KR101149442B1 - 생시 및 이유시 우량 돼지를 조기에 판단하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생시 및 이유시 우량 돼지 조기 판단용 DNA 표지인자 및 이를 이용한 우량 돼지 조기 판단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 표지인자는 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 122번째 염기 [G/T]를 단일염기다형(SNP)으로 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 DNA 표지인자를 이용하면 생시 및 이유시 우량 체중의 돼지를 조기에 판단할 수 있음으로써 종축의 유전능력을 개량할 수 있다.

돼지, 생시 체중, 이유시 체중, 단일염기다형

Description

생시 및 이유시 우량 돼지를 조기에 판단하는 방법{METHOD FOR DISCRIMINATING HEAVY PIGS AT BIRTH AND WEANING EARLY}

본 발명은 생시 및 이유시 우량 돼지 조기 판단용 DNA 표지인자 및 이를 이용한 우량 돼지 조기 판단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지의 생시 체중 및 이유시 체중과 연관된 DNA 표지인자를 개발하고 이를 이용하여 돼지의 생시 체중과 이유시 체중이 우수한 돼지를 조기에 판단할 수 있는 방법에 관한 것이다.

돼지의 생시 체중 및 이유시 체중은 현재 예비 종돈을 평가하는 중요한 요인 중 하나이다. 특히 돼지의 생시 체중은 출하까지 돼지의 성장률뿐만 아니라 자돈의 생존율에도 영향을 미치는 중요한 요인으로서, 자돈의 생시 체중이 1.2kg 이상이면 자돈 생존율이 크게 향상되는 것으로 알려져 있고 생시 체중이 0.5kg 더 높으면 이유시 체중은 1kg 이상 더 무거운 것으로 알려져 있어 돼지의 생시 체중은 예비 종돈 계량에 활용되고 있다.

자돈의 생시 체중(1.1kg 이하 : 낮음, 평균 : 1.25kg, 1.4kg 이상 : 우수)은 이유시 체중에 영향을 미칠 뿐만 아니라 출하일령 단축 및 출하체중 증가와 밀접한 연관이 있고, 특히 질병에 대한 저항성에 영향을 주어 폐사율과도 연관된다.

종축을 선발하는데 있어 기존에는 단지 표현형가에 근거하여 만들어진 선발지수식에 의하여 선발하였다. 최근에는 분자 표지인자를 활용한 변이체의 선발 또는 도태가 단일유전자에 의하여 조절되는 형질뿐만 아니라 양적형질유전좌위(Quantitative Trait Loci: QTL)에 의해 조절되는 형질에서도 표지인자 도움선발(Marker-Assisted Selection: MAS)이 효과적으로 활용될 수 있다는 것이 시뮬레이션을 통하여 확인되고 있다.

일반적으로 분자표지를 이용할 경우 표현형가에 의한 선발효과보다 25~35% 더 정확한 유전능력 측정이 가능하여 종돈의 유전능력 개량량을 획기적으로 늘릴 수 있다. 돼지 비육돈 및 자돈을 선발하는 경우 표현형가에 근거한 기존의 방법에 DNA 표지인자를 도입할 경우 선발의 정확성을 제고할 수 있어 유전능력 개량을 극대화할 수 있다.

현재 양돈산업에서 활용되는 유전자 또는 표지인자는 HAL(육질), ESR(산자수), PRLR(산자수), RBP4(산자수), KIT(백모색), MC1R(적색/흑모색), MC4R(성장, 비만), FUT1(부종병), RN(육질), AFABP(근내지방), HFABP(근내지방), PRKAG3(육질), IGF2(도체 조성) 등이 있다. 그러나 돼지의 생시 체중 및 이유시 체중과 연관된 DNA 표지인자는 개발된 바가 없었다.

이에, 본 발명의 발명자들은 심혈을 기울여 연구한 결과, 돼지의 생시 체중 및 이유시 체중에 유의적으로 연관된 SNP를 확인하여 DNA 표지인자를 개발하고, 이를 이용하여 우량 돼지를 조기에 판별할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명에 이르 렀다.

본 발명의 목적은 돼지의 생시 체중 및 이유시 체중과 연관된 DNA 표지인자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 생시 체중 및 이유시 체중이 우량한 돼지를 조기에 판단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 생시 체중 및 이유시 체중이 우량한 돼지를 조기에 판단하기 위한 프라이머 또는 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 DNA 표지인자를 개체식별 및 친자식별에 활용하는 것이다.

본 발명의 돼지의 생시 체중 및 이유시 체중에 유의적인 DNA 표지인자는, 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 122번째 염기 [G/T]를 단일염기다형(SNP)으로 하는 것이다.

본 발명의 생시 및 이유시 우량 돼지를 조기에 판단하는 방법은, 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 122번째 염기 [G/T]를 SNP로 하는 우량 돼지 조기 판단용 DNA 표지인자를 이용하여 생시 및 이유시 우량 돼지를 조기에 판단하는 것이다.

본 발명의, 우량 돼지 조기 판단용 DNA 표지인자는 돼지의 생시 및 이유시 체중과 연관되어 있어 본 발명의 DNA 표지인자를 이용하면 생시 및 이유시 우량한 돼지를 조기에 선발할 수 있다. 따라서 우수 종돈을 육성할 수 있을 뿐만 아니라 매년 외국으로부터 수입되는 종돈의 수를 줄여 해외 악성 전염병의 국내 전파를 방지하고 비용을 절감할 수 있다.

본 발명에서는, 돼지 7번 염색체의 생시 체중 및 이유시(3주령) 체중과 연관된 양적형질유전좌위를 조절하는 유전자 및 유전자의 변이를 분석하여 생시 체중 및 이유기간의 체중과 연관된 바이오 마커를 제공한다. 이에 양적형질유전좌위 내에 존재하는 포스포글리세레이트 카이나제(Phosphoglycerate Kinase 2: PGK2) 유전자를 후보 유전자로 선정하고 이 유전자의 전사조절 영역에 해당하는 DNA 염기서열을 비교하여 단일염기다형(Single Nucleotide Polymorphism: SNP)을 발굴하고 발굴된 단일염기다형이 생시 체중과 3주령 체중 형질과 연관되어 있는지를 분석하여 유의적인 단일염기다형을 발굴하고 돼지의 표지인자 도움 선발(MAS) 기법에 필요한 분자표지인자를 제공한다.

본 발명의 생시 및 이유시 우량 돼지 조기 판단용 DNA 표지인자는, 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 122번째 염기 [G/T]를 단일염기다형(SNP)으로 한다.

본 발명의 생시 및 이유시 우량 돼지 조기 판단 방법은, 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제 유전자(PGK2)의 122번째 염기 [G/T]를 단일염기다 형(SNP)으로 하는, 우량 돼지 조기 판단용 DNA 표지인자를 이용한다.

바람직하게 본 발명의 생시 및 이유시 우량 돼지 조기 판단 방법은, 상기 단일염기다형을 포함하는 돼지의 DNA를 PCR을 통해 증폭시킨 후에 상기 단일염기다형을 포함하는 염기서열을 인지하는 제한효소를 처리하여 얻어진 분해산물을 분석하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때 제한효소를 처리하여 얻어진 분해산물을 분석하는 과정은 전기영동법이 바람직하게 이용된다.

PGK2 유전자 내에서 탐색된 SNP 좌위에 대한 제한효소의 특성을 [표 1]에 나타내었다.

바람직하게 본 발명의 생시 및 이유시 우량 돼지 조기 판단 방법은, 상기 단일염기다형 위치의 뉴클레오타이드를 3' 말단 뉴클레오타이드로 포함하는 프라이머 또는 프로브를 설계하고, 상기 설계된 프라이머 또는 프로브를 이용하여 증폭시킨 결과물을 분석하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게 본 발명의 생시 및 이유시 우량 돼지 조기 판단 방법은, 상기 선택된 SNP로부터 대립유전자를 판단하기 위하여, 직접 염기서열을 결정하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 122번째 염기 [G/T]를 3' 말단 뉴클레오타이드로 포함하는 우량 체중의 돼지 조기 판단용 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 122번째 염기 [G/T]를 3' 말단 뉴클레오타이드로 포함하는 우량 체중의 돼지 조기 판단용 프로브를 제공한다.

특히, 본 발명의 우량 돼지 조기 판단용 프라이머 또는 프로브는 PGK2의 122번째 염기 [G/T]를 3' 말단 뉴클레오타이드로 포함하되, 서열목록 내의 뉴클레오타이드 10~30개로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

하기 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 포스포글리세레이트 카이나제 유전자 확인>

포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 전사조절 영역 및 전사영역에 대한 증폭 및 상기 유전자의 염기서열을 확인하기 위하여 [표 2]에서와 같은 8 쌍의 프라이머를 제작하여 이용하였다. PCR 반응을 위해 PCR reaction buffer(500mM KCl; 100mM Tris-Cl, pH8.2; 15mM MgCl₂; 0.1% Triton X-100, TaKaRa Co, Japan) 2.5㎕, 2.5mM dNTPs 2㎕, 10 pmole의 primer 1㎕, 25-50ng의 genomic DNA, 1U의 Taq DNA polymerase(CoreBio)를 넣고 최종 부피가 25㎕되도록 멸균증류수로 채웠다. PCR 증폭반응은 94℃ 10분간 변성 반응 후 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분 10초간을 35회전 동안 증폭 후 72℃에서 5분간 마지막 신장 반응을 수행하였다. PCR이 끝난 후 5㎕의 PCR 산물을 1.5%의 아가로즈 겔(agarose gel)에서 증폭여부를 확인하였다. 한편 증폭산물에 대하여 포스포글리세레이트 카이나제 (PGK2) 유전자가 맞는지를 알아보기 위하여 염기서열을 결정한 후 DNA 염기서열을 비교한 결과 원하는 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자임을 확인하였다(도 1 참조).

<실시예 2: SNP 확인>

포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 전사조절 영역 및 전사영역 내에서 SNP를 발굴하기 위하여 PCR 반응을 통해 증폭된 산물을 유전자 증폭산물 정제 키트(PCR Purification Kit, CoreBio PPHTS-30)를 이용하여 정제한 후, BigDye Terminator ver3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)와 ABI 3730XL DNA sequencer(Applied Biosystems)를 이용하여 직접 염기서열 결정(Direct sequencing)을 수행하였다.

개체별로 결정된 염기서열은 SeqMan 프로그램(DNASTAR)을 이용하여 다중서열배열(Multi-align)을 통하여 DNA 염기서열 내 단일염기다형을 탐색하였다. 본 연구를 통하여 20개의 단일염기다형이 발굴되었으며 그 결과를 [표 3]에 나타내었다.

<실시예 3: 돼지 품종별 대립유전자 빈도 조사 >

재래돼지, 랜드레이스, 듀록, 바크셔 및 라지화이트의 5개 돼지 품종에 대한 대립 유전자 빈도를 조사하고 이를 [표 4]에 나타내었다.

<실시예 4: 발굴된 SNP 유의성 확인>

재래돼지와 랜드레이스의 잡종(F1)의 2세대(F2)를 이용하여, 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 전사조절 영역의 122 G/T 다형과 돼지 생시 체중 및 3주령 체중과의 연관성 분석을 하고 그 결과를 [표 5]에 나타내었다.

[표 5]에 제시되어 있는 것과 같이, 돼지의 생시 체중 및 3주령 체중과 유의적으로 연관된 좌위는 전사개시염기를 기준으로 하였을 경우 122 G/T의 다형이 1% 수준의 통계적 유의성이 인정되었다. 생시 체중에서는 GT 유전자형이 가장 높게 나타났으며, GG 유전자형이 그 다음으로 높았으며, TT 유전자형이 가장 낮은 생시 체중에 효과를 보였다(1.30kg VS 1.22kg). 그리고 3주령 체중에서는 GG 유전자형과 GT 유전자형에 비해 역시 TT 유전자형이 현저히 낮게 나타났다(5.15kg VS 4.48kg). 따라서 돼지의 자돈 생산시 폐사율이나 사료요구율의 조절로 인한 비육돈생산을 위한 개체를 조기선발하기 위해서는 GG 또는 GT 유전자형을 가진 개체를 선발하는 것이 유리할 것으로 판단된다.

도 1은 포스포글리세레이트 카이나제 유전자의 전사조절 영역 및 전사영역의 염기서열을 나타내는 도이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> DNA MARKER ASSOCIATED WITH BODY WEIGHT OF PIGS AT BIRTH AND WEANING, AND METHOD FOR DISCRIMINATING HEAVY PIGS EARLY USING THIS <130> 09-065-RDA <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3535 <212> DNA <213> pig <400> 1 cgaactgcca aactatttcc ctaacagctg tagcatacct tattcccaat aacgataaat 60 gagatgttct attgctgtgc atctttgacg atgctgtcag aatgttggat gttagccatt 120 akaagagtat ggcgatatca ttaactatct aggaatggaa ttgctgggtc atatggtaac 180 ttcatgttta atattttgaa aaaatatcaa ggcgtcctct aaactgacta caccrtttcr 240 cattcctacc agcaatatgc garggtacca acttttcctc atcctagtca actttgttac 300 tgtctttttc aaattttagc catcctctaa aatagttttg tcaaaacctt cctgctacat 360 atttrgttca tgcaacttat agaaactgct ataataattg caaagcccgt tttcattcct 420 aaacctatca gccatatata tactttctcc aaaaataaaa actcttactc attttcagtt 480 cagatgtttt cattctcatg aaactatgcc tgttttcagc tgaatttcaa agttaygcag 540 gtagtgaaac agagagagga gagggaacag taaggaacca catcataact ttgtagcctg 600 aaagaaatgt caccattacc ttgaggggtt tactgatrct ctgtgctatg rtcttatcac 660 atttctccca aagaagccac caagcattct ctcacggtag tatgagaaca ggakaagaaa 720 gctagtgaaa atactgtata ttcaccccac gctggaatat acctaaaacc aaaggctcat 780 accaagctat gctcttaaca gaaatatttr tcaagacaag gaaaaaacag aagcatatta 840 tgttgccttg aataaacaag gtttcataga cccattcttt caaatctttc ctttaatttg 900 gcagggcaca agtttctaca ctcaatataa ttaggatttc acatgggggg aggtatgctt 960 ttcattcttt taaaagaata aaagcaattg ttaaaaaaaa aaaaaatgtc aaaaagaacc 1020 agcaggaggc ttggacgtca ggactcctct tctttcaggg tttcttcacc tcttcaactg 1080 tcaccccaag ccaccagata tcactagtct agtcttcagc cctggctcgt agaatctgca 1140 ccacgcgtct ccaaatcccg attgacagga cgattggacc aatcacagag ccaggtttcc 1200 ttgccccggt ccaatcatgg ctgccatgtg ggagacccgg tgcttggaag ataggggcgg 1260 gccaagagga agggcgttag gaaacgccat ccgcgcaaca tcgcagcagc agtgaagtgg 1320 ttccctgcaa catcgggatc taagtgttag cctgtcttcg tattgtcaaa atgtctcttt 1380 ctaagaagtt aactttggac aaactggacg tgaaagggaa acgagtcatc atgagagtag 1440 acttcaatgt tcccatgaag aggaaccaag ttacaaacaa ccaaagaatc aaggcttccc 1500 tcccaagcat cagatactgc ctrgataacg gagccaggtc agtagttctc atgagtcatt 1560 taggtagacc tgatggtgtt gcgatgcctg ataaatactc cttagagccg gtggctgctg 1620 aactcaaatc cttgctgggg aaagacgttc tgttcctaaa agactgtgtg ggctcagaag 1680 cagagcaagc ttgtgccaac ccacctgcgg gttcagtcat cctactggag aaccttcgct 1740 ttcatgtgga agaggaaggg aagggccaag atccttctgg gaataagctg aaagctgagc 1800 cagataaagt agaagccttc cgygcatcgc tctccaagct gggggatgtg tatgtcaatg 1860 atgcttttgg cacrgctcac cgggctcaca gttccatggt gggagtgaat ctgccgcaga 1920 aggcatctgg attcctgatg aaaaaggagc tggattactt tgccaaagcc ttggaaaacc 1980 cagagagacc ctttctggct atccttggtg gagctaaagt ggcagacaag atccaactca 2040 tcaaaaatat gctggacaaa gtcaatgaga tgattattgg tggcggaatg gcytttacct 2100 tccttaaggt actcaacaac atggagattg gtgcctccct gttcgacaaa gagggagcca 2160 mgattgtcaa agagatcatg gccaaagctg aaaagaatag ggtgaacatt acctttcctg 2220 ttgactttgt cattgctgac aagtttgagg aaaatgctaa ggttggccag gccacggtag 2280 cgtcaggtat acctgccggc tgggtggctt tggactgtgg tcctgagacc aacaagaaga 2340 atgcacaagt tgtggcccga gccaagctaa ttgtgtggaa tggaccttta ggggtctttg 2400 aatgggatgc ctttgctaat ggaacgaaag ccctcatgga tgaaattgtg aaagccacct 2460 ccaagggctg tatcacyatt ataggaggtg gagacacggc cacttgctgt gccaaatgga 2520 acactgaaga taaagtcagt catgtgagca ctggaggagg tgccagtcta gagcttctgg 2580 aaggtaaagt ccttcctgga gtggaggctc tcagcaatct gtagttgata gtgttccttc 2640 ctrytgtttt ctrtgcacag cctttaagtc aacttagtgc ttttacatct caacttgact 2700 tttgttaaaa tctacccctc catcaagact caggcaaaga ccaaggaatg ggccatcagg 2760 aactcttaac atcagcttaa cagtacaact catttttgtt ctgtgatgca tttgcctact 2820 gtcttaaaga tctcatttga acttcactgt tgtaattcat agaaagtgag ctgcctatta 2880 aagtgaattg aataagctga atttccttct cttttaattt tagaccagct ttattattgt 2940 tttaccattt gaaacatgga aaccaaacca aaggtgctaa ggaagggtgg ggtacaaggt 3000 gacaaatttt tatttttatt ttttgtcttt ttagggccac acgcatggca catggaggtt 3060 cctaggctag gggtcgaatc agagctgtag ctgccagcct atgccacagc ctcaccagat 3120 cccagccatg tctgtgacct acaccacagc taatggcaat gccggatcct taacccactg 3180 agtgaggctt agccggattc atttctgctg caccacgaag ggaactccga aggtgataaa 3240 ttattaaata atgaaagtgt cccaataaac tgagaaaaat aattgcattt aagaactcat 3300 gggtagcatt aaagctccac taagaggaaa gttttactaa ataagaagag aaataaaaaa 3360 tacttattaa ctcaagaagt taaaaaaaaa aaaagggagt tcccatcatg gctcagctga 3420 aatgaatctg agtagcatcc atgaagatgc agattcaatc cctggccttg ctcagtgggt 3480 caggcatctg gggttgccgt gcactctggt gtaggtcaca gatgtgggtc agatc 3535

Claims (7)

1. 삭제
2. 서열번호 1에 제시된 포스포글리세레이트 카이나제(PGK2) 유전자의 122번째 염기 [G/T]를 단일염기다형(SNP)으로 하는, 돼지의 생시 체중 및 이유시 체중과 연관된 DNA 표지인자를 이용하여 GG 또는 GT 유전자형의 돼지를 선발하는 것을 특징으로 하는 생시 및 이유시 우량 돼지를 조기에 판단하는 방법.
3. 청구항 2에 있어서,

   상기 단일염기다형을 포함하는 돼지의 DNA를 PCR을 통해 증폭시킨 후에 상기 단일염기다형을 포함하는 염기서열을 인지하는 제한효소를 처리하여 얻어진 분해산물을 분석하는 과정을 포함하여 이루어지는, 생시 및 이유시 우량 돼지를 조기에 판단하는 방법.
4. 청구항 2에 있어서,

   상기 단일염기다형 위치의 뉴클레오타이드를 3' 말단 뉴클레오타이드로 포함하는 프라이머 또는 프로브를 설계하고, 상기 설계된 프라이머 또는 프로브를 이용하여 증폭시킨 결과물을 분석하는 과정을 포함하여 이루어지는, 생시 및 이유시 우 량 돼지를 조기에 판단하는 방법.
5. 청구항 2에 있어서,

   상기 단일염기다형으로부터 대립유전자를 판단하기 위하여, 직접 염기서열을 결정하는 것을 특징으로 하는, 생시 및 이유시 우량 돼지를 조기에 판단하는 방법.
6. 삭제
7. 삭제

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