CN104854127A

CN104854127A - 白蛋白结合多肽

Info

Publication number: CN104854127A
Application number: CN201380065194.7A
Authority: CN
Inventors: 佩尔·乔纳森; 帕尔·埃克隆德
Original assignee: Affibody AB
Current assignee: Affibody AB
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: EP2912054B1; CA2889037A1; JP6382826B2; WO2014064237A1; KR20150077447A; CN104854127B; JP2015534994A; HK1210793A1; DK2912054T3; CA2889037C; AU2013336646B2; EP2912054A1; ES2639099T3; KR102151289B1; US10011641B2; US20150291668A1; AU2013336646A1; PL2912054T3

Abstract

本公开内容提供包含ABD结合基序BM的ABD结合多肽，该基序由选自由EX₂X₃X₄AX₆X₇EIX₁₀X₁₁LPNLX₁₆X₁₇X₁₈QX₂₀X₂₁AFIX₂₅X₂₆LX₂₈D和与其具有至少89％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列组成。

Description

白蛋白结合多肽

发明领域

本发明涉及结合白蛋白结合结构域ABD的多肽。该多肽具有多种工业和药物应用，例如在分离技术中用作亲和配体或在分子诊断学中用作检测剂。

背景

血清白蛋白是在哺乳动物血清中最丰富的蛋白(在人中35-50g/l，即0.53-0.75mM)，且例如在WO91/01743、WO01/45746和Dennis等(J BiolChem 277:35035-43、2002)中已经描述了将肽或蛋白共价偶联到将允许体内连接到血清白蛋白的载体分子上的若干策略。WO91/01743特别地(interalia)描述了源自链球菌蛋白G(SpG)的白蛋白结合肽或蛋白用于增加其他蛋白的半衰期的用途。该观念是将源自细菌的白蛋白结合肽/蛋白融合到治疗目的的肽/蛋白，所述治疗目的的肽/蛋白已经显示出具有从血液中的快速消除。在体内，产生的融合蛋白与血清白蛋白结合，且受益于其更长半衰期，这增加了融合的治疗目的的肽/蛋白的净半衰期。血清白蛋白的半衰期与动物的大小直接成比例，其中例如人血清白蛋白(HSA)具有19天的半衰期且兔血清白蛋白具有约5天的半衰期(McCurdy等,J Lab Clin Med143:115,2004)。

链球菌蛋白G(SpG)是存在于链球菌(streptococci)某些菌株的表面上的双功能受体，并能够结合IgG和血清白蛋白两者(等,MolImmunol 24:1113,1987)。该结构为高度重复的，具有若干结构上和功能上不同的结构域(Guss等,EMBO J 5:1567,1986)，更准确地说三个Ig结合结构域和三个血清白蛋白结合结构域(Olsson等,Eur J Biochem 168:319,1987)。已经确定了SpG中的三个血清白蛋白结合结构域之一的结构，显示为三螺旋束折叠(Kraulis等,FEBS Lett 378:190,1996,Johansson等,J.Biol.Chem.277:8114-20,2002)。46个氨基酸的基序被定义为ABD(白蛋白结合域，albumin binding domain)并且随后还已被命名为G148-GA3(GA代表蛋白G相关的白蛋白结合(protein G-related albumin binding)且G148来自其源自的链球菌菌株)。

开发了具有极大改善对人血清白蛋白的亲和性的GA3-G148的人工变体(Jonsson等,Prot Eng Des Sel 21:515-27,2008；WO2009/016043)、以及具有减少的免疫刺激性质的工程化高亲和性变体(WO2012/004384)。后者受在GA3-G148内实验性地鉴定了数个T细胞和B细胞表位的事实的启发(Goetsch等,Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32,2003)，使得此结构域本身较不适合用在用于人类施用的药物组合物中。遍及当前文本中，例如在WO2009/016043和WO2012/004384中展示的GA3-G148及其各种工程化衍生物共同地被称为“ABD”。因此，在本公开内容中“ABD”表示此类白蛋白结合多肽，而不是具有特定氨基酸序列的特定多肽。

随着将白蛋白结合结构域掺入治疗或诊断组合物中兴趣的增加，带来了对用于分离共价连接到ABD的分子的廉价和高效纯化策略的增长的需求，所述共价连接到ABD的分子例如通过在原核或真核系统中重组表达或通过直接化学共轭连接到ABD来产生。用于纯化重组表达蛋白的一般策略将包括通常使用的亲和标签诸如聚组氨酸标签、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签或FLAG标签，并使用了特别为每种标签开发的商业树脂进行经典亲和分离。然而，对于某些应用，且特别是对于将作为治疗剂使用的分子，终产物必须为均质的。由于需要例如通过酶促或化学裂解去除标签，必须确保完全裂解以获得均质产物，或当去除未完全裂解的产物时遭受收率的损失。此类问题两者造成增加产物的生产成本。因此，更具启发性的策略将是利用ABD基序本身作为纯化标签。此策略的一个实例为将重组白蛋白偶联到固体支持物(参见例如，Jonsson等,Prot Eng Des Sel 21:515-27,2008；Andersen等,J Biol Chem 286:5234-41,2011)。从粗溶质中，包含ABD标签的化合物被白蛋白捕获，去除非特异性吸附的污染物且随后通过干扰与白蛋白特异性但可逆的相互作用回收加ABD-标签的化合物。然而，白蛋白是对不同蛋白、脂肪酸、固醇类、离子等具有若干相互位点的大天然载体分子，且因此特异性和非特异性组分两者的背景结合可污染回收的样品。尽管事实上已经开发了重组人白蛋白，将其包括作为治疗产品的大规模生产中的亲和配体还是昂贵的，特别是因为其与用于就地清洗(cleaning in place)的标准程序不相容，对于白蛋白偶联基质的重复使用将不得不应用用于就地清洗的标准程序。此外，可需要更苛刻的洗脱条件以回收包含对白蛋白具有异常高亲和性的ABD变体的分子。此类条件还可对于加ABD-标签的分子是不利的。

由于蛋白A对IgG的Fc部分的天然亲和性，长期以来已经使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A作为单克隆抗体和Fc融合蛋白的工业生产中的亲和配体。因而，蛋白A以其整体，以及其单独的Fc结合结构域，已作为具有改善性质的工程化亲和配体的合理设计的起点。对于介绍，参见由Nord K和同事在Prot Eng(Nord等,Prot Eng8:601-608；1995)和在Nat Biotech(Nord等,Nat Biotech 15:772-777；1997)中的文章。

本公开内容的一个目的在于提供新的ABD结合剂。此外，本公开内容的一个目的在于提供用于在生物技术例如在蛋白纯化和分离应用中使用的新ABD结合剂。

发明描述

这些目标和从本公开内容对技术人员明显的其他目标可通过一种或更多种以下公开的多个发明方面来实现。

因此，在第一方面，本公开内容提供ABD结合多肽，包含ABD结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：

i)EX₂X₃X₄AX₆X₇EI X₁₀X₁₁LPNLX₁₆X₁₇X₁₈QX₂₀ X₂₁AFIX₂₅X₂₆LX₂₈D

其中，彼此独立地，

X₂选自F、I和L；

X₃选自H、K、N、Q、R、S、T和V；

X₄选自A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；

X₆选自F、I、L和Y；

X₇选自A、H、I、K、L、N、Q、R、S、T和V；

X₁₀选自G、H、K、N、Q、R和S；

X₁₁选自A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；

X₁₆选自N和T；

X₁₇选自F、H、L、S和T；

X₁₈选自D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T和V；

X₂₀选自H、K和R；

X₂₁选自I、L和V；

X₂₅选自F、I、L、V和Y；

X₂₆选自K和S；

X₂₈选自D和E；

和

ii)与在i)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。

与以上定义一类序列相关的ABD结合多肽是基于亲本支架的许多随机多肽变体的统计学分析，所述多肽变体在若干不同选择实验中通过其与ABD的相互作用来选择。鉴定的ABD结合基序，或“BM”相应于亲本支架的靶结合区域，所述区域构成在三螺旋束蛋白结构域内的2个α螺旋。在亲本支架中，两个BM螺旋的变化的氨基酸残基组成用于与抗体的恒定Fc部分的相互作用的结合表面。在本发明中，结合表面残基的随机变化和变体的后续选择已经用与ABD相互作用的容量替换Fc相互作用容量。

本文公开的ABD结合多肽表现一系列特性，例如当偶联到固体支持物时，使得其适于作为用于纯化包含ABD的分子的亲和配体。例如，与使用人白蛋白作为亲和配体相比较，公开的ABD结合多肽显示以下优势：

·每毫升配体偶联基质的更高纯化能力。

·与用于就地清洗的重复程序的相容性，例如使用0.5M氢氧化钠，其使得ABD结合多肽在大规模生产治疗产品中有用。

·实现更温和洗脱条件，例如在更高pH下的洗脱，其使得纯化更宽范围的包含ABD的不同分子成为可能。

在纯化包含ABD的靶蛋白的上下文中，本公开内容的ABD结合多肽可在一个或更多个不同纯化阶段中有用。因此，可在第一捕获步骤中、在任意中间纯化步骤或在最终精制步骤中的一个或者更多个中使用所述ABD结合多肽而没有限制。

技术人员将理解，使用包含根据本公开内容的ABD结合多肽的树脂可实现靶蛋白的成功纯化，而无论ABD基序在靶蛋白中所处的位置。因此，可将ABD部分放置在靶蛋白的N端或C端。可选地，靶蛋白可以为包含在其两侧侧面为其他蛋白部分的ABD部分的融合蛋白。

在本公开内容的上下文中，“ABD”是指来自链球菌蛋白G的三螺旋白蛋白结合结构域及其衍生物。特别地，“ABD”可以指GA3-G148(上述Johansson等，特此通过引用并入)或对白蛋白具有增强亲和性的GA3-G148的变体(WO2009/016043，特此通过引用并入)以及具有减少的免疫刺激性质的高亲和性变体(WO2012/004384)。换句话说，在本公开内容中，“ABD”表示在参考文献中所述的此类白蛋白结合多肽，而不是具有特定氨基酸序列的特定多肽。

如技术人员将认识到的，任何多肽的功能诸如本公开内容的多肽的ABD结合容量取决于多肽的三级结构。因此，对多肽中的氨基酸序列做出较小改变而不影响其功能是可能的。因此，本发明涵盖包含BM的修饰变体的多肽，所述BM的修饰变体使得产生的序列与通过i)定义的序列至少89％相同。在本发明的一个实施方案中，所述BM的修饰变体使得其与通过i)定义的序列至少93％相同。在又另一个实施方案中，所述BM变体与通过i)定义的序列至少96％相同。

在一些实施方案中，此类变化可在如本文公开的ABD结合多肽的序列的所有位置中做出。在其他实施方案中，此类变化可仅在非可变位置中做出，所述非可变位置还被表示为支架氨基酸残基。在此类情况下，不允许在可变位置，即在序列i)中用“X”表示的位置中的改变。例如，属于氨基酸残基的某些功能分组(例如，疏水、亲水、极性等)的一个氨基酸残基，可被来自相同功能组的另一个氨基酸残基交换是可能的。

如遍及使用的术语“同一性％”可如下计算。使用CLUSTAL W算法(Thompson等,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))将查询序列与靶序列进行比对。在与比对序列的最短序列相应的窗口上进行比较。在一些情况下，比对序列的最短序列可以是靶序列。在其他情况下，查询序列可构成比对序列的最短序列。比较了每个位置上的氨基酸残基，且将在查询序列中具有靶序列中的相同对应的位置的百分比报告为同一性％。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂选自F和L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂为F。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂为L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₃选自H、K、R、T和V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₃选自H、K、R和V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₃选自H、K和V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₃选自K和R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₃为K。

在一个实施方案中，在序列i)中X₃为R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₃为V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄选自A、H、I、L、N、V和W。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄选自H、L、N和V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄为V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄为N。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄为H。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄为L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄选自A、L、N、V和W。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄选自A、N、V和W。

在一个实施方案中，在序列i)中X₄选自A、N和W。

在一个实施方案中，在序列i)中X₆选自F和L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₆为F。

在一个实施方案中，在序列i)中X₆为L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₇选自K、L、N、Q、R和S。

在一个实施方案中，在序列i)中X₇选自K、N、Q、R和S。

在一个实施方案中，在序列i)中X₇选自K、Q、R和S。

在一个实施方案中，在序列i)中X₇选自K和R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₇为K。

在一个实施方案中，在序列i)中X₇为R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀选自H、K、N、和R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀选自H、K和N。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀选自K、N和R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀选自K和R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀为N。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀为K。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀为R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₀为H。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁选自A、F、L、R、T和Y。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁选自A、F、T和Y。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁为T。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁为A。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁为Y。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁为F。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁选自A、L、T和Y。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₁选自T和Y。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₆为T。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₇选自F、H和L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₇选自F和H。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₇选自H和L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₇为F。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₇为H。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₇为L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₈选自D、H、I、K和Q。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₈选自D、H和Q。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₈选自H和Q。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₈为H。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₈为Q。

在一个实施方案中，在序列i)中X₁₈为D。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₀选自K和R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₀选自H和R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₀为R。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₀为K。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₁选自I和L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₁为I。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₁为L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₅选自I、L和V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₅选自V和I。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₅为I。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₅为V。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₅为L。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₆为K。

在一个实施方案中，在序列i)中X₂₈为D。

在一个实施方案中，序列i)如下定义：彼此独立地，

X₂选自F和L；

X₃选自H、K、R、T和V；

X₄选自A、H、I、L、N、V和W；

X₆选自F和L；

X₇选自K、L、N、Q、R和S；

X₁₀选自H、K、N、和R；

X₁₁选自A、F、L、R、T、和Y；

X₁₆为T；

X₁₇选自F、H和L；

X₁₈选自D、H、I、K和Q；

X₂₀选自H和R；

X₂₁选自I和L；

X₂₅选自I、L和V；

X₂₆为K；且

X₂₈为D。

在一个实施方案中，序列i)如下定义：彼此独立地，

X₂选自F和L；

X₃选自H、K、T和V；

X₄选自H、L、N和V；

X₆选自F和L；

X₇选自K、R、Q和S；

X₁₀选自H、K和N；

X₁₁选自A、F、T和Y；

X₁₆为T；

X₁₇选自F、H和L；

X₁₈选自D、H和Q；

X₂₀为R；

X₂₁选自I和L；

X₂₅选自I、L和V；

X₂₆为K；且

X₂₈为D。

在定义ABD结合多肽的亚类的更具体实施方案中，序列i)满足8种条件I-VIII中的至少四种：

I.X₂选自F和L；

II.X₆选自F和L；

III.X₁₆为T；

IV.X₂₀选自H和R；

V.X₂₁选自I和L；

VI.X₂₅选自I和V；

VII.X₂₆为K；和

VIII.X₂₈为D。

在根据第一方面的ABD结合多肽的一些实例中，序列i)满足8种条件I-VIII中的至少5种。更具体地，序列i)可满足8种条件I-VIII中的至少6种，诸如8种条件I-VIII中的至少7种，诸如8种条件I-VIII中的全部。

如在以下实验部分中详细描述的，ABD结合多肽变体的选择已导致鉴定了大量单个ABD结合基序(BM)序列。这些序列组成根据该方面的序列i)的单独实施方案。单独ABD结合基序的序列在图1中示出并作为SEQ IDNO:1-52。在此方面的一些实施方案中，序列i)选自SEQ ID NO:1-52中任一个。更具体地，序列i)可选自SEQ ID NO:1-7中任一个，诸如选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。特别地，序列i)可以为SEQ ID NO:1。

在本公开内容的一些实施方案中，如以上所定义的BM“形成”三螺旋束蛋白结构域的“部分”。这应理解为表示BM的序列“插入”到或“嫁接”到原始三螺旋束结构域的序列上，使得BM置换在原始结构域中相似的结构基序。例如，不希望受理论的束缚，BM被认为组成三螺旋束的三个螺旋中的两个，且因此可置换在任何三螺旋束内的这样的双螺旋基序。如技术人员将认识到的，必须进行由两个BM螺旋置换三螺旋束结构域的两个螺旋从而不影响多肽的基本结构。即，根据本发明的此实施方案的多肽的Cα骨架的整体折叠与其形成其部分的三螺旋束蛋白结构域的基本上相同，例如具有相同顺序的相同二级结构元件等。因此，如果根据本发明的此实施方案的多肽具有如原始结构域相同的折叠，则根据本发明的BM“形成””三螺旋束结构域的“部分”，提示共享了基本的结构性质，那些性质例如产生相似的CD谱。技术人员了解相关的其他参数。

在特定实施方案中，ABD结合基序(BM)因此形成三螺旋束蛋白结构域的部分。例如，在所述三螺旋束蛋白结构域内，BM可基本组成具有互相连接环的2个α螺旋。在特定实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体蛋白的结构域。此类结构域的非限制实例为来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的5个不同的三螺旋结构域，诸如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域为蛋白Z的变体，其源自葡萄球菌的蛋白A的结构域B。

在其中本发明的ABD结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的部分的实施方案中，ABD结合多肽可包含选自以下的氨基酸序列：

iii)K-[BM]-DPSQS X_aX_bLLX_c EAKKL NDX_dQ；

其中，

[BM]为如以上定义的ABD结合基序；

X_a选自A和S；

X_b选自N和E；

X_c选自A、S和C；

X_d选自A和S；

和

iv)与由iii)定义的序列具有至少81％同一性的氨基酸序列。

如以上所讨论的，与以上氨基酸序列相比包含较小改变而没有极大地影响三级结构和其功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，序列iv)与由iii)定义的序列具有至少83％同一性、诸如至少85％同一性、诸如至少87％同一性、诸如至少89％同一性、诸如至少91％同一性、诸如至少93％同一性、诸如至少95％同一性、诸如至少97％同一性。

在如以上定义的ABD结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的X_a是A。在可选的实施方案中，在序列iii)中的X_a是S。

在如以上定义的ABD结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的X_b是N。在可选的实施方案中，在序列iii)中的X_b是E。

在如以上定义的ABD结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的X_c是A。在可选的实施方案中，在序列iii)中的X_c是S。在又另一个可选的实施方案中，在序列iii)中的X_c是C。

在如以上定义的ABD结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中的X_d是A。在可选的实施方案中，在序列iii)中的X_d是S。

在如以上定义的ABD结合多肽的一个实施方案中，在序列iii)中，X_a是A；X_b是N；X_c是A且X_d是A。

在如以上定义的ABD结合多肽的另外实施方案中，在序列iii)中，X_a是A；X_b是N；X_c是C且X_d是A。

在如以上定义的ABD结合多肽的另外实施方案中，在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是S且X_d是S。

在如以上定义的ABD结合多肽的另外实施方案中，在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是C且X_d是S。

在如以上定义的ABD结合多肽的另外实施方案中，在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是A且X_d是A。

在如以上定义的ABD结合多肽的另外实施方案中，在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是C且X_d是A。

在又另外的实施方案中，在如以上ABD结合多肽的定义中的序列iii)选自SEQ ID NO:53-104，特别选自SEQ ID NO:53-59。在另外实施方案中，序列iii)选自SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ IDNO:56。特别地，序列iii)可以为SEQ ID NO:53。

而且，在另外实施方案中，提供如以上定义的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

v)YAK-[BM]-DPSQS SELLX_c EAKKL NDSQA P；

其中[BM]为如以上定义的ABD结合基序且X_c选自S和C；和

vi)与由v)定义的序列具有至少83％同一性的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，提供如以上定义的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

vii)YAK-[BM]-DPSQS SELLX_c EAKKL NDAQA P；

其中[BM]为如以上定义的ABD结合基序且X_c选自A和C；和

viii)与由vii)定义的序列具有至少83％同一性的氨基酸序列。

可选地，提供如以上定义的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

ix)FNK-[BM]-DPSQS ANLLX_c EAKKL NDAQA P；

其中[BM]为如以上定义的ABD结合基序且X_c选自A和C；和

x)与由ix)定义的序列具有至少83％同一性的氨基酸序列。

如以上所讨论的，与以上氨基酸序列相比包含较小改变而没有极大地影响三级结构和其功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的ABD结合多肽可例如具有与由v)、vii)或ix)定义的序列至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％相同的序列。

在一些实施方案中，ABD结合基序可形成包含选自以下的氨基酸序列的多肽的部分：

ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；

ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；

ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；

ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；

AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；

VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；

AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；和

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK。

在一个实施方案中，ABD结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：

xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；

其中[BM]是如以上定义的ABD结合基序；和

xii)与由xi)定义的序列具有至少84％同一性的氨基酸序列。

再次，与以上氨基酸序列相比包含较小改变而没有极大地影响三级结构和其功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的ABD结合多肽可例如具有与由xi)定义的序列至少86％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少94％、至少96％、或至少98％相同的序列。

在此多肽中的序列xi)可选自SEQ ID NO:105-156中的任一个。特别地，序列xi)可选自SEQ ID NO:105-111中的任一个，诸如选自SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108。在此多肽的具体实施方案中，序列xi)为SEQ ID NO:105。

本发明的多肽可以是单体或多聚体形式。在本发明的一个实施方案中，ABD结合多肽以多聚体形式呈现，包含至少2个ABD结合多肽单体单元，其氨基酸序列可以是相同或不同的。多肽的多聚体形式可以是有利的，因其可具有增强的结合性质。

在一个实施方案中，所述ABD结合多肽单体单元共价偶联到一起。在特定实施方案中，ABD结合多肽单体单元被表达作为融合蛋白。

多肽可使用已知有机化学方法通过共价偶联来连接，或在用于多肽的重组表达的系统中表达为一种或更多种融合多肽，或以任何其他方式、直接地或通过连接子例如氨基酸连接子来连接。

在一个实施方案中，所述ABD结合多肽为二聚形式。可能的多聚体形式还包括三聚体形式。多肽的多聚体形式可包含如以上定义的适合数量的多肽序列。

技术人员将理解，可对根据本文公开的任何方面的ABD结合多肽进行各种修饰和/或添加，以对特定应用定制多肽而不偏离本公开内容的范围。例如，本文公开的任何ABD结合多肽可包含另外的C末端和/或N末端氨基酸。此多肽应被理解为在多肽链的最前和/或最末位置处，即在N末端和/或C末端具有添加的氨基酸残基的多肽。因此，ABD结合多肽可包含任何适合数量的添加的氨基酸残基，例如至少一个添加的氨基酸残基。每个添加的氨基酸残基可单独地或共同地添加，使得例如改善多肽的产生、纯化、在体内或在体外稳定化、偶联或检测。此类添加的氨基酸残基可包含为了化学偶联目的添加的一个或更多个氨基酸残基，其可例如允许将ABD结合多肽偶联至树脂或基质上，例如Sepharose基树脂或SulfoLink偶联树脂。这样的一个实例为添加半胱氨酸作为添加的氨基酸残基，或作为许多添加的氨基酸残基中的一个。在一个实施方案中，本文公开的ABD结合多肽包含在多肽的C末端(C-terminal end)，例如在C末端(C-terminus)的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，所述半胱氨酸为C末端添加的三肽VDC的部分。在一个实施方案中，所述半胱氨酸为单独的C末端C。

在一个特别地具体实施方案中，ABD结合多肽包含两个如以上定义的ABD结合结构域的二聚体，以及C末端半胱氨酸残基。

此类添加的氨基酸残基还可提供用于纯化或检测多肽的“标签”，诸如His₆标签或“myc”(c-myc)标签或“FLAG”标签用于与特异于该标签的抗体相互作用或在His₆标签的情况下用于固定化金属亲和层析法(IMAC)。

如以上讨论的另外氨基酸可借助于化学共轭(使用已知的有机化学方法)或借助于任何其他方式诸如表达作为融合蛋白的ABD结合多肽来偶联到ABD结合多肽。

在另外的方面，提供编码如以上描述的ABD结合多肽的多核苷酸。包含此多核苷酸的表达载体可使得能够例如通过在宿主细胞中的表达来产生ABD结合多肽。用于本文公开的ABD结合多肽的表达的此类工具以及使用其用于ABD结合多肽的重组生产的方法被包含于本公开内容中。

在本发明的另一个实施方案中，提供ABD结合多肽和可检测的剂的组合。在一个特定实施方案中，可检测的剂选自荧光剂和放射剂。荧光可检测剂包括荧光多肽，诸如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶和其变体。可用于该上下文中的放射可检测的剂包括例如放射性核素诸如³H和¹²⁵I。

尽管本发明已经参考多个示例性实施方案进行了描述，本领域技术人员将理解的是，可以做出不同的改变并且多种等价物可以由其要素所代替，而不脱离本发明的范围。另外，可以做出许多修改以使特定的情况或分子适应本发明的教导，而不脱离本发明的基本范围。因此，预期本发明不限于为进行本发明而考虑的任何具体实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书范围内的所有实施方案。

附图简述

图1为包含在本发明的ABD结合多肽中的ABD结合基序的实例(SEQID NO:1-52)、根据本发明的49-mer ABD结合多肽的实例(SEQ IDNO:53-104)、根据本发明的58-mer ABD结合多肽的实例(SEQ IDNO:105-156)、以及用于选择和筛选、或在用于阐述本发明的融合蛋白中使用的白蛋白结合结构域变体的序列(SEQ ID NO:157-162)的氨基酸序列列表。

图2显示如在实施例1中所描述的，ELISA中对于以2μg/ml的生物素化的PEP07911来检验的Z变体的选择的响应。通过将吸光度除以来自ELISA板上的阳性对照的信号来归一化该响应。

图3显示如实施例1所述进行的，对于在封闭ELISA检验中Z变体的选择的响应。在添加10x过量HSA或不添加10x过量HSA的情况下，针对0.2μg/ml的PEP07911测试Z变体的周质制备物。黑色条相应于不含HSA的样品和灰色条相应于含作为封闭剂被添加的HSA的样品。

图4显示来自实施例3中所述的柱研究I的结果。在图表中的条代表在表1中阐述的不同洗涤和洗脱步骤之后从每个ABD结合Z变体偶联的树脂中释放的样品的相对量。

图5显示来自实施例3中所述的柱研究II的结果。图5A代表在分别用0.1M柠檬酸钠,pH 3.0或0.5M HAc,pH 2.5的第一洗脱(a)或第二洗脱(b)之后，从每个ABD结合Z变体偶联的树脂、或从被包括作为参考的HSA-Sepharose树脂中释放的样品的相对量。图5B显示从在图5A中从Z变体偶联的树脂洗脱的相应级分的SDS-PAGE分析的结果。“M”是指Novex Sharp预染色蛋白标准(Invitrogen；Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)且“上样的样品”是指包含PEP08515的细菌提取物，其最初上样到每种Z变体偶联的树脂上的包含PEP08515的细菌提取物。将来自Z变体偶联的树脂的20μl洗脱液、5μl的蛋白标准或细菌提取物上样到每种SDS-PAGE凝胶的一个泳道。图5C显示图5A中从HSA Sepharose树脂洗脱的相应级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1：用0.1M柠檬酸钠,pH 3.0(pH 3(a))的首次洗脱。泳道2：用0.1M柠檬酸钠,pH 3.0(pH 3(b))的第二次洗脱。泳道3：用0.5M HAc,pH 2.5(pH 2.5(a))的首次洗脱。泳道4：用0.5M HAc,pH 2.5(pH 2.5(b))的第二次洗脱。将每种20μl洗脱液上样到SDS-PAGE凝胶中。“M”是指Novex Sharp预染色蛋白标准(Invitrogen；Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)，其上样5μl。

图6显示来自如在实施例4中描述进行的在与His₆-(Z06677)₂-Cys偶联的EAH-Sepharose树脂上ABD-融合蛋白(实线)的亲和纯化的色谱图。与HSA偶联的Sepharose树脂上相同样品(断线)的纯化被包括用于参考。样品注入点用箭头表示。A和B表示流通级分，且C和D表示洗脱级分，分别来自于His₆-(Z06677)₂-Cys偶联树脂和HSA偶联树脂。用范围从pH 5.5到pH 2.3的线性pH线性梯度进行洗脱。通过HPLC系统的内置pH计监测pH(虚线)。

图7显示如在实施例4中所示并如在实施例4中进一步所描述的来进行的反复碱孵育之后测量的，偶联到EAH-Sepharose树脂上的His₆-(Z06677)₂-Cys(实线)的动力学结合容量。偶联到Sepharose树脂的HSA(虚线)的结合容量被包括用于参考。

图8A显示如实施例7所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP10986的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号(实线)。FT和E分别指流通级分和洗脱级分。用0.1M HAc,pH 2.9进行洗脱，且通过HPLC系统的内置pH计监测pH(虚线)。

图8B显示来自实施例7所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1：上样到柱上的澄清的细菌提取物，泳道2：级分E1，泳道3：级分E2，和泳道4：级分E3。“M”是指Novex Sharp预染色蛋白标准(Invitrogen；Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)。除了泳道2上样1.25μl，将5μl的每种样品上样到SDS-PAGE凝胶的各自泳道中。

图9A显示如实施例8所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP03973的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号(实线)。FT和E分别指流通级分和洗脱级分。用0.1M HAc,pH 2.9进行洗脱，且通过HPLC系统的内置pH计监测pH(虚线)。

图9B显示来自实施例8所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1：上样到柱上的澄清的细菌提取物，泳道2和泳道3：流通级分，泳道4：级分E1，泳道5：级分E2，泳道6：级分E3，泳道7：级分E4，泳道8：级分E5。“M”是指Novex Sharp预染色蛋白标准(Invitrogen；Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)。将5μl的每种样品上样到SDS-PAGE凝胶的各自泳道中。

图10A显示如实施例9所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP06548的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号(实线)。FT和E分别指流通级分和洗脱级分。用0.1M HAc,pH 2.9进行洗脱，且通过HPLC系统的内置pH计监测pH(虚线)。

图10B显示来自实施例9所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1：上样到柱上的澄清的细菌提取物，泳道2：级分E1。“M”是指Novex Sharp预染色蛋白标准(Invitrogen；Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)。将5μl上样到SDS-PAGE凝胶的泳道M和泳道1且将5.8μl上样到泳道2中。

图11A显示如实施例10所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP17081的纯化的色谱图。显示在280nm的吸光度信号(实线)和电导率(虚线)。样品注射点用箭头表示。FT和E分别指流通级分和洗脱级分。

图11B显示来自实施例10所述的纯化的不同阶段的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道M：5μl Novex Sharp预染色蛋白标准，Invitrogen(216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)。泳道1：上样到抗ABD琼脂糖柱上的5μl澄清的、热处理的大肠杆菌(E.coli)裂解物。泳道2：来自抗ABD琼脂糖柱的5μl流通级分(flow-through)(在图11A中的FT)。泳道3：来自抗ABD琼脂糖柱的3.6μl的洗脱池(在图11A中的E)。泳道4：通过RPC(反相色谱)和缓冲液交换进一步纯化的12μl的PEP17081。

图12A显示来自如实施例11所述进行的在抗ABD琼脂糖上的，包含在其C末端与蛋白激素融合的ABD035(SEQ ID NO:159)的蛋白1的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号(实线)和电导率(虚线)。FT、W和E分别指流通级分、洗涤级分和洗脱级分。第一洗涤步骤W1用4CV的TST进行，且第二洗涤步骤W2用3CV的5mM NH₄Ac,pH 5.5进行。

图12B显示来自实施例11所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1-3：SEC纯化的蛋白：10μg(1)、5μg(2)和1μg(3)。泳道4：上样到抗ABD琼脂糖柱上的蛋白样品，即在TST中以1:10稀释的SEC纯化的蛋白。泳道5：20倍浓缩的FT。泳道6：60倍浓缩的W1。泳道7、8和9：分别为10μg(7)、5μg(8)和1μg(9)的洗脱的蛋白。标记“M”的泳道用蛋白分子量标志(Mw:200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6、3.5、2.5kDa)来上样。箭头指示污染蛋白的微弱条带，其在仅通过SEC纯化的样品中的SDS-PAGE凝胶上可见，但其通过在抗ABD琼脂糖树脂上的纯化有效地去除。

图13A显示来自如实施例12所述进行的在抗ABD琼脂糖上的，包含在其N末端与肽激素融合的ABD035(SEQ ID NO:159)的蛋白2的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号(实线)和电导率(虚线)。FT、W和E分别指流通级分、洗涤级分和洗脱级分。第一洗涤步骤W1用8CV的TST进行，且第二洗涤步骤W2用3CV的5mMNH₄Ac,pH 5.5进行。

图13B显示来自实施例12所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1：上样到抗ABD琼脂糖柱上的蛋白样品。泳道2：FT。泳道4-6：洗涤级分。泳道7-13：在图13A中标记的双峰内的洗脱的蛋白级分。相应于双峰内第一峰的级分上样到泳道7-10。标记“M”的泳道用蛋白分子量标志(Mw:200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6、3.5、2.5kDa)来上样。

实施例

遍及此研究使用以下材料，除非另外说明：

·大肠杆菌(Escherichia coli)菌株XL1-Blue(Agilent Technologies,目录号200268)

·基本如在WO2009/016043或WO2012/004384中所述制备的白蛋白结合结构域ABD001(SEQ ID NO:157)、C-ABD001(SEQ IDNO:158)、ABD035(SEQ ID NO:159)、PP013(SEQ ID NO:160)、PEP07986(SEQ ID NO:161)和PEP07911(SEQ ID NO:162)。

实施例1

ABD结合Z变体的选择和筛选

材料和方法

靶蛋白的生物素化：使用EZ-Link马来酰亚胺PEG₂-生物素(Pierce,目录号21901)将带有N端半胱氨酸的ABD001(C-ABD001；SEQ ID NO:158)和PEP07911(SEQ ID NO:162)生物素化。简言之，将蛋白溶解于50mM磷酸钠、150mM NaCl、2mM EDTA，pH 7.5中。添加二硫苏糖醇(DTT)至20mM的终浓度且用滚转(end-over-end)混合将样品在34℃下孵育1小时。使用一次性PD-10柱(GE Healthcare,目录号17-0851-01)将缓冲液交换为轭合缓冲液(50mM磷酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA，pH 7.0)。将5倍(5x)过量摩尔的EZ-Link马来酰亚胺PEG₂-生物素(溶解于轭合缓冲液)添加到蛋白样品中并在室温下(RT)伴随滚转混合继续孵育2小时。随后使用PD-10柱进行将缓冲液交换为PBS(10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.68mM KCl，pH 7.4)。根据制造商的建议使用10x过量摩尔的No-Weigh EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce，目录号21327)在室温下将PEP07986(SEQ IDNO:161)生物素化30分钟。随后根据制造商的说明书使用透析盒(Slide-a-lyzer 3.5K,3500MWCO,Pierce，目录号66333)进行将缓冲液交换为PBS。

噬菌体展示选择ABD结合Z变体：基本按照在等(JBiotechnol,128:162-183,2007)中描述的，在噬菌粒pAY02047中构建的，在细菌噬菌体上展示的蛋白Z的随机变体文库用于选择ABD结合多肽。文库Zlib004Naive.I利用Taq DNA多聚酶结合分子Z03639(描述于Gunneriusson等,Protein Eng 12:873-878,1999中，其中它被表示为Z_TaqS1-1)作为融合伴侣。文库具有1.4x 10¹⁰个变体的实际大小。

在20升发酵罐中制备噬菌体储备液。在20升补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/l TSB、5g/l酵母提取物)中孵育来自包含噬菌粒文库Zlib004Naive.I的甘油储备液的细胞。在37℃下在发酵罐(Belach Bioteknik,BR20)中生长培养物。当细胞达到0.7-0.8的光密度(OD)时，使用10x过量摩尔的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs,目录号N0315S)感染大约2.6升培养物。孵育细胞30分钟，随后用补充有0.1mM IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷，用于诱导表达)、25μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml羧苄青霉素的TSB-YE填充发酵罐至20升，且细胞在30℃下生长22小时。如在等，以上中所述的，通过在15900g离心使在培养中的细胞形成小球且留在培养基中的噬菌体颗粒在PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化钠)中沉淀2次、过滤并溶解于PBS和甘油中。使用之前将噬菌体储备液储存在-80℃下。

针对生物素化的ABD的不同变体进行三个循环的选择。噬菌体储备液制备、选择程序和在选择循环之间的噬菌体的扩增基本如在WO2009/077175针对另外一个靶的选择所描述的进行。补充有0.1％明胶和0.1％吐温20的PBS被用作选择缓冲液且通过M-280链霉亲和素(Dynal，目录号112.06)直接捕获靶-噬菌体复合物。每0.25μg ABD使用1mg珠。大肠杆菌菌株XL1-Blue被用于噬菌体扩增。选择以分为三个途径(track)的三个循环进行：一个途径使用PEP07911，一个途径使用C-ABD001且一个途径在C-ABD001和PEP07986之间交替。在选择的循环1中，在不同选择途径中使用100nM PEP07911或C-ABD001，且用0.1％PBST(补充有0.1％吐温-20的PBS)进行2次洗涤。在后续两个循环中应用了使用更低靶浓度和增加数量的洗涤的增加的严格性。对于仅具有一个靶的选择途径，在循环2和3分别使用50nM之后使用25nM PEP07911或C-ABD001。在具有交替靶的途径中，在循环2中使用75nM的PEP07986且在循环3中使用40nM的C-ABD001。对于所有途径，在循环2和3中分别使用0.1％PBST进行4次和8次洗涤。在洗涤之后，用500μl 0.1M甘氨酸-HCl,pH 2.2洗脱结合的噬菌体，随后立即用50μl Tris-HCl,pH 8.0和450μl PBS中和。在最后选择循环中，所有途径首先用0.5M HAc,pH 4.0洗脱，随后如上所述用甘氨酸-HCl洗脱。此后分别处理不同洗出液。

Z变体的ELISA筛选：为了核实选择的Z变体分子确实可与ABD的不同变体相互作用，进行ELISA检验。通过在深孔板(Nunc，目录号278752)中将来自选择的单克隆接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1mMIPTG的1ml TSB-YE培养基来产生Z变体。在37℃下孵育板18-24小时。通过离心使细胞形成小球，在400μl的0.05％PBST中重悬且在-80℃冷冻以释放细胞的周质级分。随后在水浴中将冷冻的样品解冻且重复冷冻-解冻8次。将400μl PBST 0.05％添加到样品中且通过离心使细胞形成小球。周质上清液包含表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG、作为融合到Taq DNA聚合酶结合分子Z03639的Z变体。Z#####是指单独的58个氨基酸残基Z变体。

用包含4μg/ml的Z变体特异性抗体(Affibody，目录号20.1000.01.0005)的50μl/孔的包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6)包被一半面积的96孔ELISA板(Costar，目录号3690)并在4℃下孵育过夜。倾倒抗体溶液并在室温下用100μl的PBSC(补充有0.5％酪蛋白的PBS；Sigma，目录号C8654)封闭孔2小时。丢弃封闭溶液且将50μl周质溶液添加到孔中并在室温下在缓慢震荡下孵育持续1.5小时。倾倒上清液并用0.05％PBST洗涤孔4次。然后，将PBSC中2μg/ml浓度的50μl生物素化PEP07986或PEP07911添加到每个孔中。室温下孵育板1小时，随后如上述洗涤。将在PBSC中以1:30000稀释的链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶；Thermo Scientific，目录号N100)添加到孔中且孵育板45分钟。如上述洗涤之后，将50μlImmunoPure TMB底物(Thermo Scientific，目录号34021)添加到孔中且根据制造商的建议处理板。使用多孔板读数器Victor³(Perkin Elmer)在450nm下测量孔的吸光度。

作为阳性对照，针对5μg/ml的此生物素化的靶蛋白检测包含结合到无关但特异性靶蛋白并如上表达的Z变体的周质级分。作为阴性对照，针对PEP07986或PEP07911检测相同的周质制备物。对针对PEP07986或PEP07911具有阳性吸光度值的克隆进行测序。

测序：使用标准PCR程序和引物AFFI-21(5’-tgcttccggctcgtatgttgtgtg；SEQ ID NO:163)和AFFI-22(5’-cggaaccagagccaccaccgg；SEQ ID NO:164)从单克隆中以2个步骤扩增PCR片段。使用按照制造商的方案来使用的生物素化的寡核苷酸AFFI-72(5’-生物素-cggaaccagagccaccaccgg；SEQ IDNO:165)和终止子v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems，目录号4336919)进行扩增片段的测序。使用Magnatrix 8000(MagneticBiosolution)通过结合到磁性链霉亲和素包被的珠(Detach Streptavidin Beads,Nordiag,目录号2012-01)纯化测序反应，并在ABI3130xl GeneticAnalyzer(PE Applied Biosystems)上分析。

封闭ELISA：对来自最初ELISA筛选的克隆亚群进行ELISA封闭检验，以阐明其靶结合是否受到HSA存在的影响。对于选择的Z变体，使用如上相同的周质级分。如ELISA筛选检测运行ELISA封闭检验，伴随在靶步骤引入以下方案修改：在添加到检验板之前，将HSA与靶蛋白混合。在添加到板之前，将0.2μg/ml生物素化的PEP07911与10x过量摩尔的HSA混合且然后室温下孵育15分钟以允许形成复合物。作为阳性对照，针对5μg/ml的生物素化的特异性靶蛋白检测包含结合到无关靶蛋白并如上表达的分子的周质级分。作为阴性对照，针对生物素化的PEP07911检测相同的周质制备物。作为空白，添加PBSC而不是周质制备物且添加生物素化的PEP07911作为靶。所有对照制备为如以上相同方式添加或不添加HSA的样品。

结果

ABD结合Z变体的噬菌体展示选择：在针对生物素化ABD的不同变体的三个噬菌体展示选择循环之后获得单个克隆。每个循环增加噬菌体颗粒收率(出去的噬菌体颗粒/进入的噬菌体颗粒)，表明在靶结合克隆中的富集。

Z变体的ELISA筛选：在96孔板中产生在三个选择循环之后获得的克隆，并在ELISA中筛选ABD结合活性。在图2中示出针对PEP07911检验的阳性克隆(相应于至少2x阴性对照的信号)的选择结果。对不相关蛋白特异性的对照分子给出对特异性蛋白的阳性信号，然而针对PEP07986或PEP07911没有获得信号。

封闭ELISA：对PEP07986或PEP07911的阳性对照进行包括HSA的封闭检验，以观察Z变体是否具有与天然配体HSA的重叠结合位点。对于所有测试的克隆，通过HSA的存在使对PEP07911的结合信号完全消失，达到如背景的相同水平(图3)。阳性对照的结合不受添加过量HSA的影响，且空白没有显示背景信号。

测序：对在ELISA筛选中针对ABD具有阳性吸光度值的克隆进行测序。对每个变体给出独特的标识号#####，且将单独变体称为Z#####。在图1中列出58个氨基酸残基长的Z变体的氨基酸序列，且在序列表中为SEQ ID NO:105-156。这些Z变体的推导ABD结合基序表示为BM#####并在图1中列出，且在序列表中为SEQ ID NO:1-52。将被预测组成这些Z变体的每个中的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长的多肽的氨基酸序列表示为P#####并在图1中列出，且在序列表中为SEQ ID NO:53-104。

实施例2

ABD结合Z变体的克隆和产生

材料和方法

Z变体的亚克隆：将7个ABD结合变体的DNA，Z06608(SEQ IDNO:107)、Z06620(SEQ ID NO:110)、Z06638(SEQ ID NO:106)、Z06650(SEQID NO:108)、Z06677(SEQ ID NO:105)、Z06678(SEQ ID NO:109)和Z06695(SEQ ID NO:111)从文库载体pAY02047中扩增。使用标准分子生物学技术并如在WO 2009/077175中对Z变体结合另一个靶详细描述的，应用了用于构建带有N端His₆标签和C端Cys的二聚Z变体分子的亚克隆策略。将Z基因片段亚克隆到表达载体pAY01449，产生编码的序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VDC。

培养和纯化：用包含每种各种Z变体的二聚基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)，并在37℃下在补充有50μg/ml卡那霉素的1升的TSB+YE培养基(含酵母提取物的胰蛋白大豆肉汤)中培养。在OD₆₀₀＝1下，以0.17mM的终浓度添加IPTG以诱导蛋白表达且在37℃下孵育培养物持续另外5小时。通过离心收获细胞。

将4.8克的每种细胞小团重悬于补充有29U/ml(Merck，目录号1.01654.0001)的30ml变性结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑、8M尿素，pH 7.4)，并在室温下震荡孵育1小时以释放表达的蛋白。通过离心去除细胞碎片且将每种上清液应用于1ml His GraviTrapIMAC柱(GE Healthcare，目录号11-0033-99)。通过用变性结合缓冲液、天然结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑，pH 7.4)和洗涤缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、60mM咪唑，pH 7.4)洗涤去除污染物且随后用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、250mM咪唑，pH 7.4)洗脱ABD结合Z变体。通过尺寸排阻色谱法将每种纯化的ABD结合Z变体转移到10mM NH₄HCO₃。通过使用ND-1000分光光度计并使用各自蛋白的消光系数，测量在280nm的吸光度确定蛋白浓度。冻干ABD结合Z变体并通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析终产物的纯度。使用HPLC-MS分析确认每种纯化的ABD结合Z变体的身份。

结果

培养和纯化：在大肠杆菌良好表达构建为二聚体并带有N端His₆标签和C端Cys的7个ABD结合变体Z06608(SEQ ID NO:107)、Z06620(SEQID NO:110)、Z06638(SEQ ID NO:106)、Z06650(SEQ ID NO:108)、Z06677(SEQ ID NO:105)、Z06678(SEQ ID NO:109)和Z06695(SEQ ID NO:111)。通过测量在280nm的吸光度来分光光度确定的来自4.8克细菌小团的IMAC-纯化的蛋白的量，对于不同ABD结合Z变体为从3mg到19mg的范围。

每种最终蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示，这些蛋白制备物主要包含各自的ABD结合Z变体。通过HPLC-MS确认每种ABD结合Z变体的正确分子量。

实施例3

ABD结合Z变体的结合和洗脱特征的评价

在此实施例中，使用旋转柱以小规模的形式研究如实施例1和实施例2中所述分别选择和产生的一组ABD结合多肽的结合和洗脱特征。

材料和方法

ABD结合Z变体偶联到树脂：将以如实施例2所述产生的His₆-(Z#####)₂-Cys形式的1mg的每种冻干的ABD结合Z变体Z06608、Z06620、Z06638、Z06650、Z06677、Z06678和Z06695重悬于还原缓冲液(50mM Tris-HCl、5mM EDTA、20mM DTT,pH 8.5)中并在室温下孵育2小时。使用尺寸排阻色谱法将还原的蛋白溶液转移到包括50mM DTT的偶联缓冲液(50mM Tris-HCl、5mM EDTA,pH 8.5)中，且然后与0.2mlSulfoLink偶联树脂(Thermo Fisher Scientific，目录号20401)的部分混合。此步骤使得ABD结合Z变体的C端半胱氨酸残基的硫醇基团与树脂的碘乙酰基团之间的定向位点反应成为可能，形成共价硫醚键。根据制造商的说明书进行偶联反应。如下确定定义为每毫升树脂毫克偶联的ABD结合Z变体的偶联度：基于通过分光光度测量在280nm的吸光度获得的浓度，通过从样品的原始量中减去未偶联的材料的量计算偶联的ABD结合Z变体的量。然后，用mg计的偶联的ABD结合Z变体的量除以SulfoLink偶联树脂的体积。

柱研究I：使用纯样品评价ABD结合Z变体偶联的树脂：进行第一柱研究以测试偶联到树脂的7种ABD结合Z变体中每种的结合、洗涤和洗脱性质，并通过使用ABD融合蛋白PEP08517的先前纯化的样品。PEP08517包含在其N端融合到蛋白Z的细胞因子结合变体的白蛋白结合结构域PP013(SEQ ID NO:160)。将树脂的0.1ml部分转移到测试管中且添加偶联缓冲液中以2mg/ml的0.1ml的PEP08517的纯样品。室温下，在旋转轮中孵育试管1小时。将每种样品树脂混合物转移到空的旋转柱。通过离心收集未结合的蛋白(流通，FT)。此后，添加在表1中详述的0.1ml不同溶液以洗涤并随后洗脱结合的PEP08517分子。通过离心收集每种洗涤和洗脱级分。

通过测量在280nm的吸光度在分光光度计中分析收集的级分。

表1.在柱研究I中样品和溶液的规格

柱研究II：使用细菌提取物评价ABD结合Z变体-偶联的树脂：进行第二柱研究，以进一步测试来自柱研究I的4种ABD结合Z变体偶联树脂的结合、洗涤和洗脱性质。这些树脂的配体为His₆-(Z06608)₂-Cys、His₆-(Z06638)₂-Cys、His₆-(Z06677)₂-Cys和His₆-(Z06650)₂-Cys。将装有HSASepharose的另外柱(根据制造商的说明书，将人血清白蛋白通过游离胺偶联到CNBr-活化的Sepharose 4Fast Flow，GE Healthcare，目录号17-0981)包括作为参考。通过超声处理和离心从大肠杆菌小团制备的澄清的细菌提取物用作此实验中的样品。将包含约0.5mg的PEP08515(包含在其N端融合到蛋白Z的PDGFR-β(血小板衍生生长因子受体β)结合变体的白蛋白结合结构域PP013(SEQ ID NO:160))的0.17ml细菌提取物，转移到装有每种各自ABD结合Z变体偶联的树脂或HSA Sepharose的旋转柱。通过离心收集流通级分(flow-through)并重新应用到柱两次。添加在表2中详述的不同溶液以去除细菌宿主蛋白并随后洗脱结合的PEP08515分子。通过离心收集洗涤和洗脱级分并通过测量在280nm的吸光度在分光光度计中和通过SDS-PAGE分析。

表2.在柱研究II中样品和溶液的规格

结果

ABD结合多肽的偶联效率：在表3中显示每种ABD结合多肽偶联到SulfoLink偶联树脂的程度。

表3.ABD结合Z变体偶联到SulfoLink树脂的程度

柱研究I：使用纯样品评价ABD结合Z变体-偶联的树脂：在图4中显示在表1所详述的不同洗涤和洗脱步骤之后从7种ABD结合Z变体偶联树脂中的每种释放的、并如通过测量在280nm的吸光度确定的样品PEP08517的量。

在研究的条件下，分别与ABD结合Z变体(His₆-(Z06608)₂-Cys、His₆-(Z06638)₂-Cys、His₆-(Z06650)₂-Cys)和His₆-(Z06677)₂-Cys偶联的树脂显示最有利的洗脱图，在样品应用和洗涤期间具有最小样品渗漏和用pH2.5缓冲液的洗脱下释放大多数样品。

在pH 4下ABD结合Z变体偶联的树脂都没有洗脱出许多样品。令人感兴趣地，例如His₆-(Z06608)₂-Cys的一些树脂在第二次添加pH 2.5缓冲液(“pH 2.5(b)”)时洗脱大多数样品，而例如His₆-(Z06677)₂-Cys在第一次添加pH 2.5缓冲液(“pH 2.5(a)”)时洗脱大多数样品，表明与其他候选者相比亲和配体His₆-(Z06677)₂-Cys可使用更高的洗脱pH。

柱研究II：使用细菌提取物评价ABD结合Z变体-偶联的树脂：在使用包含PEP08515的细菌提取物作为样品的进一步结合、洗涤和洗脱研究中，选择来自柱研究I的四种表现最佳ABD结合Z变体-偶联树脂，包括亲和配体His₆-(Z06608)₂-Cys、His₆-(Z06638)₂-Cys、His₆-(Z06650)₂-Cys和His₆-(Z06677)₂-Cys。在图5A中显示在表2所详述的不同洗脱步骤之后，从4种ABD结合Z变体偶联树脂中的每种、或从被包括作为参考的HSA-Sepharose树脂中释放的，并如通过测量在280nm的吸光度确定的PEP08515的量。

在图5B中显示相同洗脱级分的SDS-PAGE分析。来自两个分析的结果符合良好，即对于某种亲和配体，具有高吸光度读数的洗脱级分也在SDS-PAGE凝胶上产生粗条带，且对于具有较低吸光度读数的级分反之亦然。如同在柱研究I中，在更高pH范围(“pH 3(a)”和“pH 3(b)”)下的洗脱下与His₆-(Z06677)₂-Cys偶联的树脂释放其多数结合蛋白。

所有洗脱的样品的纯度通常很高(如从SDS-PAGE分析中估算的，超过95％)，然而对不同ABD结合Z变体可观察到轻微差异。

与HSA Sepharose树脂相比(在图5C中显示的SDS-PAGE分析)，ABD结合Z变体偶联树脂表现为具有如从吸光度读数和从SDS-PAGE分析两者中判断的更高结合容量以及更有利的洗脱性质。容量的不同不能归因于配体密度的不同；事实上，在HSA Sepharose上偶联的HSA分子的数量是与ABD结合Z变体偶联的树脂相比高大约1.5-2.2倍。

实施例4

ABD结合Z变体的进一步表征和柱研究

基于实施例3中提供的结果，选择His₆-(Z06677)₂-Cys用于进一步在连接到色谱系统的柱上表征和研究。

材料和方法

通过圆二色性分析确定熔点：进行圆二色性(CD)分析以确定His₆-(Z06677)₂-Cys的熔点(Tm)。在PBS中将纯化的样品稀释到0.5mg/ml。进行可变温度测量(VTM)，其中在以5℃/分钟的温度斜率将样品从20℃加热到90℃的期间，监测在220nm的吸光度。从在CD信号对温度的图中转变的中点确定Tm。在Jasco J-810分光偏振仪(Jasco Scandinavia AB)上使用具有1mm的光程长度的小室进行CD测量。

洗脱pH的色谱研究：将His₆-(Z06677)₂-Cys固定化到活化的EAH-Sepharose 4B(GE Healthcare，目录号17-0569-01)。根据制造商的说明书进行活化和固定化，且如在实施例3中所述确定偶联度。活化的EAHSepharose包含碘乙酰基团，其使得通过亲和配体的C端半胱氨酸定向位点的偶联成为可能。将0.43ml的树脂装到Tricorn 5/50柱(GE Healthcare)。将0.47ml HSA Sepharose(参见实施例3)装到相同类型的柱作为参考。

使用10色谱系统(GE Healthcare)进行洗脱实验。将两个柱连接到系统并用PBS平衡。将包含1mg PEP08519(包含在其N端融合到蛋白Z的Taq聚合酶结合变体的白蛋白结合结构域PP013(SEQ IDNO:160))的2ml样品上样到每个柱上，随后用PBS和0.1M柠檬酸钠、0.9％NaCl，pH 5.5洗涤。通过大于16柱体积(CV)的范围从pH 5.5到pH 2.3的线性pH梯度(使用0.1M柠檬酸钠、0.9％NaCl,pH 5.5和0.1M柠檬酸钠、0.9％NaCl,pH 2.3)洗脱结合的蛋白。通过系统的内置pH计监测pH。

ABD结合多肽的结合容量和抗碱性的色谱研究：在此实验中，对于His₆-(Z06677)₂-Cys树脂测试动力学结合容量和对碱的抗性，且将HSASepharose树脂装到在以前章节中描述的色谱研究中使用的Tricorn 5/50柱。

使用10色谱系统进行实验。将两个柱连接到系统并用PBS平衡。对于容量研究，以0.2毫升/分钟的流速(相应于2.4分钟的驻留时间)将PBS中包含0.25mg/ml PEP08519的样品上样到每个柱中，直到从柱出现的溶液在280nm的吸光度达到原始样品的10％吸光度(即10％突破点)。从样品体积中减去死体积(即，通过不包含亲和配体的柱运行样品测量的管路体积和柱体积)。用0.1M柠檬酸钠、0.9％NaCl,pH 2.3洗脱结合的蛋白。然后用PBS重新平衡柱。

在容量运行之后，通过以1毫升/分钟的流速应用5CV的0.2M NaOH，对柱进行碱处理，随后为没有流的孵育阶段。在碱中的全部孵育时间为25分钟。通过用以1毫升/分钟的5CV PBS洗涤进行柱的中和，随后为如以上所述新的容量测量。

如以上进行两个更多的碱处理随后容量测量，但NaOH浓度增加到0.5M且在最后碱处理中，孵育时间延长到2小时。

结果

圆二色性分析：将His₆-(Z06677)₂-Cys的熔点确定为54℃。

ABD结合Z变体的洗脱pH的色谱研究：确定His₆-(Z06677)₂-Cys与活化的EAH Sepharose树脂的偶联程度为每毫升树脂2.8mg多肽。

如图6所示，从包含His₆-(Z06677)₂-Cys树脂的柱上比从含有HSASepharose树脂的柱洗脱ABD融合分子PEP08519在梯度上出现地更早(即在更高pH下)，其也显示与在流通中出现的更大级分的更低结合容量。

来自His₆-(Z06677)₂-Cys柱的洗脱峰的最高峰的pH为3.3，而HSASepharose柱的相应pH为2.6。

ABD结合Z变体的结合容量和抗碱性的色谱研究：通过测量上样的样品量直到10％突破点确定动力学结合容量。His₆-(Z06677)₂-Cys柱的动力学结合容量被确定为每毫升树脂3.0mg PEP08519。HSA Sepharose柱的相应容量被确定为每毫升树脂0.5mg。如在实施例3中，不能通过配体密度的不同来解释容量的不同，由于估计固定化的HSA分子的数量为在它们各自树脂上的His₆-(Z06677)₂-Cys分子数量的两倍。

在每次碱孵育之后，再次测量动力学结合容量。在图7中显示结果。在所有孵育之后，His₆-(Z06677)₂-Cys柱保持其原始容量。这表明对相当苛刻碱性条件高的抗性，其对于使反复使用柱成为可能的就地清洗(CIP)程序是重要特征。相反地，被包括作为参考的HSA Sepharose柱在0.2M NaOH中25分钟后损失其大部分容量。

实施例5

固定化到不同树脂上的ABD结合Z变体的柱研究

在此实施例中，将ABD结合Z变体His₆-(Z06677)₂-Cys固定化到四种不同类型的树脂，且色谱法评价结合容量和抗碱性。

材料和方法

His ₆ -(Z06677) ₂ -Cys偶联到不同树脂：将4mg冻干的His₆-(Z06677)₂-Cys(如实施例2所描述产生的)溶解到1ml 0.1M NaHCO₃、0.5M NaCl,pH 8.3。将一半的样品固定化到0.67ml NHS-活化的Sepharose4Fast Flow(GE Healthcare，目录号17-0906)且一半的样品固定化到0.67mlCNBr-活化的Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare，目录号17-0981)。根据制造商的说明书进行两种偶联反应。

将2mg冻干的His₆-(Z06677)₂-Cys溶解到0.5ml 50mM Tris-HCl、5mM EDTA,20mM DTT,pH 8.5并孵育2小时。通过体积排阻色谱法去除DTT且将还原的多肽与0.67ml SulfoLink偶联树脂混合。根据制造商的说明书进行偶联反应。

在此实施例中评价的第四个柱为用His₆-(Z06677)₂-Cys固定化的EAHSepharose，如在实施例4中所述的。

如在实施例3所述确定每个树脂的偶联度。

4种ABD结合树脂的结合容量和抗碱性的色谱研究：将4种His₆-(Z06677)₂-Cys偶联的树脂装到Tricorn 5/50柱。测试动力学结合容量，之后对树脂进行0.5M NaOH持续2小时，随后进行第二动力学结合容量测试。如在实施例4所述进行容量测试和碱孵育。

结果

ABD结合Z变体His ₆ -(Z06677) ₂ -Cys对不同树脂的偶联：在表5中显示在此实施例中评价的His₆-(Z06677)₂-Cys与4种不同树脂中每种的固定化程度。

表5.His₆-(Z06677)₂-Cys对不同树脂的偶联程度

4种ABD结合树脂的结合容量和抗碱性的色谱研究：在表6中示出His₆-(Z06677)₂-Cys偶联到4种不同树脂的每种之后确定的动力学结合容量。

表6.His₆-(Z06677)₂-Cys偶联到不同树脂的动力学结合容量

确定两种碘乙酰基偶联树脂，SulfoLink偶联树脂和活化的EAHSepharose的动力学结合容量分别为每毫升树脂2.3毫克和3.4毫克样品。然而，当与每摩尔亲和配体可结合的样品的摩尔量相比，这些树脂显示相同动力学结合容量(1.4摩尔样品/摩尔His₆-(Z06677)₂-Cys配体)。换句话说，对于偶联到His₆-(Z06677)₂-Cys的SulfoLink树脂，与偶联到EAH Sepharose树脂的His₆-(Z06677)₂-Cys相比，在二聚体内的两个Z分子各自以更高程度地结合样品分子。

两种胺偶联树脂，即NHS-活化的Sepharose和CNBr-活化的Sepharose的动力学结合容量比两种碘乙酰基偶联的树脂更低。这表明，通过用于偶联碘乙酰基树脂的单个半胱氨酸定向位点固定化，使得ABD结合Z变体的结合位点更容易接近在流动相中的样品分子。

尽管事实上NHS树脂保留通过使亲和配体更容易接近而将理论上提高容量的间隔臂，NHS树脂的动力学结合容量与CNBr树脂相比少于一半。

表7中示出在用0.5M NaOH碱处理2小时之后4种不同树脂的动力学结合容量。碘乙酰基偶联树脂的动力学结合容量不受碱孵育的影响，而胺偶联的树脂的容量下降约10％。

表7.在碱处理之前和之后的动力学结合容量的比较

实施例6

抗ABD琼脂糖的生产

此实施例描述大规模生产以二聚形式并具有C端Cys的ABD结合Z变体Z006677即(Z06677)₂-Cys，且其随后固定化在SulfoLink偶联树脂上。

材料和方法

培养和纯化：将ABD结合Z变体Z06677作为二聚体亚克隆到在其中表达受T7启动子的调控的表达载体中。ABD结合多肽与另外的N端氨基酸序列GSSLQ和另外的C端氨基酸序列VDC一起表达。因此，表达的多肽具有序列GSSLQ-[Z06677][Z06677]-VDC。用质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)并在37℃下补充有50μg/ml卡那霉素的20升TSB+YE培养基(含酵母提取物的胰蛋白大豆肉汤)中培养。在OD₆₀₀＝1下，以0.17mM的终浓度添加IPTG以诱导蛋白表达且在37℃下孵育培养物持续另外5小时。通过离心收获细胞。

如实施例4和实施例5中观察到的，证明His₆-(Z06677)₂-Cys为对碱具有抗性。由于高浓度的NaOH有助于细胞破坏和纯化两者，且大部分的大肠杆菌宿主蛋白在高pH下变性，而(Z06677)₂-Cys留在溶液中，在(Z06677)₂-Cys的纯化中利用了此性质。

通过使用Ultra-Turrax T-50基础(IKA WERKE)将165克细胞小团重悬于1.2升的0.5M NaOH。室温下将悬浮液在搅拌下孵育1小时并然后在-20℃下冷冻。将冷冻的样品解冻并通过添加300ml的2M HCl和Tris碱至20mM的终浓度滴定至pH 8.2。通过离心去除细胞碎片、变性蛋白和DNA。向澄清的样品，添加800ml的[20mM Tris-HCl,pH 8.0,4.6克DTT]和(Merck，目录号1.01654.0001)至10U/ml的终浓度并在室温下继续孵育1小时。此后，添加300克的硫酸铵至1M的浓度，且在室温下搅拌孵育样品40分钟。通过离心去除在添加硫酸铵之后沉淀的蛋白，随后通过Nalgene瓶顶部过滤器(0.45μm)过滤。

添加乙腈(ACN)到样品至2％(v/v)的浓度。通过使用100色谱系统(GE Healthcare)将样品上样到装有125ml SOURCE 30RPC(GEHealthcare)的FineLine 35柱(GE Healthcare)。用包含0.1％TFA(三氟乙酸)的在Milli-Q水中的2％ACN洗涤柱，随后用包含4％ACN的相同缓冲液洗涤。通过超过15CV的从4％到25％ACN增加的ACN浓度来洗脱结合的蛋白。收集并通过SDS-PAGE和LC-MS分析洗脱的级分。合并相关的级分并通过使用装有500ml的Sephadex G-25(GE Healthcare)的XK-50柱(GE Healthcare)的体积排阻色谱转移到偶联缓冲液(50mM Tris-HCl、5mMEDTA,pH 8.5)中。通过测量在280nm的吸光度用分光光度计法分析并通过上样若干不同数量的(Z06677)₂-Cys的SDS-PAGE分析缓冲液置换的样品，且随后用考马斯蓝染色。

ABD结合多肽(Z06677) ₂ -Cys对树脂的偶联：通过添加DTT将在偶联缓冲液中包含3.4mg/ml浓度的(Z06677)₂-Cys的样品还原到20mM的浓度，随后在室温下搅拌孵育1小时。使用装有500ml Sephadex G-25、用偶联缓冲液预平衡的XK-50柱通过体积排阻色谱去除DTT。将还原的(Z06677)₂-Cys与SulfoLink偶联树脂(Thermo Scientific，目录号20404)以每毫升树脂6毫克(Z06677)₂-Cys的比例混合。根据制造商的说明书进行后续的偶联反应，但将蛋白-树脂混合物的孵育延长到15到35分钟。通过SDS-PAGE分析未偶联的蛋白来估计偶联效率。

结果

培养和纯化：通过测量在280nm的吸光度在分光光度计中并通过SDS-PAGE分析纯化的二聚ABD结合Z变体(Z06677)₂-Cys。(Z06677)₂-Cys缺少色氨酸，导致在280nm的低吸光度读数。因此，从SDS-PAGE分析估计Z变体分子的浓度，所述SDS-PAGE分析包括若干不同量的(Z06677)₂-Cys。SDS-PAGE凝胶的目测估计(Z06677)₂-Cys浓度为3.4mg/ml，纯度为约95％。

ABD结合多肽(Z06677) ₂ -Cys对树脂的偶联：通过目测运行偶联反应的未偶联蛋白级分的SDS-PAGE凝胶来估计配体密度为5.8mg(Z06677)₂-Cys/ml SulfoLink偶联树脂。

产生的(Z06677)₂-Cys偶联树脂进一步被称为“抗ABD琼脂糖”，且在以下实施例中，使用其来证明树脂在结合到与具有不同大小和功能的不同蛋白融合的不同白蛋白结合结构域部分方面的宽应用性。已显示实现成功的纯化，而无论ABD部分在靶蛋白中所处的位置。换句话说，可将ABD部分放置于N端、C端或甚至融合蛋白之内，使得其任一侧的侧面为其他蛋白部分。

实施例7

使用抗ABD琼脂糖纯化PEP10986

在此实施例中，使用装有抗ABD琼脂糖的柱纯化包含在其N端融合到蛋白Z的细胞因子结合变体的白蛋白结合结构域(PP013,SEQ ID NO:160)的PEP10986(12.5kDa)。

材料和方法

将携带可溶PEP10986的大肠杆菌细胞小团悬浮于补充有20U/ml的TST缓冲液(Tris、盐水、吐温:25mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05％吐温20,pH 8.0)。通过超声处理破裂细胞且通过离心去除细胞碎片。使用100系统进行色谱。将澄清的样品应用到装有100ml抗ABD琼脂糖(如实施例6中所描述制备的)并用TST预平衡的XK-50柱。用8CV的TST随后用8CV的5mM NH₄Ac pH 5.5洗涤柱。通过应用3CV的0.1M HAc,pH 2.9洗脱结合的蛋白。收集流通级分、洗涤级分和洗脱级分用于进一步通过SDS-PAGE和HPLC-MS分析。

为了调查抗ABD琼脂糖树脂的稳健性和碱稳定性，随后使用如上相同柱进行几次纯化，各自随后是2-3柱体积的0.5M NaOH的CIP(就地清洗)循环。

结果

图8A中示出在抗ABD琼脂糖树脂上纯化PEP10986的色谱图，且在图8B中显示选择的级分的SDS-PAGE分析。合并分别相应于图8B中泳道2、3和4的洗脱的级分E1、E2和E3。通过HPLC-MS分析核实PEP10986的正确质量且将纯度估计为比95％更高，如从SDS-PAGE分析判断的。根据分光光度计分析，池包含908mg的纯化的PEP10986，相应于约90％的收率。

通过使用如在此实施例中使用的相同柱，PEP10986和其他ABD融合分子两者的另外纯化，各自随后是2-3柱体积的0.5M NaOH的CIP(就地清洗)循环，确认抗ABD琼脂糖树脂的稳健性和碱稳定性。在23个CIP循环之后，还没有观察到在容量上显著地降低。

实施例8

使用抗ABD琼脂糖的PEP03973的纯化

在此实施例中，使用装有抗ABD琼脂糖的柱纯化包含在其N端融合到蛋白Z的HER2(人表皮生长因子受体2)结合变体的野生型白蛋白结合结构域(ABD001，SEQ ID NO:157)的PEP03973(12.4kDa)。

材料和方法

将携带可溶PEP03973的大肠杆菌细胞小团悬浮于补充有20U/ml的TST缓冲液。通过超声处理破裂细胞且通过离心去除细胞碎片。使用100系统进行色谱。将澄清的样品应用到装有100ml抗ABD琼脂糖(如实施例6中所描述制备的)并用TST预平衡的XK-50柱。用5CV的TST随后用3CV的5mM NH₄Ac pH 5.5洗涤柱。通过应用3CV的0.1M HAc,pH 2.9洗脱结合的蛋白。收集流通级分、洗涤级分和洗脱级分用于进一步通过SDS-PAGE和HPLC-MS分析。

结果

图9A中示出在抗ABD琼脂糖树脂上纯化PEP03973的色谱图，且在图9B中显示选择的级分的SDS-PAGE分析。合并分别相应于图9B中泳道5、6和7的洗脱的级分E2、E3和E4。通过HPLC-MS分析核实PEP03973的正确质量且将纯度估计为比95％更高，如从SDS-PAGE分析判断的。根据分光光度计分析，池包含1036mg的纯化的PEP10986，相应于约97％的收率。

实施例9

使用抗ABD琼脂糖的PEP06548的纯化

在此实施例中，使用装有抗ABD琼脂糖的柱纯化包含在其N端融合到与TNF-α(肿瘤坏死因子α)结合的蛋白Z的变体的两个部分(即二聚体)的白蛋白结合结构域(ABD035,SEQ ID NO:159，带有C端延伸VDC)的PEP06548(20.3kDa)。PEP06548还包含N端六聚组氨酸标签和C端半胱氨酸残基。

材料和方法

将携带可溶PEP06548的大肠杆菌细胞小团悬浮于补充27U/ml的TST缓冲液。通过超声处理破裂细胞且通过离心去除细胞碎片。通过添加DTT至20mM的终浓度来还原PEP06548样品分子的C端半胱氨酸，随后在室温下孵育持续30分钟。使用100系统进行色谱。将澄清的和还原的样品应用到装有9ml抗ABD琼脂糖并用TST预平衡的XK-16柱。此批抗ABD琼脂糖基本如在实施例6中所描述来制备，除了每毫升树脂大约2.3毫克(Z06677)₂-Cys的更低配体密度。用5.5CV的TST随后用3.3CV的5mM NH₄Ac pH 5.5洗涤柱。通过应用2.9CV的0.1M HAc,pH 2.9洗脱结合的蛋白。收集级分用于进一步通过SDS-PAGE和HPLC-MS分析。

结果

图10A中示出在抗ABD琼脂糖树脂上纯化PEP06548的色谱图，且在图10B中显示洗脱级分E1的SDS-PAGE分析。将纯度估计为比95％更高，如从SDS-PAGE分析判断的。40kDa左右的条带最可能源自通过样品分子的C端半胱氨酸之间的反应形成的二聚体。在HPLC-MS分析中也鉴定了PEP06548、以及二聚变体的较小部分的正确质量。

根据吸光度测量值，获得每毫升树脂3.7mg纯化的PEP06548，或每(Z06677)₂-Cys配体大约一个PEP06548分子。

实施例10

使用抗ABD琼脂糖的PEP17081的纯化

在此实施例中，使用装有抗ABD琼脂糖的柱纯化包含融合到以Z-PEP07986-Z形式的蛋白Z的细胞因子结合变体的两个部分的白蛋白结合结构域(PEP07986,SEQ ID NO:161)的PEP17081(18.6kDa)。还描述了随后的纯化。

材料和方法

将携带可溶PEP17081的大肠杆菌细胞小团悬浮于TST缓冲液。通过在水浴(83℃，10分钟)中热处理，随后在冰上冷却破裂细胞。添加至15U/ml的终浓度以减少由核酸引起的粘性。通过离心去除细胞碎片并过滤(0.45μm过滤器)。

通过使用100系统的抗ABD琼脂糖亲和色谱进行第一纯化步骤。将澄清的样品应用到装有25ml抗ABD琼脂糖并用2x TST(即具有双倍浓度的所有组分的TST缓冲液)预平衡的XK-26柱。用5CV的2x TST随后用8CV的5mM NH₄Ac pH 5.5洗涤柱。通过应用3CV的0.1M HAc,pH 2.9洗脱结合的蛋白。收集级分用于进一步通过SDS-PAGE和HPLC-MS分析。

使用100系统通过RPC进行第二纯化步骤。用乙腈将从抗ABD琼脂糖柱洗脱的蛋白补充到10％的终浓度并上样到装有24mlSOURCE 15RPC(GE Healthcare)并用在Milli-Q水中的10％乙腈、0.1％三氟乙酸(TFA)(溶剂A)预平衡的HR-16柱(GE Healthcare)。用3.9CV溶剂A洗涤柱。用15CV线性梯度的Milli-Q水中的递增浓度的80％乙腈、0.1％TFA(溶剂B)洗脱结合的材料，以50％溶剂B结束。收集级分用于进一步通过SDS-PAGE和HPLC-MS分析。

使用100系统通过体积排阻色谱法(SEC)进行第三纯化和缓冲液交换步骤。合并从RPC柱洗脱的选择级分且在装有500mlSephadex G-25(GE Healthcare)的XK-50柱上将缓冲液交换为1x PBS。收集级分用于进一步通过SDS-PAGE和HPLC-MS分析。

结果

图11A中示出在抗ABD琼脂糖树脂上纯化PEP17081的色谱图，且在图11B中显示SDS-PAGE分析。

大肠杆菌细胞的热处理当做细胞破裂步骤和纯化步骤两者。PEP17081对热有抗性，而许多其他大肠杆菌蛋白没有抗性且因此通过加热沉淀。作为结果，上样到抗ABD琼脂糖柱的材料为相对地纯(泳道1，图11B)。

绝大多数的PEP17081结合到抗ABD琼脂糖树脂，其通过在流通样品中明显缺少PEP17081(泳道2，图11B)而被证明。根据分光光度计分析，洗脱池包含330mg PEP17081，相应于每毫升树脂13mg PEP17081的结合容量和超过95％的收率。将洗脱的PEP17081纯度估计为比95％更高，如从SDS-PAGE分析判断的(泳道3，图11B)。RPC和通过SEC缓冲液交换之后获得纯度的进一步增加(泳道4，图11B)。通过HPLC-MS分析核实PEP17081的正确质量。

实施例11

使用抗ABD琼脂糖纯化蛋白激素

在此实施例中，使用装有抗ABD琼脂糖的柱在系统上纯化包含在其C端融合到蛋白激素的白蛋白结合结构域(ABD035,SEQ IDNO:159)的蛋白1(22.6kDa；pI 10)。

材料和方法

在大肠杆菌中以包涵体的形式表达蛋白1。在包涵体溶解并重新折叠之后，在体积排阻色谱法(SEC)上运行材料3次用于缓冲液交换和纯化。将在TST中以1：10稀释的8mg的SEC纯化蛋白1以0.5ml/min上样到装有10-12ml抗ABD琼脂糖并用TST预平衡的XK 16/20柱(GEHealthcare)。用4CV的TST洗涤柱，随后以1ml/min的流速用另外3CV的5mM NH₄Ac,pH 5.5洗涤。用3CV的0.1M HAc,pH 2.9洗脱结合的蛋白，且然后用1M Tris-HCl,pH 9中和到pH 7。收集流通级分、洗涤级分和洗脱级分用于进一步通过SDS-PAGE分析。非还原地运行4-12％Bis-TrisNuPAGE凝胶(Invitrogen)且用Simply Blue(Life Technologies)将蛋白染色。在用3CV的0.5M NaOH随后3CV的TST洗脱和就地清洗(CIP)之后，用TST再平衡柱。在各纯化之间，将树脂储存在TST+20％乙醇中。

结果

图12A中示出在抗ABD琼脂糖树脂上纯化蛋白1的色谱图，且在图12B中显示选择级分的SDS-PAGE分析。上样到抗ABD琼脂糖柱的SEC纯化蛋白1的纯度是高的。然而，在SDS-PAGE上可见污染蛋白的微弱条带，参见图12B中的箭头。通过在抗ABD琼脂糖柱上的纯化有效地消除这些污染物。在SDS-PAGE上分析来自洗涤步骤浓缩60倍的样品并显露污染物(以及蛋白1的渗漏；泳道6，图12B)。在洗脱蛋白样品中没有发现污染物(泳道7-9，图12B)。将洗脱样品的纯度估计为比98％更高，如从SDS-PAGE分析判断的。通过HPLC-MS分析核实洗脱蛋白1的正确质量。

在最初8mg的SEC纯化蛋白1中，从抗ABD琼脂糖柱的洗脱级分中收集5.4mg，产生约68％的收率。尽管在泳道5上样的流通样品中没有检测到蛋白(图12B)，经过TST的洗涤以及去除二聚体和污染蛋白，存在一些蛋白1的渗漏。

实施例12

使用抗ABD琼脂糖纯化肽激素

在此实施例中，在Pichia Pink中表达包含在其N端融合到肽激素的白蛋白结合结构域(ABD035,SEQ ID NO:159)的蛋白2(9.5kDa；pI 6.6)并使用装有抗ABD琼脂糖的柱在系统上以单个步骤纯化。

材料和方法

将100ml包含分泌的蛋白2的Pichia Pink上清液冻干并重悬于2mlDMSO(二甲基亚砜)且随后用200ml的TST稀释。将样品以1ml/min上样到装有10-12ml抗ABD琼脂糖并用TST预平衡的XK 16/20柱。用8CV的TST洗涤柱，随后用另外3CV的5mM NH₄Ac,pH 5.5洗涤。由于来自培养基的污染蛋白的高密度，增加4TST的通常洗涤。用3CV的0.1M HAc,pH 2.9洗脱结合的蛋白，且然后用1M Tris-HCl,pH 9调整到pH 4。洗脱后用TST重新平衡柱，随后CIP并储存在TST+20％乙醇中。收集流通级分、洗涤级分和洗脱级分用于通过SDS-PAGE进一步分析。

结果

图13A中示出在抗ABD琼脂糖树脂上纯化蛋白2的色谱图，且在图13B中显示选择级分的SDS-PAGE分析。来自抗ABD琼脂糖柱的洗脱峰包含3-5mg的蛋白2，相应于大约75％的收率(从蛋白质印迹估计)。通过HPLC-MS分析证实洗脱的蛋白2的正确质量。将纯度评价为比98％更高，如从SDS-PAGE分析、随后Simply Blue染色判断的。在洗脱级分中不可检测到污染培养基蛋白(泳道7-13，图13B)。认识到，在SDS-PAGE凝胶上的蛋白2运行较小，如在凝胶上包括的分子量标准所示的。

实施方案的分项列表

1.ABD结合多肽，包含ABD结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：

i)EX₂X₃X₄AX₆X₇EIX₁₀X₁₁LPNLX₁₆X₁₇X₁₈QX₂₀X₂₁AFIX₂₅X₂₆LX₂₈D

其中，彼此独立地，

X₂选自F、I和L；

X₃选自H、K、N、Q、R、S、T和V；

X₄选自A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；

X₆选自F、I、L和Y；

X₇选自A、H、I、K、L、N、Q、R、S、T和V；

X₁₀选自G、H、K、N、Q、R和S；

X₁₁选自A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；

X₁₆选自N和T；

X₁₇选自F、H、L、S和T；

X₁₈选自D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T和V；

X₂₀选自H、K和R；

X₂₁选自I、L和V；

X₂₅选自F、I、L、V和Y；

X₂₆选自K和S；

X₂₈选自D和E；

和

ii)与在i)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。

2.根据项目1的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂选自F和L。

3.根据项目2的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂为F。

4.根据项目2的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂为L。

5.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₃选自H、K、R、T和V。

6.根据项目5的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₃选自H、K、R和V。

7.根据项目6的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₃选自K和R。

8.根据项目7的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₃为K。

9.根据项目7的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₃为R。

10.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₄选自A、H、I、L、N、V和W。

11.根据项目10的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₄选自H、L、N和V。

12.根据项目11的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₄为V。

13.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₆选自F和L。

14.根据项目13的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₆为F。

15.根据项目13的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₆为L。

16.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₇选自K、L、N、Q、R和S。

17.根据项目16的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₆选自K、N、Q、R和S。

18.根据项目17的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₇选自K、Q、R和S。

19.根据项目18的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₇选自K和R。

20.根据项目19的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₇为K。

21.根据项目19的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₇为R。

22.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₀选自H、K、N和R。

23.根据项目22的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₀选自H、K和N。

24.根据项目22的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₀选自K、N和R。

25.根据项目23或项目24的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₀为N。

26.根据项目24的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₀选自K和R。

27.根据项目26的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₀为K。

28.根据项目26的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₀为R。

29.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₁选自A、F、L、R、T和Y。

30.根据项目29的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₁选自A、F、T和Y。

31.根据项目30的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₁为T。

32.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₆为T。

33.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₇选自F、H和L。

34.根据项目33的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₇选自F和H。

35.根据项目33的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₇选自H和L。

36.根据项目34的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₇为F。

37.根据项目34或35的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₇为H。

38.根据项目35的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₇为L。

39.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₈选自D、H、I、K和Q。

40.根据项目39的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₈选自D、H和Q。

41.根据项目40的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₈选自H和Q。

42.根据项目41的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₈为H。

43.根据项目41的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₁₈为Q。

44.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₀选自H和R。

45.根据项目1-43中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₀选自K和R。

46.根据项目44或45的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₀为R。

47.根据项目45的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₀为K。

48.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₁选自I和L。

49.根据项目48的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₁为I。

50.根据项目48的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₁为L。

51.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₅选自I、L和V。

52.根据项目51的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₅选自V和I。

53.根据项目52的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₅为I。

54.根据项目52的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₅为V。

55.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₆为K。

56.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中在序列i)中的X₂₈为D。

57.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中序列i)满足8种条件I-VIII中的至少4种：

I.X₂为F或L；

II.X₆为F或L；

III.X₁₆为T；

IV.X₂₀为H或R；

V.X₂₁为I或L；

VI.X₂₅为I或V；

VII.X₂₆为K；和

VIII.X₂₈为D。

58.根据项目57的ABD结合多肽，其中序列i)满足8种条件I-VIII中的至少5种。

59.根据项目58的ABD结合多肽，其中序列i)满足8种条件I-VIII中的至少6种。

60.根据项目59的ABD结合多肽，其中序列i)满足8种条件I-VIII中的至少7种。

61.根据项目60的ABD结合多肽，其中序列i)满足全部8种条件I-VIII。

62.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中序列i)选自SEQ IDNO:1-52。

63.根据项目62的ABD结合多肽，其中序列i)选自SEQ ID NO:1-7。

64.根据项目63的ABD结合多肽，其中序列i)选自SEQ ID NO:1-4。

65.根据项目64的ABD结合多肽，其中序列i)为SEQ ID NO:1。

66.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其中所述ABD结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的部分。

67.根据项目66的ABD结合多肽，其中所述ABD结合基序基本上形成在所述三螺旋束蛋白结构域之内具有相互连接环的双螺旋的部分。

68.根据项目66-67中任一项的ABD结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体结构域。

69.根据项目68的ABD结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域或其衍生物。

70.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

iii)K-[BM]-DPSQS X_aX_bLLX_c EAKKL NDX_dQ；

其中

[BM]为如项目1-65任一项中定义的ABD结合基序；

X_a选自A和S；

X_b选自N和E；

X_c选自A、S和C；

X_d选自A和S；

和

iv)与由iii)定义的序列具有至少81％同一性的氨基酸序列。

71.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_a是A。

72.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_a是S。

73.根据项目70-72中任一项的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_b是N。

74.根据项目70-72中任一项的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_b是E。

75.根据项目70-74中任一项的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_c是A。

76.根据项目70-74中任一项的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_c是S。

77.根据项目70-74中任一项的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_c是C。

78.根据项目70-77中任一项的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_d是A。

79.根据项目70-77中任一项的ABD结合多肽，其中在序列iii)中的X_d是S。

80.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中，X_a是A；X_b是N；X_c是A且X_d是A。

81.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中，X_a是A；X_b是N；X_c是C且X_d是A。

82.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是S且X_d是S。

83.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是C且X_d是S。

84.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是C且X_d是A。

85.根据项目70的ABD结合多肽，其中在序列iii)中，X_a是S；X_b是E；X_c是A且X_d是A。

86.根据项目85的ABD结合多肽，其中序列iii)选自SEQ IDNO:53-104中任一个。

87.根据项目86的ABD结合多肽，其中序列iii)选自SEQ ID NO:53-59中的任一个。

88.根据项目87的ABD结合多肽，其中序列iii)选自SEQ ID NO:53-56中的任一个。

89.根据项目88的ABD结合多肽，其中序列iii)为SEQ ID NO:53。

90.根据项目1-70中任一项定义的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

v)YAK-[BM]-DPSQS SELLX_c EAKKL NDSQA P；

其中[BM]为如以上项目1-65中任一项的ABD结合基序且X_c选自S和C；和

vi)与由v)定义的序列具有至少83％同一性的氨基酸序列。

91.根据项目1-70中任一项的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

vii)YAK-[BM]-DPSQS SELLX_c EAKKL NDAQA P；

其中[BM]为如项目1-65中任一项定义的ABD结合基序且X_c选自A和C；和

viii)与由vii)定义的序列具有至少83％同一性的氨基酸序列。

92.根据项目1-70中任一项的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

ix)FNK-[BM]-DPSQS ANLLX_c EAKKL NDAQA P；

其中[BM]为如项目1-65任一项中定义的ABD结合基序且X_c选自A和C；和

x)与ix)中定义的序列具有至少83％同一性的氨基酸序列。

93.根据项目69的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；

ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；

ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；

ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；

AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；

VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；

AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；和

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；

其中[BM]为如项目1-65中任一项定义的ABD结合基序。

94.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；

其中[BM]是如项目1-65任一项中定义的ABD结合基序；和

xii)与在xi)中定义的序列具有至少84％同一性的氨基酸序列。

95.根据项目94的ABD结合多肽，其中序列xi)选自SEQ IDNO:105-156。

96.根据项目95的ABD结合多肽，其中序列xi)选自SEQ IDNO:105-111。

97.根据项目96的ABD结合多肽，其中序列xi)选自SEQ IDNO:105-108。

98.根据项目97的ABD结合多肽，其中序列xi)为SEQ ID NO:105。

99.根据前述项目中任一项以多聚体形式的ABD结合多肽，包含至少2个ABD结合多肽单体单元，其氨基酸序列可以是相同或不同的。

100.根据项目99的ABD结合多肽，其中所述ABD结合多肽单体单元共价地偶联在一起。

101.根据项目99的ABD结合多肽，其中所述ABD结合多肽单体单元表达为融合蛋白。

102.根据前述项目中任一项的ABD结合多肽，其进一步包含在多肽的C末端、例如在C端的半胱氨酸残基。

103.编码根据前述项目中任一项的多肽的多核苷酸。

104.根据项目1-102中任一项的ABD结合多肽与可检测剂的组合。

105.根据项目104的组合，其中可检测剂为荧光剂或放射剂。

Claims

1.ABD结合多肽，所述ABD结合多肽包含ABD结合基序BM，所述基序由选自以下的氨基酸序列组成：

其中，彼此独立地，

X₂选自F、I和L；

X₃选自H、K、N、Q、R、S、T和V；

X₄选自A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；

X₆选自F、I、L和Y；

X₇选自A、H、I、K、L、N、Q、R、S、T和V；

X₁₀选自G、H、K、N、Q、R和S；

X₁₁选自A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；

X₁₆选自N和T；

X₁₇选自F、H、L、S和T；

X₁₈选自D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T和V；

X₂₀选自H、K和R；

X₂₁选自I、L和V；

X₂₅选自F、I、L、V和Y；

X₂₆选自K和S；

X₂₈选自D和E；

和

ii)与在i)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的ABD结合多肽，其中序列i)满足8种条件I-VIII中的至少4种：

I.X₂为F或L；

II.X₆为F或L；

III.X₁₆为T；

IV.X₂₀为H或R；

V.X₂₁为I或L；

VI.X₂₅为I或V；

VII.X₂₆为K；和

VIII.X₂₈为D。

3.根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其中序列i)选自SEQ ID NO:1-52。

4.根据权利要求3所述的ABD结合多肽，其中序列i)选自SEQ IDNO:1-7。

5.根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其中所述ABD结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的部分。

6.根据权利要求5所述的ABD结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的结构域或其衍生物。

7.根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

iii)K-[BM]-DPSQS X_aX_bLLX_c EAKKL NDX_dQ；

其中

[BM]为如在权利要求1-4中任一项定义的ABD结合基序；

X_a选自A和S；

X_b选自N和E；

X_c选自A、S和C；

X_d选自A和S；

和

iv)与由iii)定义的序列具有至少81％同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述的ABD结合多肽，其中序列iii)选自SEQ IDNO:53-104中任一个。

9.根据权利要求8所述的ABD结合多肽，其中序列iii)选自SEQ IDNO:53-59中任一个。

10.根据权利要求6所述的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；

ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；

ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；

ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；

AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；

VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；

AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；和

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；

其中[BM]为如权利要求1-4中任一项定义的ABD结合基序。

11.根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：

xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；

其中[BM]是如权利要求1-4中任一项定义的ABD结合基序；和

xii)与在xi)中定义的序列具有至少84％同一性的氨基酸序列。

12.根据权利要求11所述的ABD结合多肽，其中序列xi)选自SEQ IDNO:105-156。

13.根据权利要求12所述的ABD结合多肽，其中序列xi)选自SEQ IDNO:105-111。

14.多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项的多肽。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的ABD结合多肽与可检测剂的组合。