KR20150036556A

KR20150036556A - 면역 조절제

Info

Publication number: KR20150036556A
Application number: KR1020157003700A
Authority: KR
Inventors: 히로아키 히구치; 도모노리 안도; 게이시로 요시다
Original assignee: 가부시키가이샤 롯데
Priority date: 2012-07-19
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2015-04-07
Also published as: JPWO2014013727A1; TW201416084A; WO2014013727A1

Abstract

면역 이상, 특히 과잉의 면역 응답을 조절하기 위한 면역 조절제의 제공. 발명자들은 예의 연구 결과 망고스틴의 과피로부터 극성 용매로 추출한 망고스틴 과피 추출물이 면역을 조절하는 기능을 갖는 것을 알아내어, 이것을 면역 조절제로서 제공한다.

Description

면역 조절제{IMMUNEMODULATING AGENT}

본 발명은 면역 조절제에 관한 것이다.

고등 동물은 세균, 바이러스, 독물 등의 이물질이 침입해 왔을 때 몸을 방어하는 면역 기능을 구비하고 있다. 면역 기능이 저하되면, 세균 등에 의한 감염증에 걸리기 쉬워진다. 한편, 면역 기능이 과잉으로 작용하면 알레르기나 자기 면역 질환과 같은 질병을 초래한다. 본 발명에서는 면역 이상, 특히 과잉으로 작용하는 면역 기능에 의해 일어나는 질병을 예방, 치료, 혹은 경감시키는 면역 조절제의 제공을 목적으로 한다.

면역 응답에는 T 세포, B 세포, 수상 세포, 매크로파지, 비만 세포 등의 세포가 관여하고 있다. T 세포는 표면 항원에 따라 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포로 나눌 수 있고, 헬퍼 T 세포는 다시 사이토카인의 분비 프로파일에 따라 Th1 세포와 Th2 세포로 나뉜다. Th1 세포가 우세한 면역 응답은 Th1 형 응답이라 불리며 세포성 면역을 유도하고, Th2 세포가 우세한 면역 응답은 Th2 형 응답이라 불리며 액성 면역을 유도한다. Th1 형 면역 응답과 Th2 형 면역 응답은 정상적인 상태에서는 밸런스가 유지되고 있으며, 이것이 어느 쪽으로 크게 치우치면 질환을 일으킨다고 전해지고, 즉, Th1 형의 면역 응답이 항진되면 자기 면역 질환이 유도되고, Th2 형의 면역 응답이 항진되면 알레르기가 유도된다고 전해진다.

바이러스, 기생균에 감염되면 Th0 세포의 Th1 세포로의 분화가 촉진되어, 세포성 면역이 활발해진다. Th1 세포는 인터페론 γ (IFN-γ) 나 인터류킨 (IL)-2 등의 사이토카인을 산생시켜, T 세포, 매크로파지 등을 활발해지게 하여, 바이러스 감염된 세포를 공격한다. Th1 형 면역 응답이 항진되면 자기 응답형의 T 세포를 활성화시켜, 관절 류머티즘이나 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병 등의 만성 염증이나 자기 면역 질환을 유도하는 경우가 있다.

한편, 외계로부터 진드기나 하우스 더스트 등의 환경 항원이 체내에 침입하면 Th0 세포의 Th2 세포로의 분화가 유도되어, 액성 면역이 활발해진다.

알레르기의 발증에는 Th2 형 응답이 관련되어 있다. 하우스 더스트 등의 환경 항원이 생체에 침입하면, 표피 케라티노사이트로부터 흉선 간질성 림프구 신생 인자 (TSLP : thymic stromal lymphopoietin) 가 산생된다. TSLP 는 수상 세포를 활성화시켜, Th0 세포의 Th2 세포로의 분화를 촉진시킨다. 활성화된 Th2 세포로부터 IL-4, IL-13 이 산생되고, 이들이 B 세포에 작용하여, 항원에 대해 특이성을 갖는 항체가 산생되고, 액성 면역이 유도된다. 이 때, 어떠한 기전에 의해 IgE 항체가 다량으로 유도되는 경우가 있다. IgE 는 비만 세포 및 호염기구 상의 FcεRI 와 결합하여, 재차 침입한 항원과 가교되면, FcεRI 의 응집이 촉진되어, 비만 세포나 호염기구의 활성화가 일어난다. 그 때, 세포질 과립 내에 축적된 히스타민, 트립타아제, 프로테오글리칸과 같은 화학 전달 물질이 방출되어, 즉시성 알레르기 반응이 일어난다. 또한, Th2 세포로부터 산생되는 IL-5 에 의해 호산구의 병변부로의 침윤이, 또 활성화 수상 세포로부터 산생되는 CCL22 나 CCL24 와 같은 케모카인에 의해 Th2 세포의 병변부로의 침윤이 유도되어, 염증 알레르기 반응이 일어나는 경우가 있다.

최근, 알레르기에는 피부의 배리어 기능의 파탄도 관여하는 것으로 생각되기 시작하고 있다.

피부는 표피, 기저막, 진피, 피하 조직의 4 층으로 이루어지고, 표피는 다시 각층, 과립층, 유극층, 기저층으로 분류된다. 표피 세포층의 대부분을 차지하는 케라티노사이트의 질서였던 세포 증식·분화에 의해 피부 배리어가 형성되어, 각층 내 수분이 외계로 빠져나가는 것을 방지함과 함께, 외계로부터의 하우스 더스트 등의 환경 항원이 체내에 침입하는 것을 방지한다. 건선, 광선성 각화증, 어린선, 지루성 피부염 등의 피부 질환에서는, 케라티노사이트의 세포 증식 제어가 파탄을 초래하여, 피부 상피 세포의 이상 증식에 의해 피부의 비후화가 일어난다. 그 결과, 표피 배리어 기능이 저하됨으로써, 환경 항원이 침입하기 쉬워진다.

케라티노사이트의 세포 증식을 제어하는 인자로서, 아쿠아포린 3 (AQP3 : Aquaporin3) 이 보고되어 있다. AQP3 은 세포막 표면에 존재하는 물 및 글리세린의 수송 단백질로서, 세포의 증식·이동과 수분의 수송을 제어하여, 피부의 생리적 보습이나 창상 치유에 관여하는 것이 보고되어 있다. 또, 케라티노사이트는 여러 가지 자극에 의해 IL-1, IL-6, TNF-α, TSLP, CCL17 등의 염증성 사이토카인이나 케모카인을 방출하여, 면역 세포를 활성화시키는 등 면역 응답에 있어서도 중요한 역할을 한다. 또한, 케라티노사이트는 여러 가지 자극에 의해 신경 성장 인자 (NGF : Nerve growth factor) 를 방출하여, 말초 신경의 증가·비대를 일으켜, 외계의 자극에 대한 감수성이 증대되는 것이 보고되어 있다. 자극에 대한 감수성이 증대되면 소파 행동이 야기되고, 그렇게 되면, 표피 배리어가 파괴되어, 염증성 사이토카인의 산생이 유도되어, 면역 응답이 더욱 항진된다는 악순환이 된다.

면역 질환의 예방·치료에는, 면역 기능과 표피 배리어 기능을 잘 제어하는 물질, 즉 Th1/Th2 사이토카인, IgE 산생에 더하여, 케라티노사이트의 이상 증식이나 케라티노사이트로부터의 염증성 사이토카인이나 NGF 의 산생을 억제하는 물질이 발견될 것이 기대된다.

이와 같은 배경하에, 면역 조절능을 갖는 것의 탐색이 이루어지고 있으며, 쌀 원료 양조물 (특허문헌 1)·아세트산 및 프로피온산 (특허문헌 2) 등이 개시되어 있다. 그러나, 이것들은 모두 Th1/Th2 밸런스에 대한 효과를 가질 뿐, 표피 배리어 개선도 포함하는 다면적 효과를 갖는 것은 개시되어 있지 않다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로, 망고스틴 과피 추출물 중으로 이루어지는 안전하고 또한 면역 이상을 조절하는 효과를 갖는 면역 조절제에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 망고스틴 (Garcinia mangostana. Lnn) 은 물레나무과 가르시니아속에 포함된다. 망고스틴은 동남 아시아에 서식하는 식용 과수로서, 그 과피는 오래전부터 민간 전승약으로서 설사, 이질, 해열제나 피부병에 이용되어 왔다. 망고스틴은 프루트의 여왕이라 불리우며, 지명도도 높아 이미지가 좋은 소재이다. 따라서 망고스틴 과피의 추출물로 이루어지는 면역 조절제는 이미지가 좋아 환자에게 받아들여지기 쉽다.

망고스틴의 효능에 대해서는, 망고스틴의 추출물로부터 정제된 α-망고스틴 및 γ-망고스틴이, 항히스타민 효과 혹은 항세로토닌 효과를 갖는 것, 또, α-망고스틴 및 γ-망고스틴이 인간 화분증에 대한 억제 효과를 나타내는 것이 알려져 있다 (특허문헌 3). 또, 망고스틴 추출물, 특히 α-망고스틴, γ-망고스틴이 IκB 키나아제에 대한 저해 효과를 갖는 것도 알려져 있다 (특허문헌 4). 또한, 망고스틴 추출물이 아토피성 피부염을 예방/치료하는 효과를 갖는 것도 알려져 있다 (특허문헌 5).

또, 비특허문헌 1 은 γ-망고스틴이 IκB 키나아제 활성을 억제하는 것, 프로스타글란딘 E 의 방출을 억제하고, 그 결과 시클로옥시게나아제 2 유전자의 발현을 억제하는 것을 개시한다. 비특허문헌 2 는, IκB 키나아제 활성 저해제인 IMD-0354 가 면역 이상의 하나인 아토피성 피부염의 치료에 동물 레벨에서 효과를 갖는 것을 개시한다. 비특허문헌 3 은 α-망고스틴이 림프성 백혈병 B 세포에 대해 항증식 효과를 갖는 것을 개시한다. 비특허문헌 4 는 α-망고스틴 및 γ-망고스틴이 인간 백혈병 세포주 HL60 에 대해 항증식 효과를 갖는 것을 개시한다.

비특허문헌 5 는 망고스틴 과피 추출물이 인간 결장 직장 선암의 세포주 COLO205 에 대해 항증식 효과를 갖는 것을 개시한다.

일본 공개특허공보 2008-195713호 일본 공개특허공보 2009-292785호 일본 특허 제3968405호 일본 공개특허공보 2010-195831호 일본 공표특허공보 2009-142320호

Mol. Pharmacol., 66, p667 (2004) J Invest Dermatol., 127, P855 (2007) Planta Med., 75, P243 (2009) J Nat Prod., 66, P1124 (2003) ApplBiotechnol., 162, P1080 (2010)

면역 이상, 특히 과잉의 면역 응답을 조절하기 위한 면역 조절제의 제공.

발명자들은 예의 연구의 결과 망고스틴의 과피로부터 추출한 망고스틴 과피 추출물이 면역을 조절하는 기능을 갖는 것을 알아내어, 이것을 면역 조절제로서 제공한다.

망고스틴 과피 추출물로 이루어지는 면역 조절제는, 세포의 증식 억제, IgE, IFN-γ, TSLP, IL-4, CCL22, CCL24, NGF, AQP3 등의 산생을 억제한다.

망고스틴은 오래전부터 식용되고 있어, 본 발명의 면역 조절제는 안전성이 높다.

도 1 은 세포의 증식에 대해 망고스틴 과피 추출물이 나타내는 효과를 조사한 결과이다.
도 2 는 IgE 산생에 대해 망고스틴 과피 추출물이 나타내는 효과를 조사한 결과이다.
도 3 은 사이토카인의 산생에 대해 망고스틴 과피 추출물이 나타내는 효과를 mRNA 레벨에서 조사한 결과이다.
도 4 는 사이토카인의 산생에 대해 망고스틴 과피 추출물이 나타내는 효과를 mRNA 레벨에서 조사한 결과이다.
도 5 는 TSLP 의 산생에 대해 망고스틴 과피 추출물이 나타내는 효과를 mRNA 레벨에서 조사한 결과이다.
도 6 은 사이토카인, 케모카인 등의 내인성 단백질의 산생에 대해 망고스틴 과피 추출물이 나타내는 효과를 mRNA 레벨에서 조사한 결과이다.

본 발명은 망고스틴 과피 추출물로 이루어지는 면역 조절제를 제공한다. 망고스틴 과피 추출물로 이루어지는 면역 조절제는 세포의 증식을 억제한다.

세포의 종류는 한정되지 않지만, 세포는 케라티노사이트, 비만 세포 및 B 세포를 예로서 들 수 있다. 또, 망고스틴 과피 추출물로 이루어지는 면역 조절제는 IFN-γ 의 산생을 억제한다. 또, 망고스틴 과피 추출물로 이루어지는 면역 조절제는 TSLP 의 산생을 억제한다. 나아가서는, 망고스틴 과피 추출물로 이루어지는 면역 조절제는 IL-4, CCL22 (MDC), CCL24 (Eotaxin-2), NGF, AQP3 의 산생을 억제한다.

또, 본 발명은 α-망고스틴으로 이루어지는 면역 조절제를 제공한다. α-망고스틴으로 이루어지는 면역 조절제는 세포의 증식, 또, IgE, IFN-γ 또는 TSLP 의 산생을 억제한다.

또, 본 발명은 γ-망고스틴으로 이루어지는 면역 조절제를 제공한다. γ-망고스틴으로 이루어지는 면역 조절제는 세포의 증식, 또, IgE, 또는 IFN-γ 의 산생을 억제한다.

나아가 본 발명은 상기에 기재된 면역 조절제 중 어느 것을 함유하는, 면역 조절을 위한 음식품을 제공한다.

망고스틴은 물레나무과 가르시니아속에 포함되는 식물이다. 망고스틴의 과피는 망고스틴 과실 (날것 또는 건조품) 로부터 얻어지는 것을 사용할 수 있다.

망고스틴 과피 추출물이란, 망고스틴 과피로부터 용매에 의해 추출된 추출물을 말한다. 추출에 사용되는 용매는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 극성 용매이며, 바람직한 예로서 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 2-프로판올, n-부탄올, 아세톤, 아세트산에틸, 및 물로 이루어지는 군에서 선택되는 극성 용매 혹은 그들의 혼합 용매를 들 수 있다. 경구 투여제 또는 음식품으로서 사용하는 것을 고려하면, 추출 용제로서, 에탄올, 또는 물과 에탄올의 조합을 사용하는 것이 안전성 면에서 바람직하다. 추출의 온도는 특별히 규정하지는 않지만, 추출 효율 면에서, 실온 내지 용매의 비점 온도의 범위가 바람직하다. 추출 시간은 용매의 종류, 과피의 상태 (날것 또는 건조품, 분쇄물 또는 분말 등) 및 추출 온도에 따라 변화되지만, 0.5 ∼ 24 시간의 범위가 바람직하다.

추출물은 필요애 따라 이배퍼레이터 등에 의해 추출 용제를 농축시키거나, 혹은 제거해도 된다. 또, 추출물은 필요에 따라 용매 분획이나 크로마토그래피에 의해 정제하여 사용할 수도 있다.

면역 조절제란, 면역 응답을 조절하는 조절제를 가리키며, 본 발명에 있어서는 보다 바람직하게는 과잉의 면역 응답을 억제하는 조절제를 가리킨다. 면역 조절의 예로는, 세포의 증식 억제, 항체, 특히 바람직하게는 IgE 의 산생 억제, 사이토카인, 케모카인과 같은 면역 응답에 관련된 내인성 단백질, 예를 들어, IFN-γ, TSLP, IL-4, CCL22, CCL24, NGF, AQP3 의 억제를 들 수 있다.

α-망고스틴이란, 다음의 (1) 의 구조를 갖는 화합물로서, 망고스틴 과피로부터 추출이 가능하다.

[화확식 1]

γ-망고스틴이란, 다음의 (2) 의 구조를 갖는 화합물로서, 망고스틴 과피로부터 추출이 가능하다.

[화학식 2]

실시예 1

·망고스틴 과피 추출물의 조제

망고스틴의 미건조 과피 100 g 을 분쇄하여, 1 ℓ 의 70 ％ 에탄올 중에서 1 시간, 80 ℃ 에서 교반 추출하였다. 이것을 여과하여, 여과액을 이배퍼레이터로 감압 건조시켜, 27.4 g 의 추출물을 얻었다. 이것을 망고스틴 과피 추출물로 하였다. 이하, 본 명세서 중에서, 이 추출물을 ME70 이라 호칭하는 경우가 있다.

·α-망고스틴, γ-망고스틴의 조제

망고스틴의 미건조 과피 1 ㎏ 을 10 ℓ 의 메탄올에 침지시켜, 24 시간 실온하 추출하였다. 여과 후, 여과액을 이배퍼레이터로 감압 건조시켜, 80 g 의 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물 80 g 을 350 ㎖ 의 아세트산에틸에 용해시킨 후, 200 ㎖ 의 물로 2 회 세정하였다. 아세트산에틸 획분을 이배퍼레이터로 용매를 증류 제거시켜 20 g 의 건조물을 얻었다. 이 건조물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 용출은 헥산-아세트산에틸계로 점차 극성을 높이는 그라디언트 용출을 실시하여 3 개의 획분을 얻었다. 맨 처음에 얻어진 획분 (5 g) 을 재차 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산-아세트산에틸, 10 : 90 → 30 : 70 → 50 : 50) 로 정제하여, 황색 결정상의 시료로서 α-망고스틴 2 g 을 얻었다. 2 번째의 획분 (2 g) 을 재차 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산-아세트산에틸, 30 : 70 → 50 : 50, 계속해서 아세트산에틸만, 마지막으로 아세트산에틸-메탄올, 50 : 50) 로 정제하여, 황색 비결정상의 시료로서 γ-망고스틴 500 ㎎ 을 얻었다.

실시예 2

·시험법

케라티노사이트 세포, 비만 세포, 및 B 세포의 세포주의 증식에 대해 망고스틴 과피 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴이 나타내는 효과를 조사하였다.

마우스 케라티노사이트 세포주 PAM212 는 DMEM (Invitrogen, Carlsbad, USA, Cat. No.12100-046) 배지 (10 ％ FCS, 100 U/㎖ P-S 함유) 에서 배양하였다. 마우스 비만 세포주 P815 는 RPMI 1640 배지 (10 ％ FCS, 100 U/㎖ P-S 함유) 에서 배양하였다. 마우스 B 세포주 BCL1 은 RPMI 1640 배지 (10 ％ FCS, 100 U/㎖ P-S 함유) 에서 배양하였다.

각 세포의 현탁액에 여러 가지 농도의 시료 (망고스틴 과피 추출물 (ME70), α-망고스틴, γ-망고스틴, IMD-0354, FK506) 를 첨가하고, 96 웰 플레이트에 파종 하였다 (100 ㎕/well). 대조군으로서, 시료를 첨가하지 않은 군을 형성하였다. FK506 은 공지된 면역 억제제이다.

또한, PAM212 는 2 × 10⁴ 세포/㎖ 의 농도로 파종을 실시하였다. P815 는 5 × 10⁴ 세포/㎖ 의 농도로 파종을 실시하였다. BCL1 은 2 × 10⁵ 세포/㎖ 의 농도로 파종을 실시하였다.

파종 24, 48, 72 시간 후에 trypan blue dye exclusion test 에 의해 생세포 수의 측정을 실시하였다.

·결과

결과를 표 1 및 도 1 에 나타낸다. 망고스틴 과피 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴은 마우스 케라티노사이트 세포주 PAM212 의 증식을 억제하였다. IC50 은 각각 5.9 ㎍/㎖, 3.8 μM, 1.6 μM 이었다.

망고스틴 과피 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴은 마우스 비만 세포주 P815 의 증식을 억제하였다. IC50 은 각각 7.7 ㎍/㎖, 3.0 μM, 3.1 μM 이었다.

망고스틴 과피 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴은 마우스 B 세포주 BCL1 의 증식을 억제하였다. IC50 은 각각 4.9 ㎍/㎖, 2.2 μM, 1.0 M 이었다.

또, 본 실험에서 사용한 망고스틴 과피 추출물에는 α-망고스틴, γ-망고스틴이 각각 13.2 ％, 12.4 ％ 함유되고, 분자량이 각각 410.466, 396.439 인 것을 고려하여, 이하의 식에 의해 구하였다.

α-망고스틴의 기여율 = {(망고스틴 과피 추출물의 IC₅₀) (㎍/㎖) × 0.131 ÷ 410.466 ÷ 1000 × 10⁶} ÷ (α-망고스틴의 IC₅₀) (μM) × 100

γ-망고스틴의 기여율 = {(망고스틴 과피 추출물의 IC₅₀) (㎍/㎖) × 0.024 ÷ 396.439 ÷ 1000 × 10⁶｝÷ (γ-망고스틴의 IC₅₀) (μM) × 100

실시예 3

·시험법

SPF 환경하의 NC/Tnd 마우스 (7 ∼ 9 주령) 로부터 비장을 단리하여, RPMI 1640 배지 중에서 호모게나이즈 후, 70 ㎛ 메시 필터에 의해 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 원심 분리 후 (1200 rpm, 4 ℃, 5 분), 1 × 10⁸ 세포/㎖ 의 농도가 되도록 Robosep 버퍼 (Stemcell Technologies Inc, Vancouver, Canada, Cat. No.20104) 에 재현탁하였다. Mouse CD19 positive selection kit (Stemcell Technologies Inc, Vancouver, Canada, Cat. No.20000) 를 사용하여, ROBOSEP (Stemcell Technologies Inc, Vancouver, Canada, Cat. No.20104) 에 의해 CD19 양성의 세포를 분리하였다. 원심 분리 후 (1200 rpm, 4 ℃, 5 분), 5 × 10⁵ 세포/㎖ 가 되도록 RPMI 1640 배지 (10 ％ FCS, 50 U/㎖ P-S, 1 × 10^-4 M 2-ME 함유) 에 현탁하였다. 500 U/㎖ rmIL-4 (R＆D system, Inc., Minneapolis, USA, Cat. No.404-ML-010) 와 10 ㎍/㎖ LPS (Sigma, St.Louis, USA, Cat. No.L6143) 와 함께, 각 농도의 시료를 첨가하고, 96 웰 플레이트에 파종하였다 (200 ㎕/well). 대조군으로서, 시료를 첨가하지 않은 군을 형성하였다. 37 ℃, 5 ％ CO₂ 조건하에서 9 일간 배양한 후, 배양액 상청을 회수하여, ELISA 에 의해 IgE 농도를 측정하였다.

·결과

마우스 비장으로부터 단리된 B 세포에 대해, 망고스틴 과피 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴은 IL-4 와 LPS 에 의해 유도되는 IgE 의 산생을 억제하였다. 결과를 표 1 및 도 2 에 나타낸다. IC50 은 각각 4.8 ㎍/㎖, 2.5 μM, 1.6 μM 이었다.

실시예 4

In vitro 에 있어서의 사이토카인 산생에 대한 영향 (메신저 RNA (mRNA) 레벨에서의 해석)

·시험법

컨벤셔널 환경하에서 피부염을 발증시킨 NC/Tnd 마우스 (12 ∼ 17 주령) 로부터 겨드랑이 림프절을 단리하여, RPMI 1640 배지 중에서 호모게나이즈 후, 70 ㎛ 메시의 필터에 의해 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 원심 분리 후 (1200 rpm, 4 ℃, 5 min), 2 × 10⁶ 세포/㎖ 의 농도가 되도록 RPMI 1640 배지 (10 ％ FCS, 50 U/㎖ P-S, 1 × 10^-4M 2-ME 함유) 에 현탁하였다. 1 ㎍/㎖ 포크위드미토겐 (PWM ; Sigma, St.Louis, USA, Cat. No.L6143) 과 함께, 각 농도의 샘플을 첨가하고, 24 웰 플레이트에 파종하여 (1 ㎖/well), 37 ℃, 5 ％ CO₂ 조건하에서 24 시간 배양하였다. 대조군으로서, PWM 을 첨가하지 않은 군 (도 3, 4 에서는 배지로 나타낸다), 또, PWM 만을 첨가하고 샘플을 첨가하지 않은 군을 형성하였다 (도 3, 4 에서는 PWM 으로 나타낸다). 그 후, TAKARA FastPure RNA kit (TAKARA Bio Inc., Shiga, Japan, Cat. No.9190) 에 의해 토탈 RNA 를 단리하여, TAKARA PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis kit (TAKARA Bio Inc., Shiga, Japan, Cat. No.6110A) 를 사용하여 cDNA 를 제조하여, 리얼 타임 PCR 을 실시하였다. 또한, 내재성 컨트롤로서 β-actin 을 사용하여, 비교 CT 법 (ΔΔCT 법) 에 의한 비교를 실시하였다. ΔΔCT 법은, 1 사이클의 검출의 차이로, 발현량에 2 배량의 차이가 있다는 이론을 기초로, 기준이 되는 군과 비교하여, 조사하고자 하는 군이 몇 사이클 빠르거나, 혹은 몇 사이클 늦게 Threshold Line 에 도달하는가에 주목하여, 발현량을 상대 정량하는 방법이다. ΔΔCT 법에 있어서는 PWM 을 첨가하지 않은 군 (배지) 을 기준으로 하였다.

·결과

결과를 도 3, 4 에 나타낸다. 마우스 겨드랑이 밑 림프절로부터 단리된 림프구에 대해, 망고스틴 과피 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴은 PWM 에 의해 유도되는 IFN-γ 의 mRNA 의 발현 상승을 억제하였다. IC50 은 각각 6.2 ㎍/㎖, 3.6 μM, 3.6 μM 이었다. 한편, IL-4, IL-5, IL-13 에 대해서는 유의한 억제를 나타내지 않았다.

실시예 5

In vitro 에 있어서의 TSLP 산생에 대한 영향 (mRNA 레벨에서의 해석)

·시험법

NC/Tnd 마우스 신생아 (1 - 3 일) 를 도살하고, 피부를 가위로 잘라내었다. 피하 지방을 물리적으로 제거한 후, 6 ㎜ 펀치에 의해 피부 샘플을 얻었다. 0.25 ％ 트립신-EDTA 용액에 피부 샘플을 띄워, 4 ℃ 에서 1 시간 배양한 후, 37 ℃ 에서 30 분 배양하였다. 핀셋을 사용하여 피부 샘플로부터 표피를 단리하여, 24 웰 플레이트에서 배지에 띄웠다. 여러 가지 농도의 시약을 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간, 전 (前) 배양한 후, TNF-α (25 ng/㎖), IL-1β (10 ng/㎖) 를 첨가하고 37 ℃, 5 ％ CO₂ 조건하에서 배양하였다. 대조로서, 시약도 TNF-α, IL-1β 도 첨가하지 않은 군 (도 5 중 가장 좌측), TNF-α, IL-1β 만을 첨가한 군 (도 5 중 왼쪽으로부터 2 번째) 을 형성하였다. 24 시간 후, Takara RNA Fastpure 를 사용하여 토탈 RNA 를 추출하여, 리얼 타임 PCR 을 실시하였다. 또한, 내재성 컨트롤로서 β-actin 을 사용하여, ΔΔCT 법에 의한 비교를 실시하였다. ΔΔCT 법에 있어서는, 시약도 TNF-α, IL-1β 도 첨가하지 않은 군을 기준으로 하였다.

·결과

결과를 도 5 에 나타낸다. 표피 조직 배양계에 있어서, TNF-α 와 IL-1β 의 공첨가에 의해 유도되는 TSLP 의 mRNA 의 발현 상승에 대해, 망고스틴 과피 추출물, α-망고스틴은 발현 억제 작용을 나타내었다.

실시예 6

·시험법

컨벤셔널 환경하에서 아직 피부염을 발증시키지 않은 NC/Tnd 마우스 (5 - 6 주령) 를, 대조 사료 투여군, 망고스틴 과피 추출물을 함유하는 혼이 (混餌) 사료의 투여군인 망고스틴 투여군의 2 군 (각 군 n = 7) 으로 나누었다. 어느 군도 컨벤셔널 환경하에서 대조 사료를 사용하여 1 주간의 예비 사육을 실시한 후, 각각의 시험 사료를 자유 섭취시켰다. 즉, 망고스틴 투여군에는 망고스틴 과피 추출물을 0.25 ％ 함유하는 혼이 사료를 주고 (망고스틴 과피 추출물의 섭취량은 250 ㎎/㎏/day 가 된다), 대조 시료 투여군에는 CRF-1 (오리엔탈 효모사) 을 투여하였다. 시험 사료를 6 주간 투여한 후, 경추 탈구에 의해 마우스를 도살하여, 6 ㎜ 펀치에 의해 피부 샘플을 얻었다.

얻어진 피부 샘플은, TAKARA FastPure RNA kit (TAKARA Bio Inc., Shiga, Japan, Cat. No.9190) 를 사용하여 토탈 RNA 를 단리하고, TAKARA PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis kit (TAKARA Bio Inc., Shiga, Japan, Cat. No.6110A) 를 사용하여 cDNA 를 제조하여, 여러 가지 사이토카인이나 케모카인, 신경 섬유의 신전 조절에 관련된 NGF 나 세마포린 3a (Sema3a), 세포 증식 제어 인자인 AQP3 의 mRNA 발현량을 해석하기 위해 리얼 타임 PCR 을 실시하였다. 또한, 내재성 컨트롤로서 β-actin 을 사용하여, ΔΔCT 법에 의한 비교를 실시하였다. ΔΔCT 법에 있어서는 대조 사료군을 기준으로 하였다.

·결과

결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 에 있어서, 세로축은 대조 사료군에서의 값을 1 로 한 상대값이다. 망고스틴 과피 추출물 투여군에서는, 피부의 TSLP, IL-4, IFN-γ, CCL22 (MDC), CCL24 (Eotaxin-2), NGF, AQP3 의 mRNA 의 발현량이 유의하게 낮았다.

이 출원은 2012년 7월 19일에 출원된 일본 특허출원 제2012-160429호로부터의 우선권을 주장하는 것으로, 그 내용을 인용하여 이 출원의 일부로 하는 것이다.

Claims

망고스틴 과피 추출물로 이루어지는 면역 조절제.
제 1 항에 있어서,
세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,
IFN-γ 의 산생을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
TSLP 의 산생을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
제 3 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포가 케라티노사이트, 비만 세포 및 B 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 제 2 항 혹은 제 2 항에 관련된 면역 조절제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
IL-4, CCL22 (MDC), CCL24 (Eotaxin-2), NGF, AQP3 중 적어도 어느 1 종류의 산생을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
α-망고스틴으로 이루어지는 면역 조절제.
제 7 항에 있어서,
세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
IgE, IFN-γ 또는 TSLP 중 적어도 어느 1 종류의 산생을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
γ-망고스틴으로 이루어지는 면역 조절제.
제 10 항에 있어서,
세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
제 10 항 또는 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
IgE 또는 IFN-γ 중 적어도 어느 1 종류의 산생을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 조절제.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 조절제를 포함하는 면역 조절을 위한 음식품.