JP2009139138A - 反応容器 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】反応容器は、板状体10と、フィルム部材20と、上蓋部材30とを備える。
板状体10には、複数の開口11が貫通形成されている。フィルム部材20は、平面部21と、平面部21に接続される袋体22とを備える。袋体22は、開口11の内側に位置し、平面部21に接続される部分が挿入口22Aとなる。上蓋部材30は、平面部21上に載置され袋体22の挿入口22Aを密閉する。フィルム部材20は、袋体22が温調部材40に接触したとき、袋体22が温調部材40の形状に沿って変形する柔軟な材料により構成されている。
【選択図】図1
Description
このような、反応容器(チップ)も、遺伝子診断方法や遺伝子診断装置により、様々なものが供給されている。
例えば、特許文献1に示されるように、複数の小部屋に必要に応じて試料、試薬を収容し、反応に際しては仕切り手段を開放して小部屋を合体し、試料と試薬を反応させるように構成されたものがある。
特許文献1では、反応容器、サンプル処理装置に加熱手段により熱を与え・温調制御を行い、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を実施することが例示されている。
特許文献1では、一つの検体試料に対する試薬等が一連のチューブに封入されてPCR反応等に使用されるが、複数の試料を反応させるためには、多くのチューブが必要となる。
特許文献1に示されるように、反応容器やサンプル処理装置(以下、反応容器等という)そのものを加熱手段で加熱するときには、反応容器等の材質による熱伝導性の違いの他に、加熱手段と、反応容器等との接触(密着)性が悪いことにより、加熱が十分にできない、加熱に時間がかかる等の問題があった。
加熱手段と反応容器等の接触性を改善するために、温調制御される加熱手段と反応容器等の間に、弾力性あるいは密着性もしくはその両方を有する緩衝材や金属板などを挟むことが行われてきた。しかし、これらの対策では、構成要素が増えてしまう。
また、反応容器内の溶液を加熱時に攪拌しようと試みた場合、一度は蓋を開封して、攪拌操作を行わなければならず、その際に、コンタミネーションや溶液の突沸、蒸発等の問題が懸念される。
また、本発明の反応容器は、一端が閉塞され他端が挿入口とされたチューブの前記挿入口から前記チューブ内に反応試料を挿入し、前記挿入口側のチューブ箇所を閉じて密閉された反応試料の反応室が形成される反応容器であって、前記チューブは、前記反応室が温調部材に接触したとき、前記反応室が前記温調部材の形状に沿って変形する柔軟な材料により構成されていることを特徴とする。
したがって、袋体は温調部材に対する接触面積を増大させて温調部材に密着することができるので、温調部材の温度を効率良く吸収して反応試料の反応を促進させることができる。
また、本発明によれば、一端が閉塞され他端が挿入口とされたチューブの前記挿入口から前記チューブ内に反応試料を挿入し、前記挿入口側のチューブ箇所を閉じて密閉された反応試料の反応室が形成される。チューブは、反応室が温調部材に接触したとき、前記反応室が前記温調部材の形状に沿って変形する柔軟な材料により構成されている。
したがって、反応室は温調部材に対する接触面積を増大させて温調部材に密着することができるので、温調部材の温度を効率良く吸収して反応試料の反応を促進させることができる。
<反応容器>
以下、本発明の実施形態の反応容器について図面を参照して説明する。
図1は実施の形態1の反応容器の構成を示す図である。
図1に示すように、この反応容器は、板状体10と、フィルム部材20と、上蓋部材30とを備える。
板状体10には、複数の開口11がその表面10Aから裏面10Bに貫通形成されている。
フィルム部材20は、板状体10の表面10Aに載置される平面部21と、平面部21に接続された袋体22とを備える。袋体22は、平面部21が表面10Aに載置された状態で開口11の内側に位置し、平面部21に接続される部分が挿入口22Aとなる。袋体22は、板状体10の裏面10Bから下方に突出している。
上蓋部材30は、平面部21上に載置され袋体22の挿入口22Aを密閉するように構成される。
フィルム部材20は、袋体22が温調部材40に接触したとき、袋体22が温調部材40の形状に沿って変形する柔軟な材料により構成されている。したがって、この反応容器は、温調部材40の温度を効率良く吸収して反応試料の反応を促進させることができる。
この反応容器は、数μl(マイクロリットル)から数ml(ミリリットル)の少量の反応試料を反応させるのに適している。
フィルム部材20としては、目的とする反応を阻害しない、反応温度で変性がない、反応溶液と容器の間で反応をしない等、使用目的に適合した、材質、厚み等、所望の性質を備えているものを適宜選択することができる。
また、溶着で反応容器を形成する場合は、市販の熱シール器でシール可能な溶着温度を備えていることが好ましい。
接着で反応容器を形成する場合は、接着剤が反応に影響しないこと、接着剤が反応時にはがれない、接着剤の硬化に必要な時間が短いなど、要求される物性を確認しておく必要がある。
上蓋部材30としては、例えば断熱材を使用することができる。断熱材は、反応に必要な熱が逃げない材質であれば、市販のものから適宜選択して使用することが可能である。
また、蛍光測定等光学的な測定を行う場合、光透過性を有する断熱材を採用するか、個別の反応室の上部にあたる断熱材を、取り外せる構造や、断熱材の当該部分を切り欠くなどしておく。
温度変化(加熱・冷却)を行う反応は、生体分子の抽出反応、結合反応、増幅反応、定性反応、定量反応などがある。核酸の増幅反応に本柔軟性反応容器を使用する例として、PCR(Polymerase chain reaction)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)、SMAP(SMart Amplification Process)、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)などを例とする。
分注後、フィルム部材20の上部に、フィルム部材20と同じ材質のフィルム部材を載せ、熱をかけて封止部(シール部)31を形成することもできる。
封止部31については、フィルム部材同士の溶着や接着を用いて封止するか、あるいは、反応容器の外側より板状体10の一部を強力に押し付けることで封止してもよい。
反応準備を整えた後、反応容器を温調部材40にセットする。図1では、板状体10の固定具は図示していない。
図1(C)の状態で反応に必要な温調制御を行い、反応を進行させる。
反応終了後、反応生成物を利用する際、すでに反応容器が溶着、接着等により個別に反応系に分かれている場合には、容器を鋭利なチップを付帯した分注器等で破って必要量使用するか、外部圧力等により個別反応系に分割している場合には、封止圧力を順次解除していき、端から順番に反応生成物を分取することもできる。
また、蛍光で反応結果を測定する場合には、断熱材30を取り外すなどするか、断熱材30が邪魔とならぬ角度から測光する。
図2は実施の形態1の反応容器の変形例1を示す図である。
図2に示すように、この反応容器は、図1に示される板状体10の板厚を大きくし、板状体110に置き換えたものである。
袋体22は、挿入口22Aに対向する底部22Bを有し、底部22Bは、板状体110裏面110Bと同一面上に位置し、または、板状体110の表面110Aと裏面110Bとの間に位置している。
変形例1の反応容器のフィルム部材20は、袋体22の内部に収容された反応試料の体積が膨張した際に、反応試料に追従してその容積が膨張する材料により構成されている。
温調部材40は、板状体110の裏面110Bに当接されたとき、裏面110Bにおいて板状体110の開口111を閉塞する。袋体22は反応試料の反応の際、膨張するが、その膨張は、温調部材40、板状体110および断熱材30で囲まれた空間内に抑えられる。このように、個別の反応室を上記のように一定形状にすることで、光学的測定を行う際に、光路長が一定になり、測定精度を向上させることが可能となる。
図3は実施の形態1の反応容器の変形例2を示す図である。
変形例2は、変形例1と同様に反応容器の個別の反応室(袋体)22を一定形状にするものである。
図3に示すように、この反応容器は、図2に示される板状体110の裏面110B側に凹部210Cを設けて板状体210としたものである。この反応容器では、温調部材40が板状体210の裏面210Bに当接されたとき、袋体22の底部22Bが板状体210の裏面210Bを乗り越えて板状体210の凹部210Cに折り込まれる。
この例においても、袋体22は反応試料の反応の際、膨張するが、その膨張は、温調部材40、板状体210および断熱材30で囲まれた空間内に抑えられる。
図4は実施の形態1の反応容器の変形例3を示す図である。
この反応容器は、図1に示される反応容器と同じものであるが、温調部材40により加熱するのではなく、熱風やマイクロ波(電磁波)などを用いて非接触的に加熱する。冷却時には、冷風、空冷等を同様に非接触的に用いる。このようにして、温調を実施する。
本発明の反応容器の更に別の使用形態として、次の実施例1に示す酵素反応以外の反応や混合に使用することが可能である。具体的には、反応容器中で、発熱、吸熱を伴う化学反応を行うことも可能である。
また、反応を伴わない混合のみを行うことも可能である。
図5は実施の形態2の反応容器の構成を示す図である。
図5に示すように、実施の形態2の反応容器は、一端が封止部51により閉塞され、他端が挿入口50Aとされたチューブ50の挿入口50Aからチューブ50内に反応試料301を挿入し、挿入口50A側のチューブ箇所を封止部51により閉じて密閉された反応試料の反応室60が形成される反応容器である。チューブ50は、実施の形態1のフィルム部材20と同様の材料により構成され、反応室60が温調部材(ペルチェ素子71および金属緩衝材72)に接触したとき、反応室60が温調部材71および72の形状に沿って変形し、温調部材に密着する。したがって、この反応容器は、温調部材71および72の温度を効率良く吸収して反応試料の反応を促進させることができる。
<実験>
検証容器材料:
核酸増幅実証試験のための柔軟な耐熱性を有する実施の形態2の反応容器として、以下の2種を選定した。
A)ポリプロピレンシート(厚さ70μm)/東レフィルム加工(株)、トレファン、No.ZK99
B)ポリプロピレンシート(厚さ70μm)/東レフィルム加工(株)、トレファン、No.3951
C)市販品ポリプロピレンチューブ(200μLサイズ)/Applied Biosystems社、MicroAmp Optical tubes
本実施例は、実施の形態2の反応容器として、個別の反応室60を2つ備える形態で実施した。
まず、柔軟性素材のシートによりチューブ50を形成し、下記の核酸増幅反応溶液組成に従って調合された50μLのPCR反応溶液301をチューブ50内へ注入した。次いで50μLのミネラルオイル302を添加し、熱溶着法にてチューブ50の断面を封止した。封止した部位51より続けて、先と同様の操作を行い、反応溶液が封入された柔軟性容器が連続的に連なった構造になるよう形成させ、流路封止チャンバーを仮想した。ここで、流路封止チャンバーは、DNAチップなどマイクロ流路に反応溶液を注入し、必要に応じて、前記流路を適当な位置にて封止し、封止と封止間の空間スペースを反応チャンバー(反応容器)として用いることを意味する。
ヒトゲノムDNA(200ng/μL): 1μL
PRIMER-β3AR-FORWARD(10pmoL/μL): 5μL
PRIMER-β3AR-REVERSE(10pmoL/μL): 5μL
dNTP Mixture(各2.5mM): 5μL
10XBuffer: 5μL
Taq Polymerase(5unit/μL): 1μL
DDW: 28μL
------------------------------------------
TOTAL 50μL/TEST VOLUME
1)95℃、3min
2)95℃、30sec
3)65℃、30sec
4)72℃、30sec
5)2)〜4)を40サイクル
6)72℃、5min
核酸増幅反応の後の反応溶液(3μL)を9%アクリルアミドゲルにて電気泳動し、標的となる核酸鎖の増幅挙動を確認した。なお、電気泳動マーカー(M)には、20ベース・ラダーマーカーを用いた。
図6は実施例1の核酸増幅反応物のゲル電気泳動を示す図である。
図6に示される核酸増幅反応のゲル電気泳動解析の結果より、核酸増幅反応のコントロール(C)と同様に(A)、(B)それぞれの反応容器においても核酸増幅が認められた。
この結果から、本発明の反応容器を使用することで、従来のように温調部材側に反応容器と同一の型をわざわざ設ける必要がないため、温調システム構造の自由度が増すほか、温度にクリティカルな核酸増幅反応が良好に進行していることから、熱伝導性や、試薬混合性においての問題も生じていないものと考えられ、さらには、熱膨張による容器破裂等の問題も認められていない。以上のことから、この柔軟性を有する反応容器は、温調時の密着性や熱伝導性、また、混合性、熱膨張耐久性など多岐に渡り優れていることが明らかとなった。
Claims (9)
- 板状体と、フィルム部材と、上蓋部材と、
前記板状体の表面から裏面に貫通形成された開口とを備え、
前記フィルム部材は、前記板状体の表面に載置される平面部と、前記平面部に接続される袋体とを有し、前記袋体は、前記平面部が前記表面に載置された状態で前記開口の内側に位置し前記平面部に接続される部分を挿入口とし、
前記上蓋部材は、前記平面部上に載置され前記挿入口を密閉するように構成され、
前記フィルム部材は、前記袋体が温調部材に接触したとき、前記袋体が前記温調部材の形状に沿って変形する柔軟な材料により構成されている、
ことを特徴とする反応容器。 - 前記袋体は、前記板状体の裏面に突出していることを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記袋体は、前記挿入口に対向する底部を有し、
前記底部は、前記裏面と同一面上に位置し、または、前記表面と前記裏面との間に位置していることを特徴とする請求項1記載の反応容器。 - 前記開口および前記袋体は、複数設けられていることを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記フィルム部材は、前記袋体の内部に収容された反応試料の体積が膨張した際に、前記反応試料に追従してその容積が膨張する材料により構成されていることを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記温調部材は、前記板状体の裏面に当接され、前記裏面において前記開口を閉塞することを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記フィルム部材は、ポリプロピレン系、塩化ビニル系、シリコン系、テフロン(登録商標)系、ビニル系、合成ゴム系、シリコンゴム系、ポリエチレン系の樹脂から構成されることを特徴とする請求項1記載の反応容器。
- 前記フィルム部材は、前記反応試料の光学的な測定ができるよう光透過性部材により構成されていることを特徴とする請求項1または2記載の反応容器。
- 一端が閉塞され他端が挿入口とされたチューブの前記挿入口から前記チューブ内に反応試料を挿入し、前記挿入口側のチューブ箇所を閉じて密閉された反応試料の反応室が形成される反応容器であって、
前記チューブは、前記反応室が温調部材に接触したとき、前記反応室が前記温調部材の形状に沿って変形する柔軟な材料により構成されている、
ことを特徴とする反応容器。
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