KR20150066652A - 피루베이트 카르복실라제가 불활성화되거나 감소된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

피루베이트 카르복실라제가 불활성화되거나 감소된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있는 효모 세포, 및 이를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

피루베이트 카르복실라제가 불활성화되거나 감소된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법{Yeast cell with inactivated or depreessed pyruvate carboxylase and method of producing latate using the same}
피루베이트 카르복실라제가 불활성화되거나 감소된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.
PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.
또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.
현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.
따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있는 효모 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "락테이트 (lactate)"는 "젖산 (lactic acid)" 또는 그의 염을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가", "효소 활성 증가", "증가된 활성", 또는 "증가된 효소 활성"은 세포 또는 단리된 효소가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 효소의 증가된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 "불활성화" 또는 "감소", 활성이 "불활성화"되었거나 "감소"된 효소는 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성이 없는 것을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환 활성보다 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소의 감소된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어"감소 (depression)"는 유전자의 발현이 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 낮은 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 유전적으로 조작되지 않은 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있는 효모 세포가 유래된, 모세포 또는 야생형의 세포를 포함할 수 있다.
상기 효소의 활성이 불활성화되거나 또는 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 상기 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것에 의한 것일 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 상동 재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자(paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 불활성화 또는 감소될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.
상기 효소의 활성이 감소되는 것은 유전자 발현 조절 서열의 변형, 발현 감소 조절 관련 유전자의 증폭, 발현 증가 조절 관련 유전자의 결실, 또는 유전자의 카피수 감소에 의한 것일 수 있다. 발현 조절 서열은 유도 프로모터, 전사 증진 인자, 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다. 상기 유전자 발현 조절 서열의 변형은 모균주의 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터로 교체하는 것을 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 모균주의 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 정렬하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 개수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 개수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 개수를 비교 범위 내의 위치의 총 개수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트의 생산능이 향상된 것일 수 있다. 락테이트의 생산능이 향상된 효모 세포는 모균주 대비 락테이트의 생산능이 증가된 효모 세포를 의미한다.
또한, 상기 효모 세포는 자낭균류(ascomycota)일 수 있다. 상기 자낭균류는 사카로미세타시에(saccharomycetaceae) 일 수 있다. 상기 사카로미세타시에는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속, 캔디다 (Candida) 속, 피치아 (Pichia) 속, 이사첸키아 (Issatchenkia) 속, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속, 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces) 속, 쉬조사카로마이세스 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속 일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 클루이베로마이세스 속은 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 서모톨러란스 (Kluyveromyces thermotolerans)일 수 있다. 캔디다 속은 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata), 캔디다 보이디니 (Candida boidinii), 캔디다 마그놀리아 (Candida magnolia), 캔디다 메타노소르보사 (Candida methanosorbosa), 캔디다 소노렌시스 (Candida sonorensis), 또는 캔디다 유틸러스 (Candida utilis)일 수 있다. 피치아 (Pichia) 속은 피치아 스티피티스 (Pichia stipitis) 일 수 있다. 이사첸키아 (Issatchenkia) 속은 이사첸키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis)일 수 있다. 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속은 데바리오마이세스 한세니 (Debaryomyces hansenii)일 수 있다. 자이고사카로마이세스 속은 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailli) 또는 자이고사카로마이세스 룩시이 (Zygosaccharomyces rouxii)일 수 있다. 쉬조사카로마이세스 속은 쉬조사카로마이세스 크리오필러스 (S. cryophilus), 쉬조사카로마이세스 자포니쿠스 (S. japonicus), 쉬조사카로마이세스 옥토스포루스 (S. octosporus) 또는 쉬조사카로마이세스 폼베 (S. pombe)일 수 있다.
또한, 상기 효모 세포는 천연 효모 세포뿐만 아니라, 락테이트와 같은 원하는 산물을 생산하기 위한 변이 효모 세포도 포함할 수 있다. 이러한 변이 효모 세포는 예를 들면, 우라실, 설파구아니딘, 설파티아졸, 아자세린, 트리메토프림, 또는 모노플루오로아세테이트에 대하여 내성을 가질 수 있다.
상기 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트의 옥살로아세테이트로의 마그네슘-ATP 의존성 카르복실화 및 비오틴(biotin) 의존성 카르복실화 반응을 촉매할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 하나의 ATP 소비에 의해 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 6.4.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 사카로마이세스 속에서 2 개의 피루베이트 카르복실라제 동종효소(pyruvate carboxylase isoenzyme) (PYC1 및 PYC2)일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 1 (GenBank ID: NP_011453.1) 및/또는 서열번호 2(GenBank ID: NP_009777.1)의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 2 개의 피루베이트 카르복실라제는 별개의 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상기 유전자는 각각 서열번호 3 (GI Number: 6321376) 및/또는 서열번호 4(GI Number: 63196950)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase: PYC)를 코딩하는 pyc1 또는 pyc2일 수 있다. 상기 PYC1, PYC2, 또는 그의 조합의 유전자의 발현 조절 서열의 변형은 모균주의 프로모터인 PPYC1 및 PPYC2에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터로 교체하는 것일 수 있다. 상기 발현 수준이 낮은 프로모터는 예를 들면 LEUM 프로모터 (Pleum) 또는 cyc1 프로모터 (Pcyc1), 그의 변이체일 수 있다. 반면에, 모균주의 프로모터인 PPYC1 및 PPYC2에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터는 예를 들면 TEF1, GPC 프로모터, 또는 GAL 프로모터일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1 또는 pdc2일 수 있다. 일례로 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 NAD(P)H의 NAD(P)+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 EC 1.1.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: Gpd1)일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gpd1일 수 있다.
상기 효모 세포는 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 EC. 1.6.5.9 또는 EC. 1.6.5.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 유형 Ⅱ NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 (type Ⅱ NADH:ubiquinone oxidoreductase)일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 세포막 (cytoplasm)을 향하는 내부 미토콘드리아막의 외부면에 위치한 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH (cytosolic NADH)의 NAD+로의 산화를 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 해당과정에 의해 형성된 시토졸 NADH의 재산화시키는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH를 미토콘드리아 호흡 연쇄 (mitochondrial respiratory chain)에 제공하는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 Nde1, Nde2, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 미토콘드리아 내부에 위치하여 작용하는 인터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (internal mitochondral NADH dehydrogenase) NDI1과 구별되는 것일 수 있다. 상기 NDE1 및 NDE2는 각각 서열번호 11 및 12의 아미노산 서열과 각각 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 NDE1을 코딩하는 유전자 및 상기 NDE2를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 효모 세포에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다.
상기 발현의 증가는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자는 외인성 유전자일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 동종성(homologous) 또는 이종성(heterogenous)일 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 외인성 유전자는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터의 다운스트림 위치(downstream position)에 도입될 수 있다. 또한, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 게놈에 포함될 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. 상기 L-락테이트 데히드로게나제 또는 D-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 또는 그의 염을 생산할 수 있다.
락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 도입된 유전자에 의하여 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가될 수 있다.
상기 효모 세포는 단일 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 1 내지 10 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자와 같은 복수의 유전자를 포함할 수 있다. 상기 복수의 유전자는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 경우, 각각의 유전자는 동일한 유전자의 카피이거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다. 상기 외인성 락테이트 데히드로게나제는 효모 세포의 내인성 락테이트 데히드로게나제보다 활성이 좋은 것일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 또는 개구리(Xenopus laevis)로부터 선택되는 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 15, 16, 17, 및 18의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 LDH를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, ADH 프로모터, 및 CCW12 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, ADH 프로모터, 및 CCW12 프로모터는 각각 서열번호 21, 22, 23, 24, 및 73 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소되어 있는 효모 세포로서, 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열이 모균주의 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터로 교체되고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 또는 그 조합이 불활성화되거나 감소되어 있고, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것일 수 있다. 상기 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트 카르복실라제 1(PYC1), 피루베이트 카르복실라제 2(PYC2), 또는 그의 조합일 수 있다
상기 효모 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있는 효모 세포로서, 상기 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드 중 하나인 PYC1의 활성의 감소는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열이 모균주의 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터로 교체되고, 상기 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드 중 하나인 PYC2의 활성의 불활성화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체가 치환, 부가 또는 결실되어 있고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 또는 그 조합이 불활성화되거나 감소되어 있고, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있지 않은 모균주(parent cell)에 비하여, 약 4.5 내지 약 15%, 약 5 내지 약 15%, 약 6 내지 약 15%, 약 7.5 내지 약 15%, 약 8 내지 약 15%, 약 8 내지 약 14%, 또는 약 8 내지 약 13.8% 이상의 증가된 수율로 락테이트를 생산할 수 있다. 또한, 상기 세포는 소비된 글루코스 대비 생산된 락테이트의 비율인 약 45.5 내지 약 51% 이상 또는 약 45.5% 내지 약 50.5%의 수율로 락테이트를 생산할 수 있다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 호기성 또는 혐기성 조건에서 배양될 수 있다. 일례로, 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양한 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 혐기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%일 수 있다. 발효액의 pH는 2 에서 7 범위로 유지되도록 조절할 수 있다.
본 발명의 효모 세포는 연속, 반연속식, 배치식 또는 이들의 조합의 방식으로 배양될 수 있다.
용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 또는 무기질소화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 분리는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 락테이트 생산능을 가진 효모 세포의 락테이트 생산 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 3은 pUC57-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 5는 pUC19-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
도 6은 pUC19-CCW12p-LDH-His3 벡터를 나타내는 도면이다.
도 7은 pUC19-Trp1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 8은 pUC19-Leu2 벡터를 나타내는 도면이다.
도 9는 pUC19-Trp1-Pleum 벡터를 나타내는 도면이다.
도 10은 pUC19-Trp1-Pcyc1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 11은 pUC19-Leu2-Pleum 벡터를 나타내는 도면이다.
도 12는 pUC19-Leu2-Pcyc1 벡터를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작 및 발현 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (MAT α ura3 -52; trp1 -289; leu2 -3,112; his3 ㅿ 1; MAL2 -8 C ; SUC2 , EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 이용하여, 주요 부산물인 에탄올과 글리세롤 생산 경로 차단을 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase2: cyb2) 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.
(1.1) L- LDH 과발현 벡터 및 pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화 벡터의 제조
(1.1.1) L- LDH 과발현 벡터 제조
L-ldh 과발현을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 26과 27의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 CCW12 프로모터 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 GPD 프로모터를 절단한 p416-GPD (http://www.atcc.org/products/all/87360.aspx)에 도입하여 p416-CCW12p을 제작하였다.
그 후, 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh(서열번호 19)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 28과 29의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 L-ldh 발현 벡터인 p416-CCW12p-LDH을 제작하였다.
또한, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 20의 효모 자가복제 서열/효모 동원체 서열, 서열번호 21의 CYC 프로모터, 서열번호 73의 CCW12 프로모터, 및 서열번호 25의 CYC1 터미네이터를 갖고, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 19의 일본 자라 유래의 L-ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다.
도 2는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터에 일본 자라 유래의 LDH가 도입되어 있다.
(1.1.2) 유전자 교환 벡터 제조
pdc1, cyb2, gpd1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하는 동시에 L-ldh 유전자를 삽입하기 위하여 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 3은 pUC57-ura3HA (Genetics 116: 541-545, August, 1987) 벡터를 나타내는 도면이다. 도 4는 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 30과 31의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC57-ura3HA 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 제작하였다.
pdc1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 32와 33의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 pdc1 유전자 결실카세트를 제작하였다.
cyb2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 34와 35의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 cyb2 유전자 결실카세트를 제작하였다.
gpd1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 36과 37의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 gpd1 유전자 결실카세트를 제작하였다.
(1.2) pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 pdc1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
pdc1 유전자 제거를 위해, 실시예 1.1.2에서 제작된 PDC1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 pdc1 결실을 확인하기 위해 서열번호 38과 39의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 pdc1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh+ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 상기 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh+ura3) 균주 제작을 위해 도입된 PDC1 결실 카세트의 선별 마커인 URA3 유전자를 다음과 같이 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1+ldh)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix, 1 ㎍/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 38과 39의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)을 수득하였다.
상기 pdc1 유전자 제거와 같은 방법으로 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh)에서 cyb2가 결실된 변이균주를 제작하였다.
cyb2 유전자 제거를 위해, 리튬 아세테이트 용액에 재현탁된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)에 상기 pdc1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1,1,2에서 제작된 cyb2 결실 카세트를 도입하고 플레이트에 형성된 10개 콜로니를 선별하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 cyb2 결실을 확인하기 위해, 서열번호 40과 41의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 cyb2 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh +ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh +ura3)로부터 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법과 동일한 방법으로 제거하였다. 플레이트에 형성된 10개 콜로니를 선별하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 40과 41의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldhㅿcyb2::ldh)을 수득하였다.
상기 pdc1 유전자 제거와 같은 방법으로 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldhㅿcyb2::ldh)에서 gpd1이 결실된 변이균주를 제작하였다.
gpd1 유전자 제거를 위해, 리튬 아세테이트 용액에 재현탁된 사카로마이세스 세레비지애 (ㅿpdc1::ldhㅿcyb2::ldh)에 상기 pdc1 및 cyb2 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.1.2에서 제작된 gpd1 결실 카세트를 도입하고, 플레이트에 형성된 10개 콜로니를 선별하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 gpd1 결실을 확인하기 위해 서열번호 42와 43의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 gpd1 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh +ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh +ura3)로부터 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 또한 플레이트에 형성된 10개 콜로니를 선별하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 42와 43의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh)을 수득하였다.
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh)를 2013년 5월 30일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12415BP호를 부여받았다.
(1.3) LDH 강화
상기 KCTC12415BP호에 산화 환원 밸런스 (redox balance) 강화 또는 해당과정 경로 조작 (glycolysis pathway engineering)과 같은 락테이트의 생산 증가를 위하여 추가 조작 및 락테이트 생산 경로의 강화를 위해 L-ldh를 게놈 내에 추가적으로 도입할 수 있다. 그 방법은 다음과 같다.
(1.3.1) L- ldh 유전자 게놈 내 도입 벡터 제조
L-ldh의 추가 도입을 위해 유전자 도입 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 5는 HIS3 유전자를 선별마커로 이용할 수 있는 pUC19-HIS3 벡터 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100)를 나타내는 도면이다. 도 6은 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 상기의 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 30과 31의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC19-HIS3 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 제작하였다.
또한, KCTC12415BP호 균주의 게놈 내에 L-ldh 추가 도입하기 위하여, 제작된 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 주형으로 하고 서열번호 44와 45의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 TRP1 위치에 삽입하기 위한 카세트를 제작하였다.
상기 L-ldh를 포함하는 카세트는 TRP1의 유전좌에 삽입될 수 있고, 이 경우 TRP1 유전자가 결실되면서 L-ldh가 삽입될 수 있다. L-ldh 삽입 변이 균주는 다음과 같이 제작하였다.
상기 제작된 KCTC12415BP호 균주를 YPD (10 g yeast extract, 20 g peptone, 20 g 포도당) 고체 배지에 도말하여 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 10 ml에 접종하여 18 시간 동안 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 230 rpm, 30℃ 배양기에서 배양하였다.
약 4-5시간 후, OD600이 0.5 정도가 되면 4,500 rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그리고 다시 4,500 rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 15% 글리세롤이 첨가된 1M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 100 ul씩 분주하였다.
TRP1 결실과 동시에 L-ldh 발현을 위해 실시예 1.3.1에서 제작된 HIS3 유전자를 선별마커로 포함한 L-ldh 발현 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, single stranded carrier DNA와 혼합 한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 히스티딘(his) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-his))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 YSD (-his) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-his) 액체 배지에 배양해 균주로 부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, TRP1 결실을 확인하기 위해 서열번호 46과 47의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 L-ldh 발현 카세트 삽입을 확인하였다. 이렇게 얻은 균주를 CEN . PK2 -1D KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh로 명명하였다.
실시예 2. nde1 유전자 결실 카세트의 제조 및 nde1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조
(2.1) nde1 유전자 결실 카세트의 제조
nde1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 nde1 유전자의 불활성화용 벡터는 상기 실시예 1.1.2에서 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 이용하였다. Nde1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 48과 49의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde1 유전자 결실카세트를 제작하였다.
(2.2) nde1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh에서 nde1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh)를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
nde1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1, cyb2 및 gpd1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 2.1에서 제작된 nde1 유전자 결실 카세트를 상기 재현탁된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh에 도입하고, 플레이트에 형성된 10개 콜로니를 선별하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 nde1 결실을 확인하기 위해 서열번호 50과 51의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 nde1 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1+ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1+ura3)로부터 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법과 동일한 방법으로 제거하였다. 플레이트에 형성된 10개 콜로니를 선별하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 50과 51의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1)을 수득하였다.
실시예 3. pyc1 및/또는 pyc2 의 활성이 감소된 균주 제조
pyc1 및/또는 pyc2의 활성이 감소된 균주를 제조하기 위해 pyc1 및/또는 pyc2의 프로모터(Ppyc1 및 Ppyc2)를 상기 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터로 교체하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터의 일 예로 LEUM 프로모터 (Pleum), CYC1 프로모터 (Pcyc1), 또는 그의 조합을 이용하였다. LEUM 프로모터는 LEU2 프로모터의 변이체로, LEUM 프로모터가 절단된(truncate) 프로모터이다.
(3.1) P leum 및 P cyc1 단편의 준비 및 재조합 벡터의 제작
LEUM 프로모터(Pleum) (서열번호 52)를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 야생주인 CEN.PK2-1D의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였다.
Pleum를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 53 및 54의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 52℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 EcoRI으로 절단하여 DNA 단편(이하, "Pleum 카세트 1"이라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다.
또한, Pleum를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 58 및 59의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 52℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 BamHI으로 절단하여 DNA 단편(이하, "Pleum 카세트 2"라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다.
또한, CYC1 프로모터(Pcyc1) (서열번호 55)를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 야생주인 CEN.PK2-1D의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였다.
Pcyc1를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 56 및 57의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 52℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 EcoRI으로 절단하여 DNA 단편(이하, "Pcyc1 카세트 1"이라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다.
또한, Pleum를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 60 및 61의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 52℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 BamHI으로 절단하여 DNA 단편(이하, "Pcyc1 카세트 2"라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다.
pUC19-Trp1 벡터 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100) 및 수득한 Pleum 카세트 1을 제한효소 EcoRI으로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC19-Trp1-Pleum 벡터를 제작하였다. 도 7은 pUC19-Trp1 벡터를 나타내는 도면이다. 도 9는 pUC19-Trp1-Pleum 벡터를 나타내는 도면이다.
또한, pUC19-Leu2 벡터 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100) 및 수득한 Pleum 카세트 2를 제한효소 BamHI으로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC19-Leu2-Pleum 벡터를 제작하였다. 도 8은 pUC19-Leu2 벡터를 나타내는 도면이다. 도 11은 pUC19-Leu2-Pleum 벡터를 나타내는 도면이다.
후술할 Ppyc1을 Pleum로 교체하고, Ppyc2를 Pleum으로 교체한 균주를 제조하기 위해, 동일한 Pleum 카세트를 포함하고 상이한 마커를 포함하는 상기 pUC19-Trp1-Pleum 벡터와 상기 pUC19-Leu2-Pleum 벡터를 제조하였다.
pUC19-Trp1 벡터 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100) 플라스미드 및 수득한 Pcyc1 카세트 1을 제한효소 EcoRI으로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC19-Trp1-Pcyc1 벡터를 제작하였다. 도 10은 pUC19-Trp1-Pcyc1 벡터를 나타내는 도면이다.
또한, pUC19-Leu2 벡터 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100) 플라스미드 및 수득한 Pcyc1 카세트 2를 제한효소 BamHI으로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC19-Leu2-Pcyc1 벡터를 제작하였다. 도 12는 pUC19-Leu2-Pcyc1 벡터를 나타내는 도면이다.
(3.2) P pyc2 결실 카세트의 제조
Ppyc2 프로모터(Ppyc2)를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 Ppyc2 프로모터 유전자의 불활성화용 벡터는 상기 pUC57-ura3HA를 이용하였다. Ppyc2 프로모터 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 62와 63의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 Ppyc2 결실 카세트를 제작하였다.
(3.3) P leum 및 P cyc1 단편으로 pyc1 프로모터 및/또는 pyc2 프로모터가 교체된 균주의 제작
(3.3.1) pyc1 프로모터 및/또는 pyc2 프로모터의 교체 카세트 제작
Ppyc1 프로모터(Ppyc1)를 상동성 재조합 방법으로 Pcyc1 혹은 Pleum 프로모터로 교체시키기 위하여 상기 pUC19-TRP1-Pcyc1, pUC19-TRP1-Pleum을 각각 이용하였다. 상기 pUC19-TRP1-Pcyc1를 주형으로 하고 서열번호 68과 69의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 Ppyc1을 Pcyc1으로 교체할 카세트를 제작하고, pUC19-TRP1-Pleum를 주형으로 하고 서열번호 68와 70의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 Ppyc1을 Pleum으로 교체할 카세트를 제작하였다.
Ppyc2 프로모터(Ppyc2)를 상동성 재조합 방법으로 Pleum 프로모터로 교체시키기 위하여 상기 pUC19-LEU2-Pleum을 각각 이용하였다. 상기 pUC19-LEU2-Pleum를 주형으로 하고 서열번호 71과 72의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 Ppyc2을 Pleum으로 교체할 카세트를 제작하였다.
(3.3.2) Ppyc1 을 P leum 로 교체한 균주의 제작
Ppyc1을 Pleum로 교체하기 위해, 실시예 3.3.1에서 제작된 교체카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1) 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다.
상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Ppyc1의 Pleum로의 교체를 확인하기 위해 서열번호 64와 65의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 Ppyc1의 Pleum로의 교체를 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pleum)을 수득하였다.
(3.3.3) P pyc1 을 P leum 로 교체하고, P pyc2 를 P cyc1 로 교체한 균주의 제작
Ppyc1을 Pleum로 교체하고, Ppyc2를 Pcyc1로 교체하기 위해, 실시예 3.3.1에서 제작된 교체카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pleum) 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Ppyc2의 Pcyc1로의 교체를 확인하기 위해 서열번호 66과 67의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 Ppyc2의 Pcyc1로의 교체를 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::PleumㅿPpyc2::Pcyc1)을 수득하였다.
(3.3.4) P pyc1 을 P leum 로 교체하고, P pyc2 를 P leum 으로 교체한 균주의 제작
Ppyc1을 Pleum로 교체하고, Ppyc2를 Pleum으로 교체하기 위해, 실시예 3.3.1에서 제작된 교체카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::PLeum) 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Ppyc2의 Pleum으로의 교체를 확인하기 위해 서열번호 66과 67의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 Ppyc2의 Pleum으로의 교체를 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpy c1::PleumㅿPpyc2::Pleum)을 수득하였다.
(3.3.5) P pyc1 을 P cyc1 로 교체한 균주의 제작
Ppyc1을 Pcyc1로 교체하기 위해, 실시예 3.3.1에서 제작된 교체카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1) 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Ppyc1의 Pcyc1로의 교체를 확인하기 위해 서열번호 64와 65의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 Ppyc1의 Pcyc1 로의 교체를 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1)을 수득하였다.
(3.3.6) P pyc1 을 P cyc1 로 교체하고, P pyc2 를 P leum 으로 교체한 균주의 제작
Ppyc1을 Pcyc1로 교체하고, Ppyc2를 Pleum으로 교체하기 위해, 실시예 3.3.1에서 제작된 교체카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1) 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Ppyc2의 Pleum으로의 교체를 확인하기 위해 서열번호 66과 67의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 Ppyc2의 Pcyc1로의 교체를 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1ㅿPpyc2::Pleum)을 수득하였다.
(3.3.7) P pyc1 을 P cyc1 로 교체하고, P pyc2 를 결실시킨 균주의 제작
Ppyc1을 Pcyc1로 교체하고, Ppyc2를 결실시키기 위해, 실시예 3.2에서 제작된 Ppyc2 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1) 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 Ppyc2의 결실을 확인하기 위해 서열번호 66과 67의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 Ppyc2의 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1ㅿPpyc2)을 수득하였다.
실시예 4. Pyc1 및/또는 Pyc2 의 활성이 감소된 균주, 및 Pyc1 이 감소되고 Pyc2가 불활성화된 균주를 이용한 락테이트 생산
실시예 3.3.1 내지 3.3.6에서 제조된 균주들 각각을 YPD 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 40 g/L 포도당을 포함한 50 ml YPD 액체 배지에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 약 29.5시간 동안 배양하였다. 발효는 상기의 50ml의 균주 배양액내의 세포농도를 분광광도계를 이용 흡광도가 600 nm에서 5.0이 되는 양을 정량한 후 원심분리 하여 상층액을 버린 후 세포를 재현탁하여 80 g/L 포도당이 포함된 새로운 50 ml의 YPD 액체 배지에 다시 접종하여 실시하였다.
발효조건은 약 90 rpm을 유지하는 교반 배양기에서 30℃에서 24시간 이상 동안 배양하였다. 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 약 13,000 rpm에서 약 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 락테이트와 포도당의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다. 초기 플라스크에 제공된 글루코스의 양은 약 82.6 g/L이었다. 락테이트의 수율은 락테이트 생산량을 글루코스 소모량으로 나눈 값에 대한 백분율로 산출하고, 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타낸 바와 같이 KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pleum는 KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1에 비해 L-락테이트 생산성은 32.5 g/L에서 35.1 g/L로 상승하였고, 수율은 45.3%에서 49.5%로 증가하였다.
또한, KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::PLeumㅿPpyc2::Pcyc1은 KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1에 비해 락테이트 생산성은 32.5 g/L에서 37.0 g/L로 상승하였고, 수율은 45.3%에서 49.5%로 증가하였다.
또한, KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::PleumㅿPpyc2::Pleum는 KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1에 비해 L-락테이트 생산성은 32.5 g/L에서 35.9 g/L로 상승하였고, 수율은 45.3%에서 49.9%로 증가하였다.
또한, KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1은 KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1에 비해 L-락테이트 생산성은 32.5 g/L에서 35.3 g/L로 상승하였고, 수율은 45.3%에서 48.9%로 증가하였다.
또한, KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1ㅿPpyc2::Pleum는 KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1에 비해 L-락테이트 생산성은 32.5 g/L에서 35.5 g/L로 상승하였고, 수율은 45.3%에서 47.5%로 증가하였다.
또한, KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpyc1::Pcyc1ㅿPpyc2는 KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1에 비해 L-락테이트 생산성은 32.5 g/L에서 36.6 g/L로 상승하였고, 수율은 45.3%에서 45.6%로 증가하였다.
균주 OD 600 Glucose
소모 (g/L) 		L- 락테이트
생산성 (g/L) 		수율
(%)
KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1 16.0 71.7 32.5 45.3
KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1
ㅿ Ppyc1 :: P leum 		14.7 69.7 35.1 49.5
KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1
ㅿ Ppyc1 :: P leum ㅿ Ppyc2 :: Pcyc1 		16.3 74.7 37.0 49.5
KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1
ㅿ Ppyc1 :: P leum ㅿ Ppyc2 :: P leum 		15.1 71.8 35.9 49.9
KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1
ㅿ Ppyc1 :: Pcyc1 		15.2 72.2 35.3 48.9
KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1
ㅿ Ppyc1 :: Pcyc1 ㅿ Ppyc2 :: P leum 		16.3 74.8 35.5 47.5
KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1
ㅿ Ppyc1 :: Pcyc1 ㅿ Ppyc2 		17.7 80.2 36.6 45.6
실시예 5. Pyc1 및/또는 Pyc2 의 활성이 감소된 균주, 및 Pyc1 이 감소되고 Pyc2가 불활성화된 균주를 이용한 락테이트 생산
실시예 3.3.2 내지 3.3.7에서 제조된 균주 중 KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿPpy c1::PleumㅿPpyc2::Pleum를 YPD 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후, 80 g/L 포도당을 포함한 100 ml YPD에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.
발효는 상기의 100 ml의 균주 배양액을 1 L의 합성배지를 함유한 미생물 반응기에 별도로 접종하여 수행하였으며 발효 조건은 초기 60 g/L 포도당, 20 g/L 효모 추출물로 30℃로 하였다. 발효 중 pH는 5N Ca(OH)2 를 이용하여 16시간까지 pH5, 24시간까지 pH 4.5 그리고 60시간까지 pH 3.0을 유지하였고 포도당 농도가 20 g/L가 유지되도록 하였다. 추가적인 합성배지 성분은 포도당을 포함한 50 g/L K2HPO4, 10 g/L MgSO4, 0.1 g/L 트립토판, 및 0.1 g/L 히스티딘으로 구성되어 있다.
배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 추정하였으며, 발효 중 생물 반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 락테이트와 포도당의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이 KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1 ㅿPpyc1::PleumㅿPpyc2::Pleum는 KCTC12415BPㅿtrp1::ldhㅿnde1에 비해 L-락테이트 생산성은 119.8 g/L에서 122.8 g/L로 상승하였고, 수율은 57.2%에서 65.6%로 증가하였다.
균주 OD 600 L- 락테이트
생산성 (g/L) 		수율
(%)
KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1 17.2 119.8 57.2
KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1ㅿ Ppyc1 :: P Leum ㅿ Ppyc2 :: P Leum 15.1 122.8 65.6
한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Yeast cell with inactivated or depreessed pyruvate carboxylase and method of producing latate using the same <130> PN101993 <160> 73 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1178 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Gln Arg Lys Phe Ala Gly Leu Arg Asp Asn Phe Asn Leu Leu 1 5 10 15 Gly Glu Lys Asn Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Pro Ile 20 25 30 Arg Ile Phe Arg Thr Ala His Glu Leu Ser Met Gln Thr Val Ala Ile 35 40 45 Tyr Ser His Glu Asp Arg Leu Ser Thr His Lys Gln Lys Ala Asp Glu 50 55 60 Ala Tyr Val Ile Gly Glu Val Gly Gln Tyr Thr Pro Val Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Ala Ile Asp Glu Ile Ile Ser Ile Ala Gln Lys His Gln Val Asp 85 90 95 Phe Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ser Glu Phe Ala 100 105 110 Asp Lys Val Val Lys Ala Gly Ile Thr Trp Ile Gly Pro Pro Ala Glu 115 120 125 Val Ile Asp Ser Val Gly Asp Lys Val Ser Ala Arg Asn Leu Ala Ala 130 135 140 Lys Ala Asn Val Pro Thr Val Pro Gly Thr Pro Gly Pro Ile Glu Thr 145 150 155 160 Val Glu Glu Ala Leu Asp Phe Val Asn Glu Tyr Gly Tyr Pro Val Ile 165 170 175 Ile Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Val Val Arg 180 185 190 Glu Gly Asp Asp Val Ala Asp Ala Phe Gln Arg Ala Thr Ser Glu Ala 195 200 205 Arg Thr Ala Phe Gly Asn Gly Thr Cys Phe Val Glu Arg Phe Leu Asp 210 215 220 Lys Pro Lys His Ile Glu Val Gln Leu Leu Ala Asp Asn His Gly Asn 225 230 235 240 Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln 245 250 255 Lys Val Val Glu Val Ala Pro Ala Lys Thr Leu Pro Arg Glu Val Arg 260 265 270 Asp Ala Ile Leu Thr Asp Ala Val Lys Leu Ala Lys Glu Cys Gly Tyr 275 280 285 Arg Asn Ala Gly Thr Ala Glu Phe Leu Val Asp Asn Gln Asn Arg His 290 295 300 Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg Ile Gln Val Glu His Thr Ile Thr 305 310 315 320 Glu Glu Ile Thr Gly Ile Asp Ile Val Ala Ala Gln Ile Gln Ile Ala 325 330 335 Ala Gly Ala Ser Leu Pro Gln Leu Gly Leu Phe Gln Asp Lys Ile Thr 340 345 350 Thr Arg Gly Phe Ala Ile Gln Cys Arg Ile Thr Thr Glu Asp Pro Ala 355 360 365 Lys Asn Phe Gln Pro Asp Thr Gly Arg Ile Glu Val Tyr Arg Ser Ala 370 375 380 Gly Gly Asn Gly Val Arg Leu Asp Gly Gly Asn Ala Tyr Ala Gly Thr 385 390 395 400 Ile Ile Ser Pro His Tyr Asp Ser Met Leu Val Lys Cys Ser Cys Ser 405 410 415 Gly Ser Thr Tyr Glu Ile Val Arg Arg Lys Met Ile Arg Ala Leu Ile 420 425 430 Glu Phe Arg Ile Arg Gly Val Lys Thr Asn Ile Pro Phe Leu Leu Thr 435 440 445 Leu Leu Thr Asn Pro Val Phe Ile Glu Gly Thr Tyr Trp Thr Thr Phe 450 455 460 Ile Asp Asp Thr Pro Gln Leu Phe Gln Met Val Ser Ser Gln Asn Arg 465 470 475 480 Ala Gln Lys Leu Leu His Tyr Leu Ala Asp Val Ala Val Asn Gly Ser 485 490 495 Ser Ile Lys Gly Gln Ile Gly Leu Pro Lys Leu Lys Ser Asn Pro Ser 500 505 510 Val Pro His Leu His Asp Ala Gln Gly Asn Val Ile Asn Val Thr Lys 515 520 525 Ser Ala Pro Pro Ser Gly Trp Arg Gln Val Leu Leu Glu Lys Gly Pro 530 535 540 Ala Glu Phe Ala Arg Gln Val Arg Gln Phe Asn Gly Thr Leu Leu Met 545 550 555 560 Asp Thr Thr Trp Arg Asp Ala His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val 565 570 575 Arg Thr His Asp Leu Ala Thr Ile Ala Pro Thr Thr Ala His Ala Leu 580 585 590 Ala Gly Arg Phe Ala Leu Glu Cys Trp Gly Gly Ala Thr Phe Asp Val 595 600 605 Ala Met Arg Phe Leu His Glu Asp Pro Trp Glu Arg Leu Arg Lys Leu 610 615 620 Arg Ser Leu Val Pro Asn Ile Pro Phe Gln Met Leu Leu Arg Gly Ala 625 630 635 640 Asn Gly Val Ala Tyr Ser Ser Leu Pro Asp Asn Ala Ile Asp His Phe 645 650 655 Val Lys Gln Ala Lys Asp Asn Gly Val Asp Ile Phe Arg Val Phe Asp 660 665 670 Ala Leu Asn Asp Leu Glu Gln Leu Lys Val Gly Val Asp Ala Val Lys 675 680 685 Lys Ala Gly Gly Val Val Glu Ala Thr Val Cys Phe Ser Gly Asp Met 690 695 700 Leu Gln Pro Gly Lys Lys Tyr Asn Leu Asp Tyr Tyr Leu Glu Ile Ala 705 710 715 720 Glu Lys Ile Val Gln Met Gly Thr His Ile Leu Gly Ile Lys Asp Met 725 730 735 Ala Gly Thr Met Lys Pro Ala Ala Ala Lys Leu Leu Ile Gly Ser Leu 740 745 750 Arg Ala Lys Tyr Pro Asp Leu Pro Ile His Val His Thr His Asp Ser 755 760 765 Ala Gly Thr Ala Val Ala Ser Met Thr Ala Cys Ala Leu Ala Gly Ala 770 775 780 Asp Val Val Asp Val Ala Ile Asn Ser Met Ser Gly Leu Thr Ser Gln 785 790 795 800 Pro Ser Ile Asn Ala Leu Leu Ala Ser Leu Glu Gly Asn Ile Asp Thr 805 810 815 Gly Ile Asn Val Glu His Val Arg Glu Leu Asp Ala Tyr Trp Ala Glu 820 825 830 Met Arg Leu Leu Tyr Ser Cys Phe Glu Ala Asp Leu Lys Gly Pro Asp 835 840 845 Pro Glu Val Tyr Gln His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Thr Asn Leu 850 855 860 Leu Phe Gln Ala Gln Gln Leu Gly Leu Gly Glu Gln Trp Ala Glu Thr 865 870 875 880 Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Ala Asn Tyr Leu Leu Gly Asp Ile Val Lys 885 890 895 Val Thr Pro Thr Ser Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Gln Phe Met Val 900 905 910 Ser Asn Lys Leu Thr Ser Asp Asp Val Arg Arg Leu Ala Asn Ser Leu 915 920 925 Asp Phe Pro Asp Ser Val Met Asp Phe Phe Glu Gly Leu Ile Gly Gln 930 935 940 Pro Tyr Gly Gly Phe Pro Glu Pro Phe Arg Ser Asp Val Leu Arg Asn 945 950 955 960 Lys Arg Arg Lys Leu Thr Cys Arg Pro Gly Leu Glu Leu Glu Pro Phe 965 970 975 Asp Leu Glu Lys Ile Arg Glu Asp Leu Gln Asn Arg Phe Gly Asp Val 980 985 990 Asp Glu Cys Asp Val Ala Ser Tyr Asn Met Tyr Pro Arg Val Tyr Glu 995 1000 1005 Asp Phe Gln Lys Met Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Leu Ser Val Leu Pro 1010 1015 1020 Thr Arg Ser Phe Leu Ser Pro Leu Glu Thr Asp Glu Glu Ile Glu Val 1025 1030 1035 1040 Val Ile Glu Gln Gly Lys Thr Leu Ile Ile Lys Leu Gln Ala Val Gly 1045 1050 1055 Asp Leu Asn Lys Lys Thr Gly Glu Arg Glu Val Tyr Phe Asp Leu Asn 1060 1065 1070 Gly Glu Met Arg Lys Ile Arg Val Ala Asp Arg Ser Gln Lys Val Glu 1075 1080 1085 Thr Val Thr Lys Ser Lys Ala Asp Met His Asp Pro Leu His Ile Gly 1090 1095 1100 Ala Pro Met Ala Gly Val Ile Val Glu Val Lys Val His Lys Gly Ser 1105 1110 1115 1120 Leu Ile Lys Lys Gly Gln Pro Val Ala Val Leu Ser Ala Met Lys Met 1125 1130 1135 Glu Met Ile Ile Ser Ser Pro Ser Asp Gly Gln Val Lys Glu Val Phe 1140 1145 1150 Val Ser Asp Gly Glu Asn Val Asp Ser Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu 1155 1160 1165 Glu Asp Gln Val Pro Val Glu Thr Lys Ala 1170 1175 <210> 2 <211> 1180 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Ser Ser Ser Lys Lys Leu Ala Gly Leu Arg Asp Asn Phe Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gly Glu Lys Asn Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Pro 20 25 30 Ile Arg Ile Phe Arg Ser Ala His Glu Leu Ser Met Arg Thr Ile Ala 35 40 45 Ile Tyr Ser His Glu Asp Arg Leu Ser Met His Arg Leu Lys Ala Asp 50 55 60 Glu Ala Tyr Val Ile Gly Glu Glu Gly Gln Tyr Thr Pro Val Gly Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Asp Glu Ile Ile Glu Ile Ala Lys Lys His Lys Val 85 90 95 Asp Phe Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ser Glu Phe 100 105 110 Ala Asp Lys Val Val Lys Ala Gly Ile Thr Trp Ile Gly Pro Pro Ala 115 120 125 Glu Val Ile Asp Ser Val Gly Asp Lys Val Ser Ala Arg His Leu Ala 130 135 140 Ala Arg Ala Asn Val Pro Thr Val Pro Gly Thr Pro Gly Pro Ile Glu 145 150 155 160 Thr Val Gln Glu Ala Leu Asp Phe Val Asn Glu Tyr Gly Tyr Pro Val 165 170 175 Ile Ile Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Val Val 180 185 190 Arg Glu Gly Asp Asp Val Ala Asp Ala Phe Gln Arg Ala Thr Ser Glu 195 200 205 Ala Arg Thr Ala Phe Gly Asn Gly Thr Cys Phe Val Glu Arg Phe Leu 210 215 220 Asp Lys Pro Lys His Ile Glu Val Gln Leu Leu Ala Asp Asn His Gly 225 230 235 240 Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His 245 250 255 Gln Lys Val Val Glu Val Ala Pro Ala Lys Thr Leu Pro Arg Glu Val 260 265 270 Arg Asp Ala Ile Leu Thr Asp Ala Val Lys Leu Ala Lys Val Cys Gly 275 280 285 Tyr Arg Asn Ala Gly Thr Ala Glu Phe Leu Val Asp Asn Gln Asn Arg 290 295 300 His Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg Ile Gln Val Glu His Thr Ile 305 310 315 320 Thr Glu Glu Ile Thr Gly Ile Asp Ile Val Ser Ala Gln Ile Gln Ile 325 330 335 Ala Ala Gly Ala Thr Leu Thr Gln Leu Gly Leu Leu Gln Asp Lys Ile 340 345 350 Thr Thr Arg Gly Phe Ser Ile Gln Cys Arg Ile Thr Thr Glu Asp Pro 355 360 365 Ser Lys Asn Phe Gln Pro Asp Thr Gly Arg Leu Glu Val Tyr Arg Ser 370 375 380 Ala Gly Gly Asn Gly Val Arg Leu Asp Gly Gly Asn Ala Tyr Ala Gly 385 390 395 400 Ala Thr Ile Ser Pro His Tyr Asp Ser Met Leu Val Lys Cys Ser Cys 405 410 415 Ser Gly Ser Thr Tyr Glu Ile Val Arg Arg Lys Met 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240 ttggccattg acgaaatcat ttccattgcc caaaaacacc aggtagattt catccatcca 300 ggttatgggt tcttgtctga aaattcggaa tttgccgaca aagtagtgaa ggccggtatc 360 acttggattg gccctccagc tgaagttatt gactccgtgg gtgataaggt ctcagctaga 420 aacctggcag caaaagctaa tgtgcccacc gttcctggta caccaggtcc tatagaaact 480 gtagaggaag cacttgactt cgtcaatgaa tacggctacc cggtgatcat taaggccgcc 540 tttggtggtg gtggtagagg tatgagagtc gttagagaag gtgacgacgt ggcagatgcc 600 tttcaacgtg ctacctccga agcccgtact gccttcggta atggtacctg ctttgtggaa 660 agattcttgg acaagccaaa gcatattgaa gttcaattgt tggccgataa ccacggaaac 720 gtggttcatc ttttcgaaag agactgttcc gtgcagagaa gacaccaaaa ggttgtcgaa 780 gtggccccag caaagacttt accccgtgaa gtccgtgacg ccattttgac agatgcagtt 840 aaattggcca aagagtgtgg ctacagaaat gcgggtactg ctgaattctt ggttgataac 900 caaaatagac actatttcat tgaaattaat ccaagaatcc aagtggaaca taccatcaca 960 gaagaaatta ccggtataga tattgtggcg gctcagatcc aaattgcggc aggtgcctct 1020 ctaccccagc tgggcctatt ccaggacaaa attacgactc gtggctttgc cattcagtgc 1080 cgtattacca cggaagaccc tgctaagaac ttccaaccag ataccggtag aatagaagtg 1140 taccgttctg caggtggtaa tggtgttaga ctggatggtg gtaacgccta tgcaggaaca 1200 ataatctcac ctcattacga ctcaatgctg gtcaaatgct catgctccgg ttccacctac 1260 gaaatcgttc gtagaaaaat gattcgtgca ttaatcgagt tcagaattag aggtgtcaag 1320 accaacattc ccttcctatt gactcttttg accaatccag tatttattga gggtacatac 1380 tggacgactt ttattgacga caccccacaa ctgttccaaa tggtttcatc acaaaacaga 1440 gcccaaaaac ttttacatta cctcgccgac gtggcagtca atggttcatc tatcaagggt 1500 caaattggct tgccaaaatt aaaatcaaat ccaagtgtcc cccatttgca cgatgctcag 1560 ggcaatgtca tcaacgttac aaagtctgca ccaccatccg gatggaggca agtgctacta 1620 gaaaaggggc cagctgaatt tgccagacaa gttagacagt tcaatggtac tttattgatg 1680 gacaccacct ggagagacgc tcatcaatct ctacttgcaa caagagtcag aacccacgat 1740 ttggctacaa tcgctccaac aaccgcacat gcccttgcag gtcgtttcgc cttagaatgt 1800 tggggtggtg ccacattcga tgttgcaatg agatttttgc atgaggatcc atgggaacgt 1860 ttgagaaaat taagatctct ggtgcctaat attccattcc aaatgttatt gcgtggtgcc 1920 aatggtgtgg 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tggctaattc tttggatttc cctgactctg ttatggattt cttcgaaggc 2820 ttaatcggcc aaccatatgg tgggttccca gaaccattta gatcagacgt tttaaggaac 2880 aagagaagaa agttgacttg tcgtccaggc ctggaactag agccatttga tctcgaaaaa 2940 attagagaag acttgcagaa tagatttggt gatgttgatg agtgcgacgt tgcttcttat 3000 aacatgtacc caagagttta tgaagacttc caaaagatga gagaaacgta tggtgattta 3060 tctgtattgc caacaagaag ctttttgtct ccactagaga ctgacgaaga aattgaagtt 3120 gtaatcgaac aaggtaaaac gctaattatc aagctacagg ctgtgggtga tttgaacaaa 3180 aagaccggtg aaagagaagt ttactttgat ttgaatggtg aaatgagaaa aattcgtgtt 3240 gctgacagat cacaaaaagt ggaaactgtt actaaatcca aagcagacat gcatgatcca 3300 ttacacattg gtgcaccaat ggcaggtgtc attgttgaag ttaaagttca taaaggatca 3360 ctaataaaga agggccaacc tgtagccgta ttaagcgcca tgaaaatgga aatgattata 3420 tcttctccat ccgatggaca agttaaagaa gtgtttgtct ctgatggtga aaatgtggac 3480 tcttctgatt tattagttct attagaagac caagttcctg ttgaaactaa ggcatga 3537 <210> 4 <211> 3543 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgagcagta gcaagaaatt 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caacaagagt cagaacccac 1740 gatttggcta caatcgctcc aacaaccgca catgcccttg caggtgcttt cgctttagaa 1800 tgttggggtg gtgctacatt cgacgttgca atgagattct tgcatgagga tccatgggaa 1860 cgtctgagaa aattaagatc tctggtgcct aatattccat tccaaatgtt attacgtggt 1920 gccaacggtg tggcttactc ttcattacct gacaatgcta ttgaccattt tgtcaagcaa 1980 gccaaggata atggtgttga tatatttaga gtttttgatg ccttgaatga tttagaacaa 2040 ttaaaagttg gtgtgaatgc tgtcaagaag gccggtggtg ttgtcgaagc tactgtttgt 2100 tactctggtg acatgcttca gccaggtaag aaatacaact tagactacta cctagaagtt 2160 gttgaaaaaa tagttcaaat gggtacacat atcttgggta ttaaggatat ggcaggtact 2220 atgaaaccgg ccgctgccaa attattaatt ggctccctaa gaaccagata tccggattta 2280 ccaattcatg ttcacagtca tgactccgca ggtactgctg ttgcgtctat gactgcatgt 2340 gccctagcag gtgctgatgt tgtcgatgta gctatcaatt caatgtcggg cttaacttcc 2400 caaccatcaa ttaatgcact gttggcttca ttagaaggta acattgatac tgggattaac 2460 gttgagcatg ttcgtgaatt agatgcatac tgggccgaaa tgagactgtt gtattcttgt 2520 ttcgaggccg acttgaaggg accagatcca gaagtttacc 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<211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile Leu Ala Ala 50 55 60 Thr Ser Ser Val Ala Tyr Leu Asn Trp His Asn Gly Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Pro Lys Leu Asp Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val 85 90 95 Ala Lys His Asn Lys Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asn Gly Tyr 100 105 110 Val Tyr Asp Leu Thr Arg Phe Leu Pro Asn His Pro Gly Gly Gln Asp 115 120 125 Val Ile Lys Phe Asn Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Glu Pro 130 135 140 Leu His Ala Pro Asn Val Ile Asp Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Pro Leu Gln Gly Ser Met Pro Pro Glu Leu Val Cys Pro Pro 165 170 175 Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Lys Glu Asp Ile Ala Arg Lys Glu Gln Leu 180 185 190 Lys Ser Leu Leu Pro Pro Leu Asp Asn Ile 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gctaggtcca tacaccgttt caagatgacc 60 cagatctcta aacctttttt ccattccact gaagttggta agcccggacc acagcagaag 120 ctatcgaaat cttacactgc ggtattcaag aaatggtttg tcagaggttt aaagttaacc 180 ttttacacga cgttggccgg cacattgtat gtgtcatacg agctgtacaa agaatcgaac 240 ccacccaaac aggttcccca atcgaccgct tttgctaatg gtttgaaaaa gaaggagctg 300 gttattttgg gtacaggctg gggcgccata tctcttttga agaaattaga cacgtctttg 360 tataacgtga ccgtggtgtc gccaagaagc ttctttttgt tcacaccgtt attaccctca 420 acgcctgtgg gtacgataga gatgaagtct attgtcgaac cggttagatc gatcgctaga 480 agaacgcctg gagaagttca ctacattgag gcggaagcgt tggacgttga tccaaaggcc 540 aaaaaagtaa tggtgcaatc ggtgtcagag gacgaatatt tcgtttcgag cttaagttac 600 gattatcttg ttgttagtgt aggcgctaaa accactactt ttaacattcc cggggtctat 660 ggcaatgcta acttcttgaa agagattgaa gatgctcaaa atattcgtat gaagttaatg 720 aaaaccatag aacaggcaag ttcatttcct gtgaacgatc cggaaaggaa gcgattatta 780 acgttcgtgg ttgttggagg gggccctacg ggggttgaat ttgccgccga actgcaagat 840 tacatcaatc aagatttgag gaagtggatg cccgacttaa gtaaagaaat gaaggttatc 900 ttaattgaag ccctgcctaa tatcctaaac atgttcgata agacgttgat caagtatgcc 960 gaggaccttt ttgccagaga tgaaattgac ttgcaagtga atactgccgt gaaagtcgta 1020 gagccaacct atatacgcac tctgcaaaac ggccaaacaa acacggatat cgaatacggg 1080 atgctggttt gggccacggg aaatgaacca atcgattttt caaagacact gatgagtaga 1140 ataccggagc aaactaatag gcgtggtctg ttaattaatg acaagttgga gcttctcggt 1200 tctgagaatt cgatttatgc aattggtgat tgtaccgcac acacgggttt ctttcccacg 1260 gcacaagttg cacatcagga aggcgaatac ttggccaaga tcttggataa aaaattacag 1320 atagaacaat tggaatggga catgctcaac agtaccgatg aaactgaggt atcacgtcta 1380 caaaaagagg ttaatttgag gaaatctaag ttggataagt tcaactacaa gcatatgggt 1440 gcccttgcgt acatcggctc tgaaaccgca attgcagatt tgcatatggg cgactcatca 1500 taccagttga aaggtatgtt tgccttcttg ttttggaaat ccgcttattt ggccatgtgt 1560 ctctctatca ggaataggat tttaattgcc atggactgga ccaaagttta ctttcttgga 1620 agggattcct ccgtgtag 1638 <210> 15 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 15 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln 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Sequence <220> <223> CYC1 terminator <400> 25 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgcgg cc 252 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 26 cgagctcttc gcggccacct acgccgctat c 31 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 27 gctctagata ttgatatagt gtttaagcga at 32 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 28 ggatccatgt ccgtaaagga actact 26 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 29 acgcgtcgac ttaaaactgc aattcctttt gaat 34 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 30 gagctcaatt aaccctcact aaaggg 26 <210> 31 <211> 26 <212> 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Claims (15)

  1. 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있는 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 피루베이트 카르복실라제 1(PYC1), 피루베이트 카르복실라제 2(PYC2), 또는 그의 조합인 것인 효모 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제 1, 피루베이트 카르복실라제 2는 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제 1를 코딩하는 유전자, 상기 피루베이트 카르복실라제 2를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 치환, 부가 또는 결실, 유전자 발현 조절 서열의 변형, 발현 감소 조절 관련 유전자의 증폭, 발현 증가 조절 관련 유전자의 결실, 또는 유전자의 카피수 감소에 의한 것인 효모 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 모균주의 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터를 포함하는 것인 효모 세포.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 프로모터가 LEUM 프로모터 CYC1프로모터, TEF1 프로모터, GPC 프로모터, 및 GAL 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 각각 서열번호 5, 7, 9, 및 11의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 6, 8, 10, 및 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
  12. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것인 효모 세포.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 하나의 효모 세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 배양은 혐기 조건에서 수행되는 것인 방법.
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