KR20150066467A

KR20150066467A - 당쇄 분석을 통한 자궁경부암 진단 방법

Info

Publication number: KR20150066467A
Application number: KR1020140172689A
Authority: KR
Inventors: 김홍진; 김형진; 김승철; 김윤환; 주웅
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2015-06-16
Also published as: KR101747500B1

Abstract

본 발명은 자궁경부암 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 자궁 경부 조직의 세포 내 당질의 분석을 통해 자궁경부암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 자궁경부암 조직 내 단백질의 sialylation 및 fucosylation 레벨이 암화에 따라 현저하게 감소되는 것으로 나타나 기존 문헌들에 나타난 당질 변화와 상반된 결과를 나타내는바, 정상인과 자궁경부암 환자를 높은 수준의 민감도와 특이도로 구분할 수 있어, 피검체의 시료로부터 자궁경부암을 간단하면서 신속하고 정확하게 진단할 수 있다. 또한, pap semar test 시료의 세포 내 단백질은 자궁경부암의 중증도가 올라감에 따라 sialylation, galactosylation 및 mannosylation 레벨이 증가한 반면, fucosylation 레벨이 감소하는 특징을 보여 자궁경부의 암 진행도를 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 제시한 세포 내 단백질의 당쇄 분석 기술을 임상에 적용할 경우 암 진단의 정확도를 크게 향상 시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

당쇄 분석을 통한 자궁경부암 진단 방법{Diagnosis of cervical cancer using glycosylation analysis}

본 발명은 자궁경부암 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 자궁 경부 조직의 세포 내 당질의 분석을 통해 자궁경부암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

자궁경부암은 전세계 여성 사망의 주요 원인으로 인유두종바이러스(human papillomavirus) 감염에 의해 발병하는 것으로 알려져 있다. 매년 50만명의 여성이 자궁경부암으로 진단받고 있으며 25만명의 여성이 자궁경부암으로 사망한다. 인유두종바이러스 감염은 20-24세 여성에서 가장 빈번하게 발견된다(44.8%의 감염율)(M. Steben, E. Duarte-Franco, Human papillomavirus infection: epidemiology and pathophysiology, Gynecol Oncol 107 (2007) S2-5.). 대부분의 인유두종바이러스 감염은 자연적으로 사라지지만 감염이 만성적으로 지속될 경우 12-15년에 걸쳐 암으로 발전할 수 있다(P.J. Snijders, R.D. Steenbergen, D.A. Heideman, C.J. Meijer, HPV-mediated cervical carcinogenesis: concepts and clinical implications, Journal of Pathology 208 (2006) 152-164.). 인유두종바이러스의 E6, E7 단백질은 자궁경부 상피세포의 유전적 불안정과 세포주기 교란을 일으키며 이러한 세포의 변형은 상피세포의 불멸성(immortalization)을 초례하여 암 발병에 이르게 한다. Pap test는 여성 자궁 세포의 변이 여부를 진단하기 위해 50년 이상 사용되고 있는 진단법이다. Pap test에서 세포 이상이 발견되면 colposcopy 및 조직검사를 수행하여 암 발병 여부를 구체적으로 진단하게 된다.

자궁경부암의 조기 진단 및 인유두종바이러스 감염 예방을 위한 백신의 접종은 자궁경부암의 발병을 낮추기 위해 가장 중요한 요소로 인식되고 있다. Pap test를 통한 세포 검사법의 도입은 자궁경부암의 발병을 크게 낮추는데 공헌해 왔다(X.W. Jin, A. Sikon, B. Yen-Lieberman, Cervical cancer screening: Less testing, smarter testing, Cleve Clin J Med 78 (2011) 737-747.). 이러한 Pap test시행의 성공에도 불구하고 암 진단에 대한 낮은 민감도는 여전히 큰 문제로 남아 있다. Pap test와 같은 세포 검사 방법 외 분자진단 기술을 이용한 다양한 검사법이 꾸준히 제시되어 왔다. 세포 내 Ki-67, p16의 발현율 증가는 자궁조직의 암화와 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다(M.Y. Maeda, M. Simoes, A. Wakamatsu, A.L. Longatto Filho, M. Oyafuso, E.S. de Mello, M.M. Otta, V.A. Alves, Relevance of the rates of PCNA, Ki-67 and p53 expression according to the epithelial compartment in cervical lesions, Pathologica 93 (2001) 189-195; T. Sano, T. Oyama, K. Kashiwabara, T. Fukuda, T. Nakajima, Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions, American Journal of Pathology 153 (1998) 1741-1748.). 이밖에도 mini chromosome maintenance protein, cell division cycle protein 6, squamous cell carcinoma antigen등이 자궁경부암 진단을 위한 주요 마커로 알려져 있다(J.H. Shin, B. Grabowski, R. Kasiviswanathan, S.D. Bell, Z. Kelman, Regulation of minichromosome maintenance helicase activity by Cdc6, J Biol Chem 278 (2003) 38059-38067; J.G. Cook, C.H. Park, T.W. Burke, G. Leone, J. DeGregori, A. Engel, J.R. Nevins, Analysis of Cdc6 function in the assembly of mammalian prereplication complexes, Proc Natl Acad Sci U S A 99 (2002) 1347-1352.; J.M. Duk, H.W. de Bruijn, K.H. Groenier, H. Hollema, K.A. ten Hoor, M. Krans, J.G. Aalders, Cancer of the uterine cervix: sensitivity and specificity of serum squamous cell carcinoma antigen determinations, Gynecol Oncol 39 (1990) 186-194.).

당쇄 구조의 변화는 질병의 진행 및 암의 진행과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다(H.J. An, C.B. Lebrilla, A glycomics approach to the discovery of potential cancer biomarkers, Methods Mol Biol 600 (2010) 199-213.; A.D. Taylor, W.S. Hancock, M. Hincapie, N. Taniguchi, S.M. Hanash, Towards an integrated proteomic and glycomic approach to finding cancer biomarkers, Genome Medicine 1 (2009).). 현재까지 축적된 연구 결과에 따르면 암화가 진행됨에 따라 암 세포 표면 및 혈액 내 당질(glycoconjugates)에서 sialylation 및 fucosylation이 증가되는 것으로 알려져 있다고 보고되고 있다(J. Zhu, Y. Wang, Y. Yu, Z. Wang, T. Zhu, X. Xu, H. Liu, D. Hawke, D. Zhou, Y. Li, Aberrant fucosylation of glycosphingolipids in human hepatocellular carcinoma tissues, Liver Int (2013).; A. Passaniti, G.W. Hart, Cell-Surface Sialylation and Tumor-Metastasis - Metastatic Potential of B-16 Melanoma Variants Correlates with Their Relative Numbers of Specific Penultimate Oligosaccharide Structures, Journal of Biological Chemistry 263 (1988) 7591-7603.). 또한 이러한 당질의 변화는 암의 tumorigenicity, invasiveness, metastatic ability와도 밀접한 연관이 있다(U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.).

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자들은 단백질 및 핵산 마커를 이용한 종래의 방법과 달리, 자궁경부 조직 세포 내 단백질의 sialylation 및 fucosylation 수준을 조사하여 암화(carcinogenesis) 여부를 판별하고자 연구 노력한 결과, 자궁경부 조직 내 단백질의 sialylation 및 fucosylation 레벨이 암화에 따라 현저하게 감소되는 것으로 나타나 기존 문헌들에 나타난 당질 변화와 상반된 결과를 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은

(1) 피검체 시료를 파쇄하고 원심분리하여 세포 내 단백질을 분리하는 단계;

(2) 상기 분리된 세포 내 단백질에 렉틴을 가하여 결합시키는 단계;

(3) 상기 렉틴과 결합하는 상기 세포 내 단백질의 수준(level)을 측정하여 정상대조군 시료로부터 분리한 세포 내 단백질의 렉틴 결합 수준과 비교하는 단계; 및

(4) 정상대조군에 비하여 상기 렉틴과 결합하는 상기 세포 내 단백질의 수준이 감소 또는 증가되는 경우 자궁 경부암으로 판정하는 단계를 포함하는 자궁경부암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 바이오틴 표지된 렉틴 및 스트렙타비딘-결합 발색효소를 포함하는 자궁경부암 진단 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은,

(4) 정상대조군에 비하여 상기 렉틴과 결합하는 상기 세포 내 단백질의 수준이 감소 또는 증가되는 경우 자궁 경부암으로 판정하는 단계를 포함하는 자궁경부암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 감소는 상기 단계 (1)에서의 시료가 자궁 경부 조직인 경우일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 증가는 상기 단계 (1)에서의 시료가 팹 스메어(Pap smear) 또는 자궁 경부 브러쉬(brush)-채취 시료인 경우일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (2)에서, 상기 렉틴은 시알산(sialic acid), 푸코오스(fucose), 갈락토오스(galactose) 또는 만노오스(mannose)와 결합할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 렉틴은 SNA(Sambucus Nigra Lectin), ConA(Concanavalin A), RCA(Ricinus communis Agglutinin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (2)에서, 상기 렉틴은 바이오틴(biotin)으로 표지된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (3)에서의 측정은 SDS-PAGE, ELLA(enzyme-linked lectin assay), 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 조합을 통해 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 바이오틴 표지된 렉틴 및 스트렙타비딘-결합 발색효소를 포함하는, 자궁경부암 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 렉틴은 SNA(Sambucus Nigra Lectin), ConA(Concanavalin A), RCA(Ricinus communis Agglutinin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 형광염료 (fluorescence dye) 및 루시페라제(luciferase)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따르면, 피검체 시료가 자궁경부암 조직인 경우, 자궁경부암 조직 내 단백질의 sialylation 및 fucosylation 레벨이 암화에 따라 현저하게 감소되는 것으로 나타나 기존 문헌들에 나타난 당질 변화와 상반된 결과를 나타내는바, 정상인과 자궁경부암 환자를 높은 수준의 민감도와 특이도로 구분할 수 있어, 피검체의 시료로부터 자궁경부암을 간단하면서 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에서 제시한 세포 내 단백질의 당쇄 분석 기술을 임상에 적용할 경우 암 진단의 정확도를 크게 향상 시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 자궁경부 정상 조직(N)과 암조직(C) 세포 내 단백질을 SDS-PAGE와 lectin blot으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(A. SDS-PAGE; B. ConA 결합 단백질 검출을 위한 lectin blot; C. SNA 결합 단백질 검출을 위한 lectin blot; D. AAL 결합 단백질 검출을 위한 lectin blot).
도 2는 자궁경부 정상조직과 암조직 세포 내 단백질의 SNA 결합 특징을 lectin blot으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 자궁경부 정상조직과 암조직 세포 내 단백질의 AAL 결합 특징을 lectin blot으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 자궁경부 정상조직과 암조직 세포 내 단백질의 ConA 결합 특징을 enzyme-linked lectin assay(ELLA)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 자궁경부 정상조직과 암조직 세포 내 단백질의 SNA 결합 특징을 ELLA로 분석한 결과를 나타낸 것이다(P < 0.001).
도 6은 자궁경부 정상조직과 암조직 세포 내 단백질의 AAL 결합 특징을 ELLA로 분석한 결과를 나타낸 것이다(P = 0.01).
도 7은 paraffin block에서 얻은 자궁경부 정상조직과 암조직내 단백질의 당질을 ELLA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Pap smear test용 시료의 세포 내 단백질의 SNA 결합 특징을 ELLA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Pap smear test용 시료의 세포 내 단백질의 RCA I 결합 특징을 ELLA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 Pap smear test용 시료의 세포 내 단백질의 AAL 결합 특징을 ELLA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 Pap smear test용 시료의 세포 내 단백질의 ConA 결합 특징을 ELLA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

단계 (1)에서는, 피검체 시료를 파쇄하고 원심분리하여 세포 내 단백질을 분리하며, 이때 피검체 시료는 자궁 조직, 보다 구체적으로는 자궁 경부 조직, 팹 스메어(Pap smear) 또는 자궁 경부 브러쉬(brush)-채취 시료를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서 "세포 내 단백질"은 세포를 파쇄하고 원심분리를 통해 잔여물(세포 표면의 당단백질 등)을 충분히 제거한 세포의 분획을 의미한다. 기존 문헌들의 조사 결과에 따르면 암화가 진행될 경우 세포/조직 표면 당질 및 혈액 내 당질의 sialylation 및 fucosylation이 증가하는 것으로 알려져 있으나, 본 발명에서는 기존 문헌들의 방법과 달리 세포 내 단백질의 당질 변화 검사를 통해 암화여부를 판별하고자 하는바, 자궁 조직, 팹 스메어(Pap smear) 또는 자궁 경부 브러쉬(brush)-채취 시료를 시료로 사용하는 것이 바람직하다.

단계 (2)에서는, 단계 (1)에 의해 분리된 세포 내 단백질에 렉틴을 가하여 결합시킨다. 즉, 세포 내 단백질의 시알산(sialic acid), 푸코오스(fucose), 갈락토오스(galactose) 또는 만노오스(mannose)와 결합하는 렉틴을 사용하며, 보다 구체적으로는 세포 내 단백질의 sialylation, fucosylation, galactosylation 및 mannosylation 레벨을 분석하기 위해 렉틴을 사용한다. 이때 사용될 수 있는 렉틴의 종류로는, 바람직하게는 SNA(Sambucus Nigra Lectin), ConA(Concanavalin A), RCA(Ricinus communis Agglutinin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이것으로 제한되지 않고, sialylation, fucosylation, galactosylation 및 mannosylation을 측정할 수 있는 렉틴이면 어느 것도 사용할 수 있다. 이러한 sialylation, fucosylation, galactosylation 및 mannosylation을 측정할 수 있는 렉틴, 예컨대 ConA, SNA, AAL 및 RCA는 각각 mannose, sialic acid, fucose 및 galactose 결합과 반응하는 특징을 가지고 있다. 또한, 단계 (2)에서 사용되는 렉틴은 바이오틴(biotin)으로 표지된 렉틴을 사용하는 것이 바람직하다.

단계 (3)에서는, 단계 (2)에 의해 렉틴과 결합하는 세포 내 단백질의 수준(level)을 측정하여 정상대조군 시료로부터 분리한 세포 내 단백질의 렉틴 결합 수준과 비교한다. 단계 (3)에서의 측정은 SDS-PAGE, ELLA(enzyme-linked lectin assay), 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay), 면역침강(immunoprecipitation), 및 면역형광법(immunofluorescence)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정될 수 있으나, 이것으로 한정되지는 않는다.

단계 (4)에서는, 정상대조군에 비하여 렉틴과 결합하는 세포 내 단백질의 수준이 감소 또는 증가되는 경우 자궁 경부암으로 판정한다. 즉, 피검체의 시료에 따라 렉틴과 결합하는 세포 내 단백질의 수준의 변화가 나타나고, 이를 기초로 하여 자궁 경부암을 판정할 수 있다. 보다 구체적으로, 피검체가 자궁 경부 조직인 경우, 기존 문헌들의 조사 결과에 따르면 암화가 진행될 경우 세포/조직 표면 당질 및 혈액 내 당질의 sialylation 및 fucosylation이 증가하는 것으로 알려져 있으나, 자궁경부 조직 내 단백질의 sialylation 및 fucosylation 레벨은 암화에 따라 현저하게 감소되는 것으로 나타나는바, 정상대조군에 비하여 렉틴과 결합하는 세포 내 단백질의 수준이 감소된 경우 자궁 경부암으로 판정할 수 있다. 또한, 피검체의 시료가 팹 스메어(Pap smear) 또는 자궁 경부 브러쉬(brush)-채취 시료에서 분리된 세포 내 단백질은 자궁경부암의 중증도가 올라감에 따라 sialylation, galactosylation 및 mannosylation 레벨이 증가한 반면, fucosylation 레벨이 감소하는 특징을 보여 자궁경부의 암 진행도를 진단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 자궁경부암 조직과 자궁경부 정상 조직을 준비하여, 이를 조직 파쇄 버퍼 (100 mM Tis-Cl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100)와 혼합하고, Dounce homogenizer로 파쇄 한 후, 파쇄물을 12000xg로 10분간 원심분리하여 조직 잔여물을 제거하고, 원심분리된 파쇄물의 상층액을 수집하여 세포 내 단백질을 분리 한 후(실시예 1 참조), 자궁경부 정상조직과 자궁경부 암조직의 세포 내 당쇄분석을 위해 SDS-PAGE, lectin blot 및 ELLA 분석을 한 결과, 자궁경부암 조직의 세포 내 단백질은 SNA와 AAL에 대해 현저하게 감소된 반응성을 나타냄을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, pap smear test 시료 세포 내 단백질의 당쇄 분석을 위해 ELLA 분석을 한 결과, CIN III와 자궁경부암 그룹은 정상 그룹에 비해 ANA(sialylation), RCA(galactosylation) 및 ConA(mannosylation)에 대한 반응은 높은 반면, AAL에 대하여 낮은 반응성을 나타냄을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 바이오틴 표지된 렉틴 및 스트렙타비딘-결합 발색효소를 포함하는 자궁경부암 진단 키트를 제공한다. 진단키트 내에서 렉틴이 시료의 당쇄 변화를 탐지하는 원리는 다음과 같다. 즉, 자궁 조직, 팹 스메어(Pap smear) 또는 자궁 경부 브러쉬(brush)-채취 시료를 파쇄하고 원심분리하여 얻은 세포 내 단백질을 키트에 가하면, 세포 내 단백질이 렉틴과 결합하게 된다. 여기에 발색효소 또는 형광물질 및 발색기질이 순서대로 결합함으로써 그 결과가 흡광도로 나타나게 된다. 따라서, 피검체가 시료가 자궁 경부 조직인 경우에는 세포 내 단백질과 렉틴 결합 수준이 감소된 경우, 피검체 시료가 팹 스메어(Pap smear) 또는 자궁 경부 브러쉬(brush)-채취 시료인 경우에는 세포 내 단백질과 렉틴 결합 수준이 증가된 경우 자궁 경부암으로 판정할 수 있다. 이때, 렉틴은 바이오틴 표지된 렉틴으로서, SNA(Sambucus Nigra Lectin), ConA(Concanavalin A), RCA(Ricinus communis Agglutinin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 또한, 발색효소는, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 형광염료 (fluorescence dye) 및 루시페라제(luciferase)로 구성된 군으로부터 선택되고, 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)을 사용할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험방법

1-1. 임상 조직샘플 준비

11개 자궁경부암 조직과 10개 자궁경부 정상 조직은 이화여대 목동병원에서 환자들의 동의하에 수집되었다. 또한, Pap smear test 시료로 채취한 7개의 자궁경부 정상 그룹의 세포, 4개의 cervical intraepithelial neoplasia (CIN) grade III 그룹 세포와 4개의 cervical cancer그룹 세포는 이화여대 목동병원에서 환자 동의하에 수집되었다. 조직 절제 및 Pap semar test 시료 채취는 이화여대 목동병원의 임상시험 심사 위원회의 심의를 거쳐 진행되었다.

1-2. 자궁경부 조직 및 pap smear test 시료 세포내 단백질의 준비

자궁경부 조직 또는 pap smear test 시료 세포는 파쇄 버퍼 (100 mM Tis-Cl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100)와 혼합된 후 Dounce homogenizer로 파쇄 되었다. 파쇄물을 12000xg로 10분간 원심분리하여 조직 잔여물을 제거하였다. 원심분리된 파쇄물의 상층액을 수집한 후 BCA 단백질 정량 키트로 단백질 농도를 측정하였다. Paraffin block상의 조직은 deparaffinization 과정을 거친 후 상기에 기재된 과정을 거쳐 파쇄되었다.

1-3. SDS-PAGE

SDS-PAGE는 기존에 공지된 방법에 따라 진행되었다(U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.). 세포내 단백질은 10% polyacrylamide gel상에서 전개된 후 은 염색법으로 시각화 되었다.

1-4. Oxidized bovine serum albumin(oBSA)제작

oBSA 제작을 위해 BSA(Bioworld, USA)를 10 mM metaperiodate (Sigma, USA)에 녹여 4℃에서 1시간 반응 시킨 후 Tris-buffered saline + 0.1% Tween 20(TBST)에 16시간 이상 투석하였다. 투석된 oBSA 용액은 0.45 μm 필터에 통과시켰다.

1-5. Lectin blot

Lectin blot을 위해 단백질을 10% polyacrylasmide gel 상에서 전개한 후 Polyvinylidene difluoride(PVDF, ATTO Corporation, USA) 멤브레인에 트렌스퍼하였다. PVDF 멤브레인을 2.5% oxidized bovine serum albumin(oBSA)가 포함된 TBST로 밤새 블로킹 하였다. 블로킹된 PVDF 멤브레인을 TBST로 3회 세척한 후 biotin이 결합된 Concanavalin A(ConA), Sambucus Nigra Lectin(SNA), Aleuria Aurantia Lectin(AAL)와 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. Lectin은 Vector Laboratories Inc.(USA) 에서 구입하였다. 3종의 lectin은 1 μg/ml이 되게 0.25% oBSA가 포함된 TBST에 준비되었다. 멤브레인을 TBST로 3회 세척한 후 HRP가 부착된 streptavidin (PIERCE, USA)과 상온에서 40분간 반응 시켰다. HRP-conjugated streptavidin은 0.25% oBSA가 포함된 TBST에 200 ng/ml로 준비되었다. Lectin과 결합한 단백질은 chemiluminescent kit(AbClon, South Korea)를 사용하여 X-ray film상에서 시각화 되었다.

1-6. Enzyme-linked lectin assay(ELLA)

자궁경부 조직의 경우 96 well 마이크로플레이트(Greiner bio one, Germany)를 웰당 2.5 μg 또는 1.25 μg의 세포 내 단백질로 코팅되게 하였다. Pap smear test 시료는 웰당 75, 150 또는 300 ng으로 코팅되게 하였다. 코팅은 carbonate buffer 또는 phosphate-buffered saline(PBS)을 사용하여 진행되었다. 이후 각 웰은 2.5% oBSA가 포함된 TBST로 4시간 이상 상온에서 블로킹 되었다. Biotin이 부착된 ConA, SNA, AAL, RCA I을 1 μg/ml이 되게 0.25% oBSA가 포함된 TBST에 준비한 후 마이크로 플레이트에서 반응시켰다. Lectin 반응은 37℃에서 1시간 동안 진행되었다. HRP가 부착된 streptavidin(PIERCE)을 200 ng/ml이 되게 0.25% oBSA가 포함된 TBST에 준비한 후 마이크로 플레이트에서 반응시켰다 (37℃, 1시간). 발색반응은 o-phenylenediamine (Sigma, USA)으로 진행되었으며 수치는 492 nm에서 측정되었다.

1-7. 통계분석

두 그룹간 차이의 통계적 중요성은 two-tailed Student's t-test를 사용하여 분석하였다. 0.05 이하의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 판명하였다. ELLA의 민감도, 특이도 및 cut-off value는 하기와 같이 산출하였다.

민감도: number of true positives x 100 / number of true positives + number of false negatives

특이도: number of true negatives x 100 / number of true negatives + number of false positives.

Cut off value: (median value of normal group + median value of cancer group) / 2.

실시예 2. 자궁경부 정상조직과 자궁경부 암조직의 세포 내 당쇄분석

2-1. SDS-PAGE와 lectin blot 분석

자궁경부 정상조직과 암조직 세포 내 단백질과 ConA(Concanavalin A), SNA(Sambucus Nigra Lectin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)와의 결합 정도를 SDS-PAGE와 lectin blot 분석을 통하여 측정하였고, 그 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

보다 구체적으로, 도 1은 정상 자궁경부조직(N)과 자궁경부암조직(C) 세포 내 단백질에 대한 대표 SDS-PAGE 결과와 대표 lectin blot결과를 나타낸 것이다. 대표 단백질 패턴(representative banding pattern)을 얻기 위해 10개의 정상조직 파쇄물과 11개의 암조직 파쇄물은 각각 혼합되었다. 혼합물의 단백질 농도를 정량한 후 SDS-PAGE와 lectin blot을 위해 로딩하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 상에서 암조직은 정상조직에 비해 다양한 종류의 단백질을 포함함을 확인할 수 있었다(도 1A 참조). 정상 조직과 암조직의 단백질은 ConA와의 반응상에 뚜렸한 차이를 나타내지 않은 반면(도 1B 참조), 암조직의 단백질은 SNA 결합 단백질의 수준이 크게 감소함을 확인할 수 있었다(도 1C 참조). 또한, 암조직의 AAL 결합 단백질의 밴딩 패턴은 정상조직과 구분되는 밴드 패턴을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 1D 참조). Filled arrow는 정상조직 특이적인 단백질 밴드를 나타내며 blank arrow는 암조직 특이적인 단백질 밴드를 나타낸다.

도 2는 lectin blot의 SNA 반응상에서 9개 정상조직 샘플과 9개 암조직 샘플에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 도 1의 결과와 마찬가지로 암조직에서 현저하게 감소된 SNA 반응을 확인할 수 있었다.

도 3은 lectin blot의 AAL 반응에 있어 9개 정상조직 샘플과 9개 암조직 샘플에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, AAL 반응에 있어 암조직의 단백질은 정상조직에 비해 약한 반응을 나타냄을 확인할 수 있었다. Filled arrow와 blank arrow는 각각 정상조직 특이적 단백질 밴드와 암조직 특이적 단백질 밴드의 위치를 나타낸다. 상기 결과로부터, 자궁경부암 조직 세포 내 단백질의 sialylation 및 fucosylation은 정상조직과 구분되는 특징을 가짐을 알 수 있었다.

2-2. ELLA 분석

자궁경부 정상조직과 암조직 세포 내 단백질과 ConA(Concanavalin A), SNA(Sambucus Nigra Lectin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)와의 결합 정도를 Enzyme-linked lectin assay (ELLA) 분석을 통하여 측정하였고, 그 결과를 각각 도 4, 도 5, 도 6에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, ConA에 대한 반응에 있어 정상조직과 암조직 세포 내 단백질의 반응성은 차이를 나타내지 않았다. 하지만, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 암조직 세포 내 단백질은 SNA와 AAL에 대해 현저하게 감소된 반응성을 나타냄을 확인할 수 있었고, 이러한 암세포 내 단백질의 SNA와 AAL에 대한 반응성 차이는 실시예 2-1의 lectin blot의 결과와 유사한 패턴을 나타내었다.

추가적으로, Praffin block에서 얻어진 정상 자궁경부 조직과 자궁경부암 조직 내 단백질의 당질을 ELLA로 분석하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 암조직에서 SNA와 AAL에 대한 반응이 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

뿐만 아니라, ELLA 방법을 사용하여 자궁경부 조직이 정상인 사람과 암이 발생된 사람을 구분 시 민감도와 특이도를 조사하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었고, 이때 코팅되는 조직 세포 내 단백질의 양은 2.5 μg/well, 1.25 μg/well로 다양화하였다.

Coating amount of lysate protein	Statistical parameter	SNA	AAL
2.5 μg / well	Sensitivity (%)	91	73
2.5 μg / well	Specificity (%)	100	60
1.25 μg / well	Sensitivity (%)	100	70
1.25 μg / well	Specificity (%)	82	82

각 분석법의 cut-off value는 실험 방법에 나타나 있는 것과 같이 각 그룹의 median value 합의 평균값으로 설정되었다. SNA를 사용한 ELLA의 경우 91-100%의 민감도, 82-100%의 특이도를 나타내었고, AAL을 사용한 ELLA의 경우 70-73% 민감도, 60-82%의 특이도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 3. Pap smear test 시료 세포 내 당쇄분석

pap smear test 시료 세포 내 단백질과 SNA, RCA I, ConA 및 AAL 결합 정도를 Enzyme-linked lectin assay (ELLA) 분석을 통하여 측정하였고, 그 결과를 각각 도 8 내지 도 11에 나타내었다.

도 8 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, Pap smear test 시료의 SNA(sialylation), RCA(galactosylation) 및 ConA(mannosylation)에 대한 반응은 CIN III와 자궁경부암 그룹이 정상 그룹에 비해 높은 반응을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 CIN III에 비해 자궁경부암 그룹의 반응성이 더 높게 나타나 자궁경부의 이상 병변 중증도가 증가할수록 이들 렉틴에 대한 반응성이 증가하는 것으로 나타났다. 반면, CIN III와 자궁경부암 그룹은 정상 그룹에 비해 AAL에 대하여 낮은 반응성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

(1) 피검체 시료를 파쇄하고 원심분리하여 세포 내 단백질을 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 세포 내 단백질에 렉틴을 가하여 결합시키는 단계;
(3) 상기 렉틴과 결합하는 상기 세포 내 단백질의 수준(level)을 측정하여 정상대조군 시료로부터 분리한 세포 내 단백질의 렉틴 결합 수준과 비교하는 단계; 및
(4) 정상대조군에 비하여 상기 렉틴과 결합하는 상기 세포 내 단백질의 수준이 감소 또는 증가되는 경우 자궁경부암으로 판정하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 감소는 상기 단계 (1)에서의 시료가 자궁 경부 조직인 경우인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 증가는 상기 단계 (1)에서의 시료가 팹 스메어(Pap smear) 또는 자궁 경부 브러쉬(brush)-채취 시료인 경우인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 렉틴은 시알산(sialic acid), 푸코오스(fucose), 갈락토오스(galactose) 또는 만노오스(mannose)와 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 렉틴은 SNA(Sambucus Nigra Lectin), ConA(Concanavalin A), RCA(Ricinus communis Agglutinin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 렉틴은 바이오틴(biotin)으로 표지된 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (3)에서의 측정은 SDS-PAGE, ELLA(enzyme-linked lectin assay), 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 조합을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
바이오틴 표지된 렉틴 및 스트렙타비딘-결합 발색효소를 포함하는, 자궁경부암 진단 키트.
제8항에 있어서, 상기 렉틴은 SNA(Sambucus Nigra Lectin), ConA(Concanavalin A), RCA(Ricinus communis Agglutinin) 및 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 자궁경부암 진단 키트.
제8항에 있어서, 상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 형광염료 (fluorescence dye) 및 루시페라제(luciferase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 자궁경부암 진단 키트.