CN116322649A - 用于治疗癌症的cd47结合剂和脂质体复合体 - Google Patents

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Abstract

公开了一种结合癌细胞中过表达的CD47并且其中对CD47具有改善的结合强度的结合剂，以及一种脂质体复合体。本发明提供了结合癌细胞中过表达的CD47并且包括由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的结合剂，以及其中结合剂缀合至脂质体的结合剂缀合的脂质体复合体。

Description

用于治疗癌症的CD47结合剂和脂质体复合体
技术领域
本发明涉及CD47结合剂和脂质体复合体，更具体地涉及结合癌细胞中过表达的CD47的结合剂和脂质体复合体。
背景技术
在正常哺乳动物生物化学中的其他地方使用癌细胞滥用信号(abuse signals)，以防止免疫细胞破坏其他细胞，如CD47。干扰这些“不吃我(don'teat me)”信号在可以靶向多种类型癌症的有效癌症疗法的发展中产生了显著增益。
通常，称为巨噬细胞的免疫细胞检测癌细胞，然后吞噬并消灭它们。近年来，研究人员发现，细胞表面上的蛋白质能够发送信号到巨噬细胞而不吃或不破坏它们。这些信号对于帮助正常细胞防止免疫系统攻击是有用的，但是癌细胞也使用这些“不吃我”信号来躲避免疫系统。研究人员先前示出，癌细胞使用主要组织相容性类别1复合体的蛋白质PD-L1和β-2-微球蛋白质亚基来保护它们自身免受免疫细胞的影响。阻断CD47的抗体目前处于临床试验中并且靶向PD-L1或PDL1受体的癌症治疗目前被用于患者的治疗。
本研究示出，与正常细胞和周围组织相比，许多癌症产生大量的CD47。在最近的研究中，科学家示出浸润肿瘤的巨噬细胞可以通过称为Sirpα的受体感测CD47信号。他们还示出，当来自患者的癌细胞与培养皿中的巨噬细胞混合并且CD47与Sirpα之间的相互作用被阻断时，巨噬细胞将开始吞噬癌细胞。最后，它们将人乳腺癌细胞植入小鼠中。当CD47信号传导被阻断时，小鼠的免疫系统的巨噬细胞攻击癌症。特别值得注意的是发现血癌和三阴性乳腺癌受到CD47信号传导的阻断的显著影响。
[现有技术文献]
-韩国专利申请公开号2006-0121150(2006年11月28日)
发明内容
技术问题
本发明的一个方面提供了结合剂以及脂质体复合体，该结合剂结合癌细胞中过表达的CD47并且对CD47具有改善的结合亲和力。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供了一种结合剂，该结合剂结合癌细胞中过表达的CD47并且包括由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
此外，本发明提供了结合剂，其特征在于该结合剂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰基乙醇胺(DSPE)缀合的结合剂。
此外，本发明提供了结合剂，其特征在于癌症是结肠直肠癌或乳腺癌。
为了解决另一上述问题，本发明提供结合剂缀合的脂质体复合体，其中，结合剂缀合至脂质体。
此外，本发明提供了结合剂缀合的脂质体复合体，其中，使用选自由以下各项组成的组的至少一种材料使脂质体带正电荷：阳离子磷脂、DOTAP和胆固醇。
此外，本发明提供了结合剂缀合的脂质体复合体，其中，脂质体是PEG化的脂质体。
有益效果
根据本发明的结合剂和脂质体复合体对CD47具有改善的结合亲和力；因此，它们可以有效地用作用于治疗高表达CD47的癌症(例如三阴性乳腺癌)的抗癌剂的结合剂和脂质体复合体。
附图说明
图1是示出了Sirpα、SV1和SV4的氨基酸序列的比较的图。粗体字母表示非部分保守的残基。用ClustalW进行序列比对，并使用BioEdit序列比对编辑程序生成图像。
图2是示出了正确定向的SV1的突变的图。在图2A中，SV结构域(实心框)与CD47(虚线框)结构域复合，并且在图2A的模型中，SV结构域(实心框)示出影响正确定向的赖氨酸残基，并且示出通过选择不阻碍正确结合到CD47上的残基而突变的SV4(下划线)。图2B示出使用SV1和SV4的质谱分析突变后的简化DSPE-缀合(复合，结合，conjugation)的分析结果。
图3是示出了T001和人NT5M的保守基序的图。作为T001和人NT5M的序列比对，使用ClustalW比对这些序列，以确认人NT5M和T001的序列相似性。在比对中使用的序列的Swiss-Prot/TrEMBL登录号是人NT5M和T001。白色字段表示完全保守的氨基酸残基，而加框字段表示具有相似生物化学功能的部分保守的氨基酸残基。用ClustalW进行序列比对，并用ESPript服务器生成图像。
图4是示出了T001和NT5M的结构的比较的模型。胞质T001(CT)和dTMP结合的人NT5M显示为叠合，并且大部分链在结构上非常相似，但结合环区不存在于NT5M中，而仅存在于CT中。
图5是示出了用于T001的最佳表达的UTR筛选的候选结构的示意图。
图6是示出了用于T001的最佳表达的UTR筛选中的FACS分析的结果的图像和图表。分析条件如下：GFP荧光，HCT-116，6孔(5×105个细胞/孔)，24h mRNA转染，10％FBS，以及2mM Gln MEM培养基。
图7是示出了mStrawberry的N端和C端序列的示意图。如图7所示，定位估计的输入信号位置。
图8是示出了由荧光显微镜显示的mStrawberry-NLS和mStrawberry-MLS的细胞内作用位置的图像。可以看出，明亮的荧光的位置各自根据输入信号而不同地表达。
图9是示出了癌细胞中靶向代谢的作用模式(MOA)和途径的图。
图10是示出了在MCF7细胞系中mRNA转染后活死测定(live and dead assay)的结果的图像。使用荧光显微镜，在5μg/孔的mRNA处理后，观察MCF7细胞的细胞活力。转染后24小时的细胞活力有效地降低，并且该效果是时间依赖性的或剂量依赖性的。
图11是示出了在MCF7细胞系中mRNA转染后MTT分析结果的图表。
图12是示出了在MCF7细胞系中mRNA转染后根据Annexin V染色的细胞凋亡分析结果的图表。早期凋亡部分(右下象限)在mRNA转染后连续增加，且晚期凋亡部分(右上象限)也增加。
图13是示出了根据T001转染和NT5M转染的细胞毒性和细胞生长抑制的比较结果的图表。
图14是示出了CT和NT5M转染诱导的细胞凋亡的结果的图表。
图15是示出了T001转染后细胞周期停滞的图表。
图16是示出了根据结肠直肠癌细胞系HCT-116中的浓度的凋亡诱导细胞的比值的图表。
图17是示出了通过T001的siRNA处理的T001偏移效应的图表。
图18是示出了根据三阴性乳腺癌(TNBC)中的浓度的凋亡诱导的细胞的比值的图表。
图19是示出了在CT治疗三阴性乳腺癌后DNA损伤标志物的Western印迹分析结果的图像。
图20是示出了使用SV4结合剂和T001药物的抗癌剂的示意图。
图21是示意性地示出T001 mRNA的构成的示意图。
图22是示出了与包含NLS-mStrawberry mRNA的免疫脂质体(iLP)复合的羧基荧光素-DSPE的体外分析的结果的示意图和图像。在MCF7细胞系中，通过核转染通过荧光检测来确认每个翻译的mStrawberry蛋白质和mRNA的位置。A表示2.5μg的NLS-mStrawberry mRNA，B表示5μg的NLS-mStrawberry mRNA。
图23是示出了体外和体内CD47掩蔽测定的结果的图像。
图24是示出了在静脉内(IV)注射SV4缀合的iLP-NIR RFP mRNA后MCF7异种移植小鼠的分布的图像。A表示异种移植小鼠，B表示注射后1小时的异种移植小鼠，C表示注射后3小时的异种移植小鼠，D表示注射后6小时的异种移植小鼠，以及E表示异种移植小鼠的切割癌组织。
图25是示出了静脉注射iLPD后特定时间体内肿瘤体积的图表和图像。
图26是示出了iLPD治疗对小鼠器官的毒性试验的结果的图表。
图27是示出了使用根据本发明的SV4结合剂的抗癌剂的机理的示意图。
图28是示出了SIRPα和SV1的DNA序列的比较的图。
图29是示出了DSPE-PEG2000-NHS和SV4蛋白的缀合过程的图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细地描述本发明。在实现本发明之前，应理解，本说明书和权利要求书中所使用的术语或词语不应被解释为限于它们的普通含义或词典含义，而是基于发明人应能够适当定义术语的概念以便以最佳方式描述本发明的原理，从而解释为与本发明的技术构思一致的含义和概念。因此，本说明书中描述的实施例的构成仅是本发明的最优选的实施方式并且不代表本发明的所有技术精神，并且应当理解的是，在提交本申请时可以存在可以替代它们的各种等同物和修改。
本文使用的术语可以如下理解。
本文的术语“CD47”不受具体限制，并且可以源自任何动物、优选哺乳动物、以及更优选人CD47。人CD47的氨基酸序列和核苷酸序列是已知的(J.Cell.Biol.,123,485-496,(1993),Journal of Cell Science,108,3419-3425,(1995),GenBank:Z25521)。
本文所使用的术语“结合剂”是指结合到受体(特别是CD47)上的蛋白质，并且该结合剂结合到CD47上(特别是在癌细胞中)，从而使得细胞递送材料的识别和/或相互作用能够进行。
本文所使用的术语“缀合”或“缀合物”是指通过两种或更多种化合物与一种或多种化学键或接头的缔合形成的化合物。在本发明的实施方式中，结合剂和脂质体形成缀合物。
本文所使用的术语“PEG化”是一种用于通过将聚乙二醇(PEG)缀合至靶标材料来增加稳定性的技术。在本发明中，可以使用PEG化的磷脂，例如DSPE-PEG2000等。DSPE-PEG2000是指连接了数均分子量为约2000的PEG的DSPE。
本文所使用的术语“多核苷酸”通常是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，其可以是RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。在本发明的一个实施方式中，多核苷酸是合成的单链mRNA。
本文所使用的术语“5'-非翻译区(5'-UTR)”通常理解为位于mRNA的蛋白质编码区(即开放阅读框(ORF))的5'的mRNA的特定部分。通常，5'-UTR在转录起始区开始并在开放阅读框的起始密码子之前的一个核苷酸结束。
本文所使用的术语“3'-非翻译区(3'-UTR)”是通常位于mRNA的开放阅读框(ORF)和聚(A)序列之间的mRNA的部分。mRNA的3'-UTR不翻译成氨基酸序列。3'-UTR序列通常由基因表达期间转录成每个mRNA的基因编码。
本文所使用的术语“核定位信号(NLS)”和“线粒体定位信号(MLS)”各自指的是用于将特定材料(例如蛋白质或核酸)转运到细胞核和线粒体中的氨基酸序列。
本文所使用的术语“转染”是指胞外多核苷酸在有或没有伴随材料的状态下进入宿主细胞，特别是癌细胞的过程。“转染的细胞”可以指例如其中胞外mRNA被引入到细胞中并且因此具有胞外mRNA的细胞。
本发明公开了结合癌细胞中过表达的CD47的结合剂，并且包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
在本发明中，包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的结合剂称为“SV1”，以及包含由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的结合剂称为“SV4”。
首先，Sirpα-变体-形式1(SV1)选自衍生自纯Sirpα(氨基酸序列(SEQ ID NO:25))的突变体文库，该纯Sirpα是原始CD47配体的水溶性结构域。SV1突变体的选择过程如下。
通过参照Weiskopf K et al.(Weiskopf,K.,et al.(2013)."EngineeredSIRPalpha variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies."Science(New York,NY)341)(6141):88-91)中SIRPα结合到CD47上的结合亲和力改善的蛋白质，合成人SIRPα的单个14-kD结合结构域以稳固基因。从野生型SIRPα发生改变的氨基酸如下。第6位的缬氨酸被异亮氨酸取代，第27位的缬氨酸被异亮氨酸取代，第31位的异亮氨酸被苯丙氨酸取代，第47位的谷氨酸被缬氨酸取代，第53位的赖氨酸被精氨酸取代，第54位的谷氨酸被谷氨酰胺取代，第56位的组氨酸被脯氨酸取代，第66位处的丝氨酸被苏氨酸取代，以及第92位的缬氨酸被异亮氨酸取代。对于在大肠杆菌中表达蛋白质，通过密码子优化修饰现有的核酸序列来制备SV1，并比较SIRPα序列(SEQ ID NO:26)和SV1的DNA序列(SEQIDNO:27)，并在图28中示出结果。
同时，制备SV1-(C)CRM197(其是其中将CRM197蛋白加入到SV1的C端的蛋白质)、CRM197(N)-SV1(其中将CRM197蛋白加入到N端)和SV1蛋白，并通过表面等离子体共振(SPR)分析确认在端部加入这些蛋白质的效果。使用Biacore X100仪器，通过SPR的结合动力学分析每个样品。在这种情况下，作为用于分析的芯片，使用其中重组CD47蛋白缀合至500RU的蛋白质G表面的芯片，并且以5μL/分钟的流速分析HBS-P。用BiaEvaluation软件使用1:1结合模型和总体拟合分析各传感图的结果，结果示于下表1中。
[表1]
Figure BDA0004107808900000071
Figure BDA0004107808900000081
参照表1，评述SPR分析结果，证实虽然与SV1相比，在C端插入CRM197的SV1-CRM197的KD值没有显著改变，但是在N端插入CRM197的CRM197-SV1的KD值示出约2倍增加达到19.9nM，从而降低亲和力。因此，证实了当在SV1的N端添加蛋白质时，SV对CD47的亲和力与SV1的亲和力相比降低，这是由于通过防止SV1正确地结合到CD47上而发生的立体位阻。
在下文中，将参照本发明的具体实施例详细描述根据本发明的SV4结合剂、与结合剂缀合的脂质体、捕获在结合剂缀合的脂质体中的T001药物、使用SV4结合剂和T001药物的抗癌剂。
缀合SV4的脂质体
由于优点显著，基于脂质纳米颗粒的药物递送系统已被普遍使用。脂质纳米颗粒具有高药物容量、高稳定性和高特异性的优点，并且可以控制释放点。由于基因材料用作药物，因此使用阳离子脂质体将药物递送至靶标癌症。带正电荷的脂质体吸入基因药物并形成覆盖药物的球状复合体，以保护药物直到药物遇到靶标。
在本发明中，为了形成阳离子脂质体，使用阳离子磷脂、DOTAP和胆固醇之一制备前脂质体(pro-liposome)。此外，为了在通过血管将药物递送至靶标期间增加血清稳定性，另外将PEG1000-DSPE掺入前脂质体中以制备PEG化的脂质体。除了PEG化的脂质体之外，通过将NHS活化的DSPE-PEG2000与SV4蛋白缀合来制备DSPE-PEG2000-SV4。制备SV4缀合的脂质体的最终步骤是将mRNA包封的前脂质体与DSPE-PEG2000-SV4混合。SV4缀合的脂质体的具体制备方法如下。
以干膜方式制备脂质体。添加阳离子脂质体，其由DOTAP(Avanti Polar Lipids)和胆固醇(Sigma)(1:1摩尔比，10mM)以及PEG-DSPE1000(1mM；Avanti Polar Lipids)组成。在圆底玻璃烧瓶中，将阳离子脂质体溶解在氯仿和甲醇(2:1(v/v))中。在50℃用旋转蒸发器在真空下干燥脂质。为了完全去除氯仿和甲醇，将脂质膜冷冻干燥过夜。蒸发后，将脂质膜用无核酸酶的水在50℃下再水合长达1小时。超声处理水合脂质膜以形成单层囊泡。最后，使用具有100nm孔的膜，使用微型挤出机(Avanti Polar Lipids)挤出脂质。
如下制备DSPE-PEG2000-NHS和SV4蛋白的缀合物(参见图29)。以干膜方法制备DSPE-PEG2000-NHS。将溶解在氯仿中的DSPE-PEG2000-NHS在圆底玻璃烧瓶中蒸发。通过旋转蒸发器在30℃在真空下进行1小时的脂质干燥。蒸发后，将脂质膜在30℃下与溶解在无核酸酶的水中的SV4蛋白再水合1小时。为了去除残余的未缀合DSPE-PEG2000-NHS，使用渗析盒10,000MWCO(Thermo Scientific)在PBS中在pH 6.8下进行渗析过夜。
如上所述制备含有包封药物和结合配体的脂质体。将3mg阳离子脂质体、25μg鱼精蛋白和焦碳酸二乙酯水混合来制备溶液A，以及将50μg的mRNA和焦碳酸二乙酯水混合来制备溶液B。通过用焦碳酸二乙酯水平衡体积，将溶液A和B温育30分钟。此后，通过混合和温育30分钟，用包封药物形成脂质体。为了结合DSPE-PEG2000-NHS缀合的SV4配体，将含有包封药物的脂质体(1:100摩尔比)在50℃混合15分钟。
SV1作为缀合靶标
通过突变选择SV1(通过修饰天然Sirpα的序列而具有对CD47的改善的结合亲和力)，并通过突变固定SV4(当制备脂质体配制品时以待反应的正确定向插入)(参见图1)。通过以下方法进行SV4突变体的制备。用亮氨酸取代固定的SV1序列中第11和第104位的赖氨酸残基，用于以正确定向与CD47结合。为了取代，使用其中将SV1基因插入到pET28a载体中的质粒制备引物，使得点突变对应于第11和第104位的序列(参见下表2)，并根据诱变试剂盒(Agilent)的方法制备单独或同时取代的Quickchange II定点突变基因。
[表2]
Figure BDA0004107808900000091
Figure BDA0004107808900000101
SV1蛋白除了N端氨基之外还具有六个赖氨酸残基(参见图2A)。为了通过缀合将SV1连接到脂质体上以通过结合到CD47上递送药物，有必要改善结合亲和力。通过NHS缀合，可以在能在连接DSPE的化学反应中起作用的残基中选择以正确定向起作用而不干扰与CD47的结合的残基，并通过用亮氨酸取代这些残基之外的残基而不损失结合活性进行修饰(改变，modify)。如图2所示，通过取代减少与DSPE结合的残基的数目，从而通过简单结合制备DSPE缀合的SV4。
同时，为了证实赖氨酸取代对SV4的正确定向的影响，各自制备DSPE缀合形式和脂质体插入形式用于与SV1进行比较，并通过表面等离子体共振(SPR)分析与CD47的亲和力。为了分析，在使用CM5芯片缀合CD47之后，测量SV1、DSPE-SV1、LPD-SV1、SV4、DSPE-SV4和LPD-SV4的缔合和解离，并且比较KD值。具体地，通过待使用的EDC-NHS反应通过250RU的靶SPR反应将重组CD47蛋白缀合至CM5芯片的表面，以及对于HBS-P，使用1:1结合模型和总体拟合由BiaEvaluation软件来分析在30μL/分钟的流速下通过缔合3分钟和解离10分钟的过程获得的传感图。根据分析样品的特征，将pH 2.0的10mM甘氨酸用作SV1和SV4蛋白的解离缓冲液，并且将2.0M MgCl2用于附着了脂肪酸的样品。
SPR分析的结果是与Sirpα(wt)相比，SV1示出KD值从280nM显著改善至0.87nM(参见表3)。虽然SV1的亲和力大大改善，但是当通过NHS缀合反应制备SV1-DSPE时，由于KD值从0.87nM增加至2.67nM，因而亲和力降低。此外，在将SV1-iLP插入到脂质体中的情况下，亲和力进一步降低，KD值增加至10.9nM。相比之下，在SV4(其中两个作为NHS反应残基的赖氨酸被亮氨酸取代)的情况下，证实蛋白质本身的亲和力略微降低，但是由于正确定向，当与DSPE缀合时甚至当插入到脂质体中时，结合活性维持在误差范围内而没有显著降低。(参见表3)。
[表3]
分析物 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(nM)
Sirpα 6.10×105 3.70×10-1 290.0
SV1 3.53×105 3.08×10-4 0.87
SV1-DSPE 7.34×104 1.96×10-4 2.67
SV1-iLP 1.73×104 1.89×10-4 10.9
SV4 1.64×105 2.75×10-4 1.67
SV4-DSPE 2.27E×105 2.56×10-4 1.13
SV4-iLP 3.12E×105 3.95×10-4 1.27
结合剂缀合的脂质体捕获药物
在下文中，将描述捕获在脂质体中的上述结合剂(SV4)缀合的药物的实施方式。
选择源自噬菌体PBS2(PBS2噬菌体)的胸苷酸5'-磷酸水解酶作为具有通过最大化癌细胞的代谢脆弱性来杀伤癌细胞的机制的候选药物材料，该胸苷酸5'-磷酸水解酶具有类似于人5'-核苷酸酶的活性，但是仅对dTMP和dUMP具有特别高的特异性，而对其它核酸没有特异性；并且优化基因序列，使得当递送到人类细胞中时充当非特异性微小RNA(微小RNA)的位点最小化，同时表达最大化，并且将该基因序列命名为“T001”(SEQ ID NO:3)。T001的序列优化过程如下。
为了优化用于哺乳动物细胞表达的DNA序列，用以下最佳密码子替换天然密码子：丙氨酸(GCC)、精氨酸(CGC)、天冬酰胺(AAC)、天冬氨酸(GAC)、半胱氨酸(TGC)、谷氨酸(GAG)、谷氨酰胺(CAG)、甘氨酸(GGC)、组氨酸(CAC)、异亮氨酸(ATC)、亮氨酸(CTG)、赖氨酸(AAG)、甲硫氨酸(ATG)、苯丙氨酸(TTC)、脯氨酸(CCC)、丝氨酸(TCC)、苏氨酸(ACC)、色氨酸(TGG)、酪氨酸(TAC)和缬氨酸(GTG)。避免Cs和Gs的运行以简化PCR条件以及寡核苷酸合成。
与T001相似的参与人类细胞中的核酸代谢的酶是5'-核苷酸酶，并且根据作用位点，已知三种类型：NT5C(细胞质)、NT5M(线粒体)以及NT5E(胞外膜)。由于NMP或dNMP的磷酸基团的水解活性和结构的差异以及作用位点，这三种酶的优选底物核酸种类不同，并且已知它们中的大多数具有对NMP或dNMP的广泛特异性。其中，据估计NT5M(参见SEQ ID NO:32)在结构上与T001大致相似，尽管氨基酸序列与T001相比相似性较低(参见图3)。特别地，证实尽管序列存在差异，但是作用位点的序列是保守的，并且它属于卤代链烷酸脱卤酶(HAD)超家族。
尽管存在结构同源性，但NT5M与T001之间的结构差异在于T001具有不存在于NT5M中的独特结合环结构，并且这是最大的特征差异(参见图4)。
结合环与NT5M和T001的底物结合位点密切相关，并且推定与底物的特异性相关。尽管迄今对结合环的功能知之甚少，但在本发明中部分证实，由于结合环，T001与NT5M相比对dTMP具有更高的亲和力和高dTMP分辨率(参见表4)。
[表4]
Figure BDA0004107808900000121
Figure BDA0004107808900000131
如表4所示，已知在迄今为止已知的其他5'-脱氧核糖核苷酸酶中，对dTMP的亲和力最高。根据到目前为止已经报告的内容，可以看出与本发明中示出的T001相比，其他酶表现出相对宽的底物特异性以及对dTMP的较低亲和力。特别地，即使当与结构上类似的人NT5M比较时，底物的光谱也不同且根据表4对dTMP的亲和力为30倍低。推定此差异是由于T001中结合环的存在，该结合环不存在于NT5M中。
T001 mRNA药物定位和mRNA结构
T001的最终药物的形式是mRNA形式，并且通过优化表达所需的每种组分来优化非翻译区(UTR)和Kozak序列。为此，使用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，通过选择如图5所示的候选结构来确定表达效率。使用的每个UTR的序列信息显示在下表5中。
[表5]
Figure BDA0004107808900000141
Figure BDA0004107808900000151
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Figure BDA0004107808900000161
经由FACS通过GFP荧光水平分析每个UTR的表达效率。FACS分析方法如下。
将5×105个细胞置于6孔培养板的每个孔中，在37℃和5％CO2条件下，在细胞培养箱中温育24小时以附着于板的底部，然后使用lipofectamine messengerMAX试剂转染表达绿色荧光的具有每个UTR结构的EGFP mRNA。首先，将125μL的OPTI-MEM培养基和3.5μL的试剂在微管中混合并在室温下温育10分钟。在另一个微型管中，将mRNA稀释培养基加入到上述试剂中并混合，在该培养基中加入125μL培养基和1.25μg具有每个UTR结构的mRNA。再温育5分钟后，将生成物给予每个孔的细胞。4小时后，用磷酸盐缓冲盐水轻微洗涤每个孔中的细胞，替换细胞培养基，并再培养20小时。比较每个UTR的EGFP mRNA的绿色荧光蛋白的表达水平，并通过荧光显微镜和流式细胞术分析。作为对照组，使用购自TrilinkBiotechnology的EGFP mRNA。首先，比较温育后细胞的绿色荧光的强度并且通过荧光显微镜分析图像。然后，用胰蛋白质酶将具有每个UTR(包括对照)的EGFP mRNA处理的细胞从板底部分离，收获在微量离心管中，然后在磷酸盐缓冲盐水中稀释。对于由此收获的细胞，通过流式细胞仪根据强度将表达绿色荧光的细胞群的分布与对照组在强、中和弱的三个阶段中进行比较。
FACS分析的结果是UTR长度降低形式的最终表达形式被确认为第9号UTR形式(参见图6)。
对于基于UTR 9的细胞内作用位点的多样化，为了将这些位点定位在核酸合成途径存在的细胞核、细胞质和线粒体中，添加如图7所示的定位信号序列(NLS：SEQ ID NO:23，MLS：SEQ ID NO:24)，并且根据定位信号序列表达报告基因mStrawberry，以及通过荧光确认蛋白质的位置(参见图8)。根据定位信号序列的荧光定位测试(mRNA转染：lipofectamine)的具体程序如下。
将用于共聚焦显微镜的一种盖玻片放入6孔细胞培养板的每个孔中，并且在37℃和5％CO2条件下，将5×105个细胞在细胞培养箱中温育24小时以将它们附着于盖玻片。使用lipofectamine messengerMAX试剂转染每个定位信号序列和表达红色荧光蛋白的mStrawberry报告基因序列所连接的mRNA。首先，将在微管中的125μL OPTI-MEM培养基和3.5μL试剂混合，在室温下温育10分钟，并且将在另一微管中的mRNA稀释培养基添加至试剂并且温育另外5分钟，其中，在另一微管中添加了125μL培养基和1.25μg具有每个定位信号序列的报告mRNA，并且将生成物给予至每个孔的细胞。4小时后，用磷酸盐缓冲盐水轻微洗涤每个孔的细胞，替换细胞培养基，并且再培养20小时以制备用于在共聚焦显微镜下观察的样品。对于样品制备，向其中添加4％多聚甲醛试剂，并温育10分钟以固定细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤生成物，并在载玻片上添加20μL的防腐剂溶液，将固定并洗涤的盖玻片放置在载玻片上，并且在不干燥的情况下清洁相邻区域，证实mStrawberry蛋白质是否位于细胞核和线粒体中，使得利用共聚焦显微镜的红色荧光很好地操作定位信号序列。
T001 mRNA合成如下进行。
模板DNA制备：在pIRES载体中修饰用于体外转录的(IVT)mRNA合成的载体。简单来说，将5'UTR-T001-3'UTR盒克隆至pIRES载体的MCS中。为了制备IVT模板，将质粒用SacI/HpaI酶处理以产生直链，以及使含有T7启动子和T001盒的1.5kb直链仅经受柱纯化并用作PCR的模板。在PCR反应中使用正向引物(gtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagc；SEQ ID NO:37)和反向引物(gaaGCGGCCGCCTTCCTACTCAGGCTTTATTC；SEQ ID NO:38)，并且如下使用Pfu聚合酶进行所有PCR反应：在95℃下持续1分钟、在61℃下持续1分钟以及在72℃下持续3分钟，总共30个循环。PCR产物在琼脂糖凝胶上运行并在进一步处理之前使用Qiagen Cleanup试剂盒提取。
IVT mRNA合成：PCR后，使用HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒(New EnglandBiolabs，Cat.#.E2065)将遗传信息在体外从DNA转录成mRNA。通过向反应溶液中添加10μL的NTP/cap类似物混合物、1μg的模板DNA和2μL的1×T7 RNA聚合酶混合物制备20μL的IVT反应混合物。将IVT反应混合物在37℃温育30分钟。为了去除模板DNA，将1μL的脱氧核糖核酸酶添加至IVT反应混合物中，并且将该混合物在37℃下温育15分钟。对于聚(A)加尾，通过添加5μL的10×聚(A)聚合酶反应缓冲液、5μL的聚(A)聚合酶和20μL的无核酸酶水来制备20μL的IVT反应混合物，并在37℃下将混合物温育40分钟。此后，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化生成物，并且通过在旋转柱膜上用89μL的无核酸酶水洗脱来纯化合成的mRNA。然后，用1μL的Antarctic磷酸酶在37℃处理生成物30分钟以除去5'-磷酸，再次使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化，然后在旋转柱上用50μL的无核酸酶水洗脱以回收合成的mRNA。对于后续实验，将合成的mRNA调节至500ng/μL的最终浓度，接种，并且储存在-80℃下。
癌细胞中的靶标代谢
胸苷酸合成酶(TS)是用于DNA合成和修复的胸苷酸(dTMP)的唯一从头来源。靶向TS蛋白的药物是癌症治疗的主要途径，但是由于脱靶效应和毒性，它们的使用受到限制。胞质胸苷激酶(TK1)和线粒体胸苷激酶(TK2)通过从肿瘤环境中恢复胸苷而有助于产生替代的dTMP生成途径，并且可以调节对TS靶向药物的抗性。因为有报道，与常规TS蛋白靶向药物(5FUdR和培美曲塞(pemetrexed))相比，用siRNA下调TK增加了TS siRNA检测肿瘤细胞的能力，所以本发明关注于dTTP生物合成和代谢。
尽管这些酶的复合下调是增强TS靶向抗癌疗法的有吸引力的策略，但正常细胞毒性和对癌症药物的抗性可能成为问题。避免该缺陷的替代方案是获得高dTMP特异性水解酶，即T001。T001可以将dTMP水解为胸苷而不水解其他脱氧核苷酸单磷酸酯(dNMP)。细胞中失衡的核苷酸池可能由dTTP缺乏引起，并可能导致对细胞生长和增殖的严重损害。考虑到T001的底物选择性和活性，提出以下假设：(1)失衡的核苷酸池可以诱导人肿瘤细胞累积损伤，以及(2)T001的过表达可以引起失衡的核苷酸池，以及(3)失衡的核苷酸池可以通过过度修复频率引起细胞死亡。
通过将T001 mRNA转染到癌细胞中减少活细胞数目
首先，在转染各T001 mRNA之后，估计各组中的细胞数目以评估肿瘤细胞生长，并通过活死测定分析培养物中的细胞生长(参见图10)。活死测定如下进行。
将5×105个细胞加入到6孔细胞培养板的每个孔中，并在37℃和5％CO2条件下的细胞培养箱中温育24小时以附着于底部。24小时后，使用lipofectamine转染每个mRNA形式，并培养另外的24小时。回收来自每个实验组的细胞，并用2μM钙黄绿素AM和4μM EthD-1(即活力测定试剂)处理回收的细胞，反应30分钟，并通过荧光显微镜确认细胞。钙黄绿素AM被活细胞的酶降解后进入细胞并显示绿色荧光，而EthD-1进入死细胞的细胞并染色细胞核从而显示红色荧光。
如图10所示，与对照相比，转染后24小时的活细胞显著减少，并且mRNA形式(NT、MT和CT)之间没有差异。
通过将T001 mRNA转染到癌细胞中抑制活细胞增殖
进行MTT分析以量化细胞活力。MTT分析方法如下。
在96孔培养板中每孔加入10,000个细胞，并在37℃、5％CO2条件下的细胞培养箱中温育24小时以附着于底部。24小时后，制备lipofectamine试剂并针对每种mRNA形式和浓度进行转染，并在温育另外的24小时、48小时和72小时之后每次进行细胞活性测定实验。将10μL的EZ-Cytox(即细胞活性测定试剂)给予每个孔的每种样品，在每个孔中每次都培养细胞，并且在反应2小时后，使用酶标仪测量在450nm波长下的吸光度值。通过比较与对照组相比的每种形式的mRNA处理组的值，分析每个处理时间和浓度的细胞活力。
MTT分析的结果是与对照组相比，用T001 mRNA转染的细胞的增殖在转染后24小时显著抑制，并且抑制作用维持高达72小时，表示每个细胞的活力持续降低。细胞活力显示为根据剂量而不同(参见图11)。
通过将T001 mRNA转染进入癌细胞诱导凋亡
根据实验结果，在Annexin V染色之后进行流式细胞术分析以检查T001是否诱导细胞凋亡从而减少细胞数目或抑制细胞增殖。具体分析方法如下。
将5×105个细胞添加到6孔细胞培养板的每个孔中，在37℃和5％CO2条件下在细胞培养箱中温育24小时以附着到板的底部，并使用lipofectamine messengerMAX试剂用每种形式的mRNA转染。首先，将125μL的OPTI-MEM培养基和3.5μL的试剂在微管中混合，并将混合物在室温下温育10分钟。在另一个微型管中，将mRNA稀释培养基(其中混合125μL培养基和1.25μg具有每个UTR结构的mRNA)加入上述试剂并进一步温育5分钟，然后给予至每个孔的细胞。4小时后，用磷酸盐缓冲盐水轻微洗涤每个孔中的细胞，替换细胞培养基，并进一步培养20小时，使用胰蛋白质酶从板底部分离细胞，收集到微量离心管中，然后在磷酸盐缓冲盐水中稀释。向每个微量离心管中添加3μL的Annexin V染色试剂和碘化丙啶染色试剂，并在室温下反应15分钟后，通过流式细胞术比较由T001形式诱导的细胞死亡的程度。作为对照，使用无mRNA的lipofectamine messengerMAX试剂。Annexin V试剂染色经历细胞凋亡的细胞的细胞膜，以及碘化丙啶染色死细胞的胞内核。因此，在流式细胞术图上，没有经历细胞凋亡的细胞分布在第三象限，并且细胞群的位置根据细胞凋亡的程度从第四象限移动到第一象限。
分析结果是细胞凋亡率在所有形式中是类似的。对照组的细胞凋亡率是3.75％，以及用NT、MT和CT转染的细胞的过早死亡率分别是21.59％、25.11％和24.65％。用NT、MT和CT转移的细胞的细胞凋亡率分别为9.85％、8.42％和11.47％(参见图12)。细胞凋亡率以剂量依赖性方式增加，示出T001的每个形式之间存在一些差异。
T001和NT5M对结肠癌细胞(HCT-116)的细胞毒性的比较
T001因其与NT5M的结构差异而对核酸T更具特异性。因此，由于dTTP损失而不是核酸总体损失引起的核酸失衡可对癌细胞代谢具有更大影响，从而抑制癌细胞的生长。为了证明这一点，就每种酶之间的细胞活力和细胞生长抑制作用，比较成熟形式的人NT5M和非成熟形式(包括内含子)与胞质T001(CT)，以便根据底物特异性检查对细胞的作用。将每种mRNA转染到结肠癌细胞系HCT-116中，并在其后24小时，进行台盼蓝测定，针对HCT-116的细胞活力和细胞生长抑制的结果示于图13中。具体的实验方法如下。
用1.25μg每种非成熟形式NT5M、成熟形式NT5M和CT mRNA转染HCT-116细胞。24小时后，将生成物各自用胰蛋白质酶处理并且使用离心机收获细胞。在用1×DPBS再悬浮收获的细胞之后，将一定量的细胞与台盼蓝试剂以1:1的比例混合。在室温(RT)下温育2分钟后，使用血细胞计数器对细胞数量进行计数。在获得用台盼蓝试剂染色和未染色的细胞的数量之后，获得活细胞和非活细胞的数量，然后除以细胞的总数获得活力。每个实验重复三次或更多次以评估显著性。
如图13所示，在T001对dTMP具有高亲和力和活性的情况下，对细胞的影响大于具有相似活性的人NT5M对细胞的影响。
特别地，证实细胞中示出的毒性主要由细胞凋亡的诱导引起(参见图14)。将其中HCT-116细胞用非成熟的NT5M、成熟的NT5M和CT mRNA转染(每种1.25μg)的细胞培养24小时，然后测量和分析细胞凋亡的程度。结果是，尽管两种类型的NT5M mRNA示出与对照组相比Sub G1组增加了约12％，但是CT mRNA示出与对照组相比增加了约25％。认为由T001表达引起的细胞凋亡源自由胞内核酸缺乏引起的细胞周期变化，并且预测当底物中特定核酸和dTTP的选择性缺乏引起细胞周期停滞并且加强这个过程时，它将最终诱导细胞凋亡(参见图15)。
上述结果所示的细胞凋亡诱导作用示出根据结肠癌细胞系中CT的治疗浓度的浓度依赖性趋势，表明CT活性直接参与细胞凋亡(参见图16)。
为了确认这些癌细胞的细胞凋亡是否是T001的作用，使用用于CT的siRNA敲除T001后确认细胞凋亡程度的变化。制备靶向T001的两种类型的siRNA并且将其转染到HCT-116细胞中，然后转染CT mRNA。24小时后，通过Annexin V/PI染色确认细胞凋亡的程度。具体的实验方法如下。
制备两种类型的靶向T001的siRNA，并使用RNAiMAX试剂进行转染，且1小时后转染CT mRNA。24小时后，收获细胞并使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I染色。在室温下温育20分钟后，使用流式细胞术分析荧光程度。每个样品分析10,000个细胞。所使用的siRNA的序列如下。
[siT001-1]
正义(SEQ ID NO:33)：CGAGAAGAAGUCAGAUUACAUCAAG
反义(SEQ ID NO:34)：CUUGAUGUAAUCUGACUUCUUCUCG
[siT001-2]
正义(SEQ ID NO:35)：CGCAAAUUCAUUGAAACCUUCCUGA
反义(SEQ ID NO:36)：UCAGGAAGGUUUCAAUGAAUUUGCG
分析结果是证实与单独用CT mRNA转染的组相比，在用siRNA转染后用CT mRNA转染的组中细胞凋亡减少(参见图17)。
T001在三阴性诱导癌症中的浓度依赖性抑制作用
认为T001的作用机制能够诱导除结肠癌之外的癌中的癌细胞死亡，因此，对三阴性乳腺癌(TNBC)进行相同的测试以证实细胞凋亡诱导能力。具体测试方法如下。
各自以5×105个细胞/孔接种MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，然后分别用0、0.625、1.25和2.5μg的CT mRNA转染。24小时后，收获细胞，并使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I染色。在室温下温育20分钟后，使用流式细胞仪分析荧光程度。每个样品分析10,000个细胞。通过三个重复实验评价显著性。
在一定浓度下用胞质T001(CT)mRNA处理两种类型的三阴性乳腺癌之后，通过Annexin V/PI染色对培养24小时的细胞进行FACS分析。结果证实即使在测试的癌中，凋亡细胞的比值也与CT mRNA的浓度成比例地增加(参见图18)。
为了分析引起细胞凋亡的蛋白质水平，将1.25μg的CT mRNA转染到作为TNBC细胞系的MDA-MB-231和MDA-MB-468中，然后在此之后18小时进行Western印迹法。具体分析方法如下。
用CT mRNA转染后，18小时后收获细胞。使用RIPA缓冲液(+蛋白质酶抑制剂，磷酸酶抑制剂)将细胞在冰上裂解30分钟，然后使用4℃离心机分离蛋白质15分钟。定量分离的蛋白质，并将10至20μg的蛋白质加载到丙烯酰胺凝胶上。在将凝胶转移至PVDF膜之后，在室温下用5％脱脂乳封闭1小时。向其中加入每种1'抗体，并将生成物在4℃下储存过夜。在用0.1％TBST洗涤生成物以后，将2'抗体加入其中，并在室温下温育生成物1小时。用0.1％TBST洗涤生成物后，使用ECL溶液检测蛋白质。使用ChemiDoc XRS+分析蛋白质表达。
分析结果如图19所示，PARP(细胞凋亡标记物)和γ-H2AX(DNA损伤标记物)裂解的表达增加。证实由于在CT mRNA治疗期间dTTP的缺乏而发生DNA损伤，并且证实通过其诱导细胞凋亡。
使用SV4结合剂和T001药物的抗癌剂
在下文中，将描述使用SV4结合剂和T001药物的抗癌剂的实施方式。
使用SV4结合剂和T001药物的抗癌剂是第四代靶向抗癌剂，它们靶向癌细胞的免疫逃逸和代谢脆弱性，由此显著减少正常细胞的副作用，其方式为使得它们主要检测并且结合癌细胞表面上过表达的CD47，其次，进入癌细胞的mRNA型核酸代谢抑制剂检测并抑制癌细胞的过量核酸合成代谢。通常，癌细胞特异性表面蛋白通常分布在正常细胞中，因此当将能够识别特异性表面蛋白的靶向蛋白偶联至毒性材料时，对正常细胞的损害是不可避免的。然而，仅识别不会产生毒性，如果靶向过度尝试核酸合成的癌细胞的代谢，则癌细胞的识别率变高，从而减少对正常细胞的损害。即，大多数识别CD47且即使将T001 mRNA引入细胞中也不扩增核酸用来生长的正常细胞将具有很小的损伤，因为其对核酸的需求很小，但是仅通过合成过量核酸才能生长的癌细胞将具有显著的损伤，这是由于由dTMP的缺乏引起的核酸失衡所致。因此，即使在识别具有高CD47表达的癌细胞的过程中靶向一些具有相对高CD47水平的正常细胞，也可以通过经由引入内部的靶向核酸代谢对癌细胞引起更大损害来增加癌细胞的识别率，从而减少对正常细胞的损害。
如图20所示，使用SV4结合剂的抗癌剂的组成是以脂质体纳米颗粒的形式，其中，该组成在外部具有CD47识别蛋白并在内部捕获mRNA，在mRNA中，定位信号(核内、胞质内和线粒体内)是以癌症类型的不同组合的形式。图27示意性地示出了使用根据本发明的SV4结合剂的抗癌剂的机制。
抗癌剂的组分
(1)CD47结合剂(SV4)
在将DSPE缀合到高亲和力CD47缀合物(源自Sirpα的蛋白质的一种修饰体)中，将SV4(被修饰成以正确定向位于脂质体外部)用作CD47结合剂，并且SV4的预测结构示于图1A中。比较结合DSPE的样品和DSPE插入脂质体的样品的KD值的结果，可见脂质体形式通过序列突变得到改善(参见上表1)。
(2)基于脂质体的药物递送系统组分
作为用于使脂质体带正电荷以实现至靶标的顺利药物递送的材料，阳离子磷脂(DSPE-PEG1000)、DOTAP和胆固醇的结构分别示于式1至3中。
[式1]
Figure BDA0004107808900000251
[式2]
Figure BDA0004107808900000252
[式3]
Figure BDA0004107808900000253
(3)药物
如上所述，在图21中将T001 mRNA的结构示意性地示出为能够核内、胞质内和线粒体内表达的mRNA。
通过与定位信号融合的mStrawberry mRNA定位翻译的蛋白质
为了证实定位信号是否工作良好，用核和线粒体定位信号将mRNA转染到MCF7中。检测mStrawberry荧光以确认每种mRNA的成功转染和定位(参见图22)。具体的实验方法如下。
将5×105个细胞加入到6孔细胞培养板的每个孔中，并在37℃和5％CO2条件下的细胞培养箱中温育24小时以附着于板底部。在用羧基荧光素缀合的DSPE构建的脂质体中捕获产生红色荧光蛋白的mStrawberry mRNA，所述红色荧光蛋白与在实验室中合成的细胞内胞质定位信号连接，并通过用完成24小时培养的MCF-7细胞处理而转染。再温育24小时后，在共焦激光荧光显微镜下在具有绿色波长的绿色荧光细胞上确认脂质体的羧基荧光素的位置，并确认用红色波长转染的mRNA产生mStrawberry蛋白并位于细胞质中。
CD47介导的药物递送的证实
为了证实药物递送是否由CD47介导，用SV4缀合的iLP处理MCF-7细胞，SV4缀合的iLP中捕获药物表柔比星(epirubicin)。在这种情况下，将用CD47抗体(多克隆)处理的实验组与未处理的实验组进行比较以确定药物递送是否由CD47介导。特异性CD47掩蔽测定方法如下。
将5×105个细胞加入到6孔细胞培养板的每个孔中，并在37℃和5％CO2条件下的细胞培养箱中温育24小时以附着于底部。将CD47抗体仅添加至一个细胞样品中至5μg/mL的终浓度并反应4小时以在细胞表面上阻断CD47。其中捕获表柔比星，以及用SV4缀合的脂质体(iLP)处理每个细胞至10μM的最终表柔比星浓度并培养24小时。24小时后，通过荧光显微镜比较分析引入细胞中并在细胞核中显示红色荧光的表柔比星的荧光水平。在这种情况下，将直接用表柔比星处理的细胞样品用作对照(参见图23A)。首先将100μg的SV4蛋白给予MCF7异种移植小鼠并且饱和，以制备其中小鼠体内的癌细胞的CD47被阻断的状态，以及给予相同体积的磷酸盐缓冲盐水以制备其中癌细胞的CD47未被阻断的状态。在此，将100μL(5μg的mRNA/0.5mg的脂质体)的脂质体(其中同时插入了在近红外区中表现出红色荧光的SV4-DSPE和花青5.5-DSPE)通过血管内注射给予小鼠体内以证实CD47介导的对靶标的可及性。
实验结果是如图23A所示，在CD47被阻断的治疗组中没有观察到表柔比星荧光，但是在CD47未被阻断的实验组中观察到表柔比星荧光。
另外，在为了证实体内CD47介导的药物递送能力的MCF7-异种移植小鼠模型实验中，观察到由于血细胞中存在的CD47引起的总噪声；然而，与用SV4阻断的小鼠相比，证实了在CD47未被阻断的小鼠的癌细胞中更强的药物递送(参见图23B)。
在MCF7异种移植小鼠模型中，静脉注射含有近红外红色荧光蛋白(NIR RFP)的mRNA的SV4缀合的iLP，然后随时间分析荧光图像。结果示于图24。具体的实验方法如下。
培养人乳腺癌细胞系MCF7，并将其异种移植到裸鼠中。通过静脉注射调整来给予捕获了NIR-RFP(近红外-红色荧光蛋白)mRNA的SV4-iLP，使得可以给予每25g小鼠5μgmRNA，然后，使用体内光学成像系统追踪注射的样品的荧光水平。
参考图24，观察到一种现象，其中尽管mRNA递送通过一些血细胞的CD47发生，但表达以相对高的水平在癌细胞中积累。
在MCF7异种移植小鼠IV中进行癌症生长控制功效测试(28天)，且具体地，将MCF7进行培养并且皮下注射到裸鼠中。在随机分类具有生长肿瘤的裸鼠之后，分别用PBS、脂质体、脂质体-NT和脂质体-MT(20mpk的脂质体，10μg mRNA/mg的脂质体)静脉内(IV)处理小鼠。以5μg的量处理每种mRNA，并且以3天间隔进行总计5次处理，持续28天。以3天的间隔检查肿瘤体积，并以图表呈现结果。在第28天，在处死裸鼠后，分离肿瘤并测定它们的体积。结果示于图25中。
参考图25，与两个对照组相比，iLPD-NT和iLPD-MT组中肿瘤生长速率显著降低(P＝0.03)。此外，在PBS和空白脂质体注射样品之间存在一些差异。
为了评估体内mRNA的毒性作用，在实验过程中对小鼠的体重进行测量。结果发现所有组的小鼠的体重在整个实验期间稍微增加，并且与对照组相比，样品注射后体重的变化不明显。如图25所示，比较从实验完成后处死的小鼠收集的肿瘤组织的最终大小，并呈现结果。
用采集自实验完成后处死的小鼠的血液和组织进行血液学和组织学检查，结果显示在图26中。参考图26，与对照组相比，除了用样品处理的小鼠的血液和肝脏中的WBC数目之外，几乎没有任何显著的毒性作用。
公开了上述本发明的优选实施方式以解决技术任务，并且本发明所属领域的普通技术人员在本发明的精神和范围内可以进行各种修改、改变、添加等，并且此类修改和改变应被视为属于所附权利要求。
序列表
<110> 弗比奥韩国有限公司（ForBioKorea Co., Ltd.）
<120> 用于治疗癌症的CD47结合剂和脂质体复合体（CD47 binder and liposomecomplex for treatment cancer）
<130> PCT21-08004
<150> KR 10-2020-0122151
<151> 2020-09-22
<160> 38
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47结合剂SV1
<400> 1
Met Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe
20 25 30
Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val
50 55 60
Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser
65 70 75 80
Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg
85 90 95
Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser
115
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD47结合剂SV4
<400> 2
Met Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Leu Ser Val Ser Val
1 5 10 15
Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe
20 25 30
Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val
50 55 60
Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser
65 70 75 80
Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg
85 90 95
Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Leu Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser
115
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T001
<400> 3
Met Val Phe Ser Ile Lys Glu Pro Phe Ser Ile Val Thr Asp Cys Asp
1 5 10 15
Glu Val Leu Thr Asp Ile Ser Pro Leu Trp Val His Lys Ile Gln Gln
20 25 30
Asn Ala Asp Tyr Phe Gly Lys Tyr Phe Asp Leu Ser Lys Leu Glu Gly
35 40 45
Leu Glu Phe Gly Thr Phe Glu His Tyr Gln Thr Val Leu Ser Arg Pro
50 55 60
Glu Phe His Leu Asn Lys Trp Leu Arg Lys Glu Asn Leu Val Leu Ser
65 70 75 80
Asp Glu Glu Glu Lys Glu Leu Phe Glu Arg Phe Tyr Ser Leu Tyr Asp
85 90 95
Asn Asp Glu Phe Tyr Glu Asp Cys Met Pro Thr Lys Met Cys Glu Gly
100 105 110
Ile Tyr Lys Leu Ser Leu Gln Lys Phe Val Asp Lys Ile Tyr Val Val
115 120 125
Thr Arg Thr Ser Glu Gly Thr Lys Glu Gly Lys Arg Lys Phe Ile Glu
130 135 140
Thr Phe Leu Asn Ser Asn Lys Val Glu Ile Ile Phe Val Gly Lys Asn
145 150 155 160
Glu Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Lys Asn Val Lys Met Ile
165 170 175
Val Glu Asp Glu Leu Ser Asn Ile Asn Asp Ile Val Glu Asn Cys Asn
180 185 190
Asp Gly Phe Glu Glu Val Asp Thr Tyr Ile Pro Ser Thr Gly Tyr Asn
195 200 205
Asn Lys Asp Ile Asp Gly Phe Asn Glu Asn Leu Met Lys Lys Gly Phe
210 215 220
Asn Ala Val Pro Tyr Val Ile Ile Glu Arg Pro Glu Thr Glu Glu Lys
225 230 235 240
Ala Val
<210> 4
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 4
ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60
atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120
tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177
<210> 5
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 5
gaattcacgc gtcgagcatg catctagggc ggccaattcc gcccctctcc cccccccccc 60
tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg 120
tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa 180
cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg 240
caaggtctgt tgaatgtcg 259
<210> 6
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 6
ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60
atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120
tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177
<210> 7
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 7
ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60
atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120
tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177
<210> 8
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 8
gactagtgca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg agaataagag aaagaaaatg 60
aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg tgtaaagcca acaccctgtc 120
taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct ctgtgcttca attaataaaa 180
aatggaaaga acctagatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgcatc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 300
aaaggctctt ttcagagcca ccagaatt 328
<210> 9
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 9
ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 60
atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg 120
tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaatta 177
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<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 10
gactagtgca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg agaataagag aaagaaaatg 60
aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg tgtaaagcca acaccctgtc 120
taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct ctgtgcttca attaataaaa 180
aatggaaaga acctagatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgcatc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 300
aaaggctctt ttcagagcca ccagaatt 328
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 11
gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60
attcaagctt gagg 74
<210> 12
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 12
gactagtgca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg agaataagag aaagaaaatg 60
aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg tgtaaagcca acaccctgtc 120
taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct ctgtgcttca attaataaaa 180
aatggaaaga acctagatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatgcatc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 300
aaaggctctt ttcagagcca ccagaatt 328
<210> 13
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 13
cttcctactc aggctttata caaagaccaa gaggtacagg tgcaagggag agaagaagag 60
taagaagaaa tataagagcc acc 83
<210> 14
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 14
ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60
acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 15
agtaagaaga aatataagag ccacc 25
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 16
ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60
acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101
<210> 17
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 17
gggagactgc cacc 14
<210> 18
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 18
ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60
acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 19
gggagactgc caag 14
<210> 20
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 20
ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60
acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101
<210> 21
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR序列
<400> 21
gctagc 6
<210> 22
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR序列
<400> 22
ttaattaagc tgccttctgc ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc 60
acctgtacct cttggtcttt gaataaagcc tgagtaggaa g 101
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核质蛋白NLS序列
<400> 23
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 痘病毒MLS序列
<400> 24
Lys Ile Ser Val Tyr Leu Thr Ala Ala Val Val Gly Phe Val Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Ile Leu Lys Trp Tyr Arg Gly Thr
20 25
<210> 25
<211> 503
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人Sirpa
<400> 25
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg
130 135 140
Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr
145 150 155 160
Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro
165 170 175
Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile
195 200 205
His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln
210 215 220
Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg
225 230 235 240
Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu
245 250 255
Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys
260 265 270
Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu
275 280 285
Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn
290 295 300
Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser
305 310 315 320
Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly
325 330 335
Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro
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Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu
355 360 365
Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala
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Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys Ala
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn Asn
435 440 445
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Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg Thr
465 470 475 480
Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala
485 490 495
Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 26
<211> 357
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 人Sirpa DNA序列
<400> 26
ggtgaggagg agctgcaggt gattcagcct gacaagtccg tatcagttgc agctggagag 60
tcggccattc tgcactgcac tgtgacctcc ctgatccctg tggggcccat ccagtggttc 120
agaggagctg gaccagcccg ggaattaatc tacaatcaaa aagaaggcca cttcccccgg 180
gtaacaactg tttcagagtc cacaaagaga gaaaacatgg acttttccat cagcatcagt 240
aacatcaccc cagcagatgc cggcacctac tactgtgtga agttccggaa agggagccct 300
gacacggagt ttaagtctgg agcaggcact gagctgtctg tgcgtgccaa accctct 357
<210> 27
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SV1 DNA序列
<400> 27
gaagaggaac tgcagattat tcagccggac aagtccgtaa gcgttgcagc tggcgagagc 60
gccattctgc actgcactat tacctccctg tttccggtgg gcccgatcca gtggttccgt 120
ggcgctggcc cagcccgtgt gctgatctac aatcaacgtc agggcccgtt cccgcgtgta 180
accactgtta gcgagaccac caagcgtgaa aacatggact tttccatcag catcagcaac 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtattaagt tccgtaaagg cagccctgac 300
acggagttta agtctggcgc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc gtct 354
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KKtoLL11_F1引物
<400> 28
gattattcag ccggacctgt ccgtaagcgt tgc 33
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KKtoLL11_R1引物
<400> 29
gcaacgctta cggacaggtc cggctgaata atc 33
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KKtoLL104_F2引物
<400> 30
ctgacacgga gtttctgtct ggcgcag 27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KKtoLL104_R2引物
<400> 31
ctgcgccaga cagaaactcc gtgtcag 27
<210> 32
<211> 198
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> NT5M
<400> 32
Met Gly Gly Arg Ala Leu Arg Val Leu Val Asp Met Asp Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Asp Phe Glu Gly Gly Phe Leu Arg Lys Phe Arg Ala Arg Phe Pro
20 25 30
Asp Gln Pro Phe Ile Ala Leu Glu Asp Arg Arg Gly Phe Trp Val Ser
35 40 45
Glu Gln Tyr Gly Arg Leu Arg Pro Gly Leu Ser Glu Lys Ala Ile Ser
50 55 60
Ile Trp Glu Ser Lys Asn Phe Phe Phe Glu Leu Glu Pro Leu Pro Gly
65 70 75 80
Ala Val Glu Ala Val Lys Glu Met Ala Ser Leu Gln Asn Thr Asp Val
85 90 95
Phe Ile Cys Thr Ser Pro Ile Lys Met Phe Lys Tyr Cys Pro Tyr Glu
100 105 110
Lys Tyr Ala Trp Val Glu Lys Tyr Phe Gly Pro Asp Phe Leu Glu Gln
115 120 125
Ile Val Leu Thr Arg Asp Lys Thr Val Val Ser Ala Asp Leu Leu Ile
130 135 140
Asp Asp Arg Pro Asp Ile Thr Gly Ala Glu Pro Thr Pro Ser Trp Glu
145 150 155 160
His Val Leu Phe Thr Ala Cys His Asn Gln His Leu Gln Leu Gln Pro
165 170 175
Pro Arg Arg Arg Leu His Ser Trp Ala Asp Asp Trp Lys Ala Ile Leu
180 185 190
Asp Ser Lys Arg Pro Cys
195
<210> 33
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siT001-1正义
<400> 33
cgagaagaag ucagauuaca ucaag 25
<210> 34
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siT001-1反义
<400> 34
cuugauguaa ucugacuucu ucucg 25
<210> 35
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siT001-2正义
<400> 35
cgcaaauuca uugaaaccuu ccuga 25
<210> 36
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siT001-2反义
<400> 36
ucaggaaggu uucaaugaau uugcg 25
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR正向引物
<400> 37
gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gc 32
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR反向引物
<400> 38
gaagcggccg ccttcctact caggctttat tc 32

Claims (6)

1.一种结合癌细胞中过表达的CD47的结合剂，包括由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的结合剂，其中，所述结合剂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰基乙醇胺(DSPE)缀合的结合剂。
3.根据权利要求1所述的结合剂，其中，癌症是结肠癌或乳腺癌。
4.一种结合剂缀合的脂质体复合体，其中，权利要求1所述的结合剂缀合至脂质体。
5.根据权利要求4所述的结合剂缀合的脂质体复合体，其中，使用选自由阳离子磷脂、DOTAP和胆固醇组成的组的至少一种材料使所述脂质体带正电荷。
6.根据权利要求4所述的结合剂缀合的脂质体复合体，其中，所述脂质体是PEG化的脂质体。
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EP2804617B9 (en) * 2012-01-17 2021-04-07 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University High affinity sirp-alpha reagents
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