KR20150058681A

KR20150058681A - 갯무 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150058681A
Application number: KR1020130141130A
Authority: KR
Inventors: 허진영; 이상희; 한찬규; 최지혜; 김미나
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2013-11-20
Filing date: 2013-11-20
Publication date: 2015-05-29

Abstract

본 발명은 갯무(Raphanus sativus L.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 소교세포의 활성화(activation)을 감소시키고, 신경보호(neuroprotective) 활성을 갖으며, 신경세포의 아폽토시스를 감소시킨다. 본 발명의 조성물은 천연물인 갯무로부터 추출한 조성물로써 인체에 부작용이 거의 없는 조성물을 제공할 수 있다.

Description

갯무 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Improving, Preventing or Treating for Neurodegenerative Disease comprising Extract from Raphanus sativus L.}

본 발명은 갯무 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

십자화과(十字花科, Brassicaceae) 또는 배추과는 속씨식물 십자화목의 과 가운데 하나이다. 네 개의 꽃잎이 십자 형태를 보여준다. 배추와 겨자 등의 식용 작물이 이 분류에 속한다. 대부분이 풀이며 잎은 어긋나고 턱잎이 없다. 200속 1800여 종이 주로 한대·온대 지방과 고산지대에 난다. 한국에는 22속 48종 1아종 18변종 1품종이 있다.

신경계는 여러 유형의 세포를 포함한다. 신경 충격의 전달을 책임지는 신경세포(neuron) 및 상기 신경세포에 의해 빈 채로 있는 공간을 차지하는 신경아교 세포. 간 또는 피부 세포와 달리, 신경세포는 상호교환이 불가능하다. 이들 각각은 전체 시스템의 기능에 있어서 특수한 일부를 담당한다. 신경퇴화는 신경세포의 사멸을 포함하는 신경의 구조 및 기능의 점진적 상실 을 의미한다. 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환 및 헌팅턴 질환을 포함하는 많은 신경퇴행성 질환은 신경퇴화 과정의 결과로 인해 발생한다.

천연물 추출물과 신경퇴화 관련 국내특허로는, 공개특허 제10-2002-7002061호 약용인삼을 포함하는 뇌세포 또는 신경세포 보호제, 공개특허 제10-2010-0060949호 신경세포 보호용 조성물 및 공개특허 제10-2003-0007105호 황련추출물을 함유하는 신경세포 보호 및 재생용 조성물 등이 있으며, 국외특허로는, WO2012001687 A neuroprotective natural extract, US13/517,381 Plant extracts for treating neurodegenerative disease 및 PCT/GB2007/000122 Cannabinoid-containing plant extracts as neuroprotective agents 등이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신경퇴행성 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 소재를 찾고자 소교세포(microglia)의 활성을 억제하는 천연물 추출물을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 십자화과인 갯무(Raphanus sativus L.)의 추출물이 소교세포의 NO 생성을 억제하고, 소교세포의 과활성을 억제하며, 신경독성에 대한 세포사멸 억제 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 갯무(Raphanus sativus L.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 신경퇴행성 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 소재를 찾고자 소교세포(microglia)의 활성을 억제하는 천연물 추출물을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 십자화과인 갯무(Raphanus sativus L.)의 추출물이 소교세포의 NO 생성을 억제하고, 소교세포의 과활성을 억제하며, 신경독성에 대한 세포사멸 억제 효과를 확인하였다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 갯무 추출물은 갯무에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 추출용매로서 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(본 발명의 일 구현예에 따르면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올 또는 이의 조합을 갯무에 처리하여 수득한 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 갯무 추출물은 메탄올로 추출한 갯무 추출물이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 갯무 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 갯무 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 갯무 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 갯무 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 갯무로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 갯무 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경퇴행성 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 상기 신경퇴행성 질환은 알쯔하이머 질환, 치매, 헌팅턴 질환, 파킨슨씨 질환, 근위축성 측삭 경화증, 기억력저하 및 중증근무력증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 소교세포의 활성화(activation)를 억제한다.

본 발명의 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 소교세포의 활성화를 45-65%, 50-60% 또는 53-57% 감소시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 신경보호(neuroprotective) 활성을 갖는다.

본 발명의 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 소교세포의 활성화를 감소시켜 신경세포(neuron)의 세포사멸을 10-40%, 15-35% 또는 20-30% 감소시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 신경세포의 아폽토시스(apoptosis)를 감소시킨다.

본 발명의 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경세포의 아폽토시스를 5-25%, 8-22% 또는 10-20% 감소시킨다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물, 기능성 식품 조성물 또는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 갯무 추출물뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 갯무 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 갯무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 갯무 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 갯무 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 갯무 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 갯무(Raphanus sativus L.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 천연물인 갯무로부터 추출한 조성물로써 인체에 부작용이 거의 없는 조성물을 제공할 수 있다.

도 1a 및 1b는 다양한 십자화과 천연물 추출물의 LPS-유도성 NO 생성의 억제 효과를 확인한 결과이다. BV-2(도 1a) 또는 랫트 초대배양 소교세포(도 1b)에 2 ㎍/㎖ LPS를 24시간 동안 처리하여 NO 방출에 대한 각 추출물의 영향을 그리스(griess) 시약으로 검출한 결과를 나타낸다. 세포독성은 MTT 분석법으로 측정하였다. 모든 결과는 3회 독립 실험의 평균±표준오차로 나타내었다. '###'은 대조군과 비교하여 유의한 차이(p<0.001)를 나타내고, '*'은 p<0.05, '**'은 p<0.01 및 '***'은 p<0.001은 LPS 처리한 실험군과 비교하여 유의한 차이를 나타내는 표시이다.
도 2a 및 2b는 LPS-유도성 NO 생산에 대한 WR 추출물의 억제 효과를 나타낸다. BV-2(도 2a) 또는 랫트 초대배양 소교세포(도 2b)에 2 ㎍/㎖ LPS를 24시간 동안 처리하여 NO 방출에 대한 WR 추출물의 영향을 나타낸다. 세포독성은 MTT 분석법으로 측정하였다. iNOS 억제제인 L-NMMA를 양성 대조군으로 사용하였다. '###'은 대조군과 비교하여 유의한 차이(p<0.001)를 나타내고, '*'은 p<0.05, '**'은 p<0.01 및 '***'은 p<0.001은 LPS 처리한 실험군과 비교하여 유의한 차이를 나타내는 표시이다.
도 3은 조건배지 실험의 일정을 도식화하여 보여준다.
도 4는 조건 배지 시스템에서 소교세포-매개 신경 세포 사멸에 대한 WR 추출물의 신경보호 효과를 나타낸다. MTT 분석으로 SH-SY5Y의 세포 생존을 측정하였다. 각 실험군의 구성은 다음과 같다:
Control-CM(대조군 조건배지)은 24시간 배양한 BV-2 세포의 상층액(배지)이고; LPS-CM은 BV-2 세포 배양 2시간에 LPS가 처리된 조건배지이며; LPS-WR-CM은 BV-2 세포 배양 0시간에 WR 추출물 및 배양 2시간에 LPS가 처리된 조건배지이고; control-CM-LPS는 상기 대조군 조건배지에 LPS가 처리된 조건배지이며; control-CM-WR은 상기 대조군 조건배지에 WR 추출물이 처리된 조건배지이다(도 4a). Control-CM(대조군 조건배지)은 24시간 배양한 BV-2 세포의 상층액(배지)이고; Aβ-CM은 BV-2 세포 배양 2시간에 Aβ가 처리된 조건배지이며; Aβ-WR-CM은 BV-2 세포 배양 0시간에 WR 추출물 및 배양 2시간에 Aβ가 처리된 조건배지이고; control-CM-Aβ는 상기 대조군 조건배지에 Aβ가 처리된 조건배지이며; control-CM-WR은 상기 대조군 조건배지에 WR 추출물이 처리된 조건배지이다(도 4b). 모든 결과는 3회 독립 실험의 평균±표준오차로 나타내었다. ‘##'은 미처리 대조군과 비교한 p<0.01의 값이고, **는 LPS 또는 Aβ 단독 처리군과 비교한 p<0.01의 값이다.
도 5는 WR 추출물의 항-아폽토시스 효과를 보여준다. LPS-조건배지를 24시간동안 처리한 SH-SY5Y 세포의 조건배지-유도 아폽토시스를 억제한다. Annexin-FITC 및 PI 녹색 염색을 통해 LPS-유도 아폽토시스를 FACS(488 ㎚ 및 633 ㎚ 여기 파장)로 확인하였다. 도 5a는 대조군, 도 5b는 LPS-조건 배지 및 도 5c는 LPS/WR 추출물-조건 배지를 나타낸다. 다음으로 아폽토시스의 단계를 구분하였다: 초기 아폽토시스(Annexin⁺/PI^-); 후기 아폽토시스/네크로시스 세포(Annexin⁺/PI⁺); 및 생존 세포(Annexin^-/PI^-).
도 6은 신경세포-신경교세포 공동-배양에서 LPS 또는 Aβ 유도성 소교세포-매개 신경세포의 사멸에 대한 WR 추출물의 신경보호 효과를 나타낸다. WR 추출물을 처리 또는 미처리한 랫트 초대배양 피질 신경 세포에 LPS 또는 Aβ를 처리하였다. 24시간 후, MTT 분석을 통해 세포 생존을 확인하였다. 모든 결과는 3회 독립 실험의 평균±표준오차로 나타내었다. 모든 결과는 3회 독립 실험의 평균±표준오차로 나타내었다. ‘##'은 대조군과 비교한 p<0.01의 값이고, **는 LPS 또는 Aβ 단독 처리군과 비교한 p<0.01의 값이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실싱예 1: 갯무 추출물의 제조

건조된 갯무 전초를 80% 메탄올에 침전시킨 후 초음파 파쇄하여 상온에서 2시간 동안 추출하고 감압증류법으로 메탄올을 제거한 후, 동결건조하여 사용하였다.

실시예 2: 소교세포(microglia) 활성억제 검증

십자화과 식품소재의 소교세포 활성억제 소재 도출

십자화과 및 국화과 식품소재중 50여종 추출물의 NO 억제 효능을 검증하였다. 소교 세포(microglia) 과활성 억제능을 검증하기 위하여, BV-2 소교세포와 랫트 초대배양 소교세포를 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리하여 NO를 유도한 후, 상층액을 이용하여 글리스(Griess) 시약으로 측정하였다. 10 ㎍/㎖ 십자화과 식품소재를 처리하였을 때, 8종의 추출물이 NO 분비를 억제하는 것을 확인하였으며, 그중 갯무(Raphanus sativus L. var. hortensis Backer for. raphanistroides Makino; Wild Radish; WR)는 대조군으로 사용한 NO(Nitric Oxide) 합성효소 억제제인 NMMA(10 μM)를 처리하였을 때와 유사한 효능을 확인하여 효능이 우수한 소교세포 활성억제제로 도출하였다(도 1).

실시예 3: 갯무 추출물의 소교세포 과활성 억제 효능

십자화과 식품추출물 중 선택된 WR 추출물의 소교세포 활성억제능을 검증하기 위하여, 농도별 NO 생성 억제효과 실험을 실행하였다. 그 결과, WR 추출물을 농도별로(1, 10, 50 ㎍/㎖) 처리하였을 때, NO 생성이 농도 의존적으로 유의성 있게 감소함을 확인하였다. BV-2 소교세포와 랫트 초대배양 소교세포에 WR 추출물 처리 2시간 후 2 ㎍/㎖ LPS를 세포에 자극시킨 결과, BV-2 세포에서 23 μM 로 증가되었던 NO는 1 ㎍/㎖ WR 추출물 처리군에서 18.2 μM, 10 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖ 처리군에서 각각 15.2 μM 및 9.8 μM 로 50 ㎍/㎖ 처리군에서 가장 우수한 효능을 확인하였다. 랫트 초대배양 소교세포에서도 유사한 결과를 도출할 수 있었는데, LPS에 의해 32 μM로 증가되었던 NO 생성량은 WR 추출물 1, 10 및 50 ㎍/㎖ 처리군 에서 각각 29.3 μM, 21.0 μM 및 14.3 μM로 감소되어 초대배양 소교세포에서도 통계적으로 유의하게 NO 생성량을 감소시킴을 확인하였다. 이는 LPS 처리 군 대비 56% 의 NO 감소효과를 나타낸다. NO 감소효과가 세포독성에 의한 것이 아님을 증명하기 위하여 세포 생존율을 측정한 결과, WR 추출물은 BV-2 소교세포와 랫트 초대배양 소교세포에서 독성을 나타내지 않았으며 이는 세포독성에 의한 NO저해가 아닌, WR 추출물에 의한 NO 저해효능임을 나타낸다(도 2).

실시예 4: WR 추출물의 소교세포 신경독성 보호효과

소교세포 과활성화에 따른 소교세포의 분비물질들이 신경(neuron)의 세포사멸을 일으키고, 신경 세포의 사멸과 동시에 신경 세포에서 다시 유해한 분비물질을 내어 소교세포의 활성화가 반복되어 신경 세포의 사멸을 계속해서 유도한다. 소교세포의 과활성화 조절효능이 검증된 WR 추출물을 이용하여 만든 조건 배지(conditioned media)를 인간 신경아 세포종 세포(human neuroblastoma cell)인 SH-SY5Y와 랫트 초대배양 피질 신경(rat primary cultured cortical neuron)에 적용하여 WR 추출물의 소교세포 활성을 조절함으로써, 신경 세포의 세포사멸을 억제하는지 확인하였다. 소교세포의 세포를 이용한 조건 배지는 다음과 같이 준비하였다:

SH-SY5Y 세포를 1×10⁶cells/㎖로 분주하여 24시간 배양 후, LPS-CM 또는 Aβ-CM를 처리하고 16-24 시간 배양하여, MTT를 통해 세포생존율(cell viability)을 측정하였다. LPS-CM를 처리한 경우, 58%의 생존율을 나타낸 반면, WR 추출물 및 LPS를 처리한 조건배지(WR/LPS-CM)에서는 86%의 생존율을 나타내어 WR 추출물에 의한 소교세포의 활성 조절은 신경 세포의 세포 사멸을 억제하는 것을 확인하였다. 또한 Aβ-CM(Aβ-conditioned media)을 처리하였을 때에는 67%의 세포생존율을 나타내었지만, WR 추출물을 처리한 Aβ-CM(WR/Aβ-CM)에서는 86%의 생존율을 나타내어 WR 추출물의 Aβ에 의한 소교세포의 활성도 조절하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).

실시예 5: WR 추출물의 소교세포 신경독성에 대한 항- 아폽토시스 효능

소교세포의 활성 조절에 의한 신경 세포 사멸억제가 아폽토시스(apoptosis) 억제에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 유동세포 분석법(flow cytometry)를 이용하여 아폽토시스 억제를 확인하였다.

아폽토시스에 의한 세포사멸이 진행되면 Annexin-V가 세포와 반응하게 되고, 세포가 괴사(necrosis)와 같은 물리적으로 사멸하게 되면 PI(Propidium iodide)가 핵에 염색되어 확인이 가능하다.

MTT에서와 같은 방법으로 세포를 준비한 뒤, FACS 분석을 실시한 결과, 도 5에서와 같이, LPS-조건배지만 처리한 군에서는 72%의 아폽토시스가 진행되었고, WR/LPS-조건배지에서는 57%의 아폽토시스가 진행되어 아폽토시스 억제에 의한 신경세포 보호 효능을 검증하였다.

실시예 6: WR 추출물의 신경세포-신경교세포 공동-배양에서 신경 독성 보호효과

WR 추출물을 처리한 조건 배지를 이용하여 WR 추출물의 소교세포의 세포 활성을 조절하여 신경 세포 사멸억제효능을 검증하였고, WR 추출물이 직접적으로 신경세포의 세포사멸을 조절하는지 확인하기 위하여 신경세포-신경교(glial)세포를 직접적으로 공동-배양(co-culture) 한 후에 WR 추출물의 보호 활성을 확인하는 실험을 실시하였다. 랫트 초대배양 피질 신경 및 랫트 초대배양 신경교 세포를 7-12일동안 각각 배양 한 후, 이용하여 신경세포 배양물 상에 트랜스막(transmembrane)을 이용하여 신경교세포를 분주하여 공동-배양을 시행하고, 2 ㎍/㎖ LPS 또는 25 μM Aβ를 처리하여 세포독성을 측정하였다. 그 결과, LPS에 의해 54%의 세포 생존율을 보였던 신경 세포는 50 ㎍/㎖ WR 추출물 처리군에서 79%의 세포 생존율을 나타내어 LPS 단독처리군에 비해 47% 정도 높은 세포 생존율을 확인하였고, Aβ 처리군 에서 60%의 세포 생존율을 나타낸 반면, 50 ㎍/㎖ WR 추출물 처리군에서는 Aβ 단독처리한 군에서 보다 34% 증가된 생존율을 나타내어 WR 추출물이 공동-배양 시스템에서도 신경교 세포의 활성을 조절하여 신경 세포를 보호하는 효능을 지닌 것을 확인하였다(도 6).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

갯무(Raphanus sativus L.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알쯔하이머 질환, 치매, 헌팅턴 질환, 파킨슨씨 질환, 근위축성 측삭 경화증, 기억력저하 및 중증근무력증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 소교세포의 활성화(activation)를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 신경보호(neuroprotective) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 신경세포의 아폽토시스(apoptosis)를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 기능성 식품 조성물 또는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.