KR20150057551A - 마이크로 챔버 플레이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로 챔버 플레이트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유동성 필름을 이용하여 마이크로 챔버 홀을 형성하여, 진공 및/또는 원심력을 이용하여 시료를 주입할 때 보다 원활하게 시료공급이 가능할 뿐 아니라 마이크로 챔버 홀에 포함되어 있는 기포 및 잔존 시료 등을 효율적으로 배출할 수 있도록 함으로써 보다 정확하고 효율적인 분석이 가능한 마이크로 챔버 플레이트에 대한 것이다.

Description

마이크로 챔버 플레이트 {Micro Chamber Plate}
본 발명은 마이크로 챔버 플레이트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유동성 필름을 이용하여 마이크로 챔버 홀을 형성함으로써, 진공 및/또는 원심력을 이용하여 시료를 주입할 때 보다 원활하게 시료공급이 가능할 뿐 아니라 마이크로 챔버 홀에 포함되어 있는 잔존 기포 및 여분의 시료 등이 효율적으로 배출될 수 있어 보다 정확하고 효율적인 분석 및 반응이 가능한 마이크로 챔버 플레이트에 대한 것이다.
마이크로 챔버란 수 마이크로 리터 이하의 미세한 반응이 일어나는 용기로서, 실리콘웨이퍼, 유리, 금속, 세라믹 또는 플라스틱 등으로 형성될 수 있으며, 상기 마이크로 챔버 플레이트란, 상기 마이크로 챔버가 2차원적으로 배열되어 이루어진 플레이트로서 일반적으로 일 측면은 시료가 주입되고 밀봉될 수 있는 구조로 이루어진다.
한편, 유전자의 양을 측정하는 방법으로서 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 수행하면서 실시간으로 유전자의 양에 비례하여 증가되는 형광값을 측정할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)방법이 개발되었다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 중합효소연쇄반응을 수행함에 따라 중합효소연쇄반응 산물로부터 발생되는 형광값을 각 사이클마다 측정하고, 일정량 이상의 형광값이 발생되는 사이클을 확인함으로써 시료의 특정유전자 초기 농도를 정량적으로 분석할 수 있다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 상기 중합효소연쇄반응 후에 전기영동과정이 필요하지 않고, 중합효소연쇄반응을 수행함과 동시에 반응된 산물을 정량적으로 측정하여 시료 내부의 각각의 특정염기배열을 가진 유전자의 농도를 109이상의 범위에서 결정할 수 있는 이점이 있다("A-Z of Quantitative PCR" edited by Stephen A. Bustin 2004-2006 International University, "Realtime PCR" edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group).
상기 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 수행하는 실시간 중합효소연쇄반응 기기는 다양한 형태가 제안된 바 있으며, 다수의 시료를 분석할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응 기기로서 표준 96 웰(well) 또는 384 웰 플레이트를 사용하여 96개 또는 384개의 유전자들을 분석할 수 있는 기기가 제안된 바 있다(Roche 사의 Light cycler 480, ABI 7500, 7900).
상기 Roche 사의 실시간 중합효소연쇄반응 기기는 반응 시료의 양이 10 내지 50의 것으로, 비교적 많은 양의 시료가 소요되고 많은 수의 유전자를 분석하지 못하는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해 MEMS(Micro Electro Mechanical Systems) 기술을 이용하여 반응 시료의 양을 줄임으로써 빠른 시간 내에 많은 시료를 동시에 분석하기 위한 다양한 방법들이 제시된 바 있으며, 이에 따라 마이크로 챔버 어레이 플레이트를 이용한 방법 역시 제안된 바 있다.
마이크로 챔버 어레이 플레이트를 사용하는 방법은 크게 상기 마이크로 챔버에 반응시료를 주입하는 단계, 마이크로 챔버 간의 반응용액을 밀봉시키는 단계, 반응 및 분석단계의 3단계로 구성될 수 있으며, 첫 번째로 개별적으로 상기 마이크로 챔버에 시료용액을 가하는 방법으로서, 투명한 세포배양용 마이크로 챔버 플레이트에 반투과성 막을 덮어 마이크로 챔버를 격리시키고 각각의 마이크로 챔버에 하나의 세포를 배양하여 배양액을 제거한 후, 택맨(Taqman) 반응용액을 가하고 증발방지를 위해 투명 오일로 밀봉하여 온도사이클링을 하면서 플레이트의 바닥에서 형광값을 측정하는 마이크로 챔버 어레이 플레이트가 제안된 바 있다.(YASUDA, Kenji EP 1,541,678 A1, JP 2002245900 Nucleic Acid Analysis Chip and Nucleic Acid Analyzer)상기 방식은 각각의 마이크로 챔버에 각기 다른 용액을 마이크로 피펫으로 흡입하고 가해 주어야하므로 시간이 많이 걸리고 특히, 1,536개 이상의 마이크로 챔버에 시료를 주입하기 위해서 미세자동분주기를 사용해야 하는데 각각 다른 용액을 가하기전에 세척하는 과정에 많은 시간이 걸려 현실적으로 384 플레이트 이상은 사용이 어려운 문제점이 있다.
두 번째로, 첫 번째 방법을 해결하기 위해 실리콘 웨이퍼를 포토리소그래피와 화학식각 방식으로 마이크로 챔버 어레이를 구성한 반응기가 E. Tamiya 교수그룹의 Hidenori Nagai 등에 의해 제시된 바 있다.(Anal. Chem. 200173, 1043-1047, Development of a Microchamber Array for Picoliter PCR)
상기 반응기는 중합효소연쇄반응 용액의 증발을 방지하기 위해 현미경 슬라이드 커버 글라스를 이용하였으나, 상기 커버글라스를 덮을 때와 떼어낼 때 반응액의 교차오염이 유발됨에 따라 발수성 막을 커버글라스와 웨이퍼 사이에 끼워서 먼저 상기 커버글라스를 제거한 후 반응용액을 건조시킨 후에 발수성 막을 제거하고 분석해야하는 번거로움이 있었으며, 실시간 유전자 정량증폭에 사용할 수 없는 문제점이 있었다.
세 번째로, 정량증폭 문제점을 해결하기 위해서 같은 연구실에서 Y. Matsubara 등은 웨이퍼 상의 오목한 마이크로 챔버에 각각의 프라이머를 마이크로어레이 장비를 이용하여 가한 후 건조시킨 마이크로 챔버 어레이를 개발하였다.(7th International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems October 5-9, 2003, Squaw Valley California USA)
상기 마이크로 챔버 어레이는 칩의 상부에 미네랄 오일을 가하여 마이크로 챔버를 완전히 덮은 다음 여기에 중합효소연쇄반응 반응액을 나노제트 분주기를 이용하여 반응기의 미네랄 오일 위에서 점적하는 방법을 사용하였다. 이 방법은 1인치 X 3인치의 실리콘 웨이퍼를 포토리소그래피와 화학식각 방식으로 50 나노 리터의 부피(0.65 X 0.65 X 0.2 mm)를 가지는 1,248개의 마이크로 챔버 어레이 칩을 제조한 후 마이크로 챔버에 프라이머와 택맨(Taqman) 프로브 용액을 나노 리터 분주기로 점적하여 이것을 건조시키고, 전체를 미네랄 오일로 코팅을 하여 각각의 마이크로 챔버를 격리 밀봉하였다.
상기 세 번째 방법을 이용하여 제조된 마이크로 챔버 어레이는 나노 리터 분주기를 이용하여 Taq DNA 중합효소와 시료 DNA의 혼합액을 미네랄 오일의 상층부에서 분사하여 각각의 마이크로 챔버에 분주하여 줌으로서 성공적으로 마이크로 챔버에서 각각의 반응성분들이 교차오염이 없이 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있는 장점이있다.
그러나 상기 방법은 용액을 주입할 때 별도의 마이크로어레이용 나노 리터 분주장비가 필요하고, 분주를 하기 위한 시간이 오래 소요되며, 플레이트 이동 시에 미네랄오일의 유동으로 반응액 상호간의 교차오염의 위험성이 높은 문제점이 있다. 또한, 온도 사이클링 반응 시 고온에서 버블이 발생되고 오일과 수용액의 소수성효과로 인해 수용액이 구형형태로 되어 렌즈효과를 일으킴에 따라 광학 측정 시 여기광과 발광이 산란, 분산되어 측정오차를 크게 만드는 문제점이 있다.
네 번째로, 상기 세 번째와 같은 화학적인 식각방식에 의해 제조된 마이크로 챔버이지만 상기 세 번째 방식보다 훨씬 많은 수의 반응을 시킬 수 있는 것으로 PicoTiterPlate 가 개발된 바 있다(John H. Leamon et al., A massively parallel PicoTiterPlate based platform for discrete pico-liter-scale polymerase chain reactions. Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777).
상기 네 번째 방식은 39.5 pl의 양으로 300,000 개의 독립적인 중합효소연쇄반응을 시킬 수 있는 형태가 있으나 프라이머/프로브들을 고정화한 담체가 있어야 하므로 균일한 광학 특성이 요구되는 실시간 정량 중합효소연쇄반응에 적용될 수 없다.
다섯 번째로, 미량시료를 반응시키기 위해서 미국특허 제 5948673호에는 '필름 반응기(또는 DNA 카드)'라 하는 반응기가 제시된 바 있다.
상기 필름 반응기는 3층의 매우 얇은 필름으로 되어 있으며, 구체적으로, 하층 필름은 반응기의 밑면을 형성하고, 중층 필름은 반응기의 측면을 형성하며, 상층 필름은 시료주입구를 형성한다. 상기 필름 반응기에 파이펫을 통하여 미량 시료용액을 주입한 후에 반응을 위해서는 반응주입구를 완전하게 밀봉하여야 하는데, 완벽히 밀봉되지 않을 경우 중합효소연쇄반응 시 반응용액이 모두 증발되게 되는 문제점이 있으며, 상기 필름 반응기는 수천 개의 시료를 다루기 위해서는 구조적으로 너무 복잡해지므로 현실적으로 제조가 불가능하다.
여섯 번째로 표준 ELISA 플레이트 크기로 1,536 형광분석 반응을 수행할 수 있는 반응플레이트가 WO 02/40158과 US 6,232,114에 개시된 바 있다.
상기 여섯 번째 방법은 플레이트에 다수의 관통된 구멍을 형성하고, 형광양이 적은 투명한 필름을 밀착하여 다수의 반응용기를 형성하고 여기에 시료를 담은 후 투명필름으로 밀봉하여 반응을 수행하는 용기를 이용하는 방법이다. 상기 반응 플레이트는 상면 및 하면이 투명하게 형성되고, 일측 면에서 여기광을 가해주고 다른 한쪽에서 형광을 측정할 수 있는 장점이 있다.
그러나 상기 여섯 번째 방법 역시, 많은 수의 유전자를 분석하기 위해서는 각각의 마이크로 챔버마다 각각 다른 프라이머와 프로브가 들어가야 하는데 많은 수의 시료를 분석하는 플레이트는 수천 개의 다른 용액을 미세한 마이크로 챔버에 넣어 주어야 하므로, 이를 위해 종래의 나노 리터 분주기와 같은 특수한 분주장비가 필요하고, 많은 시간이 걸리는 작업이면서도 시료 주입 시 불량이 발생하는 문제점을 그대로 가지고 있게 된다.
또한, 마이크로 챔버 내에 용액을 완전히 채울 수 없는 문제로 인하여, 기포가 생기고 가온될 경우 마이크로 챔버 상부에 수증기가 맺히게 되어 스케터링에 의해 광학 측정을 방해하는 문제점도 있다.
일곱 번째로 일측 면에 시료 주입을 위한 다공성 막이 형성되고 타측 면에 광학 측정부가 형성된 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 반응플레이트를 본 발명자 등이 PCT 출원(PCT/KR2008/005635)한 바 있다.
상기 일곱 번째 방법은 플레이트에 다수의 관통된 구멍을 형성하고, 일측 면에 형광양이 적은 투명한 필름을 밀착하여 다수의 반응용기를 형성하고 여기에 시료를 담은 후 타측 면에 시료용액 주입이 가능한 다공성 막으로 밀봉하여 반응을 수행하는 용기를 이용하는 방법이다. 상기 반응 플레이트는 다공성 막을 통해 시료용액 주입 후 주입면에 미네랄 오일을 점적하여 밀봉하고, 타측 면에 형성된 광학 측정부로 여기광 인가 및 측정하는 방법이다.
그러나 상기 일곱 번째 방법은, 주입부와 광학 측정부가 별도로 형성되어 있어 구조가 복잡하고, 주입부에 형성된 미네랄 오일층이 투명해져 바닥면의 얼룩 상태에 따라 측정 결과의 편차 문제가 있을 수 있다. 또한, 반응 및 측정을 위해 미네랄 오일점적된 주입부가 하측으로 향할 수 있는데 이때 시료에 비해 상대적으로 밀도가 낮은 미네랄 오일이 마이크로 챔버 내부로 유입되어 스케터링을 유발하는 문제점도 있다.
최근에는 본 출원의 발명자들에 의해 마이크로 챔버 내부의 용액 증발을 방지하고, 시료 주입을 원활하게 함으로써 시료 주입에 소요되는 시간을 획기적으로 단축할 수 있을 뿐 아니라, 마이크로 챔버 홀 간의 용액이 혼입되지 않도록 함과 동시에 시료주입부와 광학 측정부를 일체화하여 간단한 구조를 가지면서도 측정 정확도를 높일 수 있는 새로운 구조의 마이크로 챔버 플레이트가 개발된 바 있다(대한민국 특허 공개공보 제2012-0010118호 참조).
그러나 상기 방법은, 주입을 위한 시료를 다공성 막에 직접 인가하는 구조로 되어 있어, 1) 진공에 의한 시료 주입 방법을 사용할 경우; 진공 인가시 시료의 끓음을 방지하기 위해서 원심력을 가해 주게 되는데 이때 다공성 막의 기공을 통한 기체의 배출이 시료의 표면 장력과 원심력에 의해 방해받게 되고, 2) 원심력에 의해 마이크로 챔버 내의 기체가 압착되어 부피가 축소됨으로써 주입 과정 중에 막을 통해 빠져나갈 수 있을 정도의 부력을 받지 못하고 작은 기포 형태로 잔존하다가 대기압 상태의 측정 조건에서 다시 팽창되어 측정을 방해하는 문제점이 있다.
하지만, 기존의 마이크로 챔버 플레이트들은 모두 각 마이크로 챔버 홀 내에 포함되어 있는 잔존 기포나 여분의 시료 등이 제거되기 어렵고, 이에 따라 여전히 측정의 정확도가 낮다는 단점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 유동성 필름을 이용하여 마이크로 챔버 홀을 형성할 경우, 시료 주입이 완료된 후 각 마이크로 챔버 홀 내에 포함되어 있는 잔존 기포와 여분의 시료가 효율적으로 배출되어 궁극적으로 측정의 정확도가 제고될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 유동성 필름을 이용하여 마이크로 챔버 홀을 형성함으로써, 진공 및/또는 원심력을 이용하여 시료를 주입할 때 보다 원활하게 시료공급이 가능할 뿐 아니라 마이크로 챔버 홀에 포함되어 있는 잔존 기포 및 여분의 시료 등이 효율적으로 배출될 수 있어 보다 정확하고 효율적인 분석 및 반응이 가능한 마이크로 챔버 플레이트를 제공하는 것이다.
특히, 본 발명에 따른 마이크로 챔버 플레이트는 실시간 중합효소 연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행함에 있어, 각 마이크로 챔버 홀 내에 잔존할 수 있는 기포를 완벽하게 제거함으로써 광학 측정시의 정확도를 획기적으로 제고할 수 있을 뿐 아니라, 각 마이크로 챔버 홀 내의 용액 증발을 방지하고, 각 마이크로 챔버 홀 내로의 시료 주입 시간을 단축함으로써 용액 주입의 용이성을 제고할 수 있으며, 각 마이크로 챔버 간의 용액 혼입을 완벽하게 차단할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로 플레이트의 제조방법 및 이를 이용한 분석 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 마이크로 챔버 몸체(300) 상측면(303)에 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)를 포함하며, 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분이 내장될 수 있는 단위 개수의 마이크로 챔버 홀(301)이 형성된 마이크로 챔버 플레이트에 있어서, 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)의 일부 또는 전부, 특히 마이크로 챔버 홀(301)의 하측면(305)이 유동성 필름(200)으로 구성된 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트를 제공한다.
상기 유동성 필름(200)은 마이크로 챔버 몸체(300)에 밀착됨과 동시에 투명한 광학부를 형성하며, 진공 및/또는 원심력 등의 가압에 의하여 시료를 주입할 경우, 원심력에 의해 유동성을 가지는 유동성 필름(200)이 원심력이 작용하는 방향으로 늘어나게 되며(처짐 현상 발생), 진공을 가하여 마이크로 챔버 홀(301) 내부에 있는 공기를 배기시켜 시료가 원활히 유입될 수 있도록 하고, 이후 진공 및 원심력이 제거되면 다시 원래 모양으로 유동성 필름(200)이 돌아오게 되는데(처짐 현상 해소), 이때 각 마이크로 챔버 홀(301) 내에 포함되어 있는 잔존 기포나 여분의 시료가 함께 시료주입부(800)를 통해 원활하게 배출될 수 있다.
본 발명에서의 '유동성 필름(200)'은 열을 가하거나, 감압 또는 가압시 유연성을 가져서 그 형상이 자유롭게 변화할 수 있는 특징을 가지는 필름을 의미한다. 특히, 10~1000G, 바람직하게는 300~700G, 더욱 바람직하게는 400~600G의 원심력이 가해질 때, 원심력이 작용하는 방향으로 늘어나는, 즉 처짐현상이 발생할 수 있는 특성을 가지는 것이 바람직하다.
상기 유동성 필름(200)은 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)에만 형성될 수 있으며, 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)과 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에 모두 형성될 수도 있다. 특히 상기 유동성 필름(200)은 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에서 마이크로 챔버 홀 측면(302)을 거쳐, 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)의 일부 또는 전부, 특히 마이크로 챔버 홀(301)의 하측면(305)까지 연장되어 형성되는 것이 바람직하다. 상기 유동성 필름(200)은 마이크로 챔버의 몸체에 밀착됨과 동시에 투명한 광학부와 마이크로 챔버 홀(301)을 형성하는 역할을 한다.
구체적으로, 상기 유동성 필름(200)이 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)에만 형성될 경우, 마이크로 챔버 홀(301)의 하측면(305)을 포함한 마이크로 챔버 몸체 하측면 모두에 유동성 필름이 형성될 수 있으며, 상기 유동성 필름(200)이 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에서 마이크로 챔버 홀 측면(302)을 거쳐, 마이크로 챔버 홀(301)의 하측면(305)까지 연장되어 형성될 경우, 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)에서는 마이크로 챔버 홀(301)의 하측면(305)에만 유동성 필름이 형성되는 것이 바람직하다.
상기 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)에 유동성 필름(200)을 형성시키기 위해서는 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)에 유동성 필름(200)을 바로 밀착시킬 수도 있지만, 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에 유동성 필름(200)을 밀착시킨 후, 100~300, 바람직하게는 110~270의 온도에서 블로우 성형하여 마이크로 챔버 홀 측면(302)을 거쳐, 마이크로 챔버 몸체 하측면(304)의 일부 또는 전부, 특히 마이크로 챔버 홀(301)의 하측면(305)까지 연장되어 형성되도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 블로우 성형시, 가압 및/또는 진공을 추가적으로 인가하여 주는 것이 바람직하다. 이를 통해 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분, 시료 등이 주입될 수 있는 유동성 필름(200)으로 이루어진 내부공간인 마이크로 챔버 홀(301)이 형성된다.
본 발명에 있어서 상기 유동성 필름(200)의 재질은 광학 측정이 가능하도록 투명성을 지니는 것이라면 어느 것이라도 제한 없이 사용가능하며, 바람직하게는 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 연신 또는 비연신된 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA로 이루어진 군에서 선택된 하나의 고분자 물질 또는 2 이상의 물질이 포함된 코폴리머의 재질로 이루어질 수 있다. 또한 상기 유동성 필름(200)의 두께는 200 이하, 특히 100 이하의 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)와의 부착을 용이하게 하기 위하여, 마이크로 챔버 몸체 밀폐부 표면에 접착성 물질이 도포되거나, 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500) 사이에 접착 성능을 가진 접착 필름(100)이 추가적으로 도입될 수 있으며, 또한, 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체(300)와의 부착을 용이하게 하기 위하여, 마이크로 챔버 몸체 표면에 접착성 물질이 도포되어 접착성 코팅층(600)이 형성되거나, 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체(300) 사이에 접착 성능을 가진 접착 필름(100)이 추가적으로 도입될 수 있다.
상기 접착 필름(100)과 접착성 물질은 유동성 필름과 같이 광학 측정부를 형성할 수 있도록 투명한 재질로 이루어지는 것이 바람직하지만, 일부 빛에 불투과성, 또는 선택적 투과성을 가지는 물질이 사용되더라도 무방하다. 바람직한 접착성 물질은 폴리에틸렌계 필름형 핫멜트 접착제가 사용될 수 있으며, 접착성 필름은 일예로 ZPMA-film001(Pinghu Zhanpeng Hot Melt Adhesive Web & Film Co., Ltd.) 등의 제품이 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 '생물학적 물질 분석을 위한 특이성분'이란 특정한 생물학적 물질, 예를 들어 단백질, DNA, RNA 등의 정량 또는 정성 분석을 위한 성분으로서, 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 의미하며, 특히 실시간 중합효소연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행하기 위해 필요한 성분을 의미한다. 특히, '핵산 분석을 위한 특이성분'은 DNA나 RNA 등의 정량 또는 정성 분석을 위한 성분으로서, 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 의미한다.
본 발명에서의 '시료'란 제조되는 마이크로 챔버 플레이트에 따라 정량 또는 정성 분석을 위한 검체가 단독으로 사용되거나, 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위해 필요한 성분에 검체를 추가하여 사용될 수 있다. 상기 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위해 필요한 성분은 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, DNA 또는 RNA 중합효소 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 실시간 중합효소연쇄반응을 위해 필요로 하는 성분이 제한없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 핫스타트 반응을 위해 피로포스페이트, 피로포스파타제등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어, 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 금속, 고분자 필름, 플라스틱, 다공성 막 재질 등으로 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 마이크로 챔버 몸체(300) 또는 유동성 필름(200)에 부착되어 마이크로 챔버 홀(301)에 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분(400) 또는 시료(700)가 포함될 수 있도록 하는 정도의 경도를 가지며, 마이크로 챔버 홀(301)에 포함되는 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분(400) 또는 시료(700)와의 반응성이 없는 재질의 물질이라면 어느 것이라도 제한 없이 사용가능하다. 특히, 상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 기공 크기 0.2 내지 5.0 의 다공성 막 재질로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 알루미늄, 스텐레스스틸, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA, 폴리스티렌, 나일론, 폴리우레탄 등의 필름 형태이거나, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA, 나일론, PTFE, PVDF 등의 다공성 막일 수 있다.
상기 마이크로 몸체 밀폐부(500)는 5~400 , 바람직하게는 10~200 의 두께를 가질 수 있으며, 광학 측정 효율을 높이기 위해 빛을 반사하는 재질 또는 빛을 반사할 수 있도록 표면이 코팅 또는 개질된 것이 바람직하다.
또한, 상기 마이크로 몸체 밀폐부(500)는 유동성 필름(200)을 통한 마이크로 챔버 몸체(300)와의 융착 등을 통해 마이크로 챔버 홀(301) 내부로 주입된 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분 또는 시료가 외부로 유출되는 것을 방지하는 목적으로 사용된다.
상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)에는 각 마이크로 챔버 홀(301) 당 하나 이상의 시료주입부(800)가 형성되어 있는 것이 바람직하다. 각 시료주입부(800)는 마이크로 챔버 홀(301)의 면적에 따라 상이하게 형성될 수 있으며, 각 마이크로 챔버 홀 전체 면적(마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)와 접촉하고 있는 방향으로의 상부의 면적) 대비 0.05% 내지 60%의 면적을 가지는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서 상기 시료주입부(800)는 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)가 금속인 경우 에칭으로 가공 가능하며, 고분자 필름인 경우 펀칭으로 가공 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 설명한 바와 같이 본 발명에 있어서 상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 유동성 필름(200)의 상층부에 융착되며, 마이크로 챔버 밀폐부와(500)와 유동성 필름(200) 사이에 접착 성능을 가진 접착 필름(100)이 추가적으로 도입될 수 있는데, 이때 접착 필름은 열융착, 초음파 융착, 접합제 도포 등의 방법을 통해 도입될 수 있다. 가열에 의한 융착의 경우, 100~170, 바람직하게는 110~160, 더욱 바람직하게는 120~150의 온도로 가열을 통하여 밀착이 원활하게 되도록 한다. 밀착 후 진공 및/또는 원심력 등의 가압을 통한 시료(700) 주입이 완료된 이후, 시료주입부(800)를 고분자 필름, 오일, 실리콘, 파라핀 및 접착제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 이용하여 밀봉할 수 있다.
본 발명에 있어서 마이크로 챔버 몸체(300)는 금속 또는 고분자 재질로 이루어지는 것이 바람직하며, 특히 SUS(Stainless Steel) 재질로 이루어지는 것이 바람직하다. 특히, 마이크로 챔버 몸체(300)의 표면은 유동성 필름(200)과의 접착력을 증대시켜 유동성 필름(200)의 이탈을 방지하고 유동성 필름(200)의 측면이 마이크로 챔버 몸체(300)에 안착하도록 하여 원심력에 의한 유동성 필름(200)의 처짐이 원심력 방향으로만 한정되도록 하기 위하여 폴리에스터계 고분자 수지 및 폴리에틸렌계 핫멜트 접착제 중에서 선택된 하나 이상의 물질에 의해 코팅되어 접착성 코팅층(600)이 형성되어 있는 것이 바람직하다. 상기 마이크로 챔버 몸체의 표면의 코팅은 스프레이, 디핑, 또는 롤러 등의 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 수행 가능하다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 마이크로 챔버 플레이트 제조의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법은
(a) 마이크로 챔버 몸체의 상측면(303)에 유동성 필름(200)을 밀착시키는 단계;
(b) 블로우 성형을 통해 각 마이크로 챔버 홀 측면(302)과 유동성 필름(200)을 밀착시키는 동시에 마이크로 챔버 홀 하측면(305)에 유동성 필름(200)을 형성하여 마이크로 챔버 홀(301)을 형성하는 단계;
(c) 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)의 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)를 융착시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법에 있어서, 마이크로 챔버 몸체(300), 유동성 필름(200), 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500) 등은 앞서 설명한 바와 같은 기술적 특징을 가진다.
상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에, (b') 각 마이크로 챔버 홀(301)에 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분(400)을 주입하는 단계;를 더 포함할 수 있으며, 상기 (b) 단계의 블로우 성형은 100~300, 바람직하게는 110 내지 270의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 (b) 단계의 블로우 성형 단계에서 진공 또는 가압, 또는 진공 및 가압을 가해주어 마이크로 챔버 홀을 형성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 (c) 단계 이후에, (d) 시료(700) 주입 단계 및 (e) 시료주입부(800) 밀봉 단계; 를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 유동성 필름을 포함하는 마이크로 챔버 플레이트는 실시간 중합효소 연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행함에 있어, 각 마이크로 챔버 홀 내에 잔존할 수 있는 잔존 기포 및 여분의 시료를 완벽하게 제거함으로써 광학 측정시의 정확도를 획기적으로 제고할 수 있을 뿐 아니라, 각 마이크로 챔버 홀 내의 용액 증발을 방지하고, 각 마이크로 챔버 홀 내로의 시료 주입 시간을 단축함으로써 용액 주입의 용이성을 제고할 수 있으며, 각 마이크로 챔버 간의 용액 혼입을 완벽하게 차단할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 마이크로 챔버 홀(301)에 주입되는 특이성분의 종류에 따라 소량의 시료를 이용한 다양한 분석이 가능하고, 하나의 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 다수의 시료 분석이 가능한 장점이 있다.
도 1은 유동성 필름과 마이크로 챔버 몸체 밀폐부가 부착되어 완성된 마이크로 챔버 플레이트의 사시도이다.
도 2는 마이크로 챔버 몸체에 유동성 필름을 밀착시킨 뒤 시료를 주입하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2-(A)는 마이크로 챔버 몸체에 유동성 필름이 밀착된 상태를 나타내는 도면.
도 2-(B)는 유동성 필름이 밀착된 마이크로 챔버 몸체에 가열, 진공 또는 압력을 가해서 원기둥형 광학측정부를 형성하여 마이크로 챔버 홀이 형성된 상태를 나타내는 도면.
도 2-(C)는 유동성 필름이 밀착된 마이크로 챔버 몸체에 가열, 진공 또는 압력을 가해서 반구형 광학측정부를 형성하여 마이크로 챔버 홀이 형성된 상태를 나타내는 도면.
도 2-(D)는 상기 마이크로 챔버 홀에 특이 성분이 주입된 형태를 나타내는 도면.
도 2-(E)는 마이크로 챔버 몸체의 상측면에 마이크로 챔버 몸체 밀폐부가 융착된 상태를 나타내는 도면.
도 2-(F)는 진공 및/또는 원심력으로 마이크로 챔버 홀 내로 시료를 주입한 상태를 나타내는 도면(마이크로 챔버 홀 내부에 기포가 포함되어 있음).
도 2-(G)는 진공 및/또는 원심력이 제거된 뒤 유동성 필름이 수축하여 마이크로 챔버 홀 내 기포가 배출되어 제거된 상태를 나타내는 도면.
도 3은 마이크로 챔버 플레이트에 유동성 필름과 접착 필름을 밀착시킨 뒤 시료를 주입하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3-(A)는 마이크로 챔버 몸체에 유동성 필름과 접착 필름이 밀착된 상태를 나타내는 도면.
도 3-(B)는 유동성 필름과 접착 필름이 밀착된 마이크로 챔버 몸체에 가열, 진공 또는 압력을 가해서 원기둥형 광학측정부를 형성하여 마이크로 챔버 홀이 형성된 상태를 나타내는 도면.
도 3-(C)는 유동성 필름과 접착 필름이 밀착된 마이크로 챔버 몸체에 가열, 진공 또는 압력을 가해서 반구형 광학측정부를 형성하여 마이크로 챔버 내부에 용기를 형성한 도면.
도 3-(D)는 상기 마이크로 챔버 홀에 특이 성분이 주입된 형태를 나타내는 도면.
도 3-(E)는 마이크로 챔버 몸체의 상측면에 마이크로 챔버 몸체 밀폐부가 융착된 상태를 나타내는 도면.
도 3-(F)는 진공 및/또는 원심력으로 마이크로 챔버 홀 내로 시료를 주입한 상태를 나타내는 도면(마이크로 챔버 홀 내부에 기포가 포함되어 있음).
도 3-(G)는 진공 및/또는 원심력이 제거된 뒤 유동성 필름이 수축하여 마이크로 챔버 홀 내 기포가 배출되어 제거된 상태를 나타내는 도면.
도 4는 제작된 마이크로 챔버 플레이트를 내장하는 중합효소 연쇄반응용 챔버 결합체의 결합 사시도이다.
도 5는 제작된 마이크로 챔버 플레이트를 내장하는 중합효소 연쇄반응용 챔버 결합체를 나타낸 형상이다.
도 6은 마이크로 챔버 몸체 밀폐부의 시료 주입부 형상의 예시를 도시한 것이다.
도 7은 마이크로 챔버 홀에 시료주입 후 기포가 배기된 현상을 비교 보여주는 도면이다. (사진은 약 60배 확대하여 촬영한 사진으로 가운데 까맣게 보이는 점들은 시료주입부의 모습이다.)
(A) 기존 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 시료 주입 시 기포가 마이크로 챔버 홀 내에 형성된 사진.
(B) 본 발명의 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 시료 주입 시 마이크로 챔버 홀 내에 기포 없이 시료가 주입된 사진.
도 8은 본 발명의 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 중합효소 연쇄반응결과 증폭 현상이 나타남을 보여주는 그래프이다.
도 9은 본 발명의 마이크로 챔버 플레이트를 이용한 중합효소 연쇄반응 결과물에 대한 SDS-PAGE 젤 확인 결과이다.
이하, 실시예 및 도면을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 마이크로 챔버 플레이트의 제조
1.1 마이크로 챔버 몸체(300)의 준비
마이크로 챔버 몸체 내부에 일정 공간, 즉 마이크로 챔버 홀(301)이 형성될 수 있도록 일정한 두께의 SUS(Stainless Steel)를 에칭하여 마이크로 챔버 몸체(300)를 준비하였다. 마이크로 챔버 몸체(300)를 형성하는 SUS(Stainless Steel)의 두께는 1 mm이고, 챔버 홀(301)은 직경 1.2 mm 내지 1.9 mm이며, 각각의 챔버 홀(301)은 2.25 mm 간격으로 개별 플레이트 당 최대 768개까지 형성된다. 챔버 홀(301)의 직경 및 각각의 챔버 홀(301) 간의 간격은 용이하게 조절이 가능하다.
1.2 마이크로 챔버 몸체(300)와 유동성 필름(200)의 밀착
상기 유동성 필름(200)은 폴리에틸랜, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트 및 폴리카보네이트에서 선택된 하나 또는 둘 이상이 조합되어 사용가능하며 성형이 가능한 투명한 필름은 모두 사용 가능하다. 이하, 캐스트 유동성 필름(200)으로 폴리프로필렌(Cast Polypropylene) 필름(한국 율촌화학 GCP, 60 )을 사용한 실시예를 예로 들어 설명한다.
마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에 유동성 필름(200)을 밀착시키기 위하여, 마이크로 챔버 몸체(300)에 액상핫멜트(에어로켐, 427T)를 MEK에 3~5 vol%로 희석하여 스프레이 코팅하였다. 액상핫멜트는 마이크로 챔버 몸체로부터 유동성 필름(200)이 이탈되지 않도록 마이크로 챔버 몸체(300)와 유동성 필름을 고정시키는 역할을 한다. 이후. Cast Polypropylene (CPP) 필름 (한국 율촌화학 (GCP, 60 ))과 접착 필름(ZPMA-film001, Pinghu Zhanpeng Hot Melt Adhesive Web & Film Co., Ltd.)을 마이크로 챔버가 제조 가능한 크기로 재단하고, 블로우 성형용 성형 기구물에 마이크로 챔버 몸체, CPP 필름, 접착 필름 순으로 적층하였다.
본 발명의 유동성 필름(200)은 상기 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)과 각 마이크로 챔버 홀 측면(302)에 밀착되어 형성되며, 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에서 마이크로 챔버 몸체 하측면(304), 특히 마이크로 챔버 홀(301)의 하측면(305)까지 연결되어 각각의 마이크로 챔버 홀(301)을 연결하도록 형성되며, 각각의 마이크로 챔버 홀 내부를 보호하고 각각의 마이크로 챔버 홀을 분리시키며 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에서 마이크로 챔버 밀폐부(500)의 융착이 가능하도록 하는 역할을 한다.
상기 유동성 필름(200)은 투명한 필름으로 이루어져 주입부의 배면에 위치하여 광학 측정부를 형성한다. 상기 유동성 필름(200)을 이루는 필름의 조합은 바람직하게는, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 연신 및 무연신 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA 또는 이들의 코폴리머 중 선택될 수 있으며, 이들 필름은 진공 및 가압에 의해 마이크로 챔버 몸체(300)에 밀착되는 동시에 투명한 광학 측정부를 형성함으로써 마이크로 챔버 홀(301)을 형성할 수 있다.
1.3 유동성 필름을 이용한 마이크로 챔버 홀 형성
마이크로 챔버 몸체에 상기 실시예 1.2와 같이 유동성 필름(200)을 부착시킨 후, 170~270 온도로 가열하면서, 진공(- 20 kPa ~ -100 kPa) 또는 가압(1~2kgf/)하는 블로우 성형을 통해 마이크로 챔버 홀 측면(301)과 마이크로 챔버 하측면(304)에 유동성 필름(200)을 형성하였다. 이때 진공 및 가압 인가시에는 리크(leak)가 발생하지 않도록 밀폐하였다. 블로우 성형이 완료 후 1 시간이 경과한 때, 찬물을 이용하여 성형 기구물을 냉각시키고, 성형 기구물에서 유동성 필름이 성형된 마이크로 챔버 몸체를 분리하였다. 마이크로 챔버 몸체에 성형된 유동성 필름의 여분을 마이크로 챔버 몸체에 맞게 커팅하였다.
1.4. 마이크로 챔버 홀(301) 내부로의 특이성분(400)의 분주
상기 마이크로 챔버 몸체에 형성된 각 마이크로 챔버 홀(301) 내부에 핵산 분석을 위한 특이성분(400)을 각각 분주하였다. 상기 특이성분(400)은 각각의 프라이머 또는 프로브를 포함한다. 특이성분(400)의 분주는 전용의 시료 분주기를 이용하여 이루어지며, 반응을 위해 계산된 농도의 시료가 각 마이크로 챔버 홀(301) 당 1~2 씩 동시에 분주되었다. 분주된 특이성분(400)은 마이크로 챔버 홀(301)로부터의 이탈을 방지하기 위해 80~90 의 오븐에서 5 분 건조시켰다.
1.5. 마이크로 챔버 몸체(300)와 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)의 융착
상기 서로 다른 특이성분이 내장된 마이크로 챔버 홀(301)을 포함하는 마이크로 챔버 몸체(300)에 시료주입부(800)가 형성된 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)를 부착하였다. 상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 두께 10 ~ 200 의 알루미늄, 스텐레스스틸, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA, 폴리스티렌, 나일론, 폴리우레탄 등의 필름 형태이거나, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA, 나일론, PTFE, PVDF 등의 다공성 막 또는 금속일 수 있다.
상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)가 금속 또는 필름의 형태일 경우, 상기 시료 주입부(800)는 시료 주입을 위한 한 개 이상의 주입홀을 가지며, 주입홀은 각 마이크로 챔버 홀 면적의 0.05% 내지 60%의 면적을 가지는 점 또는 선으로 이루어지는데, 바람직하게는 도 6과 같은 형상일 수 있다.
상기 필름 형태의 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)의 경우, 시료(700) 주입 및 주입홀 실링 시에 일부 시료(700)가 유출되어도 이웃한 다른 마이크로 챔버로 시료 용액이 혼입되는 것을 방지하기 위하여 각각의 마이크로 챔버 사이를 격리시키는 패턴이 형성될 수 있다.
또한, 상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)가 다공성 막일 경우, 기공 크기가 0.2 ~ 5.0 인 투명하거나 반투명한 고분자성 다공성 막일 수 있다. 본 발명에서는, 두께 50 의 스텐레스 스틸을 에칭 가공하여 200 의 시료주입부(800)를 형성시켜 사용하였다. 상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 상기 마이크로 챔버에 형성된 유동성 필름(200)의 융착면에 융착되어 마이크로 챔버 상부를 밀폐함으로써 각각의 독립된 마이크로 챔버를 형성시킨다.
상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)의 융착은 상기 마이크로 챔버 몸체(300)에 이미 밀착된 유동성 필름(200)의 소재 및 구성에 따라, 상기 유동성 필름(200)이 1종의 필름으로 이루어졌을 경우, 접착제가 도포되어 경화되거나, 상기 유동성 필름이 2종 이상의 필름의 조합으로 이루어졌을 경우에는, 초음파 밀착에 의하거나, 열에 의해 가열 압착되어 이루어질 수 있다.
상기 접착제는 상온 경화 형이나, 열 경화 형, 반응 경화 형 등일 수 있으며, 물에 의해 녹아 나오지 않고 열에 안정하면 바람직하다.
상기 초음파 밀착이나 열에 의한 밀착의 경우, 마이크로 챔버 몸체(300)와 밀착된 유동성 필름(200)의 변형이 없으면서 유동성 필름(200)의 일부가 용융될 수 있는 온도인 것이 바람직하다. 본 발명의 경우, 150 에서 5초 이내로 가열 압착하거나 롤로 압착하여 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)를 융착하였다. 또한, 실제로 초음파 밀착의 경우 부착면에서 발생한 열이 마이크로 챔버 내부로 전달되지 않기 때문에 온도와 무관하게 수행될 수 있다.
바람직하게는 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500) 융착 후 완전한 안치를 위하여 냉각 및 후 압착 공정이 더 수행될 수 있다.
실시예 2. 시료주입부를 통한 시료의 주입
마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)에 형성된 시료주입부(800)를 통해 시료를 각 마이크로 챔버 홀(301)에 진공 주입하는 과정을 상세히 설명한다. 이때 사용되는 시료는 각 마이크로 챔버 홀(301)마다 상이할 수도 있고, 일부 또는 전부의 마이크로 챔버홀에 동일한 시료가 주입될 수 있다.
상기 마이크로 챔버 홀(301) 내부에 시료(700)를 주입할 때, 진공 및 원심력을 이용하여 마이크로 챔버 홀(301) 내부의 공기를 우선 제거한 이후에 시료(700)가 접촉되도록 하여 마이크로 챔버 홀(301) 내부의 공기를 원활하게 제거할 수 있도록 하며, 이를 통해 시료(700)가 기포 없이 완전하게 주입되도록 한다.
그러나, 마이크로 챔버 홀(300) 내부의 공기를 제거한다 하더라도 장시간 진공 상태를 유지할 경우 시료(700)의 증발이 발생할 수 있고, 충분한 진공 인가가 이루어지지 않을 경우에는 잔류하는 기포를 완전히 제거하는데 한계가 있다.
따라서 본 발명에서는, 원심력에 의해 유동할 수 있는 유동성 필름(200)을 형성하여 충분한 시료 공급이 가능하도록 함으로써 시료(700)의 완벽한 주입을 가능하도록 한다.
상기 유동성 필름(200)은 원심력에 의해 처짐이 발생할 수 있으며, 그로 인해 내용적이 증가하고 시료주입부(800)로부터 충분한 시료(700) 공급이 가능하도록 하며, 원심력 해제 시 처짐이 완화되어 여분의 시료가 마이크로 챔버 홀(301) 외부로 다시 배출되는 동시에 마이크로 챔버 홀(301) 내부에 잔존할 수 있는 기포(701)가 시료주입부(800)를 통해 마이크로 챔버 홀(301) 외부로 완전히 빠져 나가도록 함으로써, 완벽한 시료 주입이 가능하도록 한다.
본 발명에서는 50 G 이하의 원심력에서 1분 30초 이내로 진공을 인가한 후, 진공 상태를 유지하며 450 G 이상에서 시료(700)의 주입이 이루어지도록 하였다. 상기 원심력은 상기 유동성 필름(200)의 처짐이 발생할 수 있는 충분한 원심력인 것이 바람직하며, 본 발명에서는 450 G 이상에서 충분히 유동성 필름(200)의 처짐이 발생하도록 하였다.
시료주입이 완료된 후, 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)에 형성되어 있는 시료주입부(800)를 통한 시료(700)의 유출을 막기 위해 시료주입부(800)를 실링하였다. 바람직하게는 고분자성 필름, 오일, 실리콘, 파라핀, 접착제 등에 의해 실링될 수 있으며, 바람직하게는 고분자성 필름을 부착하여 주입부(800)를 실링하였다.
본 발명에서는 시료로써 HBV Kit (바이오니아, AccuPower ® HBV Quantitative PCR Kit)를 이용하였으며, 자세하게는 96-웰 플레이트 용으로 공급되는 건조형태의 시료에 IPC(internal positive control) 0.5 ?, PC(positive control) 0.5 ?과 증류수(D.W)를 주입하여 전체 부피를 50 ?으로 맞춘 후 본 발명의 마이크로 챔버 플레이트 챔버 홀내에 주입시키기 위해 전용 주입기를 이용하여 각 마이크로 챔버 홀 내부로 주입시켜 마이크로 챔버 플레이트를 완성하였다.
본 실시예에서 제조되는 마이크로 챔버 플레이트는 제조 후 중합효소 연쇄반응이 제대로 수행되는지 확인하기 위해 제조하는 것으로 실시예 1.4에 따른 특이성분 주입단계를 생략하고 시료와 함께 IPC와 PC를 주입해 주었다. 이때, 사용된 PC는(positive control)이 본 실험에서 검체의 역할을 수행하게 되어 증폭결과를 확인 할 수 있는 것이다.
실시예 3. 중합효소연쇄반응 수행 및 정량 분석
상기 실시예 2에서 제조된 마이크로 챔버 플레이트를 이용하여, 중합효소 연쇄 반응을 수행하고, 그 결과로부터 본 발명의 마이크로 챔버 플레이트에서 유전자 증폭이 가능함을 확인하였다.
본 발명에 사용되는 증폭장비는 한국 등록특허 10-1089045에 언급된 장치를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하였다. 증폭 반응 조건은 아래 표 1과 같다. 아래 반응 조건의 온도 및 시간은 본 실시예에 한정된 것은 아니며, 반응에 적합한 다른 조건으로 변경 가능하다. 상기 조건에 따라, 25 에서 1분 간 안정화를 거쳐, 95 에서 5분 간 변성 시킨 후, 95 에서 5초, 55 에서 10초씩 50회 반복하여 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 8과 도 9에 나타내었다. 도 8에 따르면, 중합효소연쇄반응의 사이클이 진행됨에 따라 측정된 형광 값이 증가하며 전형적인 증폭 곡선을 보여, 모든 마이크로 챔버 플레이트의 챔버에서 증폭이 일어남을 확인할 수 있었다. 또한, 도 9에서 증폭된 산물을 확인하기 위해 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였으며, 확인결과 PC(positive control) 증폭 위치에서 밴드를 확인할 수 있어 정상적인 증폭이 확어났음을 확인하였다. (Marker : (주)바이오니아, 25/100 bp Mixed DNA Ladder) 이와 같은 결과를 통해, 본 발명의 마이크로 챔버 플레이트에서 정상적인 유전자 증폭이 가능함을 확인하였다.
표 1. 중합효소연쇄반응 조건
Figure pat00001
실시예 4. 마이크로 챔버 플레이트의 사용
도 4 및 도 5를 참조하여 본 발명에 마이크로 챔버 플레이트의 사용방법을 설명한다. 본 발명에 따른 마이크로 챔버 플레이트는 마이크로 챔버 플레이트 수용부(5000)에 수용될 수 있다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부(5000)는 평평한 판상으로 형성될 수 있다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부(5000)는 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(4000)를 안치시키기 위한 것이다. 도면부호 5100은 마이크로 챔버 플레이트 수용부(5000)가 다수개 일체로 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 모듈을 나타낸다. 한편, 마이크로 챔버 플레이트 수용부 모듈(5100)의 측면에는 수용부 체결돌기(5200)가 돌출 형성된다. 도 4의 도면 부호 3100은 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000)가 상호 연결되어 다수개 형성된 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개 모듈을 나타낸다.
또한, 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000) 하측면에 용기 연통부가 형성된다. 용기 연통부는 외력에 의하여 벌어지는 절개선(3200)일 수 있다. 상기 절개선은 원심을 가했을 경우 압력에 의해 절개선이 벌어지는 현상이 발생하여 주입하고자 하는 시료용액이 절개선을 통해 마이크로 챔버 홀 내부로 유입되도록 한다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000) 하측면에 외력이 작용하지 않는 경우 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000)에 임시 저장된 핵산을 포함하는 시료 용액은 절개선(3200)을 통하여 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000) 외부로 유출되지 않게 된다. 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000)는 실리콘 재질로 형성될 수 있다. 한편, 절개선(3200)의 형상은 "+" 형상이거나, "<" 형상이거나, "=" 형상이거나, "?quot; 형상일 수 있다.
상기 마이크로 챔버 플레이트 수용부는 체결 케이스(2000)에 체결될 수 있다. 체결 케이스(2000)에는 상하면을 관통하는 케이스 관통공(2200)이 형성된다. 도면부호 2100은 체결 케이스(2000)가 상호 연결되어 다수개 형성된 체결 케이스 모듈을 나타낸다. 한편, 체결 케이스 셋(2100)의 측면에는 수용부 체결돌기(5200)가 끼워지는 케이스 체결홈(2300)이 형성된다. 체결 케이스(2000)는 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000) 상단을 압착하며 마이크로 챔버 플레이트 수용부에 체결된다. 체결 케이스(2000)와 마이크로 챔버 플레이트 수용부(5000)와의 체결은 수용부 체결돌기(5200)가 케이스 체결홈(2300)에 끼워짐으로써 이루어진다. 체결 케이스(2000)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(5000)에 체결됨으로써 덮개 지지부의 하측단이 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(4000) 상면에 밀착되고, 이에 따라 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000)와 시료 주입용 마이크로 챔버 플레이트(4000) 상면 사이에 시료 용액 저장 공간이 형성된다. 체결 케이스(2000)가 마이크로 챔버 플레이트 수용부(5100)와 체결됨에 따라 관통공의 하측단은 시료 용액 저장 공간에 연통되고, 케이스 관통공(2200)은 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000)와 연통된다.
체결 케이스(2000)에는 케이스 덮개(1000)가 부착된다. 케이스 덮개(1000)에는 상하면을 관통하는 케이스 덮개 관통공(1200)이 형성된다. 케이스 덮개 관통공(1200)은 케이스 덮개(1000)가 체결 케이스(2000)에 부착된 경우 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덮개(3000)의 일부는 밀폐하도록 형성된다. 도면부호 1100은 케이스 덮개(1000)가 상호 연결되어 다수개 형성된 케이스 덮개 모듈을 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
100 : 접착 필름
200 : 유동성 필름
300 : 마이크로 챔버 플레이트 몸체
301 : 마이크로 챔버 홀
302 : 마이크로 챔버 홀 측면
303 : 마이크로 챔버 몸체 상측면
304 : 마이크로 챔버 몸체 하측면
305 : 마이크로 챔버 홀 하측면
400 : 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분
500 : 마이크로 챔버 몸체 밀폐부
600 : 접착성 코팅층
700 : 시료
701 : 기포
800 : 시료주입부
1000 : 케이스 덮개
1100 : 케이스 덮개 모듈
1200 : 케이스 덮개 관통공
2000 : 체결 케이스
2100 : 체결 케이스 모듈
2200 : 체결 케이스 관통공
2300 : 체결 케이스 체결홈
3000 : 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덥게
3100 : 마이크로 챔버 플레이트 수용부 덥게 모듈
3200 : 절개선
4000 : 마이크로 챔버 플레이트
4100 : 마이크로 챔버 플레이트 모듈
5000 : 마이크로 챔버 플레이트 수용부
5100 : 마이크로 챔버 플레이트 수용부 모듈
5200 : 마이크로 챔버 플레이트 수용부 채결돌기

Claims (28)

  1. 마이크로 챔버 몸체(300), 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)를 포함하며, 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분이 내장될 수 있는 마이크로 챔버 홀(301)이 형성된 마이크로 챔버 플레이트에 있어서,
    마이크로 챔버 몸체 하측면(304)의 일부 또는 전부가 유동성 필름(200)으로 구성된 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)은 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에서 마이크로 챔버 챔버 홀 측면(302)을 거쳐, 마이크로 챔버 홀 하측면(305)까지 연장되어 형성된 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  3. 제1항에 있어서,
    마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에 유동성 필름(200)을 부착시키고, 블로우 성형한 후, 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)를 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)에 밀착시켜 제조된 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)은 가열, 진공 또는 가압, 또는 가열, 진공 및 가압에 의해 마이크로 챔버 몸체(300)에 부착되는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)은 진공 또는 가압, 또는 진공 및 가압에 의한 시료 공급시 처짐이 발생하여 시료주입부(800)로부터 시료 공급이 가능하도록 하며,
    진공 및 가압 해제 시 처짐이 완화되어 여분의 시료와 마이크로 챔버 홀(301) 내부에 잔존하고 있는 기포(701)가 시료주입부(800)를 통해 마이크로 챔버 홀 외부로 빠져 나오도록 하는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버(300) 몸체의 사이, 또는 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)의 사이에 밀착을 위한 접착 필름(100)이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)은 광학 측정을 위한 투명성을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)은 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 연신 및 무연신 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA 또는 이들의 코폴리머 중에서 선택된 재질을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)에 각 마이크로 챔버 홀 당 하나 이상의 시료주입부(800)가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 금속 또는 고분자 필름으로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 기공 크기 0.2 내지 5.0 의 다공성 막인 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 각 시료주입부(800)는 각 마이크로 챔버 홀 전체 면적 대비 0.05% 내지 60%의 면적을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  13. 제2항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 유동성 필름(200)과 열융착, 레이저융착 및 접착제 도포에서 선택된 하나 이상의 방법을 통해 융착되는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체(300)의 표면은 폴리에스터계 고분자 수지 및 폴리에틸렌계 핫멜트 접착제 중에서 선택된 하나 이상의 물질에 의해 코팅된 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  15. (a) 마이크로 챔버 몸체의 상측면(303)에 유동성 필름(200)을 부착시키는 단계;
    (b) 블로우 성형을 통해 각 마이크로 챔버 홀 측면(302)과 유동성 필름(200)을 부착시키는 동시에 마이크로 챔버 홀 하측면(305)에 유동성 필름(200)을 형성하여 마이크로 챔버 홀(301)을 형성하는 단계;
    (c) 마이크로 챔버 몸체 상측면(303)의 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)를 융착시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에 (b') 각 마이크로 챔버 홀(301)에 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분을 주입하는 단계;
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 블로우 성형은 100 내지 300의 온도에서 수행되는 것을
    특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체(300)의 사이, 유동성 필름(200)과 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500) 사이에 밀착을 위한 접착 필름(100)이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)은 광학 측정을 위한 투명성을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 유동성 필름(200)은 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 연신 및 무연신 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA 또는 이들의 코폴리머 중에서 선택된 재질을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)에 각 마이크로 챔버 홀 당 하나 이상의 시료주입부(800)가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 금속 또는 고분자 필름으로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  23. 제15항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)는 기공 크기 0.2 내지 5.0 의 다공성 막인 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  24. 제15항에 있어서,
    상기 각 시료주입부(800)는 각 마이크로 챔버 홀 전체 면적 대비 0.05% 내지 60%의 면적을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  25. 제15항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서의 마이크로 챔버 몸체 밀폐부(500)와 유동성 필름(200)은 열융착, 초음파융착, 접합제 도포에서 선택된 하나 이상의 방법을 통해 융착되는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  26. 제158항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버 몸체(300)의 표면은 폴리에스터계 고분자 수지 및 폴리에틸렌계 핫멜트 접착제 중에서 선택된 하나 이상의 물질에 의해 코팅된 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트.
  27. 제15항에 있어서,
    상기 (c) 단계 이후
    (d) 시료(700) 주입 단계; 및
    (e) 시료주입부(800) 밀봉 단계;
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 시료 주입부(800)의 밀봉은 고분자 필름, 오일, 실리콘, 파라핀 및 접착제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 마이크로 챔버 플레이트의 제조방법.
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