 2011). 미정제 용질로부터, ABD 태그를 포함하는 화합물은 알부민에 의해 캡쳐되고, 비-특이적으로 흡수된 오염물은 제거되고, ABD-태그된 화합물은 그 후 알부민에 특이적이지만 가역적인 상호작용을 방해함으로써 회수된다. 그러나, 알부민은 여러가지 단백질, 지방산, 스테롤, 이온 등에 대해 다양한 상호작용 부위를 갖는 큰 천연 담체분자이므로, 이에 따라 특이적 및 비특이적 성분 둘 모두의 배경 반응이 회수된 샘플을 오염시킬 수 있다. 재조합 인간 알부민이 개발되었다는 사실에도 불구하고, 치료제의 대규모 생산에서 친화성 리간드로서 이를 포함시키는 것은 여전히 비용이 높고, 특히 위치 내 클리닝을 위한 표준 절차가 양립불가능하기 때문에, 알부민-커플링된 매트릭스의 반복 사용에 적용되어야만 할 것이다. 또한, 알부민에 대해 현저하게 높은 친화성을 갖는 ABD 변이체를 함유하는 분자를 회수하기 위해 엄격한 용출 조건이 필요할 수 있다. 이러한 조건은 또한 ABD-태그된 분자에 대해 호의적이지 않을 수 있다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터의 단백질 A는 IgG의 Fc 부분에 대한 단백질 A의 천연 친화성으로 인해, 단일클론 항체 및 Fc-융합 단백질의 공업적 생산에서 친화성 리간드로서 오랫동안 사용되어져 왔다. 단백질 A, 뿐만 아니라 이의 개별적인 Fc-결합 도메인은 그 전체가 후속적으로 개선된 특성을 갖는 조작된 친화성 리간드의 합리적인 설계를 위한 출발점으로서 역할을 하였다. 개요에 대해서는 Nord K 및 동료들의 논문 Prot Eng(Nord et al, Prot Eng 8:601-608; 1995) 및 Nat Biotech(Nord et al, Nat Biotech 15:772-777; 1997)를 참고하라.
본 발명의 목적은 신규한 ABD 결합제를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 생명공학에서 예를 들면 단백질 정제 및 분리 적용에서 사용하기 위한 신규한 ABD 결합제를 제공하는 것이다.
본 발명으로부터의 숙력가에게 명백한 이들 목적, 및 다른 목적은 하기에서 논의되는 하나 이상의 다양한 진보적 양상에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 ABD 결합 모티프 BM을 포함하는 ABD 결합 폴리펩티드를 제공하며, 이의 모티프는 하기 i) 및 ii)로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다:
i) EX2X3X4AX6X7EI X10X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28D
여기에서, 서로 독립적으로,
X2는 F, I 및 L로부터 선택되고;
X3은 H, K, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X4는 A, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 F, I, L 및 Y로부터 선택되고;
X7은 A, H, I, K, L, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X10은 G, H, K, N, Q, R 및 S로부터 선택되고;
X11은 A, D, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 F, H, L, S 및 T로부터 선택되고;
X18은 D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X20은 H, K 및 R로부터 선택되고;
X21은 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25는 F, I, L, V 및 Y로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 D 및 E로부터 선택됨;
및
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 89% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
관련된 서열의 부류, ABD 결합 폴리펩티드의 상기 정의는 몇몇 상이한 선별 실험에서 ABD와의 상호작용에 대해 선택되어진, 모체 스캐폴드의 많은 무작위 폴리펩티드 변이체의 통계학적 분석을 기반으로 한다. 확인된 ABD 결합 모티프, 또는 "BM"은 모체 스캐폴드의 표적 결합 부위에 상응하며, 상기 부위는 3중 나선 번들 단백질 도메인 내에 2개 알파 나선을 구성한다. 모체 스캐폴드에서, 2개의 BM 나선의 다양한 아미노산 잔기는 항체의 불변 Fc 부분과 상호작용하기 위한 결합 표면을 구성한다. 본 발명에서, 결합 표면 잔기의 무작위 변이 및 변이체의 후속적인 선별은 Fc 상호작용 능력을 ABD와 상호작용하는 능력으로 대체한다.
본 명세서에 개시된 ABD 결합 폴리펩티드는 일련의 특성, 예를 들면 고체 지지체에 결합되는 경우, ABD를 포함하는 분자를 정제하기 위한 친화성 리간드로서 적합하게 만드는 것과 같은 특성들의 세트를 나타낸다. 예를 들면, 친화성 리간드로서 인간 알부민을 사용하는 것과 비교해보면, 개시된 ABD 결합 폴리펩티드는 다음과 같은 이점들을 입증한다:
· 리간드-결합 매트릭스 ㎖ 당 더 높은 정제 능력.
· ABD 결합 폴리펩티드를 치료제의 대규모 생산에서 유용하게 하는, 예를 들면, 0.5 M 수산화나트륨을 사용하여, 소정의 위치에 세정하기 위한 반복 절차와의 적합성.
· ABD를 포함하는 상이한 분자의 더 넓은 범위의 정제를 가능하게 하는, 예를 들면 더 높은 pH에서 용출과 같은 온화한 용출 조건의 유효화.
ABD-함유 표적 단백질의 정제의 맥락에서, 본 발명의 ABD 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 정제 단계에서 유용할 수 있다. 따라서, 임의의 중간 정제 단계에서 또는 최종 연마 단계에서, 하나 이상의 제1 캡쳐 단계에서 제한없이 사용될 수 있다.
숙련가는 본 발명에 따른 ABD 결합 폴리펩티드를 포함하는 수지를 사용하는, 표적 단백질의 성공적인 정제가 표적 단백질에서 ABD 모이어티의 위치에 상관없이 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, ABD 모이어티는 표적 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 위치될 수 있다. 대안적으로, 표적 단백질은 양 측면 상에 다른 단백질 모이어티에 의해 플랭크된 ABD 모이어티를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "ABD"는 연쇄상구균 단백질 G 및 이의 유도체로부터의 3중-나선 알부민 결합 도메인을 지칭한다. 특히, "ABD"는 GA3-G148(Johansson et al, 상기, 참조로서 본 명세서에 포함됨) 또는 알부민에 대한 개선된 친화성을 갖는 GA3-G148의 변이체(WO2009/016043, 참조로서 본 명세서에 포함됨), 뿐만 아니라 감소된 면역 자극성 특성을 갖는 고 친화성 변이체(WO2012/004384, 참조로서 본 명세서에 포함됨)를 지칭할 수 있다. 달리 말하면, 본 발명에서, "ABD"는 특정한 아미노산 서열을 갖는 특정한 폴리펩티드라기 보다는, 참조된 문헌들에서 기술된 알부민 결합 폴리펩티드의 부류를 나타낸다.
숙련가가 인식할 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드의 ABD 결합능과 같은, 임의의 폴리펩티드의 기능은 폴리펩티드의 3차 구조에 의존한다. 그러므로, 그의 기능에 영향을 미치지 않으면서 폴리펩티드 내의 아미노산 서열에 작은 변화를 주는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 생성된 서열이 i)에 의해 정의된 서열과 적어도 89% 동일하도록 하는 BM의 변형된 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 BM의 변형된 변이체는 그들이 i)에 의해 정의된 서열과 93% 동일하도록 하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 BM 변이체는 i)에 의해 정의된 서열과 96% 동일하다.
일부 실시양태에서, 이러한 변화는 본 명세서에 개시된 ABD 결합 폴리펩티드의 서열의 모든 위치에서 이루어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 변화는 스캐폴드 아미노산 잔기로서 또한 명명된, 비-가변 위치에서만 이루어질 수 있다. 이러한 경우에, 변화는 가변 위치, 즉 서열 i)에서 "X"로 명명된 위치에서 허용되지 않는다. 예를 들면, 아미노산 잔기의 특정의 기능적 분류에 속하는 아미노산 잔 기(예: 소수성, 친수성, 극성 등)가 동일한 기능기로부터의 다른 아미노산 잔기와 교환할 수 있는 것이 가능하다.
명세서 전반에 사용된 바와 같은, 용어 "% 동일성"은 다음과 같이 계산될 수 있다. 쿼리 서열은 CLUSTAL W 알고리즘을 이용하여 표적 서열에 정렬된다(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J.,Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). 비교는 정렬된 서열의 가장 짧은 것에 대응하는 창(window)을 통해 행한다. 정렬된 서열의 가장 짧은 것은 어떤 경우에는 여기에서 개시된 알부민 결합 도메인과 같은 표적 서열일 수 있다. 다른 경우에, 쿼리 서열은 정렬된 서열의 가장 짧은 것을 구성할 수도 있다. 각 위치의 아미노산 잔기들을 비교하고, 표적 서열과 동일한 상응성(identical correspondence)을 가지는 쿼리 서열
에서 위치의 백분율은 % 동일성으로 보고된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X2는 F 및 L로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X2는 F이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X2는 L이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X3은 H, K, R, T 및 V로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X3은 H, K, R 및 V로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X3은 H, K 및 V로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X3은 K 및 R로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X3은 K이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X3은 R이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X3은 V이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 A, H, I, L, N, V 및 W로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 H, L, N 및 V로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 V이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 N이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 H이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 L이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 A, L, N, V 및 W로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 A, N, V 및 W로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X4는 A, N 및 W로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X6은 F 및 L로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X6은 F이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X6은 L이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X7은 K, L, N, Q, R 및 S로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X7은 K, N, Q, R 및 S로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X7은 K, Q, R 및 S로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X7은 K 및 R로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X7은 K이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X7은 R이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 H, K, N, 및 R로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 H, K 및 N으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 K, N 및 R로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 K 및 R로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 N이다
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 K이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 R이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X10은 H이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 A, F, L, R, T 및 Y로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 A, F, T 및 Y로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 T이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 A이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 Y이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 F이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 A, L, T 및 Y로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X11은 T 및 Y로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X16은 T이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X17은 F, H 및 L로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X17은 F 및 H로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X17은 H 및 L로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X17은 F이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X17은 H이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X17은 L이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X18은 D, H, I, K 및 Q로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X18은 D, H 및 Q로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X18은 H 및 Q로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X18은 H이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X18은 Q이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X18은 D이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X20은 K 및 R로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X20은 H 및 R로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X20은 R이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X20은 K이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X21은 I 및 L로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X21은 I이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X21은 L이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X25는 I, L 및 V로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X25는 V 및 I로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X25는 I이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X25는 V이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X25는 L이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X26은 K이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)에서 X28은 D이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)는 다음과 같이 정의된다: 서로 독립적으로,
X2는 F 및 L로부터 선택되고;
X3은 H, K, R, T 및 V로부터 선택되고;
X4는 A, H, I, L, N, V 및 W로부터 선택되고;
X6은 F 및 L로부터 선택되고;
X7은 K, L, N, Q, R 및 S로부터 선택되고;
X10은 H, K, N, 및 R로부터 선택되고;
X11은 A, F, L, R, T, 및 Y로부터 선택되고;
X16은 T이고;
X17은 F, H 및 L로부터 선택되고;
X18은 D, H, I, K 및 Q로부터 선택되고;
X20은 H 및 R로부터 선택되고;
X21은 I 및 L로부터 선택되고;
X25는 I, L 및 V로부터 선택되고
X26는 K이고; 및
X28는 D이다.
하나의 실시양태에서, 서열 i)는 다음와 같이 정의된다: 서로 독립적으로,
X2는 F 및 L로부터 선택되고;
X3은 H, K, T 및 V로부터 선택되고;
X4는 H, L, N 및 V로부터 선택되고;
X6은 F 및 L로부터 선택되고;
X7은 K, R, Q, 및 S로부터 선택되고;
X10은 H, K, 및 N으로부터 선택되고;
X11은 A, F, T, 및 Y로부터 선택되고;
X16은 T이고;
X17은 F, H 및 L로부터 선택되고;
X18은 D, H 및 Q로부터 선택되고;
X20은 R이고;
X21은 I 및 L로부터 선택되고;
X25는 I, L 및 V로부터 선택되고;
X26은 K이고; 및
X28는 D이다.
ABD 결합 폴리펩티드의 서브-부류를 정의하는 더욱 구체적인 실시양태에서,서열 i)는 8개 조건 I-VIII 중 적어도 4개를 충족한다:
I. X2는 F 및 L로부터 선택되고;
II. X6는 F 및 L로부터 선택되고;
III. X16은 T이고;
IV. X20은 H 및 R로부터 선택되고;
V. X21은 I 및 L로부터 선택되고;
VI. X25는 I 및 V로부터 선택되고;
VII. X26은 K이고; 및
VIII. X28은 D이다.
제1 양태에 따른 ABD 결합 폴리펩티드의 일부 예에서, 서열 i)는 8개의 조건 I-VIII 중 적어도 5개를 충족한다. 더욱 구체적으로, 서열 i)는 8개의 조건 I-VIII 중 적어도 7개, 8개의 조건 I-VIII 중 8개 모두와 같이, 8개의 조건 I-VIII 중 적어도 6개를 충족할 수 있다.
하기의 실험 항목에 상세히 기술되는 바와 같이, ABD 결합 폴리펩티드 변이체의 선별은 다수의 개개 ABD 결합 모티프(BM) 서열의 확인을 초래한다. 이들 서열은 이 양태에 따른 서열 i)의 개별 실시양태를 구성한다. 개별 ABD 결합 모티프의 서열은 도1 및 서열번호 1-52로서 나타낸다. 이 양태의 일부 실시양태에서, 서열 i)는 서열번호 1-52 중 임의의 하나로부터 선택된다. 더욱 구체적으로 서열 i)는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4와 같은 서열번호 1-7 중 임의의 하나로부터 선택될 수 있다. 특히, 서열 i)는 서열번호 1일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같이 BM은 3중-나선 번들 단백질 도메인"의 일부를 형성한다". 이는 BM이 본래 도메인 내에 유사한 구조적 모티프를 대체하도록, 본래의 3중-나선 번들 도메인의 서열 내로 BM의 서열이 "삽입" 또는 "이식"되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 이론에 구속받는 것을 원하지 않지만, BM은 3중-나선 번들의 3중 나선 중 2개를 구성하는 것으로 여겨지고, 따라서 임의의 3중-나선 번들 내에 2중-나선 모티프로 대체될 수 있다. 숙련가가 인식할 바와 같이, 2개의 BM 나선에 의한 3중-나선 번들 도메인의 2개 나선의 대체는 폴리펩티드의 기본 구조에 영향을 미치지 않도록 수행되어야 한다. 다시 말하면, 본 발명의 실시양태에 따른 폴리펩티드의 Cα 골격의 전체적인 접힘은 일부분을 형성하는, 예를 들면 동일한 순서 등으로 제2 구조의 동일한 요소를 갖는, 3중-나선 번들 단백질 도메인의 접힘과 실질적으로 동일하다. 따라서, 본 발명에 따른 BM은 본 발명의 실시양태에 따른 폴리펩티드가 본래의 도메인과 같은 동일한 접힘을 갖는 경우, 3중-나선 번들 도메인의 "일부를 형성"하고, 이는 기본 구조적 특성이 공유되는 것을 의미하며, 이들 특성은 예를 들면 유사한 CD 스펙트럼을 유도한다. 숙련가는 적절한 다른 파라메터에 대해 인식하고 있다.
따라서 특별한 실시양태에서, ABD 결합 모티프(BM)는 3중-나선 번들 단백질 도메인의 일부를 형성한다. 예를 들면, BM은 상기 3중-나선 번들 단백질 도메인 내에, 상호연결 루프를 갖는 2중 알파 나선을 실질적으로 구성할 수 있다. 특별한 실시양태에서, 상기 3중-나선 번들 단백질 도메인은 세균 수용체 단백질의 도메인으로부터 선택된다. 이러한 도메인의 비-제한적인 예는 도메인 B와 같은 황색포도상구균으로부터의 단백질 A의 5개의 상이한 3중-나선 도메인, 및 이들의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 3중-나선 번들 단백질 도메인은 단백질 Z의 변이체이며, 이는 포도상구균성 단백질 A의 도메인 B로부터 유래된다.
본 발명의 ABD 결합 폴리펩티드가 3중-나선 번들 단백질 도메인의 부분을 형성하는 실시양태에서, ABD 결합 폴리펩티드는 하기 iii) 및 iv)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
iii) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
여기에서
[BM]은 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고;
Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
Xd는 A 및 S로부터 선택됨; 및
iv) iii)에 의해 정의된 서열과 적어도 81% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
상기 논의된 바와 같이, 3차 구조 및 이의 기능에 크게 영향을 주지 않으면서 상기 아미노산 서열과 비교해 부수적인 변화를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 서열 iv)는 iii)에 의해 정의된 서열과 적어도 83%, 예컨대 적어도 85　%, 예컨대 적어도 87　%, 예컨대 적어도 89　%, 예컨대 적어도 91　%, 예컨대 적어도 93　%, 예컨대 적어도 95　%, 예컨대 적어도 97　% 동일성을 가진다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 하나의 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xa는 A이다. 대안적인 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xa는 S이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 하나의 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xb는 N이다. 대안적인 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xb는 E이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 하나의 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xc는 A이다. 대안적인 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xc는 S이다. 또 다른 대안적인 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xc는 C이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 하나의 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xd는 A이다. 대안적인 실시양태에서, 서열 iii)에서 Xd는 S이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 하나의 실시양태에서, 서열 iii)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고 Xd는 A이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, 서열 iii)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고 Xd는 A이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, 서열 iii)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고 Xd는 S이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, 서열 iii)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고 Xd는 S이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, 서열 iii)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 A이고 Xd는 A이다.
상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드의 추가의 실시양태에서, 서열 iii)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고 Xd는 A이다.
다른 추가적인 실시양태에서, 상기 ABD 결합 폴리펩티드의 정의에서 서열 iii)은 서열번호 53-104, 특히 서열번호 53-59로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로부터선택된다. 특히, 서열 iii)은 서열번호 53일 수 있다.
또한, 추가의 실시양태에서, 하기 v) 및 vi)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드가 제공된다.
v) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
여기에서 [BM]은 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고 Xc는 S 및 C로부터 선택됨; 및
vi) v)에 의해 정의된 서열과 적어도 83% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
다른 실시양태에서, 하기 vii) 및 viii)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드가 제공된다.
vii) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDAQA P;
여기에서 [BM]은 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고 Xc는 A 및 C로부터 선택됨; 및
viii) vii)에 의해 정의된 서열과 적어도 83% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
대안적으로, 하기 ix) 및 x)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드가 제공된다.
ix) FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
여기에서 [BM]은 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고 Xc는 A 및 C로부터 선택됨; 및
x) ix)에 의해 정의된 서열과 적어도 83% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
상기 논의된 바와 같이, 3차 구조 및 이의 기능에 크게 영향을 주지 않으면서 상기 아미노산 서열과 비교해 부수적인 변화를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드는 예를 들면 v), vii) 또는 ix)에 의해 정의된 서열과 적어도 84 %, 예컨대 적어도 86 %, 예컨대 적어도 88　%, 예컨대 적어도 90　%, 예컨대 적어도 92　%, 예컨대 적어도 94　%, 예컨대 적어도 96　%, 예컨대 적어도 98　% 동일한 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, ABD 결합 모티프는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 부분을 형성할 수 있다:
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; 및
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK.
하나의 실시양태에서, ABD 결합 폴리펩티드는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
xi) VDAKYAK-[BM]- DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
여기에서 [BM]은 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프임; 및
xii) xi)에서 정의된 서열과 적어도 84 % 동일성을 갖는 아미노산 서열.
또한, 3차 구조 및 이의 기능에 크게 영향을 주지 않으면서 상기 아미노산 서열과 비교해 부수적인 변화를 포함하는 폴리펩티드가 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드는 예를 들면 xi)에 의해 정의된 서열과 적어도 86 %, 적어도 87 %, 적어도 89　%, 적어도 91　%, 적어도 93　%, 적어도 94　%, 적어도 96　%, 적어도 98　% 동일한 서열을 가질 수 있다.
이러한 폴리펩티드에서 서열 xi)는 서열번호 105-156 중 임의의 하나로부터 선택될 수 있다. 특히 서열 xi)는 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107 및 서열번호 108로부터 선택되는 것과 같이, 서열번호 105-111 중 임의의 하나로부터 선택될 수 있다. 이 폴리펩티드의 특정한 실시양태에서, 서열 xi)는 서열번호 105이다.
본 발명의 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체성 형태일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서 ABD 결합 폴리펩티드는 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는 적어도 2개의 ABD 결합 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하는 다량체 형태로 존재한다. 폴리펩티드의 다량체 형태는 결합 특성을 향상시킬 수 있다는 점에서 장점이 있을 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 ABD 결합 폴리펩티드 단량체 단위는 공유결합에 의해 함께 커플링된다. 특별한 실시양태에서, ABD 결합 폴리펩티드 단량체 단위는 융합 단백질로서 발현된다.
폴리펩티드는 알려진 유기 화학적 방법을 사용해 공유 결합을 통해 연결되거나, 또는 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 시스템에서 하나 이상의 융합 폴리펩티드로서 발현되거나, 또는 직접적으로 또는 아미노산 링커와 같은 링커를 통해, 임이의 다른 방식으로 연결될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 ABD 결합 폴리펩티드는 이량체 형태이다. 가능한 다량체성 형태는 또한 삼량체 형태를 포함한다. 폴리펩티드의 다량체 형태는 상기 정의된 바와 같은 적합한 수의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
숙련가는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 특정한 응용에 대해 폴리펩티드를 짜맞추기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 양태에 따른 ABD 결합 폴리펩티드에 대해 다양한 변형 및/또는 첨가가 이루어질 수 있는 것으로 이해할 것이다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 임의의 ABD 결합 폴리펩티드는 C-말단 및/또는 N-말단 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 폴리펩티드 사슬의 맨 처음 또는 맨 끝 위치, 즉 N- 및/또는 C- 말단에 추가 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드로서 이해되어져야 한다. 따라서, ABD 결합 폴리펩티드는 임의의 적합한 수의 추가적인 아미노산 잔기, 예를 들면 적어도 하나의 추가적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 각각의 추가적인 아미노산 잔기는 예를 들면 생산, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정성, 결합성, 또는 폴리펩티드의 검출을 개선하기 위해 개별적으로 또는 집합적으로 첨가될 수 있다. 이러한 추가적인 아미노산 잔기는 화학적 결합 목적을 위해, 예를 들면 세파로오스-기반 수지 또는 설포링크(SulfoLink) 커플링 수지와 같은 수지 또는 매트릭스에 대해 ABD 결합 폴리펩티드의 결합을 허용할 수 있다. 이의 하나의 예는 추가적인 아미노산 잔기로서, 또는 많은 추가적인 아미노산 잔기 중 하나로서 시스테인 잔기의 추가이다. 하나의 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 ABD 결합 폴리펩티드는 폴리펩티드의 C-말단 끝, 예를 들면 C-말단에 시스테인 잔기를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 시스테인은 C-말단 추가적인 트리펩티드 VDC의 일부분이다. 하나의 실시양태에서, 상기 시스테인은 단독 C-말단 C이다.
하나의 특별히 특정한 실시양태에서, ABD 결합 폴리펩티드는 C-말단 시스테인 잔기 뿐만 아니라, 상기 정의된 바와 같은 2개의 ABD 결합 도메인의 이량체를 포함한다.
이러한 추가적인 아미노산 잔기는 또한 His6 태그 또는 "myc"(c-myc) 태그 또는 His6-태그의 경우에 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 또는 태그에 특이적인 항체와 상호작용하기 위한 "FLAG" 태그와 같은 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 위한 "태그"를 제공할 수 있다.
상기 논의된 바와 같은 추가적인 아미노산은 화학적 접합(알려진 유기 화학적 방법을 사용함)의 수단에 의해 또는 융합 단백질로서 ABD 결합 폴리펩티드의 발현과 같은 임의의 다른 수단에 의해 ABD 결합 폴리펩티드에 결합될 수 있다.
추가적인 양태에서, 상기 기술된 바와 같은 ABD 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는, 예를 들면 숙주 세포 내에 발현에 의해, ABD 결합 폴리펩티드의 생산을 가능하게 할 수 있다. 본 명세서에 개시된 ABD 결합 폴리펩티드의 발현을 위한 이러한 도구 뿐만 아니라, ABD 결합 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해 이들을 이용하는 방법이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, ABD 결합 폴리펩티드 및 검출제의 조합이 제공된다. 특별한 실시양태에서, 검출제는 형광제 및 방사성 물질로부터 선택된다. 형광성 검출제는 녹색 형광 단백질, 붉은색 형광 단백질, 루시퍼라제 및 이들의 변이체와 같은 형광 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 문맥에서 유용한 방사성 물질은 예를 들면 3H and 125I와 같은 방사성핵종을 포함한다.
본 발명은 다양한 예시적 실시양태를 참조하여 설명하였지만, 당업자라면 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있고, 구성요소를 등가물로 대체할 수 있는 것으로 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 본질적 범주를 벗어나지 않으면서, 본 발명의 교시내용에 맞추어 특정 상황이나 분자를 조정하도록 많은 변형이 이루어질 수 있다. 그러므로, 본 발명을 수행하기 위해 고려되는 임의의 특정 실시양태에 본 발명을 제한하고자 함이 아니라, 첨부된 청구항의 범주 내에 속하는 모든 실시양태를 포함하려는 것으로 의도된다.
도 1은 본 발명의 ABD 결합 폴리펩티드에 포함된 ABD 결합 모티프의 실시예의 아미노산 서열(서열번호 1-52), 본 발명에 따른 49-머 ABD 결합 폴리펩티드의 실시예의 아미노산 서열(서열번호 53-104), 본 발명에 따른 58-머 ABD 결합 폴리펩티드의 실시예의 아미노산 서열(서열번호 105-156), 뿐만 아니라 선별 및 스크리닝을 위해 사용되거나 또는 본 발명의 설명을 위한 융합 단백질에서 사용된 알부민 결합 도메인 변이체의 서열(서열번호 157-162)의 목록이다.
도 2는 실시예 1에 기재된 바와 같이 2 ㎍/㎖의 바이오틴 PEP07911로 분석된 Z변이체의 선별을 위해 ELISA에서의 반응을 나타낸다. 반응은 ELISA 플레이트 상에 양성 대조군으로부터의 신호와 흡광도로 나누어 표준화하였다.
도 3은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행된 블로킹 ELISA 분석에서 Z 변이체의 선별을 위한 반응을 나타낸다. Z 변이체의 페리플라즘 제제는 10 x 과량의 HSA의 첨가 또는 미첨가로 0.2 μg/㎖의 PEP07911에 대하여 시험하였다. 검정 막대는 HSA 부재하의 샘플에 해당하며, 회색 막대는 블로킹제로서 HSA를 첨가한 샘플에 해당한다.
도 4는 실시예 3에 기술된 컬럼 연구 I로부터의 결과를 나탄낸다. 다이어그램에서 막대는 표 1에 나타낸 상이한 세척 및 용출 단계 후에 ABD 결합 Z 변이체-커플링 수지의 각각으로부터 방출되는 샘플의 상대적인 양을 나타낸다.
도 5는 실시예 3에 기술된 컬럼 연구 I로부터의 결과를 나타낸다. 도 5a는 0.1M 시트르산 나트륨, pH 3.0 또는 0.5 M HAc, pH 2.5를 사용한 제1 용출(a) 또는 제2 용출(b) 후에, 각각 ABD 결합 Z-변이체 커플링 수지의 각각으로부터 또는 참조로서 포함된 HSA 스파로스 수지로부터 방출된 샘플의 상대적인 량을 나타낸다. 도 5b는 도 5a에서 Z-변이체 커플링 수지로부터 용출된 상응하는 분획의 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. "M"은 NOVEX 샤프 사전 염색 단백질 표준(인비트로겐, Mw: 216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa)를 언급하며, "로드 샘플"은 당초 Z 변이체 커플링 수지상에 로딩된 PEP08515를 함유하는 박테리아 추출물을 언급한다. Z-변이체 커플링된 수지로부터 용출물 20μL, 단백질 표준 또는 박테리아 추출물 5 μL를 하나의 레인에 SDS-PAGE 겔의 각각을 로딩하였다. 도 5c는 도 5a에서 HSA 스파로스 수지로부터 용출된 대응 분획의 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 레인 1: 0.1 M 시트르산 나트륨에 의한 제1 용출, pH 3.0 (pH 3 (a)). 레인 2: 0.1M 시트르산 나트륨에 의한 제2 용출, pH 3.0 (pH 3 (b)). 레인 3: 0.5M HAc에 의한 제1 용출, pH 2.5 (pH 2.5 (a)). 레인 4: 0.5 M HAc에 의한 제2 용출, pH 2.5 (pH 2.5 (b)). 각각의 용출액 20 μL를 SDS-PAGE 겔상에서 로딩하였다. "M"은 5 μL가 로딩된 NOVEX 샤프 사전 염색 단백질 표준 (인비트로겐, Mw: 216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa)를 언급한다.
도 6은 His6-(Z06677)2-Cys (실선)과 커플링된 EAH 세파로스 수지상에서 ABD-융합 단백질의, 실시예 4에서 개시된 봐와 같이 수행되는, 친화성 정제로부터의 크로마토그램을 나타낸다. HSA (파선)와 커플링된 세파로오스 수지 상에서 동일 샘플의 정제가 참고를 위해 포함된다. 시료 주입점은 화살표로 나타낸다. A 및 B는 관류 분획을 나타내며, C 및 D는 각각 His6-(Z06677)2-Cys 커플링 수지 및 HSA 커플링 수지로부터 용출 분획을 나타낸다. 용출은 pH가 5.5 내지 pH 2.3 범위의 pH를 선형 pH 구배를 사용하여 수행하였다. pH값(점선)은 HPLC 시스템의 조입된(build-in) pH 미터로 모니터링 하였다.
도 7은 지시된 바와 같이 및 실시예 4에 더욱 기술된 바와 같이 수행된 반복 알칼리 인큐베이션 후에 측정된, EAH 세파로스 수지(실선)에 커플링된 His6-(Z06677)2-Cys의 동적 결합 능력을 나타낸다. 세파로스 수지 (파선)에 결합된 HSA의 결합능력이 참고를 위해 포함된다.
도 8a는 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행된 항-ABD 아가로스에 ABD-융합 단백질 PEP10986의 친화성 정제로부터 크로마토그램을 나타낸다. 샘플 주입점은 화살표로 표시된다. 280 nm에서의 흡광도 신호는 (실선)으로 나타낸다. FT 및 E는 각각 관류 분획 및 용출 분획을 언급한다. 용출은 0.1M HAc, pH 2.9로 수행하고, pH (점선)은 HPLC 시스템의 조입된 pH 미터로 모니터링 하였다.
도 8b는 실시예 7에 기술된 정제로부터 선택한 분획의 SDS-PAGE 분석 결과 나타낸다. 레인 1: 컬럼에 로딩된 정화된 세균 추출물, 레인 2: 분획(E1), 레인3: 분획(E2), 및 레인 4: 분획 E3. "M"은 NOVEX 샤프 사전 염색 단백질 표준(인비트 로겐, Mw: 216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa)을 언급한다. 각 샘플 5 μL은 1.25μL가 로딩된 레인 2를 제외하고는 SDS-PAGE 겔의 각 레인선에 로딩하였다.
도 9a는 실시예 8에 기술된 바와 같이 수행된 항-ABD 아가로스에 ABD-융합 단백질 PEP03973의 친화성 정제로부터 크로마토그램을 나타낸다. 샘플 주입점은 화살표로 나타낸다. 280 nm에서 흡광도 신호는 (실선)으로 나타낸다. FT 및 E는 각각 관류 분획 및 용출 분획을 언급한다. 용출은 0.1M HAc, pH 2.9로 수행하고, pH (점선)은 HPLC 시스템의 조입된 pH 미터로 모니터링 하였다.
도 9b는 실시예 8에 기술된 정제로부터 선택된 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 레인 1: 컬럼에 로딩된 정화된 세균 추출물, 레인 2 및 레인 3: 관류, 레인 4: 분획 E1, 레인 5: 분획 E2, 레인 6 : 분획 E3, 레인 7 : 분힉 E4, 레인 8: 분획 E5. "M"은 NOVEX 샤프 사전 염색 단백질 표준(인비트로겐, Mw: 216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa)를 언급한다. 각각의 샘플 5 μL은 SDS-PAGE 겔의 각 레인에 로딩하였다.
도 10a는 실시예 9에 기술된 바와 같이 수행된 항-ABD 융합 단백질의 친화성 정제로부터 크로마토그램을 나타낸다. 샘플 주입점은 화살표로 나타낸다. 다. 280 nm에서 흡광도 신호는 (실선)으로 나타낸다. FT 및 E는 각각 관류 분획 및 용출 분획을 언급한다. 용출은 0.1 M HAc, pH 2.9로 수행화고 pH (점선)은 HPLC 시스펨의 조입된 HPLC 시스템으로 모니터링 하였다.
도 10b는 실시예 9에 기술된 정제로부터 선택된 분획의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 레인1: 칼럼에 로딩된 정화된 세균 추출물, 레인 2: 분획 E1. "M"은 NOVEX 샤프 사전 염색 단백질 표준(인비트로겐, Mw: 216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa)를 언급한다. 5 μL는 레인 M 및 레인 1에 로딩하였고, 5.8 μL은 SDS-PAGE 겔의 레인 2에 로링하였다.
도 11a는 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행된 항-ABD 아가로스에 ABD-융합 단백질 PEP17081의 정제의 크로마토그램을 나타낸다. 280nm에서 흡광도 신호 (실선) 및 전도성(점선)를 나타낸다. 샘플 주입점은 화살표로 나타낸다. FT 및 E는 각각 관류 분획 및 용출 분획을 언급한다.
도 11b는 실시예 10에 기술된 정제의 상이한 단계로부터 선택된 분획의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 레인 M: 5μL NOVEX 샤프 사전 염색 단백질 표준, 인비트로겐 (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa). 레인 1: 항-ABD 아가로스 칼럼에 로딩된 정화된 열처리 대장균 용해물 1.5μL. 레인 2: 항-ABD 아가로스 칼럼 (도 11a에서 FT)로부터 관류 5μL. 레인 3: 항-ABD 아가로스 칼럼(도 11a에서 e)로부터 용출 풀 3.6 μL. 레인 4: RPC (역상 크로마토 그래피)에 의해 추가로 정제하고, 완충액을 교환한 PEP17081 12 μL.
도 12a는 실시예 11에 기술된 바와 같이 수행된 항-ABD 아가로스상에 단백질 호르몬에 대한 C-말단에서 융합된 ABD035 (서열번호: 159)를 포함하는 단백질 1의 친화성 정제로부터 크로마토그램을 나타낸다. 샘플 주입점은 화살표로 나타낸다. 280 nm에서 흡광도 신호(실선) 및 전도성 (점선)을 나타낸다. FT, W 및 E는 각각 관류 분획, 세척 분획, 및 용출 분획을 언급한다. 제1 세척 단계, W1은 4CV의 TST로 수행하였고, 제2 세척단계 W2는 3CV의 5mM NH4Ac, pH 5.5로 수행하였다.
도 12b는 실시예 11에 기술된 정제로부터 선택된 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 레인 1-3: SEC 정제 단백질: 10 μg(1), 5 μg (2) 및 1 μg (3). 레인 4: 항-ABD 아가로스 컬럼에 로딩된 단백질 샘플, 즉 TST중에 1:10 희석된 SEC 정제된 단백질. 레인 5: FT 20 배 농축. 레인 6: W1 60 배 농축. 레인 7, 8 및 9: 용출 단백질: 10μg (7), 5μg (8) 및 1μg (9). "M"은 단백질 분자량 마커 (Mw: 200, 116.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31, 21.5, 14.4, 6, 3.5, 2.5 kDa)로 로딩하였다. 화살표는 SEC에 의해 정제된 샘플에서 SDS-PAGE 겔상에 가시 가능하였지만 항-ABD 아가로스 수지로 정제하여 효율적으로 제거한 오염 단백질의 약한 밴드를 나타낸다.
도 13a는 실시예 12에 기술된 바와 같이 수행된 항-ABD 아가로스상에서, 펩티드 호르몬에 대한 N-말단에서 융합된 ABD035 (서열번호:> 159)를 포함하는 단백질 2의 친화성 정제로부터 크로마토그램을 나타낸다. 샘플 주입점은 화살표로 나타낸다. 280 nm에서 흡광도(실선) 및 전도성(점선)을 나타낸다. FT, W 및 E는 각각 관류 분획, 세척 분획 및 용출 분획을 언급한다. 제1 세척 세척단계, W1은 8CV의 TST를 사용화여 수행하였고, 제2 세척 단계, W2는 3CV의 5mM NH4Ac, pH 5.5를 사용하여 수행하였다.
도 13b는 실시예 12에 기술된 정제로부터 선택된 분획의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 레인 1: 항-ABD 아가로스에 로딩된 단백질 샘플. 레인 2: FT. 레인 4-6: 세척 분획. 레인 7-13: 도 13a에 표시된 이중 피크 내에 용출된 단백질 분획. 이중 피크 내에 제1 피크에 대응하는 분획은 레인 7-10에 로딩하였다. "M"으로 표시된 레인은 단백질 분자량 마커 (Mw: 200, 116.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31, 21.5, 14.4, 6, 3.5, 2.5 kDa)를 사용하여 로딩하였다.
실시예
다르게 언급된 경우를 제외하고 다음 재료를 본 실시예 전반에서 사용하였다:
대장균 균주 XL1-블루(Agilent Technologies, cat. no. 200268)
알부민 결합 도메인 ABD001(서열번호 157), C-ABD001(서열번호 158), ABD035(서열번호 159), PP013(서열번호 160), PEP07986(서열번호 161) 및PEP07911(서열번호 162)은 실질적으로 국제공개공보 WO2009/016043 또는 WO2012/004384에 기술된 바와 같이 제조하였다.
실시예 1
ABD 결합 Z 변이체의 선별 및 스크리닝
재료 및 방법
표적 단백질의 비오티닐화: N-말단 시스테인(C-ABD001; 서열번호 158) 및 PEP07911(서열번호 162)를 갖는 ABD001을 EZ-링크 말레이미드 PEG2-비오틴(Pierce, cat. no. 21901)을 사용해 비오니틸화시켰다. 요약하면, 단백질을 50 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.5 중에 용해시켰다. 디티오트레이톨(DTT)을 20 mM의 최종 농도까지 첨가하고, 샘플을 엔드-오버-엔드(end-over-end) 혼합으로 34℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 완충액을 일회용 PD-10 컬럼(GE Healthcare, cat. no. 17-0851-01)을 사용하여 접합 완충액(50 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0)으로 교환하였다. 5배(5x) 몰 과량의 EZ-Link 말레이미드 PEG2-비오틴(접합 완충액 중 용해됨)을 단백질 샘플에 첨가하고, 엔드-오버-엔드 혼합으로 실온(RT)에서 2시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. PBS로의 후속 완충액 교환(10mM 인산염, 137mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4)을 PD-10 컬럼을 사용하여 수행하였다. PEP07986(서열번호 161)은 10x 몰 과량으로 No-Weigh EZ-링크 설포-NHS-LC-비오틴(Pierce, cat. no. 21327)을 사용하여 실온에서 30분 동안 제조자의 제안서에 따라 비오니틸화시켰다. PBS에 대한 후속 완충액 교환을 제조자의 설명서에 따라 투석 카세트(Slide-a-lyzer 3.5 K, 3500 MWCO, Pierce, cat. no. 66333)를 사용해 수행하였다.
ABD 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 실질적으로 문헌 [Gronwall et al(J Biotechnol, 128:162-183, 2007)]에 기술된 바와 같이 파지미드 pAY02047에 구성된, 박테리오파지에 디스플레이된 단백질 Z의 무작위 변이체의 라이브러리를 사용하여 ABD 결합 폴리펩티드를 선별하였다. 라이브러리 Zlib004Naive.I는 융합 파트너로서 Taq DNA 폴리머라제 결합 분자 Z03639(Gunneriusson et al, Protein Eng 12:873-878, 1999에서 기술됨, 여기에서 Z TaqS1-1 로서 명명됨)를 이용한다. 라이브러리는 실제 크기 1.4　x　1010 변이체를 가졌다.
파지 스톡을 20ℓ 배양기에서 제조하였다. 파지미드 라이브러리 Zlib004Naive.I를 함유하는 글리세롤 스톡으로부터의 세포를 2 % 글루코스 및 100 ㎍/ml 암피실린이 보충된 20ℓ의 TSB-YE(Tryptic Soy Broth-Yeast Extract; 30 g/l TSB, 5 g/ℓ 효모 추출물)에 접종하였다. 배양물을 배양기(Belach Bioteknik, BR20) 내에서 37℃에서 성장시켰다. 세포가 0.7-0.8의 광학 밀도(OD)에 도달했을 때, 대략 2.6ℓ의 배양물을 10x 몰 과량의 M13K07 헬퍼 파지(New England Biolabs, cat. no. N0315S)를 사용해 감염시켰다. 세포를 30분 동안 인큐베이션시킨 결과, 배양기를 0.1 mM IPTG(발현 유도를 위한, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드), 25 ㎍/ml 카나마이신 및 12.5 ㎍/ml 카르베니실린으로 보충된 TSB-YE와 함께 20ℓ까지 채웠고, 세포를 22시간 동안 30℃에서 성장시켰다. 배양물 내의 세포를 15900 g으로 원심분리시켜 펠렛화시키고, 배지 중에 남아있는 파지 입자를 PEG/NaCl(폴리에틸렌 글리콜/염화 나트륨)중에 2회 침전시키고, 상기 문헌 [Gronwall et al]에 기술된 바와 같이 PBS 및 글리세롤 중 여과하고 용해시켰다. 파지 스톡은 사용하기 전에 -80℃에서 저장하였다.
선별은 비오티닐화된 ABD의 상이한 변이체에 대해 3 주기로 수행하였다. 선별 주기들 사이의 파지 스톡 제조, 선별 절차 및 파지의 증폭은 실질적으로 WO2009/077175에서 다른 표적의 선별에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다. 0.1 % 젤라틴 및 0.1 % 트윈20이 보충된 PBS를 선별 완충액으로서 사용하였고, 표적-파지 복합체를 Dynabeads® M-280 스트렙타비딘(Dynal, cat. no. 112.06)에 의해 직접 캡처하였다. 0.25 ㎍ ABD 당 1 mg 비드를 사용하였다. 대장균 균주 XL1-블루를 파지 증폭에 사용하였다. 선별은 다음의 세개의 트랙으로 나누어진 3 주기로 수행하였다: PEP07911을 사용하는 하나의 트랙, C-ABD001을 사용하는 하나의 트랙 및 C-ABD001과 PEP07986 사이를 교차하는 하나의 트랙. 선별의 주기 1에서, 100 nM PEP07911 또는 C-ABD001을 상이한 선별 트랙에서 사용하였고, PBST 0.1 %(0.1 % 트윈-20으로 보충된 PBS)로 2회 세척을 수행하였다. 감소된 표적 농도 및 증가된 세척 횟수를 사용하는, 증가된 엄중도(stringency)를 후속 2개 주기로 적용하였다. 단지 하나의 표적을 갖는 선별 트랙의 경우, 50 nM 이어서 25 nM의 PEP07911 또는 C-ABD001을 각각 주기 2 및 3에 사용하였다. 대안적인 표적을 갖는 트랙에서는, 75 nM PEP07986을 주기 2에 사용하였고, 40 nM C-ABD001을 주기 3에 사용하였다. 모든 트랙에 경우, 4회 및 8회 세척을 PBST 0.1 %를 사용하여, 각각 주기 2 및 3에서 수행하였다. 세척 후, 결합된 파지를 500 ㎕ 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.2로 용출시키고, 이어서 50 ㎕ 트리스-HCl, pH 8.0 및 450 ㎕ PBS로 즉시 중화시켰다. 마지막 선별 주기에서, 모든 트랙을 0.5 M HAc, pH 4.0로 먼저 용출시키고, 이어서 상기 기술된 바와 같이 글리신-HCl로 용출시켰다. 상이한 용출물은 그후에 개별적으로 처리하였다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 선별된 Z 변이체 분자가 ABD의 상이한 변이체와 실제로 상호작용하는지를 검증하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다. 깊은-웰 플레이트(Nunc, cat. no. 278752) 중 100 ㎍/ml 암피실리 및 0.1 mM IPTG로 보충된 1 ml TSB-YE 배지 내로 선별물로부터의 단일 콜로니를 접종함으로써 Z 변이체를 제조하였다. 플레이트를 37℃에서 18-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 400 ㎕ PBST 0.05 %에서 재현탁시키고, -80℃에서 냉동시켜 세포의 주변세포질 분획을 방출시켰다. 냉동 샘플을 워터 배쓰에서 후속적으로 해동시키고, 냉동-해동을 8회 반복하였다. 400 ㎕ PBST 0.05 %를 샘플에 첨가하고,세포를 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 주변세포질 상청액은 AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG로서 발현되는, Taq DNA 폴리머라제 결합 분자 Z03639에 대한 융합물로서 Z 변이체를 함유하였다. Z#####는 개개 58개 아미노산 잔기 Z 변이체를 언급한다.
절반-영역 96-웰 ELISA 플레이트(Costar, cat. no. 3690)를 Z 변이체(Affibody, cat. no. 20.1000.01.0005)에 특이적인 항체 4 ㎍/ml를 함유하는 50　㎕/웰의 코팅 완충액(50 mM 탄산 나트륨, pH 9.6)으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 항체 용액을 따라 붓고, 웰을 실온에서 2시간 동안 100 ㎕의 PBSC(0.5 % 카세인으로 보충된 PBS; Sigma, cat. no. C8654)로 블로킹시켰다. 블로킹 용액을 버리고, 50 ㎕의 주변세포질 용액을 웰에 첨가하고, 느리게 진탕시키면서 RT에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 따라 붓고, 웰을 PBST 0.05　%로 4회 세척하였다. 그 후, PBSC 중 2 ㎍/ml 농도에서, 50 ㎕의 비오티닐화된 PEP07986 또는 PEP07911을 각각의 웰로 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 기술된 바와 같이 세척하였다. PBSC 중 1:30000 희석된 스트렙타비딘-HRP(Horseradish peroxidase; Thermo Scientific, cat. no. N100)를 웰로 첨가하고, 플레이트를 45분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 기술된 바와 같이 세척한 후, 50 ㎕ ImmunoPure TMB 기질(Thermo Scientific, cat. no. 34021)을 웰에 첨가하고, 플레이트를 제조자의 권고사항에 따라 처리하였다. 웰의 흡광도는 다중-웰 플레이트 판독기, Victor3(Perkin Elmer)를 사용해 450 nm에서 측정하였다.
양성 대조군으로서, 상기와 같이 발현되고 무관하지만 특이적인 표적 단백질에 결합하는 Z 변이체를 함유하는 주변세포질 분획을 5　㎍/ml의 이 표적 단백질에 대해 분석하고, 비오티닐화시켰다. 음성 대조군으로서, 동일한 주변세포질 제제를 PEP07986 또는 PEP07911에 대해 분석하였다. PEP07986 또는 PEP07911에 대해 양성 흡광도 값을 갖는 클론에 대해 서열분석을 수행하였다.
서열분석: PCR 단편을 표준 PCR 프로그램 및 프라이머 AFFI-21(5'-tgcttccggctcgtatgttgtgtg; 서열번호 163) 및 AFFI-22(5'-cggaaccagagccaccaccgg: 서열번호 164)를 사용하여 단일 콜로니로부터 2개의 단계에서 증폭시켰다. 증폭된 단편의 서열분석은 제조자의 프로토콜에 따라 사용되는, 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드 AFFI-72(5'-비오틴-cggaaccagagccaccaccgg; 서열번호 165) 및 BigDye® Terminator v3.1 주기 서열분석 키트(Applied Biosystems, cat. no. 4336919)를 사용해 수행하였다. 서열분석 반응물을 Magnatrix 8000(Magnetic Biosolution)을 사용하여 자기적 스트렙타빈 코팅된 비드(Detach Streptabidin Beads, Nordiag, cat. no. 2012-01)에 결합시켜 정제하고, ABI PRISM® 3130xl 유전자 분석기(PE Applied Biosystems) 상에서 분석하였다.
ELISA 블로킹: 그의 표적 결합이 HAS의 존재에 의해 영향을 받았는지 여부를 규명하기 위해, 초기 ELISA 스크린으로부터의 클론의 하부세트를 ELISA 블로킹 분석에 적용시켰다. 선별된 Z 변이체의 경우, 상기와 같이 동일한 주변세포질 분획을 사용하였다. ELISA 블로킹 분석은 표적 단계에서 도입된 다음 프로토콜 변형과 함께, ELISA 스크리닝 분석으로서 작동시켰다: HAS를 분석 플레이트에 첨가하기 전에 표적 단백질과 혼합하였다. 0.2 ㎍/ml의 비오티닐화된 PEP07911을 10x 몰 과량의 HSA와 혼합한 후, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켜 플레이트에 첨가하기 전에 복합체를 형성하였다. 양성 대조군으로서, 상기와 같이 발현되고 무관한 표적 단백질에 결합하는 분자를 함유하는 주변세포질 분획을 5　㎍/ml의 비오티닐화된 특이적 표적 단백질에 분석하였다. 음성 대조군으로서, 동일한 주변세포질 제제를 PEP07911에 대해 분석하였다. 블랭크로서, PBSC를 주변세포질 제제 대신에 첨가하고, 비오티닐화된 PEP07911을 표적으로서 첨가하였다. 모든 대조군을 상기와 같은 동일한 방식으로 HSA를 첨가한 그리고 천가하지 않은 샘플로서 제조하였다.
결과
ABD 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 개개 클론을 비오티닐화된 ABD의 상이한 변이체에 대해 3 주기의 파지 디스플레이 선별 후에 수득하였다. 파지 입자 수율(파지 입자 아웃(out)/파지 입자 인(in))은 각각의 주기 동안 증가하였는데, 이는 표적 결합 클론이 풍부함을 의미한다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 선별의 3 주기 후 수득한 클론을 96-웰 플레이트에서 생산하고, ELISA로 ABD 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. PEP07911에 대해 분석된 양성 클론(음성 대조군에 적어도 2x 상응하는 신호)의 선별의 결과는 도 2에 나타낸다. 무관한 단백질에 대해 특이적인 대조군 분자는 특이적 단백질에 대해 양성 신호를 나타내는 반면, PEP07986 또는 PEP07911에 대해서는 어떠한 신호도 얻지 못했다.
ELISA 블로킹: Z 변이체가 천연 리간드 HSA를 갖는 중복 결합 부위를 갖는지 여부를 확인하기 위해, PEP07986 또는 PEP07911에 대해 양성인 클론을 HSA를 포함하는 블로킹 분석에 적용시켰다. 모든 시험된 클론의 경우, PEP07911에 대한 결합 신호는 HSA의 존재에 의해 완전히 사라졌으며, 배경에서와 동일한 수준에 도달했다(도 3). 양성 대조군의 결합은 과량의 HSA의 첨가에 영향을 받지 않았고, 블랭크는 어떠한 배경 신호도 보이지 않았다.
서열분석: ELISA 스크리닝에서 ABD에 대해 양성 흡광도 값을 갖는 클론에 대해 서열분석을 수행하였다. 각각의 변이체에 고유의 식별번호 #####를 부여하고, 개별 변이체는 Z#####로서 지칭하였다. 58개 아미노산 잔기 길이 Z 변이체의 아미노산 서열은 도 1 및 서열번호 105-156로서 서열 목록에 나타낸다. 이들 Z 변이체의 추론된 ABD 결합 모티프는 BM#####로서 지칭하고, 도 1 및 서열번호 1-52로서 서열 목록에 나타낸다. 이들 Z 변이체 각각 내에 완전한 3중-나선 번들을 구성하도록 예상되는 49개 아미노산 잔기 길이 폴리펩티드의 아미노산 서열은 P#####로 지칭하고, 도 1 및 서열번호 53-104로서 서열 목록에 나타낸다.
실시예 2
ABD 결합 Z 변이체의 클로닝 및 생산
재료 및 방법
Z 변이체의 서브클로닝: 7개의 ABD 결합 Z 변이체, Z06608(서열번호 107), Z06620(서열번호 110), Z06638(서열번호 106), Z06650(서열번호 108), Z06677(서열번호 105), Z06678(서열번호 109) 및 Z06695(서열번호 111)의 DNA를 라이브러리 벡터 pAY02047로부터 증폭하였다. N-터미널 His6 태그 및 C-터미널 Cys를 갖는 이량체 Z 변이체 분자의 구성을 위한 서브클로닝 전략은 표준 분자 생물 기술을 사용하였고, 다른 표적에 결합하는 Z 변이체에 대하여 WO　2009/077175에 상세히 기술된 바와 같이 적용하였다. Z 유전자 단편을 발현 벡터 pAY01449 내로 서브클로닝하여 인코딩된 서열 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VDC를 생성하였다.
배양 및 정제: 대장균 BL21(DE3) 세포(Novagen)를 각각의 개개 Z 변이체의 이량체 유전자 단편을 함유하는 플라스미드로 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 1ℓ의 TSB + YE 배지(Tryptic Soy Broth with Yeast Extract) 중 37　℃에서 배양하였다. OD600 = 1에서, IPTG를 첨가하여 최종 농도 0.17 mM까지 단백질 발현을 유도하고, 배양물을 추가의 5시간 동안 37　℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리하여 수거하였다.
4.8 g의 각각의 세포 펠렛을 29 U/ml Benzonase®(Merck, cat. no. 1.01654.0001)이 보충된 30 ml의 변성 결합 완충액(20 mM 인산 나트륨, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸, 8 M 우레아, pH 7.4) 중 재-현탁시키고, 1시간 동안 실온에서 교반하면서 인큐베이션시켜 발현된 단백질을 방출시켰다. 세포 파편을 원심분리로 제거하고, 각각의 상청액을 1 ml His GraviTrap IMAC 컬럼(GE Healthcare, cat. no. 11-0033-99) 상에 적용시켰다. 오염물을 변성 결합 완충액, 천연 결합 완충액(20 mM 인산 나트륨, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.4) 및 세척 완충액(20 mM 인산 나트륨, 0.5 M NaCl, 60 mM 이미다졸, pH 7.4)으로 세척하여 제거하고, 그 후 ABD 결합 Z 변이체를 용출 완충액(20 mM 인산 나트륨, 0.5 M NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 7.4)으로 용출시켰다. 각각의 정제된 ABD 결합 Z 변이체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 10 mM NH4HCO3로 이동시켰다. 단백질 농도는 NanoDrop®ND-1000 분광광도계를 사용하고, 개개 단백질의 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. ABD 결합 Z 변이체를 동결건조시키고, 최종 생성물의 순도를 쿠사미 블루로 염색된 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 각각의 정제된 ABD 결합 Z 변이체의 정체는 HPLC-MS 분석을 사용해 확인하였다.
결과
배양 및 정제: N-터미널 His6 태그 및 C-터미널 Cys를 가지며 이량체로서 구성된, 7개의 ABD 결합 Z 변이체 Z06608(서열번호 107), Z06620(서열번호 110), Z06638(서열번호 106), Z06650(서열번호 108), Z06677(서열번호 105), Z06678(서열번호 109) 및 Z06695(서열번호 111)는 대장균에서 잘 발현되었다. 4.8 g의 박테리아 펠렛으로부터의 IMAC-정제된 단백질의 양은 상이한 ABD 결합 Z 변이체에 대해 3 mg 내지 19 mg 범위로, 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 분광광도계적으로 결정하였다.
각각의 최종 단백질 제제의 SDS-PAGE 분석은 이들이 개별 ABD 결합 Z 변이체를 주로 함유하였음을 보여주었다. 각각의 ABD 결합 Z 변이체의 정확한 분자량은 HPLC-MS에 의해 확인하였다.
실시예 3
ABD 결합 Z 변이체의 결합 및 용출 특성의 평가
본 실시예에서는, 각각 실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같이 선별되고 생산된 ABD 결합 폴리펩티드 세트의 결합 및 용출 특성을 스핀 컬럼을 사용하여 소-규모 형태로 연구하였다.
재료 및 방법
수지에 대한 ABD 결합 Z 변이체의 커플링: 실시예 2에서 기술된 바와 같이 생산된 His6-(Z#####)2-Cys 포맷으로, 1 mg의 각각의 동결건조된 ABD 결합 Z 변이체 Z06608, Z06620, Z06638, Z06650, Z06677, Z06678 및 Z06695를 환원 완충액(50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, 20 mM DTT, pH 8.5) 중에 재현탁시키고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 환원된 단백질 용액을 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 50 mM DTT를 포함하는 결합 완충액(50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.5)으로 이동시킨 후, 0.2 ml의 설포링크 결합 수지(Thermo Fisher Scientific, cat. no. 20401)의 부분과 혼합하였다. 이 절차는 티오에테르 공유 결합을 형성하여, ABD 결합 Z 변이체의 C-터미널 시스테인 잔기의 티올기와 수지의 요오드아세틸기 사이의 부위-지시된 반응을 가능하게 한다. 상기 커플링 반응은 제조자의 설명서에 따라 수행하였다. 수지 ml 당 커플링된 ABD 결합 Z 변이체로서 정의되는, 커플링의 정도는 다음과 같이 결정하였다: 커플링된 ABD 결합 Z 변이체의 양은 280 nm에서 흡광도의 분광광도계적 측정에 의해 수득된 농도를 기초로 하여, 본래 샘플의 양에서 결합하지 않은 물질의 양을 감산하여 계산하였다. 그 후 mg인 커플링된 ABD 결합 Z 변이체의 양을 설포링크 커플링 수지의 용적으로 나누어주었다.
컬럼 연구 I: 순수한 샘플을 사용하는 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지의 평가: 제1 컬럼 연구를 수지에 커플링된 7개의 ABD 결합 Z 변이체 각각의 결합, 세척 및 용출 특성에 대해 하였고, ABD 융합 단백질 PEP08517의 사전 정제된 샘플을 사용하였다. PEP08517은 단백질 Z의 사이토카인 결합 변이체에 대해 그의 N-말단에 융합된 알부민 결합 도메인 PP013(서열번호 160)을 포함한다. 수지의 0.1 ml 부분을 시험 튜브로 이동시키고, PEP08517의 순수한 샘플 0.1 ml를 결합 완충액 중 2　mg/ml로 첨가하였다. 튜브를 실온에서 1시간 동안 바퀴를 회전시키며 인큐베이션시켰다. 각각의 샘플-수지 믹스(mix)를 빈 스핀 컬럼으로 이동시켰다. 결합하지 않은 단백질을 원심분리(관류, FT)에 의해 수집하였다. 표 1에서 명시된, 0.1 ml의 상이한 용액을 그 후 세척을 위해 첨가하고, 후속적으로 결합된 PEP08517 분자를 용출시켰다. 각각의 세척 및 용출 분획은 원심분리에 의해 수집하였다.
수집된 분획을 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 분광광도계로 분석하였다.
컬럼 연구 I에서 샘플 및 용액의 명세서
단계 샘플 / 용액 약어
1 50 mM 트리스-HCl 중 PEP08517의 순수한 샘플, 5 mM EDTA, pH 8.5 PEP08517
2 결합되지 않은 PEP08517 FT
3 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4 PBS
4 5 mM 트리스-HCl, pH 8 트리스
5 0.5 M HAc / NaAc, pH 4 pH 4(a)
6 0.5 M HAc / NaAc, pH 4 pH 4(b)
7 0.5 M HAc, pH 2.5 pH 2.5(a)
8 0.5 M HAc, pH 2.5 pH 2.5(b)
컬럼 연구 II: 박테리아 추출물을 사용하는 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지의 평가: 제2 컬럼 연구는 컬럼 연구 I로부터의 4개의 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지의 결합, 세척 및 용출 특성을 추가적으로 시험하기 위해 수행하였다. 이들 수지의 리간드는 His6-(Z06608)2-Cys, His6-(Z06638)2-Cys, His6-(Z06677)2-Cys 및 His6-(Z06650)2-Cys였다. HSA 세파로스(CNBr-활성화된 세파로스 4 Fast Flow에 대해 자유 아민을 통해, 제조자의 설명서에 따라, 결합된 인간 혈청 알부민, GE Healthcare, cat. no. 17-0981)로 채워진 추가적인 컬럼은 참조로서 포함되었다. 초음파처리 및 원심분리에 의해 대장균 펠렛으로부터 제조된, 정화된 박테리아 추출물을 본 실험의 샘플로서 사용하였다. (단백질 Z의 변이체에 결합하는 PDGFR-β(혈소판 유래된 성장 인자 베타)에 대해 그의 N-말단에 융합된 알부민 결합 도메인 PP013(서열번호 160)을 포함하는) PEP08515의 대략 0.5 mg을 함유하는, 0.17 m의 박테리아 추출물을 각각의 개별 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지 또는 HSA 세파로스로 채워진 스핀 컬럼으로 이동시켰다. 관류를 원심분리에 의해 수집하였고, 컬럼에 2회 재적용시켰다. 표 2에 명시된 상이한 용액을 첨가하여 박테리아 숙주 단백질을 제거하고, 후속적으로 결합된 PEP08515 분자를 용출시켰다. 세척 및 용출 분획을 원심분리에 의해 수집하였고, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 분광광도계로 분석하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
컬럼 연구 II에서 샘플 및 용액의 명세서
단계 샘플 / 용액 약어 용적(ml)
1 샘플: PEP08515를 함유하는 박테리아 추출물 PEP08515 0.17
2 샘플 적용 후 수집된 관류 I FT I 0.17
3 관류 I의 재적용 후 수집된 관류 II FT II 0.17
4 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4 PBS 4 x 0.2
5 5 mM NH4Ac, pH 5.5 NH4Ac 2 x 0.2
6 0.1 M 시트르산 나트륨, pH 3.0 pH 3.0(a) 0.1
7 0.1 M 시트르산 나트륨, pH 3.0 pH 3.0(b) 0.1
8 0.5 M HAc, pH 2.5 pH 2.5(a) 0.1
9 0.5 M HAc, pH 2.5 pH 2.5(b) 0.1
결과
ABD 결합 폴리펩티드의 결합 효능: 설포링크 커플링 수지에 대한 각각의 ABD 결합 폴리펩티드의 커플링의 정도는 표 3에 나타낸다.
설포링크 수지에 대한 ABD 결합 Z 변이체의 결합의 정도
Figure pct00001
컬럼 연구 I: 순수한 샘플을 사용하는 ABD 결합 Z 변이체 - 커플링된 수지의 평가: 표 1에 명시된 상이한 세척 및 용출 단계 후 7개의 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지 각각으로부터 방출된 샘플 PEP08517의 양은 280 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타낸다.
연구된 조건 하에서, ABD 결합 Z 변이체(His6-(Z06608)2-Cys, His6-(Z06638)2-Cys, His6-(Z06650)2-Cys) 및 His6-(Z06677)2-Cys로 커플링된 수지는 각각 샘플 적용 및 세척 동안 약간의 샘플 누출과 함께 가장 유리한 용출 프로파일을 나타냈고, 대부분의 샘플은 pH 2.5 완충액으로의 용출에서 방출되었다.
ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지 중 어떤 것도 pH 4에서 대부분의 샘플을 용출시키지 않았다. 흥미롭게도, 일부 수지, 예를 들면 His6-(Z06608)2-Cys는 pH 2.5 완충액("pH 2.5(b)")의 제2 첨가에서 대부분의 샘플을 용출시킨 반면, 예를 들면 His6-(Z06677)2-Cys는 제 1 pH 2.5 완충액 첨가("pH 2.5(a)")에서 대다수의 샘플을 용출시켰으며, 이것은 다른 후보물질과 비교할 때 더 높은 용출 pH가 친화성 리간드 His6-(Z06677)2-Cys와 함께 사용될 수 있음을 나타낸다.
컬럼 연구 II: 박테리아 추출물을 사용하는 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지의 평가: 친화성 리간드 His6-(Z06608)2-Cys, His6-(Z06638)2-Cys, His6-(Z06650)2-Cys 및 His6-(Z06677)2-Cys를 포함하는, 컬럼 연구 I으로부터의 4개의 최적 수행 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지를 추가의 결합, 세척 및 용출 연구를 위해 선택하였고, 여기에서 PEP08515를 함유하는 박테리아 추출물을 샘플로서 사용하였다. 표 2에 명시된 상이한 용출 단계 후, 4개의 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지 각각으로부터, 또는 참조로서 포함된 HSA-세파로스 수지로부터 방출된 PEP08515의 양은 280 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 5a에 나타낸다.
동일한 용출된 분획의 SDS-PAGE 분석은 도 5b에 나타낸다. 2개의 분석으로부터의 결과는 잘 부합되었는데, 다시 말하면 특정 친화성 리간드의 경우, 높은 흡광 판독을 갖는 용출된 분획이 또한 SDS-PAGE 겔 상에서 두꺼운 밴드를 나타냈고, 낮은 흡광 판독을 갖는 분획의 경우는 반대였다. 컬럼 연구 I에서와 같이, His6-(Z06677)2-Cys와 커플링된 수지는 용출의 더 높은 pH 범위("pH 3(a)" 및 "pH 3(b)")에서 대다수의 결합된 단백질이 방출되었다.
모든 용출된 샘플의 순도는 일반적으로 아주 높았지만(SDS-PAGE 분석으로부터 추측시, 95　%를 초과함), 상이한 ABD 결합 Z 변이체의 경우 약간의 차이를 관찰할 수 있었다.
HSA 세파로스 수지와 비교할 때(도 5c에서 나타난 SDS-PAGE 분석), ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지는 흡광도 판독 및 SDS-PAGE 분석 둘 모두로부터 판단된 바와 같이 더욱 유리한 용출 특성 뿐만 아니라 더 높은 결합 능력을 갖는 것으로 보인다. 능력면에서의 차이는 리간드 밀도의 차이로 기인하지 않을 수 있다; 사실상 HSA 세파로스 상에 커플링된 HSA 분자의 수는 ABD 결합 Z 변이체-커플링된 수지와 비교할 때 대략 1.5 - 2.2배 더 높았다.
실시예 4
ABD 결합 Z 변이체의 추가적인 특성 및 컬럼 연구
실시예 3에서 나타난 결과에 기초하여, His6-(Z06677)2-Cys를 크로마토그래피 시스템에 연결된 컬럼 상에서 추가적인 특성 및 연구를 위해 선별하였다.
재료 및 방법
원형 이색성 분석에 의한 융점의 결정: 원형 이색성(CD) 분석을 수행하여 His6-(Z06677)2-Cys의 융점(Tm)을 결정하였다. 정제된 샘플을 PBS 중 0.5 mg/ml로 희석시켰다. 가변 온도 측정(VTM)을 수행하였는데, 5　℃/분의 온도 슬로프(temperature slope)를 갖는, 20　℃ 내지 90　℃의 샘플의 가열 동안 220 nm에서 흡광도를 모니터링하였다. Tm은 CD 신호 대 온도 플롯에서의 이행의 중간점으로부터 결정하였다. CD 측정은 1 mm의 광로 길이를 갖는 세포를 사용하여 Jasco J-810 분광편광계(Jasco Scandinavia AB) 상에서 수행하였다.
용출 pH의 크로마토그래피 연구: His6-(Z06677)2-Cys를 활성화된 EAH-세파로스 4B(GE Healthcare, cat. no. 17-0569-01) 상에 고정시켰다. 활성화 및 고정화는 제조자의 설명서에 따라 수행하였고, 커플링의 정도는 실시예 3에 기술된 바와 같이 결정하였다. 활성화된 EAH 세파로스는 친화성 리간드의 C-말단 시스테인을 통해 부위 특이적 커플링을 가능하게 하는 요오드아세틸기를 함유한다. 0.43 ml의 수지를 Tricorn 5/50 컬럼(GE Healthcare) 내에 채웠다. 참조로서, 0.47 ml의 HSA 세파로스(실시예 3 참조)를 동일한 종류의 컬럼 내에 채웠다.
용출 실험은
Figure pct00002
익스플로러 10 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 2개의 컬럼을 시스템에 부착하고 PBS로 평형화시켰다. 1 mg PEP08519 (단백질 Z의 Taq 폴리머라제 결합 변이체에 대해 그의 N-말단에 융합된 알부민 결합 도메인 PP013(서열번호 160)을 포함함)를 함유하는 샘플 2 ml를 각각의 컬럼 상에 로딩한 다음, PBS 및 0.1 M 시트르산 나트륨, 0.9 % NaCl, pH 5.5로 세척하였다. 결합된 단백질은 16 컬럼 용적(CV)에 걸쳐 pH 5.5 내지 pH 2.3(0.1 M 시트르산 나트륨, 0.9 % NaCl, pH 5.5, 및 0.1 M 시트르산 나트륨, 0.9 % NaCl, pH 2.3를 사용함) 범위의 선형 pH 구배에 의해 용출시켰다. pH는
Figure pct00003
익스플로러 시스템의 내장 pH 미터에 의해 모니터링하였다.
ABD 결합 폴리펩티드의 결합 능력 및 알칼리 저항성의 크로마토그래피 연구: 본 실험에서는, 동적 결합능 및 알칼리에 대한 저항성을 이전 항목에서 기술된 크로마토그래피 연구에서 사용된 Tricorn 5/50 컬럼 내에 채워진 His6-(Z06677)2-Cys 수지 및 HSA 세파로스 수지에 대해 시험하였다.
본 실험은
Figure pct00004
익스플로러 10 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다. 2개의 컬럼을 시스템에 부착시켰고 PBS로 평형화시켰다. 능력 연구를 위해, 컬럼에서 나오는 용액의 280 nm에서의 흡광도가 본래 샘플의 흡광도의 10%(즉, 10% 브레이크스루)에 도달할 때까지, PBS 중 0.25　mg/ml의 PEP08519를 함유하는 샘플을 0.2　ml/분(2.4 분의 거주 시간에 상응함)의 유속으로 각각의 컬럼 상에 로딩하였다. 사장(dead) 용적(즉, 친화성 리간드를 포함하지 않는 컬럼을 통과한 샘플을 이동시켜 측정된, 튜브 및 컬럼 용적)을 샘플 용적으로부터 감산하였다. 결합된 단백질은 0.1 M 시트르산 나트륨, 0.9 % NaCl, pH 2.3로 용출시켰다. 그 후 컬럼을 PBS로 재평형화시켰다.
능력 시험(run) 후, 1 ml/분 유속으로 5 CV의 0.2 M NaOH를 적용시켜 컬럼을 알칼리 처리한 후, 유동 없이 인큐베이션 기간을 두었다. 알칼리 내에서 총 인큐베이션 시간은 25분이었다. 컬럼의 중화는 1 ml/분으로 5 CV의 PBS로 세척을 수행한 후, 상기 기술된 바와 같이 새로운 능력 측정을 수행하였다.
2회 더 알칼리 처리 후, 상기와 같이 능력 측정을 수행하였지만, NaOH 농도는 0.5 M까지 증가하였고, 마지막 알칼리 처리에서, 인큐베이션 시간을 2시간까지 연장하였다.
결과
원형 이색성 분석: His6-(Z06677)2-Cys의 융점은 54℃인 것으로 결정되었다.
ABD 결합 Z 변이체의 용출 pH의 크로마토그래피 연구: 활성화된 EAH 세파로스 수지에 대한 His6-(Z06677)2-Cys의 결합 정도는 수지 ml 당 2.8 mg의 폴리펩티드인 것으로 결정되었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, His6-(Z06677)2-Cys 수지를 함유하는 컬럼으로부터의 ABD-융합 분자 PEP08519의 용출은 HSA 세파로스 수지에 의한 컬럼으로부터의 용출 보다 구배 중 더 빨리(즉, 더 높은 pH에서) 나타났으며, 이는 또한 관류로부터 나오는 더 큰 분획을 갖는 더 낮은 결합능을 보여주었다.
His6-(Z06677)2-Cys 컬럼으로부터 용출된 피크에 대한 피크 최대치에서 pH는 3.3인 반면, HSA 세파로스 컬럼에 대한 상응하는 pH는 2.6이었다.
ABD 결합 Z 변이체의 결합능 및 알칼리 저항성의 크로마토그래피 연구: 동적 결합능력은 10% 브레이크스루(breakthrough)까지의 샘플의 양을 측정하여 결정하였다. His6-(Z06677)2-Cys 컬럼의 동적 결합능은 수지 ml 당 3.0 mg PEP08519인 것으로 측정되었다. HSA 세파로스 컬럼에 대해 상응하는 능력은 수지 ml 당 0.5 mg인 것으로 측정되었다. 실시예 3에서와 같이, 능력의 차이는 리간드 밀도의 차이로서는 설명될 수 없는데, 이는 고정된 HSA 분자의 수가 그들 각각의 수지 상의 His6-(Z06677)2-Cys 분자의 숫자의 2배인 것으로 추정되기 때문이다.
동적 결합능력을 각각의 알칼리 인큐베이션 후 다시 측정하였다. 결과는 도 7에 나타낸다. 모든 인큐베이션 후, His6-(Z06677)2-Cys 컬럼은 그의 본래 능력을 유지하였다. 이것은 상대적으로 엄격한 알칼리 조건에 대해 높은 저항성을 나타내는데, 이는 컬럼의 반복 사용을 가능하게 하는 소정의 위치에서 세정(CIP) 절차에서 중요한 양상이다. 반면, 참조로서 포함된 HSA 세파로스 컬럼은 0.2 M NaOH 중 25분 후, 그의 능력의 대부분을 손상했다.
실시예 5
상이한 수지 상에 고정된 ABD 결합 Z 변이체의 컬럼 연구
본 실시예에서는, ABD 결합 Z 변이체 His6-(Z06677)2-Cys를 4개의 상이한 종류의 수지 상에 고정시키고, 결합능력 및 알칼리 저항성을 크로마토그래피로 평가하였다.
재료 및 방법
상이한 수지에 대한 His 6 -(Z06677) 2 -Cys의 커플링: 4 mg의 동결건조된 His6-(Z06677)2-Cys(실시에 2에서 기술된 바와 같이 제조됨)을 1 ml 0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3 중에 용해시켰다. 샘플의 절반을 0.67 ml의 NHS-활성화된 세파로스 4 Fast Flow(GE Healthcare, cat. no. 17-0906) 상에 고정시키고, 샘플의 절반을 0.67 ml의 CNBr-활성화된 세파로스 4 Fast Flow(GE Healthcare, cat. no. 17-0981) 상에 고정시켰다. 커플링 반응 둘 모두는 제조자의 설명서에 따라 수행하였다.
2 mg의 동결건조된 His6-(Z06677)2-Cys를 0.5 ml 50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, 20 mM DTT, pH 8.5 중에 용해키시고, 2시간 동안 인큐베이션시켰다. DTT를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하고, 환원된 폴리펩티드를 0.67 ml의 커플설포링크 수지와 혼합하였다. 커플링 반응은 제조자의 설명서에 따라 수행하였다.
본 실험에서 평가된 4번째 수지는 실시예 4에서 기술된 바와 같은 His6-(Z06677)2-Cys와 함께 고정된 EAH 세파로스였다.
각각의 수지의 커플링의 정도는 실시예3에서 기술된 바와 같이 결정하였다.
4개의 ABD 결합 수지의 결합능력 및 알칼리 저항성의 크로마토그래피 연구: 4개의 His6-(Z06677)2-Cys-커플링된 수지를 Tricorn 5/50 컬럼 내에 채웠다. 동적 결합능력을 시험한 후, 수지를 2시간 동안 0.5 M NaOH에 적용시키고, 이어서 제2 동적 결합능력 시험을 하였다. 능력 시험 및 알칼리 인큐베이션은 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
상이한 수지에 대한 ABD 결합 Z 변이체 His 6 -(Z06677) 2 -Cys의 커플링:
본 실험에서 평가된 4개의 상이한 수지 각각에 대한 His6-(Z06677)2-Cys의 고정화의 정도는 표 5에 나타낸다.
표 5: 상이한 수지에 대한 His6-(Z06677)2-Cys의 커플링의 정도
Figure pct00005
4개의 ABD 결합 수지의 결합능력 및 알칼리 저항성의 크로마토그래피 연구: 4개의 수지 각각에 대한 His6-(Z06677)2-Cys의 커플링 후 결정된 동적 결합능력은 표 6에 나타낸다.
표 6: 상이한 수지에 대해 커플링된 His6-(Z06677)2-Cys의 동적 결합능력
Figure pct00006
설포링크 커플링 수지 및 활성화된 EAH 세파로스의 2개의 요오드아세틸-커플링된 수지의 동적 결합능력은 각각 수지 ml 당 2.3 및 3.4 mg 샘플인 것으로 측정되었다. 그러나, 친화성 리간드의 몰 당 결합할 수 있는 샘플의 몰량을 비교하는 경우, 이들 수지는 동일한 동적 결합능력(His6-(Z06677)2-Cys 리간드의 1.4 mol의 샘플/몰)을 보였다. 달리 말하면, 설포링크 수지에 대해 커플링된 His6-(Z06677)2-Cys의 경우, EAH 세파로스 수지에 대해 커플링된 His6-(Z06677)2-Cys와 비교할 때 이량체 내에 2개의 Z 분자가 각각 더 높은 규모로 샘플 분자에 결합한다.
2개의 아민-커플링된 수지, 즉 NHS-활성화된 세파로스 및 CNBr-활성화된 세파로스의 동적 결합능은 2개의 요오드아세틸-커플링된 수지의 경우보다 더 낮았다. 이것은 요오드아세틸 수지에 대한 커플링을 위해 사용된 바와 같은, 단일 시스테인을 통한 부위 특이적 고정화가 이동 상에서 ABD 결합 Z 변이체의 결합 부위를 샘플 분자에 더욱 접근가능하게 한다는 것을 나타낸다.
NHS 수지가 친화성 리간드를 더욱 접근가능하게 함으로써, 이론적으로 능력을 개선시키는 스페이서 암(spacer arm)을 보유한다는 사실에도 불구하고, NHS 수지의 동적 결합능력은 CNBr 수지와 비교할때 절반 미만이었다.
2시간 동안 0.5 M NaOH로 알칼리 처리 후, 4개의 상이한 수지의 동적 결합능력을 표 7에 나타낸다. 요오드아세틸-커플링된 수지의 동적 결합능력은 알칼리 인큐베이션에 의해 영향을 받지 않은 반면, 아민-커플링된 수지의 능력은 대략 10% 낮아졌다.
표 7. 알칼리 처리 전과 후의 동적 결합능력의 비교
Figure pct00007

실시예 6
항-ABD 아가로스의 생산
본 실시예는 C-말단 Cys를 가지며, 이량체 형태인 ABD 결합 Z 변이체 Z006677, 즉 (Z06677)2-Cys의 대규모 생산, 그리고 설포링크 커플링 수지 상에서의 이의 후속 고정화를 기술한다.
재료 및 방법
배양 및 정제: 발현이 T7 프로모터에 의해 조절되는 발현 벡터 내로 ABD 결합 Z 변이체 Z06677는 발현이 T7 프로모터에 의해 조절되는 발현 벡터 내에 이량체로서 서브클로닝하였다. ABD 결합 폴리펩티드는 추가 N-말단 아미노산 서열 GSSLQ 및 추가적인 C-말단 아미노산 서열 VDC로 발현시켰다. 따라서, 발현된 폴리펩티드는 서열 GSSLQ-[Z06677][Z06677]-VDC를 가진다. 대장균 BL21(DE3) 세포(Novagen)를 플라스미드로 형질전화시키고 50 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 20ℓ의 TSB + YE 배지(Tryptic Soy Broth with Yeast Extract)중에 37℃에서 배양하였다. OD600 = 1에서, 0.17 mM의 최종농도로 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 배양물을 추가의 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리하여 수거하였다.
실시예 4 및 실시예 5에서 나타낸 바와 같이, His6-(Z06677)2-Cys은 알칼리에 대해 저항성이 있는 것으로 증명되었다. 이러한 특성은 (Z06677)2-Cys의 정제에 있어서 장점이 있는데, 그 이유는 높은 농도의 NaOH가 세포 파괴 및 정제에 모두에 기여하고, 대장균 숙주 단백질의 대부분이 높은 pH에서 변성되는 반면, (Z06677)2-Cys는 용액 중 남아있기 때문이다.
Ultra-Turrax T-50 베이직(IKA WERKE)을 사용하여 165 g의 세포 펠렛을 1.2 ℓ의 0.5 M NaOH 중에 재현탁시켰다. 현탁액을 교반시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, -20℃에서 냉동시켰다. 냉동 샘플을 해동시키고, 20 mM의 최종 농도까지 300 ml의 2 M HCl 및 트리스 염기를 첨가하여 pH 8.2로 적정하였다. 세포 파편, 변성된 단백질 및 DNA를 원심분리하여 제거하였다. 샘플을 정화시키기 위해, 10 U/ml의 최종 농도까지 800 ml의 [20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 4.6 g DTT] 및 Benzonase®(Merck, cat. no. 1.01654.0001)를 첨가하였고, 인큐베이션을 실온에서 1시간 동안 진행하였다. 그 후, 300 g의 황산 암모늄을 1 M의 농도까지 첨가하고, 샘플을 40분 동안 교반시키면서 실온에서 인큐베이션시켰다. 황산 암모늄 첨가 후 침전된 단백질을 원심분리로 제거한 후, Nalgene 바틀 탑 필터(0.45 ㎛)를 통해 여과시켰다.
아세토니트릴(ACN)을 2 %(v/v) 농도까지 샘플에 첨가하였다. 샘플은
Figure pct00008
익스플로러 100 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 125 ml의 SOURCE 30 RPC(GE Healthcare)으로 채워진 FineLine 35 컬럼(GE Healthcare) 상으로 로딩시켰다. 컬럼을 0.1 % TFA(트리-플루오로 아세트산)을 함유하는 Milli-Q 물 중 2 % ACN으로 세척한 후, 4 %의 ACN을 함유하는 동일한 완충액으로 세척하였다. 결합된 단백질을 15 CV에 걸쳐 4 % 내지 25 % ACN으로 ACN 농도를 증가시켜 용출시켰다. 용출된 분획을 수집하고, SDS-PAGE 및 LC-MS로 분석하였다. 관련 분획을 풀링시키고, 500 ml의 Sephadex G-25(GE Healthcare)으로 채워진 XK-50 컬럼(GE Healthcare)를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 커플링 완충액(50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.5)으로 이동시켰다. 완충액 교환된 샘플을 280 nm에서 흡광도를 측정하여 분광광도계적으로 분석하고, (Z06677)2-Cys의 여러가지 상이한 양을 로딩시켜 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 그 후 쿠마시 블루로 염색하여 분석하였다.
수지에 대한 ABD 결합 폴리펩티드(Z06677) 2 -Cys의 커플링: 커플링 완충액 중 3.4 mg/ml 농도로 (Z06677)2-Cys를 함유하는 샘플을 20 mM의 농도까지 DTT를 첨가하여 환원시킨 후, 실온에서 1시간 동안 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 커플링 완충액으로 예비 평형화된, 500 ml Sephadex G-25로 채워진 XK-50 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 DTT를 제거하였다. 환원된 (Z06677)2-Cys를 수지 ml 당 6 mg의 (Z06677)2-Cys의 비율로 설포링크 커플링 수지(Thermo Scientific, cat. no. 20404)와 함께 혼합하였다. 이후의 커플링 반응은 제조자의 지시에 따라 수행하였지만, 단백질-수지 혼합물의 인큐베이션을 15 내지 35분으로 연장하였다. 커플링 효율은 커플링되지 않은 단백질의 SDS-PAGE 분석으로 평가하였다.
결과
배양 및 정제: 정제된 이량체 ABD 결합 Z 변이체(Z06677)2-Cys는 SDS-PAGE에 의해 및 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 분광광도계로 분석하였다. (Z06677)2-Cys는 트립토판이 부재하였는데, 이는 280 nm에서 낮은 흡광도 판독을 초래하였다. 그러므로 Z 변이체 분자의 농도는 SDS-PAGE 분석으로부터 평가되었는데, 이는 여러가지 상이한 양의 (Z06677)2-Cys를 포함하였다. SDS-PAGE 겔의 육안 검사는 대략 95%의 순도로 3.4 mg/ml까지 (Z06677)2-Cys의 농도로 평가되었다.
수지에 대한 ABD 결합 폴리펩티드 (Z06677) 2 -Cys의 커플링: 리간드 밀도는 커플링 반응의 커플링되지 않은 단백질 분획 상의 SDS-PAGE 겔 이동을 육안 검사함으로써 5.8 mg (Z06677)2-Cys/ml 설포링크 커플링 수지로 추정하였다.
생산된 (Z06677)2-Cys-커플링된 수지는 추가로 "항-ABD 아가로스"로 언급되고, 다음 실시예에서, 이것을 다양한 크기 및 기능의 상이한 단백질과 융합하여 상이한 알부민 결합 도메인 모이어티에 결합한다는 측면에 있어서, 수지의 넓은 적용성을 증명하기 위해 사용하였다. 성공적인 정제는 표적 단백질 내에 ABD 모이어티가 위치하는지 여부와 상관없이 달성되는 것으로 나타난다. 달리 말하면, ABD 모이어티는 한쪽 측면 상에 다른 단백질 모이어티에 의해 플랭크되도록 N-말단, C-말단 또는 심지어 융합 단백질 내에 위치될 수 있다.
실시예 7
항-ABD 아가로스를 사용하는 PEP10986의 정제
본 실시예에서는, 단백질 Z의 사이토카인 결합 변이체에 대해 그의 N-말단에 융합된 알부민 결합 도메인(PP013, 서열번호 160)을 포함하는 PEP10986(12.5 kDa)을 항-ABD 아가로스로 채워진 컬럼을 사용하여 정제하였다.
재료 및 방법
가용성 PEP10986를 포함하는 펠렛화된 대장균 세포를 20 U/ml Benzonase® 세포가 보충된 TST-완충액(트리스, 식염수, 트윈: 25 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.05 % 트윈 20, pH 8.0) 중에 현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 파괴시키고, 세포 파편은 원심분리하여 제거하였다. 크로마토그래피는
Figure pct00009
익스플로러 100 시스템을 사용하여 수행하였다. 정화된 샘플을 100 ml 항-ABD 아가로스(실시예 6에 기술된 바와 같이 제조됨)로 채워진 XK-50 컬럼 상에 적용시키고, TST로 예비-평형화시켰다. 컬럼을 8 CV의 TST, 이어서 8 CV의 5 mM NH4Ac pH 5.5로 세척하였다. 결합된 단백질을 3 CV의 0.1 M HAc, pH 2.9를 적용시켜 용출시켰다. 관류 분획, 세척 분획 및 용출된 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-MS에 의한 추가적인 분석을 위해 수집하였다.
다음에 항-ABD 아가로스 수지의 강도 및 알칼리 안정성을 조사하기 위해, 여러차례 정제 후, 각각 2-3 컬럼 용적의 0.5 M NaOH의 CIP(소정의 위치에서 세정) 주기를 상기와 같은 동일한 컬럼을 사용하여 수행하였다.
결과
항-ABD 아가로스 수지 상의 PEP10986의 정제로부터의 크로마토그램은 도 8a에 나타내고, 선별된 분획의 SDS-PAGE 분석은 도 8b에 나타낸다. 도 8B에서 각각 레인 2, 3 및 4에 상응하는 용출된 분획 E1, E2 및 E3를 풀링하였다. PEP10986의 정확한 질량은 HPLC-MS 분석에 의해 확인하고, 순도는 SDS-PAGE 분석으로부터 판단시 95% 보다 높은 것으로 평가되었다. 분광광도계적 분석에 따르면, 풀은 대략 90%의 수율에 상응하는, 908 mg의 정제된 PEP10986을 함유하였다.
항-ABD 아가로스 수지의 강도 및 알칼리 안정성은 PEP10986 및 다른 ABD 융합 분자 모두를 추가로 정제하고, 이어서 본 실시예에서와 같은 동일한 컬럼을 사용하여, 2-3 컬럼 용적의 0.5 M NaOH의 CIP(소정의 위치에서 세정) 주기를 거쳐 확인하였다. 23 CIP 주기 후, 능력면에서 어떠한 유의미한 감소도 관찰되지 않았다.
실시예 8
항-ABD 아가로스를 사용하는 PEP03973의 정제
본 실시예에서는, 단백질 Z의 HER2(인간 상피 성장 인자 수용체 2) 결합 변이체에 대해 그의 N-말단에 융합된 야생형 알부민 결합 도메인(ABD001, 서열번호 157)을 포함하는 PEP03973(12.4 kDa)을 항-ABD 아가로스로 채워진 컬럼을 사용하여 정제하였다.
재료 및 방법
가용성 PEP03973를 포함하는 펠렛화된 대장균 세포를 20 U/ml Benzonase® 세포로 보충된 TST-완충액 중에 현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 파괴시키고, 세포 파편은 원심분리하여 제거하였다. 크로마토그래피는
Figure pct00010
익스플로러 100 시스템을 사용하여 수행하였다. 정화된 샘플을 100 ml 항-ABD 아가로스(실시예 6에 기술된 바와 같이 제조됨)로 채워진 XK-50 컬럼 상에 적용시키고, TST로 예비-평형화시켰다. 컬럼을 5 CV의 TST, 이어서 3 CV의 5 mM NH4Ac pH 5.5로 세척하였다. 결합된 단백질을 3 CV의 0.1 M HAc, pH 2.9을 적용시켜 용출시켰다. 관류 분획, 세척 분획 및 용출된 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-MS에 의한 추가 분석을 위해 수집하였다.
결과
항-ABD 아가로스 수지 상의 PEP03973의 정제로부터의 크로마토그램은 도 9a에 나타내고, 선별된 분획의 SDS-PAGE 분석은 도 9b에 나타낸다. 도 9b에서 각각 레인 5, 6 및 7에 상응하는 용출된 분획 E2, E3 및 E4를 풀링하였다. 정확한 PEP03973의 질량은 HPLC-MS 분석에 의해 확인하고, 순도는 SDS-PAGE 분석으로부터 판단시 95% 보다 높은 것으로 평가되었다. 분광광도계적 분석에 따르면, 풀은 대략 97%의 수율에 상응하는, 1036 mg의 정제된 PEP03973을 함유하였다.
실시예 9
항-ABD 아가로스를 사용하는 PEP06548의 정제
본 실시예에서는, TNF-α(종양 괴사 인자 알파)에 결합하는 단백질 Z의 변이체의 2개의 모이어티(즉, 이량체)에 대해 그의 N-말단에 융합된 알부민 결합 도메인(ABD035, 서열번호 159, C-말단 연장 VDC를 가짐)을 포함하는, PEP06548(20.3 kDa)을 항-ABD 아가로스로 채워진 컬럼을 사용하여 정제하였다. PEP06548은 또한 N-말단 헥사히스티딘 태그 및 C-터미널 시스테인 잔기를 포함한다.
재료 및 방법
가용성 PEP06548을 포함하는 펠렛화된 대장균 세포를 27 U/ml Benzonase® 세포로 보충된 TST-완충액 중에 현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 파괴시키고, 세포 파편은 원심분리하여 제거하였다. PEP06548 샘플 분자의 C-말단 시스테인을 DDT의 첨가에 의해 20 mM의 최종 농도까지 감소시키고, 이어서 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 크로마토그래피는
Figure pct00011
익스플로러 100 시스템을 사용하여 수행하였다. 정화된 샘플을 9 ml 항-ABD 아가로스로 채워진 XK-16 컬럼 상에 적용시키고, TST로 예비-평형화시켰다. 항-ABD 아가로스의 이 배치를 수지 ml 당 대략 2.3 mg(Z06677)2-Cys의 더 낮은 리간드 밀도를 제외하고는, 실질적으로 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조하였다. 컬럼을 5.5 CV의 TST, 이어서 3.3 CV의 5 mM NH4Ac pH 5.5로 세척하였다. 결합된 단백질을 2.9 CV의 0.1 M HAc, pH 2.9을 적용시켜 용출시켰다. 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-MS에 의한 추가적인 분석을 위해 수집하였다.
결과
항-ABD 아가로스 수지 상의 PEP06548의 정제로부터의 크로마토그램은 도 10a 에 나타내고, 용출된 분획 E1의 SDS-PAGE 분석은 도 10b에 나타낸다. 순도는 SDS-PAGE 분석으로부터 판단시 95% 보다 높은 것으로 평가되었다. 대략 40 kDa의 밴드는 샘플 분자의 C-말단 시스테인들 사이의 반응에 의해 형성된 이량체로부터 유래된 것일 가능성이 가장 컸다. 이량체 변이체의 부수적인 부분 뿐만 아니라 PEP06548의 정확한 질량을 또한 HPLC-MS 분석에 의해 확인하였다.
흡광도 측정에 따르면, 수지 ml 당 3.7mg의 정제된 PEP06548, 또는 (Z06677)2-Cys 리간드 당 대략 하나의 PEP06548 분자가 얻어졌다.
실시예 10
항-ABD 아가로스를 사용하는 PEP17081의 정제
본 실시예에서는, Z-PEP07986-Z 형식으로 단백질 Z의 사이토카인 결합 변이체에 대해 2개의 모이어티에 융합된 알부민 결합 도메인(PEP07986, 서열번호 161)을 포함하는 PEP17081(18.6 kDa)을 항-ABD 아가로스로 채워진 컬럼을 사용해 정제하였다. 이후의 정제를 또한 기술한다.
재료 및 방법
가용성 PEP17081을 포함하는 펠렛화된 대장균 세포를 TST-완충액 중에 현탁시켰다. 세포를 워터 배쓰(83　℃, 10　분) 중에 열 처리하여 파괴시키고, 이어서 얼음 상에서 냉각시켰다. Benzonase®을 15 U/ml의 최종 농도까지 첨가하여 핵산에 의해 야기된 점도를 감소시켰다. 세포 파편을 원심분리 및 여과(0.45 ㎛ 필터)에 의해 제거하였다.
제1 정제 단계는
Figure pct00012
익스플로러 100 시스템을 사용하여 항-ABD 아가로스 친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 정화된 샘플을 25　ml 항-ABD 아가로스로 채워진 XK-26 컬럼 상에 적용시키고, 2x TST(즉, 2배 농도로 모든 성분을 갖는 TST 완충액)으로 예비-평형화시켰다. 컬럼을 5 CV의 2x TST, 이어서 8 CV의 5 mM NH4Ac pH 5.5로 세척하였다. 결합된 단백질을 3 CV의 0.1 M HAc, pH 2.9를 적용시켜 용출시켰다. 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-MS에 의한 추가 분석을 위해 수집하였다.
제2 정제 단계는
Figure pct00013
익스플로러 100 시스템을 사용하여, RPC에 의해 수행하였다. 항-ABD 아가로스 컬럼으로부터 용출된 단백질을 10%의 최종 농도까지 아세토니트릴로 보충하고, 24 ml SOURCE 15 RPC(GE Healthcare)로 채워진 HR-16 컬럼(GE Healthcare) 상에서 로딩하고, Milli-Q 물(용매 A) 중 10 % 아세토니트릴, 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA)로 예비-평형화시켰다. 컬럼을 3.9 CV 용매 A로 세척하였다. 결합된 재료를 80 % 아세토니트릴의 증가하는 농도의 15 CV의 직선 구배, Milli-Q 물(용매 B) 중 0.1 % TFA, 50 % 용매 B까지로 세척하였다. 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-MS에 의한 추가 분석을 위해 수집하였다.
제3 정제 및 완충액 교환 단계는
Figure pct00014
익스플로러 100 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 수행하였다. RPC 컬럼으로부터 용출된 선별된 분획을 풀링하고, 완충액을 500 ml Sephadex G-25(GE Healthcare)로 채워진 XK-50 컬럼 상에서 1x PBS로 교환하였다. 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-MS에 의한 추가 분석을 위해 수집하였다.
결과
항-ABD 아가로스 수지 상에 PEP17081의 정제로부터의 크로마토그램은 도 11a에 나타내고, SDS-PAGE 분석은 도 11b에 나타낸다.
대장균 세포의 열 처리는 세포 파괴 단계 및 정제 단계 모두에서 작용하였다. PEP17081은 열에 저항성이 있는 반면, 많은 다른 대장균 단백질은 저항성이 없으며, 따라서 열 처리시 침전된다. 그 결과, 항-ABD 아가로스 컬럼 상에 로딩된 재료는 상대적으로 순수하였다(레인 1. 도 11b).
대다수의 PEP17081는 항-ABD 아가로스 수지에 결합하였는데, 이는 관류 샘플 내에 PEP17081의 명백한 부재로서 증명된다(레인 2, 도 11B). 분광광도적 분석에 따르면, 용출된 풀은 수지 ml 당 13 mg의 PEP17081의 결합능력 및 95%를 초과하는 수율에 상응하는, 330 mg의 PEP17081을 함유하였다. 용출된 PEP17081의 순도는 SDS-PAGE 분석으로부터 판단시 95% 보다 높은 것으로 평가되었다(레인 3, 도 11B). 순도의 추가 증가는 SEC에 의한 완충액 교환 및 RPC 후에 얻어졌다(레인 4, 도 11b). PEP17081의 정확한 질량은 HPLC-MS 분석에 의해 확인하였다.
실시예 11
항-ABD 아가로스를 사용하는 단백질 호르몬의 정제
본 실시예에서는, 단백질 호르몬에 대해 그의 C-말단에 융합된 알부민 결합 도메인(ABD035, 서열번호 159)을 포함하는 단백질 1(22.6 kDa; pI 10)을 항-ABD 아가로스로 채워진 컬럼을 사용하여
Figure pct00015
익스플로러 시스템 상에서 정제하였다.
재료 및 방법
단백질 1을 혼입체(inclusion body)의 형태로 대장균에서 발현시켰다. 혼입체의 가용화 및 재폴딩 후, 재료는 완충액 교환 및 정제를 위해 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 상에서 3회 수행하였다. TST 중 1:10 희석된 PBS 중, 8 mg의 SEC 정제된 단백질 1을 10-12 ml 항-ABD 아가로스로 채워진 XK 16/20 컬럼(GE Healthcare) 상에서 0.5 ml/분으로 로딩시키고, TST로 예비-평형화시켰다. 컬럼을 4 CV의 TST로 세척하고, 이어서 1 ml/분의 유속으로, 5 mM NH4Ac, pH 5.5로 추가의 3 CV으로 세척하였다. 결합된 단백질을 3 CV의 0.1 M HAc, pH 2.9로 용출시킨 후, pH 9, 1 M 트리스-HCl로 pH 7까지 중화시켰다. 관류 분획, 세척 분회 및 용출된 분획은 SDS-PAGE에 의한 추가적인 분석을 위해 수집하였다. 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔(Invitrogen)을 비-환원적으로 이동시키고, 단백질을 Simply Blue(Life Technologies)로 염색하였다. 컬럼을 용출 후 TST로 재평형화시키고, 3 CV의 0.5 M NaOH, 이어서 3 CV의 TST로 소정의 위치에서 세정(CIP)하였다. 정제 사이에, 수지를 TST + 20 % 에탄올 중에 저장하였다.
결과
항-ABD 아가로스 수지 상의 단백질 1의 정제로부터의 크로마토그램은 도 12a에 나타내고, 선별된 분획의 SDS-PAGE 분석은 도 12b에 나타낸다. 항-ABD 아가로스 컬럼 상에 로딩된 SEC 정제된 단백질 1의 순도는 높았다. 그러나, 단백질을 오염시키는 약한 밴드가 SDS-PAGE 겔 상에서 확인되었다. 도 12b의 화살표를 참고하라. 이들 오염물은 항-ABD 아가로스 컬럼 상에서 정제에 의해 효과적으로 제거되었다. 60배 농축된 세척 단계로부터의 샘플을 SDS-PAGE 상에서 분석하였고, 오염물(또한 단백질 1의 누출; 레인 6, 도 12b)을 확인하였다. 용출된 단백질 샘플에서는 어떠한 오염물도 관찰되지 않았다(레인 7-9, 도 12b). 용출된 샘플의 순도는 SDS-PAGE 분석으로부터 판단된 바와 같이 98% 보다 높은 것으로 추정하였다. 용출된 단백질 1의 정확한 질량은 HPLC-MS 분석에 의해 확인하였다.
SEC 정제된 단백질 1의 처음 8 mg 중, 5.4 mg이 항-ABD 아가로스 컬럼으로부터의 용출된 분획에서 수집되었는데, 이는 대략 68%의 수율을 유도하였다. 레인 5에 로딩된 관류 샘플에서 어떠한 단백질도 관찰되지 않았지만(도 12b), 이량체의 제거 및 단백질을 오염시키는 것 외에 TST로 세척 시에 단백질 1의 일부가 누출되었다.
실시예 12
항-ABD 아가로스를 사용하는 펩티드 호르몬의 정제
본 실시예에서는, 펩티드 호르몬에 대해 그의 N-말단에 융합된 알부민 결합 도메인(ABD035, 서열번호 159)을 포함하는 단백질 2(9.5 kDa, pI 6.6)를 Pichia Pink에서 발현시키고, 항-ABD 아가로스로 채워진 컬럼을 사용하여
Figure pct00016
익스플로러 시스템 상에서 단일 단계로 정제하였다.
재료 및 방법
분비된 단백질 2를 함유하는 100 ml의 Pichia Pink 상청액을 동결건조시키고, 2 ml DMSO(디메틸 설폭사이드) 중에 재현탁시키고, 그 후 200 ml의 TST로 희석시켰다. 샘플을 10-12 ml 항-ABD 아가로스로 채워진 XK 16/20 컬럼 상에 1 ml/분으로 로딩시키고, TST로 예비-평형화시켰다. 컬럼을 8 CV의 TST로 세척하고, 이어서 5 mM NH4Ac, pH 5.5로 추가 3 CV 세척을 하였다. 4 CV TST의 통상적인 세척은 배지로부터의 단백질을 오염시키는 고 밀도로 인해 증가시켰다. 결합된 단백질을 3 CV의 0.1 M HAc, pH 2.9로 용출시킨 후, 1 M 트리스-HCl, pH 9를 사용하여 pH 4로 조정하였다. 컬럼을 용출, 이어서 CIP 후에 TST로 재-평형화시키고, TST + 20 % 에탄올 중 저장하였다. 관류 분획, 세척 분획 및 용출된 분획을 SDS-PAGE에 의한 추가적인 분석을 위해 수집하였다.
결과
항-ABD 아가로스 수지 상의 단백질 2의 정제로부터의 크로마토그램은 도 13a에 나타내고, 선별된 분획의 SDS-PAGE 분석은 도 13b에 나타낸다. 항-ABD 아가로스 컬럼으로부터의 용출 피크는 대략 75%의 수율(웨스턴 블롯으로부터 평가됨)에 상응하는, 3-5 mg의 단백질 2를 함유하였다. 용출된 단백질 2의 정확한 질량은 HPLC-MS 분석으로부터 확인하였다. 순도는 SDS-PAGE 분석에 이어서 Simply Blue 염색으로부터 판단시 98% 보다 높은 것으로 평가되었다. 용출 분획 중에서 어떠한배지 단백질 오염도 관찰되지 않았다(레인 7-13, 도 13B). 단백질 2는 겔 상에 포함된 분자량 표준에 의해 표시된 바와 같이 SDS-PAGE 겔 상에서 더 적게 이행하는 것으로 인식된다.
실시양태의 항목별 목록
1, ABD 결합 모티프 BM을 포함하고, 상기 모티프가 하기 i) 및 ii)로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 ABD 결합 폴리펩티드:
i) EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D
여기에서, 서로 독립적으로,
X2는 F, I 및 L로부터 선택되고;
X3은 H, K, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X4는 A, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 F, I, L 및 Y로부터 선택되고;
X7은 A, H, I, K, L, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X10은 G, H, K, N, Q, R 및 S로부터 선택되고;
X11은 A, D, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 F, H, L, S 및 T로부터 선택되고;
X18은 D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X20은 H, K 및 R로부터 선택되고;
X21은 I, L 및 V로부터 선택되고;
X25는 F, I, L, V 및 Y로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 D 및 E로부터 선택됨; 및
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 89% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
2. 제1항에 있어서, 서열 i)에서 X2는 F 및 L로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
3. 제2항에 있어서, 서열 i)에서 X2는 F인 ABD 결합 폴리펩티드.
4. 제2항에 있어서, 서열 i)에서 X2는 L인 ABD 결합 폴리펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X3은 H, K, R, T 및 V로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
6. 제5항에 있어서, 서열 i)에서 X3은 H, K, R 및 V로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
7. 제6항에 있어서, 서열 i)에서 X3은 K 및 R로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
8. 제7항에 있어서, 서열 i)에서 X3은 K인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
9. 제7항에 있어서, 서열 i)에서 X3은 R인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X4는 A, H, I, L, N, V 및 W로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
11. 제10항에 있어서, 서열 i)에서 X4는 H, L, N 및 V로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
12. 제11항에 있어서, 서열 i)에서 X4는 V인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X4는 F 및 L로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
14. 제13항에 있어서, 서열 i)에서 X6은 F인 ABD 결합 폴리펩티드.
15. 제13항에 있어서, 서열 i)에서 X6은 L인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X7은 K, L, N, Q, R 및 S로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
17. 제16항에 있어서, 서열 i)에서 X7은 K, N, Q, R 및 S로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
18. 제17항에 있어서, 서열 i)에서 X7은 K, Q, R 및 S로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
19 제18항에 있어서, 서열 i)에서 X7은 K 및 R로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
20. 제19항에 있어서, 서열 i)에서 X7은 K인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
21. 제19항에 있어서, 서열 i)에서 X7은 R인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X10은 H, K, N, 및 R로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
23. 제22항에 있어서, 서열 i)에서 X10은 H, K 및 N으로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
24. 제22항에 있어서, 서열 i)에서 X10은 K, N 및 R로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 서열 i)에서 X10은 N인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
26. 제24항에 있어서, 서열 i)에서 X10은 K 및 R로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
27. 제26항에 있어서, 서열 i)에서 X10은 K인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
28. 제26항에 있어서, 서열 i)에서 X10은 R인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X11은 A, F, L, R, T 및 Y로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
30. 제29항에 있어서, 서열 i)에서 X11은 A, F, T 및 Y로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
31. 제30항에 있어서, 서열 i)에서 X11은 T인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X16은 T인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X17은 F, H 및 L로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
34. 제33항에 있어서, 서열 i)에서 X17은 F 및 H로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
35. 제33항에 있어서, 서열 i)에서 X17은 H 및 L로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
36. 제34항에 있어서, 서열 i)에서 X17은 F인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 서열 i)에서 X17은 H인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
38. 제35항에 있어서, 서열 i)에서 X17은 L인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X18은 D, H, I, K 및 Q로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
40. 제39항에 있어서, 서열 i)에서 X18은 D, H 및 Q로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
41. 제40항에 있어서, 서열 i)에서 X18은 H 및 Q로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
42. 제41항에 있어서, 서열 i)에서 X18은 H인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
43. 제41항에 있어서, 서열 i)에서 X18은 Q인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X20은 H 및 R로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X20은 K 및 R로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 서열 i)에서 X20은 R인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
47. 제45항에 있어서, 서열 i)에서 X20은 K인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X21은 I 및 L로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
49. 제48항에 있어서, 서열 i)에서 X21은 I인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
50. 제48항에 있어서, 서열 i)에서 X21은 L인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X25는 I, L 및 V로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
52. 제51항에 있어서, 서열 i)에서 X25는 V 및 I로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
53. 제52항에 있어서, 서열 i)에서 X25는 I인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
54. 제52항에 있어서, 서열 i)에서 X25는 V인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X26은 K인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)에서 X28은 D인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)는 8개 조건 I-VIII 중 적어도 4개를 충족하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
I. X2는 F 또는 L이고;
II. X6는 F 또는 L이고;
III. X16은 T이고;
IV. X20은 H 또는 R이고;
V. X21은 I 또는 L이고;
VI. X25는 I 또는 V이고;
VII. X26은 K이고; 및
VIII. X28은 D이다.
58. 제57항에 있어서, 서열 i)는 8개 조건 I-VIII 중 적어도 5개를 충족하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
59. 제58항에 있어서, 서열 i)는 8개 조건 I-VIII 중 적어도 6개를 충족하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
60. 제59항에 있어서, 서열 i)는 8개 조건 I-VIII 중 적어도 7개를 충족하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
61. 제60항에 있어서, 서열 i)는 8개 조건 I-VIII의 모두를 충족하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)는 서열번호 1-52로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
63. 제62항에 있어서, 서열 i)는 서열번호 1-7로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
64. 제63항에 있어서, 서열 i)는 서열번호 1-4로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
65. 제64항에 있어서, 서열 i)는 서열번호 1인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD 결합 모티프는 3중-나선 번들 단백질 도메인의 일부를 형성하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
67. 제66항에 있어서, 상기 ABD 결합 모티프는 상기 3중-나선 번들 단백질 도메인 내에, 상호연결 루프를 갖는 2중 알파 나선의 일부를 실질적으로 형성하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 3중-나선 번들 단백질 도메인이 세균 수용체 단백질로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
69. 제68항에 있어서, 상기 3중-나선 번들 단백질 도메인이 황색포도상구균으로부터의 단백질 A의 도메인, 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 iii) 및 iv)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ABD 결합 폴리펩티드:
iii) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
여기에서
[BM]은 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고;
Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
Xd는 A 및 S로부터 선택됨;
및
iv) iii)에 의해 정의된 서열과 적어도 81% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
71. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 A인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
72. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 S인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)에서 Xb는 N인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
74. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)에서 Xb는 E인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)에서 Xc는 A인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
76. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)에서 Xc는 S인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
77. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)에서 Xc는 C인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
78. 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)에서 Xd는 A인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
79. 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)에서 Xd는 S인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
80. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고 Xd는 A인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
81. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고 Xd는 A인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
82. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고 Xd는 S인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
83. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고 Xd는 S인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
84. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고 Xd는 A인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
85. 제70항에 있어서, 서열 iii)에서 Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 A이고 Xd는 A인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
86. 제85항에 있어서, 서열 iii)은 서열번호 53-104중 어느 하나로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
87 제86항에 있어서, 서열 iii)은 서열번호 53-59중 어느 하나로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
88. 제87항에 있어서, 서열 iii)은 서열번호 53-56중 어느 하나로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
89. 제88항에 있어서, 서열 iii)은 서열번호 53인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
90. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 v) 및 vi)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드:
v) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
여기에서 [BM]은 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고 Xc는 S 및 C로부터 선택됨; 및
vi) v)에 의해 정의된 서열과 적어도 83% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
91. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 vii) 및 viii)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드:
vii) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDAQA P;
여기에서 [BM]은 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고 Xc는 A 및 C로부터 선택됨; 및
viii) vii)에 의해 정의된 서열과 적어도 83% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
92. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 ix) 및 x)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드:
ix) FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
여기에서 [BM]은 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고 Xc는 A 및 C로부터 선택됨; 및
x) ix)에 의해 정의된 서열과 적어도 83% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
93. 제69항에 있어서, 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ABD 결합 폴리펩티드:
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; 및
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK.
여기에서, [BM]은 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이다.
94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 xi) 및 xii)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드:
xi) VDAKYAK-[BM]- DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
여기에서 [BM]은 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프임; 및
xii) xi)에서 정의된 서열과 적어도 84 % 동일성을 갖는 아미노산 서열.
95. 제94항에 있어서, 서열 xi)는 서열번호 105-156으로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
96. 제95항에 있어서, 서열 xi)는 서열번호 105-111로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
97. 제96항에 있어서, 서열 xi)는 서열번호 105-108로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
98. 제97항에 있어서, 서열 xi)는 서열번호 105인 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있는 적어도 2개의 ABD 결합 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하는 다량체 형태의 ABD 결합 폴리펩티드.
100. 제99항에 있어서, 상기 ABD 결합 폴리펩티드 단량체 단위는 공유결합에 의해 함께 커플링되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
101. 제99항에 있어서, 상기 ABD 결합 폴리펩티드 단량체 단위는 융합 단백질로서 발현되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 C-말단에서, 예를 들면 C-말단에서 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 ABD 결합 폴리펩티드.
103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
104. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항의 ABD 결합 폴리펩티드 및 검출제의 조합.
105. 제104항에 있어서, 상기 검출제가 형광제 또는 방사성 물질인 조합.
<110> AFFIBODY AB <120> ABD BINDING POLYPEPTIDE <130> IPA150401-SE <150> EP12189932.2 <151> 2012-10-25 <150> US 61/718,238 <151> 2012-10-25 <160> 165 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 1 Glu Leu Lys Val Ala Phe Lys Glu Ile Asn Thr Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 His Gln Gln Arg Ile Ala Phe Ile Ile Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 2 Glu Leu Val Asn Ala Phe Ser Glu Ile Lys Ala Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Leu His Gln Arg Leu Ala Phe Ile Val Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 3 Glu Leu His His Ala Phe Arg Glu Ile Lys Phe Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Phe His Gln Arg Leu Ala Phe Ile Val Lys Leu Asp Asp 20 25 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 4 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Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 134 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 134 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Lys Tyr Ala Leu Met Glu Ile 1 5 10 15 Arg Tyr Leu Pro Asn Leu Thr His Arg Gln Lys Ile Ala Phe Ile Leu 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 135 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 135 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Arg Trp Ala Val Ser Glu Ile 1 5 10 15 Arg His Leu Pro Asn Leu Thr Phe His Gln Arg Ile Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 136 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 136 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ala Phe Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Leu Pro Asn Leu Thr Leu Asn Gln His Ile Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 137 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 137 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Lys Ala Ala Phe Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg Thr Leu Pro Asn Leu Thr Phe Gly Gln Arg Thr Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 138 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 138 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Thr Thr Ala Met Lys Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ala Leu Pro Asn Leu Thr His Gln Gln Arg Ile Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 139 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 139 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asp Met Arg Ala Phe His Glu Ile 1 5 10 15 Asn Lys Leu Pro Asn Leu Thr Leu Ala Gln Arg Val Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 140 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 140 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Asn Ala Ala Phe Thr Glu Ile 1 5 10 15 Ser Ser Leu Pro Asn Leu Thr Leu Asp Gln Arg Leu Ala Phe Ile Phe 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 141 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 141 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Arg Trp Ala Leu Asn Glu Ile 1 5 10 15 His Ile Leu Pro Asn Leu Thr Leu Glu Gln Lys Val Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 142 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 142 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Lys Asn Ala Phe Ile Glu Ile 1 5 10 15 Lys Asn Leu Pro Asn Leu Thr Thr Asn Gln Thr Leu Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 143 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 143 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ser Leu Ala Phe Val Glu Ile 1 5 10 15 His Lys Leu Pro Asn Leu Thr His His Gln Arg Leu Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 144 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 144 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gln Trp Ala Phe Asn Glu Ile 1 5 10 15 His Asn Leu Pro Asn Leu Thr Tyr Val Gln Arg Ile Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 145 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 145 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Gln Thr Ala Met Gln Glu Ile 1 5 10 15 Asn Ser Leu Pro Asn Leu Thr Leu Glu Gln Arg Ile Ala Phe Ile Phe 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 146 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 146 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gly Trp Ala Phe Arg Glu Ile 1 5 10 15 Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr His Tyr Gln Arg Ile Ala Phe Ile Met 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 147 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 147 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Leu Trp Ala Phe Asn Glu Ile 1 5 10 15 Lys Gly Leu Pro Asn Leu Thr His Asp Gln Arg Ile Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 148 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 148 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ser Phe Ala Phe Ser Glu Ile 1 5 10 15 Asn Val Leu Pro Asn Leu Thr Phe His Gln Lys Ile Ala Phe Ile Tyr 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 149 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 149 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Phe Arg Gly Ala Ile Ala Glu Ile 1 5 10 15 Arg Asp Leu Pro Asn Leu Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ala Phe Ile Phe 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 150 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 150 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Glu Asn Ala Tyr Lys Glu Ile 1 5 10 15 Gly Ser Leu Pro Asn Leu Thr Leu Ala Gln Lys Val Ala Phe Ile Leu 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 151 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 151 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Arg Gln Ala Leu Gln Glu Ile 1 5 10 15 His Ile Leu Pro Asn Leu Thr His Ser Gln Arg Val Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 152 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 152 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn His Ala Ala Phe Gln Glu Ile 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Asn Leu Thr Leu Asn Gln Arg Leu Ala Phe Ile Thr 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 153 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 153 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Asn Tyr Ala Phe Lys Glu Ile 1 5 10 15 Asp Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Met Gln Lys Leu Ala Phe Ile Val 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 154 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 154 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ala Phe Lys Glu Ile 1 5 10 15 Lys Ala Leu Pro Asn Leu Thr Gly Gln Gln Arg Phe Ala Phe Ile Leu 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 155 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 155 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ser Lys Ala Leu Thr Glu Ile 1 5 10 15 Arg Met Leu Pro Asn Leu Thr Phe Arg Gln Arg Ile Ala Phe Ile Ile 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 156 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered ABD binding polypeptide <400> 156 Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Met Ala Tyr Thr Glu Ile 1 5 10 15 Gly Leu Leu Pro Asn Leu Thr Phe Ser Gln Leu Leu Ala Phe Ile Ile 20 25 30 Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 157 <211> 46 <212> PRT <213> Streptococcus sp. G148 <400> 157 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 158 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered albumin binding domain <400> 158 Cys Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr 1 5 10 15 Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 159 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered albumin binding domain <400> 159 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 160 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered albumin binding domain <400> 160 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 161 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered albumin binding domain <400> 161 Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr 20 25 30 Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 162 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered albumin binding domain <400> 162 Gly Leu Ala Ser Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr 1 5 10 15 Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 163 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 163 tgcttccggc tcgtatgttg tgtg 24 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 164 cggaaccaga gccaccaccg g 21 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 165 cggaaccaga gccaccaccg g 21

Claims (15)

  1. ABD 결합 모티프 BM을 포함하고, 상기 모티프가 하기 i) 및 ii)로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 ABD 결합 폴리펩티드:
    i) EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D
    여기에서, 서로 독립적으로,
    X2는 F, I 및 L로부터 선택되고;
    X3은 H, K, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
    X4는 A, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
    X6은 F, I, L 및 Y로부터 선택되고;
    X7은 A, H, I, K, L, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
    X10은 G, H, K, N, Q, R 및 S로부터 선택되고;
    X11은 A, D, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
    X16은 N 및 T로부터 선택되고;
    X17은 F, H, L, S 및 T로부터 선택되고;
    X18은 D, E, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
    X20은 H, K 및 R로부터 선택되고;
    X21은 I, L 및 V로부터 선택되고;
    X25는 F, I, L, V 및 Y로부터 선택되고;
    X26은 K 및 S로부터 선택되고;
    X28은 D 및 E로부터 선택됨; 및
    ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 89% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
  2. 제1항에 있어서, 서열 i)는 8개 조건 I-VIII 중 적어도 4개를 충족하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드:
    I. X2는 F 또는 L이고;
    II. X6는 F 또는 L이고;
    III. X16은 T이고;
    IV. X20은 H 또는 R이고;
    V. X21은 I 또는 L이고;
    VI. X25는 I 또는 V이고;
    VII. X26은 K이고; 및
    VIII. X28은 D이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 i)는 서열번호 1-52로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 서열 i)는 서열번호 1-7로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ABD 결합 모티프는 3중-나선 번들 단백질 도메인의 일부를 형성하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 3중-나선 번들 단백질 도메인이 황색포도상구균으로부터의 단백질 A의 도메인, 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 iii) 및 iv)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ABD 결합 폴리펩티드:
    iii) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
    여기에서
    [BM]은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이고;
    Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
    Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
    Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
    Xd는 A 및 S로부터 선택됨;
    및
    iv) iii)에 의해 정의된 서열과 적어도 81% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
  8. 제7항에 있어서, 서열 iii)은 서열번호 53-104중 어느 하나로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 서열 iii)은 서열번호 53-59중 어느 하나로부터 선택된 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  10. 제6항에 있어서, 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ABD 결합 폴리펩티드:
    ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
    ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
    ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
    ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
    AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
    VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
    AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
    VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
    VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
    AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
    VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
    VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; 및
    AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK.
    여기에서, [BM]은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프이다.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 xi) 및 xii)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 ABD 결합 폴리펩티드:
    xi) VDAKYAK-[BM]- DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
    여기에서 [BM]은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 ABD 결합 모티프임; 및
    xii) xi)에서 정의된 서열과 적어도 84 % 동일성을 갖는 아미노산 서열.
  12. 제11항에 있어서, 서열 xi)는 서열번호 105-156으로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 서열 xi)는 서열번호 105-111로부터 선택되는 것인 ABD 결합 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 ABD 결합 폴리펩티드 및 검출제의 조합.

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