KR20150038543A - 약물 전달 단백질의 수송-증진 돌연변이체의 단리 - Google Patents

약물 전달 단백질의 수송-증진 돌연변이체의 단리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물 전달 단백질의 수송-증진 돌연변이체를 단리시키기 위한 방법에 관한 것이다. 한 가지 구체예에서, 본 발명은 세포 기관에 치료제를 전달하기 위한 담체를 제공하며, 상기 담체는 돌연변이체 펜톤 염기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 침입을 증진시키는 하나 이상의 돌연변이를 가진 펜톤 염기 (PB) 단백질을 포함한 조성물을 투여함으로써 세포로의 수송을 증진시키는 방법을 제공한다.

Description

약물 전달 단백질의 수송-증진 돌연변이체의 단리{ISOLATING TRAFFIC-ENHANCING MUTANTS OF DRUG DELIVERY PROTEIN}
정부 권리
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 수혜 번호 제CA129822호 및 제CA140995호 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 특이적인 세포 기관으로의 약물 전달을 개선시키기 위해 세포 침투 기능을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
발명의 배경
방향 진화는 신규한 향성, 감소된 비-특이적 전달, 및 면역 회피를 지닌 위형 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 발생시키는 데에 이용되었다 (Kwon and Schaffer, 2008; Maheshri et al., 2006). 상이한 선택압(selective pressure)으로 시험관내 및 생체내 전체 바이러스 라이브러리 및 파지 디스플레이의 바이오패닝(biopanning)은 개선된 리간드 결합 및 흡수, 면역 상호작용, 또는 효소 활성과 같은 바람직한 특성을 가진 단백질을 발생시켰다 (Yuan et al., 2005). 따라서, 이 방법론은 개선된 특징을 가진 새로운 단백질 변이체를 형성하기 위해 순이론적 돌연변이에 대한 유력하고 더욱 효과적인 대안일 수 있다. 이 공정에 대해 가장 최근에 개발된 기법은 세포-특이적 표적된 벡터를 선별하기 위해 상이한 세포 유형에 대해 스크리닝될 수 있는 변이체의 라이브러리를 형성하기 위해 오류-유발 PCR 및 시차제 연장을 이용할 수 있다 (Zhao et al., 1998). 지금까지, 개선된 세포간 수송 기능을 가진 단백질 변이체를 단리시키 위한 공정은 아직 개발되지 않았다. 본 발명은 새로운 절차 그리고 절차에 기인한 약물 전달을 위한 개선된 세포 침투 기능을 가진 새로운 단백질 분자를 소개한다.
발명의 요약
여러 가지 구체예는 세포로의 수송을 증진시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 세포 침입을 증진시키는 하나 이상의 돌연변이를 가진 펜톤 염기 (PB) 단백질을 포함한 조성물을 제공하는 단계 및 세포에 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 111C 및/또는 333F이다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 세포질 및/또는 세포핵을 표적한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 추가로 치료 약물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포는 종양 세포이다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7,서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 및/또는 서열 번호: 20이다.
다른 구체예는 세포 기관을 표적하는 약물 전달 분자를 생산하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 펜톤 염기 (PB) 유전자를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 폴리뉴클레오티드의 돌연변이체를 발생시키는 단계, b) 파지 벡터(phage vector) 내로 돌연변이체 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 파지 벡터를 포함한 파지 라이브러리(phage library)를 발생시키는 단계, c) 파지 라이브러리로 세포를 형질변환하는 단계, d) 형질변환된 세포를 분획화하고 형질변환된 세포로부터 세포 기관을 수확하는 단계, e) 수확된 세포 기관으로부터 파지를 증폭시키는 단계, f) 수확된 세포 기관으로부터 증폭된 파지로 세포를 형질전환하는 단계, g) 단계 (d), (e), (f), 및 (g)를 반복하는 단계, h) 각각의 회전에서 수확된 세포 기관으로부터의 파지를 적정하는 단계, i) 가장 높은 역가를 가진 파지를 선별하고 파지로부터 돌연변이체 폴리뉴클레오티드의 서열을 얻는 단계; 및 j) 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 단계, 여기서 폴리펩티드는 세포 기관을 표적하는 약물 전달 분자임. 또 다른 구체예에서, 세포 기관은 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 핵, 리보솜, 원형질 막 및 사이토졸로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 포유류 또는 비-포유류 세포이다. 또 다른 구체예에서, 돌연변이체는 PCR-기반 기법, 화학적 돌연변이 유발, 자외선-유도 돌연변이 유발 또는 이의 조합 중 임의의 하나 또는 그 이상을 이용하여 발생된다. 또 다른 구체예에서, 약물 전달 분자는 표적 도메인, 엔도소몰리틱 리간드 도메인 및 양전하로 하전된 도메인을 포함한다.
다른 구체예는 세포 기관에 치료제를 전달하기 위한 담체를 포함하고, 상기 담체는 세포 침입을 증진시키는 하나 이상의 펜톤 염기 (PB) 돌연변이에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 펜톤 염기 (PB) 돌연변이는 111C 및/또는 333F를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 담체는 폴리리신 모티프를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 담체는 헤레굴린(heregulin)의 표적 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 PB 돌연변이는 C-말단 결실을 포함한다.
다른 구체예는 세포 기관에 치료제를 전달하기 위한 담체 및 치료 약물을 포함하는 치료제를 포함하고, 상기 담체는 세포 침입을 증진시키는 하나 이상의 펜톤 염기 (PB) 돌연변이에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 치료 약물은 화학치료제이다.
여러 가지 다른 구체예는 증식 활성이 없는 담체를 생산하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 헤레굴린 (Her)의 수용체 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이체를 발생시키는 단계, (b) 파지 벡터 내로 돌연변이체 Her 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 파지 벡터를 포함한 파지 라이브러리를 발생시키는 단계, (c) 유사분열 저해제의 존재에서 파지 라이브러리로 MDA-MB-435 세포를 형질전환하는 단계; (d) 형질전환된 세포를 분획화하고 MDA-MB-435 세포의 막 분획을 추출하는 단계, (e) 막 분획으로부터 막 파지를 수확하는 단계, f) 유사분열 저해제의 존재에서 MDA-MB-435 세포 내로 막 파지를 형질전환하는 단계, (g) 단계 (d), (e), 및 (f)를 반복하는 단계, (h) 각각의 회전에서 MDA-MB-435 세포 증식을 모니터링하고 가장 낮은 MDA-MB-435 세포 증식을 가진 막 파지를 선별하는 단계, (i) 선별된 막 파지에서 Her 폴리뉴클레오티드 돌연변이체의 서열을 얻는 단계, 및 (j) Her 서열 및 펜톤 염기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 단계, 여기서 폴리펩티드는 증식 활성이 없는 담체임.
다른 구체예는 핵에 치료제를 전달하기 위한 담체를 포함하고, 상기 담체는 돌연변이체 Her 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 담체는 폴리펩티드 인코딩 펜톤 염기 (PB) 단백질 및 폴리리신 모티프를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, PB 단백질은 돌연변이체 펜톤 염기 단백질이다.
다른 구체예는 담체 및 치료 약물을 포함한 치료제를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 명세서의 구체예에 따라, 바이오패닝 전략을 도시한다.
도 2는 본 명세서의 구체예에 따라, 펜톤 염기 유전자의 PCR-기반 무작위 돌연변이 유발을 도시한다. PCR 산물 (1600bp 밴드 바로 위)은 밀도계측 분석에 기반하여, 100ng DNA를 함유하고, 이는 ~4800ng의 총 수득량을 제공한다. 초기 표적 DNA는 97ng이었기 때문에, ~50의 수득/초기 비 및 ~5.6의 중복수를 가지고, 이는 제조자의 프로토콜 (Genemorph II, Strategene, La Jolla, CA, USA)에서 제공된 표준 곡선에 대해 추론될 때, ~8/kb의 돌연변이율에 상응한다.
도 3은 본 명세서의 구체예에 따라, 핵 구획에서 증진된 분할을 가진 펜톤 염기 변이체를 디스플레이하는 파지의 단리를 도시한다. 돌연변이를 일으킨 PB를 무작위로 디스플레이하는 T7 파지 라이브러리는 세포 결합 및 흡수에 대해 본문에서 설명된 조건에 따라 1x10^8 pfu로 1x10^6 HeLa 세포에 첨가되었다. 임의의 표면-결합 파지를 제거하기 위해 세포는 트립신처리로 수확되었고, 그 다음 상업적 분획화 키트 (Qproteome Cell Compartment Kit; Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 이용하여 분획화되었다. 파지는 표준 절차에 따라 각각의 분획으로부터 하룻밤 동안 PEG-침전되었고, 그 다음 TB 박테리아 배지에서 재현탁되었고 그리고 BLT5403 박테리아에 첨가되어 단리된 파지를 증폭시켰다. 증폭된 파지는 플라크 어세이(plaque assay)로 적정되었고, 그 다음 이전에 설명된 바와 같은 조건 및 동일한 역가를 이용하여 HeLa 상에서 재-패닝되었다. 사이토졸 분획으로부터 얻은 파지는 3 회전의 사이토졸 바이오패닝을 겪은 반면에, 핵 분획으로부터 얻은 파지는 2 회전을 겪었다.
도 4는 본 명세서의 구체예에 따라, 바이오패닝으로부터 단리된 수송 변이체의 정렬을 도시한다.
도 5는 본 명세서의 구체예에 따라, 전장 돌연변이체, 111C가 세포질 및 핵으로의 증진된 수송을 나타낸다는 점을 도시한다. 도 5(A)는 단백질이 아세톤 침전에 의한 각각의 분획으로부터 침전되었고 펠렛(pellet)은 40uL 탈염 완충액에서 재현탁되었고, 그 다음 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통해 분석되었다는 점을 도시한다. 도 5(B)는 Image J를 이용한 밴드 밀도의 분석이 야생형 단백질과 비교하여 사이토졸 및 핵 분획 둘 모두에서 111C의 증가를 나타낸다는 점을 보여준다. 수송 및 세포 분획화 어세이: 플라스크에서 성장하는 부착 HeLa 세포는 50분 동안 교반과 함께 37℃ 배양에서 5mL 1XPBS+2mM EDTA로 분리되었고 15 mL 원뿔형 튜브로 이동되었다. 세포의 밀도가 측정되었고, 그리고 세포는 튜브당 5x106개 세포로 별개의 튜브 내로 분배되었다. 세포는 1X PBS + Ca2+ + Mg2+로 3회 세척되어 EDTA가 제거되고, 그리고 세포 펠렛은 0.7 ml 완충액 A (20mM HEPES, pH 7.4; 2mM MgCl2; DMEM내 3% BSA)에서 재현탁되었다. 야생형 (WT) 또는 돌연변이체 (111C, 333F) 펜톤 염기 단백질 (450 ug)은 별개의 세포 분취량에 첨가되었고 혼합물은 수용체 결합을 촉진시키기 위해 교반과 함께 2시간 동안 4℃에서 배양되었고, 그 다음 수용체-결합 단백질의 내재화를 촉진시키기 위해 교반과 함께 2시간 동안 37℃에서 배양되었다. 대조 처리는 단백질을 받지 않았다 (NP). 이후 세포가 수집되고 Qproteome Cell Compartment 어세이 키트 (Qiagen)를 이용하여 준세포 분획화 (subcellular fractionation)위해 가공처리되었다.
도 6은 본 명세서의 구체예 따라, PB 돌연변이체, 111C 및 333F가 야생형 PB와 비교하여 증진된 핵 침입을 나타낸다는 점을 도시한다. 도 6(A)는 세포간 수송 및 면역세포화학을 도시한다. 절차는 Gene Therapy (2006) 13, 821-836에서 상세설명된 확립 프로토콜을 따랐다. 항-펜톤 염기 항체 (Ad5 항체)는 1:500 희석에서 이용되었다. 알렉사-플루오르 488 염소 항-토끼는 1:400 희석에서 이용되었다 (2차 항체). 팔로이딘은 1:100 희석에서 이용되었고, 그리고 DAPI는 300nM에서 이용되었다. 녹색, 야생형 또는 돌연변이체 (111C, 333F) PB; 적색, 액틴; 청색, 핵. 도 6(B)는 단백질 수송의 정량화를 도시한다. 왼쪽 패널에서 나타난 각각의 처리로부터 16개의 세포가 정량화를 위해 선별되었다. 총수는 Adobe Photoshop에서 각각의 이미지의 히스토그램에 기반하였다. 바(Bar)는 녹색 채널에서 80-255 윈도우 내에서의 녹색 화소 수를 나타낸다.
도 7은 본 명세서의 구체예에 따라, PB 돌연변이체의 업데이트된 정렬을 도시한다. 새로운 펩티드 길이는 돌연변이체 클론의 핵산 서열로부터 번역된 아미노산 서열에 기반한다. 서열은 본 명세서의 도 8-17에서 제공된다.
도 8은 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 111 클론 A (111A)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 9는 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 111 클론 C (111C)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 예상되는 아미노산 서열을 도시한다.
도 10은 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 111 클론 G (111G)로부터 돌연변이된 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 11은 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 331 클론 E (331E)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 12는 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 331 클론 I (331I)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 13은 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 331 클론 J (331J)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 14는 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 333 클론 A (333A)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 15는 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 333 클론 D (333D)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 16은 본 명세서의 구체예에 따라, 분획 333 클론 E (333E)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
도 17은 분획 333, 클론 F, G, 및 H (333F, 333G, 333H)로부터 돌연변이된 PB의 핵산 및 펩티드 서열을 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 약어 "PB"는 펜톤 염기를 의미한다.
병든 세포에 치료학적 유전자 및 약물을 전달하기 위한 여러 가지 시약이 개발되었고, 그리고 상기 시약은 리포좀, 합성 폴리머, 펩티드, 단백질, 바이러스, 및 바이러스 나노입자를 포함한다 (Medina-Kauwe, 2006; Medina-Kauwe et al., 2005). 전형적으로, 이들 시약으로 형성된 입자는 유전자 또는 약물 페이로드(payload)의 전달을 촉진시키기 위해 변형을 필요로 한다. 이러한 변형은 부수적인 표적 리간드 또는 항체, 막 침투제, 및/또는 세포간 표적제 (가령 핵 표적제)를 포함한다. 이들 변형은 주로 순이론적 설계를 통해 도입되고 따라서 이러한 변형에 의해 발생되는 각각의 새로운 변이체는 실증 검사를 필요로 한다. 이것은 시간 소모적 및 노동 집약적일 수 있고, 그리고 차선적인 작업을 초래할 위험이 있다.
세포막 침투 및/또는 세포간 수송을 개선하기 위한 과거 및 현재 시도는 세포 침투 또는 세포간 표적 펩티드를 약물 담체에 접합하기 위해 순이론적 설계를 이용하였다. 이러한 기법은 각각의 분자의 실증 검사를 필요로 한다. 수많은 유형의 세포 침투 펩티드는 증진된 유전자 및 약물 전달을 위해 검사되었고, 그리고 AntP, TAT, GALA, 꿀벌 멜리틴, 및 유사한 펩티트를 포함한다 (Medina-Kauwe, 2006; Medina-Kauwe et al., 2005). 유사하게, 핵 표적 활성은 상이한 폴리-염기 도메인의 부속물, 가령 SV40 NLS, HMG-1, 프로타민, 및 유사한 펩티드 또는 단백질을 통해 유전자 전달제에 첨가되었다 (Medina-Kauwe, 2006; Medina-Kauwe et al., 2005). 이들 펩티드 각각이 세포막을 침투하고 핵을 비롯한, 세포간 구획을 표적하는 능력을 보유하지만, 또 다른 분자에 공유결합으로 커플링되거나 또 다른 분자에 대해 융합 단백질로서 발현될 때 그들의 활성은 변경된다. 더욱이, 이들 펩티드의 상이한 변이체 각각의 실증 검사는 시간 소모적 및 노동 집약적이다. 따라서, 순이론적 설계 및 실증 검사는 이 문제에 대한 기존 해결책이지만, 이 기법은 이의 제한을 갖는다.
본 명세서에서 설명된 발명은 개선된 세포 침투, 세포간 수송, 및/또는 준세포 표적을 획득하였던 단백질 돌연변이체를 단리시키기 위해 선택압을 이용함으로써 세포 침투/세포간 수송 단백질/펩티드의 순이론적 설계 및 실증 검사에 요구되는 시간과 노력을 회피한다. 이 공정으로부터 파생된 단백질 돌연변이체는 인공 진화/선택압을 통해 획득한 개선된 특징으로 인해 현재 사용중인 기존 유전자/약물 전달 단백질 또는 모 단백질보다 독특한 이점을 갖는다. 최종적으로, 아래 설명되는 공정에 의해 단리된 특이적 단백질은 그들의 개선된 막 용해 및 수송 특징으로 인해 기존 세포 침투 펩티드보다 이점을 더 제공할 것이다. 그러므로, 그들은 유전자 및 약물 전달을 증대시키는 데에 이용될 수 있고, 따라서 나노 의학에서 이용되는 입자의 치료학적 효능을 증진시킨다.
본 발명은 세포 기관을 표적하는 약물 전달 분자를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 펜톤 염기 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 폴리뉴클레오티드의 돌연변이체를 발생시키는 단계; (b) 파지 벡터 내로 돌연변이체 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 파지 벡터를 포함한 파지 라이브러리를 발생시키는 단계; (c) 파지 라이브러리로 세포를 형질변환하는 단계; (d) 형질변환된 세포를 분획화하고 형질변환된 세포로부터 세포 기관을 수확하는 단계; (e) 수확된 세포 기관으로부터 파지를 증폭시키는 단계; (f) 수확된 세포 기관으로부터 증폭된 파지로 세포를 형질전환하는 단계; (g) 단계 (d), (e), (f), 및 (g)를 반복하는 단계; (h) 각각의 회전에서 수확된 세포 기관으로부터의 파지를 적정하는 단계; (i) 가장 높은 역가를 가진 파지를 선별하고 파지로부터 돌연변이체 폴리뉴클레오티드의 서열을 얻는 단계; 및 (j) 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 단계, 여기서 폴리펩티드는 세포 기관을 표적하는 약물 전달 분자임.
몇몇 구체예에서, 세포 기관은 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 핵, 리보솜, 원형질 막 및 사이토졸로 구성된 군에서 선택된다. 세포는 포유류 또는 비-포유류 세포일 수 있다. 돌연변이체는 임의의 무작위 돌연변이 유발 방법 또는 표적된 돌연변이 유발 방법을 이용하여 발생될 수 있다. 돌연변이체를 발생시키는 데에 이용될 수 있는 방법의 예시는 PCR-기반 기법, 화학적 돌연변이 유발, 자외선-유도 돌연변이 유발 또는 이의 조합 중 임의의 하나 또는 그 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 펜톤 염기 유전자내 돌연변이는 삽입, 결실, 치환 또는 이의 조합 중 임의의 하나 또는 그 이상일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 약물 전달 분자는 표적 도메인, 엔도소몰리틱 리간드 도메인 및 양전하로 하전된 도메인을 포함한다.
본 발명은 세포 기관에 치료제를 전달하기 위한 담체를 또한 제공하며, 상기 담체는 돌연변이체 펜톤 염기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 펜톤 염기 유전자내 돌연변이는 다음 단계에 의해 단리될 수 있다: (a) 펜톤 염기 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 폴리뉴클레오티드의 돌연변이체를 발생시키는 단계; (b) 파지 벡터 내로 돌연변이체 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 파지 벡터를 포함한 파지 라이브러리를 발생시키는 단계; (c) 파지 라이브러리로 세포를 형질변환하는 단계; (d) 형질변환된 세포를 분획화하고 형질변환된 세포로부터 세포 기관을 수확하는 단계; (e) 수확된 세포 기관으로부터 파지를 증폭시키는 단계; (f) 수확된 세포 기관으로부터 증폭된 파지로 세포를 형질전환하는 단계; (g) 단계 (d), (e), (f), 및 (g)를 반복하는 단계; (h) 각각의 회전에서 수확된 세포 기관으로부터의 파지를 적정하는 단계; (i) 가장 높은 역가를 가진 파지를 선별하고 파지로부터 돌연변이체 폴리뉴클레오티드의 서열을 얻는 단계; 및 (j) 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 단계, 여기서 폴리펩티드는 세포 기관을 표적하는 약물 전달 분자임. 담체는 폴리리신 모티프 및 표적 도메인, 예를 들어 헤레굴린의 표적 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명은 상기 설명된 담체 및 치료 약물을 포함한 치료제를 추가로 제공한다. 치료 약물은 예를 들어, 질병을 치료하고, 저해하고, 예방하고, 질병의 영향을 완화시키고, 질병의 중증도를 감소시키고, 질병의 발달 가능성을 감소시키고, 질병의 진행을 늦추고 및/또는 질병을 치유하는 임의의 약물일 수 있다. 치료제에 의해 표적되는 질병은 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식세포종, 아세포종, 여러 가지 면역 세포 상에서 발현되는 항원, 및 여러 가지 혈액학적 질병과 연관된 세포 상에서 발현되는 항원, 자가면역 질환, 및/또는 염증 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치료제는 화학치료제일 수 있다.
본 발명은 증식 활성이 없는 담체를 생산하는 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 헤레굴린 (Her)의 수용체 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이체를 발생시키는 단계; (b) 파지 벡터 내로 돌연변이체 Her 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 파지 벡터를 포함한 파지 라이브러리를 발생시키는 단계; (c) 유사분열 저해제 (예를 들어 택솔(taxol))의 존재에서 파지 라이브러리로 MDA-MB-435 세포를 형질전환하는 단계; (d) 형질전환된 세포를 분획화하고 MDA-MB-435 세포의 막 분획을 추출하는 단계; (e) 막 분획으로부터 막 파지를 수확하는 단계; (f) 유사분열 저해제의 존재에서 MDA-MB-435 세포 내로 막 파지를 형질전환하는 단계; (g) 단계 (d), (e), 및 (f)를 반복하는 단계; (h) 각각의 회전에서 MDA-MB-435 세포 증식을 모니터링하고 가장 낮은 MDA-MB-435 세포 증식을 가진 막 파지를 선별하는 단계; (i) 선별된 막 파지에서 Her 폴리뉴클레오티드 돌연변이체의 서열을 얻는 단계; 및 (j) Her 서열 및 펜톤 염기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 단계, 여기서 폴리펩티드는 증식 활성이 없는 담체임. Her 유전자내 돌연변이는 삽입, 결실, 치환 또는 이의 조합 중 임의의 하나 또는 그 이상일 수 있다.
본 발명은 핵에 치료제를 전달하기 위한 담체를 추가로 제공하고, 상기 담체는 돌연변이체 Her 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 돌연변이체 Her은 상기 설명된 방법에 따라 얻어진다. 담체는 폴리펩티드 인코딩 펜톤 염기 단백질 및 폴리리신 모티프를 추가로 포함한다. 펜톤 염기 단백질은 돌연변이체 단백질일 수 있다.
실시예
실시예 1
수송-증진 돌연변이체의 단리.
이전에, 시험관 내 및 생체 내에서 종양 세포에 여러 가지의 치료학적 분자를 표적하고 전달하기 위한 재조합 아데노바이러스 펜톤 염기 단백질이 개발되었다 (Agadjanian et al., 2012; Agadjanian et al., 2009; Agadjanian et al., 2006; Medina-Kauwe et al., 2001a; Medina-Kauwe et al., 2001b; Rentsendorj et al., 2008). 현재, 펜톤 염기 재조합 단백질 (HER2+ 종양 세포에 치료제를 표적하는 데에 이용되는 HerPBK10의 'PB' 도메인을 포함하는 동일한 것; (Agadjanian et al., 2012; Agadjanian et al., 2009; Agadjanian et al., 2006; Medina-Kauwe et al., 2001b; Rentsendorj et al., 2008)은 세포 결합 후 다수의 세포 침입 경로를 통해 진행되고, 하지만 이의 모두가 아닌 몇 가지만 사이토졸 내로의 막 침투 및 침입을 지원한다 (Rentsendorj et al., 2006). 이 기능을 개선하고 세포 표적 내로 치료제의 전달과 침투를 증진시키기 위하여, 판독으로서 핵 축적을 이용함으로써 증진된 세포 침투 활성을 가진 펜톤 염기 변이체를 단리시키는 데에 방향 진화 기법을 이용하였는데, 그 이유는 엔도좀 탈출(endosomal escape)이 핵 내로 침입할 수 있기 때문이다 (Rentsendorj et al., 2006).
절차: 이 두-단계 공정은 다음을 수반한다: 1. 무작위 돌연변이 유발을 통한 돌연변이체 라이브러리의 형성, 및 2. 스크리닝 공정에 따라, 개선된 기능을 가진 변이체를 단리시키기 위한 선택압의 도입. 여기서, 사이토졸 및/또는 핵 내로의 침입을 견뎌낸 파지의 단리는 선택압의 역할을 할 것이고, 이는 증진된 세포 침투 활성을 가진 변이체를 얻을 것으로 예상된다 (도 1에서 요약됨). 이에 따라, 발명자는 펜톤 염기 유전자에 무작위로 돌연변이를 일으키고 K. T7 파지 벡터에 클로닝된 돌연변이체의 라이브러리를 만들었다. 이전에 확립된 방향 진화 연구 (Cherry et al., 1999; Shafikhani et al., 1997; Wan et al., 1998; You and Arnold, 1996)에 기반하여, 발명자는 유전자마다 1-4개의 아미노산 변화 (또는 2-7개의 뉴클레오티드 변화)의 돌연변이 빈도를 목표로 하였다. 특수화된 오류-유발 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법 (GeneMorphII Random Mutagenesis Kit; Stratagene, La Jolla, CA, USA)을 이용한 산물 수율에 기반하여, 발명자는 펜톤 염기마다 ~8개 뉴클레오티드/kb 또는 13.6개 뉴클레오티드의 확립된 돌연변이 빈도를 획득하였다 (도 2). 발명자는 T7-Select 파지 벡터 내로 이 산물을 삽입하였고 그리고 재조합 파지를 포장하여 5x1010 pfu/mL의 증폭된 라이브러리 역가를 초래하였다.
라이브러리를 HeLa 세포 상에서 패닝하였다 (상기 세포는 PB 단백질의 결합 및 흡수를 위해 인터그린 수용체를 발현함). 파지를 1시간 동안 4 ℃에서 세포 상에 배양하여 수용체 결합을 촉진시켰지만 흡수는 촉진시키지 않았고, 그 다음 세포를 세척하고 37℃에서 2시간 동안 배양하여 내재화를 촉진시켰다. 흡수 후, 수확된 세포를 분획화하여 사이토졸 분획 및 핵 분획을 단리시켰다. 이후 각각의 분획으로부터 증폭된 파지를 반복하여 바이오패닝하였고, 그리고 상응하는 일련의 분획을 세포 수확물로부터 추출하였다 (즉, 회전 1에서 단리된 핵 파지를 증폭시키고 세포에 다시 첨가하고, 그 다음 핵 파지를 다시 얻기 위해 핵 분획의 단리를 반복하였음). 2 또는 3 회전의 바이오패닝 후, 야생형 펜톤 염기를 디스플레이하는 파지와 비교하여 돌연변이를 일으킨 라이브러리로부터 핵/사이토졸 파지의 상대적인 강화를 결정하기 위해 각각의 반복 분획으로부터 단리된 파지를 적정하였다.
결과 : 비-돌연변이된 모 파지, T7-PB는 1 미만의 핵/사이토졸 파지 역가비를 산출하였고, 이는 2시간까지 핵에 도달하는 파지의 비율은 세포질에 남아있는 파지의 비율보다 더 적었다는 점을 나타낸다 (도 3). 대조적으로, 2 회전의 바이오패닝 및 핵 파지 (3-3a)의 단리 후, T7-PB와 비교하여 유의적인 증가와 함께, 세포질 보유와 비교하여 더 높은 핵 축적 쪽으로의 이동(shift)이 관찰되었다 (P=0.05) (도 3). 심지어 3 회전의 사이토졸 분획 패닝 (1-1-1)으로부터 단리된 파지도 T7-PB와 비교하여 핵 구획에서, 비록 매우 유의적인 것은 아니지만, 상대적인 증가를 나타내었다 (P=0.07) (도 3).
3 회전의 바이오패닝 및 사이토졸 및 핵 돌연변이체의 단리 후, 발명자는 각각의 강화된 모집단에서 무작위로 고른 클론을 차례로 배열하였고 사이토졸 및 핵 분획 둘 모두로부터 단리된 다수의 클론이 카르복시- [C-] 말단 절단 단백질을 인코딩하였다는 점을 밝혀내었다 (도 4). 야생형 펜톤 염기 (wt PB) 선형 서열의 중앙 근처에 위치한 287LDV 및 340RGD 인테그린 결합 모티프는 대부분의 절단된 클론에서 보유되지 않았다. 절단된 돌연변이체 중 하나는 LDV를 함유하지만 RGD 모티프는 함유하지 않았고, 반면에 남아있는 절단은 LDV 및 RGD 모티프가 둘 다 결핍되었다. 바이오패닝으로부터 단리된 전장 클론은 LDV 및 RGD 모티프 둘 모두를 보유하지만, 또한 잠재적인 기능 - 아미노산 변화 변경을 도입하는 여러 가지 점 돌연변이도 함유한다 (도 4). 이들 중에는 사이토졸 분획 클론 111C내 Leu60Trp 대체; 및 핵 분획 클론 333F내 Lys375Glu, Val449Met, 및 Pro469Ser 아미노산 변화가 있다. 증진된 사이토졸 및/또는 핵 침투를 부여하는 각각의 단리된 변이체의 능력을 검사하기 위하여, 각각의 세포간 수송을 면역형광 및 공초점 현미경으로 모 단백질과 비교하고, 준세포 분획화로 확인할 것이다. 구체적으로, 전장 돌연변이체 (111C 및 333F) 그리고 돌연변이체 331J는 인테그린 결합 모티프를 보유하기 때문에, 이들 변이체를 wt PB와 비교하여 검사하였는데, 그 이유는 그들이 인테그린 결합 및 흡수를 통해 세포로 들어가는 것으로 예측되기 때문이다. 한편, 남아있는 절단 변이체는 임의의 수용체-결합 모티프가 결핍되어있기 때문에, 이들을 HerPBK10 내로 삽입하여 PB 도메인을 대체하고, 그리고 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER) 결합 및 흡수를 통해 세포로 들어가는 모 HerPBK10과 비교하여 검사할 것이다.
실시예 2
약화된 신호전달을 이용한 수용체-결합 및 세포내 섭취(endocytosis) 돌연변이체의 단리
이론적 설명 : 종양-표적 세포 침투 단백질, HerPBK10은 여기서 HerPBK10의 'HER' 도메인으로서 명시된, 헤레굴린의 수용체 결합 도메인의 포함을 통해 특이적으로 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER)를 표적으로 한다 (Medina-Kauwe et al., 2001b). 하지만, 헤레굴린 수용체의 결찰은 수용체 이형이합체 비, 리간드 하위유형, 세포 유형, 및 특정한 세포간 분자의 존재를 비롯한 여러 가지 인자에 따라, 종양 세포 증식, 분화, 그리고 몇몇 경우에는 아폽토시스를 야기할 수 있는 신호전달을 유도할 수 있다 (Aguilar et al., 1999; Lewis et al., 1996; Weinstein et al., 1998). 종양 진행과 같은 부작용을 유도할 가능성은 유사분열 저해제에 의해 도입된 선택압이 증식 신호전달이 결핍된 수용체 결합 및 세포내 섭취 돌연변이체를 선별할 수 있는지 없는지에 대한 검사로 이어진다. 발명자는 Her 변이체를 디스플레이하는 파지 라이브러리를 발생시킴으로써 이 기법을 검사하는 것을 제안하였고, 그리고 휴지기 세포로부터 내재화 파지를 단리시키고, 비-증식성 인간 유방암 세포 상에서 재-패닝함으로써 증식 신호전달이 결핍된 Her 종을 내재화하기 위한 라이브러리를 스크리닝한다.
절차 : 코딩 서열에 걸쳐 분포된 상이한 돌연변이를 함유한 Her 서열의 라이브러리는 오류-유발 PCR 및 시차제 연장으로 생성할 수 있고, 이는 주형 서열의 초기 프라이밍(priming) 후 반복된 주기의 변성 및 간단한 어닐링(annealing)/연장을 수반한다 (Zhao et al., 1998). T7Select 박테리오파지 (전제 단백질을 디스플레이하도록 개발됨), 및 제조자의 지시에 따라 생성된 재조합 파지 내로 이동시키기 위한 적절한 벡터 암(vector arm) 내로 결과적 라이브러리를 삽입할 것이다 (Novagen, Gibbstown, NJ, USA). 진화형 AAV 캡시드의 바이오패닝에 기반하여, 10^12 파지의 초기 역가를 택솔과 같은 유사분열 저해제를 함유한 배지에서 유지된 MDA-MB-435 세포에 첨가할 것이고, 그리고 약 30-45분 후 (결합과 내재화를 위해 요구되는 시간; Medina-Kauwe et al., 2000)에, 트립신/EDTA로 세포를 수확하고 (비-내재화된 파지를 제거하기 위함) 그리고 미가공 바이러스의 소포 분획을 단리시키기 위해 막-추출할 것이며 (Qproteome Plasma Membrane Protein Kit, Qiagen Inc., Valencia, CA, USA), 이는 CsCl 밴딩(banding)으로 단리시킬 수 있다. 3 내지 4 회전의 선별 (즉 신선한 세포에 단리된 바이러스를 첨가 그리고 막 추출을 반복)을 수행할 것이고 단리된 바이러스를 다음 방식으로 특징화할 것이다. 첫 번째로, 항-파지 항체 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 면역형광법을 위해 강화된 바이러스를 받는 신선한 세포를 고정하고 가공처리하여 단리된 파지가 여전히 내재화되는지 확인할 것이다. 동시에 처리된 별개의 세포를 대사 어세이로, 모의 및 처리되지 않은 세포와 비교하여 증식에 대해 평가할 것이다. 두 번째로, 단리된 파지로부터 Her 서열을 잘라 내고 재조합 단백질 생산을 위한 박테리아 발현 벡터 내로 삽입할 것이고 (Medina-Kauwe et al., 2001a), 그 다음 돌연변이체 Her를 모 Her 그리고 모의 및 처리되지 않은 세포와 비교하여, 앞서 설명된 바와 같은 MDA-MB-435 인간 유방암 세포에서 내재화 및 증식 활성에 대해 검사하였다. 돌연변이체 클론을 차례로 배열하여 돌연변이된 영역을 식별하고, 그리고 HerPBK10 발현 카세트(cassette) 내로 다시 삽입할 것이고, 이는 모 'Her'을 대신한다.
상기 설명된 다양한 방법 및 기술은 본 출원을 수행하기 위한 다수의 방식을 제공한다. 물론, 설명된 모든 목적 또는 이점이 반드시 본 명세서에서 설명된 임의의 특정한 구체예에 따라 성취될 수 있어야 하는 것은 아니라는 점이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 교시된 또는 제시된 바와 같은 다른 목적 또는 이점을 반드시 성취할 필요 없이 본 명세서에서 교시된 바와 같은 하나의 이점 또는 이점들을 성취하거나 최적화하는 방식으로 수행될 수 있다는 점을 인지할 것이다. 여러 가지 대안이 본 명세서에서 언급된다. 몇 가지 바람직한 구체예는 구체적으로 하나, 또 다른, 또는 여러 가지 특징을 포함하는 반면, 다른 것들은 하나, 또 다른, 또는 여러 가지 특징을 배제하고, 하지만 여전히 다른 것들은 하나, 또 다른, 또는 여러 가지 이로운 특징의 포함으로 특정한 특징을 경감시킨다는 점이 이해되어야 한다.
추가적으로, 기술자는 상이한 구체예로부터의 여러 가지 특징의 적용 가능성을 인지할 것이다. 유사하게, 상기 논의된 여러 가지 요소, 특징 및 단계, 그리고 각각의 이러한 요소, 특징, 또는 단계에 대한 공지된 다른 등가물은 본 명세서에서 설명된 원리에 따라 방법을 수행하기 위해 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 여러 가지 요소, 특징, 및 단계 중에서 몇 가지는 다양한 구체예에 구체적으로 포함되고 다른 것들은 구체적으로 배제될 것이다.
본 출원은 특정한 구체예와 실시예의 문맥에서 개시되었지만, 본 출원의 구체예가 구체적으로 개시된 구체예를 넘어 다른 대안적인 구체예 및/또는 이의 용도 및 변형 그리고 등가물로 연장된다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
몇몇 구체예에서, 본 출원의 특정한 구체예를 설명하는 문맥에서 (특히 다음 청구범위의 특정 문맥에에서) 사용된 용어 "a"와 "an" 및 "the" 그리고 유사한 지시어는 단수형 및 복수형 둘 모두를 아우르는 것으로 해석될 수 있다. 본 명세서에서 값의 범위의 열거는 단지, 범위 내에 속하는 각각의 별개 값에 대해 개별적으로 나타내는 약기법으로서 역할하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 이것이 본 명세서에서 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서 내로 편입된다. 본 명세서에서 설명된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 반대되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서의 특정한 구체예에 관한 것이라면, 임의의 및 모든 예시, 또는 예시적인 언어 (예를 들면, "가령")의 사용은 단지, 본 출원을 더 분명히 하기 위한 것으로 의도되고 그리고 청구되지 않는 한 본 출원의 범위에 제한을 두지 않는다. 본 명세서내 어떠한 언어도 본 출원의 실시에 있어서 필수적인 임의의 비-청구 요소를 명시하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본 출원을 수행하기 위해 발명자에게 공지된 최적의 방식을 비롯하여, 본 출원의 바람직한 구체예가 본 명세서에서 설명된다. 이들 바람직한 구체예에 대한 변형은 전술한 설명을 독해시 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이다. 기술자가 이러한 변형을 적절하게 이용할 수 있고, 그리고 본 출원이 본 명세서에서 구체적으로 설명된 것과는 다르게 실시될 수 있다는 점이 고려된다. 이에 따라, 본 출원의 많은 구체예는 준거법에 의해 허용된 바와 같이 여기에 첨부된 청구범위에서 열거된 내용의 모든 변형과 등가물을 포함한다. 더욱이, 상기-설명된 요소의 임의의 조합은 이의 가능한 모든 변형에서, 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 반대되지 않는 한 본 출원으로 포함된다.
본 명세서에서 참조된 모든 특허, 특허 출원, 특허 출원의 공개공보, 및 다른 자료, 가령 논문, 책, 명세서, 간행물, 문헌, 문서 등은 모든 목적을 위해 그들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입되는데, 상기한 것, 본 문헌과 모순되거나 불일치되는 상기한 것 중 어느 하나, 또는 본 문헌과 연관된 현재 또는 그 이후의 광범위한 청구범위에 관해 제한적인 영향을 가질 수 있는 상기한 것 중 어느 하나와 연관된 임의의 심사과정 서류는 제외한다. 예로서, 편입된 내용 중 어느 하나와 연관된 용어의 설명, 정의, 및/또는 사용 그리고 본 문헌과 연관된 것 사이의 어떠한 불일치 또는 상충이 있다면, 본 문헌내 용어의 설명, 정의 및/또는 사용이 지배적일 것이다.
마지막으로, 본 명세서에서 개시된 본 출원의 구체예는 본 출원의 구체예의 원리의 예증이 되는 것으로 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 출원의 범위 내에 있을 수 있다. 따라서, 제한적인 것은 아닌, 예로서, 본 출원의 구체예의 대안적인 구성은 본 명세서에서의 교시에 따라 활용될 수 있다. 이에 따라, 본 출원의 구체예는 이전에 보여지고 설명된 바와 같은 것에 제한되지 않는다.

Claims (24)

  1. 세포로 수송을 증진시키는 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
    세포 침입을 증진시키는 하나 이상의 돌연변이를 가진 펜톤 염기 (PB) 단백질을 포함한 조성물을 제공하는 단계; 및
    세포에 유효량의 조성물을 투여하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 111C 및/또는 333F인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 조성물은 세포질 및/또는 세포핵을 표적하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조성물은 치료 약물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 세포는 종양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7,서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 및/또는 서열 번호: 20인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 세포 기관을 표적하는 약물 전달 분자를 생산하기 위한 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    a. 펜톤 염기 (PB) 유전자를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 폴리뉴클레오티드의 돌연변이체를 발생시키는 단계;
    b. 파지 벡터(phage vector) 내로 돌연변이체 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 파지 벡터를 포함한 파지 라이브러리(phage library)를 발생시키는 단계;
    c. 파지 라이브러리로 세포를 형질변환하는 단계;
    d. 형질변환된 세포를 분획화하고 형질변환된 세포로부터 세포 기관을 수확하는 단계;
    e. 수확된 세포 기관으로부터 파지를 증폭시키는 단계;
    f. 수확된 세포 기관으로부터 증폭된 파지로 세포를 형질전환하는 단계;
    g. 단계 (d), (e), (f), 및 (g)를 반복하는 단계;
    h. 각각의 회전에서 수확된 세포 기관으로부터의 파지를 적정하는 단계;
    i. 가장 높은 역가를 가진 파지를 선별하고 파지로부터 돌연변이체 폴리뉴클레오티드의 서열을 얻는 단계; 및
    j. 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 단계,
    여기서 폴리펩티드는 세포 기관을 표적하는 약물 전달 분자임.
  8. 제7항에 있어서, 세포 기관은 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 핵, 리보솜, 원형질 막 및 사이토졸로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 세포는 포유류 또는 비포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 돌연변이체는 PCR-기반 기법, 화학적 돌연변이 유발, 자외선-유도 돌연변이 유발 또는 이의 조합 중 임의의 하나 또는 그 이상을 이용하여 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 약물 전달 분자는 표적 도메인, 엔도소몰리틱(endosomolytic) 리간드 도메인 및 양전하로 하전된 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 세포 기관에 치료제를 전달하기 위한 담체에 있어서, 세포 침입을 증진시키는 하나 이상의 펜톤 염기 (PB) 돌연변이에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 담체.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 펜톤 염기 (PB) 돌연변이는 111C 및/또는 333F를 포함하는 것을 특징으로 하는 담체.
  14. 제12항에 있어서, 폴리리신 모티프를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 담체.
  15. 제12항에 있어서, 헤레굴린(heregulin)의 표적 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 담체.
  16. 제12항에 있어서, 하나 이상의 PB 돌연변이는 C-말단 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 담체.
  17. 제12항의 담체와 치료 약물을 포함한, 치료제.
  18. 제17항에 있어서, 치료 약물은 화학치료제인 것을 특징으로 하는 치료제.
  19. 증식 활성이 없는 담체를 생산하는 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 헤레굴린 (Her)의 수용체 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 폴리뉴클레오티드에서 돌연변이체를 발생시키는 단계;
    (b) 파지 벡터 내로 돌연변이체 Her 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 파지 벡터를 포함한 파지 라이브러리를 발생시키는 단계;
    (c) 유사분열 저해제의 존재에서 파지 라이브러리로 MDA-MB-435 세포를 형질전환하는 단계;
    (d) 형질전환된 세포를 분획화하고 MDA-MB-435 세포의 막 분획을 추출하는 단계;
    (e) 막 분획으로부터 막 파지를 수확하는 단계;
    (f) 유사분열 저해제의 존재에서 MDA-MB-435 세포 내로 막 파지를 형질전환하는 단계;
    (g) 단계 (d), (e), 및 (f)를 반복하는 단계;
    (h) 각각의 회전에서 MDA-MB-435 세포 증식을 모니터링하고 가장 낮은 MDA-MB-435 세포 증식을 가진 막 파지를 선별하는 단계;
    (i) 선별된 막 파지에서 Her 폴리뉴클레오티드 돌연변이체의 서열을 얻는 단계; 및
    (j) Her 서열 및 펜톤 염기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생산하는 단계, 여기서 폴리펩티드는 증식 활성이 없는 담체임.
  20. 핵에 치료제를 전달하기 위한 담체에 있어서, 제19항의 돌연변이체 Her 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 담체.
  21. 제20항에 있어서, 폴리펩티드 인코딩 펜톤 염기 (PB) 단백질 및 폴리리신 모티프를 추가로 포함하는 담체.
  22. 제20항에 있어서, PB 단백질은 돌연변이체 펜톤 염기 단백질인 것을 특징으로 하는 담체.
  23. 제19항의 담체와 치료 약물을 포함한, 치료제.
  24. 제23항에 있어서, 치료 약물은 화학치료제인 것을 특징으로 하는 치료제.

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