KR20150074662A

KR20150074662A - 돈육의 육질 예측용 돼지 fsd2 유전자 조성물 및 이를 이용한 돈육의 육질 예측방법

Info

Publication number: KR20150074662A
Application number: KR1020130162661A
Authority: KR
Inventors: 김태헌; 이경태; 장길원; 조용민; 이시우
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2015-07-02
Also published as: KR101595019B1

Abstract

본 발명은 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트와 이를 이용하여 돈육의 육질을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물 및 이를 이용한 돈육의 육질 예측방법을 이용하여 돈육의 육질형질에 대한 분자생물학적 수준에서의 해석이 가능하며, 돈육의 육질을 예측할 수 있는 분자표지인자로서 육질이 개량된 종돈의 선발이 가능하다.

Description

돈육의 육질 예측용 돼지 FSD2 유전자 조성물 및 이를 이용한 돈육의 육질 예측방법{Genetic composition of porcine FSD2 for predicting meat quality of pork and predicting method of meat quality using thereof}

본 발명은 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트와 이를 이용하여 돈육의 육질을 예측하는 방법에 관한 것이다.

최근의 분자 유전학 기법의 발달은 DNA 수준에서의 유전병이나 가축의 육질 등 특정 형질과 연관되어 있는 유전자 마커(genetic marker)의 개발이 가능한 방향으로 발달되어 왔다. DNA의 다형성은 중요한 경제형질을 결정하는 주요유전자와 양적형질좌위(QTL; quantitative trait loci)에 의한 마커 개발을 가능하게 하며, 연관 분석(linkage analysis), 유전자 지도(genetic map), 친자 감별(parentage testing), 품종간의 구별(distinction of breeds), 가계도 분석(pedigree analysis), 유전적 다양성(divergence) 및 관련성 (relationship) 등을 분석할 수 있는 강력한 도구로서 이용되어 왔다. 특히 가축의 유전 및 육종학 분야에서는 DNA 의 다형성에 기초한 유전자 마커를 통한 도움 선발(MAS, marker assisted selection)에 활용되고 있다.

가축에 있어서 대부분의 경제형질들은 다양한 유전자의 영향을 통해 나타나는 양적형질로 알려져 있으며 이러한 형질에 관여하는 원인 유전자 발굴 및 유전적 위치를 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 형질관련 유전자 마커 발굴을 위하여 기능 유전자를 대상으로 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymor phism) 발굴 및 형질 관련성 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재까지 다양한 형질관련 SNP들이 발굴되었다.

게놈 지도의 완성에 따라 SNP의 존재도 밝혀진 경우가 많으나, 아직 발견되지 않은 SNP 역시 존재하며, 발견된 SNP일지라도 표현형에 미치는 영향에 대해서 연구되지 않은 경우가 아직 많이 존재하고 있다. SNP가 표현형에 영향을 미쳐 돈육의 육질 또는 육량 관련 형질이 달라지는 경우에는 돈육의 육질 또는 육량 관련 형질에 대한 효과가 있는 마커로서 사용될 수 있다.

한국공개특허공보 제2011-0139009호

본 발명의 목적은 세포간 조직 치밀성 및 돈육의 수분 함량과 관련될 것으로 예상되는 돼지의 FSD2 (fibronectin type Ⅲ and SPRY domain containing 2) 유전자의 구조를 규명하고, 이로부터 돈육의 도체중, 육색 및 수분함량과 연관된 신규한 단일염기다형을 발굴하여 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 조성물, 마이크로어레이 또는 키트를 이용하여 돈육의 육질을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해,

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위를 단일염기다형으로 포함하는 각각 10 ~ 200 개의 뉴클레오타이드의 연속적인 폴리뉴클레오타이드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물이 제공될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 돈육의 육질은 도체중, 육색, 수분 함량 및 지방 함량으로부터 선택되는 적어도 하나에 의해 예측될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 마이크로어레이가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 키트가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 도체중을 가지며, AA 및 GG인 경우, GA인 경우보다 높은 명도를 가지며, AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 황색도를 가지며, GA 및 GG인 경우, AA인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 GG인 경우, CC 및 GC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC 및 GG인 경우, GC인 경우보다 높은 명도를 가지며, CC인 경우, GC 및 GG인 경우보다 높은 황색도를 가지며, GC 및 GG인 경우, CC보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 도체중을 가지며, GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 황색도 및 지방 함량을 가지며, GA인 경우, AA 및 GG인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 4로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 도체중을 가지며, GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 황색도 및 지방 함량를 가지며, GA인 경우, AA 및 GG인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 5로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 도체중을 가지며, AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 명도 및 황색도를 가지며, GA 및 GG인 경우, AA인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 6으로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 명도 및 황색도를 가지며, TC 및 TT인 경우, CC인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 7로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 황색도를 가지며, TC 및 TT인 경우, CC인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 8로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 도체중을 가지며, TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 황색도를 가지며, CC 및 TC인 경우, TT인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며; 서열번호 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 황색도를 가지며, TC 및 TT인 경우, CC인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하는 돈육의 육질 예측 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위에 대한 단일염기다형의 단상형이 GGAAGTTCT 단상형인 경우, 다른 단상형인 경우보다 높은 도체중 및 수분 함량을 가지며, GGAAGTTCT 단상형이 아닌 경우, 높은 황색도를 가지는 것으로 판정하는 돈육의 육질 예측 방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물 및 이를 이용한 돈육의 육질 예측방법을 이용하여 돈육의 육질형질에 대한 분자생물학적 수준에서의 해석이 가능하며, 돈육의 육질을 예측할 수 있는 분자표지인자로서 육질이 개량된 종돈의 선발이 가능하다.

도 1은 돼지 FSD2 유전자의 구조 및 SNP의 위치를 나타낸 것이다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "단일염기다형(SNP; single nucleotide polymorphism)"은 동일한 종의 개체 사이의 DNA에 존재하는 한 염기쌍의 차이(single base-pair variation)로서 유전자 다형성 중 가장 많이 존재하는 형태이다. 프로모터와 같은 전사조절부위 염기서열에 존재하는 SNP는 발현되는 유전자의 양을 조절할 수 있으며, RNA 스플라이싱에 영향을 주는 엑손-인트론 경계에 있는 염기서열들이나, 3'-비번역부위에 존재하는 SNP는 RNA 안정성이나 번역 능력에 영향을 주는 경우가 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "FSD2 (fibronectin type Ⅲ and SPRY domain containing 2)" 유전자는 다양한 동물의 세포외 단백질에서 발견되는 Fibronectin type Ⅲ 도메인과 PSE (pale soft exudative) 돈육 발생과 연관된 ryanodine 수용체와 연결되는 SPRY 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자이다.

서열번호 1 내지 10은 돼지의 FSD2 (fibronectin type Ⅲ and SPRY domain containing 2) 유전자의 일 부분을 나타낸 것이며, 본 발명에 따르면 서열번호 1 내지 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위를 단일염기다형으로 포함하는 각각 10 ~ 200 개의 뉴클레오타이드의 연속적인 폴리뉴클레오타이드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오타이드의 조합에 따른 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물이 제공될 수 있다.

여기서, 상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위는 5'-비해독영역(untranslational region, UTR)에 내에 존재하며, 상기 서열번호 3 내지 10으로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위는 코딩 서열(CDS) 영역으로서 FSD2 유전자의 2번째 엑손 내에 존재한다.

여기서, 상기 돈육의 육질은 도체중(carcass weight; CWT), 사후 24시간 pH (pH24), 보수력(water holding capacity; WHC), 육즙손실(Driploss), 가열감량(Heatloss), CIE_명도(MC_L), CIE_적색도(MC_a), CIE_황색도(MC_b), 등지방두께(backfat thickness; BF), 전단력(shearinf force; SF), 수분(Moisture) 함량, 지방(Fat) 함량, 단백질(Protein) 함량 및 콜라겐(Collagen) 함량 등으로부터 선택되는 적어도 하나에 의해 예측될 수 있다.

다른 실시예에 있어서, 상기 돈육의 육질은 바람직하게는 도체중, 육색(CIE_명도(MC_L), CIE_적색도(MC_a), CIE_황색도(MC_b)), 수분 함량 및 지방 함량으로부터 선택되는 적어도 하나, 보다 바람직하게는 도체중, 육색, 수분 함량 및 지방 함량에 의해 예측될 수 있다.

상기 돈육의 육질의 예측 또는 판정하기 위한 항목은 농림축산식품부고시 제2013-109호에 따른 축산물등급판정 세부기준을 근거로 하며, 상기 항목에 대한 측정 방법 및 측정 결과로부터 상기 돈육의 육질을 예측 또는 판정하는 방법은 상기 고시 및 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려져 있다.

여기서, 상기 단일염기다형(single nucleotide polymorphism; SNP)을 확인하는 방법에는 특별한 제한은 없으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 사용되고 있는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 대립 유전자 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립 유전자 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오타이드 결합 어세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism)으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 핵산분자는 돼지의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다.

여기서, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는, 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다.

상기 단일염기다형의 서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 단일염기다형을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 단일염기다형을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 동물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 단일염기다형을 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 단일염기다형 변이체 여부를 결정한다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 단일염기다형을 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 단일염기다형 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 단일염기다형 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 유전자 조성물의 확인은 대립형-특이 유전자 증폭 방법에 의해 실시될 수 있다. 단일염기다형이 유전자 증폭 방법에 적용되는 경우, 특히 SNAP (single nucleotide amplified polymophism)라 통칭된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭(참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응(Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다.

여기서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 크기를 10 ~ 200 bp로 한정한 것은 현재의 혼성화 기술로 재현이 가능한 수준에서 기술적인 구체성을 나타내도록 바람직하게 한정한 것에 불과하며, 상기 단일염기다형을 식별할 수 있는 정도라면 사용하는 기술에 따라 상기 범위를 벗어나는 크기로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 돈육 육질 예측용 유전자 조성물은 본 발명에서 개시된 단일염기다형 이외의 돈육 육질과 통계적으로 유의성이 입증된 다른 단일염기다형 종류를 포함할 수 있으며, 돈육 육질 예측의 통계적 유의성, 신뢰도 및 정확성 등의 향상을 위해 다양한 조합으로 사용될 수 있다.

여기서, 상기 마이크로어레이는 상기 단일염기다형의 염기서열을 인지하기 위한 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라, 상기 유전자 조성물의 식별을 보다 용이하게 할 수 있는 범위 내라면, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 cDNA를 포함할 수도 있다.

본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 상기 단일염기다형을 검출하기 위한 물질이 핵산에 국한되는 것은 아니다. 핵산의 특정서열을 인식하는 폴리펩티드, 단백질, 기타 핵산 또는 단백질의 변형체 등 다양한 생물학적 기법이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 키트가 제공될 수 있다. 상기 키트는 상기 단일염기다형을 선택적으로 검출할 수 있는 성분의 유전자 조성물 뿐만 아니라, 이러한 검출을 보다 용이하고 신속하게 진행시킬 수 있는 용기 또는 부대장치를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "단상형(haplotype)"은 동일한 염색체 상에 통계적으로 연관된 단일염기다형의 집합을 의미하며, 동일한 염색체 상에서 함께 유전되는 경향이 있는 인접한 단일염기다형의 집합이다. 예를 들어, 총 9개의 SNP 좌위에 대한 단일염기다형의 단상형의 가능한 경우의 수는 총 512개이나, 실제 관찰되는 단상형의 수는 이보다 더 적을 수 있으며, 관찰되는 단상형 중에서도 목적으로 하는 표현형과 통계적인 유의성을 가지는 단상형의 수는 제한적일 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1. 돈육 육질 예측을 위한 FSD2 유전자 유래 단일염기다형의 개발

(1) 공시재료

본 발명의 실시예에서 사용되는 모든 공시돈은 부계 계통인 버크셔 품종 순종 돼지를 전북 남원에 소재하고 있는 다산종돈에서 생산된 돼지 총 704두이다. 돼지는 동일한 사양 조건 하에서 사육되었고, 평균 체중이 약 110 kg에 도달했을 때 도축하여 FSD2 유전자의 변이 빈도 분석 및 이와 연관된 형질 분석을 실시하였다.

도축 후 10번째 및 11번째 척추뼈 사이에서 측정되는 등지방두께(backfat thickness; BF)를 제외한 그 외 육질형질은 등심조직을 이용하여 측정되었다. 도체중(carcass weight; CWT)은 도축 후 머리, 내장, 다리 및 가죽 등 부분을 제외한 나머지 무게를 측정하였으며, 산도는 도축 24시간 (pH24) 경과 후 도체 pH meter (pH^*K21, NWK-Binar GmbH Co., Germany)로 측정하였다. 보수력(water holding capacity; WHC)은 등심의 절단면을 위로 하여 5 분 동안 방치한 다음, 절단면 위로 참출된 육즙을 직경 5 cm 여과지(Whatman No.5)로 흡착하여 여과지에 흡착된 육즙의 무게를 측정하였으며, 육즙손실(Driploss)은 등심을 지퍼팩에 넣어 외부공기를 차단시킨 후 4 ℃에서 24 시간 후 처음 등심의 무게와 나중 무게를 육즙 감량을 측정하였다. 가열감량(Heat loss)은 등심의 심부온도를 75 ℃에서 10 분 간 가열한 다음 냉각시켜 감량된 무게를 측정하였다. 육색은 등심을 절개하여 30 분 노출시킨 후 색채 휘도계(Minolta Co. CR 300, Japan)로 CIE (Commision Internationale de Leclairage) 명도(L), 적색도(a), 황색도(b) 값을 측정하였다. 이때의 표준판은 Y=92.40, x=0.3136, y=0.3196의 백색 타일을 사용하였다. 전단력(shearing force; SF)은 섭취 시 느껴지는 연도를 객관적으로 분석하기 위해 Warner-Bratzler shear force meter(G-R Elec. Mfg. Co., USA)을 사용하여 측정하였다. 이 외 수분 함량, 지방 함량, 단백질 함량 및 콜라겐 함량은 미국 분석화학방법 연합회에서 제공하는 방법에 따라 각각 측정되었다.

하기의 표 1에는 공시재료로 사용된 버크셔 품종의 돼지 총 666두에 대한 각 형질의 평균, 표준편차, 최솟값 및 최댓값이 기재되어 있다.

형질	평균	표준편차	최솟값	최댓값
CWT (kg)	85.98	5.51	71	105
pH24	5.77	0.19	5.37	6.72
WHC (%)	58.40	3.38	50.13	67.82
Drip loss (%)	4.43	1.91	12.30	14.38
Heat loss (%)	26.51	4.16	12.30	39.02
MC_L	48.49	2.75	38.00	57.68
MC_a	6.26	1.04	3.40	9.62
MC_b	3.14	1.21	0.33	6.85
BF (mm)	25.10	5.20	12	41
SF (kg/0.5inch²)	3.08	0.80	1.45	6.14
Moisture (%)	75.17	1.12	69.98	77.57
Fat (%)	2.67	1.18	0.42	10.15
Protein (%)	23.76	0.88	20.95	26.24
Collagen (%)	0.89	0.13	0.53	1.39

(2) 조직으로부터 DNA 추출

DNA는 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)를 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 등심 조직을 약 20 mg정도 절단하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 잘게 자른 후 Nucleic lysis solution 600 ㎕와 Proteinase K 20 ㎕을 첨가해 보어텍싱(vortexing)한 후 55 ℃ 항온수조에 1 시간 동안 방치하면서 세포를 용해시키는 동안 약 20 분 간격으로 보어텍싱을 해주었다. 배양이 끝난 후 3분 동안 얼음위에서 냉각한 후 RNaseA (20 mg/ml) 3 ㎕ 첨가 후 37 ℃ 배양기에 15분 동안 넣어두었다. 그 후 상온에서 10분 동안 식힌 후 단백질 침전 용액 200 ㎕을 첨가해 20 초간 격렬하게 보어텍싱한 후 얼음 위에서 5분 동안 냉각한 후 13,000 rpm에서 6분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 새 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 이소프로파놀(isopropanol) 600 ㎕을 첨가해 반전(inverting)한 후 13,000 rpm에서 6분 동안 원심분리하였다. 펠렛(pellet)을 제외한 상층액을 버리고 70% 에탄올 1 ㎖를 첨가해 10 회 전환한 후 13,000 rpm에서 6분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 제외한 상층액을 버리고 상온에서 건조시킨 후 멸균 증류수 200 ㎕ 첨가해 Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer V3.7 (Themo Scientific, USA)을 이용하여 농도와 질(quality)을 측정하였다. 추출 된 DNA는 50 ng/㎕로 맞춰 실험에 사용될 때까지 -20 ℃ 냉동고에 보관 하였다.

RNA는 수컷 한 마리의 두록 개체에서 총 18개의 조직(대뇌, 소뇌, 뇌하수체, 시상하부, 등심, 간, 위, 폐, 심장, 비장, 신장, 맹장, 십이지장, 대장, 직장, 공장, 방광 및 정소)을 채취하고, Trizol 시약을 사용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 임의의 헥사머와 SuperScriptⅢ (Invitron사)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.

(3) 돼지 FSD2 유전자의 구조 확인

돼지 FSD2 유전자의 코딩 DNA 정보(CDS)를 확인하는 과정에서 현재까지 밝혀진 돼지의 유전체 서열(Ensembl 데이터베이스, 7:57,653,600-57,679,877)에서 중간에 밝혀지지 않은 부분이 존재하여 정확한 돼지 FSD2 유전자의 엑손 영역을 정의할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 완성도를 높이기 위하여 농촌진흥청 국립축산과학원에서 보유하고 있는 한국재래돼지 BAC (bacterial artificial chromosome) 유전자 은행에서 미해독 영역의 양 옆에서 하기의 표 2에 기재된 프라이머를 제작하여 이를 이용한 BAC 클론을 선발하였다.

프라이머 종류	서열		생성물 크기(bp)	용도
프라이머 종류	정방향	역방향	생성물 크기(bp)	용도
FSD2_mRNA1	AAGCTGCGGATGTCTTCTGT	TCATGTACACTGCACGCTCA	875	cDNA 서열화
FSD2_mRNA2	AGCTCACCTGAGAAGGACCA	GTGTGTCTCATGCACCAGGA	740
FSD2_mRNA3	GTGGAGGTGGACGAGTGTTT	CTTGCGGTCTCAGGTCTGTT	781
FSD2_gDNA1	AAAAATTGTGGATGAGTTGAGC	TCATATCCTCCCTACACCCTTG	903	엑손2 SNP genotyping
FSD2_gDNA2	TGCCAGCAGAGAAAGCAGTA	CCTACTCTGGCCACAACCAT	738	엑손4 SNP genotyping
FSD2_gDNA3	GAGCGGCTCAAGAAAAACAC	ACGAATCCGAGTAGGAACCA	542	엑손6 SNP genotyping
FSD2_upper	GGGTGAGACATGGCTGATTT	CATGAGGCACAAAAGCTGAA	259	BAC 스크리닝
FSD2_lower	CAGAGCCCCAGTCATCAACT	CGACTCTGAGGAGAGGAGGA	210	BAC 스크리닝
FSD2_mRNA1	AAGCTGCGGATGTCTTCTGT	TCATGTACACTGCACGCTCA	875	조직 특이적 qPCR
Porcine_GAPDH	GCAAAGTGGACATTGTCGCC	TCCTGGAAGATGGTGATGGC	160	조직 특이적 qPCR

선발된 BAC 클론 KNP-346F01에 대하여 Large Construction Kit (Qiagen사)를 사용하여 BAC DNA를 추출하였다. 추출된 BAC DNA는 GS Junior pyrosequencer(Roche Diagnostic사)를 사용하여 임의 절단 염기서열 해독을 수행하고 Newbler의 de novo assembler 프로그램을 이용하여 조합 작업을 완성하여 단일한 132,448 염기쌍 정보를 확보하였다. 완성된 KPN-346F01 클론 서열에 대하여 NCBI의 15개 EST 정보(BF193397, FS678702, BX671727, DT333101, EW306575, EW242042, EW511269, EW410997, DY416136, FS682916, BX671726, DY419298, EW308607, BX925930, EW308615)를 조합하여 돼지 FSD2 유전자의 엑손 영역을 정의하였다(도 1 참조).

(4) 프라이머(primer) 제작 및 유전자 증폭

FSD2 유전자의 예상되는 기능을 바꿀 수 있는 유전자 변이를 탐색하기 위하여 엑손 영역에 대한 변이를 탐색하였다. 총 120두의 버크셔 돼지의 cDNA를 이용하였고, 상기 표 2의 프라이머를 사용하여 증폭하고, 염기서열을 해독하여 서열 변이를 탐색하였다. 염기서열의 해독은 ABI PRISM 3730 Genetic Analyzer (Life Technologies사)를 이용하였다. 해독 결과는 DNASTAR사의 Lasergene7 패키지의 SeqMan 프로그램을 사용하여 조합하고 변이를 발견하였다. 일차 유전자형 분석을 통하여 엑손 영역에서 총 10개의 단일염기다형(single nucleotide polymorphism, SNP)을 발견하였다(도 1 및 표 3참조).

SNP	영역	유전자형	수	빈도	대립유전자 빈도
g.-26G/A	5'-UTR	GG	104	0.15
		GA	337	0.5	A(0.60)
		AA	232	0.34	G(0.40)
		total	673	1
g.-15G/C	5'-UTR	GG	106	0.16
		GC	337	0.5	C(0.59)
		CC	231	0.34	G(0.41)
		total	674	1
g.102G/A	exon2	GG	297	0.44
		GA	312	0.46	A(0.33)
		AA	66	0.1	G(0.67)
		total	675	1
g.124G/A	exon2	GG	298	0.44
		GA	311	0.46	A(0.33)
		AA	66	0.1	G(0.67)
		total	675	1
g.134G/A	exon2	GG	105	0.16
		GA	337	0.5	A(0.59)
		AA	233	0.35	G(0.41)
		total	675	1
g.290T/C	exon2	TT	104	0.15
		TC	338	0.5	C(0.60)
		CC	233	0.35	T(0.40)
		total	675	1
g.594T/C	exon2	TT	104	0.15
		TC	338	0.5	C(0.60)
		CC	233	0.35	T(0.40)
		total	675	1
g.3662T/C	exon4	TT	232	0.34
		TC	348	0.51	C(0.40)
		CC	100	0.15	T(0.60)
		total	680	1
g.3824T/C	exon4	TT	102	0.15
		TC	338	0.5	C(0.60)
		CC	237	0.35	T(0.40)
		total	677	1
g.6756G/A	exon6	GG	297	0.47
		GA	287	0.46	G(0.70)
		AA	46	0.07	A(0.30)
		total	630	1

발견된 변이의 다형성을 확인하기 위하여 총 704두의 버크셔 개체의 genomic DNA에 대하여 상기 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR direct 염기서열 해독을 수행하였다.

유전자 증폭반응은 20 ㎕를 총 반응량으로 하여 50 ng/㎕ DNA 1 ㎕, 각 프라이머 10 pmole 2 ㎕, 10 mM dNTPs mix 1 ㎕, 10× 반응 완충액 2 ㎕, HS Taq DNA Polymerase(Genet Bio, Chungnam, Korea) 0.2 ㎕를 넣고 반응액을 만든 후 유전자 증폭기(MJ research PCR, PTC-240, USA)에서 증폭하였다. 증폭반응 조건은 94 ℃에서 10 분 동안 예비변성시킨 후 94 ℃에서 30초 동안 변성, 60 ~ 63 ℃에서 30초 동안 결합, 72 ℃에서 1분 동안 진행을 35 회 연속 반응시킨 후 72 ℃에서 10분 동안 최종 진행시켰다. PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)을 이용하여 전기영동을 실시하고, 젤 이미지 분석기를 이용하여 UV상에서 증폭여부를 확인하였다.

(5) 통계분석

분석에 사용되어진 704두에 대하여 10개의 단일염기다형에 대한 유전자형과 각 형질간의 연관 분석을 위하여 SAS9.2 PROC GLM (generalized linear model) procedure (Statistical Analysis System, USA)를 이용하여 두 단계 분석으로 수행 하였다. 표현형에 영향을 미치는 요인들을 아래와 같은 일반 선형모델에 적용하였다.

일반선형모델(General linear model; GLM) : Y = Xb+e

여기서, X = 각 형질별 고정효과 및 공변이를 포함한 벡터, b = 각 형질별 고정효과 및 공변이 효과, e = 무작위 오차(random error)

주어진 모델에서 모든 형질에 대해 종돈(sire), 성별(sex)을 고정효과 (fixed effect)로 도축일령(slaughter date)을 공변이로 보정하였다. 연관분석은 최소자승법(Least Squares; LS)을 이용하여 각 형질별로 설정된 모델에 대해서 각 형질에 대해 영향을 미치는 마커 효과를 분석하기 위해 회귀분석 모델을 적용하였다.

모델(model) : y = μ + xb + addi + doi + e

여기서, μ = 각 형질에 대한 전체 평균, b = 각 형질별 고정효과 및 공변이 효과, addi = 고정효과로 i번째 단일염기다형의 부가적(additive) 효과, doi = 고정효과로 i번째 단일염기다형의 우성적(dominant) 효과, e = 무작위 오차(random error)

(6) 돼지 FSD2 유전자의 단일염기다형의 형질 연관성 분석

분석에서 부계, 성별을 고정인자로 사용하였고 도축시기를 공분산으로 하였다. 각 변이의 부가적(additive) 및 우성적(dominant) 효과는 AA, AB, BB 유전자형을 각각 1, 0, -1 그리고 0, 1, 0으로 대체하여 회귀변량에 따라 고정하였다. 총 10개의 엑손 변이 중에서 2개의 단일염기다형(g.-26G/A 및 g.-15G/C; 각각 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위)은 5'-비해독영역(untranslational region, UTR)에 존재하였으며, 나머지 8개의 단일염기다형(g.102G/A, g.124G/A, g.134G/A, g.290T/C, g.594T/C, g.3662T/C, g.3824T/C 및 g.6756G/A; 각각 서열번호 3 내지 10으로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위)는 코딩 서열(CDS) 영역에 위치하는 것을 확인하였다.

하기의 표 4에 기재된 바와 같이 돼지 FSD2 유전자 내의 9개의 SNP (서열번호 1 내지 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위)는 돈육의 도체중, 육색, 수분 함량 및 지방 함량과 통계적으로 유의한 연관성을 가지는 것으로 확인되었다.

SNP	Traits	Genotype			P-value
SNP	Traits	AA	GA	GG	P-value
g.-26G/A	CWT	86.15 0.6	86.67 0.53	88.22 0.68	0.0086**
	MC_L	49.56 0.31	48.95 0.27	49.38 0.35	0.0362*
	MC_B	3.38 0.11	3.08 0.1	3.15 0.13	0.0037**
	Moisture	75.39 0.1	75.64 0.09	75.6 0.12	0.0083**
		CC	GC	GG
g.-15G/C	CWT	86.13 0.6	86.72 0.53	88.1 0.68	0.0129*
	MC_L	49.58 0.31	48.96 0.27	49.34 0.35	0.036*
	MC_B	3.38 0.11	3.09 0.1	3.13 0.13	0.0054**
	Moisture	75.4 0.1	75.63 0.09	75.61 0.12	0.0162*
		AA	GA	GG
g.102G/A	CWT	88.11 0.8	86.9 0.53	86.25 0.58	0.042*
	MC_B	3.18 0.15	3.08 0.1	3.3 0.11	0.0397*
	Moisture	75.53 0.14	75.69 0.09	75.37 0.1	0.0003***
	Fat	2.51 0.15	2.44 0.1	2.69 0.11	0.0148*
		AA	GA	GG
g.124G/A	CWT	88.12 0.8	86.9 0.53	86.26 0.58	0.0439*
	MC_B	3.18 0.15	3.08 0.1	3.3 0.11	0.0453*
	Moisture	75.53 0.14	75.69 0.09	75.38 0.1	0.0005***
	Fat	2.5 0.15	2.45 0.1	2.69 0.11	0.0185*
		AA	GA	GG
g.134G/A	CWT	86.1 0.6	86.69 0.53	88.21 0.68	0.0069**
	MC_L	49.58 0.31	48.94 0.27	49.37 0.35	0.0301*
	MC_B	3.38 0.12	3.08 0.1	3.14 0.13	0.0056**
	Moisture	75.4 0.1	75.64 0.09	75.6 0.12	0.0131*
		CC	TC	TT
g.290T/C	CWT	86.1 0.6	86.68 0.53	88.25 0.68	0.0057**
	MC_L	49.58 0.31	48.97 0.27	49.31 0.35	0.0421*
	MC_B	3.38 0.12	3.09 0.1	3.14 0.13	0.0057**
	Moisture	75.4 0.1	75.64 0.09	75.61 0.12	0.0133*
		CC	TC	TT
g.594T/C	CWT	86.13 0.6	86.66 0.53	88.25 0.68	0.0065**
	MC_B	3.38 0.12	3.08 0.1	3.14 0.13	0.004**
	Moisture	75.39 0.1	75.64 0.09	75.6 0.12	0.0084**
		CC	TC	TT
g.3662T/C	CWT	88.06 0.71	86.74 0.53	85.86 0.61	0.0044**
	MC_B	3.13 0.13	3.03 0.1	3.32 0.12	0.0059**
	Moisture	75.61 0.12	75.65 0.09	75.42 0.11	0.0173*
		CC	TC	TT
g.3824T/C	CWT	86.13 0.61	86.61 0.54	88.08 0.7	0.0144*
	MC_B	3.31 0.12	3.03 0.1	3.11 0.13	0.0083**
	Moisture	75.4 0.11	75.66 0.09	75.62 0.12	0.0067**

* : P < 0.05; ** : P < 0.01; *** : P < 0.001

또한, 상기 단일염기다형에 대한 단상형(haplotype) 분석을 위해 PHASE2.1.1 프로그램을 이용하였다. 하기의 표 5에 기재된 바와 같이 총 5가지의 haplotype이 형성되어지는 것으로 나타났으며, 상기 haplotype 중 GGAAGTTCT 단상형과 ACGGACCTC 단상형이 각각 29.6% 및 55.7%를 차지하고 있는 것으로 나타났다.

No.	haplotype	빈도
1	GGGGGTTCT	0.065407
2	GGAAGTTTC	0.030665
3	GGAAGTTCT	0.295714
4	ACGGACCTC	0.557074
5	ACGGACCCT	0.036416

돼지 FSD2 유전자 내 9개의 SNP에 대한 haplotype별 형질 연관성을 나타낸 표 6를 참조하면, GGAAGTTCT 단상형이 있는 개체와 ACGGACCTC 단상형이 없는 개체에서 도체중이 높았으며, GGAAGTTCT 단상형이 없는 개체에서 황색도가 높았다. 또한, GGAAGTTCT 단상형이 있는 개체와 ACGGACCTC 단상형이 없는 개체에서 높은 수분 함량을 나타내었다. 따라서, GGAAGTTCT 단상형이 있으며, ACGGACCTC 단상형이 없는 개체를 종돈으로 선발한다면 높은 도체중 및 수분 함량을 가지며, 황색도가 낮은 개체를 선발할 수 있을 것이다.

	Haplotype3 (GGAAGTTCT), Frequency: 0.295714
Traits	0	1	2	P-value
Traits	(n =317 )	(n =278 )	(n =53 )	P-value
CWT	86.17 0.58	86.73 0.55	88.34 0.88	0.0341*
Driploss	4.80 0.18	4.80 0.17	4.87 0.27	0.9590
pH24	5.73 0.02	5.72 0.02	5.70 0.03	0.7851
WHC	58.08 0.24	57.86 0.23	58.23 0.37	0.4107
HeatLoss	26.21 0.44	25.72 0.42	25.78 0.67	0.3700
BF	24.71 0.50	25.35 0.47	25.45 0.76	0.2328
MC_L	49.31 0.30	48.93 0.28	49.20 0.45	0.2717
MC_B	3.29 0.11	3.00 0.10	3.03 0.17	0.0036**
Moisture	75.42 0.10	75.69 0.09	75.54 0.15	0.0027**
SF	3.16 0.07	3.13 0.06	3.14 0.10	0.8988
Fat	2.65 0.11	2.45 0.11	2.60 0.17	0.1030
Protein	24.02 0.08	24.04 0.07	24.1 0.12	0.7708
MC_A	5.99 0.11	5.88 0.10	6.14 0.16	0.1795
Collagen	0.89 0.01	0.89 0.01	0.90 0.02	0.7540
	Haplotype4 (ACGGACCTC) Frequency: 0.557074
Traits	0	1	2	P-value
Traits	(n =113 )	(n =346 )	(n =189 )	P-value
CWT	87.58 0.67	86.69 0.55	85.79 0.64	0.0259*
Driploss	4.87 0.21	4.76 0.17	4.86 0.20	0.7673
pH24	5.68 0.02	5.73 0.02	5.74 0.02	0.0279*
WHC	58.17 0.28	57.93 0.23	57.89 0.26	0.5743
HeatLoss	25.78 0.51	25.94 0.42	25.93 0.49	0.9369
BF	25.13 0.58	25.11 0.47	25.22 0.55	0.9675
MC_L	49.30 0.34	49.00 0.28	49.10 0.33	0.6394
MC_B	3.16 0.13	3.07 0.10	3.13 0.12	0.7362
Moisture	75.62 0.12	75.64 0.09	75.34 0.11	0.0022**
SF	3.14 0.08	3.17 0.06	3.07 0.07	0.2607
Fat	2.45 0.13	2.54 0.11	2.65 0.12	0.2678
Protein	24.16 0.09	24.01 0.07	23.97 0.08	0.0829
MC_A	5.93 0.12	5.93 0.10	6.04 0.12	0.4574
Collagen	0.90 0.02	0.90 0.01	0.88 0.02	0.2195

* : P < 0.05; ** : P < 0.01

실시예 2. 본 발명에 실시예에 따른 돈육의 육질 예측용 단일염기다형 유전자 조성물이 포함된 마이크로어레이의 제작

본 발명의 실시예에 육질 예측용 단일염기다형 유전자 조성물이 포함된 마이크로어레이는 하기와 같은 방법을 통하여 제조되었다.

서열번호 1 내지 10으로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위를 단일염기다형으로 포함하는 각각 20개의 연속된 염기로 구성되는 뉴클레오타이드(상기 10종류의 단일염기다형은 상기 20개의 연속된 염기 중 11번째에 위치)를 기판상에 고정하였다. 단일염기다형 위치에는 두 개의 대립형질이 존재하므로 각 서열마다 2개씩의 폴리뉴클레오타이드를 기판상에 고정화하였다.

먼저, 상기 각 폴리뉴클레오티디의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실릴화 슬라이드(Telechem사)에 스팟팅하였으며, 이때 상기 스팟팅 버퍼는 2×SSC(saline-sodium citrate, pH 7.0)을 사용하였다. 스팟팅 후 건조기에 두어 결합을 유도한 후 0.2% SDS(sodium dodecyl sulfate)로 2분 동안, 3차 증류수로 2분 동안 세척하여 결합되지 않은 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95 ℃에서 2분 동안 처리하여 변성을 유도한 후, 블로킹 용액(1.0g NaBH₄, PBS(pH 7.4) 300 ㎖, EtOH 100 ㎖)으로 15분 동안, 0.2% SDS 용액으로 1분 동안, 3차 증류수로 2분 동안 각각 세척하고 상온에서 건조시켜 마이크로어레이를 제작하였다.

실시예 3. 본 발명에 실시예에 따른 마이크로어레이를 이용한 돈육의 육질 예측 방법.

본 발명자들은 육질을 예측하고자 하는 돼지의 혈액으로부터 표적 DNA를 분리하고, Cy3-dUTP(Metabion사)로 형광 표지시켰다. UniHyb 혼성화 용액(Telechem사) 하에서 상기 실시예 2에서 제조된 마이크로어레이와 형광 표지된 표적 DNA의 혼성화를 42 ℃에서 4시간 동안 수행하였다. 2×SSC로 실온에서 5분 동안 두 번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다.

건조 후 슬라이드를 스캔어레이 5000(ScanArray 5000: GSI Lumonics 사)으로 스캔하고 스캔 결과를 퀀트어레이(QuantArray)(GSI Lumonics 사)와 ImaGene 소프트웨어(BioDiscover사)로 분석하였다. 상기의 분석 결과로부터 상기 돼지가 본 발명에 따른 단일염기다형을 어떠한 유전자형으로 가지고 있는지 여부를 확인함으로써, 돈육의 육질을 예측하였다.

따라서, 상기에 기술한 바와 같이 본 발명에 따른 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물 및 이를 이용한 돈육의 육질 예측방법을 이용하여 돈육의 육질형질에 대한 분자생물학적 수준에서의 해석이 가능하며, 돈육의 육질을 예측할 수 있는 분자표지인자로서 육질이 개량된 종돈의 선발이 가능하다.

이상, 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Genetic composition of porcine FSD2 for predicting meat quality of pork and predicting method of meat quality using thereof <130> NPF-25086 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = g or a <400> 1 ataaccatct agtgcactga cctcagaaat ggggttttct gttctaggac ccaggatatc 60 tattaataac tgtccaaaaa gaaaccttcc tgtgcagagg ngctgccccg agcatccaga 120 gccacgatgg aagaggaagc aggtgaggcc ccggggctgg gcaggcccgc tgctcctaag 180 gatttccact tttatcacgt g 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = g or c <400> 2 gtgcactgac ctcagaaatg gggttttctg ttctaggacc caggatatct attaataact 60 gtccaaaaag aaaccttcct gtgcagaggg gctgccccga ncatccagag ccacgatgga 120 agaggaagca ggtgaggccc cggggctggg caggcccgct gctcctaagg atttccactt 180 ttatcacgtg gatctgtacg a 201 <210> 3 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = g or a <400> 3 tggaagagga agcaggtgag gccccggggc tgggcaggcc cgctgctcct aaggatttcc 60 acttttatca cgtggatctg tacgactctg aagacagact ncagatcttc ccggaaggaa 120 acactcggat gcgaagagag gtagtccagg ctgaaatgac caacgaacca agagcagccg 180 tgaaagagaa ggctccgaga g 201 <210> 4 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = g or a <400> 4 cccggggctg ggcaggcccg ctgctcctaa ggatttccac ttttatcacg tggatctgta 60 cgactctgaa gacagactgc agatcttccc ggaaggaaac nctcggatgc gaagagaggt 120 agtccaggct gaaatgacca acgaaccaag agcagccgtg aaagagaagg ctccgagaga 180 ccttgaagaa gaagtggatg a 201 <210> 5 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = g or a <400> 5 ggcaggcccg ctgctcctaa ggatttccac ttttatcacg tggatctgta cgactctgaa 60 gacagactgc agatcttccc ggaaggaaac actcggatgc naagagaggt agtccaggct 120 gaaatgacca acgaaccaag agcagccgtg aaagagaagg ctccgagaga ccttgaagaa 180 gaagtggatg aacttgtcca t 201 <210> 6 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = t or c <400> 6 aaggctccga gagaccttga agaagaagtg gatgaacttg tccatcttta cggacttgaa 60 gatgatcatg aattaggcga tgcattcgtt gacgaaagca ngcccagaat agaggtttca 120 gagtatcctc cttatgggat gatggggaga gaagcagcca gggagcagag agactggaga 180 cttagcggcg aggaggctaa t 201 <210> 7 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = t or c <400> 7 gctacgtcat cccagaggag gaagacgagg atgaagctgc ggatgtcttc tgtgtcacct 60 gcaaaacacc agtcagagct ttggaggttt ctgatgaaca naaggaacat gaggtaaccc 120 cactccataa agcactggaa agtgccaagg taaatagatc tccttagttc ttcttgctct 180 tgatattgca tttctatctc a 201 <210> 8 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = t or c <400> 8 actctgtcgt gaacattcat acactgaaat gatggctgag gttgactatc ttgcaggaga 60 attttggaag acaagaacaa aactttgagt cacattacaa ngagatcttg gaaacacttg 120 ctcaaaaata cgaagaaaaa atacaagctc taggggagaa aaagaaagag aagctagaag 180 ccttgtatgg acaactggtc a 201 <210> 9 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = t or c <400> 9 agaaagagaa gctagaagcc ttgtatggac aactggtcag ctgtggagaa aatcttgata 60 cctgcaaaga actaatggaa acaatagagg agatgtgtca ngaagagaag gttgatttca 120 taaaggtcag tagcaaggag ttcccactgt ggtacaaagg gatcagagcg tctctgcagc 180 accaggacgc aggttcgatc c 201 <210> 10 <211> 201 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> n = g or a <400> 10 tcaaagttcg gccaagaggc cctctttgca ttatactagt gacccctcag gagagtgccc 60 ctccattctt gtcagtgtgt ctttttacac ccacagactc ngaaaattcc tgaaaacaaa 120 aacagatgtt gagatctcga cgcagcctga cttcgacgac cagactttgg acttttctga 180 tgtggagcag ctgatggact c 201

Claims

서열번호 1 내지 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위를 단일염기다형으로 포함하는 각각 10 ~ 200 개의 뉴클레오타이드의 연속적인 폴리뉴클레오타이드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물.
제1항에 있어서,
상기 돈육의 육질은 도체중, 육색, 수분 함량 및 지방 함량으로부터 선택되는 적어도 하나에 의해 예측되는 것인 돈육의 육질 예측용 유전자 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 유전자 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 마이크로어레이.
제1항 또는 제2항에 따른 유전자 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 키트.
서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 도체중을 가지며, AA 및 GG인 경우, GA인 경우보다 높은 명도를 가지며, AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 황색도를 가지며, GA 및 GG인 경우, AA인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 GG인 경우, CC 및 GC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC 및 GG인 경우, GC인 경우보다 높은 명도를 가지며, CC인 경우, GC 및 GG인 경우보다 높은 황색도를 가지며, GC 및 GG인 경우, CC보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 도체중을 가지며, GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 황색도 및 지방 함량을 가지며, GA인 경우, AA 및 GG인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 4로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 도체중을 가지며, GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 황색도 및 지방 함량를 가지며, GA인 경우, AA 및 GG인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 5로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 GG인 경우, AA 및 GA인 경우보다 높은 도체중을 가지며, AA인 경우, GA 및 GG인 경우보다 높은 명도 및 황색도를 가지며, GA 및 GG인 경우, AA인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 6으로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 명도 및 황색도를 가지며, TC 및 TT인 경우, CC인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 7로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 황색도를 가지며, TC 및 TT인 경우, CC인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 8로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 도체중을 가지며, TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 황색도를 가지며, CC 및 TC인 경우, TT인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하며;
서열번호 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위의 유전자형이 TT인 경우, CC 및 TC인 경우보다 높은 도체중을 가지며, CC인 경우, TC 및 TT인 경우보다 높은 황색도를 가지며, TC 및 TT인 경우, CC인 경우보다 높은 수분 함량을 가지는 것으로 판정하는 돈육의 육질 예측 방법.
서열번호 1 내지 9로 표시되는 염기서열에서 101번째 좌위에 대한 단일염기다형의 단상형이:
GGAAGTTCT 단상형인 경우, 다른 단상형인 경우보다 높은 도체중 및 수분 함량을 가지며, GGAAGTTCT 단상형이 아닌 경우, 높은 황색도를 가지는 것으로 판정하는 돈육의 육질 예측 방법.