KR20150060744A

KR20150060744A - 아르테리바이러스

Info

Publication number: KR20150060744A
Application number: KR1020157008519A
Authority: KR
Inventors: 마르욜레인 키케르트; 브라이언 레너드 마크; 퓍 베르튄 카스테렌 반; ? 베르튄 카스테렌 반; 테렌스 윌리엄 제임스; 에릭 욘 스네이더
Original assignee: 라이덴 유니버시티 메디컬 센터; 유니버시티 오브 매니토바
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2015-06-03
Also published as: US20150313988A1; CA2883591A1; JP2015532269A; WO2014048955A1; BR112015006605A2; CN104812409A; EP2900257A1; US20140154265A1; MX2015003765A; RU2015115486A; US9457073B2

Abstract

본 발명은 비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 복제-적격 아르테리바이러스(Arterivirus), 의약으로서의 그의 용도, 백신으로서의 그의 용도 및 예방에 있어서의 그의 용도, 상기 아르테리바이러스를 포함하는 백신 및 아르테리바이러스성 PLP2-유비퀴틴 복합체에 관한 것이다.

Description

아르테리바이러스 {ARTERIVIRUS}

본 발명은 복제-적격 아르테리바이러스, 의약으로서의 그의 용도, 백신으로서의 그의 용도 및 예방에 있어서의 그의 용도, 상기 아르테리바이러스를 포함하는 백신, 및 아르테리바이러스성 PLP2-유비퀴틴 복합체에 관한 것이다.

아르테리바이러스 과는 니도비랄레스 (Nidovirales) 목에 속하는데, 현재에는 그의 4가지 종이 공지되어 있다: 말 동맥염 바이러스 (Equine arteritis virus) (EAV), 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스 (Porcine respiratory and reproductive syndrome virus) (PRRSV), 락테이트 데히드로게나제 상승 바이러스 (Lactate dehydrogenase elevating virus) (LDV), 및 원숭이 출혈열 바이러스 (Simian hemorrhagic fever virus) (SHFV). LDV 및 SHFV는 미미한 수준의 경제적 영향만을 끼치는데, 이는 이들 바이러스가 각각 마우스와 원숭이를 감염시키기 때문이다. 이와는 달리, EAV 및 특히 PRRSV는 사회에 상당한 경제적 부담을 지우고 있다.

말 동맥염 바이러스는 말에게서 감염을 유발시키므로, 말 사육 업계에서 되풀이되고 있는 문제점이다. 따라서, 이는 말 사육자에게 상당한 경제적 부담을 제기한다. 말 동맥염 바이러스는 소위 "보균 종마"에게서 영속적인 감염을 일으키고, 연속해서 이 바이러스를 암말에게 전염시켜, 잠재적으로는 태아의 유산을 초래한다. 말 사육자는 특히 종마에게서 EAV가 존재하는 지를 조심스럽게 모니터링하고, 생 약독화 바이러스에 기초하거나 EAV 구조적 소단위의 발현에 기초한, 상기 바이러스에 대항한 수많은 백신을 개발하였다. 그러나, 최근 뉴 멕시코, 미국 (2006년) 및 프랑스 (2007년)에서의 집단발병으로 인해, 수의사와 말 소유자들 간에 EAV에 대한 관심이 증가되어 왔다. 그리고 진단 도구와 백신이 입수 가능하긴 하지만, 현재 입수 가능한 백신은 개선되어야 한다 (하기 참조).

PRRSV는 전 세계 양돈 산업에 악영향을 미치는, 경제적으로 단연코 가장 중요한 아르테리바이러스이다. 이러한 바이러스에 감염되면, 성장이 느려지고, 사료 효율이 감소되며, 이유기 내지 다 자란 돼지에게서 식욕 부진과 열이 발생하고, 임신한 암퇘지에게서 유산이 발생하며, 어린 돼지에게서 호흡기 질환이 발생한다. 미국에서만도, 매년 PRRSV 감염과 연관된 손실이 2005년에는 대략 5억 6천만 달러이고 2011년에는 대략 6억 6천 4백만 달러인 것으로 추정되었다. PRRSV 감염이, 예를 들어 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile), 돼지 인플루엔자, 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus sp .), 로타바이러스 (rotavirus) 또는 돼지 시르코바이러스 (porcine circovirus)에 의해 야기된 기타 질환과 비교한 경우에 가장 큰 생산성 손실을 유발시키는, 돼지 산업에 대한 건강 위해 요소 중 최우선을 차지한다. 2006년에 동남아시아에서 고도로 치명적인 PRRSV 균주가 출현하였고 아시아 돼지 산업이 전 세계에서 가장 크다는 사실을 고려해 볼 때, 전 세계 중 이들 지역에서의 손실이 미국에 대해 보고된 것 보다 상당히 더 높은 것으로 가정해도 별로 틀리지 않을 것이다. PRRSV와 연관된 질환이 PRRSV에 대항한 생 약독화 백신과 사멸 백신 둘 다의 입수 가능성에도 불구하고 통제하기가 어려운 것으로 입증되었기 때문에, PRRSV는 여전히 돼지 산업에 대한 주요 위협이 되고 있다.

생 약독화 백신은 통상적으로, 세포 배양 중인 균주를 일련의 계대접종함으로써 생성되는 바이러스를 포함하는데, 이러한 계대접종에 의해 돼지에게서 더 이상 질환을 유도시키지 않는 약독화 바이러스가 생성된다. 이들 백신은 일반적으로, 오래 지속되는 일정 수준의 보호를 유도한다. 그러나, 단일 PRRSV 백신 균주로부터 유래된 경우에는, 이들 백신은 이종 PRRSV 감염에 대해 충분히 보호해줄 수 없다 (PRRSV 단리물은 고도로 분기되고 유럽 및 북미 유전자형으로 통합 정리될 수 있음). 부가적으로, 생 약독화 백신으로 예방접종하는 것이 야생형 바이러스에 의한 재감염을 완전히 방지할 수 없고, 백신 접종된 무리를 통하여 백신 바이러스가 전파되는 것이 여러 차례 관찰되었다. 또한, 백신 균주의 병원성으로 복귀되는 것이 관찰되었다 (Storgaard, T. et al., (1999), Botner , A. et al., (1997), Nielsen, H.S. et al., (2001)). 또한, 현재 상업적으로 입수 가능한 마커 백신이 존재하지 않기 때문에, 백신 접종된 동물과 자연스럽게 감염된 동물을 구별하는 것이 불가능하다. 사멸 바이러스 백신이 또한 입수 가능하고 이들은 본질적으로 훨씬 더 안전한데, 이는 이들 백신이 복제성 바이러스를 포함하지 않기 때문이다. 그러나, 불리한 측면에서 보면, 바이러스 복제가 없다는 것은 이들 백신이 일반적으로 덜 유효한 주요 이유가 되는 것으로 추정된다.

효능있는 아르테리바이러스 백신을 개발하는 데 있어서 부가의 복잡한 요인은 일반적으로, 아르테리바이러스가 숙주의 선천 면역 반응을 회피하는 것으로 여겨진다는 사실에 있다. 일반적으로, 아르테리바이러스의 강력한 면역-조정 능력이 (생 약독화) 백신에 의한 효율적인 면역 반응의 유도를 방지하는 것으로 여겨진다. 따라서, 유도될 수 있는 면역의 수준은 문제를 유발시키는 바이러스에 대해 보호를 제공하기에 최적 이하일 수 있다.

따라서, 전통적인 사멸 및 생 약독화 아르테리바이러스 기반 백신과 연관된 문제점을 감소시키거나 또는 심지어 이러한 문제점을 해결하기 위한 또 다른 접근 방식이 필요하다.

아르테리바이러스 과는 약 13 내지 16 kb 범위의 게놈 크기를 갖는 양성-센스 (+) 단일-가닥 RNA 바이러스로 이루어진다. 감염시, 이러한 RNA는 2개의 레플리카제 전구체 폴리단백질, 즉 pp1a 및 pp1ab로 번역된다. 아르테리바이러스의 기능적 비-구조 단백질 (nsp)은 내부적으로 코딩된 프로테아제에 의한 이들 폴리단백질의 절단으로부터 유래된다. 이러한 폴리단백질로부터 방출되면, 이들 비-구조 단백질은 함께, 복제 및 전사 복합체를 형성하는데, 이는 바이러스성 게놈의 복제에 대해 책임이 있고 구조 단백질을 코딩하는 서브게놈 메신저 RNA의 합성에 대해 책임이 있다. 원형 아르테리바이러스, 즉 EAV의 pp1a 및 pp1ab 폴리단백질은 비-구조 단백질 1 (nsp1), nsp2 및 nsp4에 존재하는 3개의 내부 프로테아제에 의해 적어도 13개의 비-구조 단백질로 절단된다. 아르테리바이러스성 nsp2는 그의 N-말단 영역에 파파인-유사 프로테아제 (PLP) 도메인을 함유한다. 이러한 프로테아제가 통상적으로 지칭되는 바와 같은 PLP2는 nsp2와 nsp3 간의 접합부의 절단에 대해 책임이 있고, 이러한 이유로 인해, 그의 촉매적 활성이 바이러스성 복제에 필수인 것으로 예상된다 (더 오래된 문헌에는 종종, 상기 프로테아제가 CP (시스테인 프로테아제) 또는 nsp2 CP로서 지칭되어 있음).

폴리단백질 프로세싱에 있어서의 nsp2의 역할 이외에도, 보다 최근에는 nsp2가 상기 지시된 바와 같이 숙주의 선천 면역 반응의 회피에 있어서 또한 특정 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 감염시, 바이러스성 핵산의 존재로 인해 선천 면역 신호 전달 캐스케이드의 활성화가 촉발되어, NFκB 및 Irf3/Irf7과 같은 전사 인자가 활성화되므로, 궁극적으로 베타 인터페론 (IFN-β)을 코딩하는 유전자 및 기타 염증 유발성 사이토킨의 전사가 초래될 수 있다. 단백질 인산화를 통하는 것 이외에도, 이들 신호 전달 경로는 단백질 유비퀴틴화를 통하여 양성적 및 음성적 둘 다로 광범위하게 조절된다 (Jiang, X. (2012)). 비교 서열 분석 결과, nsp2의 PLP2 도메인이 탈-유비퀴틴화 효소 (DUB)의 난소 종양 도메인-함유 (OTU) 부류에 속하는 단백질과 매우 다른 유사성을 나타내었다는 것이 밝혀진 경우에, 상기 단백질 nsp2의 가능한 면역 회피 활성에 대한 관심이 제기되었다 (Makarova (2000)). 그 이후에, 아르테리바이러스성 PLP2가 실제로 진정한 DUB 활성을 보유하고 있다는 사실과 이러한 활성이 항바이러스 상태의 유도를 저해하거나 저하시키기 위해 선천 면역 신호 전달 인자로부터 유비퀴틴 (또한 Ub로서 추가로 지칭됨)을 제거하기 위해 이용되는 것으로 예상된다는 사실이 확인되었다 (Frias-Staheli, N. (2007), Sun, Z. (2010), van Kasteren, P.B. (2012)). 그의 DUB 활성 이외에도, 아르테리바이러스성 PLP2는 또한, 세포성 표적 단백질로부터 유비퀴틴-유사 항바이러스성 단백질 인터페론 자극 유전자 15 (ISG15)를 제거하는 것으로 밝혀졌다 (Frias-Staheli, N. (2007), Sun, Z. (2012), Arguello, M.D. (2007)). 이러한 활성은 탈ISG화 활성으로서 지칭될 것이다. 유비퀴틴과 ISG15 간의 밀접한 관계로 인해, 이러한 PLP2 도메인의 역할은 일반적으로, DUB/탈ISG화 활성으로서 지칭될 것이다.

폴리단백질 프로세싱 기능과 DUB/탈ISG화 활성 간에 매우 밀접한 관련성이 있다는 것은 명백한데, 이는 양 활성이 PLP2 내의 동일한 촉매적 코어 아미노산 잔기에 좌우되기 때문이다. 게다가, 아르테리바이러스 레플리카제 폴리단백질 내의 nsp2/nsp3 절단 부위를 규정하는 서열 (xxGG)은 유비퀴틴 및 유비퀴틴-유사 분자 ISG15에서 발견되는 정규 C-말단 모티프 (LRGG)에 대한 유사성을 표시하는데, 절단은 두 번째 글리신 잔기 바로 다음에서 일어난다. 그 결과로서, 이들 기질 특이성을 독립적으로 연구하는 것이 불가능하지 않다면 상기와 같은 밀접한 관련성은 그것을 극히 어렵게 만든다.

nsp2/nsp3 접합부에서 (이것 없으면 바이러스는 살아갈 수 없음) 폴리단백질 프로세싱 기능을 온전하게 유지함과 동시에 DUB/탈ISG화 활성을 특이적으로 저하시키거나 제거할 것인, PLP2 도메인 내에서 또는 이 도메인과 근접해서 변형을 만들어 주는 몇 가지 예비 시도가 보고되었다.

문헌 [Sun et al. (2010)]에는 PRRSV의 PLP2 도메인의 N-말단 경계에서 몇 가지 아미노산 위치에서의 돌연변이를 만들기 위한 시도가 기재되어 있다. 상기 문헌의 저자들은 상기 영역 내에서의 B-세포 에피토프 (ES2)의 존재를 기초로 하여, 돌연변이를 도입하기 위한 PLP2 도메인의 특정 부분을 선택하였다. 예상될 수 있었던 바와 같이, nsp2/nsp3 접합부에서 폴리단백질 프로세싱 활성에 있어서의 상기 영역의 중요성을 고려해 볼 때, 상기와 같이 생성된 거의 대부분의 PLP2 돌연변이는 바이러스에 대해 치명적이었다. 위치 D458A, S462A 및 D465A (번호는 문헌 [Sun et al., 2010]을 참조함)에서의 3가지 돌연변이만이 바이러스 생존력을 완전히 상실시키지 않으면서 "허용"되었다. 그러나, 이들 돌연변이체는 NFκB 활성화를 억제하는 데 있어서 거의 어떠한 감소도 나타내지 않았거나 전혀 감소를 나타내지 않았다. 이들 위치에서 만들어진 돌연변이는 바이러스에 대해 치명적이거나, 또는 탈유비퀴틴화를 통하여 NFκB 활성화를 억제할 수 있는 그의 능력에 있어서 야생형 바이러스와 거의 상이하지 않는 생존 가능한 바이러스를 초래한다는 결론만을 내릴 수 있었다. 이러한 연구 결과는 폴리단백질 프로세싱과 DUB/탈ISG화에 있어서 밀접하게 관련된 PLP2 기능들을 분리시키는 것이 어렵다는 것을 입증해준다.

선(Sun) 등은 나중에, PLP2 폴리단백질 프로세싱 기능은 보유하면서도 DUB/탈ISG화 활성을 차단시킬 수 있는 가능성을 연구하기 위한 새로운 시도로 돌연변이를 도입하기 위한 또 다른 영역을 선택하였다 (Sun 2012). 문헌 [Sun (2012)]에는, PRRSV의 PLP2 도메인의 N-말단 경계에서의 새로운 세트의 결실이 기재되어 있다. ORF1a-코딩 단백질의 아미노산 402-420로부터의 영역 전반에 걸쳐 있는 결실만이, ISG15 길항제 기능에 있어서 부분적인 감소를 나타내었고 극히 낮은 역가이긴 하지만 여전히 복제할 수 있었던 바이러스를 산출시키는 것으로 밝혀졌는데, 단 부가의 하류 점 돌연변이가 위치 462에 존재해야 한다. 따라서, 이러한 바이러스가 생 백신 바이러스에 대한 기준으로서 적합하지 않다고 언급한 이유이다.

특허 출원 WO2012/063212에는 아마도 PRRSV에서 손상된 면역 회피 능력을 초래할 수도 있는 변형을 만들고자 한 시도가 기재되어 있다. 이러한 특허 출원에는, 전체 바이러스 게놈 전반에 걸쳐 산재된 위치에서 32개 아미노산 변화를 포함하는 돌연변이체 바이러스가 기재되어 있는데, 이들은 모두 PLP2 도메인 외부에 있고, 그의 모두는 바이러스의 인터페론 유도/억제 표현형에 대해 직접적으로 책임이 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 이들 변화 모두는 야생형 바이러스를, 인터페론 억제 활성이 감소된 복제-적격 바이러스로 전환시키기 위해 도입되어야만 한다. 어떤 아미노산 변화(들)가 이러한 억제 효과에 대해 실제적으로 책임이 있다는 지표는 전혀 없기 때문에, 바이러스의 안전성에 관한 예측을 전혀 할 수가 없는데: 이는 또한, 단일 점 돌연변이로 인해 병원성으로 복귀되는데, 이로써 상기 바이러스는 불량한 백신 후보가 될 것이다. 또한, 약독화 표현형에 대해 책임이 있는 아미노산에 관한 지식의 결여로 인해, 다른 균주로부터 새로운 백신 후보를 구축하는 것도 어려워지는데: 바이러스 내에 32개 아미노산 변화를 도입하기 위한 몹시 힘든 과제 외에도, 또 다른 바이러스의 상이한 서열 맥락에서 이들 32개 아미노산 돌연변이가 IFN 억제의 감소와 바이러스 약독화에 대해 동일한 효과를 나타낼 것으로 예상되지 않는다.

특허 출원 WO2009/008924에는 OTU-함유 바이러스성 단백질의 탈ISG화 활성을 억제함으로써 바이러스성 감염을 방지하는 방법이 기재되어 있다. 이 출원은 주로, 제약 화합물을 통하여 OTU-함유 바이러스성 단백질의 탈ISG화 활성을 표적으로 하는 것을 목표로 하고 있다. 그러나, 상기 출원은 폴리단백질 프로세싱 기능을 온전하게 유지함과 동시에 DUB/탈ISG화 활성을 특이적으로 제거하는 아르테리바이러스 내에서의 변형에 대하여 전혀 개시하지 않거나 심지어 이러한 변형에 대해 전혀 암시하지 않는다.

따라서 기본적으로, 불가피하게 DUB/탈ISG화 활성 상의 상당한 감소를 유발시키는 공지된 돌연변이는 바이러스 복제에 있어 허용되지 않는 감소를 초래하거나 또는 대부분의 경우에 바이러스 복제를 전혀 초래하지 않는 것으로 보인다. 지금까지 허용되는 결과가 없다는 것은 PLP2의 DUB/탈ISG화 활성과 폴리단백질 프로세싱 기능 간의 밀접한 관련성을 풀어 내는 것이 전혀 가능하지 않을 수 있다는 것을 강력하게 제안하고 있다.

본 발명의 목적은 한편으로는 여전히 복제-적격하고, 다른 한편으로는 그럼에도 불구하고 PLP2의 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 표시하는 아르테리바이러스 과의 바이러스를 제공하는 것이다.

놀랍게도, 폴리단백질 프로세싱 기능과 DUB/탈ISG화 활성에 대한 PLP2 활성 부위가 동일하긴 하지만, 한편으로는 Ub 및 ISG15에 대한 기질 결합성이 상이하고, 다른 한편으로는 nsp2/nsp3 절단 부위가 상이하다는 사실이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 한편으로는 Ub의 베타-그래스프(beta-grasp) 폴드 또는 ISG15의 C-말단 베타-그래스프 폴드와 결합하는 PLP2 도메인의 일부가 상기와 같이 확인되고, 다른 한편으로는 Ub 또는 ISG15의 C-말단 꼬리의 비구조화 영역과 유사한 xxGG 모티프를 함유하는 폴리단백질의 비구조화 영역과 결합하는 데 참여한 영역이 확인된 것은, 보다 구체적으로는 유비퀴틴과 결합될 때, nsp2의 PLP2 도메인의 3D-구조의 해석과 분석을 통하여 본 발명에 의해 처음으로 수행될 수 있었다.

지금까지는, 특히 X-선 결정학에 적합한 단백질 결정을 자라게 하는 데 있어서의 어려움으로 인해, PLP2 도메인의 3D-구조를 결정하는 것이 가능하지 않았다.

해결해야 할 첫 번째 문제점은 PLP2 도메인의 결정학적 분석을 허용하였던 충분한 양의 nsp2-단편을 생성하는 것과 관련이 있다. nsp2는 발현 시스템에서 불충분하게 발현되고, 융합 단백질로서 발현되는 경우에는, PLP2가 불용성으로 되지 않으면서 융합 파트너로부터 제거하기가 어려우므로, 단백질 결정화에 적합하지 못하다.

놀랍게도, 발현 플라스미드 pASK3 (Gohara D, et al., (1999))으로부터의 N-말단 유비퀴틴을 수반한 프레임에서 EAV PLP2 도메인 (이러한 경우에는, 상기 폴리단백질 잔기 261-392이지만, 반드시 그런 것은 아님)이 발현하는 것이 1) 단백질이 바이러스성 폴리단백질로부터 유래될 것인 경우였던 바와 같이, 천연 N-말단을 갖고 있고, 2) 결정화 목적에 충분한 양으로 생성될 수 있었던 단백질을 수득하기에 충분하였다는 사실이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 통상적으로, 플라스미드 pASK3은 DUB 유비퀴틴 프로테아제 1 (Ubp1)을 또한 발현하는 이. 콜라이 (E. coli) 세포에서 단백질을 발현시키기 위해 사용되는데, 그에 따른 결과로서 N-말단 유비퀴틴 태그가 발현 후 바로 절단 제거된다. 그러나, 현 상황 하에서는, PLP2 그 자체가 DUB로서 작용한다는 사실로 인해, DUB Ubp1을 동시에 발현하지 않으면서도 플라스미드 pASK3을 이용하여 N-말단 유비퀴틴 태그를 수반한 프레임에서 폴리단백질 잔기 261-392 (즉, EAV nsp2의 PLP2 도메인)를 발현하는 것이 충분하였다. 또한, PLP2가 그의 인식 부위 LxGG 바로 다음을 절단한다는 사실로 인해, 단백질이 바이러스성 레플리카제 폴리단백질 절단으로부터 유래되는 경우였던 바와 같이, 그의 천연 N-말단을 갖는 PLP2 단편이 생성되었다. 이러한 EAV nsp2의 PLP2 도메인의 특수 조합과 발현 플라스미드 pASK3의 사용으로 인해, 실제로 천연 N-말단을 갖고 있고 단백질 X-선 결정학에 의한 PLP2 도메인의 3차원적 구조를 결정할 수 있기에 충분한 양으로 생성되는 단백질 단편이 제공되었다.

PLP2 도메인의 3D-구조를 결정하는 공정에서 직면하게 되는 두 번째 문제점은 정제된 PLP2 도메인을 결정화시킬 수 없었다는 것이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 다음 단계에서는 문헌 [James et al. (2011)]에 의해 기재된 바와 같이 문헌 [Messick et al. (2008)] 및 [Borodovsky et al. (2002)]에 따라서, 메카니즘 기반 자살 억제제 Ub_(1-75)-3-브로모프로필아민 (Ub-3Br)을 제조하였다. 그 다음, 37℃ 하에 1시간 동안 Ub-Br3을 정제된 PLP2와 각각 3:2 몰 비로 온화하게 혼합함으로써 이들 단백질을 공유 결합시켰다. 이로써 생성된 PLP2-유비퀴틴 복합체를 겔 여과, 음이온 교환 [소스(Source) 15Q] 크로마토그래피에 의해 정제한 다음, 20 mM 트리스(Tris), pH 8.0, 50 mM NaCl로 교환시킨 후, 10 mg/ml로 농축시키고 4℃ 하에 저장하였다. PLP2 도메인의 촉매적 친핵체 (Cys 270)와 유비퀴틴의 C-말단 간의 공유 결합에 의해 안정화시킨 상기 PLP2-유비퀴틴 복합체가 형성되면, 결정화되기에 충분히 안정적이고 상기 복합체의 3D-구조가 X-선 결정학에 의해 결정될 수 있기에 충분히 안정적이었던 복합체가 산출되었다. PLP2-Ub 복합체는 현적(hanging-drop) 증기 확산에 의해 결정화되었다. 실시예 섹션은 결정화 공정에 관한 추가의 상세 정보를 제공한다.

상기 언급된 바와 같이, EAV PLP2 도메인 (EAV pp1a의 잔기 261-392; 13.6 kDa)의 결정 구조는 메카니즘 기반 억제제 Ub-Br3과의 공유적 복합체로서 결정되었다. 다수의 시스테인 잔기가 보존되고 프로테아제 기능성에 대해 입증된 그들의 중요성은 PLP2가 아연과 결합할 수 있었다는 것을 제안하였기 때문에 (Snijder et al., 1995), 상기 복합체의 결정 구조는 아연 흡수단 전반에 걸쳐 수집된 X-선 회절 데이터를 이용하는 다중 파장 이상 분산 (MAD) 위상 조정 실험에 의해 결정되었다. 이로써 생성되는 전자 밀도 지도 결과, 완전한 유비퀴틴 분자와 결합된 PLP2의 잔기 261-387이 드러났고 상기 복합체의 특정 모델을 1.45Å 해상도로 구축 및 정밀화 (R _work = 0.16, R _free = 0.18)시킬 수 있었다 (도 1A).

PLP2는 결합된 Ub 분자의 C-말단 (Ub 이량체 내의 '원위' Ub)이 용매 노출된 활성 부위를 향하도록 지시하는 얕은 Ub-결합 부위를 갖는 치밀한 2-도메인 폴드를 채택하고 있다 (도 1A). PLP2의 도메인 I (잔기 267-307 및 365-378)은 2-가닥 역평행 시트 (β2↑ β6↓)에 대해 패킹된 3-나선 다발 (α1, α2, α4)로 이루어진다. 도메인 II는 도메인 I의 나선 α1 및 α2에 대해 함께 패킹되는 α-나선 (α3)과 4-가닥 β-시트 (β1↑ β5↓ β4↑ β3↑) 상에 중심을 두고 있다. 도메인 II는 사면체 기하학적 구조를 수반한 아연 이온과 배위되는 4개의 시스테인 잔기 (Cys 319, 349, 354, 356)에 의해 안정화되는 대다수의 Ub-결합 부위를 포함한다 (도 1B). 그들의 배열은 C-말단 유형 아연 목걸이 모티프와 유사한 C4 아연 핑거를 형성한다 (Andreini et al., 2011) (도 1B). 위치 C1 (Cys319)과 C2 (Cys349) 사이의 큰 삽입부는 도메인 II의 많은 부분에 걸쳐 아연 핑거의 안정화 효과를 연장시키는 것으로 보인다. 5번째 시스테인 (Cys344)이 아연 이온 근처에 위치하지만, 그와 배위하지는 않는데, 이는 보고된 바 있는 (Andreini et al., 2011) 기타 아연 목걸이 모티프와 일치하고, Cys344가 알라닌으로 돌연변이되는 것이 PLP2 도메인의 촉매적 활성에 전혀 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주는 기존의 발견 내용과 일치한다 (Snijder et al., 1995). 상기 시스테인 중 3개 (Cys 319, 349, 및 354)가 아르테리바이러스에 완전히 보존되고, 이들 잔기와 Cys356을 대상으로 돌연변이 분석한 결과, 그들의 존재가 촉매적 활성에 필수적인 것으로 입증되었다 (Snijder et al., 1995). 그러나, 그것이 활성 부위로부터 멀리 떨어져 있다는 것을 고려해 볼 때 (약 25Å) (도 1A), 아연 핑거는 촉매 작용에 참여하는 것과 는 반대로 구조적 역할을 하는 것으로 보인다. 아연의 부재 하에서 성장된 (M9 배지) 이. 콜라이에서 PLP2 도메인이 발현되면 불용성 단백질이 산출되는데, 이는 아연 핑거가 구조적이고 프로테아제의 정확한 폴딩에 요구되는 것으로 예상된다는 발상을 뒷받침해준다.

PLP2 활성 부위는 촉매적 시스테인 친핵체 (Cys270) 및 히스티딘 (His332) 잔기를, His332의 이미다졸 고리와 수소 결합되어 수반되는 아스파라긴 (Asn263)과 함께 함유한다 (도 1C). Cys270의 측쇄는 3-프로필아민 (3CN) 변형을 통하여 Ub의 C-말단과 공유적으로 커플링되는데, 이는 촉매적 반응의 아실-효소 중간 단계를 모방하고 Cys270의 실체를 촉매적 친핵체로서 확인시켜 준다 (도 1A, C).

아르테리바이러스 PLP2는 전형적인 OTU-도메인 구조에서 벗어난다. OTU 슈퍼패밀리의 구성원은 아르테리바이러스 PLP2의 구조적 동족물로서 분류되는데, 이는 이러한 슈퍼패밀리의 구성원으로서의 그의 분류를 뒷받침해준다. 그러나, 아르테리바이러스 PLP2와 OTU-도메인 프로테아제 간의 서열 유사성은 극히 약하고 (Makarova et al., 2000), 실제로 EAV PLP2 구조는 전형적인 OTU-폴드에서 상당히 벗어나는 위상학적 특색을 나타낸다. 공지된 OTU-도메인 구축물의 도메인 I은 2개의 내부 나선에 대해 수직으로 패킹되는 한 쌍의 용매 노출된 알파 나선을 함유한다 (도 1D, G, H). 이러한 내부 나선이 PLP2에 보존되긴 하지만 (α1 및 α2), 용매 노출된 나선은 상기 언급된 3-나선 다발을 형성하기 위해 나선 α1 및 α2와 평행으로 패킹되는 단일 나선 (α4)에 의해 대체된다 (도 1A, F). 이러한 위상학은 파파인의 L 도메인과 미묘하게 유사하고 (Kamphuis et al., 1984), Ub와의 복합체에서 결정되었던 다른 OTU-도메인 DUB와 비교해서 Ub 결합성에 대한 그의 기여도와 PLP2의 도메인 I의 크기를 현저하게 감소시킨다 (Akutsu et al., 2011; Capodagli et al., 2011; Huang et al., 2012; James et al., 2011; Messick et al., 2008).

공지된 OTU-도메인 구조로부터의 더 두드러진 차이는 PLP2의 도메인 II에 아연 핑거가 존재하고 (도 1A, B) 그것이 촉매적 활성에 결정적으로 중요하다는 것이다 (Snijder et al., 1995). 아연 핑거를 함유하는 Ub-결합 도메인은 수많은 OTU-도메인 DUB 내에 존재하지만, OTU-도메인 폴드 내의 원위 Ub 결합 부위의 일부를 포함하지는 않는다. 이들은 대신, 가요성 링커를 통하여 OTU-도메인과 연결되는 보조 도메인으로서 존재하는데 (Komander et al., 2009), A20의 경우에는, 이들이 부가의 폴리유비퀴틴 연쇄 특이성을 제공하고 상기 단백질이 특이적 신호 전달 복합체를 표적으로 하는 것이 가능한 것으로 보인다 (Bosanac et al., 2010). PLP2의 경우, 아연 핑거 모티프는 OTU-폴드의 구성 요소이고, 다음에 기재되는 바와 같이, 프로테아제 표면 상의 원위 Ub 분자를 결합시키고 위치 설정하는 데 있어서 중추적인 역할을 한다 (도 1). 현재에는, OTU-도메인 DUB가 그들의 구조적 특징을 기초로 하여 3가지 하위부류로 통합 정리된다: 오튜바인(Otubain), A20-유사 OTU 및 OTU (Komander et al., 2009).

EAV PLP2의 놀랍고도 독특한 특색을 고려해 볼 때, 본 발명자들은 지금, 아르테리바이러스 PLP2 효소가 아연-의존성 OTU의 새로운 (네 번째) 하위부류를 나타낸다고 믿고 있다. 아르테리바이러스 PLP2 및 CCHFV OTU는 이들이 세포성 표적으로부터 Ub 이외에도 ISG15를 제거한다는 점에서 진핵성 OTU-도메인 DUB로부터 독특하다. CCHFV OTU에 대해 관찰된 ISG15-태그부착된 기질에 대한 교차 반응성은, ISG15의 C-말단 Ub-유사 도메인과 Ub 둘 다를 수용할 수 있도록 Ub-결합 부위를 변형시키는 이러한 부위 상의 독특한 β-헤어핀으로부터 주로 발생된다 (Akutsu et al., 2011; James et al., 2011). 놀랍게도, 아르테리바이러스 PLP2가 또한, ISG-태그부착된 기질에 대한 교차 반응성을 나타내긴 하지만, β-헤어핀 구조가 PLP2 내에 완전히 부재하고 아연-핑거 모티프의 나선 α3에 의해 대체된다는 사실이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 흥미롭게도, CCHFV OTU 상의 β-헤어핀의 역할에 따라서, 나선 α3의 잔기는 Ub의 소수성 'Ile44 패치' (Ub 결합 단백질에 의해 통상적으로 표적화된 부위) (Dikic et al., 2009)와 결합하고, CCHFV OTU에 대해 관찰된 바와 등가의 방식으로 Ub가 PLP2 도메인과 결합하는 것을 도와준다 (도 1E). 이러한 결합 방식으로, CCHFV OTU는 Ub 상에 존재하지 않는 ISG15 상의 부가의 벌키 잔기를 수용할 수 있는데, 이는 EAV PLP2 도메인에도 또한 존재할 것으로 보이는 특색이다.

상기와 같이, Ub 및 ISG15를 표적화하는 그의 이소펩티다제 활성 이외에도, 아르테리바이러스 PLP2는 또한, 레플리카제 폴리단백질의 성숙화 공정의 일부로서 바이러스성 폴리단백질 내의 특이적 펩티드 결합을 절단시킨다. PLP2 활성 부위로부터의 나선 α3의 거리를 고려해 볼 때 (도 1A), 바이러스성 폴리펩티드 내의 선형 nsp2/nsp3 접합부와 결합하고 이를 절단시킬 수 있는 효소의 능력에는 영향을 미치지 않으면서 PLP2의 DUB 및 탈ISG화 활성을 선택적으로 붕괴시킬 것인 돌연변이가 Ub-결합 부위의 상기 영역 내로 도입될 수 있었다는 사실이 본 발명에 의해 처음으로 결정될 수 있었다. 이러한 발견은 EAV의 추정상의 nsp2/nsp3 절단 부위 (828-RLIGG↓-832)가 Ub 및 ISG15의 C-말단 꼬리 (RLRGG↓)와 밀접하게 유사하긴 하지만, 이러한 절단 부위의 nsp2 서열 상류가 Ub-유사 폴드를 갖는 것으로 여겨지지 않다는 관찰 결과에 의해 강화되었는데, 이는 대다수의 PLP2 Ub-결합 부위가, 상기 효소가 nsp2/nsp3 접합부를 인식하고 절단하는 데 필요하지 않다는 것을 시사한다.

본 발명의 장점 중의 하나는 아르테리바이러스의 PLP2 도메인에 대한 3D-구조, 그리고 무엇보다도 1.45Å 해상도가 본 발명에 의해 밝혀졌다는 것이다. 따라서, PLP2 디유비퀴티나제 및 폴리단백질 절단 활성의 구조-유도 디커플링을 수행하는 것이 본 발명에 의해 처음으로 가능하고; 본 발명에 따른 아르테리바이러스, 즉 여전히 복제-적격하지만 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 아르테리바이러스를 제공하기 위하여, 모든 아르테리바이러스 내의 PLP2 도메인의 어느 영역이 변형될 수 있거나 변형될 수 없다는 것이 본 발명에 의해 처음으로 합리적으로 결정될 수 있다.

단지 한 예로서, PLP2, 유비퀴틴 및 PLP2-유비퀴틴 결합 표면의 3D-구조가 아르테리바이러스 EAV에 대해, 보다 구체적으로는 균주 부시루스(Bucyrus) (진뱅크(GeneBank) 수탁 번호 NC_0022532)에 대해 도 2에 제공되어 있다. 그러나, 다음이 강조된다: PLP2-유비퀴틴 복합체의 결정 구조를 수득하기 위하여 본원에 제공된 결정화 방법과 발현 방법의 새롭게 개발된 조합이 일반적으로 모든 아르테리바이러스의 PLP2 도메인에 적용 가능하다. 이러한 점에서 그것은 주로, PLP2 도메인의 단순한 아미노산 서열이라기 보다는, 유비퀴틴 결합 표면을 결정하는 PLP2 도메인의 3D-구조라는 것을 실현시키는 것이 또한 중요하다. 이는 도 3에 제시된 다중 서열 정렬로부터 바로 나온 것이다. 이러한 구조상 기능적인 정렬은 EAV 부시루스 균주 뿐만 아니라 대표적이긴 하지만 독특한 3개의 PRRSV 균주, 즉 GM2 (중국 사육장 균주), 렐리스타트(Lelystad) (원형 유럽 균주) 및 VR-2332 (원형 북미 균주)의 PLP2 서열을 포함한다. 개별 아미노산의 특징 및 다양한 균주 내의 아미노산의 수에 있어서의 차이 둘 다와 관련해서 (이로써 정렬 중의 여러 위치에 존재하는 갭이 생성됨), 다양한 아르테리바이러스 서열들 간에 상당 수의 차이가 존재한다는 것을 즉시 알 수 있다. 그럼에도 불구하고, EAV 부시루스 균주의 PLP2 도메인의 유비퀴틴 결합 표면의 3D-구조와, PRRSV 균주 GM2, 렐리스타트 및 VR-2332에 대한 비교 분자 모델링에 의해 예측된 3D-구조는 현저하게 유사하다. 이는 도 4에 예시되어 있는데, 여기에는 EAV 균주 부시루스, PRRSV 균주 렐리스타트 및 PRRSV 균주 VR-2332의 PLP2-유비퀴틴의 구조적 모델이 도시되어 있다. 다시 언급하면, 아미노산 서열과 수에 있어서의 차이에도 불구하고, EAV 및 상기 2개의 PRRSV 균주의 PLP2 도메인의 유비퀴틴 결합 표면은 현저하게 유사하다는 것을 바로 알 수 있다.

그리고 사실상 이는 다음 예상에 따른다: 모든 아르테리바이러스성 PLP2 도메인은 동일한 촉매적 코어를 이용하고, 이러한 프로테아제의 극히 복잡한 기질 특이성으로 인해, 3D-구조는 아르테리바이러스 과의 다양한 구성원들 간에 잘 보존되어야만 한다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 실시양태는 비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다.

비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인은 극히 짧은 도메인이고; 예를 들어, EAV 균주 부시루스의 PLP2 도메인은 단지 127개 아미노산 (서열 9)으로 이루어지고, PRRSV 균주 렐리스타트의 PLP2 도메인은 단지 136개 아미노산 (서열 10)으로 이루어진다. 예를 들어, PRRSV 균주 VR-2332의 PLP2 도메인은 139개 아미노산 (서열 11)으로 이루어진다. 도 3은 EAV 균주 부시루스, PRRSV 균주 렐리스타트, PRRSV 균주 VR-2332 및 PRRSV 균주 GM2에 대한 PLP2 도메인의 서열 정렬을 나타낸다 (하기 참조). 도 4는 EAV PLP2에 대한 그들 각각의 서열의 정렬을 기초로 한 VR-2332 및 렐리스타트의 분자 모델을 도시한 것이다. 일단 EAV PLP2에 정렬되면, 이는 VR-2332 또는 LV의 서열이 EAV PLP2 결정 구조의 3D 백본 구조 상으로 치환될 수 있게 해준다. 달리 언급하면, EAV PLP2 도메인의 아미노산 측쇄가 다중 서열 정렬에 의해 표시된 바와 같이 VR-2332 또는 LV의 아미노산 측쇄에 의해 대체된다. 거기에서, 누락된 루프가 처음부터 모델링되고 전체적인 3D 모델은 표적 기능을 최소화하는 적절한 에너지를 이용하여 최적화된다.

도 3에 제시된 바와 같은 EAV의 PLP2 도메인의 아미노산 서열의 넘버링은 박스 내에 있는 다양한 영역을 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, 이러한 넘버링은 PLP2 도메인의 "컨센서스 넘버링"으로서 지칭된다.

본원에서 정의된 바와 같이, 복제-적격 아르테리바이러스는 여전히 복제할 수 있는, 즉 감염성 자손 바이러스를 생산할 수 있는 바이러스이다. 감염성 자손 바이러스는 복제-적격 감염성 자손 바이러스이거나 또는 복제-결함있는 감염성 자손 바이러스일 수 있다.

본 발명에 따른 복제-적격 바이러스는 생 약독화 아르테리바이러스 백신에 대한 기준으로서 매우 적합하다. 그러나, 백신에 사용하기 위해 충분한 양의 바이러스를 생산하기 위해서는, 자손 바이러스의 양이 충분히 높아야만 한다. 따라서, 본 발명의 목적상, 복제-적격 바이러스는 동일한 세포 시스템에서 본 발명에 따른 돌연변이 없이 동일한 바이러스에 의해 생산된 자손 바이러스의 양 아래에 3 ¹⁰log보다 크지 않은 양으로 감수성 세포 시스템에서 자손 바이러스를 생산하는 바이러스이다. 단지 한 예로서, 특정 양의 PRRSV 균주가 특정의 세포 배양 시스템에서 1,000,000개의 감염성 자손 바이러스 입자를 생산하는 경우, 본 발명에 따른 돌연변이를 수반하는 동일한 균주는 복제-적격 바이러스로서의 자격을 얻기 위하여 1000개 이상의 감염성 입자를 생산해야만 한다. 바람직하게, 자손 바이러스의 양은 동일한 세포 시스템에서 본 발명에 따른 돌연변이를 수반하지 않은 바이러스에 의해 생산된 자손 바이러스의 양 아래에 2 ¹⁰log보다 크지 않다.

보다 바람직하게, 자손 바이러스의 양은 상기 양 아래에 1 ¹⁰log보다 크지 않다.

본 발명의 목적상, 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 본 발명에 따른 아르테리바이러스는 이러한 바이러스가 야생형 바이러스에 의해 나타낸 인터페론 베타 mRNA 유도의 양 보다 적어도 2배 수준으로 인터페론 베타 mRNA 유도 상의 증가를 나타내도록 PLP2 도메인에서의 돌연변이를 갖는 바이러스이다. 실시예 섹션에서는, 인터페론 베타 mRNA 유도의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있는 실시간 정량적 PCR 반응에 관한 설명이 제공된다. 그 실시예에서는, EAV 야생형 바이러스 및 본 발명에 따른 돌연변이체의 인터페론 베타 mRNA 유도 수준을 시험하고 비교한다.

RT-PCR에서 EAV IFN 베타 mRNA 시험에 필요한 프라이머는 표 2에 제공되어 있다. 문헌 (Artursson K, et al., J. Interferon Res. 12(3):153-160 (1992))에는, 돼지 IFN 베타의 서열이 제공되어 있는데, 이로써 통상의 기술자는 본 발명에 따른 PRRS 바이러스 돌연변이체의 IFN 베타 mRNA 유도 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있는 실시간 PCR 반응에 대한 거의 동등한 수준의 프라이머를 설계할 수 있다.

도 9A에는, 예를 들어 EAV 돌연변이체 I353R이 이러한 I353R 돌연변이를 포함하지 않는 야생형 바이러스와 비교해서 IFN 베타 mRNA를 약 4배 정도 생산한다는 것이 도시되어 있다. 도 9A에서의 3중-돌연변이체는 심지어, 야생형 바이러스와 비교해서 IFN 베타 mRNA를 약 8배 정도 생산한다.

도 6B로부터 알 수 있는 바와 같이, T312A와 같은 돌연변이체는 야생형 바이러스 보다 상당히 더 조밀한 알파-플래그 레인 (이는 나머지 유비퀴틴 접합체의 양을 나타냄)을 초래하는 수준의 DUB-활성을 이미 보여준다. 인접한 I353R 레인 (이에 대해 도 9A에 도시된 상응하는 돌연변이된 바이러스는 야생형 바이러스와 비교해서 IFN 베타를 4배 정도 생산함)은 T312A 레인 보다 약 2배 더 높은 알파-플래그 레인의 밀도를 나타낸다. 이러한 이유로 인해, 본 발명자들은 야생형 바이러스에 의해 나타낸 인터페론 베타 mRNA 유도의 양 보다 적어도 2배, 바람직하게 4배, 보다 바람직하게 8배 수준으로 인터페론 베타 mRNA 유도 상의 증가를 나타내도록 PLP2 도메인에서의 돌연변이를 갖는 바이러스가, 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 바이러스인 것으로 간주한다.

본 발명의 목적상, 돌연변이는, 예를 들어 다음에 설명되는 바와 같이 대체, 삽입 또는 결실일 수 있다.

도 3에는, 아르테리바이러스의 4가지 상이한 예의 PLP2 도메인에 관한 개요가 제공되어 있다: EAV 균주 부시루스, 및 PRRSV 균주 GM2, 렐리스타트 및 VR-2332. 서열들을 정렬하고 관련 영역을 박스로써 표시한다. 이 도면은 도 2 및 4와 밀접하게 관련하여 이해되어야 한다. 도 2는 EAV의 PLP2 도메인의 3D-구조, 및 유비퀴틴이 이러한 구조와 결합하는 방식을 도시한 것이다. 도 4는 PRRSV 균주 렐리스타트 및 VR-2332의 PLP2 도메인의 예측되는 3D-구조, 및 유비퀴틴이 이러한 구조와 결합하는 방식을 도시하고 있는데, 비교를 위해 EAV 균주 부시루스의 PLP2 도메인의 결정 구조가 나란히 도시되어 있다. 점선을 따라 박스 내에 있는 도 3의 잔기는 거의 활성 부위라고 할 수 있고, 유비퀴틴의 RLRGG 모티프와 상호작용하는 잔기를 나타낸다. 이들 잔기를 돌연변이시키는 것이 PLP2 도메인의 폴리단백질 프로세싱 활성에 영향을 미치는 것으로 예상되므로, 바람직하게는 피해야 한다. 실선을 따라 박스 내에 있는 잔기는 유비퀴틴의 베타-그래스프 폴드 (즉, 유비퀴틴의 주요 몸체)와 직접적으로 결합되지만, 거의 활성 부위라고 할 수 없는 잔기를 나타낸다. 아연-결합 부위와 이러한 부위를 바로 둘러싸고 있는 잔기는 유비퀴틴의 베타-그래스프 폴드 및 아마도 ISG15의 C-말단 도메인의 유사한 영역과 결합되는 PLP2 도메인의 대다수의 유비퀴틴 상호작용 표면을 형성한다.

상기 언급된 바와 같이 (그리고 도 3에서의 정렬로부터 알 수 있는 바와 같이), 그것은 어느 아미노산 잔기가 유비퀴틴 상호작용 표면을 형성하는 지를 결정하는 3D-구조이다. 이는 또한 도 4C를 따른데, 여기서 PRRSV 균주 렐리스타트의 경우에는, 특히 Thr478, Val479 및 Val520이 유비퀴틴과 결합하는 것으로 예측되는 반면, PRRSV 균주 VR-2332의 경우에는, 상기 역할이 Ala486, Leu487 및 Cys528에 의해 수행되고, EAV 균주 부시루스의 경우에는, 상기 역할이 Thr312, Ile313 및 Ile353에 의해 수행되는 것으로 도시되어 있다.

본 발명의 첫 번째 실시양태의 바람직한 형태에서, nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는, 복제-적격 아르테리바이러스는 EAV 및 PRRSV로 이루어진 바이러스의 군으로부터 선택된다.

도 3은 주요 EAV 및 PRRSV 균주를 나타내는 4개의 아르테리바이러스 서열의 유비퀴틴 상호작용 표면 정렬을 규정하는 구조상 정렬된 서열을 나타낸다. 이러한 정렬은 실제로, 박스가 도 4에서 나란히 도시된 바와 같은 모델 (PRRSV) 또는 결정 구조 (EAV)에 따라서, 모든 경우에 유비퀴틴과 상호작용하는 각각의 PLP2 아미노산 서열의 영역을 표시한다는 의미에서 구조적이다.

도 3 및 4C로부터, 유비퀴틴과의 상호작용 표면에서의 그들의 위치와 관련해서, 하나의 아르테리바이러스 내의 어느 아미노산이 또 다른 아르테리바이러스의 아미노산에 상응하는지를 알 수 있는데, 예를 들어 EAV 내의 I313은 LV 내의 V479, 및 VR2332 내의 L487에 상응한다.

비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는, 복제-적격 아르테리바이러스를 수득하기 위하여, 도 3의 관점에서 구조상 정렬된 PLP2 서열 내의 실선을 따라 박스 내에 있는 영역 내에서 및/또는 이러한 영역에 근접해서 돌연변이를 만드는 것이 바람직할 것이다. 도 3에서의 아미노산 넘버링은 아르테리바이러스의 4가지 예에 대해 나타낸 것이다: EAV 균주 부시루스, 및 PRRSV 렐리스타트, VR-2332 및 GM2. 다른 아르테리바이러스 PLP2 서열도 도 3에 이미 제시된 서열과 동등하게 구조상 정렬될 수 있다는 것은 명백하다. 상기 표시된 바와 같이, 용이한 참조를 위해, 도 3에 제시된 바와 같은 EAV의 PLP2 도메인의 아미노산 서열의 넘버링은 박스 내에 있는 다양한 영역을 지칭하기 위해 사용된다.

따라서, 상기 실시양태의 보다 바람직한 형태는 PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 296-297 및/또는 309-319 및/또는 326-330 및/또는 345-355 중 어느 것에 위치하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다. 이 도면에서, PRRSV 렐리스타트에 대한 위치는 각각 463-464, 475-485, 492-496 및 512-522이다. PRRSV VR-2332 및 PRRSV GM2의 경우에는, 그 위치가 471-472, 483-493, 500-504 및 520-530이다.

상기 실시양태의 보다 더 바람직한 형태는 PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 296-297 및/또는 310-318 및/또는 327-329 및/또는 346-354 중 어느 것에 위치하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다. 단지 한 예로서, 예를 들어 PRRSV 렐리스타트에 대한 이들 위치는 463-464, 476-484, 493-495 및 513-521이다.

상기 실시양태의 또한 보다 더 바람직한 형태는 PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 296-297 및/또는 311-317 및/또는 328 및/또는 347-348 및/또는 351-353 중 어느 것에 위치하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다.

본 발명자들은 한 예로서 부위 지시된 돌연변이 유발을 통하여, 예를 들어 EAV PLP2 유비퀴틴 상호작용 표면의 위치 Thr312, Ile313 및 Ile353이 상기 효소의 DUB 활성에 중요하고, IFN 반응을 저해할 수 있는 EAV 바이러스의 능력에 중요하다는 사실을 입증하였다. PRRSV 균주 렐리스타트 내의 유사한 위치 (Thr478, Val479 및 Val520) 및 VR2332 내의 유사한 위치 (Ala486, Leu487 및 Cys528), 및 DUB 및 탈ISG화 활성에 중요한 것으로서 확인된 영역 내에서의 이웃하는 아미노산이 또한, PRRSV에서의 동일한 효과를 달성하기 위해 돌연변이될 수 있다. EAV PLP2 도메인의 위치 Ile313 (렐리스타트 PLP2의 Val479, VR2332 PLP2의 Leu487) 및 Ile353 (렐리스타트 PLP2의 Val520, VR2332 PLP2의 Cys528)이 유비퀴틴 상호작용 표면의 용매-노출된 표면 상에 존재한다는 사실을 고려해 볼 때, 렐리스타트 또는 VR2332 PLP2 도메인 상의 이들 위치는 DUB 및 탈ISG화 활성을 선택적으로 붕괴시키는 다양한 아미노산으로 돌연변이될 수 있었다. 이러한 아미노산은, 예를 들어 Ala, Arg, Ser, Thr, Trp을 포함한다 (이에 대해, 본 발명자들은 EAV PLP2 도메인 내의 위치 353에서 그것이 허용될 수 있다는 것을 이미 입증함). EAV PLP2의 Thr312 (렐리스타트 PLP2의 Thr478, VR2332 PLP2의 Ala486)의 측쇄를 꽉 조인 루프 내에 패킹하므로, 이러한 위치에서의 돌연변이는 루프를 미스폴딩할 수 있을 정도로 최대한 더 보존시킬 필요가 있다. 이러한 위치에서의 가능한 돌연변이는, 예를 들어 Gly (EAV, 렐리스타트 및 VR2332의 경우), Ala 또는 Ser (EAV 및 렐리스타트의 경우)를 포함한다.

상기 실시양태의 가장 바람직한 형태는 PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 컨센서스 위치 T312, I313 또는 I353에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다.

이러한 가장 바람직한 형태의 구체적 형태는 상기 아르테리바이러스가 EAV이고, PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 T312A, I313V, I353A, I353R, I353S, I353T 또는 I353W인 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다.

유비퀴틴과 직접적으로 결합하는 PLP2 도메인의 유비퀴틴 상호작용 표면의 잔기 (도 3에서 실선을 따라 박스 내에 있음) 이외에도, 유비퀴틴 상호작용 표면을 구조상 뒷받침해주고 이러한 표면의 외형을 규정하는 데 도움을 주어 유비퀴틴 (및 ISG15)의 구조에 상보적이 되도록 하는 수많은 잔기가 존재한다. PRRSV 균주 렐리스타트 및 VR-2332로부터의 PLP2 도메인의 비교 분자 모델 및 EAV PLP2 도메인의 3D 결정 구조를 기초로 하여, EAV PLP2의 잔기 303-306 (렐리스타트 PLP2의 470-473 및 VR-2332 PLP2의 478-481)은 PLP2 효소의 유비퀴틴 상호작용 표면 아래에 나선 2를 위치시키는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 영역 내의 잔기를 돌연변이시키는 것은 나선 2의 적절한 위치 설정에 영향을 끼쳐, 유비퀴틴 상호작용 표면의 왜곡을 유발시키므로 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 초래하는 데 사용될 수 있었다. 이들 잔기가 PLP2 활성 부위로부터 멀리 떨어져있다는 것을 고려해 볼 때, 그들의 돌연변이는 바이러스성 폴리단백질 프로세싱에 대한 최소한의 효과를 나타내면서 DUB/탈ISG화 활성을 감소시키는 데 사용될 수 있었다.

따라서, 상기 실시양태의 또 다른 더 바람직한 형태는 PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 303-306 중 어느 것에 위치하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다. 상기 도면에서, PRRSV 렐리스타트에 대한 위치는 470-473이다. PRRSV VR-2332의 경우에는, 그 위치가 478-481이다.

유사하게, EAV PLP2의 잔기 343-346 (렐리스타트 PLP2의 510-513 및 VR-2332 PLP2의 518-521)은 Ub와 수많은 주요 결합 상호작용을 형성하는 구조인 아연 핑거 모티프의 나선 3을 위치 설정하는 데 도움을 준다. 이러한 영역 내의 잔기를 돌연변이시키는 것은, 바이러스성 폴리단백질 프로세싱에 영향을 미치지 않으면서 DUB/탈ISG화 활성을 선택적으로 감소시키기 위해 아연 핑거 모티프 및 그를 둘러싸고 있는 유비퀴틴 상호작용 표면의 위치를 왜곡시킬 수 있었다.

따라서, 상기 실시양태의 또한 또 다른 더 바람직한 형태는 PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 343-346 중 어느 것에 위치하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다. 상기 도면에서, PRRSV 렐리스타트에 대한 위치는 510-513이다. PRRSV VR-2332의 경우에는, 그 위치가 518-521이다.

또한, EAV PLP2 잔기 Phe350 (렐리스타트 PLP2의 Val517 및 VR-2332 PLP2의 Val525)은 아연 핑거의 나선 3 상에 위치하고 나선 2에 대해 나선 3을 패킹하는 데 참여한다. 유비퀴틴을 결합하는 데 있어서의 나선 3의 중요성을 고려해 볼 때, EAV PLP2 잔기 Phe350 (렐리스타트 PLP2의 Val517 및 VR-2332 PLP2의 Val525)을 돌연변이시키는 것은 나선 3을 변위시킴으로써, DUB/탈ISG화 활성을 선택적으로 감소시키기 위해 사용될 수 었었다.

따라서, 상기 실시양태의 또한 또 다른 더 바람직한 형태는 PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 350에 위치하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다. 상기 도면에서, PRRSV 렐리스타트에 대한 위치는 517이다. PRRSV VR-2332의 경우에는, 그 위치가 525이다.

DUB 및 탈ISG화 활성에 대해 중요한 것으로 여겨진 PLP2 효소의 영역 내로 도입될 수 있는 잔기 돌연변이의 유형은 돌연변이시키고자 하는 잔기(들)의 국지적 환경에 좌우되고 과도한 부담없이 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 이러한 잔기가 유비퀴틴 상호작용 표면 상에 있고, 유비퀴틴의 소수성 영역에 대해 패킹되는 소수성 측쇄 (예를 들어, 류신)을 갖는 경우, 허용 가능한 돌연변이는 다음을 포함할 수 있었다: 1) 측쇄의 완전한 제거 (즉, 글리신으로 치환됨), 2) 소수성 상호작용을 정전기적으로 붕괴시키기 위한 극성 측쇄 (예를 들어, Asp, Glu, Ser 등)로의 치환, 3) 상기 상호작용을 입체적으로 붕괴시키기 위한 대형 벌키 잔기 (예를 들어, Trp, Arg, Lys)로의 치환. 주: Arg과 Lys은 둘 다 극성이고 벌키하므로, 상승적 효과를 제공하여 상기 위치에서 상호작용의 상당한 붕괴를 초래한다. 유비퀴틴 상호작용 표면 전체에 걸친 상기 돌연변이의 조합을 이용하여 DUB 및 탈ISG화 활성에 있어서의 최대의 감소를 달성할 수 있었다.

표적화 잔기가 숨겨진 소수성 잔기인 경우, 치환은 좀 더 보존적일 필요가 있는데, 즉 치환은 바람직하게, 전반적으로 적절한 단백질 폴딩은 보유하지만, DUB 및 탈ISG화 활성을 감소시키기 위해 유비퀴틴 상호작용 표면을 왜곡시키도록 변경된 외형을 갖는 또 다른 소수성 잔기에 의해 이루어져야 한다.

표적화 잔기가 단백질 안정화를 위해 필요한 중요한 정전기적 상호작용을 형성하는 경우에는, 이러한 상호작용을 보유하는 치환만이 상기 위치에 도입될 수 있다.

상기 돌연변이 유발 지침의 예는 EAV PLP2 효소에서 수행되었던 치환에 대해 관찰될 수 있다 (표 1). 예를 들어, Thr312의 측쇄는 꽉 조인 루프 내에 패킹되는데, 여기서 위치 312에서의 부가의 벌크가 상기 루프의 외형을 왜곡시켜, 가능하게는 단백질 미스폴딩을 유발시키는 것으로 예상된다. 실제로, T312A가 허용되긴 하였지만, T312L 및 T312V는 상기 바이러스에 치명적이었다. T312L은 루프 구조를 붕괴시키므로 바이러스에 대해 치명적인 것으로 예상되는 좀 더 벌키한 측쇄를 도입하는 반면, T312V는 바이러스 생육성에 필요한 것으로 보이기도 하는 극성 히드록실 기를 제거한다. 이와는 달리, Ile353의 측쇄는 유비퀴틴 상호작용 표면 상에 완전히 노출된다. 달리 언급하면, 이러한 잔기의 측쇄는 PLP2 구조에 대해 패킹되지 않거나 또는 이러한 구조의 어느 부분도 지지하지 않으므로, 상기 위치에서 조사된 모든 측쇄 치환은 허용되었다 (T353Ala, Arg, Ser, Thr, Trp).

또한, EAV PLP2 결정 구조를 본 발명에서 사용하여, 문헌 (Sun et al. (2010))에 의해 PLP2 도메인에 대해 이루어진 치환의 결과를 설명할 수 있다. 예를 들어, Cys429Ala, 및 His498Ala 치환은 생존할 수 없는 바이러스를 산출시켰는데, 이는 이들 잔기가 활성 부위의 촉매적 잔기를 포함하기 때문이지만, Asp458Ala는 생존 가능한 바이러스를 생산하면서도, NF-κB 활성화에 어떠한 영향도 미치지 않았는데, 이는 EAV PLP2 구조에 따라서, 상기 위치에서의 주쇄 카르보닐 기만이 유비퀴틴과 상호작용하기 때문이다. 따라서, 아마도 프롤린을 제외하고는, 상기 위치에서의 측쇄 치환은 PLP2의 촉매적 기능에 영향을 미치지 않을 것이다. 그러나, Ser462Ala는 또한, Ub-의존성 NFκB 활성화를 저해할 수 있는 능력이 약간 감소된 (2배) 생존 가능한 바이러스를 산출시켰다. EAV PLP2 구조를 기초로 하여, 상기 위치에서의 극성 잔기, 예컨대 Ser (SD-0180 PLP2) 또는 Asp (EAV PLP2)는 유비퀴틴의 Arg74의 수소-결합의 거리 이내인데, 이는 PLP2 활성 부위에 매우 근접하다. 이러한 부위에서의 돌연변이는 DUB 활성을 저해함과 동시에, 또한 폴리단백질 프로세싱을 저해할 수 있었는데, 이는 Asp458Ala 돌연변이체와 비교해서 감소된 Ser462Ala의 바이러스성 역가에 의해 입증되는 바와 같다. 문헌의 저자 (Sun et al.)에 의해 창출된 세 번째 생존 가능한 돌연변이 (Asp465Ala)는 잔기가 유비퀴틴과 직접적으로 상호작용할 수 없게 하는 위치에서 나선 2 내에 존재한다. 이러한 잔기는 PLP2 도메인의 3-나선 다발 내의 상호작용을 패킹하는 데 중요한 것으로 보이므로, 이러한 돌연변이가 NFκB 활성화에 영향을 미치기는 하였지만, 바이러스 역가에 대해 가장 큰 부정적 효과를 지니고 있었는데, 이는 나선형 다발의 붕괴가 PLP2 도메인의 전반적인 안정성에 불리한 영향을 미치기 때문인 것으로 예상된다.

측쇄 치환 (부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 발생된 점 돌연변이) 이외에도, 유비퀴틴 상호작용 표면을 포함하는 PLP2 도메인의 영역 내의 잔기(들)의 결실 및/또는 삽입을 이용하여, PLP2 도메인의 DUB 및 탈ISG화 활성을 특이적으로 붕괴시킬 수 있었다. 예를 들어, PRRSV 균주 렐리스타트의 서열 479-484 (VR-2332의 487-492, EAV의 313-318) 내에 부가의 잔기를 삽입하면, 유비퀴틴 상호작용 표면에서 효소 표면 상에 부가의 벌크가 도입됨으로써, 활성 부위 영역에 영향을 미치지 않으므로 PLP2 도메인에 의한 폴리단백질 프로세싱에 영향을 미치지 않으면서, 유비퀴틴과 ISG15 결합을 붕괴시킬 수 있었다. 유비퀴틴 상호작용 표면을 왜곡시키기 위해 잔기를 삽입하거나 결실시키는 상기 전략은, 돌연변이될 수 있는 것으로 상기 표시되는 PLP2 도메인 내의 어느 부위도 이용할 수 있었다. 바람직하게, 잔기를 삽입하거나 결실시키는 전략은 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 296-297 및/또는 303-306 및/또는 309-319 및/또는 326-330 및/또는 343-355 중 어느 것에서 PLP2 도메인에 적용된다. 보다 바람직하게, 상기 전략은 도 3에서 실선을 따라 박스 내에 있는 PLP2 도메인의 영역에 적용된다.

자발적인 무작위 돌연변이가 자연계에서 발생한다는 것은 일반적으로 공지되어 있는데, 이는 본 발명에 따른 바이러스를 수득하기 위하여 의도적으로 만들어진 돌연변이는 추가의 자발적 돌연변이를 진행할 수 있다는 것을 의미한다. 최악의 경우에는, 이러한 돌연변이로 인해, 본 발명에 따른 바이러스가 더 이상 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 나타내지 않는 바이러스로 복귀된다. 본 발명의 이점 중 하나는, 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 초래하는 돌연변이가 만들어질 수 있는 몇 가지 위치가 본 발명에 의해 확인될 수 있다는 것이다. 이는 단지 하나의 돌연변이만이 만들어지는 것이 아니라, 확인된 바와 같은 영역 내에서 둘 이상의 돌연변이가 본 발명에 의해 가능하다는 것을 의미한다. 이러한 돌연변이체는 복귀되는 경향이 훨씬 덜 한데, 이는 이미 낮은 복귀 돌연변이 발생 기회가 훨씬 더 감소되기 때문이다.

따라서, 본 발명에 따른 가장 바람직한 복제-적격 아르테리바이러스는 적어도 2가지의 돌연변이를 포함하는데, 이들 각각이 감소된 DUB/탈ISG화 활성에 기여하고 있다. 단일 아미노산에서의 돌연변이를 초래하는 것과 함께, 뉴클레오티드 수준에서의 2가지 연속되는 돌연변이가 또한 이러한 면에서, 적어도 2가지의 돌연변이를 포함하는 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스의 정의 내에 포함되는 것으로 간주된다는 점이 강조된다. 이러한 돌연변이의 한 예가 상기 언급된 EAV I353R 돌연변이체이다.

본 발명에 따른 바이러스를 초래하는 돌연변이를 만들기 위해 3D-구조의 정보를 어떻게 이용해야 하는지에 관한 단지 한 예로서, 결정 구조 (도 5A, B) 및 ISG15와 결합된 PLP2 도메인의 비교 분자 모델 (도 5C, D)을 기준으로 하여, 다음을 관찰할 수 있다: Ile353이 아연 배위 부위의 C4 (Cys354) 다음의 나선 α3의 C-말단 끝에 위치한다. 이는 Ub의 Ile44 패치 내로 직접 발사되는데, 여기서 Ub의 Ile44, Val70 및 Leu8과 광범위한 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용이 일어난다. Thr312 및 Ile313은 활성 부위에 더 근접하게 위치하는데, 여기서 이들은 Ub의 잔기 Leu8, Leu71 및 Leu73과 부가의 소수성 상호작용을 한다. Thr312는 ISG15의 Asn89와 결정적인 수소 결합 상호작용을 한다 (도 5D).

이러한 정보를 기준으로 하여, 다양한 단일, 이중 및 삼중 돌연변이가 PLP2 도메인의 Ub-결합 부위 내에서의 3개의 주요 위치 (Ile353, Thr312 및 Ile313)에서 본 발명에 의해 만들어졌다.

이와 같이 만들어진 다양한 돌연변이에 관한 개요가 표 1에 제공되어 있다.

이들 돌연변이를 수반하는 재조합 바이러스로 감염 실험을 진행하기 전에, 본 발명자들은 PLP2 돌연변이체를 신속하게 스크리닝해 줄 수 있는, 사용하기 용이한 2가지 시험관내 시험을 이용하였다. 이러한 2가지 시험은 다음에 기재되어 있고, 세부 사항은 실시예 섹션에 제공되어 있으며 그 결과는 표 1에 나타나 있다.

첫 번째 시험은 역 유전학을 통하여 PLP2 도메인에서의 돌연변이를 수반하는 재조합 돌연변이체 바이러스를 시도하고 생산한 다음, 그러한 바이러스를 그의 복제 적격성에 관하여 시험하기 위하여 세포 배양 시스템에서 개시시키는 것이 필요하지 않다는 사실을 기초로 한다. 이들 PLP2 실험의 맥락에서 복제 적격성은 기본적으로, nsp2/nsp3 절단을 수행할 수 있는 돌연변이체 PLP2 도메인의 능력에 좌우되고, 이는 시험관내 시스템에서 용이하게 시험할 수 있다. 본 발명자들은 EAV 레플리카제 폴리단백질 프로세싱과 DUB/탈ISG화 활성에 대한 상기 언급된 위치에서의 다양한 돌연변이의 효과를 명확하게 규명하기 위해 시험관내 검정 및 PLP2 도메인의 이소성 발현을 사용하였다. 이를 위하여, N-말단 HA 태그를 수반하는 자가-절단성 nsp2-3 폴리단백질을 코딩하는 포유류 발현 벡터 내로 돌연변이를 도입하였다. HEK293T 세포에서 야생형 nsp2-3을 발현시키면, PLP2는 nsp2/nsp3 접합부의 절단을 매개하였다 (도 6A). 예상된 바와 같이, PLP2 활성 부위 돌연변이체 (C270A/H332A)는 nsp2/nsp3 부위의 어떠한 프로세싱도 표시하지 않았고, 단지 nsp2-3 전구체를 생산하였다 (도 6A). Ub-결합 부위가 Thr312 또는 Ile353의 대체에 의해 표적화되었던 7개 단일 부위 돌연변이체가 야생형 수준의 nsp2/nsp3 절단을 표시하였는데, 이는 폴리단백질 프로세싱이 이들 돌연변이에 의해 현저하게 영향을 받지 않는다는 것을 제안하고 있다 (도 6A). 또한, 위치 Thr312, Ile313, 및 Ile353에서의 돌연변이의 조합을 시험하였는데, 본질적으로 유사한 결과를 나타내었다 (도 6A). 보다 장 시간 노출한 결과, 심지어 야생형 PLP2의 경우에도 일부 nsp2-3 전구체 단백질이 밝혀졌지만, 그의 양은 2가지 또는 3가지 돌연변이를 조합한 경우에 미미한 수준으로만 증가되었다 (도 7B, 8).

두 번째 시험은 돌연변이된 PLP2의 감소된 DUB/탈ISG화 활성에 관하여 시험하기 위해서는, PLP2 도메인에서의 돌연변이를 갖는 복제-적격 재조합 아르테리바이러스를 만드는 것이 필요하지 않다는 사실에 기초한다. PLP2 DUB 활성에 대한 돌연변이의 효과는 FLAG-태그부착된 Ub를 발현하는 플라스미드와 조합된, 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 수반하는 nsp2-3을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 포유류 세포를 형질감염시킴으로써 시험할 수 있다. FLAG-Ub를 이소성 발현시키면, 광범위한 세포성 표적의 FLAG-태그부착된 유비퀴틴화가 초래되는데, 이는 항-FLAG 항체를 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot) 분석에 의해 가시화될 수 있다. 예상된 바와 같이, 야생형 PLP2가 발현되면, Ub-접합체의 축적이 강력하게 저하되는 반면, 활성 부위 돌연변이체의 발현은 무시할 수 있는 수준의 효과를 나타내었다 (도 6B). DUB 활성의 가장 두드러진 감소를 표시하는 PLP2 돌연변이체의 선별이 도 6B에 제시되어 있다. 이들 Ub-결합 부위 돌연변이체는 다양한 정도의 DUB 활성을 표시하였는데, 야생형과 활성 부위 돌연변이체 간에는 그 표현형이 다양하였다 (도 6B). 유사한 실험을 사용하여 PLP2의 탈ISG화 활성에 대한 이들 돌연변이의 효과를 평가하였다. 이러한 검정의 경우에는, ISG15 및 그의 접합에 필수적인 E1 (UbE1L) 및 E2 (UbcM8) 효소를 코딩하는 플라스미드의 조합물로 포유류 세포를 공동-형질감염시키면, 세포성 단백질 집단의 ISG화가 야기되었는데, 이는 항-ISG15 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 상에서 가시화될 수 있다 (도 8). 또한, 야생형 PLP2가 발현되면, ISG화 단백질의 축적이 강력하게 저하되는 반면 (도 8), 활성 부위 돌연변이체의 발현은 그렇치 못하였다 (도 8). PLP2 도메인의 탈ISG화 활성에 대한 돌연변이의 효과는 DUB 활성에 대한 그들의 효과 보다 더 평범하다 (도 8).

시험관내 검정을 수행하여, PLP2의 활성 부위 내로 유입되는 Ub 또는 ISG15의 C-말단 꼬리를 나타내는, Ub, ISG15, 및 RLRGG-펩티드 기질을 향한 활성에 대한 PLP2 내에서의 돌연변이의 효과에 관한 더 상세한 분석을 제공한다. 이러한 검정을 위해, 본 발명자들은 돌연변이체 I353R 및 T312A/I313V/I353R에 초점을 맞추었는데, 이는 이들이 세포 배양 기반 검정에서 DUB 활성에 대한 현저한 효과를 보여주었고, 활성 부위 돌연변이체와 유사한 수준의 IFN-β 프로모터 활성 억제를 표시하였으며 (다음에 기재됨), BHK-21 세포에서 돌연변이된 세포의 개시시 작동 가능한 역가를 산출하였기 때문이다 (다음에 기재됨).

펩티다제 효소의 역학은 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) (MM) 방정식을 따른다:

상기식에서, [P]는 생성물의 농도이고, t는 시간이며, [S]는 기질의 농도이고, [E]는 효소의 총 농도이며, k_cat 및 K_m은 미카엘리스 파라미터이다. 효소 활성에 대한 아미노산 점 돌연변이의 효과는, 비

로써 기재된 바와 같이 이들이 상기 효소의 특이성에 어떻게 영향을 미치는 지에 의해 가장 잘 설명된다.

정상적으로, k_cat 및 K_m 파라미터는 본격적인 미카엘리스-멘텐 분석으로부터 별개로 수득된다. 그러나, 비

는 또한, 낮은 기질 농도에서 MM 방정식을 통합함으로써 독립적이고도 정확하게 수득될 수 있다:

<방정식 1>

상기 방정식은 형광성 표지된 기질 유비퀴틴-아미노메틸쿠마린 (Ub-AMC), ISG15-아미노메틸쿠마린 (ISG15-AMC) 또는 이들 기질의 C-말단 펩티드 모티프인 RLRGG-AMC [보스톤 바이오켐(Boston Biochem)]를 이용하여 시험관 내에서 PLP2 활성을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. PLP2는 이들 기질로부터 AMC를 제거한다. 유리된 AMC는 그것이 Ub, ISG15 또는 RLRGG 펩티드와 커플링되는 경우 보다 훨씬 더 높은 형광 양자 수율을 갖고 있으므로, PLP2 활성에 비례되는 형광 신호를 제공한다. (유비퀴틴 상호작용 표면을 요구하는) Ub-AMC 또는 ISG15-AMC에 대항한 PLP2 돌연변이체의 활성과 (활성 부위 영역하고만 결합되는) RLRGG-AMC에 대항한 그들의 활성을 비교함으로써, DUB 또는 탈ISG화 활성에 있어 선택적인 감소를 나타내는 PLP2 돌연변이체를 확인할 수 있다.

Ub-AMC 및 ISG15-AMC는 비교적 불량한 수중 용해도를 나타내기 때문에, 완전한 MM 분석은 어렵다. 또 다른 한편으론, 방정식 1은 용해도 문제를 회피하고

을 신속하고도 신뢰할만한 방식으로 결정하기 위한 유용한 방법을 제공해준다. 생성물 형광은 그의 농도에 비례하기 때문에, 낮은 기질 농도에서 다음 방정식 1의 변형에 따라서, 시간의 경과에 따른 생성물 형광의 점진적 발달이 진행된다:

<방정식 1a>

상기식에서, F는 형광 측정치이고 A _∞ 는 상수 파라미터이다. 따라서, 상당히 Km 아래인 농도에서 AMC-표지된 기질을 함유하는 용액에 PLP2를 부가한 후 점진적으로 발달된 형광의 시간-프로파일을 사용하여

을 결정할 수 있다.

실시예 섹션은 비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 복제-적격 아르테리바이러스의 충분한 예를 제공한다.

nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 부가의 아르테리바이러스를 만들고자 하는 통상의 기술자는 PLP2 돌연변이체를 신속하게 스크리닝하기 위하여 상기 언급된 바와 같고 그리고 본 실시예에 상세한 방식으로 기재된 바와 같이, nsp2/nsp3 프로테아제 활성과 DUB/탈ISG화 활성을 결정하기 위해 상기 논의된 바와 같은 시험관내 시험을 이용할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 유비퀴틴과 결합된 PLP2 도메인의 결정 구조는, 이러한 결정이 본 발명에 의해 처음으로 안정한 형태로 만들어질 수 있었다는 사실로 인해 결정될 수 있었다.

이러한 결정의 형성은, PLP2-유비퀴틴 복합체를 형성하기 위하여 PLP2 도메인에 대한 유비퀴틴의 공유적 결합을 허용해주는 조건 하에, PLP2 도메인을 포함하는 정제된 nsp2 단편을 유비퀴틴과 혼합하는 것을 통하여 가능하였다. PLP2 도메인은 도메인 그 자체일 수 있거나 (예를 들어, EAV nsp2의 위치 261-392로부터의 아미노산) 또는 PLP2 도메인과 nsp2 단백질의 추가 일부를 포함할 수 있다.

PLP2-ISG15 복합체를 형성하기 위하여 PLP2 도메인에 대한 ISG15의 공유적 결합을 허용해주는 조건 하에, PLP2 도메인을 포함하는 정제된 nsp2 단편을 ISG15와 혼합하는 것을 통하여 상기 결정을 형성하는 것에도 동일한 접근 방식이 적용된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 유비퀴틴 및 적어도 아르테리바이러스의 nsp2의 PLP2 도메인 (여기서, 상기 PLP2 도메인은 상기 유비퀴틴과 공유 결합됨)을 포함하는 PLP2-유비퀴틴 복합체, 또는 ISG15 및 적어도 아르테리바이러스의 nsp2의 PLP2 도메인 (여기서, 상기 PLP2 도메인은 상기 ISG15와 공유 결합됨)을 포함하는 PLP2-ISG15 복합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 바람직한 형태에서, 아르테리바이러스는 EAV 및 PRRSV로 이루어진 바이러스의 군으로부터 선택된다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아르테리바이러스성 감염에 대해 포유류를 보호하기 위한 생 약독화 백신에 관한 것이다.

본 발명에 따른 생 약독화 백신을 제조하기 위한 출발 물질로서, 야생형 또는 생 약독화 바이러스 균주를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상이한 세포주 전반에 걸친 일련의 계대접종을 통하여 바이러스를 약독화시키는 방법은 관련 기술분야에 광범위하게 보고되어 있다. 이는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

그러나, 약독화된 바이러스 균주로 출발하고자 하는 통상의 기술자가 본 발명에 따른 PRRSV 또는 EAV에 대한 백신을 필요로 하는 경우에는, 원칙적으로 새로운 생 약독화 아르테리바이러스를 발생시킬 필요가 없다. 생 약독화 PRRSV 및 EAV는 관련 기술분야의 문헌에 보고되었으며, 상업적으로 입수 가능하다. 따라서, 이러한 바이러스는 본 발명에 따른 생 약독화 백신을 개발하고자 하는 통상의 기술자에 대한 매우 적합한 출발 물질을 형성할 수 있다.

상업적으로 입수 가능한 생 변형 PRRSV-백신, 그들의 특징 및 그들의 생산자에 관한 개요는 특히 문헌 [Murtaugh, M.P. and Genzow, M. (Vaccine 29: 8192-8204 (2011))]에 제공되어 있다.

생 변형 EAV-백신에 관한 개요는 특히 문헌 [McCollum, W.H. (American Journal of Veterinary Research 47: 1931-1934 (1986))]; 및 [Summers-lawyer, K.A. et al., (Journal of Equine Veterinary Science Volume 31: 129-138 (2011))]에 제공되어 있다. 생 약독화 EAV 바이러스는 특히 미국에서 허가되었다.

통상적으로, 본 발명에 따른 백신은 비경구 경로를 통하여 투여될 것이다. 바람직하게, 이러한 백신은 근육내 투여될 것이다. 백신 중에 적합한 본 발명에 따른 바이러스의 양은 사용된 바이러스의 약독화 수준에 따라서 10² 내지 10⁸ TCID₅₀의 범위일 것이다. 상기 인용된 문헌, 및 EAV 및 PRRSV 백신 접종과 관련한 분야에서의 지식은, 필요로 하는 바이러스의 양을 결정하는 데 있어서 충분한 지침을 통상의 기술자에게 제공해준다. 백신 균주가, 약독화되는 결실을 포함하는 기존의 상업적으로 입수 가능한 바이러스 균주를 기초로 한 경우, 제조업체의 지시 사항은 사용하고자 하는 바이러스의 양에 관한 좋은 지침을 공급할 것이다. 경험으로 보건데, 생 약독화 바이러스의 경우, 10⁴ 내지 10⁶ TCID₅₀의 양이 극히 적합한 바이러스 양으로 간주될 것이다.

아르테리바이러스에 의해 유발된 질환 다음으로, 말과 돼지는 종종, 다양한 기타 바이러스성, 기생충 및 박테리아성 질환으로 인해 고통받고 있다. 이러한 이유로 인해, 이들은 상기 질환에 대해 자주 백신 접종받는다. 따라서, 몇 가지 백신을 조합하고 이러한 조합물을 하나의 단일 투여로 투여하는 것이 동물 복지, 사용의 용이성 및 비용 절감의 관점에서 좋은 이유가 있다.

따라서, 상기 실시양태의 바람직한 형태는 백신을 접종할 동물에 대해 병원성인 바이러스 또는 미생물의 부가의 면역원, 이러한 면역원에 대항한 항체, 또는 상기 바이러스 또는 미생물의 면역원을 코딩하는 유전 정보를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다.

가장 자주 관찰되는, 돼지에 대해 병원성인 바이러스/미생물의 예는 브라키스피라 히오디센테리아에 (Brachyspira hyodysenteriae), 아프리카 돼지 열 바이러스, 니파 바이러스 (Nipah virus), 돼지 시르코바이러스, 돼지 토르크 테노 바이러스 (Porcine Torque Teno virus), 가성광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 에리시펠로 루시오파티아에 (Erysipelo rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis), 헤모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 스트렙토코쿠스 수이스 (Streptococcus suis), 미코플라스마 히오뉴모니아에 (Mycoplasma hyopneumoniae) 및 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 (Actinobacillus pleuropneumoniae)이다. 따라서, 상기 실시양태의 보다 바람직한 형태는 돼지에 대해 병원성인 상기 바이러스 또는 미생물이 브라키스피라 히오디센테리아에, 아프리카 돼지 열 바이러스, 니파 바이러스, 돼지 시르코바이러스, 돼지 토르크 테노 바이러스, 가성광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스, 에스케리키아 콜라이, 에리시펠로 루시오파티아에, 보르데텔라 브론키셉티카, 살모넬라 콜레라수이스, 헤모필루스 파라수이스, 파스테우렐라 물토시다, 스트렙토코쿠스 수이스, 미코플라스마 히오뉴모니아에 및 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다.

가장 자주 관찰되는, 말에 대해 병원성인 바이러스/미생물의 예는 말 인플루엔자 바이러스, 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 말 헤르페스바이러스 (Equine Herpesvirus) 1 및 말 헤르페스바이러스 4이다.

따라서, 상기 실시양태의 동등하게 더 바람직한 형태는 말에 대해 병원성인 상기 바이러스 또는 미생물이 말 인플루엔자 바이러스, 클로스트리디움 테타니, 말 헤르페스바이러스 1 및 말 헤르페스바이러스 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다.

제약상 허용되는 담체는 안정화제, 희석제 및 완충제일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 적합한 안정화제는, 예를 들어 SPGA, 탄수화물 (예컨대 건조 우유, 혈청 알부민 또는 카세인) 또는 그의 분해 산물이다. 적합한 완충제는, 예를 들어 알칼리 금속 인산염이다. 희석제는 물, 수성 완충제 (예컨대 완충 식염수), 알콜 및 폴리올 (예컨대 글리세롤)을 포함한다.

생 약독화 바이러스를 포함하는, 일반적이긴 하지만 특별한 백신은 저온에서 저장해야만 하거나 또는 이들 백신은 냉동 건조된 형태로 존재해야 한다. 냉동 건조된 백신은 적절한 냉각 조건 하에 또는 심지어 실온 하에 유지시킬 수 있다. 종종, 상기 백신을 안정화제와 혼합하여, 예를 들어 분해되기 쉬운 단백질이 분해되지 못하게 하여 백신의 저장 수명을 향상시키거나 또는 냉동 건조 효율을 개선시킨다. 유용한 안정화제는 특히, SPGA, 탄수화물, 예를 들어 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 전분, 슈크로스, 덱스트란 또는 글루코스, 단백질, 예컨대 알부민 또는 카세인 또는 그의 분해 산물, 및 완충제, 예컨대 알칼리 금속 인산염이다. 따라서, 바람직하게, 본 발명에 따른 백신은 냉동 건조된 형태로 존재한다. 또한, 백신은 생리학상 허용되는 희석제에 현탁시킬 수 있다. 이러한 완충제는, 예를 들어 멸균수, 완충제 등일 수 있다. 바이러스를 유화시키거나 안정화시키기 위한 화합물과 희석제가 또한 본 발명에 포함되는 것은 말할 것도 없다.

또한 본 발명의 또 다른 실시양태는 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시양태는 백신에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시양태는 포유류에서 아르테리바이러스 감염을 예방하는 데에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 복제-적격 아르테리바이러스에 관한 것이다.

실시예

실시예 1

플라스미드, 세포 및 항체. EAV PLP2의 박테리아성 발현을 위해, EAV pp1a의 잔기 261-392 및 동일 프레임내 C-말단 HIS₆ 정제 태그를 코딩하는 cDNA 단편을 pASK3 벡터 내의 Ub 융합 파트너의 하류에 삽입하여 (Gohara et al., 1999), 플라스미드 pASK3-ePLP2를 산출시켰다. pcDNA3.1 벡터 [인비트로젠(Invitrogen)] 중의 N-말단 HA 태그와 동일 프레임 내에 있는 EAV pp1a의 잔기 261-1064를 클로닝함으로써, EAV nsp2-3 폴리단백질을 코딩하는 포유류 발현 구축물을 만들었다. Pfu DNA 중합효소 [페르멘타스(Fermentas)]를 이용하여 부위 지시 돌연변이 유발시킴으로써 모든 돌연변이체를 조작하였다. 프라이머 서열은 요청시 입수 가능하다. 모든 구축물은 서열 분석에 의해 검증하였다. 다음 포유류 발현 플라스미드는 다른 곳에 기재되었다: pLuc-IFN-β (Fitzgerald et al., 2003), pRL-TK [프로메가(Promega)], pEBG-RIG-I₍ _2CARD ₎ (Gack et al., 2007), pcDNA-eGFP (van Kasteren et al., 2012), pCMV-FLAG-Ub (Gack et al., 2009), pCAGGS-HA-mUbE1L, pCMV2-FLAG-UbcM8, 및 pCAGGS-V5-hISG15 (Versteeg et al., 2010).

HEK293T 세포를 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 2 mM L-글루타민으로 보충시킨 둘벡코(Dulbecco) 변형 이글 배지 [론자(Lonza)]에서 배양하였다. BHK-21 세포를 5% FBS, 10% 트립토스 인산염 브로쓰, 및 10 mM HEPES (pH 7.4)로 보충시킨 글라스고우(Glasgow) 최소 필수 배지 (론자)에서 배양하였다. 일차 말 폐 섬유아세포 (ELF)를 10% FBS로 보충시킨 최소 필수 배지 (론자)에서 배양하고 콜라겐-코팅된 플라스틱 상에서 성장시켰다. 모든 배양 배지는 100 U/ml의 페니실린 및 100 mg/ml의 스트렙토마이신을 함유하였다.

상업적으로 입수 가능한 다음 항체를 사용하였다: α-HA [ab18181; 아브캄(Abcam)], α-FLAG [F3165; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)], α-GST [sc459; 산타 크루즈(Santa Cruz)], α-β-액틴 [A5316; 시그마-알드리치], 당나귀-α-마우스-Cy3 [715-165-151; 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)], 및 염소-α-토끼-AL488 [A-11008; 인비트로젠]. 다음 항체가 다른 곳에 기재되었다: α-hISG15 (클론 2.1) (Malakhov et al., 2003) 및 α-EAV N 단백질 (클론 3E2) (MacLachlan et al., 1998). EAV PLP2 도메인 및 GFP를 인식하는 토끼 항혈청은 에스케리키아 콜라이로부터 정제된 재조합 단백질을 사용하여 생성시켰다.

Ub와 결합된 EAV PLP2 도메인의 정제 및 결정화. 이. 콜라이 BL21-골드(DE3) 세포를 pASK3-ePLP2로 형질전환시키고, 37℃ 하에 LB 배지에서 0.7의 광학 밀도 (OD₆₀₀)가 되도록 배양하였다. 이어서, 이 배양물을 200 ng/ml의 무수 테트라시클린으로 보충시키고, 진탕시키면서 28℃ 하에 3시간 동안 인큐베이션하여 Ub-PLP2-HIS₆ 융합 단백질의 발현을 유도시켰다. 세포를 펠릿화하고, 빙냉 용해 완충제 (20 mM MES pH 7, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5 mM 이미다졸 pH 7.4, 0.5 mM TCEP)에서 재현탁시키며, 프렌치(French) 압력 셀 (AMECO)을 이용하여 용해시켰다. 이 용해물을 원심분리에 의해 정화시키고, 용해 완충제로 미리-평형시킨 Ni-NTA 칼럼 [퀴아젠(Qiagen)] 상에 부하하였다. 15 mM 이미다졸로 보충시킨 용해 완충제로 세척한 후, 150 mM 이미다졸로 보충시킨 평형 완충제를 이용하여 상기 칼럼으로부터 재조합 PLP2를 용리시키고, 50 mM 트리스, pH 8.0, 300 mM NaCl 및 5 mM DTT로 교환시킨 후, 4℃ 하에 저장하였다. PLP2 도메인의 내인성 DUB 활성으로 인해, 이. 콜라이에서의 발현 동안 상기 융합 단백질로부터 N-말단 Ub-태그가 효율적으로 제거되었으므로, 친화 크로마토그래피한 결과, C-말단 HIS₆ 정제 태그만을 수반하는 고도로 순수한 PLP2가 산출되었다.

제임스(James) 등의 문헌 [James et al., 2011]에 의해 기재된 바와 같이 메식(Messick) 등의 문헌 [Messick et al., 2008] 및 보로도프스키(Borodovsky) 등의 문헌 [Borodovsky et al., 2002]에 따라서, 메카니즘 기반 자살 억제제 Ub_(1-75)-3-브로모프로필아민 (Ub-3Br)을 제조하였다. 37℃ 하에 1시간 동안 Ub-Br3을 정제된 PLP2와 3:2 몰 비로 온화하게 혼합함으로써 이들 단백질을 공유 결합시켰다. 이로써 생성된 PLP2-Ub 복합체를 겔 여과 [슈퍼덱스(Superdex) 75]에 이어, 음이온 교환 (소스 15Q) 크로마토그래피에 의해 정제한 다음, 20 mM 트리스, pH 8.0, 50 mM NaCl로 교환시킨 후, 10 mg/ml로 농축시키고 4℃ 하에 저장하였다.

PLP2-Ub 복합체는 100 mM MES pH 6.2, 18% PEG 20,000으로 이루어진 모액 중의 10 mg/ml 하에 현적 증기 확산시킴으로써 결정화되었다. 결정을 신속하게 냉각시키고, 20% 글리세롤로 보충시킨 모액을 통하여 이들을 쓸어낸 후 액상 질소에 저장하였다.

X-선 데이터 수집 및 결정 구조의 결정. 다중 파장 이상 분산 (MAD) 실험에 대한 X-선 회절 데이터를 캐나디언 라이트 소스 (Canadian Light Source) (빔 라인 08ID-1)에서 수집하였다. N₂ (g) 스트림 하에 100K로 유지시킨 PLP2-Ub 복합체의 단일 결정으로부터 아연의 흡수단 전반에 걸쳐 3개의 상이한 파장에서 데이터를 수집하였다. 이 데이터는 MOSFLM 및 SCALA (Collaborative Computational Project Number 4, 1994)를 이용하여 처리하고, phenix.autosol (Adams et al., 2010)을 이용하여 구조 인자 위상을 결정하였다. SOLVE에 의해 발생된 초기 위상은 PHENIX 패키지 내의 RESOLVE를 이용하여 밀도 변형시킴으로써 개선시켰다. 유리 R-인자를 사용하여 교차 검증을 위한 반사의 무작위 서브세트를 비축한 후 (문헌 [Brunger, 1992]), phenix.autobuild (Adams et al., 2010)를 이용하여 모델을 구축하였고, COOT (Emsley and Cowtan, 2004) 및 phenix.refine (Adams et al., 2010)을 이용하여 수동으로 완료하고 제련하였다.

PRRSV 균주 렐리스타트 및 VR2332로부터의 PLP2 도메인의 비교 분자 모델링

PRRSV 균주 렐리스타트 및 VR2332로부터의 PLP2 도메인의 비교 분자 모델은 PRRSV 균주 렐리스타트, VR2332 및 GM2의 전장 nsp2 서열, 및 EAV 부시루스로부터의 결정화된 PLP2 도메인의 서열 (nsp2 잔기 261-387)의 다중 서열 정렬을 기초로 하여 프로그램 MODELLER 9.10 (Eswar, N. et al., 2006)을 사용하여 구축하였다 (도 3). 다중 정렬은 제네이어스 프로(Geneious Pro) 5.1.7 소프트웨어 패키지 내의 클러스탈W(ClustalW) 알고리즘을 사용하여 생성시켰다. 렐리스타트에 대해 모델링된 잔기 (420-555) 및 VR2332에 대해 모델링된 잔기 (428-566)는 EAV 부시루스 PLP2 도메인의 결정 구조와 정렬시킨 것이다. 렐리스타트 및 VR2332 PLP2 도메인에 대해 독특한 루프 구조 (즉, EAV PLP2 결정 구조 내에 존재하지 않음)는 MODELLER 9.10과 함께 '루프모델' 서브루틴을 사용하여 최적화하였다. 유비퀴틴과 결합된 렐리스타트 및 VR2332 PLP2 도메인의 모델은 프로그램 PyMOL [DeLano WL (2002) The PyMOL Molecular Graphics System; 델라노 사이언티픽 (DeLano Scientific; 미국 캘리포니아주 팔로 알토)]을 사용하여, 이들 PLP2 도메인의 모델을 유비퀴틴과 결합된 EAV PLP2 도메인의 결정학적 복합체의 PLP2 도메인 위에 중첩시킴으로써 생성시켰다. 정렬 결과, PRRSV 모델이 EAV PLP2 결정 구조와 결합한 경우에 관찰되는 바와 동일한 결합 배향 및 C-말단 꼬리 입체 형태로 유비퀴틴을 용이하게 수용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 꽉 조인 홈 내에서 유비퀴틴의 C-말단 RLRGG와 결합하는 효소 활성 부위가 초래되는 것을 포함한, 유비퀴틴과 PRRSV 모델 간의 심각한 구조적 충돌이 전혀 없는 것으로 관찰되었다. 상기와 동일한 중첩을 이용하여 렐리스타트 및 VR2332 PLP2 모델에 아연 원자를 부가하면, 이들 모델 내의 시스테인 잔기가 이러한 중첩된 아연 원자 주위에 모여있는 것으로 드러났고, EAV PLP2 결정 구조에 대해 관찰된 바와 유사하게 이들 PRRSV PLP2 도메인의 상기 영역에 아연 핑거 모티프가 존재한다는 강력한 증거가 제공된다.

기타 PRRSV 균주로부터의 PLP2 도메인의 상응하는 비교 분자 모델이 제조되었다. 이러한 경우, 다음 약독화 PRRSV 백신 균주가 사용되었다: 이전 USDA 승인된 PRRSV 균주 프라임팩(PrimePac) [쉐링-플라우 (Schering-Plough; 미국 뉴저지주 서밋); 진뱅크 수탁 번호 DQ779791.1 참조]에 존재하는 바와 같은 균주, 및 MSD 동물 건강 제품 포르실리스(Porcilis®) PRRS에 존재하는 바와 같은 균주 (통상적으로 "DV 균주"로서 공지됨). 이로써, 이들 균주의 PLP2 도메인이 다른 두 PRRSV 균주의 PLP2 도메인과 유사하고, 실제로는 EAV 유비퀴틴 결합 부위와 비교해서 유비퀴틴과 결합하는 것으로 예상된 동일한 잔기를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 4D/4E 참조).

세포-배양 기반 검정. 다양한 PLP2 돌연변이체에 의한 nsp2/nsp3 절단을 평가하기 위하여, HEK293T 세포를 10 ㎠ 웰에서 80% 전면성장률까지 성장시키고, CaPO₄를 사용하여, 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 함유하는 nsp2-3을 코딩하는 4 ㎍ 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 37℃ 하에 16 h 후, 세포를 2x 램리(Laemmli) 샘플 완충제 (2xLSB; 250 mM 트리스, 2% SDS, 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루, 2 mM DTT, pH 6.8)에 용해시켰다. 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 부하하고, 반-건조 전이 세포 [바이오-라드(Bio-Rad)]를 이용하여 하이본드(Hybond)-P 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 [GE 헬스케어(GE Healthcare)]에 블롯팅하였다. 적절한 항체와 함께 인큐베이션한 후, 아머샴(Amersham) ECL 플러스 검출 시약 (GE 헬스케어)을 이용하여 단백질 밴드를 가시화하였다.

다양한 PLP2 돌연변이체의 DUB 활성을 평가하기 위하여, HEK293T 세포를 4 ㎠ 웰에서 80% 전면성장률까지 성장시키고, CaPO₄를 사용하여 FLAG-Ub (0.25 ㎍), GFP (0.25 ㎍), 및 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 함유하는 nsp2-3 (1.5 ㎍)을 코딩하는 플라스미드의 조합물로 형질감염시켰다. 37℃ 하에 16 h 후, 세포를 2xLSB에 용해시키고, 상기 언급된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

다양한 돌연변이체의 탈ISG화 활성을 평가하기 위하여, HEK293T 세포를 4 ㎠ 웰에서 80% 전면성장률까지 성장시키고, CaPO₄를 사용하여 hISG15 (0.75 ㎍), HA-mUbE1L (0.25 ㎍), FLAG-UbcM8 (0.25 ㎍), GFP (0.25 ㎍), 및 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 함유하는 nsp2-3 (0.5 ㎍)을 코딩하는 플라스미드의 조합물로 형질감염시켰다. 37℃ 하에 48 h 후, 세포를 2xLSB에 용해시키고, 상기 언급된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

루시페라제 기반 IFN -β 프로모터 활성 검정. 2 ㎠ 웰에서 80% 전면성장률까지 성장시킨 HEK293T 세포를, 리포펙타민2000(Lipofectamine2000) (인비트로젠)을 사용하여 IFN-β 프로모터의 제어 하의 반딧불이 루시페라제 (50 ng), 레닐라(renilla) 루시페라제 (5 ng), RIG-I₍ _2CARD ₎ (25 ng), 및 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 함유하는 nsp2-3 (500 ng)을 코딩하는 플라스미드의 조합물로 사중으로 형질감염시켰다. 형질감염에 사용된 DNA의 총량은 적절한 양의 빈 벡터를 부가함으로써 웰당 1 ㎍으로 조정하였다. 37℃ 하에 12 h 후, 4개 웰 중 3개를 100 ㎕ 수동적인 용해 완충제 (프로메가)에 용해시키고, 샘플을 대상으로 하여 미트라스(Mithras) LB 940 다중모드 판독기 [버솔드 테크놀로지스(Berthold Technologies)] 상에서 듀얼-루시페라제 리포터 검정 시스템 (프로메가)을 이용하여 루시페라제 활성에 관하여 검정하였다. 3가지 독립적인 실험 각각으로부터의 나머지 웰을 2xLSB에 용해시키고, 1:1:1 비로 혼합한 다음, 상기 언급된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

쌍을 이루지 않은 양측 스튜던츠 t 시험을 사용하여, 3가지 독립적인 실험에서 수득되었던 결과의 통계적 유의성을 결정하였다. P 값 <0.05가 통계상 유의적인 것으로 간주되었다.

시험관내 PLP2 도메인 활성 검정

유비퀴틴 상호작용 표면 상에 단일 점 돌연변이 (Ile353Arg)를 함유하는 변이체 및 야생형 EAV PLP2 도메인에 의한 Ub-AMC 및 RLRGG-AMC의 절단에 대해 실험적으로 결정된

값의 예가 표 3에 나타나 있다. 정상 상태 형광 스펙트럼을 플루오로로그(Fluorolog)-3 호리바 조빈 이본(Horiba Jobin Yvon) 분광형광계 (미국 뉴저지주 에디슨) 상에서 측정하였다. 샘플은 10 x 3 ㎟ 일회용 큐벳에 담겨져 있었다. 시그마 플롯(Sigma Plot; 미국 캘리포니아주 포인트 리치몬드) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 시그마(Sigma; 미국 미주리주 세인트루이스)로부터의 150 mM 이온 강도 (NaCl) 완충제 pH 8에서 50 mM 트리스 중의 실온 하에 측정을 수행하였다. 기질 농도는 RLRGG-AMC 및 Ub-AMC 기질 각각에 대해 50 μM 및 200 nM로 유지시킨 반면, 효소 농도는 RLRGG-AMC 기질의 경우에 1.7 내지 2.6 μM의 최종 농도로 사용하고 Ub-AMC 기질의 경우에는 116 내지 174 nM의 최종 농도로 사용하였다. 샘플을 360 nm 광으로 여기시키고, 시간-의존적 방출을 460 nm 하에 수집하였다.

여기 및 방출 실트(silt)를 3 nm 대역 통과로 설정하였다. 야생형 및 돌연변이체에 대해 측정된

값이 표 3에 제공되어 있다.

이 표로부터 즉시 알 수 있는 바와 같이, 야생형 바이러스 및 돌연변이체 I353R의 RLRGG-AMC에 대한 k _cat /K _M 값은 거의 동등한 수준인 반면, 돌연변이체 I353R의 Ub-AMC에 대한 k _cat /K _M 값은 야생형 바이러스 보다 20배 더 낮다.

RLRGG-AMC 및 Ub-AMC 기질에 대하여 결정된 야생형 및 I353R 돌연변이체 EAV PLP2 효소에 대한 실험적 k _cat /K _M 값.

역 유전학. EAV PLP2-코딩 서열 내의 돌연변이는 Pfu DNA 중합효소 (페르멘타스)를 이용하여 부위 지시 돌연변이 유발시킴으로써 적절한 셔틀 벡터에서 조작한 다음, 이를 부가의 (번역상 침묵) AflII 및 BspEI 제한 부위를 수반하는 EAV 전장 cDNA 클론 pEAN551의 유도체인 pEAN551/AB로 전이시켰다 (Posthuma et al., 2008). pEAN551/AB로부터 유래된 바이러스를 모든 실험에서 야생형 대조군으로서 사용하였다. 모든 구축물은 서열 분석함으로써 검증하였다.

XhoI-선형화된 야생형 또는 돌연변이체 EAV 전장 cDNA 클론으로부터의 시험관내 RNA 전사를, mMESSAGE mMACHINE T7 키트 [앰비온(Ambion)]를 이용하여 수행하였다. 5 ㎍의 시험관내 합성된 EAV RNA를, 제조업체의 지시에 따라서 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector) (론자)의 프로그램 T-020 및 아막사 셀 라인 뉴클레오펙터 키트 T를 이용하여 5.0 x 10⁶개 BHK-21 세포 내로 전기영동시켰다. 세포를 적절한 배지에 재현탁시키고, 75 ㎠ 플라스크에 시딩한 다음, 39.5℃ 하에 인큐베이션하였다. 바이러스 함유 상청액을 형질감염 후 24 h에 수거하고, 앞서 기재된 바와 같이 말 폐 섬유아세포 상에서 플라크 검정함으로써 역가를 결정하였다 (Nedialkova et al., 2010).

정확한 돌연변이의 존재를 검증하기 위하여, QIAamp 바이러스성 RNA 미니 키트 (퀴아젠)를 이용하여 바이러스-함유 상청액으로부터 RNA를 단리시키고, 리버트에이드(RevertAid) H 마이너스 역전사효소 (페르멘타스) 및 무작위 육량체성 프라이머를 이용하여 DNA로 전환시켰다. 상기 돌연변이를 코딩하는 PLP2 도메인의 영역을, Pfu DNA 중합효소 (페르멘타스)를 이용하여 연속해서 PCR 증폭시키고 서열 분석하였다.

정량적 실시간 PCR. 전면성장 말 폐 섬유아세포를 야생형 또는 돌연변이체 EAV로 0.25의 m.o.i.로 감염시키고 37℃ 하에 인큐베이션하였다. 감염 후 20 및 24 h에, 세포 용해물을 트리퓨어(TriPure) 단리 시약 [로슈(Roche)]에 수거하였다. 클로로포름을 부가한 후, 수성 상을 뉴클레오스핀(Nucleospin) RNA II 키트 [마쉐레이-나겔(Macherey-Nagel)]의 완충제 RA1과 1:1 비로 혼합하고, 제조업체의 지시에 따라서 RNA를 단리하였다. 단리된 RNA를 연속해서, 리버트에이드 H 마이너스 역전사효소 (페르멘타스) 및 올리고(dT)20 프라이머를 사용하여 cDNA 합성용 주형으로서 사용하였다. 최종적으로, ROX와의 iTaq SYBR 그린 슈퍼믹스 (바이오라드)를 사용하여 CFX384 터치 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오라드) 상에서 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)함으로써 샘플을 검정하였다. 프라이머3을 이용하여, 말 GAPDH, 액틴-β, IFN-β, 및 EAV 게놈을 표적으로 하는 프라이머를 설계하였고 (Rozen and Skaletsky, 1998), 서열이 표 2에 제공되어 있다. 실시간 PCR 프로그램에 이어 용융-곡선 분석을 수행하여 본 반응의 특이성을 검증하였다. 표준 곡선 방법을 이용하여 결과를 정량화하고, GAPDH 및 액틴-β의 상대적 양의 기하 평균에 대해 표준화시켰다.

도 9은 qPCR의 결과를 도시한 것이다. 도 9B에서는, 야생형 바이러스, 단일 돌연변이체 (I353R) 및 삼중 돌연변이체 (T312A/I313V/I353R)로 감염된 주요 말 폐 세포에서 생성된 바이러스성 mRNA의 양이 실제적으로 동일하다는 것을 알 수 있다. 이는 이들 돌연변이체 바이러스에서는 복제 수준이 야생형 바이러스와 비교해서 실제적으로 변하지 않는다는 것을 보여주는데, 이는 상기 돌연변이체가 폴리단백질 프로세싱할 수 있다는 것을 시사한다.

도 9A에서는, IFN 베타 mRNA의 유도가 야생형 바이러스에서 보다 돌연변이체에서 상당히 더 높다는 것을 알 수 있다. 또한, 삼중 돌연변이체가 단일 돌연변이체 보다 IFN 베타의 유도에 대한 억제 효과가 훨씬 더 낮다는 것을 알 수 있다. 상기 도면으로부터, 실제로 상기 돌연변이체는 DUB/탈ISG화 활성에 있어서 매우 유의적인 감소를 나타낸다는 것이 명백한데, 이는 직접적으로 IFN 베타 유도에 대한 억제 효과의 유의적 약화에 관한 것이다 (야생형 바이러스는 그의 DUB/탈ISG화 활성을 통하여 표시됨). 이는 본 발명에 따른 돌연변이체 바이러스가 야생형 버전 보다 더 우수한 세포성 면역 반응을 촉발시키므로, 실제로 개선된 백신을 제공한다는 것을 시사한다.

실시예 2: 생체내 실험

실험적 설계. 20마리의 SPF 셰틀랜드(Shetland) 말 (암말)을 본 연구에 사용하였다. 이들은 3개 군에 할당하였는데, 9마리 암말은 군 1 (n=9)에 할당하고, 9마리 암말은 군 2 (n=9)에 할당하며, 2마리 암말은 군 3 (n=2)에 할당하였다. 군 1의 동물에게는 세포-배양 적응시킨 야생형 EAV 백신 (EAV-wt; 균주 부시루스로부터 유래된 클론)을 투여하였다. 군 2의 동물에게는 돌연변이체 EAV 백신 (EAV-PLP2; 도 9와 연계해서 기재된 바와 같은 삼중 돌연변이체)을 투여하였다. 양 군에 대해, 각각의 바이러스 1x10⁷ PFU를 함유하는 1 ml 용량을 사용하였고, 현탁액을 경부 근육 내로 근육내 (IM) 제공하였다. 군 3의 동물에게는 백신을 접종하지 않았고, 이를 백신 접종하지 않은 시험감염용 대조군으로서 제공하였다.

백신 접종한지 대략 5주 후, 모든 암말을 병원성 EAV 균주 (EAV 켄터키 84 균주, 통상적으로 KY84로서 지칭됨)로 감염시켰다. 주사기에 부착된 노즐을 사용하여, 2x10⁴ PFU/ml를 함유하는 5 ml의 바이러스 현탁제를 투여함으로써 바이러스를 비내 (IN) 적용하였다. 감염 후 (즉, 백신 접종하고 시험 감염한 후), 직장 온도를 감염 후 0일부터 14일까지 매일 측정하고, 감염 후 21일 및 28일에 측정하였다. 시험 감염 후, 모든 암말을 대상으로 하여 감염 후 0일부터 14일까지 매일 임상 징후에 관하여 관찰하였다.

암말의 혈액 샘플을 백신 접종 및 시험 감염하기 전 0일째에 채취하고, 각각의 감염 후 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 21, 및 28일에 채취하였다. 혈액 샘플을 대상으로 하여 EAV 및 EAV-특이적 항체의 존재에 관하여 시험하였다.

바이러스 중화 시험. 항응고제를 수반하지 않는 튜브 내에 수집된 혈액 샘플로부터 혈청을 준비하였다. 혈액을 실온 하에 적어도 4시간 동안 응고시킨 후, 4℃ 하에 15분 동안 700xg로 원심분리시킴으로써 혈청을 수집하였다. 사용할 때까지, 그 혈청을 -20℃ 하에 저장하였다.

본 시험 혈청의 중화 항체 역가를 96-웰 플레이트에서 이중으로 결정하였다. 간략하게 언급하면, 2배 일련의 샘플 희석물을 (이중으로) 마이크로타이터 플레이트에서 만들고, 이를 고정 양의 생 EAV 바이러스와 혼합하였다. 1시간의 인큐베이션 기간 후, 베로(Vero) 세포를 가하였다. 플레이트를 CO₂의 존재 하에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션한 후, 세포변성 효과 (CPE)를 알아보기 위하여 단층을 조사하였다. 각 웰은 음성 (CPE 없음) 또는 양성 (CPE 있음)으로 스코어링되었다. CPE가 없는 것으로 관찰된 가장 높은 혈청 희석율의 역수로서 EAV 중화 항체 역가를 계산하고, 이를 log₂로서 표현하였다.

전혈로부터의 총 RNA 단리 및 EAV RNA의 정량화. 템푸스(Tempus™) 혈액 RNA 튜브를 이용하여 수집된 전혈로부터의 RNA를, 제조업체의 지시에 따라서 (인비트로젠) '안정화된 혈액 튜브 RNA 단리 키트를 위한 매그맥스(MagMAX™)'를 이용하여 단리하였다. 총 혈액으로부터의 RNA (800 ng)를, 리버트에이드 H 마이너스 RT (페르멘타스) 및 올리고(dT)20 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. ROX와의 iTaq SYBR 그린 슈퍼믹스 (바이오라드)를 사용하여 CFX384 터치 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오라드) 상에서 정량적 실시간 PCR함으로써 샘플을 연속해서 검정하였다. 통상의 소프트웨어 프로그램 프라이머3을 이용하여 프라이머 세트를 설계하였다.

결과. 본 시험은 타당하였는데, 이는 백신 접종하지 않은 대조군 암말이 시험 감염할 때까지 EAV-음성을 유지하였기 때문이다. 또한, 균주 KY84로의 시험 감염으로 인해, 백신 접종하지 않은 동물에게서 바이러스혈증 및 임상적 징후가 발생하였다. 군 1 및 2의 백신 접종된 동물에게서는 인지할 말한 어떠한 임상적 징후도 거의 나타나지 않았다. 이들 결과를 기초로 하여, 돌연변이체 균주가 적어도 공지된 부시루스 백신 균주와 동일한 수준에서, 병원성 시험 감염에 대해 효과적으로 보호해줄 수 있었다고 결론지을 수 있다. 이는 다음에 표시되는 바와 같은 바이러스 중화 시험과 체온을 분석함으로써 확인되었다.

체온

측정된 체온 개개의 데이터를 기초로 하여, 각 군의 말에 대한 평균 값을 계산하였다. 이들 값은 도 10에 도시되어 있다. 백신 접종 후 1일 내지 6일 사이에, 백신 접종된 군 둘 다 (EAV-wt 및 EAV-PLP2 백신)에 대해서 명백한 (그리고 거의 동등한 수준의) 체온 상승이 관찰되었다.

시험 감염 후, 대조군은 3일과 10일 사이에 체온의 피크를 보여준 반면, 백신 접종된 군의 체온은 증가하지 않았고 정상 범위를 유지하였다.

바이러스 중화 시험

개개의 데이터를 기초로 하여 평균 값을 계산하였다. VN 역가에 관한 그래픽 요약이 도 11에 제공되어 있다. 본 실험의 시작시, 모든 말은 EAV에 대한 중화 항체에 대해 음성이었다. 백신 접종 후, EAV 특이적 VN 항체 역가는 검출 가능하였고, 군 1 (EAV-wt)과 군 2 (EAV-PLP2) 둘 다에 대해 ± 7.5 log₂의 안정기에 도달하였다. 시험 감염 후, 특이적 VN 항체 역가가 대조군에 대해 검출 가능하였고, 시험 감염은 백신 접종한 양 군의 동물의 VN 역가를 추가로 증가시키지 않았다.

EAV -특이적 qPCR에 의한 혈액에 존재하는 EAV의 검출

EAV의 양은 전혈 샘플로부터 추출된 총 RNA의 실시간 qRT-PCR 분석에 의해 결정하였다. 군 1과 2 둘 다에서의 바이러스 RNA 역가는 백신 접종 후 대략 4일째에 거의 동일한 수준으로 최대치에 도달하였는데, 그 후에 서서히 떨어졌다. EAV-PLP2 돌연변이체에 도입되었던 돌연변이는 생체 내에서 약간의 부가 약화를 유발시키는 것으로 여겨졌는데, 이는 관찰된 EAV-PLP2 역가가 모 균주 EAV-wt에 의해 도달된 역가와 비교해서 기껏해야 시험된 시점 보다 약간 더 낮기 때문이다. 이와 같이 약간의 약화가 가능함에도 불구하고, EAV-PLP2 돌연변이체는 생체 내에서 상당히 잘 성장한다고 결론지을 수 있는데, 이는 시험관내 실험에서 관찰될 수 있는 바와 일치한다 (실시예 1).

시험 감염 후, 백신 접종하지 않은 두 동물 (군 3)은 그들의 혈액에서 높은 바이러스성 RNA 역가를 표시하였는데, 이는 시험 감염이 성공적이었다는 것을 입증해준다. EAV-wt로 백신 접종된 9마리 동물 (군 1) 중 4마리에게서, 시험 감염 균주의 바이러스성 RNA가 시험 감염 후 4일, 6일 및/또는 8일째에 그들의 혈액에서 검출될 수 있었던 반면, 시험 감염 균주 RNA는 이들 시점에서 군 2 동물 중 어느에게서도 검출될 수 없었다. 이는 돌연변이체 균주가 야생형 균주와 비교해서 개선된 면역 반응을 유도시킨다는 사실을 명백히 암시해준다.

도면에 대한 범례

도 1: EAV PLP2 - Ub 복합체의 구조, 및 효모 OTU1 및 CCHFV OTU와의 중첩. A) Ub (오렌지색)와 결합된 EAV PLP2 (보라색)의 구조. B ) C4 아연 핑거 모티프에 대한 전자 밀도. 청색 밀도는 1.0σ에서 윤곽을 만든 최대-가능도 가중 2 F _o - F _c 지도이다. 아연 원자 (회색) 주변의 녹색 밀도는 5.0σ에서 윤곽을 만든 F _o - F _c 누락 지도이다. C) EAV PLP2 활성 부위의 촉매 트리아드. 청색 밀도는 1.0σ에서 윤곽을 만든 최대-가능도 가중 2 F _o - F _c 지도이다. 시스테인 친핵체 (Cys270)가 3NC 링커를 통하여 Ub와 공유 결합되는데, 이는 Ub의 Gly76을 대체한다. His332의 이미다졸 고리를 지향하는 Asn263이 두 가지 대안적 입체 형태로 존재한다. D ) EAV PLP2 (보라색), CCHFV OTU (녹색) 및 효모 OTU1 (적색)의 중첩. PLP2는 2개 중앙 나선의 보존된 코어, 및 CCHFV OTU 및 효모 OTU1을 수반한 4-가닥 베타 시트를 공유한다. E) Ub와 복합체를 형성한 CCHFV OTU 및 EAV PLP2의 중첩. 두 효소는 유사한 배향으로 Ub를 움켜잡고 있는데, EAV PLP2의 C4 아연 핑거 모티프가 CCHFV OTU의 β-헤어핀을 대체하고 있다. EAV PLP2, CCHFV OTU 및 효모 OTU1에 대한 위상학적 다이아그램이 각각 패널 F, G, 및 H에 도시되어 있다. 효소들 간에 보존되는 영역의 윤곽이 드러났다 (점선 박스). EAV PLP2 내의 아연 원자와 배위되는 4개의 시스테인 잔기가 황색 원으로서 도시되어 있다. 구조적 영상은 PyMOL을 이용하여 준비하였다 (DeLano, 2002).

도 2: EAV PLP2 구조 (PISA 분석에 기초함). 회색 지역은 DUB 및 탈ISG화 활성을 선택적으로 붕괴시키도록 표적화시켜야 하는, PLP2 효소 상의 유비퀴틴 상호작용 표면 (617Å²)을 규정한다. 효소 활성 부위 내의 촉매적 친핵체 시스테인 270 (C270)이 유비퀴틴의 C-말단과 공유 결합되는데, 이는 촉매적 반응의 아실-효소 중간 단계와 유사하다.

도 3: EAV 및 PRRS 서열의 다중 서열 정렬. 이 도면은 아르테리바이러스성 PLP2 도메인에 대한 구조상 기능적인 정렬을 나타낸다. EAV 넘버링은 컨센서스 위치를 의미하기 위해 사용된다 (예를 들어, PRRSV 렐리스타트에서 "위치 T478"은 "컨센서스 위치 T312"와 동일함).

도 4: Ub와 결합된 아르테리바이러스성 PLP2 도메인의 결정학적 구조를 기초로 한 PRRSV PLP2 도메인의 구조 모델. A) PRRSV 균주 렐리스타트로부터의 유비퀴틴과 결합된 PLP2 도메인의 분자 모델. B) PRRSV 균주 VR-2332로부터의 유비퀴틴과 결합된 PLP2 도메인의 분자 모델. C) EAV 균주 부시루스로부터의 유비퀴틴과 결합된 PLP2 도메인의 분자 모델. D) EAV PLP2 도메인의 잔기 Thr 312, Ile 313, Ile 353을 대신하는 PRRSV PLP2 잔기를 나타내는 표. E) EAV PLP2 도메인의 잔기 Thr 312, Ile 313, Ile 353을 대신하는 2개의 다른 균주의 PRRSV PLP2 잔기를 나타내는 표.

도 5: EAV PLP2 도메인의 Ub -결합 부위 및 EAV PLP2 도메인과 결합된 ISG15의 비교 모델. A) 표면으로서 도시된 612Å² Ub-결합 부위를 수반한, Ub (연회색)과 결합된 EAV PLP2 (암회색). DUB 및 탈ISG화 활성을 붕괴시키는 돌연변이 분석에 대한 표적이 된 잔기가 화살표로 표시되어 있다. B ) EAV PLP2-Ub 결합 표면의 확대도. EAV PLP2 잔기 Ile353은 Ub의 Ile44, Leu8, 및 Val70과 반 데르 발스 상호작용을 형성하는 반면, 잔기 Thr312 및 Ile313은 PLP2의 활성 부위에 더 근접한 Ub 상의 소수성 패치 (잔기 Leu8, Val70, Leu71, 및 Ile73에 의해 형성됨)와 상호작용한다. C ) ISG15와 결합된 EAV PLP2 도메인의 비교 분자 모델. 이 모델은 ISG15 (PDB 1Z2M으로부터)의 C-말단 Ub-유사 도메인을 EAV PLP2-Ub 복합체의 Ub 분자 상에 중첩시킴으로써 구축하였다. 이 모델은 EAV PLP2 도메인이 ISG15와 결합하여, 이것이 Ub에 존재하지 않는 ISG15 상에 존재하는 부가의 벌크를 수용할 수 있다는 것을 예측하게 한다. D ) ISG15의 잔기 Asn89와 EAV PLP2 도메인의 Thr312 간의 수소 결합 상호작용이 ISG15 결합에 중요하다고 여겨진다는 것을 보여주는, 모델링된 EAV PLP2-ISG15 결합 상호작용의 클로즈업.

도 6: EAV PLP2 도메인의 DUB 활성과 폴리단백질 프로세싱의 디커플링 .

A) HEK293T 세포를, 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 함유하는 nsp2-3을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 37℃ 하에 16 h 후, 세포를 용해시키고, 그 결과를 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 야생형 PLP2에 의해 nsp2│3 접합부를 단백질 분해적 프로세싱하면, nsp2-3 전구체로부터 HA-태그부착된 nsp2가 방출되었다. 촉매적으로 불활성인 돌연변이체 C270A/H332A을 제외하고는 (van Kasteren et al., 2012), 모든 돌연변이체가 nsp2│3 절단 부위의 효율적인 프로세싱을 표시하였다.

*B) HEK293T 세포를 야생형 또는 돌연변이체 PLP2 및 FLAG-Ub를 함유하는 nsp2-3을 코딩하는 플라스미드의 조합물로 형질감염시켰다. FLAG-Ub의 발현으로 인해, 광범위한 세포성 단백질의 FLAG-태그부착된 유비퀴틴화가 초래되는데, 이는 항-FLAG 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 상에서 가시화될 수 있다. 야생형 PLP2의 발현으로 인해서는 유비퀴틴화가 강력하게 저하되었지만, C270A/H332A 돌연변이체의 발현으로 인해서는 그렇치 못하였다. Ub-결합 부위 돌연변이체는 다양한 정도의 DUB 활성을 나타냈는데, 야생형과 활성 부위 돌연변이체 간에는 그 표현형이 다양하였다.

도 7: PLP2 Ub -결합 부위 돌연변이는 IFN -β 프로모터 활성화의 억제를 약화시킨다.

A) IFN-β 프로모터 활성의 억제에 대한 다양한 PLP2 Ub-결합 부위 돌연변이의 효과를 평가하기 위한, 루시페라제 기반 리포터 검정. HEK293T 세포를, IFN-β 프로모터의 제어 하의 반딧불이 루시페라제, 레닐라 루시페라제, RIG-I₍ _2CARD ₎, 및 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 함유하는 nsp2-3을 코딩하는 플라스미드의 조합물로 사중으로 형질감염시켰다. 야생형 PLP2는 IFN-β 프로모터의 활성화를 강력하게 억제하였지만, 활성 부위 돌연변이체는 단지 미미한 수준의 억제 활성을 보여주었다. Ub-결합 부위 돌연변이체는 다양한 정도의 억제를 나타내었다. 데이터를 3가지 독립적인 실험에서 수득하였고, 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던츠 t 시험을 이용하여 분석하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내고, p-값은 야생형에 상대적인 것이다.

B) A 하에 기재된 3가지 실험 각각에서 나머지 웰로부터 수득된 용해물을 1:1:1 비로 혼합하고, nsp2-3의 발현을 알아보기 위해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

도 8: HEK293T 세포를, 야생형 또는 돌연변이체 PLP2를 함유하는 nsp2-3, ISG15, 및 E1 (UbE1L) 및 E2 (UbcM8) 효소를 코딩하는 플라스미드의 조합물로 형질감염시켰다. ISG15 및 그의 E1 및 E2 효소의 발현으로 인해, 세포성 단백질 집단의 ISG화가 발생하는데, 이는 항-ISG15 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 가시화될 수 있다. 야생형 PLP2의 발현으로 인해서는 ISG화가 감소되었지만, 활성 부위 돌연변이체의 발현으로 인해서는 그렇치 못하였다. Ub-결합 부위 돌연변이는 탈ISG화 활성에 대해 약한 효과만을 나타내었다.

도 9: 정량적 실시간 PCR. 본 도면은 바이러스성 성장에 대한 PLP2 도메인에서의 몇 가지 돌연변이의 효과 (도 9B에서 EAV 게놈의 정량화에 의해 검정됨)와, DUB/탈ISG화 활성에 대한 PLP2 도메인에서의 몇 가지 돌연변이의 효과 (도 9A에서 감염에 따른 결과로서, DUB/탈ISG화 활성과 직접적으로 (상호간에) 상관이 있는 IFN베타 mRNA 유도의 정량화에 의해 검정됨)를 도시한 것이다.

도 10: 시험 감염하기 전 및 후에, EAV-wt, EAV 돌연변이체 균주 EAV-PLP2로 백신 접종한 동물, 및 백신 접종하지 않은 동물의 평균 체온.

도 11: 시험 감염하기 전 및 후에, EAV-wt, EAV 돌연변이체 균주 EAV-PLP2로 백신 접종한 동물, 및 백신 접종하지 않은 동물의 평균 EAV 바이러스 중화 항체 역가.

참고 문헌

SEQUENCE LISTING <110> Academisch Ziekenhuis Leiden, also acting under the name Leiden University Medical Centre & University of Manitoba <120> Arterivirus <130> LUMC Manitoba arterivirus <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> primer sequence <400> 1 tgccgcctgg agaaagctgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> primer sequence <400> 2 gagggcaatg ccagccccag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> primer sequence <400> 3 ccacgccatc ctgcgtctgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> primer sequence <400> 4 accgctcgtt gccgatggtg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> primer sequence <400> 5 aggtggatcc tcccaatggc cc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> primer sequence <400> 6 ggggcaacgt tgaggggctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> primer sequence <400> 7 ccgacccggt gtgaccgttg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> primer sequence <400> 8 aagggtcgcg ggtgccaatg 20 <210> 9 <211> 127 <212> PRT <213> Equine arteritis virus <400> 9 Gly Tyr Asn Pro Pro Gly Asp Gly Ala Cys Gly Tyr Arg Cys Leu Ala 1 5 10 15 Phe Met Asn Gly Ala Thr Val Val Ser Ala Gly Cys Ser Ser Asp Leu 20 25 30 Trp Cys Asp Asp Glu Leu Ala Tyr Arg Val Phe Gln Leu Ser Pro Thr 35 40 45 Phe Thr Val Thr Ile Pro Gly Gly Arg Val Cys Pro Asn Ala Lys Tyr 50 55 60 Ala Met Ile Cys Asp Lys Gln His Trp Arg Val Lys Arg Ala Lys Gly 65 70 75 80 Val Gly Leu Cys Leu Asp Glu Ser Cys Phe Arg Gly Ile Cys Asn Cys 85 90 95 Gln Arg Met Ser Gly Pro Pro Pro Ala Pro Val Ser Ala Ala Val Leu 100 105 110 Asp His Ile Leu Glu Ala Ala Thr Phe Gly Asn Val Arg Val Val 115 120 125 <210> 10 <211> 136 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 10 Thr Tyr Ser Pro Pro Thr Asp Gly Ser Cys Gly Trp His Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Met Asn Arg Met Ile Asn Gly Asp Phe Thr Ser Pro Leu Thr 20 25 30 Gln Tyr Asn Arg Pro Glu Asp Asp Trp Ala Ser Asp Tyr Asp Leu Val 35 40 45 Gln Ala Ile Gln Cys Leu Arg Leu Pro Ala Thr Val Val Arg Asn Arg 50 55 60 Ala Cys Pro Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Lys Leu Asn Gly Val His Trp 65 70 75 80 Glu Val Glu Val Arg Ser Gly Met Ala Pro Arg Ser Leu Ser Arg Glu 85 90 95 Cys Val Val Gly Val Cys Ser Glu Gly Cys Val Ala Pro Pro Tyr Pro 100 105 110 Ala Asp Gly Leu Pro Lys Arg Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ser Ala Tyr 115 120 125 Arg Leu Pro Ser Asp Cys Val Ser 130 135 <210> 11 <211> 139 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 11 His Tyr Ser Pro Pro Ala Glu Gly Asn Cys Gly Trp His Cys Ile Ser 1 5 10 15 Ala Ile Ala Asn Arg Met Val Asn Ser Lys Phe Glu Thr Thr Leu Pro 20 25 30 Glu Arg Val Arg Pro Pro Asp Asp Trp Ala Thr Asp Glu Asp Leu Val 35 40 45 Asn Ala Ile Gln Ile Leu Arg Leu Pro Ala Ala Leu Asp Arg Asn Gly 50 55 60 Ala Cys Thr Ser Ala Lys Tyr Val Leu Lys Leu Glu Gly Glu His Trp 65 70 75 80 Thr Val Thr Val Thr Pro Gly Met Ser Pro Ser Leu Leu Pro Leu Glu 85 90 95 Cys Val Gln Gly Cys Cys Gly His Lys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Asp 100 105 110 Ala Val Glu Val Ser Gly Phe Asp Pro Ala Cys Leu Asp Arg Leu Ala 115 120 125 Glu Val Met His Leu Pro Ser Ser Ala Ile Pro 130 135 <210> 12 <211> 139 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 12 Ser Tyr Ser Pro Pro Ala Asp Gly Asn Cys Gly Trp His Cys Ile Ser 1 5 10 15 Ala Ile Ala Asn Arg Met Val Asn Ser Asp Phe Lys Thr Thr Leu Pro 20 25 30 Glu Arg Val Arg Pro Pro Asp Asp Trp Ala Thr Asp Glu Asp Leu Val 35 40 45 Asn Thr Ile Gln Val Leu Lys Leu Pro Ala Ala Leu Asp Arg Asn Gly 50 55 60 Ala Cys Gly Ser Ala Lys Tyr Val Leu Lys Leu Glu Gly Glu His Trp 65 70 75 80 Thr Val Ser Val Ala Pro Gly Met Ser Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Glu 85 90 95 Cys Val Gln Gly Cys Cys Glu His Lys Gly Gly Leu Val Ser Pro Asp 100 105 110 Ala Val Glu Val Ser Gly Phe Asp Pro Ala Cys Leu Asp Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Val Met His Leu Pro Ser Ser Thr Ile Pro 130 135 1

Claims

비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 복제-적격 아르테리바이러스(Arterivirus), 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 생 약독화 백신.
제1항에 있어서, 바이러스가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 영역 296-297, 303-306, 309-319, 326-330 및 343-355로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 컨센서스 위치 영역에 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 생 약독화 백신.
제2항에 있어서, 바이러스가 상기 컨센서스 위치 영역의 군 중 적어도 3개의 상이한 컨센서스 위치 영역에 돌연변이를 갖는 것인 생 약독화 백신.
제1항에 있어서, 바이러스가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 T312, I313 및 I353 중 1개 이상에서 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 생 약독화 백신.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르테리바이러스가 말 동맥염 바이러스 (Equine arteritis virus) (EAV) 및 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스 (Porcine respiratory and reproductive syndrome virus) (PRRSV)로 이루어진 바이러스의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제2항 또는 제3항에 있어서, PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 영역 296-297, 303-306, 310-318, 327-329 또는 343-354에 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제6항에 있어서, PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 영역 296-297, 303-306, 311-317, 328, 343-346, 347-348 또는 350-353에 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제7항에 있어서, PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 컨센서스 위치 T312, I313 또는 I353에 있는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제8항에 있어서, 상기 아르테리바이러스가 EAV이고, PLP2 도메인에서의 상기 돌연변이가 T312A, I313V, I353A, I353R, I353S, I353T 또는 I353W로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제4항에 있어서, 상기 바이러스가 각각 감소된 DUB/탈ISG화 활성에 기여하는 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 백신을 접종할 동물에 대해 병원성인 바이러스 또는 미생물의 부가의 면역원, 상기 면역원에 대한 항체 또는 상기 바이러스 또는 미생물의 면역원을 코딩하는 유전 정보를 포함하는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제11항에 있어서, 백신을 접종할 동물에 대해 병원성인 상기 바이러스 또는 미생물이 브라키스피라 히오디센테리아에 (Brachyspira hyodysenteriae), 아프리카 돼지 열 바이러스, 니파 바이러스 (Nipah virus), 돼지 시르코바이러스 (Porcine Circovirus), 돼지 토르크 테노 바이러스 (Porcine Torque Teno virus), 가성광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 구제역 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 로타바이러스 (Rotavirus), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 에리시펠로 루시오파티아에 (Erysipelo rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis), 헤모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 스트렙토코쿠스 수이스 (Streptococcus suis), 미코플라스마 히오뉴모니아에 (Mycoplasma hyopneumoniae) 및 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에 (Actinobacillus pleuropneumoniae)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생 백신.
제11항에 있어서, 백신을 접종할 동물에 대해 병원성인 상기 바이러스 또는 미생물이 말 인플루엔자 바이러스, 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 말 헤르페스바이러스 (Equine Herpesvirus) 1 및 말 헤르페스바이러스 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생 백신.
비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이를 재조합적으로 도입함으로써 상기 돌연변이가 만들어지는 것을 특징으로 하는, 비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 복제-적격 아르테리바이러스의 제조 방법.
제14항에 있어서, 바이러스가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 영역 296-297, 303-306, 309-319, 326-330 및 343-355로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 컨센서스 위치 영역에 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 바이러스가 도 3에 도시된 바와 같은 EAV 넘버링에 따라 컨센서스 위치 T312, I313 및 I353 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 복제 적격 아르테리바이러스.
비-구조 단백질 nsp2의 PLP2 도메인에서의 돌연변이로 인해 감소된 DUB/탈ISG화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 복제-적격 아르테리바이러스.
유비퀴틴 및 적어도 아르테리바이러스의 nsp2의 PLP2 도메인 (여기서, 상기 PLP2 도메인은 상기 유비퀴틴과 공유 결합됨)을 포함하는 PLP2-유비퀴틴 복합체, 또는 ISG15 및 적어도 아르테리바이러스의 nsp2의 PLP2 도메인 (여기서, 상기 PLP2 도메인은 상기 ISG15와 공유 결합됨)을 포함하는 PLP2-ISG15 복합체.
제19항에 있어서, 상기 아르테리바이러스가 EAV 및 PRRSV로 이루어진 바이러스의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, PLP2-유비퀴틴 복합체 또는 PLP2-ISG15 복합체.