KR20150034243A - 프로바이오틱 캡슐화용 마이크로입자, 그의 제조 및 이용 - Google Patents

프로바이오틱 캡슐화용 마이크로입자, 그의 제조 및 이용 Download PDF

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이레네 에스파르짜 까딸란
카를로스 가마쪼 데 라 라실랴
카롤리나 곤잘레스 페레로
까를로스 하비에르 곤잘레스 나바로
후안 마뉴엘 이라쉬 가레타
레베카 페날바 소브론
아나 로모 후알데
라켈 비르또 레싸노
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쎈뜨로 나씨오날 데 테끄놀로히아 이 세구리다드 알리멘따리아, 라보라토리오 델 에브로
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Abstract

본 발명은 카세인 및 키토산에 의해 형성된 매트릭스, 및 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 마이크로입자에 관한 것이다; 상기 매트릭스는 (i) 가공, (ii) 저장 및 (iii) 위장관을 통한 통과 동안 상기 프로바이오틱 박테리아를 보호하여, 그그의 수명을 연장시킨다. 본 발명은 마이크로입자의 수득 방법 및 그를 포함하는 생성물 및 조성물에도 관한 것이다.

Description

프로바이오틱 캡슐화용 마이크로입자, 그의 제조 및 이용{MICROPARTICLES FOR THE ENCAPSULATION OF PROBIOTICS, PREPARATION AND USES THEREOF}
본 발명은 식품, 뉴트라슈티컬 (nutraceutical), 코스메슈티컬 (cosmeceutical) 및 약학 기술 범주에 포함된다. 구체적으로, 본 발명은 카세인 및 키토산 및 프로바이오틱 박테리아에 의해 형성된 매트릭스를 포함하는 마이크로입자, 그 마이크로입자의 수득 방법 및 그의 적용에 관한 것이다.
일반 사항
건강한 성인의 장내 세균총은 비교적 안정하고, 숙주의 건강에 중요한 역할을 하는 락토바실러스 (lactobacillus) 및 비피더스균 (bifidobacterium) 종으로 주로 구성된 각종 유익한 세균군을 함유한다. 유익한 결장 세균총의 불균형은, 위장관 감염, 변비, 과민성 대장 증후군, 염증성 장 질환, 알러지, 심장 질환 및 결장암과 같은 상이한 질병들의 발생에 기여할 수 있다. 세계 보건 기구 (World Health Organization: WHO)는 이들 위험의 예방을 위하여 유익한 미생물 또는 프로바이오틱의 치료 및 예방 능의 이용을 권장하였다.
프로바이오틱은 충분한 양으로 투여시, 숙주에 유익한 생리학적 효과를 제공하는 살아있는 미생물로서 정의된다 (Perez-Luyo, 2008). 이런 의미에서, 이들은 락토오스 소화에서의 도움, 장 감염 예방, 면역조절 작용, 암 및 심혈관 질환 예방의 원인이 된다. 추가적으로, 충치 예방에서 프로바이오틱의 가능한 역할은 연구 중에 있다.
프로바이오틱을 섭취하는 4가지 기본적인 방법이 있다: 농축 배양물로서, 음료에 첨가된 형태 (예로서, 과일 주스, 등), 프리바이오틱 (prebiotic) 섬유 중에 접종된 형태, 건강 보조식품으로서, 동결건조된 세포 제형 (예로서, 분말, 캡슐, 정제, 등) 및 우유-기반 식품 중 접종된 형태.
프로바이오틱 박테리아는 광범위한 식품, 주로 유제품 (요거트, 치즈, 아이스크림, 우유-기반 디저트, 등) 뿐만 아니라, 씨리얼, 주스, 초콜렛, 등과 같은 다른 식품에도 혼입되어 왔다.
그러나, 가공 및/또는 보존 동안 이들 생성물 중 프로바이오틱의 생존률은 매우 낮으며 (De Vos et al., 2010), 이들 미생물이 언급된 유익한 효과를 생산하기 위해서는, 이들은 섭취시 생육 상태로 남고, 적당한 농도로 존재하여야만 한다. 프로바이오틱 배양물의 생육력을 감소시키는 원인이 되는 몇가지 인자, 예로서 식품 가공/생산 종료시 산도, 그의 생애에 걸쳐 또는 산성화 후 생산된 산도, 발효 대사산물에 의한 저해, 영양분 결핍, 포장 투과도, 삼투압, 저장 온도, 다른 미생물 종과의 상호작용, 등이 존재한다. 일반적으로, 그 생애에 걸쳐 생성물의 산성이 더욱 강하면, 비피도박테리아 (Bifidobacteria) 및 L. 애시도필러스(L. acidophilus)와 같은 프로바이오틱 박테리아의 생육력은 더욱 낮다.
프로바이오틱 생육력을 개선시키기 위한 전략에는 내산성 균주의 선발, 프로바이오틱 미생물의 초기 농도의 증가, 또는 그의 생애에 걸쳐 활성인 대사를 유지하는 적합한 프리바이오틱의 첨가, 낮은 산성화후 수준, 및 원하지 않는 발효 대사산물의 형성의 방지가 포함된다. 프로바이오틱 농축물은 종종 이용 전 및 식품 및/또는 뉴트라슈티컬 생성물으로의 혼입 후 장기간 동안 저장된다는 것을 고려하여, 이 전체 기간에 걸친 세균 생육력의 유지를 가능하게 하는 계(system)를 찾고, 이에 따라 생성물 저장 수명을, 가능한 경우 추가적인 경제적 비용을 막기 위하여 특정 온도 및 습도 조건의 이용을 필요로 하지 않으면서, 연장시키는 것은 매우 중요하다.
프로바이오틱의 이용시 고려되어야할 관련 측면은, 이들이 상기 언급된 인간 건강에 유익한 효과를 생성하므로, 이들이 결장까지 여전히 생육상태로 도달하여야만 하며, 이에 의하여 이들은 상부 위장관의 장벽, 즉 위 내 산성 및 소화 효소와 소장 내 담즙염을 극복하는 것이 요구된다.
또한, 프로바이오틱 박테리아는 동결, 건조, 산소에의 노출, 온도, 배양 매질 중 고농도의 젖산, 등과 같은 산업적 수준에서의 생산 동안의 각종 스트레스 인자에 노출된다.
전술한 내용 고려시, 기재된 불리한 환경 조건 하에서 주어진 그의 생육력을 유지하기 위한 대안으로서 살아있는 프로바이오틱을 캡슐화하는 가능성은 (Borgogna et al., 2010; Ding and Shah, 2008) 오늘날 큰 관심을 얻고 있다. 이들 기술은, 이를 통해 수득되는 이익이 여전히 개선될 수 있지만, 수년 동안 사용되어 왔다.
이제까지 설계된 대부분의 프로바이오틱 마이크로캡슐화 방법은 크게 3 군으로 구성된다: 산업적 수준으로 확장가능한 (scalable) 압출, 유액 및 분무-건조 (Heidebach et al., 2011). 압출 방법은 쉽게 확장가능한 기술은 아니어서 다량의 생성물을 얻는 것을 어렵게 만들지만, 세균에 유해하지 않은 간단하고 경제적인 방법이다. 유화는 문헌에서 가장 흔히 기재된 프로바이오틱 박테리아를 캡슐화하기 위한 기술이지만, 계면활성제 및 오일의 이용을 필요로 하는 더욱 복잡한 기술이어서, 이는 경제적으로 다소 실행불가능하며, 이들이 혼입되는 생성물의 관능 성질 및 질감에 영향을 미칠 수 있고, 저지방 식품의 개발에 적합하지 않다. 분무 건조 ("분무")에 의한 마이크로캡슐화는 간단하고 경제적인 공정이지만, 미생물의 동시적인 탈수 및 열 불활성화 공정 결과로서 높은 세균 사망율을 유발한다.
일반적으로, 프로바이오틱을 캡슐화하는데 가장 적합한 마이크로캡슐은 하기 필요조건을 따라야 한다 (Heidebach et al., 2011):
· 세균 생육력의 양보없이, 간단하고 경제적인 공정을 통하여 수득될 것.
· 그들이 혼입되는 식품의 관능 성질의 변경을 방지하는데 적합한 크기 및 특징을 가질 것 (100㎛ 초과의 크기를 갖는 입자들은 소비자에 의해 의식될 수 있다).
· 불리한 환경 조건으로부터 프로바이오틱을 보호할 것 (기질, 가공, 저장, 등).
· 프로바이오틱을 안정화하고, 상부 위장관의 조건으로부터 유래된 스트레스로부터 그를 보호할 것.
· 생균을 장으로 유리시킬 것.
모든 바람직한 필요조건, 또는 적어도 대부분의 관련 필요조건을 따르는 제제는 이제까지 개발되지 않았다.
프로바이오틱 박테리아를 캡슐화하는데 사용되는 재료들 중 하나는, 전체 우유 단백질의 약 80%를 구성하는 공액된 단백질인 카세인이다. 이 단백질을 단독으로 또는 다당류를 포함하는 기타 중합체와 조합하여 프로바이오틱 박테리아를 캡슐화하는데 이용하는 연구가 개발되어 왔으며 (Heidebach et al., 2009, Heidebach et al., 2010. Oliveira et al., 2007), 세균 생육력을 희생하지 않으면서 양호한 캡슐화 효율 결과가 수득된다. 언급된 상기 3개의 논문 중, 앞의 두 논문은 매우 큰 크기의 마이크로캡슐 (100㎛ 초과)을 초래하는 다소 확장불가능한 유화계에 기초한다. 한편, 3개의 나타낸 논문에서 수행된 산성 pH에 대한 내성에 대한 연구는 마이크로입자가 박테리아를 산성으로부터 보호한다는 것을 명확히 보여준다. 그러나, 상기 논문들 중 어느 것도 단지 산성 pH보다 더욱 공격적인 실제 위 조건을 재현하기 위하여 펩신을 이용하여 연구를 수행하지는 않았다 (이 효소는 단백질을 분해하고, 매질에 대한 박테리아 노출을 증가시킬 수 있다). 유사하게, 이들 논문에서 생육력 연구는 시간에 걸쳐 수행되었으며, 캡슐화된 박테리아 제제 및 자유 박테리아 제제 모두에서 박테리아의 매우 현저한 손실이 인정되며, 캡슐화된 박테리아의 경우 60~120일의 저장시 (상이한 조건 하) 더욱 낮은 것으로 관찰된다.
락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)은 가장 흔하게 사용되는 젖산균 중 하나로; 이 박테리아는 인간의 위장관의 건강한 콜로니화를 가능하게 하는 GRAS (Generally Recognized as Safe: 일반적으로 안전한 것으로 여겨지는 것)로서 간주된다. L. 플란타룸 균주는 오늘날 프로바이오틱으로 시판된다. 그러나, L. 플란타룸은 위장 매질 조건에 매우 민감한 박테리아로, 이의 수는 단지 며칠 후에 매우 현저히 낮아지기 때문에, 저장 동안, 심지어는 냉장 하에서도 매우 단기간 동안 유지될 수 있다 (Ayub and Brinques, 2011).
이들 박테리아를 저장 동안 및 위장관 장벽을 통한 통과 동안 모두에서 보호하기 위한 이들의 캡슐화에 대한 두 개의 논문이 최근 발행되었다. 첫번째 논문에서 (Ayub and Brinques, 2011), 저자는 그러한 박테리아의 캡슐화를 위하여 상이한 유형의 제형들을 사용하며, 이들은 모두 알기네이트 및/또는 펙틴 및/또는 키토산 기재이다. 그러나, 이들은 위장관 내성을 개선시키는데 실패하고 있으며, 이들이 4℃에서 저장하는 동안의 생육 세포들의 수를 개선시키기는 하지만, 연구 38일 후 생육 세포들의 수에서의 현저한 감소가 여전히 존재한다. 또다른 논문에서 (Gbassi et al., 2009), 박테리아를 유청 단백질로 코팅된 알기네이트 매트릭스 내에 고정화한 후 박테리아의 내성은 현저히 증가된다. 그러나, 이는 마이크로입자에 관한 것이라기보다는, 거시적 (macroscopic) 입자에 관한 것으로, 이의 관능 성질은 보다 바람직하지 않을 수 있으며, 나아가 보존을 위해 동결건조를 필요로 한다.
또다른 흔히 사용되는 젖산 박테리아는 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei)로, 이의 건강 증진능은 널리 보고되어 왔다. 이는 다른것 들 중, 야쿠르트 (yakult), 케피어 (kephir), 액티멜 (actimel), 제필러스 (gefilus) 및 비피트 (vifit)와 같은 전통적인 발효유를 포함하는 세계적으로 분포된 각종 생성물, 및 파메산 (parmeasan) 및 만체고 (manchego)와 같은 치즈에서 발견될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 박테리아는 이전의 것 (L. 플란타룸)과 동일한 한계를 갖는데, 즉 상부 위장관 조건에 민감하고, 저장 기간 동안 그의 안정성이 매우 제한된다.
추가적으로, 캡슐화 중합체로서 알기네이트를 이용하는 것을 기본으로 하는 프로바이오틱 박테리아를 캡슐화하기 위한 계는 설명되어 왔으며, 이들 경우 중 다수에서 매우 큰 크기의 캡슐이 수득되거나 (700㎛ 내지 2 mm), 또는 다소 확장불가능한 유화 방법이 사용된다. 산성 pH에 대한 박테리아의 내성은, 캡슐화되었을 때 일부 경우들에서 증가되지만, 그러한 논문의 대부분은 효소 존재하에서의 연구를 수행하지 않아서, 위장관 조건이 충실하게 재현되지 않고, 단지 산도에 대한 내성만이 고려된다. 한편, 이들 캡슐화 계는 상이한 조건 하에서의 저장 동안 세균 수에서의 감소를 줄이기도 하지만, 그럼에도 불구하고, 짧은 기간에 걸쳐 현저한 감소가 여전히 존재한다.
따라서, 가공, 저장 및/또는 위장관을 통한 통과 동안, 프로바이오틱 박테리아의 보호를 가능하게 하는 계를 개발할 필요가 여전히 존재하며; 유리하게는 상기 계는, 균일한 크기를 갖고, 그들이 결국 혼입되는 생성물의 관능 성질을 방해하지 않으며, 제어된 조건 또는 환경 조건 하에서의 가공 및 저장 동안 및 위장관을 통한 통과 동안 프로바이오틱 박테리아를 보호할 수 있는, 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 마이크로입자이다.
발명의 개요
본 발명의 발명자들은 전술된 문제들을 해결하는 마이크로입자, 즉 식품 및 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 및 약학 생성물 내 혼입을 위해 프로바이오틱 박테리아를 캡슐화하는 능을 갖는 마이크로입자를 발견하였다. 이들 마이크로입자는, 이들이 혼입되는 식품 또는 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 또는 약학 생성물을 가공시 및 환경 조건 또는 제어된 조건 하에서 연장된 기간에 걸친 저장 동안 모두에서, 외부 약제에 의한 불활성화로부터 프로바이오틱 박테리아를 보호하여, 이들 식품 또는 뉴트라슈티컬 생성물의 저장 수명을 증가시킨다. 나아가, 섭취 후, 이들은 원하는 위치에서의 프로바이오틱 박테리아의 방출을 용이하게 하고, 상부 위장관, 특히 위에서의 "산성-펩신성" 조건에서 이들을 보호한다.
이들 마이크로입자는, 그들이 혼입되는 식품 또는 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 또는 약학 제제 내에서 안정하고 불활성이며, 상기 식품, 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 또는 약학적 매트릭스가 세균 생육력을 희생시키는 것을 방지한다.
또한, 본 발명자들은 산업적 규모로 적용가능한, 간단한 방법으로 이들 마이크로입자를 수득하는 방법을 개발하였다. 이 방법은 계면활성제 또는 유화제, 합성 중합체, 또는 식품 첨가제로서 승인되지 않은 임의의 시약의 사용을 포함하지 않는다. 또한, 이 방법은 수득된 마이크로입자의 크기를 100㎛ 미만으로 제어하여 이들이 소비자에 의해 발견되거나 또는 그들이 혼입되는 생성물의 관능 성질에 부정적인 영향을 미치는 것을 방지하는 것을 가능하게 한다.
마이크로입자는 용해되지는 않지만, 수성 매질 중에 쉽게 재현탁될 수 있어서, 이들이 담긴 프로바이오틱 박테리아를 매질로부터 보호한다. 본 발명의 마이크로입자는 그들이 혼입되는 생성물 내에서 안정하게 유지되어, 환경적 조건 및/또는 제어된 조건 하에서 오랜 저장 기간 후 생육 박테리아 수에서의 현저한 감소가 방지된다. 또한, 이들 마이크로입자는 음료 및 유제품에서 고형 식품에 이르는 상이한 유형의 식품, 및 뉴트라슈티컬 생성물에 적용가능하다. 유사하게, 상기 마이크로입자는 코스메슈티컬 및 약학 제제 내로 제형화될 수 있다.
추가적으로, 상기 마이크로입자는 강한 면역조절 효과를 갖고, T-헬퍼 1 (Th1) 반응의 유도 및/또는 Th1을 향한 면역 반응의 이동을 유리하게 하는 것으로 관찰되어 왔으며, 따라서 이들은 면역계 장애의 예방 및/또는 치료를 위해, 예로서 Th2-매개된 이식 거부반응, 알러지 및 알러지-관련 질환, 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리, 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염 및/또는 점막 감염의 예방 및/또는 치료에서, 면역계 조절 (면역조절성) 조성물의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 마이크로입자는 프로바이오틱 미생물을 캡슐화 및 안정화하기 위한 신규 계를 제공한다. 본 발명에 따르면, 카세인은 오랜 저장 기간 동안의 환경 조건 및 위 조건으로부터 프로바이오틱 박테리아를 보호하기 위한 비히클 (vehicle)로서 키토산과 조합되어 사용됨에 따라, 이들의 생애가 증가되고, 창자 내로의 유리가 용이하게 되어, 이에 따라 이들의 프로바이오틱 효과를 개선시킨다. 나아가, 카세인 그 자체는 캡슐화된 프로바이오틱 박테리아 그 자체의 유익한 효과를 보완하는 중요한 영양 성질을 갖는다.
요약하면, 본 발명의 마이크로입자는 (i) 가공, (ii) 저장 및 (iii) 위장관을 통한 통과 동안 프로바이오틱 박테리아를 보호하는 능력을 갖는다.
따라서 한 측면에서, 본 발명은 매트릭스 및 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 마이크로입자에 관한 것으로, 여기에서 상기 매트릭스는 카세인 및 키토산으로 이루어진다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 의해 제공된 마이크로입자의 수득 방법에 관한 것으로, 이는 카세인 또는 카세인 공급원, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산의 혼합을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 의해 제공된 다수의 마이크로입자를 포함하는 조성물, 또는 본 발명에 의해 제공된 하나 이상의 마이크로입자 및 식품, 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 또는 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 의해 제공된 마이크로입자를 포함하는 식품, 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 또는 약학 생성물에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 상기 마이크로입자, 조성물 또는 생성물의 면역계 조절 조성물의 제조에서의 이용에 관한 것이거나, 또는 달리 말하면, 본 발명은, 면역계 조절 조성물에서의 이용을 위한 본 발명에 의해 제공된 상기 마이크로 입자, 조성물 또는 생성물에 관한 것이다. 상기 면역조절 조성물은 Th1 반응의 유도 및/또는 Th1을 향한 면역 반응 이동, 바람직하게는 Th2로부터 Th1을 향한 이동을 쉽게 하며, 면역계 장애의 예방 및/또는 치료, 예로서 (i) Th2-매개된 이식 거부반응, (ii) 알러지 및 알러지-관련 질환, (iii) 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리, (iv) 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염 및/또는 점막 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 면역계 장애의 예방 및/또는 치료에서 경구 사용을 위한 본 발명에 의해 제공된 마이크로입자, 조성물 또는 생성물에 관한 것이고, 그리고 Th2-매개된 이식 거부반응; 알러지 및 알러지-관련 질환; 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리; 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염, 또는 점막 감염의 예방 및/또는 치료에서 경구 사용을 위한 본 발명에 의해 제공된 마이크로입자, 조성물 또는 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 기타 더욱 상세한 측면은, 보다 상세한 예시 및 설명 모두를 통하여, 가장 관련된 결과를 보여주는 특정 실시예들이 포함된 하기 내용에서 명백하게 될 것이다.
도 1은 분무 건조에 의하여 수득된 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자의 광현미경 영상을 나타낸다: A) 비어있는 마이크로입자 (×20); B) 캡슐화된 L. 플란타룸 (×20)을 가짐. 오른쪽 아래 부분의 수평선은 100 ㎛를 나타낸다.
도 2는 다음 A) 및 B)의 형광 현미경 영상을 나타낸다: A) 형광 마커로 염색된 L. 플란타룸 (×20); B) 캡슐화된 (×20) L. 플란타룸 (형광 마커로 염색됨)을 갖는 분무 건조에 의해 수득된 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자. 오른쪽 아래 부분의 수평선은 100 ㎛를 나타낸다.
도 3은 캡슐화된 (×20) L. 플란타룸 (형광 마커로 염색됨)을 갖는, 칼슘 염 존재하에서 키토산으로 개질된, 분무 건조에 의해 수득된 카세인 마이크로입자의 형광 현미경 영상을 나타낸다. 오른쪽 아래 부분의 수평선은 100 ㎛를 나타낸다.
도 4는 환경 조건 (25℃) 하에서 시간에 따른 L. 플란타룸의 생존을 나타내는 그래프이다: L. 플란타룸의 신선한 현탁액; 비캡슐화 동결건조된 L. 플란타룸; 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Ap); 바닐린 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Bp); TPP 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Cp); 및 칼슘 염 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Dp).
도 5는 모의시험된 위장성 매질 내에서 L. 플란타룸의 생존을 나타내는 그래프이다 (0 내지 2 시간: 모의시험된 위 매질; 2.1 내지 8 시간: 모의시험된 장 매질): L. 플란타룸의 신선한 현탁액; 비캡슐화 동결건조된 L. 플란타룸; 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Ap); 바닐린 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Bp); TPP 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Cp); 및 칼슘 염 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 플란타룸 (제제 Dp). * 표시는 동결-건조 생성물에 대해서 마이크로입자 수에서 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 6은 모의시험된 위장성 매질 중에서 처리된 후 캡슐화된 L. 플란타룸을 이용한 분해 과정 동안, 바닐린 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 (제제 Bp)를 보여주는 주사 전자 현미경 영상을 나타낸다.
도 7은 환경 조건 (25℃) 하에서 시간에 따른 L. 카세이의 생존을 나타내는 그래프이다: L. 카세이의 신선한 현탁액; 비캡슐화 동결건조된 L. 카세이; 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 카세이 (제제 Ac); 바닐린 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 카세이 (제제 Cc); 및 3인산염 (TPP) 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 카세이 (제제 Dc).
도 8은 모의시험된 위장성 매질 내에서 L. 카세이의 생존을 나타내는 그래프이다 (0 내지 2 시간: 모의시험된 위 매질; 2.1 내지 8 시간: 모의시험된 장 매질): 비캡슐화 동결건조된 L. 카세이; 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 카세이 (제제 Ac); 바닐린 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 카세이 (제제 Cc); 및 3인산염 (TPP) 존재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 내에 캡슐화된 L. 카세이 (제제 Dc). * 표시는 동결-건조 생성물에 대해서 마이크로입자 수에서 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 9는 그의 비캡슐화된 형태의 L. 플란타룸 (자유 LP), 캡슐화된 L. 플란타룸 (Bp) 또는 박테리아 (L. 플란타룸) 및 입자의 물리적 혼합물 (물리적 혼합물)로 처리된 마우스들로부터 수득된 말초 림프구의 면역표현형 분석의 결과를 보여주는 막대 차트이다. 점선은 미처리된 대조군에서 수득된 비를 나타낸다.
도 10은 그의 비캡슐화된 형태의 L. 플란타룸 (자유 LP), 캡슐화된 L. 플란타룸 (Bp) 또는 박테리아 (L. 플란타룸) 및 입자의 물리적 혼합물 (물리적 혼합물)로 처리된 마우스들로부터 수득된 말초 림프구의 시험관 내 자극 후 Th1/Th2 비의 지수 결과를 나타내는 막대 차트이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 프로바이오틱 박테리아를 캡슐화하기 위한 마이크로입자의 생산에 관한 것으로, 식품, 뉴트라슈티컬, 약제 또는 코스메슈티컬 매트릭스 내의 혼입 후 그의 불활성화를 방지하거나, 또는 가공 및 제어된 조건 또는 환경 조건 하에서 연장된 저장 기간에 걸친 저장 동안 그를 보호하고, 나아가 일단 섭취된 후 위장관을 통한 이동 동안 "산성-펩틱" 조건으로부터 그를 보호하기 위한 목적을 갖는다.
본 발명의 마이크로입자
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 매트릭스 및 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 마이크로입자, 이하 "본 발명의 마이크로입자"에 관한 것으로, 상기 매트릭스는 카세인 및 키토산으로 이루어진다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "마이크로입자"는 1 밀리미터 (mm) 미만, 일반적으로 약 0.5 내지 999 마이크로미터(㎛), 전형적으로 약 1 내지 900 ㎛의 크기를 갖는 구형 또는 유사한 형태의 콜로이드 계를 지칭하는데 사용된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 1 mm 미만, 일반적으로 약 0.1 내지 999 ㎛, 전형적으로 0.2 내지 900 ㎛, 유리하게는 0.3 내지 500 ㎛, 바람직하게는 0.4 내지 250 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 125　㎛, 더더욱 바람직하게는 0.7 내지 50 ㎛, 여전히 더욱 바람직하게는 1 내지 40 ㎛, 여전히 더더욱 바람직하게는 2 내지 12 ㎛를 포함하는 크기를 갖는다.
본 발명의 범주에서, 용어 "매트릭스"는 코팅제(들) 또는 조성물을 지칭한다. 본 발명에 따라, 상기 매트릭스는 카세인 및 키토산으로 이루어지고, 프로바이오틱 박테리아를 완전히 또는 부분적으로 코팅한다.
용어 "프로바이오틱"은 적합한 양으로 투여시 숙주의 건강에 유익한 생리학적 작용을 나타내는 살아있는 미생물로서 정의된다 (FAO/WHO 2002. 식품에서 프로바이오틱의 평가에 대한 지침서 (Guidelines for the evaluation of probiotics in food), London). 본 발명에 사용된 프로바이오틱은 "프로바이오틱 박테리아", 즉 적합한 양으로 투여시 숙주의 건강에 유익한 생리학적 작용을 나타내는 살아있는 미생물이다. 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리움 또는 락토바실러스 속의 박테리아이다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 L. 플란타룸 및 L. 카세이로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 프로바이오틱 박테리아는 각각 옥수수 사일리지 (silage) 및 치즈로부터 분리된 L. 플란타룸 CECT 220 및 L. 카세이 CECT 475 T이다. 또다른 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 하위종 락티스(lactis)의 균주로, 예컨대 상표명 BB-12® 하에 시판되는 것이 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 용어, "카세인"은 총 우유 단백질의 약 80%를 구성하는 복합단백질을 지칭한다. 이는 글로불린의 정의에 속하는 인단백질형 단백질로, 가용성이고; 높은 보수능을 갖고 20℃, pH 약 4.6에서 침전한다. 이는 4개의 필수 부분들에 의해 형성되고 (αs1-카세인, αs2-카세인, β-카세인 및 κ-카세인), 이들은 그의 아미노산 조성, 그의 전하 분포 및 칼슘 존재 하에서 응집물을 형성하는 경향으로 인하여 서로 상이하다. 우유에서, 카세인은 직경 50 내지 600 nm의 (평균 약 150 nm) 안정한 콜로이드성 마이셀을 형성한다. "키토산"은 키틴의 N-탈아세틸화로부터 유래된 천연 중합체이다 (폴리-N-아세틸-D-글루코사민). 탈아세틸화 과정은 키틴의 분자 사슬로부터 아세틸기를 제거하여 완전한 아미노기 (-NH2)를 남기는 것을 포함한다. 키토산 샘플 내 탈아세틸화 정도는 따라서, 다당류의 서브유닛 중 자유 아미노기의 함량을 지칭하며, 예로서 다른 것들 중 Hidalgo et al. 또는 ASTM F2260-03(2008) 표준 (양자 핵 자기공명 분광법에 의한 키토산 염 중 탈아세틸화 정도의 결정을 위한 표준 시험 방법: Standard Test Method for Determining Degree of Deacetylation in Chitosan Salts by Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 에 의해 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다. 일반적으로, 상용 키토산의 탈아세틸화 정도는 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상이다. 특정 실시형태에서, 키토산의 탈아세틸화 정도는 60% 내지 100%, 전형적으로 75% 내지 95%, 또는 그 이상으로 구성된다. 키토산은 하기 화학식 I의 단량체 단위의 반복에 기초한 아미노다당류 구조를 갖는다:
[화학식 I]
Figure pct00001
식 중, "n"은 정수, 및 나아가 아미노기가 아세틸화된 "m"개의 단위이다. "n+m"의 합은 중합도, 즉 키토산 사슬 내 단량체 단위의 수를 나타낸다.
키토산은 산성 pH에서 주로 양자화되고, 따라서 산성 pH에서 양으로 하전된 다당류이다.
키토산의 분자량은 넓은 범위 내에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자를 수득하기 위해 사용된 키토산의 분자량은 5 내지 850 kDa, 전형적으로는 25 내지 300, 바람직하게는 40 내지 200 kDa, 더욱 바람직하게는 50 내지 150 kDa으로 구성된다.
본 발명의 범주에서, 키토산에 대한 대체물로서 그의 유도체가 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 그러한 유도체는 하나 이상의 히드록실기 및/또는 하나 이상의 아미노기가 개질된 키토산으로서 이해된다. 다른 것들 중, 이들 유도체는 아세틸화, 알킬화 또는 설폰화 키토산, 및 티올화 유도체로, Roberts, Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166에 의해 설명된 것과 같다. 유도체가 사용된 경우, 키토산의 O-알킬 에테르, 키토산의 O-아실 에스테르, 트라이메틸키토산, 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 키토산, 등으로부터 바람직하게 선택된다. 다른 가능한 유도체에는 염, 예컨대 키토산 시트레이트, 키토산 나이트레이트, 키토산 락테이트, 키토산 포스페이트, 키토산 글루타메이트, 등이 포함된다. 임의의 경우에서, 당업자는 최종 제제의 상업적 안정성 및 생육력에 영향을 미치지 않으면서 키토산 상에 만들 수 있는 변경을 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 키토산 유도체는 친수성으로 개질된 키토산이고; 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "친수성으로 개질된 키토산"은 친수성 기, 예컨대 수성 매질 중 키토산 용해도를 증가시키는 기로 개질된 키토산, 예로서 알킬화 키토산 (예로서, 트라이메틸키토산, 등), 설폰화 키토산, 티올화 키토산, 키토산 염 (예로서, 글루타메이트, 염소화물, 락테이트, 아세테이트, 등), 퀴토-올리고당 (quito-oligosaccharide), 등이다. 또다른 특정 실시형태에서, 키토산 유도체는 소수성으로 개질된 키토산이 아니며; 본 명세서에서 사용된 것과 같은, "소수성으로 개질된 키토산"은 소수성 기, 즉 수성 매질 중에서 키토산의 용해도를 감소시키는 기, 예로서 키토산에 증가된 소수성을 부여하기에 충분한 크기를 갖는 알킬 또는 아릴기, 예로서 지방산 또는 알데하이드 잔기, 바람직하게는 3 내지 18 개의 탄소 원자의 포화된 또는 불포화된 지방산, 예로서 팔미트산, 라우르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 카프론산, 카프릴산, 스테아르산, 프로파논 산 또는 부티르산으로 개질된 키토산이다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자의 매트릭스가 카세인 및 키토산 유도체, 예컨대 소수성으로 개질된 키토산으로 이루어지는 경우, 본 발명의 마이크로입자는 알기네이트 또는 소수성으로 개질된 알기네이트 (소수성으로 개질된 키토산과 관련하여 앞서 정의된 것과 같은, 소수성 기로 개질된 알기네이트)로 이루어지는 외부 코팅이 없다.
상기 언급된 것과 같이, 키토산 및 카세인은 본 발명의 마이크로입자의 일부인 매트릭스를 구성한다. 키토산:카세인 중량비는 넓은 범위에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고 특정 실시형태에서, 상기 키토산:카세인 중량비는 1:1-150, 바람직하게는 1:5-100, 더욱 바람직하게는 약 1:14-40이다.
본 발명의 마이크로입자 내에 존재할 수 있는, 매트릭스의 중량 단위 당 프로바이오틱 박테리아의 양은 넓은 범위에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 매트릭스 1 밀리그램 당 106 이상의 콜로니 형성 단위 (CFU/mg), 일반적으로 106 CFU/mg 내지 5x1013　CFU/mg, 바람직하게는 108 CFU/mg 내지 1012 CFU/mg을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 가교결합제를 더 포함한다. 상기 비제한적이고, 예시적인 가교결합제의 예에는 약학적으로 또는 화장용으로 허용가능하거나, 또는 인간이나 동물용 식품에서의 사용에 적합한 2가 금속 양이온; 3인산염; 및 일반적으로 카세인 및/또는 키토산과 화학적 상호작용을 구축할 수 있는 임의의 물질이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "약학적으로 또는 화장용으로 허용가능하거나, 또는 인간이나 동물용 식품에서의 사용에 적합한 2가 금속 양이온"은, 그의 원자가가 2인 임의의 금속 원소로부터 유래하는 양이온, 예컨대 알칼리 토금속, 예로서 칼슘, 마그네슘, 아연 등이거나, 또는 몇 개의 원자가를 갖는 경우, 그 중 2의 원자가이며, 예로서, 철 등이 있으며, 단 이는 약학적으로 또는 화장용으로 허용가능하거나 또는 식품에서의 이용에 적합하다; 특정 실시형태에서, 상기 2가 금속 양이온은 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 가교결합제로서 유용한 2가 금속 양이온은, 수용액 중에서 상기 2가 금속 양이온을 발생시키는 화합물과 같은 상기 금속 양이온의 적합한 공급원에 의해 제공될 수 있으며, 예로서 염화 칼슘, 칼슘 아세테이트, 칼슘 글루코네이트, 칼슘 락테이트, 칼슘 소르베이트, 칼슘 아스코르베이트, 칼슘 시트레이트, 칼슘 프로피오네이트, 칼슘 설페이트 등 또는 상기 화합물들의 혼합물이 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "3인산염"은 3인산의 접합된 염기인 폴리포스페이트 펜타-음이온 (penta-anion)을 포함하는 화합물로, 예로서 흔히 STPP (3인산나트륨) 또는 간단히 "TPP"로 확인되는, 3인산나트륨이 있다.
본 발명에서 가교결합제로서 사용될 수 있는, 카세인 및/또는 키토산과 화학적 상호작용을 구축할 수 있는 물질의 추가적인 예에는 바닐린 [3-메톡시-4-하이드록시벤즈알데하이드], 제니핀 [메틸 (1R,2R,6S)-2-하이드록시-9-(하이드록시메틸)-3-옥사바이시클로[4.3.0]노나-4,8-다이엔-5-카르복실레이트], 등이 포함된다.
특정 실시형태에서, 가교결합제는 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2가 금속 양이온, 3인산염; 바닐린; 제니핀; 또는 이의 임의의 조합이다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 가교결합제는 칼슘 양이온 (Ca2+), TPP 또는 바닐린이다. 또다른 특정 실시형태에서, 가교결합제는 Ca2+이고, 가교결합제는 카세인 및 키토산으로 이루어지는 매트릭스, 프로바이오틱 박테리아 및 가교결합제를 함유하는 혼합물을 가압 처리, 예컨대 100 내지 800 MPa 범위의 압력에서 정수압 (hydrostatic) 사이클 처리시키는 것을 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 둘 이상의 가교결합제, 바람직하게는 2 개의 상이한 가교결합제; 본 발명의 마이크로입자에 결과적으로 존재하는 2 개의 상이한 가교결합제의 상기 조합의 예시적인 예에는 하기의 2원 조합이 포함된다:
- 3인산염, 예로서 TPP, 및 바닐린;
- 3인산염, 예로서 TPP, 및 제니핀;
- 3인산염, 예로서 TPP, 및 약학적으로 또는 화장용으로 허용가능하거나, 또는 인간이나 동물용 식품에서의 사용에 적합한 2가 금속 양이온, 예컨대 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2가 금속 양이온;
- 바닐린 및 제니핀;
- 바닐린 및 약학적으로 또는 화장용으로 허용가능하거나, 또는 인간이나 동물용 식품에서의 사용에 적합한 2가 금속 양이온, 예컨대 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2가 금속 양이온;
- 제니핀 및 약학적으로 또는 화장용으로 허용가능하거나, 또는 인간이나 동물용 식품에서의 사용에 적합한 2가 금속 양이온, 예컨대 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2가 금속 양이온.
본 발명의 마이크로입자는 하나 이상의 가교결합제를 포함하고, 가교결합제와 카세인 및 키토산으로 이루어지는 매트릭스의 중량비는, 가교결합제의 유형에 따라 넓은 범위 내에서 변화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 가교결합제가 TPP인 경우, 가교결합제 (TPP):매트릭스 (카세인 및 키토산) 비는 약 1:0.1-800, 유리하게는 1:1-500, 바람직하게는 약 1:100-300이다. 또다른 특정 실시형태에서, 가교결합제가 바닐린인 경우, 가교결합제 (바닐린):매트릭스 (카세인 및 키토산) 비는 약 1:0.1-500, 유리하게는 1:1-250, 바람직하게는 약 1:50-100이다. 또다른 특정 실시형태에서, 가교결합제는 Ca2+이고, 가교결합제 (Ca2+ 또는 Ca2+ 공급원):매트릭스 (카세인 및 키토산) 비는 약 1:0.1-50, 유리하게는 1:1-25, 바람직하게는 약 1:6-16이다.
또다른 구체적이며 선택적인 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는, 통상의 방법, 예로서 분무 건조를 통하여, 이 마이크로입자의 건조 공정 동안 또는 본 발명의 마이크로입자를 함유하는 현탁액의 건조 공정 동안, 매트릭스 및 프로바이오틱 박테리아를 보호하는 화합물을 더 포함하며, 이하에서 "보호제"라 지칭한다. 실질적으로, 이러한 특징에 맞는 임의의 화합물이 보호제로서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 보호제는 보호 역할에 추가적으로 프리바이오틱으로서의 역할을 하는 일반적으로 적합한 식품 첨가물 또는 당류이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "프리바이오틱"은 프로바이오틱 성장 및/또는 활성을 자극하는 비소화성 식품 성분을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 보호제의 비제한적이며 예시적인 예에는 락토오스, 만니톨, 수크로오스, 말토덱스트린, 글루코오스, 소르비톨, 등 및 예로서 올리고프룩토오스, 펙틴, 이눌린, 갈락토-올리고당, 락툴로오스 (lactulose), 인간 젖 올리고당, 식이 섬유 등, 및 이의 임의의 조합과 같은 프리바이오틱 특징을 갖는 물질들이 포함된다. 특정 실시형태에서, 보호제는 만니톨 또는 수크로오스이다. 본 발명의 마이크로입자가 보호제를 포함하는 경우, 카세인 및 키토산으로 이루어지는 매트릭스와 보호제의 중량비는 넓은 범위 내에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 매트릭스 (카세인 및 키토산):보호제의 중량비는 1:0.1-5, 전형적으로는 1:0.5-4, 바람직하게는 약 1:1이다.
본 발명의 마이크로입자의 수득 방법
또다른 측면에서, 본 발명은 매트릭스 및 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 마이크로입자의 수득 방법에 관한 것으로, 이하에서 "본 발명의 방법"이라 하며, 여기에서 상기 매트릭스는 카세인 및 키토산 (본 발명의 마이크로입자)으로 이루어지고, 이 방법은 카세인 또는 카세인 공급원, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산의 혼합을 포함한다.
카세인은 그 자체로서 혼입될 수 있거나 또는 카세인 공급원에 의해 제공될 수 있다. 간단함을 위해서, 용어 "카세인" 및 "카세인 공급원"은 본 명세서의 상세한 설명에서 상호교환가능하게 사용된다. 사실상 임의의 카세인 공급원이 본 발명의 방법을 실시하는데 사용될 수 있다. 카세인 공급원은 기원이 매우 상이할 수 있으며, 예로서 우유, 콩 등일 수 있다. 특정 실시형태에서, 카세인 공급원은 수용액 또는 현탁액 형태로; 이 경우에서, 카세인은 카세인산 또는 카세인염, 예로서 카세인나트륨의 형태 등일 수 있거나, 또는 카세인의 임의의 다른 가용성 형태일 수 있다. 다른 카세인염, 예로서 카세인칼슘 또는 카세인포스포칼슘이 사용될 수 있지만, 실시에 있어서, 카세인나트륨을 이용하는 것이 더욱 유리하다. 카세인 공급원을 함유하는 수용액 또는 현탁액은 당업자에게 알려진 통상의 방법, 예로서 카세인 공급원을 수성 매질에 첨가함으로써 수득될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은, "수성 매질"은 물을 포함하는 매질이고, 바람직하게는 주로 물을 함유하는 매질, 더욱 바람직하게는 본질적으로 물로 이루어진 수성 매질이다. 상기 수용액에 함유될 수 있는 카세인의 함량은 넓은 범위에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 상기 수용액에 함유된 카세인의 양은 0.1% 내지 10% (중량/부피), 바람직하게는 0.5% 내지 5%, 더욱 바람직하게는 1% 내지 2%로 구성된다. 카세인의 상기 수용액은 바람직하게는 임의의 유기 용매를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하기 위해, 프로바이오틱 박테리아의 현탁액이 유리하게 제조된다. 사실상 임의의 프로바이오틱 박테리아가 사용될 수 있지만, 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리움 또는 락토바실러스 속의 박테리아이다. 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 L. 플란타룸 또는 L. 카세이다. 특정 실시형태에서, 프로바이오틱 박테리아는 L. 플란타룸 CECT 220 및 L. 카세이 CECT 475 T이다. 또다른 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 상표명 BB-12® 하에 시판되는 것과 같은 비피도박테리움 아니말리스 하위종 락티스의 균주이다. 박테리아 현탁액은 프로바이오틱 박테리아에 추가하여, 상응하는 프로바이오틱 박테리아에 적합한 매질을 포함한다. 상기 매질은 당업자에게 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱이 락토바실러스 속의 박테리아, 예로서 L. 플란타룸 또는 L. 카세이인 경우, 상기 매질은 110661 MRS 배양액 (broth) (Merck) [MRS 배양액]으로 확인되는 것과 같은, De Man, Rogosa 및 Sharpe에 따른 락토바실러스용 배양액을 포함하며; 상기 매질은 락토바실러스 및 기타 젖산균이 잘 생장하도록 하고, 임상용 샘플 및 식품, 특히 유제품으로부터의 락토바실러스를 배양 및 풍부화하는데 흔히 사용된다. 일반적으로, MRS 매질은 (g/L 단위): 10 g의 폴리펩톤; 10 g의 고기 추출물, 5 g의 효모 추출물, 20 g의 글루코오스, 1.08 ml Tween®80 (폴리에톡실화 소르비탄 모노올레이트 또는 폴리소르베이트 80), 2 g의 인산 칼륨, 5 g의 나트륨 아세테이트, 2 g 암모늄 시트레이트, 0.2 g의 황산 마그네슘, 0.05 g의 황산 망간을 포함한다. 25℃ 온도에서 매질의 pH는 6.4±0.2이다. 이러한 배지는 모든 락토바실러스 종의 풍부한 성장을 가능하게 한다. 펩톤 및 글루코오스는 질소, 탄소 및 박테리아 성장에 필수적인 기타 성분의 공급원이다. 폴리에톡실화 소르비탄 모노올레이트, 마그네슘, 망간 및 아세테이트는 보조인자를 제공하며, 일부 미생물의 성장을 저해할 수 있다. 암모늄 시트레이트는 그람 (Gram) 음성균의 성장을 저해하는 저해제로서 작용한다.
박테리아 현탁액 중에 존재할 수 있는 프로바이오틱 박테리아의 양은 넓은 범위 내에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 박테리아 현탁액 중 존재하는 프로바이오틱 박테리아의 양은 106 CFU/ml 이상, 일반적으로 106 내지 5×1012 CFU/ml, 바람직하게는 108 내지 1012 CFU/ml이다. 구체적이고 선택적인 실시형태에서, 박테리아 현탁액은 당류, 예컨대 수크로오스 또는 예로서 말토오스 또는 트레할로오스와 같은 기타 적합한 2당류도 함유하며; 이들 화합물은 세포 막과 단백질을 모두 보호하기 때문에 마이크로입자의 건조 공정 동안 일반적으로 중요한 역할을 한다. 2당류는 탈수가 일어날 때 단백질과 수소 결합을 형성하며, 이는 단백질 구조를 유지하고 변성을 방지하도록 한다. 한편, 당류는 탈수 동안 물 분자 대체물로서 작용할 수 있어서, 인지질 이중층 및 막 모두의 극성 기를 둘러싸고, 막 및 단백질의 구조적 온전성을 유지하는 것으로 보인다. 상기 박테리아 현탁액이, 예로서 나타낸 목적을 위한 2당류, 예로서 수크로오스를 함유하는 경우, 상기 박테리아 현탁액 중에 존재하는 2당류 (예로서, 수크로오스)의 양은 0.1% 내지 10% (중량/부피)의 2당류 (예로서, 수크로오스), 바람직하게는 1% 내지 3% (중량/부피)로 구성될 것이다. 키토산의 경우, 사실상 임의의 키토산 또는 그의 적합한 유도체가 본 발명의 방법을 실시하는데 사용될 수 있으며; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 상기 키토산은 60 내지 100%, 바람직하게는 75% 내지 95%의 탈아세틸화도를 갖고, 및 5 내지 850 kDa, 전형적으로는 25 내지 300 kDa, 바람직하게는 40 내지 200 kDa, 더욱 바람직하게는 50 내지 150 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 실시형태에서, 키토산은 수용액 또는 현탁액의 형태이다. 키토산을 함유하는 수용액 또는 현탁액은 당업자에 의해 알려진 통상의 방법, 예로서 키토산을 수성 매질, 예로서 물 또는 주로 물을 함유하는 매질에 첨가함으로써 수득될 수 있다. 상기 수용액 또는 현탁액 중에 함유될 수 있는 키토산의 양은 넓은 범위 내에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 상기 수용액 또는 현탁액 중 함유된 키토산의 양은 0.05% 내지 1% (중량/부피), 바람직하게는 0.1% 내지 0.3%, 더욱 바람직하게는 1% 내지 2%로 구성된다. 키토산의 상기 수용액 또는 현탁액은 바람직하게는 임의의 유기 용매를 함유하지 않는다.
카세인, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산이 본 발명의 방법의 혼합 단계에서 혼합되는 순서는 관계없다. 특정 실시형태에서, 카세인 및 프로바이오틱 박테리아가 먼저 혼합되고, 그 후 키토산이 첨가된다; 또다른 특정 실시형태에서, 카세인 및 키토산이 먼저 혼합되고, 그 후 프로바이오틱 박테리아가 첨가된다; 또다른 특정 실시형태에서, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산이 먼저 혼합되고, 그 후 카세인이 첨가된다; 그리고 또다른 특정 실시형태에서, 카세인, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산이 첨가 및 혼합된다. 특정 실시형태에서, 상기 언급된 것과 같이, 상기 성분들은 카세인의 수용액 형태, 카세인, 프로바이오틱 박테리아의 현탁액 및 키토산 수용액의 형태로 첨가될 수 있다.
카세인, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산은, 프로바이오틱 박테리아의 생육력에 영향을 미치지 않도록, 바람직하게는 실온, 즉 18℃ 내지 25℃, 바람직하게는 20℃ 내지 22℃를 포함하는 온도에서, 유리하게는 교반 하에 혼합된다.
본 발명의 마이크로입자의 형성 전에, 혼합물 중에 존재하는 카세인 및 키토산의 중량비는 넓은 범위 내에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 상기 카세인:키토산의 중량비는 1:0.01-0.5, 바람직하게는 1:0.01-0.1, 더욱 바람직하게는 약 1:0.02-0.07, 또는 달리 말하면, 본 발명의 마이크로입자의 형성 전에 혼합물 중 존재하는 키토산:카세인의 중량비는1:1-150, 바람직하게는 1:5-100, 더욱 바람직하게는 약 1:14-40이다.
본 발명의 마이크로입자의 형성 전에 혼합물 중에 존재하는 프로바이오틱 박테리아와 매트릭스 성분 (카세인 및 키토산)의 비는 넓은 범위 내에서 변화될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아/매트릭스 비는 매트릭스 1 mg 당 106 CFU 이상, 일반적으로 106　CFU/mg 내지 1013 CFU/mg, 바람직하게는 109 CFU/mg 내지 1012 CFU/mg를 포함한다.
상기 언급된 것과 같이 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 가교결합제, 예로서 3인산염 (예로서, 3인산나트륨 (TPP)); 바닐린; 제니핀;예로서, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2가 금속과 같은, 약학적으로 또는 화장용으로 허용가능하거나, 또는 인간이나 동물용 식품에서의 사용에 적합한 2가 금속 양이온; 또는 이의 임의의 조합, 또는 카세인 및/또는 키토산과 화학적 상호작용을 구축할 수 있는 임의의 기타 성분을 더 포함한다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 둘 이상의 가교결합제, 바람직하게는 본 발명의 마이크로입자와 관련하여 상기 언급된 둘 이상의 가교결합제의 조합을 포함한다.
본 발명의 마이크로입자는 하나 이상의 가교결합제를 포함하고, 본 발명의 방법은 하나 이상의 가교결합제를 카세인, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산의 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 가교결합제 (또는 가교결합제들)은 수용액 형태로 상기 혼합물에 첨가될 수 있다. 가교결합제가 칼슘 양이온(Ca2+)인 경우, 이는 상기 양이온의 적합한 공급원, 예컨대 수용액 중에서 상기 2가 양이온을 생성할 수 있는 화합물, 예로서 염화칼슘, 칼슘 아세테이트, 칼슘 글루코네이트, 칼슘 락테이트, 칼슘 소르베이트, 칼슘 아스코르베이트, 칼슘 시트레이트, 칼슘 프로피오네이트, 칼슘 설페이트, 등 또는 상기 화합물의 혼합물에 의해 제공될 수 있다. 본 발명의 마이크로입자는 가교결합제를 포함하며, 첨가되는 가교결합제의 양은 본 발명의 마이크로입자와 관하여 상기 언급된 것과 같은 가교결합제의 성질에 따라 달라진다. 임의의 경우에서, 상기 가교결합제는, 가교결합제가 TPP인 경우, 가교결합제 (TPP):매트릭스 (카세인 및 키토산)의 비가 약 1:0.1-800, 유리하게는 1:1-500, 바람직하게는 약 1:100-300; 가교결합제가 바닐린인 경우, 가교결합제 (바닐린):매트릭스 (카세인 및 키토산)의 비가 약 1:0.1-500, 유리하게는 1:1-250, 바람직하게는 약 1:50-100; 그리고 가교결합제가 Ca2+인 경우, 가교결합제 (Ca2+ 또는 칼슘 공급원):매트릭스 (카세인 및 키토산)의 비가 약 1:0.1-50, 유리하게는 1:1-25, 바람직하게는 약 1:6-16이 되도록 하는 충분한 양으로 첨가될 것이다.
상기 언급된 조건, 즉 실온 및 교반 하에서 카세인, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산 혼합 후, 카세인 및 키토산으로 이루어지는 매트릭스 및 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 본 발명의 마이크로입자가 형성된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 마이크로입자들은, 그들이 형성된 매질 중 현탁액으로 존재한다.
그 후, 바람직한 경우, 카세인, 프로바이오틱 박테리아 및 본 발명의 마이크로입자를 함유한 키토산의 혼합 결과 생성된 현탁액을, 본 발명의 마이크로입자를 건조시키기 위하여, 통상의 방법에 의한, 유리하게는 분무 건조 또는 동결 건조를 통해 건조처리시키고; 이 건조 처리는 본 발명의 마이크로입자를 분말 형태로 수득하는 것을 가능하게 하며, 이는 그의 안정성을 증가시키는데 기여한다. 특정 실시형태에서, 이 건조 처리는, 특히 분무 건조에 의해 또는 동결 건조에 의해 수행되는 경우, 본 발명의 마이크로입자와 관련하여 상기 언급된 것과 같은 보호제를 첨가하는 것을 포함하고, 이는 그의 건조 동안 매트릭스 및 프로바이오틱 박테리아를 보호하고, 예로서 당류 또는 일반적으로 적합한 식품 첨가제는, 보호 역할에 추가하여 프리바이오틱으로서 작용한다. 본 발명의 맥락에서 보호제로서 사용될 수 있는 당류의 비제한적이고 예시적인 예에는, 락토오스, 만니톨, 수크로오스, 말토덱스트린, 글루코오스, 소르비톨, 등 및 예로서 올리고프룩토오스, 펙틴, 이눌린, 갈락토-올리고당, 락툴로오스, 인간 젖 올리고당, 식이 섬유 등과 같은 프리바이오틱 성질을 갖는 다당류가 포함된다. 특정 실시형태에서, 보호제는 만니톨이다. 본 발명의 마이크로입자가 보호제를 포함하는 경우, 이는 적합한 양으로 첨가되고; 카세인 및 키토산으로 이루어지는 매트릭스와 보호제의 중량비는 넓은 범위 내에서 변화될 수 있지만, 특정 실시형태에서, 매트릭스 (카세인 및 키토산):보호제의 중량비는 1:0.1-5, 전형적으로 1:0.5-4, 바람직하게는 약 1:1이다.
본 발명의 방법이 본 발명의 마이크로입자의 현탁액을 건조시키는 것을 포함하는 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 현탁액 및 마이크로입자는 분무건조에 의해 건조되고; 이를 위하여, 본 발명의 마이크로입자 및/또는 카세인, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산, 및 선택적으로 가교결합제 및/또는 보호제의 혼합물을 함유하는 현탁액을 분무건조기 내로 도입시키고, 가공 조건 [공기 유입 온도, 공기 유출 온도, 공기압, 샘플 펌핑 속도, 흡입, 및 기류]을 제어한다. 당업자는 각 경우에 가장 적합한 가공을 설정할 수 있다.
바람직한 경우, 본 발명의 방법은 본 발명의 마이크로입자의 안정화를 위한 추가 단계를 포함할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자의 가교결합이 가교결합제, 예로서 Ca2+와 같은 2가 금속 양이온의 첨가 및 고압 처리에 의하여 수행되는 경우, 본 발명의 방법은 가교결합제, 및/또는 카세인, 프로바이오틱 박테리아, 키토산 및 가교결합제의 혼합물을 더 포함하는 본 발명의 마이크로입자를 함유하는 현탁액을 적합한 용기, 예로서 밀봉되고 하나 이상의 정수압 사이클로 처리되는 비닐백 내로, 100 내지 800 MPa, 바람직하게는 100 내지 400 MPa의 압력에서, 1 내지 30 분, 바람직하게는 2 내지 10 분의 기간 동안 도입시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 높은 정수압 처리는 카세인, 프로바이오틱 박테리아, 키토산 및 가교결합제를 포함하는 상기 혼합물 상에, 100 MPa에서 5-분 사이클, 또는 300 MPa에서 2-분 사이클을 적용하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 카세인, 프로바이오틱 박테리아, 키토산 및 가교결합제 (Ca2+)를 포함하는 혼합물은 100　MPa에서 5-분 사이클로 처리된다. 이러한 고압 처리는, 카세인, 프로바이오틱 박테리아, 키토산 및 가교결합제를 포함하는 혼합물을 분무 건조에 의한 건조 공정 처리하기 전에, 이 혼합물 상에 적용된다. 대안적으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 고압 처리는 가교결합제를 혼입할 필요 없이 마이크로입자 그 자체로 가교결합 가능하게 하는 처리로, 본 발명의 마이크로입자는 가교결합제 부재 하에서 이들을 높은 압력으로 처리시킴으로써 가교될 수 있을 것이다.
본 발명의 방법은 본 발명의 마이크로입자를 건조 분말 형태로 수득하는 것을 가능하게 하며, 이는 제어된 또는 환경 조건 하에서 장기 저장 동안 본 발명의 마이크로입자의 안정성에 기여하며, 이는 다른 의도된 고체 및 액체 생성물 (예로서, 식품 등)에 쉽게 혼입될 수도 있다.
본 발명의 방법을 통하여 수득가능한 마이크로입자는 본 발명의 마이크로입자의 특징을 갖고, 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.
적용
본 발명의 마이크로입자는, 프로바이오틱 박테리아의 캡슐화능, 및 공정 동안 (상기 프로바이오틱 박테리아가 부하된, 카세인 및 키토산으로 이루어지는 매트릭스를 포함하는 마이크로입자의 수득) 및 제어된 조건 또는 환경 조건 하에서 연장된 기간의 저장 조건에 걸친 저장 동안의 그의 보호능을 갖고, 또한 일단 섭취되면 위장관을 통한 통과 동안 그를 보호하는 능을 가져서; 따라서 다른 의도의 생성물 (예로서, 식품 등) 내 혼입 후 프로바이오틱 박테리아의 불활성화가 방지 또는 실질적으로 감소된다.
추가적으로, 본 발명의 마이크로입자는 강한 면역조절 효과를 갖고, 따라서 이들은 면역계 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 면역계 조절 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
따라서 또다른 측면에서, 본 발명은 조성물에 관한 것으로, 이하에서는 다음 (i) 및 (ii)로부터 선택되는 "본 발명의 조성물"이다:
(i) 복수의 본 발명의 마이크로입자로 이루어지거나, 또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 복수의 마이크로입자로 이루어지거나, 또는 복수의 본 발명의 마이크로입자 및 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자로 이루어지는 조성물; 및
(ii) 본 발명의 하나 이상의 마이크로입자, 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자 및 식품, 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 또는 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물.
본 발명의 마이크로입자의 특징은 이미 상기 정의된 것과 같고, 본 명세서에 참고로 통합된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자의 평균 크기는 약 0.5 내지 125 ㎛, 바람직하게는 1 내지 40 ㎛, 더욱 바람직하게는 내지 2 내지 12 ㎛이다. "평균 크기"는 수성 매질 중에서 함께 이동하는, 마이크로입자 군의 평균 직경으로서 이해된다. 이들 계의 평균 크기는 당업자에게 알려진 표준 방법에 의하여 측정될 수 있으며, 예로서 하기 실험 부분에 기재된다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자 중에 존재하는 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리움 및 락토바실러스 속의 박테리아로부터 선택되고; 더욱 특정한 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 L. 플란타룸 및 L. 카세이.로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 프로바이오틱 박테리아는 L. 플란타룸 CECT 220 및 L. 카세이 CECT 475 T이다. 또다른 특정 실시형태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 상표명 BB-12® 하에 시판되는 것과 같은, 비피도박테리움 아니말리스 하위종 락티스의 균주이다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 상기 언급된 것과 같은 가교결합제, 예로서 TPP, 바닐린 또는 2가 금속 양이온, 예로서 Ca2+를 포함한다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 둘 이상의 가교결합제, 바람직하게는 본 발명의 마이크로입자에 관련하여 상기 언급된 두 개의 상이한 가교결합제의 조합을 포함한다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 당류, 예로서 만니톨과 같은 보호제를 포함한다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자는 건조 분말 형태이다.
첫번째 경우에서, 본 발명의 조성물은 (i) 단지 독점적으로 본 발명의 마이크로입자로만 구성 및/또는 본 발명의 방법을 통하여 수득가능한 마이크로입자이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 조성물 (i)는 하기 조성물 A 내지 C로부터 선택된다:
조성물 A:
40 중량% 내지 60 중량%의 카세인,
0.1 중량% 내지 3.5중량%의 키토산,
109 CFU/g 내지 5×1012　CFU/g의 프로바이오틱 박테리아,
0 중량% 내지 0.15 중량%의 3인산나트륨, 및
0 중량% 내지 60 중량%의 보호제;
를 포함하고, 여기에서 중량 비는 조성물의 총 중량에 대한 것인 조성물;
조성물 B:
40 중량% 내지 60 중량%의 카세인,
0.1 중량% 내지 3.5 중량%의 키토산,
109 CFU/g 내지 5×1012　CFU/g의 프로바이오틱 박테리아,
0 중량% 내지 0.6 중량%의 바닐린 및
0 중량% 내지 60 중량%의 보호제;
를 포함하고, 여기에서 중량 비는 조성물의 총 중량에 대한 것인 조성물; 및
조성물 C:
40 중량% 내지 60 중량%의 카세인,
0.1 중량% 내지 3.5 중량%의 키토산,
109 CFU/g 내지 5×1012　CFU/g의 프로바이오틱 박테리아,
0 중량% 내지 10 중량%의 Ca2+, 및
0 중량% 내지 60 중량%의 보호제,
를 포함하고, 여기에서 중량 비는 조성물의 총 중량에 대한 것인 조성물.
두 번째 경우에서, 본 발명의 조성물 (ii)은 하나 이상의 본 발명의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자, 및 식품, 뉴트라슈티컬, 코스메슈티컬 또는 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자, 또는 복수의 본 발명의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법을 통하여 수득가능한 마이크로입자를 포함하는 조성물을 포함하는 식품 또는 사료이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "식품"은 그의 특징, 적용, 성분, 제조 및 보존 상태로 인하여, 일반적으로 또는 이상적으로 다음 목적 중 일부를 위하여 사용될 수 있는, 임의의 천연, 고체 또는 액체, 천연 또는 가공된 임의의 물질 또는 생성물이다: a) 인간 또는 동물의 일반 영양으로서 또는 기호 식품 (pleasurable foods)으로서; 또는 b) 인간이나 또는 동물용 식품의 특별한 경우들에서, 식이성 생성물. 용어 "사료"는, 개별적으로 또는 편의적으로 서로 혼합된, 동물의 식품으로서 적합한 임의의 기원의 모든 천연 재료 및 최종처리된 생성물을 포함한다. 즉석섭취 식품 (ready-to-eat food)은 예로서 소비에 적합한 수성 용액을 이용하여 희석될 필요가 없는 것이다. 원칙적으로, 즉석섭취 식품 내에 존재하는 성분들은 균형잡혀 있고, 먹을 수 있도록 만들기 위하여 추가 성분을 식품에 첨가할 필요가 없는 것으로 당업자에게 고려된다. 농축 (concentrated) 식품은 하나 이상의 성분들이 즉석섭취 식품에서보다 더욱 높은 농도로 존재하며, 따라서 이용을 위해서는 예로서 소비에 적합한 수용액으로써 그를 희석시키는 것이 필요하다. 본 발명에 의하여 제공되는 식품의 비제한적이고 예시적인 예들로는, 유제품 및 파생제품 (derivatives), 예로서 발효유, 요거트, 케피어, 커드 (curd), 치즈, 버터, 아이스크림, 우유-기반 디저트, 등, 및 비-유제품, 예컨대 제빵 제품, 케이크 및 패스트리 (pastry), 씨리얼 (cereal), 초콜렛, 잼, 쥬스, 다른 과일 파생품, 오일 및 마가린, 제조 음식 (prepared dish), 등이 포함된다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자, 또는 복수의 본 발명의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자를 포함하는 조성물을 포함하는 뉴트라슈티컬 조성물이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "뉴트라슈티컬 조성물"은, 건강의 이익을 제공하거나 또는 질환의 예방 또는 감소에 관련된 치료 작용을 갖는 하나 이상의 천연 생성물, 예로서 프로바이오틱 박테리아 등을 포함하는, 인간 또는 동물에서의 이용에 적합한 조성물을 지칭하며, 그리고 이는 식품에 일반적으로 존재하는 (또는 존재하지 않는) 농축된 천연 생활성 생성물의 비-식품 매트릭스 (예로서, 캡슐, 분말, 등)로 제공되는 식이보조식품 (dietary supplmenet)을 포함하며, 이는 그러한 식품 내에 존재하는 것보다 더 높은 복용량으로 섭취된 경우, 정상 식품이 가질 수 있는 효과보다 더욱 큰 건강에 대해 좋은 효과를 낸다. 따라서, 용어 "뉴트라슈티컬 조성물"은 독립된 또는 정제된 식품 생성물 및 정상적으로 경구적으로 사용되는 제형, 예로서 캡슐, 정제, 사쳇 (sachet), 음용 유리병, 등으로 일반적으로 제공되는 첨가제 또는 보조 식품을 포함하고; 그러한 생성물들은, 생리학적 이익 또는 질환, 일반적으로 만성 질환에 대한 보호를 제공한다. 바람직한 경우, 본 발명에 의하여 제공된 뉴트라슈티컬 조성물은, 프로바이오틱 박테리아에 추가하여, 하나 이상의 뉴트라슈티컬 (질환 예방 또는 감소와 관련된 생성물 또는 성분), 예로서, 플라보노이드, 오메가-3 지방산, 등 및/또는 하나 이상의 프리바이오틱 (프로바이오틱 활성 및/또는 성장을 자극하는 비-소화성 식품 성분), 예로서 올리고프룩토오스, 펙틴, 이눌린, 갈락토-올리고당, 락툴로오스, 인간 젖 올리고당, 식이섬유 등을 함유할 수 있다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법을 통하여 수득가능한 마이크로입자, 또는 복수의 본 발명의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법을 통하여 수득가능한 마이크로입자를 포함하는 조성물을 포함하는, 경구, 국소, 직장 또는 질 투여에 적합한 약학 조성물이고; 그러한 목적을 위하여, 상기 조성물은, 예로서 캡슐, 분말, 과립, 정제 (코팅 또는 비코팅됨), 사쳇, 매트랙스, 현탁액 등의 형태의, 경구 투여에 적합한 하나 이상의 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 비히클, 또는 예로서 크림, 연고, 살브 (salve), 등의 형태의, 국소 적용에 적합한 하나 이상의 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 비히클, 또는 예로서 좌약, 등의 형태의, 직장 투여에 적합한 하나 이상의 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 비히클, 또는 볼러스 (bolus), 좌약, 등의 형태의, 질 투여에 적합한 하나 이상의 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함한다. 경구, 국소, 직장 또는 질 투여로 의도된 약학 조성물 제형에 적합한 부형제 및 상기 약학 조성물의 생산에 대한 정보는 책 "Tratado de Farmacia Galenica", by C. Fauli i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones에서 찾을 수 있다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 마이크로입자 또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자, 또는 복수의 본 발명의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자를 포함하는 조성물을 포함하는 화장용 조성물이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "화장용 조성물"은 인간 또는 동물의 개인 위생에서의 이용에 적합한 조성물, 또는 인간 또는 동물 신체의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않으면서 자연미를 증진 또는 신체 외관을 변화시키기 위한 조성물로, 그러한 효과를 제공하는 하나 이상의 생성물을 포함하는 조성물을 지칭한다. 바람직한 경우, 본 발명에 의하여 제공되는 화장용 조성물은, 프로바이오틱 박테리아에 추가하여 하나 이상의 화장용 생성물, 즉 인간 또는 동물 신체의 외적 부분 (표피, 모발계, 손톱, 입술 및 외부 생식 기관)과 또는 치아 및 볼 (buccal) 점막과 접촉하여 배치되도록 의도된 성분 또는 혼합물을 함유할 수 있으며, 이는 그를 청징화, 방향화 (perfuming), 그의 외관 변화, 그를 보호, 그를 양호한 상태로 유지, 또는 체취를 수정하기 위한 배타적인 또는 주요 목적을 위한 것이다. 화장용 생성물의 예시적인 예는 INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients: 국제 화장 성분 명명법) 목록에 포함된 생성물을 포함한다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자, 또는 복수의 본 발명의 마이크로입자 및/또는 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자를 포함하는 조성물을 포함하는 코스메슈티컬 조성물이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "코스메슈티컬 조성물"은 하나 이상의 코스메슈티컬 생성물 (기능성 화장료, 피부개량제 또는 활성 화장료), 즉 사용자의 피부, 모발 및/또는 손발톱에 효과를 미치는 활성 성분을 함유하는 화장-약학 특징을 갖는 국소 혼성 생성물을 보다 높고 보다 유효한 농도로 포함하는 신체 또는 동물 신체에서의 사용에 적합한 조성물을 지칭하며, 따라서 이들은 화장 및 약물 사이의 중간 수준에 위치된다. 코스메슈티컬 생성물의 예시적인 예에는 정유 (essential oil), 세라마이드 (ceramide), 효소, 미네랄, 펩타이드, 비타민, 등이 포함된다. 당업자는 본 발명의 마이크로입자 또는 그를 함유하는 조성물은 식품 또는 사료의 일부, 또는 뉴트라슈티컬, 약학 또는 코스메슈티컬 생성물의 일부일 수 있으며, 이는 본 발명의 추가적인 측면을 구성한다는 것을 이해할 것이다. 상기 생성물은 액체, 반고체 또는 고체 형태일 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 마이크로입자는 강한 면역조절 효과를 갖고, Th1 반응의 유도를 촉진 및/또는 Th1에 대한, 바람직하게는 Th2로부터 Th1를 향한 (실시예 7) 면역 반응을 이동시켜, 따라서 이들은 면역계 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 면역계 조절 조성물의 제조에 예로서, Th2-매개된 이식 거부반응, 알러지 및 알러지-관련 질환, 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리, 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염 및/또는 점막 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용될 수 있다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 하나 이상의 마이크로입자 또는 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 식품, 약학, 코스메슈티컬 또는 뉴트라슈티컬 생성물, 이하 "본 발명의 생성물"의, 면역계 조절 조성물의 제조에서의 이용에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 측면에 따라, 본 발명은, 본 발명의 마이크로입자, 또는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 생성물의 면역계 조절 조성물에서의 이용에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은, "면역계 조절 조성물"은 (이하에서 "본 발명의 면역조절성 조성물") 면역계에서 특정 반응을 자극하여, 이를 더욱 반응성으로 만들어서, 예로서 특정 사이토카인 (cytokine)의 생산을 통하여 면역 반응에 연관된 세포들의 발생에 개입할 수 있는 조성물이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "조성물"은, 상기 기재된 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물을 포함하는 임의의 약학 조성물, 식품 조성물 (식품 또는 사료), 뉴트라슈티컬 조성물 등을 포함한다.
실시예 7에 나타낸 결과는 L. 플란타룸을 함유하는 본 발명의 마이크로입자의 CD1 마우스로의 투여가, 한편으로는 세포독성 림프구의 수에서의 약간의 증가를 유도하고 (CD4+/CD8+ 비에서의 감소에 의해 명확히 나타남) (도 9), 다른 한편으로는 인터류킨-6 (IL-6)의 생산에 비해 인터페론-감마 (IFN-g) 합성에서의 증가를 일으켜, 이에 따라 Th1 프로파일을 향한 면역 반응을 이동시킨다는 것을 명확히 보여준다. 결과에 구속되고자 하지는 않지만, 이들 결과는 면역 반응의 유형을 변경 및 그를 Th1 반응을 향해 이동시키는, 본 발명의 마이크로입자와 면역계간의 가능한 상호작용을 나타내는 것으로 보인다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 바람직하게는 Th1 반응을 유도 및/또는 면역 반응을 Th1를 향해, 바람직하게는 Th2로부터 Th1를 향해 이동시키는 조성물이다. 이러한 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역조절 조성물은 주로 또는 바람직하게는 면역계의 Th1 반응을 자극 또는 유도하여, Th1 면역 반응에 연관된 세포들의 발생에서 IFN-g, 인터페론-알파 (IFN-α), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-18 (IL-18) 등과 같은 특정 사이토카인의 생산을 통하여 이를 더욱 반응성으로 만든다. 당업자는, 본 발명의 마이크로입자의 투여가 바람직하게는 Th1 반응을 유도 및/또는 Th2에서 Th1을 향해 면역반응을 이동시키는지의 여부를 통상의 방법, 예로서 실시예 7에 기재된 분석과 같이, 예로서 Th1 반응, 및 선택적으로 Th2의 특이적 사이토카인을 정량화하는 것에 기초한 방법에 의하여 쉽게 결정할 수 있다.
바람직한 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 경구 투여에 적합한 조성물 (간단함을 위해 때때로 본 명세서에의 기재에서 "경구 조성물"로서 지칭됨)로, 고체, 액체 또는 반고체 제형으로 제공될 것이다. 그러한 목적을 위하여, 본 발명의 상기 면역조절 조성물은 본 발명의 마이크로입자, 또는 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물과 함께, 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함할 것이고; 상기 약학적으로 허용가능한 비히클은 예로서 캡슐, 분말, 과립, 현탁액 등의 형태인 경구 투여에 적합한 하나 이상의 부형제를 포함한다. 당업자는 경구 투여를 위해 의도된 약학 조성물의 제형 및 상기 조성물의 생산 방법에 적합한 부형제를 안다. 예로서, 경구 투여를 위해 의도된 조성물 제제 및 그의 생산에 적합한 부형제에 대한 정보는 책 "Tratado de Farmacia Galenica"에서 찾을 수 있다 [C. Fauli Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones].
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 면역계 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 경구 조성물이고; 상기 면역계 장애는 천연 (유전자) 장애 또는 유도된 장애, 예컨대 감염 과정, 스트레스 등에 의해 유도된 장애일 수 있다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 다음의 예방 및/또는 치료를 위한 경구 조성물이다:
- Th2 반응-매개된 이식 거부반응,
- 알러지 및 알러지-관련 질환,
- 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리,
- 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염, 또는
- 점막 감염.
이식 거부반응은 이식물 수령자의 면역계가 이식된 장기 또는 조직을 공격하는 과정이다. 그의 특징으로 인하여, 본 발명의 면역조절 조성물은 Th2 반응-매개된 이식 (예로서, 장기, 조직, 등) 거부반응의 예방 및/또는 치료에 특히 유용할 수 있다.
알러지는 면역계의 과민반응 장애이다. 알러지 반응은 인간의 면역계가 환경 중의 정상적으로는 무해한 물질에 반응하는 경우 일어난다. 상기 성분에 민감한 대상에서 면역 반응 (알러지 반응)을 일으키는 물질은 "알러젠 (allergen)"으로서 알려져 있다. 알러젠이 그에 알러지성인 대상의 신체에 들어가면, 그 대상의 면역계는 대량의 항체 (IgE)를 생산함으로써 반응한다; 동일한 알러젠에 대한 연속적인 노출은 화학적 매개체, 특히 히스타민의 방출을 일으키고, 이는 알러지성 반응의 전형적인 증상을 생산할 것이다. 다양한 종류의 알러젠이 존재하며, 비제한적인 예로서, 상기 알러젠은 꽃가루의 알러젠성 추출물, 가축, 곤충, 진드기, 등을 포함하는 동물의 알러젠성 추출물, 식품 또는 식제품 중 알러젠성 추출물, 금속, 타액 중 존재하는 성분, 대상에서 민감성 반응을 유도하는 곤충 집게발 (pincers) 또는 침 (stingers), 대상에서 민감성 반응을 유도하는 식물 중 존재하는 성분, 등 일 수 있다.
집단 중 존재하는 가장 흔한 알러지들 중에는 다음과 같은 것들이 있다:
- 식물 꽃가루에 대한 알러지, 예로서, 벼과 식물 (Gramineae) (예로서, 호밀풀 (Lolium perenne), 포아 프라텐세 (Poa pratense), 큰 조아재비 (Phleum pratense), 우산잔디 (Cynodon dactylon), 넓은김의털 (Festuca pratensis), 오리새 (Dactylis glomerata), 사초용 호밀 (Secale cereale), 여섯줄 보리 (Hordeum vulgare), 귀리커넬 추출물 (Avena sativa), 트리티쿰 사티바 (Triticum sativa), 등)의 꽃가루에 대한 알러지, 기타 풀 (예로서, 넓은잎외잎쑥 (Artemisia vulgaris), 명아주 (Chenopodium album), 창질경이 (Plantago lanceolata), 타락사쿰 불가레 (Taraxacum vulgare), 파리에타리아 주다이카 (Parietaria judaica), 살솔라 칼리 (Salsola kali), 아기쐐기풀 (Urtica dioica), 등)의 꽃가루에 대한 알러지, 나무 (예로서, 올리브 (Olea Europea), 교목 종 (Platanus sp.), 큐프레서스 종 (Cupresus sp.), 등)의 꽃가루에 대한 알러지;
- 동물 (예로서, 개, 고양이, 말, 가금류, 등)에 대한 알러지, 동물 피부, 비듬 또는 깃털에 대한 알러지, 곤충 (예로서, 벌, 말벌, 모기, 말파리, 등)에 대한 알러지, 예로서 대상에서 민감성 반응을 유도하는 곤충 타액, 집게발 또는 침 중에 존재하는 성분에 대한 알러지, 진드기에 대한 알러지, 예로서 집먼지 진드기 (예로서, 유럽집먼지진드기 (Dermatophagoides pteronyssimus), 큰다리먼지진드기 (Dermatophagoides farinae), 아카로스 사이로 (Acaros Siro), 열대진드기 (Blomia tropicalis), 주름먼지 진드기 (Euroglyphus maynei), 글라이시파구스 도메스티쿠스 (Glyciphagus domesticus), 레피도글라이푸스 데스트럭터 (Lepidoglyphus destructor), 긴털가루진드기 (Tyrophagus putrescentiae), 등)가 포함됨;
- 균류 (fungi) (예로서, 알타나리아 알터나타 (Alternaria alternata), 클라도스포리움 허바룸 (Cladosporium herbarum), 등)에 대한 알러지;
- 식품 또는 식품 중 존재하는 식품 성분, 예로서 물고기, 과일 (파인애플, 키위, 등)에 대한 알러지;
- 금속 (예로서, 니켈, 등)에 대한 알러지.
일반적으로, 특정 알러젠에 민감한 대상은 다른 상이한 알러젠에도 민감한 경우가 꽤 흔하다.
본 발명의 면역 조절 조성물은 일반적으로 알러지의 예방 및/또는 치료에 경구적으로 사용될 수 있고; 특정 실시형태에서, 상기 알러지는 상기 나타낸 알러지의 군으로부터, 즉 식물 꽃가루에 대한 알러지, 곤충에 대한 알러지, 진드기에 대한 알러지, 균류에 대한 알러지; 동물에 대한 알러지, 식품에 존재하는 식품 성분에 대한 알러지, 금속에 대한 알러지, 먼지에 대한 알러지 등, 및 이의 조합으로 이루어지는 알러지들의 군으로부터 선택된다.
엄격하게 필수적인 것으로 보이지는 않지만, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물을 사용함에 의한 알러지의 예방 및/또는 치료는 알러지를 일으키는 알러젠의 투여에 의해 촉진될 수 있다. 그러한 목적을 위하여, 상기 알러젠은, 본 발명의 면역조절 조성물의 제제 그 자체 내에 알러젠을 포함시킴으로써 또는 독립된 제제 중의 알러젠을 본 발명의 면역조절 조성물과 동시에 투여함으로써, 본 발명의 면역조절 조성물과 함께 대상에 투여될 수 있다 (본 발명의 면역조절 조성물 및 알러젠의 동시 투여). 대안적으로, 알러젠은 본 발명의 면역조절 조성물의 투여 전 또는 후의 기간에 대상에 투여될 수 있고 (본 발명의 면역조절 조성물 및 알러젠의 순차 투여); 이 경우에서, 알러젠은 그 자신의 제제로 조제될 것이다. 실질적으로 임의의 알러젠이 투여될 수 있지만, 특정 실시형태의 이러한 구체적인 실시형태에서, 상기 알러젠은 상기 단락에서 언급된 알러지를 유발하는 알러젠이다. 상기 알러젠은 당업자에 의해 알려진 통상의 방법에 의하여 수득될 수 있거나 또는 시장에서 취득할 수 있다.
본 발명의 면역조절 조성물은 알러지-관련 질환의 예방 및/또는 치료에 경구적으로 사용될 수 있다. 당업자는 일반적으로 알러지와 관련된 질환을 안다. 비제한적인 예시로서, 대부분의 흔한 알러지-관련 질환은 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택된다.
면역결핍은, 감염성 질환에 대항하여 싸우기 위한 면역계의 능력이 희생되거나 또는 부재한 병리학적 상태로; 그러한 조건 하에서, 면역계는 그의 대응하는 보호 기능을 충족하지 못하고, 생물이 감염되기 쉽도록 한다. 사실, 면역결핍은 병에 걸린 사람이 매우 감염되기 쉽도록 만든다. 일반적으로, 대부분의 면역결핍은 후천성 면역결핍이지만 ("이차적 면역결핍"); 그럼에도 불구하고, 일부 사람들은 그의 면역계에 결함을 갖고 태어난다 ("일차적 면역결핍"). 이식 거부반응 억제 수단으로서 그들의 면역계를 억제하기 위한 의약품을 먹는 장기이식 환자들 및 과활성 면역계를 갖는 환자들이 면역결핍을 가질 수 있는 대상들 중에서 발견된다. 일반적으로, 면역결핍을 갖는 사람은, 누구에게나 미칠 수 있는 정상적 감염에 더하여, 기회감염에 특히 취약한 경향이 있다.
면역결핍은 생리학적, 선천성, 또는 후천성 면역결핍일 수 있다. 일반적으로 면역결핍 상황에서, 예로서 생리학적 면역결핍 (예로서, 신생아에서, 임신 동안, 등), 일차적 또는 선천성 면역결핍 (예로서, 디조지 증후군 (Di George syndrome)에서의 무감마글로불린혈증 등과 같은 유전 질환), 또는 후천성 또는 이차적 면역결핍 (예로서, 영양실조, 노화, 특정 의약품을 이용한 치료, 예컨대 화학요법제, 항류머티즘제, (장기 이식 후 투여된) 면역억제제, 글루코코르티코이드, 등; 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 자가면역 질환, 등)에서와 같이 병원균에 대한 생물 방어는, Th1/Th2 균형의 이후 변경에 따라 감소된다.
본 발명의 면역조절 조성물은, 예로서, 극심한 강도이거나 또는 장기간인 경우 가변하는 강도의 감염에 대한 취약성을 통해 임상적으로 드러나는 면역결핍 상황을 일으킬 수 있는 정신 물리학적 스트레스와 같이, 특정 스트레스 조건 하에서 생물의 자연 면역 방어를 지지하는데 유용하다.
본 발명의 면역조절 조성물은 바람직하게는 T1 반응을 유도 및/또는 면역 반응을 Th을 향해 (예로서, Th2로부터 Th1을 향해) 이동함으로써 면역계를 조절하고, 예로서 이는 면역결핍으로부터 유래되거나 그 결과로서 생성된 병리의 예방 및/또는 치료를 위해 경구적으로 사용될 수도 있다. 당업자는 면역결핍, 예로서 감염 등으로부터 유래된 병리를 안다.
따라서, 본 발명의 면역조절 조성물은 임의의 기원의 면역결핍 또는 결과의 병리의 예방 및/또는 치료에, 예로서 세포내 병원균 (예로서, 박테리아, 원생동물, 바이러스 등)에 의하여 유발된 감염 및 점막 감염 (예로서, 구강 감염, 기도 감염, 위장관 감염, 비뇨생식기관 감염, 점막 감염, 피부 감염, 등) 및 면역결핍 상태로부터 유래된 일반적으로 모든 감염의 경구적 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 세포내 병원균은 진핵성 병원균, 예로서 원생동물 (예로서, 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax) (말라리아를 일으킴), 레슈마니아 종 (Leishmania sp.) (레슈마니아증 관련됨), 엔트아메바 종 (Entamoeba sp.), 크립토스포리디움 종 (Cryptosporidium sp.) 등 또는 균류, 또는 원핵성 병원균, 예컨대 세균 (예로서, 대장균 (Escherichia coli), 살모넬라 종 (Salmonella sp.), 시겔라 종 (Shigella sp.), 캄필로박터 종 (Campylobacter sp.), 여시니아 종 (Yersinia sp.), 비브리오 종 (Vibrio sp.), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), 나병균 (M. leprae), 리스테리아 종 (Listeria sp.), 브루셀라 종 (Brucella sp.), 클라미디아 (chlamydias) 등), 또는 바이러스 (예로서, 이중가닥 DNA (dsDNA) 바이러스, 예로서, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 수두바이러스 (poxvirus) 등), 단일가닥 DNA (ssDNA) 바이러스, 예로서, 파보바이러스 (parvovirus) 등, 이중가닥 RNA (dsRNA) 바이러스, 예로서, 레오바이러스 (reovirus) 등, 양성 단일가닥 RNA ((+)ssRNA) 바이러스, 예로서, 피코르나바이러스 (picornavirus), 토가바이러스 (togavirus) 등, 음성 단일가닥 RNA [(-)ssRNA] 바이러스, 예로서, 오르토믹소바이러스 (orthomyxovirus), 라브도바이러스 (rhabdovirus) 등, 역전사 단일가닥 RNA (ssRNA-RT) 바이러스, 예로서, 레트로바이러스 (retrovirus) 등; 또는 역전사 이중가닥 RNA (dsRNA-RT) 바이러스, 예로서, 헤파드나바이러스 (hepadnavirus) 등)이다.
또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 점막 감염의 치료 및/또는 예방에서 사용될 수 있고; 비제한적인 예시로서, 상기 점막은 구강 점막, 위장관 점막, 비뇨생식기관 점막 및 기도 점막, 등이다. 일반적으로, 이들 감염은 세포내 병원균에 의해 유발될 수 있다. 특정 실시형태에서, 점막 감염은 장내세균 (예로서, 대장균, 살모넬라 종, 시겔라 종, 캄필로박터 종, 여시니아 종, 비브리오 종, 등)), 장내 바이러스 (예로서, 칼리시바이러스 (calicivirus), 로타바이러스 (rotavirus), 아데노바이러스, 아스트로바이러스 (astrovirus), 등) 또는 원생동물 (예로서, 엔트아메바 종, 크립토스포리디움 종, 레슈마니아 종, 등)에 의하여 유발된다.
바람직하게는 경구 투여에 적합한 본 발명의 면역조절 조성물은, 살아있는 재료, 구체적으로 프로바이오틱 박테리아를 포함하는, 그 안에 존재하는 활성 성분의 특정 성질을 고려하여 당업자에 의해 알려진 방법에 의하여 제조될 수 있고, 바람직하게는, 생산된 마이크로입자가 가공, 저장 및 투여 동안, 특히 위장관을 통한 통과 (경구 투여) 동안 상기 프로바이오틱 박테리아를 보호하기 때문에, 본 발명에 의하여 제공된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 추가적으로, 섭취 후, 이들은 프로바이오틱 박테리아가 원하는 위치에서 유리되는 것을 촉진하며, 상부 위장관, 특히 위의 "산성-펩틱" 조건으로부터 그를 보호한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은, 치료될 병리의 유형 및 심각성 및 대상의 연령 및 체중에 따라, 일일 1회 또는 수회의 투여를 위한 단일 제형으로 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물 중에 존재하는 본 발명의 마이크로입자는 건조 분말 또는 동결건조물의 형태이며, 선택적으로는 대상에의 투여에 적합한 비히클 내에 존재한다. 일반적으로, 활성 성분 (본 발명의 마이크로입자, 조성물 또는 생성물)은 적합한 조성물 내에 포함된다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 식품, 약제 또는 뉴트라슈티컬 허용가능한 비히클을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 의하여 제공되는 약학 조성물, 뉴트라슈티컬 조성물 또는 식품은 프로바이오틱 박테리아에 적합한 비히클을 제공한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 면역조절 조성물은 약학 조성물, 뉴트라슈티컬 조성물을 포함하거나 또는 식품에 포함된다. 비제한적이며 예시적인 예로, 의약 생성물, 식이 생성물, 우유 유래 생성물들, 예컨대 요거트, 치즈, 크림, 제과류, 과일 주스 등이 포함되며, 그리고 상기 언급된 바와 같이 바람직한 경우, 예로서 비타민, 무기질염, 예로서 프리바이오틱제, 섬유질, 등과 같은 기타 상용성 활성 성분과 같은, 생물에 유리한 다른 성분이 포함될 수 있다.
상기 언급된 것과 같이, 본 발명의 측면은 대안적으로, 면역계 조절 조성물 (본 발명의 면역조절 조성물)에서의 이용을 위한 본 발명의 마이크로입자, 또는 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물로서 표시될 수 있다. 상기 언급된 면역조절 조성물의 특징은 필요한 부분만 약간 수정하여 여기에서 적용가능하다. 바람직한 특정 실시형태에서, 상기 면역계 조절 조성물은 바람직하게는 Th1 반응을 유도 및/또는 Th1을 향해, 바람직하게는 Th2로부터 Th1을 향해, 면역 반응을 이동시킨다. 유사하게, 특정 실시형태에서, 상기 면역계 조절 조성물은, 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물에 추가하여, 식품, 약제 또는 뉴트라슈티컬 허용가능한 비히클을 포함한다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물을 포함하는 상기 면역계 조절 조성물은 약학 조성물, 뉴트라슈티컬 조성물의 형태이거나 또는 대안적으로는 식품 내에 포함된다. 또다른 특정 실시형태에서, 상기 면역계 조절 조성물 중에 존재하는 마이크로입자는 건조 분말의 형태이다.
본 발명은 또한, 면역계 장애 (예로서, 자연적 장애 또는 유도된 면역계 장애)의 예방 및/또는 치료에 경구적으로 사용되기 위한 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 생성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 본 발명의 마이크로입자는 경구 투여를 위해 조제된 약학 조성물이다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 조성물은 경구 투여를 위해 조제된 약학 조성물이다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 생성물은 경구 투여에 적합한 약학 생성물이다.
유사하게, 본 발명은 또한, Th2-매개된 이식 거부반응; 알러지 및 알러지-관련 질환; 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리; 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염, 또는 점막 감염 [Th2-매개된 이식 거부반응, 알러지 및 알러지-관련 질환; 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리; 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염, 또는 점막 감염의 특징은 이미 상기에 언급되었으며, 참고로서 통합된다]의 예방 및/또는 치료에서 경구적 사용을 위한 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 마이크로입자는 경구 투여용으로 조제된 약학 조성물 중에 존재한다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 조성물은 경구 투여용으로 조제된 약학 조성물이다. 또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 상기 생성물은 경구 투여에 적합한 약학 생성물이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상에서의 면역계 장애 또는 병리의 예방 및 치료방법에 관한 것으로, 이는 본 발명의 면역조절 조성물, 또는 본 발명의 마이크로입자, 또는 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물의 유효량을, 치료를 필요로 하는 대상에게 경구 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, 대상에서 "면역계 장애 또는 병리"는 Th-1 반응에 기초한 치료가 유리할 수 있는 질환들과 같은 자연 및 유도된 면역계 장애, 예로서 Th2-매개된 이식 거부반응; 알러지 및 알러지-관련 질환; 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리; 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염, 또는 점막 감염을 포함한다. Th2-매개된 이식 거부반응, 알러지 및 알러지-관련 질환; 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리; 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염, 또는 점막 감염의 특징은 이미 상기에서 언급되었고, 참고로서 통합된다..
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "대상"은 인간을 포함하는 임의의 포유동물을 포함한다.
본 발명의 면역조절 조성물, 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물의 특징은 이미 상기 정의되었고, 본 명세서에 참고로서 통합된다.
본 발명의 면역조절 조성물, 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물의 제공 및 투여 형태의 특징은 이미 상기에서 언급되었고, 본 명세서에 참고로서 통합된다.
치료를 필요로하는 대상에의 투여를 위하여, 본 발명의 면역조절 조성물, 본 발명의 마이크로입자, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 생성물은 식품, 약제 또는 뉴트라슈티컬 허용가능한 비히클 내에 포함될 수 있거나, 또는 약학 조성물, 뉴트라슈티컬 조성물 중에 존재할 수 있거나 또는 식품 내 포함될 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 이를 제한하는 것으로서 여겨져서는 안된다.
실시예
하기 실시예는 프로바이오틱 박테리아를 포함할 수 있고, 상기 언급된 요인들 (가공, 저장 및/또는 위장관을 통한 통과)로부터 상기 미생물을 보호할 수 있는 카세인 및 키토산 마이크로입자의 생산을 설명한다. 달리 나타내지 않는 한, 이들 실시예를 실시하기 위해 사용된 일반 방법은 하기에 기재된다.
일반 방법
I. 빈 카세인 및 키토산 마이크로입자 생산을 위한 일반 방법
카세인 및 키토산 마이크로입자의 제조방법은 수성 매질 중에 카세인나트륨 (ANVISA, Madrid, Spain 소재)을 용해시키고, 이어서 특정 부피의 키토산 용액 및 선택적으로 특정 양의 가교결합제를 자석 교반 하에 일정 흐름으로 첨가하는 것을 포함하였다. 형성된 마이크로입자는, 그를 함유하는 현탁액을 만니톨과 같은 보호제의 첨가 후 분무 건조기를 통하여 통과시킨후 건조된다.
달리 나타내지 않는 경우, 이들 실시예에서 사용된 키토산은, Guinama (Valencia, Spain 소재)로부터의, 탈아세틸화도가 90.2% 및 분자량이 105±0.01 kDa을 갖는 특징화된 키토산이었다.
달리 나타내지 않는 경우, 이들 실시예에서 사용된 분무건조기는 Buchi 액세서리, B-295 Inert Loop 및 B-296 제습기가 있는 Buchi B-290 미니 분무건조기였다 (Buchi Switzerland, Flawil, Switzerland 소재).
이들 실시예에서 사용된 만니톨은 Guinama (Valencia, Spain 소재)로부터의, 순도 99.4%의 D-만니톨, E-421이었으나, Sigma-Aldrich로부터의 D-만니톨도 때때로 사용되었다.
II. 마이크로입자 특징화
마이크로입자의 크기는 Colorview Soft Imaging Systems 카메라가 있는 Olympus CH40 현미경을 이용하여, 광현미경을 통하여 결정하였다.
마이크로입자의 형태학은 주사 전자 현미경 (Zeiss, DSM 940A, Germany)을 이용하여 더 관찰하였다. 이 목적을 위하여, 마이크로입자를 9nm의 금 분자 층으로 코팅하고 (Emitech K550, 스퍼터-코팅기 (Sputter-Coater) 장치, United Kingdom 소재), Zeiss DMS 940 A 현미경 (United States 소재)을 이용하여 사진을 찍었다.
III. 프로바이오틱 박테리아의 현탁액 조제를 위한 일반 방법
이들 실시예를 실시하기 위하여 사용된 프로바이오틱 박테리아는 옥수수 사일리지 및 치즈로부터 각각 분리된, 락토바실러스 플란타룸 CECT 220 및 락토바실러스 카세이 CECT 475 T였다. 두 미생물의 동결 건조 생성물을, 무산소 (anaerobic) 챔버 (MACS 500 AIRLOCK, AES Chemunex, Spain 소재) 내, 37℃, 무산소성 대기 (85% 질소, 10% 수소, 5% 이산화탄소) 하에, MRS 배양액 (Merck, Barcelona 소재) 중에 재활성화시켰다. 사용시까지 -85℃에서 동결된 채 유지되는 비축 (stock) 현탁액의 분취액 500 ㎕를 이들 재활성화된 배양물로부터 제조하였다.
작업 현탁액은 하기와 같이 제조되었다. 해당 미생물의 분취액 100 ㎕를 10mL MRS 배양액으로 전달하였다. 무산소 조건 하에서, 12시간/37℃ 동안 인큐베이션 후, 106 CFU/mL (밀리미터 당 콜로니 형성 단위)의 계수에 도달하기 위하여, MRS 배양액이 담긴 50 mL 플라스크로 전달되어야만 하는 샘플 부피를 계산하기 위하여 거시적 계수를 Thoma 챔버에서 수행하였다. 그 부피를 접종한 후, 초기 고정 성장기 (stationary growth phase)에 도달될 때까지 플라스크를 상기 기재된 조건에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 샘플링 시기에 MRS 한천 (Merck, Barcelona 소재)에 해당 10단위 (decimal) 희석물 (0.1% BPW 배양액 (Merck, Barcelona 소재))을 접종함으로써 세균 개체군을 추적 및 계수하였다.
IV. 캡슐화된 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 카세인 및 키토산 마이크로입자 생산을 위한 일반 방법
캡슐화된 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 카세인 및 키토산 마이크로입자의 일반적인 생산 방법은 수성 매질 중 카세인나트륨 (ANVISA, Madrid, Spain 소재)을 용해시키고, 상기 섹션 III에 기재된 방법에 따라 수득되고, 원심분리 및 특정 부피의 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁된, 특정 부피의 박테리아 현탁액을 교반 하에 항류로 (constant flow) 첨가하는 것을 포함하였다. 특정 부피의 키토산 용액 및 선택적으로 특정 부피의 가교결합제를 그 후 첨가하였다.
V. 프로바이오틱 박테리아의 염색 및 그의 캡슐화를 위한 일반 방법
이 방법은, 박테리아가 마이크로입자 내부에 포획되었음, 즉 카세인 및 키토산으로 이루어지는 매트릭스가 프로바이오틱 박테리아를 코팅하였음을 형광 현미경을 통하여 정성적으로 확인하기 위하여 실시되었다.
박테리아를 염색하기 위한 방법은 인산염 버퍼 (pH 7.4) 내 로다민 B 아이소티오시아네이트의 포화 용액을 제조하고, 그를 0.2 ㎛ 막을 통하여 여과하고, 그를 상기 섹션에서 기재된 방법에 따라 수득된 특정 부피의 박테리아 현탁액에 첨가하는 것을 포함하였다. 혼합물을 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상등액 내 과다한 로다민을 일단 제거하면, 염색된 박테리아는 특정 부피의 2% 수크로오스 용액 (중량/부피) 내에 재현탁시켰다. 염색된 박테리아는 상기 섹션에 기재된 방법에 따라 캡슐화되었다.
VI. 제제 내에 존재하는 생육 박테리아의 정량, 및 공정에 걸친 박테리아 사멸 사이클의 결정을 위한 일반 방법
캡슐화된 박테리아를 계수하기 위하여, 1 mL의 1% NaOH (pH 10) 용액을 알려진 중량 (약 500 ㎍)의 마이크로캡슐에 첨가하고, 5 분의 와동 (vortexing) 후, 해당 10단위 희석물을 0.1% BPW 배양액 (Merck, Barcelona, Spain) 중에서 수행하고, MRS 한천 플레이트 내에 접종하였다. 무산소 조건 하, 37℃에서 24-48 시간 동안 인큐베이션 후 (MACS 500 에어락 챔버 (Airlock chamber), AES Chemunex, Spain 소재), 콜로니 계수를 수행하였다.
제제의 각 그램 당으로 그를 건조분무기로 통과시키기 전에, 제제 내에 초기 포함된 박테리아의 양 및 공정 종료시 수득된 계수를 고려하여, 다음 등식을 통하여 세균 사멸 사이클을 결정하였다:
세균 사멸 사이클: log (초기 CFU/g) - log (회수된 CFU/g)
VII. 모조된 (simulated) 위장성 매질 내 마이크로캡슐화된 젖산균의 내성 평가 방법
L. 플란타룸 및 L. 카세이의 위장관 내성을 Vinderola et al., 2003에 의해 기재된 방법에 따라 평가하였다.
연구를 수행하기 위하여, 10 ㎕의 액체 세균 배양액 또는 500 ㎍의 분말의 형태의 마이크로입자의 제제를, pH 2.5의 위 모조제 (simulant) 0.99 mL가 있는 PVC 관에 첨가하였다. 평가하기로 계획된 처리 횟수에 따라 사용된 많은 관, 구체적으로 시간에 대응하여 위 모조제를 갖는 5 개의 관이 사용되었다: 0 및 2 시간 (위 모조제에 대한 내성) 및 0, 3 및 6 시간 (장 모조제에 대한 내성).
약전에 따라 위 모조제를 제조하였으며, 이는 용액 1 리터에 대해 다음 조성을 가졌다:
- 2 g NaCl
- 3.2 g 펩신 (Sigma, Barcelona, Spain 소재)
- 7 mL 37% HCl (부피/부피)
펩신을 HCl 내에 용해시키고, 혼합물을 그 후 제 I 유형의 물 1리터에 첨가하였다. 수행될 시험에 따라, 37% HCl (부피/부피)을 이용하여 최종 pH를 1.2 또는 2.5로 조절하였다.
또한 약전 조제법으로부터 제조된 장 모조제는 하기 성분으로 제조되었다:
- 6.8 g의, 250 mL의 제 I 유형 물 중에 용해되고, 77 mL의 0.2 N NaOH가 첨가된, 일염기성 인산칼륨 (Panreac, Madrid, Spain 소재)
- 500 mL 물
- 10 g 판크레아틴 (Sigma, Barcelona, Spain 소재).
0.2 N NaOH 또는 0.2 N HCl을 이용하여 pH를 6.8로 조절하였다.
5 개의 관을, 샘플 추출 및 생존물 평가 시간까지 37℃에서 선회 (orbital) 교반기 (150 rpm) 내에서 유지하였다. 위 모조제 (2 시간) 내에서의 처리 시간이 지난 후, PVC 관을 원심분리하고 (13,000　rpm/10 분), 상등액을 폐기하였다. 2시간의 시간을 평가하기 위하여, 관들 중 하나의 펠렛을 상기 기재된 1%의 NaOH (pH 10)을 이용하여 마이크로캡슐을 파열시키는 처리를 하였다. 남아있는 관의 펠렛을 0.99 mL의 장 모조제 내에 재현탁시켜 이 매질 중에서의 내성을 0, 3 및 6시간에 평가하였다 (연구 시작으로부터 2, 5 및 8 시간). 이들 시간이 지난 후, 남아있는 생존물을 평가하기 위하여, 관들을 원심분리하고, 상등액을 폐기하고 펠렛을 1% NaOH 로 처리하였다 (마이크로캡슐을 파열하기 위한 처리).
상기 기재된 MRS 한천 플레이트 내 계수 방법을 이용하여 생균수 계수를 수행하였다. 플레이트를 무산소 조건 하에서 37℃에서 24 시간 내지 48 시간 동안 인큐베이션하여 콜로니 형성 단위의 수를 결정하였다. 생존 박테리아의 분획을 하기 등식에 따라 계산하였다:
Figure pct00002
식 중, Nt는 각 처리 시간 후 총 생 젖산균을 나타내고, N0은 접종된 젖산균 (LAB)의 초기 수를 나타낸다 (Bao et al., 2010).
VIII. 환경 조건 하에서 저장 시간에 걸쳐 마이크로캡슐화된 젖산균의 안정성 평가 방법
마이크로캡슐화된 박테리아 안정성 연구를 실온 (25℃)에서 저장 시간에 걸쳐 세균 생육력을 평가함으로써 수행하였다.
그러한 목적을 위하여, 500 ㎍의 샘플을 기밀된 유리 용기 내에서 유지된 마이크로캡슐 제제로부터 취하고, 상기 샘플을 상기 기재된 파열 및 생존물 평가 방법으로 처리하였다. 대조구로서, 두 미생물 모두의 신선한 현탁액 및 동결건조된 생성물 모두에서 유사한 방법으로 연구를 수행하였다.
실시예 1
락토바실러스 플란타룸 속의 캡슐화된 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 카세인 및 키토산 마이크로입자의 제조 및 특징화
박테리아를 함유하는 마이크로 입자의 상이한 유형을 제조하였으며, 이들 모두 기본중합체로서 키토산으로 개질된 카세인을 이용하였다. 상기 마이크로입자의 제조 방법은 가교결합제의 존재 또는 부재 및 사용된 가교결합제의 유형에 따라 달라졌다.
(Ap) 가교결합제 부재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자
섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 1.5 mL의 박테리아 현탁액 (1.2×1012 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 25 mL에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, 400 mg의 키토산을 250 ml의 정제수에 교반하에 첨가하고, 0.1 N HCl로 pH를 조절함으로써 pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 10 mL를 첨가하였다.
5분 동안 인큐베이션 후, 100 mg의 만니톨을 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 다음과 같았다:
- 공기 유입 온도: 85℃
- 공기 배출 온도: 40-45℃
- 공기압: 6 바 (bar) (6×105 Pa)
- 샘플 펌핑 속도: 3.5 mL/분
- 흡입: 100%
- 기류: 600 L/시간.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를 특징화 및 정량화를 위해 다시 수집하였다. 이들 프로바이오틱의 존재가 입자의 물리화학적 특징에 어떻게 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 동일한 연구를 박테리아 부재 하에서 수행하였다. 도 1은 프로바이오틱 존재 및 부재 모두에서, 상기 입자에서 수득된 광현미경 영상을 보여준다. 입자 크기는 캡슐화된 박테리아의 존재에 영향을 받지 않는다는 것을 영상으로부터 확인할 수 있다.
한편, 박테리아가 카세인 및 키토산 마이크로입자 내에 캡슐화된 것을 확인하기 위하여, 섹션 V의 "일반 방법"에 기재된 방법에 따라 형광 마커로 염색된 박테리아를 이용하여 동일한 연구를 반복하였다. 도 2는 염색된 자유 박테리아 (A) 및 캡슐화된 박테리아 (B) 모두의 형광 현미경 영상을 보여준다. 마이크로입자에서 관찰된 형광 (A)은 전적으로 박테리아로 인한 것이다. 마이크로입자 외부의 박테리아의 존재는 전혀 관찰되지 않으므로, 이들이 캡슐화되었음이 확인된다.
(Bp) 바닐린 존재 하에서 카세인 및 키토산 마이크로입자
0.5 mL의 바닐린 수용액 (5 mg/mL) 을 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 25 mL에 첨가하였다. 15 분 (이상)의 인큐베이션 후, 섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 0.3 mL의 박테리아 현탁액 (4.7×1011 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 혼합물에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 10 mL를 첨가하였다.
5분 동안 인큐베이션 후, 250 mg의 만니톨을 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 섹션 Ap에 기재된 것들과 유사하였다.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를, 특징화 및 정량을 위해 다시 수집하였다.
(Cp) TPP 존재 하에서의 카세인 및 키토산 마이크로입자
섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 1.5 mL의 박테리아 현탁액 (4.7×1011 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 25 mL에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 10 mL를 첨가하였다. 5분의 인큐베이션 후, 1 mg/mL의 TPP 용액 0.8 mL를 첨가하였다.
5분 후, 250 mg의 만니톨을 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 섹션 Ap에 기재된 것들과 유사하였다.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를, 특징화 및 정량을 위해 다시 수집하였다.
(Dp) 칼슘염 존재하에서 카세인 및 키토산 마이크로입자
섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 4 mL의 박테리아 현탁액 (1.2×1012 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 25 mL에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 2 mL를 첨가하였다. 5분의 인큐베이션 후, 2 mL의 2 % 칼슘 아세테이트 (중량/부피) 및 2 mL의 2% 염화칼슘 (중량/부피)을 첨가하였다.
100 mg의 만니톨을 5분 후 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 섹션 Ap에 기재된 것들과 유사하였다.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를, 특징화 및 정량을 위해 다시 수집하였다.
도 3은 마이크로입자에 대해 수득된 형광 현미경 영상을 나타내며, 여기에서 자유 박테리아의 존재는 관찰되지 않았다.
표 1은 카세인 및 키토산 마이크로입자 내 캡슐화 공정으로부터 유래된 L. 플란타룸의 사멸 사이클을 요약한다.
카세인 마이크로입자 생산 방법의 락토바실러스 플란타룸 생존에 대한 영향
제제 유형 SD에 의한 건조 전 박테리아 수 (CFU/g) SD에 의한 건조 후 박테리아 수 (CFU/g) 마이크로입자의 수득 공정으로 인한 박테리아 사멸 사이클 (로그 (log CFU)
Ap 3.67×1012 2.50×1010 2.17
Bp 2.42×1011 2.50×1010 0.99
Cp 1.21×1012 7.50×1010 1.21
Dp 9.28×1012 1.70×1010 2.74
SD: 분무 건조
수득된 마이크로입자의 크기는 약 7±4 ㎛의 범위로, 모든 제제에서 유사하였다. 그러나, 세균 사멸 사이클은, 바닐린 또는 TPP가 가교결합제로서 사용된 경우 더 낮았다.
수득된 결과에 의하면, 제제 Bp 및 Cp는 동일 수득 공정 동안 프로바이오틱에 대해 보다 양호한 보호를 제공하는 것이었다. 따라서, 위장관 내성 및 저장 동안 생육력에 대한 연구를 수행하기 위해 두 제제를 모두 선택하였다.
실시예 2
캡슐화된 락토바실러스 플란타룸의, 환경 조건 하에서 저장 시간에 걸친 안정성 평가
실시예 1에 기재된 제제 Ap, Bp, Cp 및 Dp를 환경 조건 (25℃) 하에서 시간에 걸쳐 박테리아의 생존을 평가하는데 사용하였으며, 비교 대조구로서 신선한 현탁액 및 동결건조 생성물 모두를 이용하였다. 도 4는 수득된 결과를 보여준다.
결과는, 연구 첫달 후 현탁액 중 신선한 박테리아의 계수에서 7 로그 단위의 손실이 있었고, 3달 후 동결건조된 형태의 박테리아의 경우 4.5 로그 단위의 손실이 관찰되었음을 명확하게 보여주었다. 그러나, 이들 프로바이오틱이 실시예 1에 기재된 임의의 카세인 및 키토산 마이크로입자 내에 캡슐화된 경우, 그의 수는 일정하게 유지되었으며, 8달 동안의 연구 동안 현저한 손실이 관찰되지 않았다. 이들 결과는 본 발명에 기재된 제제가 동결건조된 박테리아에 비하여, 환경 조건 하에서의 세균 생육력을 적어도 2배 증가시킴을 확인시켜 주었다.
실시예 3
락토바실러스 플란타룸 속의 캡슐화된 프로바이오틱 박테리아의 모조된 위장성 매질에 대한 내성의 평가
실시예 1에 기재된 제제 Ap, Bp, Cp 및 Dp를, 섹션 VII의 "일반 방법"에 기재된 방법에 따라, 모조된 위장성 매질 중에서 캡슐화된 박테리아의 내성을 평가하는데 사용하였다. 도 5는 공정을 통한 제제 및 자유의 비캡슐화된 박테리아에 대해 수득된 내성 모두에 대하여 수득된 결과를 보여준다. 자유 박테리아 (비캡슐화 동결건조된 박테리아)의 경우, 생균수는 연구 동안에 걸쳐 서서히 감소하여 4 로그 단위의 평균 손실로 종료되었다. 제제 Ap 및 Dp의 경우, 그 수가 전체 분석에 걸쳐 실질적으로 일정하게 유지되어, 위 모조제 (2 시간) 내 분석 종료 및 장 모조제 (8시간) 내 분석 종료 모두에서 동결 건조된 생성물보다 현저히 더 높았다. Bp 및 Cp 제제에서, 농도에서의 감소가 위 모조제에서의 체류 동안 관찰되었으며, 2시간 째에서의 계수는 동결 건조 생성물과 상당히 유사하였다. 그러나, 일단 마이크로입자를 장 모조제로 이동시키자, 계수에서의 증가가 관찰되어, 이는 분석 종료시 (8 시간) 동결 건조 생성물보다 현저히 더 높았다. 최종 계수에서의 이러한 증가는 비피도박테리아를 이용하여 수행한 연구에서의 다른 저자들에 의해서 이미 설명되어 왔으며, 여기에서 이들은 이 현상이 낮은 pH 스트레스 동안 박테리아가 경험하는 손상이 단지 일시적이고, 박테리아를 최종적으로 죽이지 않아, 이는 장 매질을 통과시 이들이 회복되는 것을 가능하게 한다는 사실에 기인한 것이라고 결론지었다 (Lacroix and Picot, 2004).
요약하면, 위 모조제 매질 (2 시간) 내에서의 연구 후, 박테리아가 유리된 경우보다 박테리아가 Ap 및 Dp 제제 내에 캡슐화된 경우, 더욱 높은 생존이 관찰되었으며, 상기 차이는 유의하였다. 대조적으로, 이들 차이는 Bp 및 Cp 제제에서는 관찰되지 않았다. 그러나, 연구 종료 후 (8시간 후, 위 모조제 매질 및 그 후 모조된 장 매질 통과 후), 모든 마이크로입자 제제에서 (Ap, Bp, Cp 및 Dp) 차이는 더욱 크고 유의하여 동결건조된 생성물에 비해 3 사이클 이상의 차이에 달하였다.
이들 결과는, 기재된 마이크로입자가 연구된 박테리아의 모조된 위장관 조건에 대한 내성을 현저히 증가시킨다는 것을 증명하였다.
한편, 마이크로입자는, 시간에 걸친 분해 과정 동안 그들의 상태의 평가에 대하여 특징되었다. 도 6은 박테리아가 마이크로입자 내부에 수용되었고, 상기 마이크로입자가 시간에 걸쳐 분해된 경우 매질에 유리됨을 관찰가능하게 한다.
실시예 4
락토바실러스 카세이 속의 캡슐화된 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 카세인 마이크로입자 또는 카세인 및 키토산 마이크로입자의 제조 및 특징화
박테리아를 함유하는 마이크로 입자의 상이한 유형을 제조하였으며, 이들 모두 키토산 및 기본 중합체로서 카세인을 이용하였다. 상기 마이크로입자의 제조 방법은 사용된 가교결합제의 유형에 따라 달라졌다.
(Ac) 가교결합제 부재 하에서 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자
섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 2 mL의 박테리아 현탁액 (2.2×1010 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 25 mL에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, 400 mg의 키토산을 250 ml의 정제수에 교반하에 첨가하고, 0.1 N HCl로 pH를 조절함으로써 pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 10 mL를 첨가하였다. 5분 동안 인큐베이션 후, 100 mg의 만니톨을 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 다음과 같았다:
- 공기 유입 온도: 85℃
- 공기 배출 온도: 40-45℃
- 공기압: 6 바 (6×105 Pa)
- 샘플 펌핑 속도: 3.5 mL/분
- 흡입: 100%
- 기류: 600 L/시간.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를 특징화 및 정량화를 위해 다시 수집하였다. 이들 프로바이오틱의 존재가 입자의 물리화학적 특징에 어떻게 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 동일한 연구를 박테리아 부재 하에서 수행하였다.
(Bc) 칼슘 염 존재 하에서 카세인 및 키토산 마이크로입자
섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 1.8 mL의 박테리아 현탁액 (9.4×1010 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 150 mL에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 25.5 mL를 첨가하였다. 칼슘염의 혼합물 (12 ml의 2% 칼슘 아세테이트 (중량/부피) 및 12 ml의 0.9% 염화칼슘 (중량/부피))을 이 용액에 첨가하였다.
5분 동안 인큐베이션 후, 1,500 mg의 만니톨을 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 다음과 같았다:
- 공기 유입 온도: 75℃
- 공기 배출 온도: 38℃
- 공기압: 6 바 (6×105 Pa)
- 샘플 펌핑 속도: 3.5 mL/분
- 흡입: 100%
- 기류: 600 L/시간.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를 특징화 및 정량화를 위해 다시 수집하였다.
(Cc) 바닐린과 가교결합된 카세인 및 키토산 마이크로입자
0.5 mL의 바닐린 (5 mg/mL) 수용액을 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 25 mL에 첨가하였다. 15 분 (이상)의 인큐베이션 후, 섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 3 mL의 박테리아 현탁액 (1.2×109 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 혼합물에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 10 mL를 첨가하였다.
5분 동안 인큐베이션 후, 200 mg의 만니톨을 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 섹션 Bc에 기재된 것들과 유사하였다.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를, 특징화 및 정량을 위해 다시 수집하였다.
(Dc) 3인산염과 가교결합된 카세인 및 키토산 마이크로입자
섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 1.2 mL의 박테리아 현탁액 (9.4×1010 CFU/mL)을, 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 100 mL에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 20 mL를 첨가하였다. 1.6 mL의 TPP (1 mg/ml)를 여기에 첨가하였다.
5분 동안 인큐베이션 후, 1,000 mg의 만니톨을 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 섹션 Bc에 기재된 것들과 유사하였다.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를 특징화 및 정량화를 위해 다시 수집하였다.
표 2는 캡슐화된 L. 카세이를 함유하는 카세인 및 키토산 마이크로입자의 물리화학적 특성, 및 입자 생산 공정으로부터 유래된 세균 사멸 사이클을 요약한다.
캡슐화된 락토바실러스 카세이를 갖는 카세인 및 키토산 마이크로입자의 물리화학적 특징
제제 유형 SD에 의한 건조 전 박테리아 수 (CFU/g) SD에 의한 건조 후 박테리아 수 (CFU/g) 마이크로입자의 수득 공정으로 인한 박테리아 사멸 사이클 (로그 CFU)
Bc 4.49 x 1010 3.80 x 109 1.07
Cc 6.82 x 109 7.80 x 109 0.00
Dc 4.89 x 1010 1.30 x 1010 0.58
SD: 분무 건조
수득된 마이크로입자의 크기는 약 7±4 ㎛의 범위로, 모든 경우에서 유사하였다. 생산 공정과 관련하여, 상기 데이터는 개발된 제제가 일반적으로 공정 전체에 걸쳐 L. 플란타룸보다 L. 카세이를 일반적으로 보호하고, 나아가 제제 Cc 및 Dc가 최선의 보호를 부여하는 것들임을 보여준다.
생성물 그램 또는 밀리리터 당 살아있는 프로바이오틱의 최소 수에 관한 합의는 없지만, 그의 저장 수명의 종료시 약 107-108 CFU/mL (CFU/g)의 농도가 일반적으로 최소 충족 수준으로서 받아들여진다. 109 CFU의 수가 장 내로 유리되기 위해서는 프로바이오틱 생성물이 약 100 g/일의 양으로 규칙적으로 소비되어야만 한다는 것도 수립되어 왔다 (Karimi et al., 2011; Mohammadi et al., 2011; Vinderola et al., 2000a). 따라서, 본 발명에 의해 제공된 방법은 세균 수를 약 109 CFU/g (표 2)로 유지하기 때문에, 적합한 방법으로써 고려될 수 있고, 이는 이 제제가 식품 중 약 1%의 비율을 가져, 예로서 107 CFU/g의 프로바이오틱 박테리아의 필요 농도를 유지하는 것을 가능하게 한다.
저장 동안 캡슐화된 박테리아의 위장 내성 및 생육력을 알기 위하여 제제 Cc 및 Dc를 선택하였는데, 이는 이들이 최선의 보호 결과를 제공하였으며, 고압의 이용을 필요로 하지 않아, 생산 공정을 단순화하기 때문이었다.
실시예 5
환경 조건 하에서 저장 기간에 걸친 캡슐화된 락토바실러스 카세이 의 안정성의 평가
실시예 4에 기재된 제제 Ac, Cc 및 Dc를 환경 조건 하에서, 대조구로서 신선한 현탁액 및 동결 건조된 생성물을 모두 이용하여, 시간에 따른 박테리아의 생존을 평가하는데 사용하였다. 도 7은 수득된 결과들을 요약한다.
결과는, 연구 첫달 후 현탁액 중 신선한 박테리아의 수에서 5 로그 단위의 손실이 있었고, 3달 후, 3 로그 단위의 손실이 동결건조된 박테리아의 경우에서 관찰되었으며, 5달 후 5 로그 단위의 손실에 도달되었음을 보여준다. 제제 Ac, Cc 및 Dc에 따른 카세인 및 키토산 마이크로입자 내에서 캡슐화된 박테리아의 경우에서, Ac는 3달 후 손실이 약 0.5 로그 단위, 및 6 달 후 3 로그 단위였으며, 제제 Dc는 2 로그 단위, 및 제제 Cc는 1 로그 단위였다.
이들 결과는 본 발명에 기재된 제제가, L. 플란타룸의 경우에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 동결건조된 박테리아에 비하여, 환경 조건 하에서 세균 생육력의 증가를 가능하게 하였음을 확인하여 준다.
실시예 6
모조된 위장성 매질에 대한 캡슐화된 락토바실러스 카세이 속 프로바이오틱 박테리아의 내성의 평가
실시예 4에 기재된 제제 Ac, Cc 및 Dc를, "일반 방법"의 섹션 VII에 기재된 방법을 따라 모조된 위장 매질 내에서 캡슐화된 박테리아의 내성을 평가하는데 사용하였다. 도 8은 마이크로입자에 대한 연구를 통하여 수득된 결과 및 비캡슐화 동결건조된 박테리아에 대해 수득된 내성을 보여준다.
자유 박테리아의 경우 (비캡슐화 동결건조된 박테리아), 생균수는 위 매질 내 연구의 첫번째 두 시간 후 현저히 감소되었고 (4 로그단위), 이는 그 후 유지되었다. 그러나, 데이터는 캡슐화된 박테리아가 위 매질 내 처리에 현저하게 더욱 내성이며, 처리 종료시에는 약 1.5 로그 단위의 평균 손실에 도달하였음을 보여준다. 또한, 제제 Ac 및 Cc의 경우, 장 매질 통과 후, 동결건조된 대조구보다는 유의하게 더 높게 유지되었지만, 박테리아의 내성이 감소되었으며, 이는 제제 Dc에서는 관찰되지 않은 효과이다.
이들 결과는 기재된 마이크로입자가 모조된 위장 조건에 대해 연구된 박테리아의 내성을 증가시킨다는 것을 증명하였다.
실시예 7
L. 플란타룸과 관련된 카세인 바이오캡슐의 면역학적 연구
본 실시예를 실시하기 위하여, 실시예 1에서 기재된 바닐린 존재 하에 키토산으로 개질된 카세인 마이크로입자 (참조번호 Bp)를 사용하였다. 이를 위하여, 0.5 mL의 바닐린 (5 mg/mL)을 10 mg/mL의 카세인나트륨 수용액 25 mL에 첨가하였다. 15 분 (이상)의 인큐베이션 후, 섹션 III의 "일반 방법"에 기재된 1 mL의 박테리아 현탁액 (4.6×1010 CFU/mL)을 원심분리 및 2% 수크로오스 (중량/부피) 용액에 재현탁시킨 후, 혼합물에 첨가하였다. 그 후 이 혼합물에, pH 5.5-6을 갖는 수성 매질 중 제조된 1.6 mg/mL 농도를 갖는 키토산 용액 2 mL를 첨가하였다.
100 mg의 만니톨을 5분 후 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 분무 건조 기술을 이용하여 제제를 건조시켰다. 공정 조건은 다음과 같았다:
- 공기 유입 온도: 85℃
- 공기 배출 온도: 40-45℃
- 공기압: 6 바 (6×105 Pa)
- 샘플 펌핑 속도: 3.5 mL/분
- 흡입: 100%
- 기류: 600 L/시간.
분말 형태로 수득된 마이크로입자를 특징화 및 정량화를 위해 다시 수집하였다. 수득된 마이크로입자의 평균 크기는 7±4㎛였다. 한편, 박테리아 수는 마이크로입자 1 그램 당 5.1×1010 CFU의 역가를 제공하였다.
면역 연구는, 윤리 위원회 협회 (Ethics Committee of the Institution) 및 실험 동물에 대한 유럽 법령 (86/609/EU)에 따라 수행하였다. 그러한 목적을 위하여, 평균 체중이 20 g인 24 마리의 수컷 CD1 마우스들 (Charles River)을 사용하고, 이들을 정상의 명-암 조건 (12시간-12시간) 처리하였다. 동물을 4 개의 상이한 군으로 나누었고 (군 당 6 마리), 각 군은 연속된 21일 동안 상이한 매일의 처리를 받았다.
0.1 mL의 PBS (인산염 완충 식염수 pH 7.4)를 제 1 군에 경구투여하였다 (대조구). 제 2 군을 2% 수크로오스 중 락토바실러스 플란타룸의 현탁액을, 107 CFU/마우스의 투여량으로 처리하였다 (자유 LP). 제 3 군을 키토산으로 개질되고 바닐린 (100　㎍/마우스)으로 가교결합된 빈 카세인 마이크로입자와 혼합된 2% 수크로오스 중 L. 플란타룸 (107　CFU/마우스)에 의해 형성된 현탁액 형태의 물리적 혼합물로 처리하였다 (물리적 혼합물, MF). 최종적으로, 제 4군은 상기 기재된, 키토산으로 개질되고 바닐린으로 가교결합된 카세인 마이크로입자 중에 혼입된 L. 플란타룸의 제제 (107 CFU/마우스) (Bp)를 처리받았다.
22일에, 약 250 ㎕ 부피의 혈액을 혈청 분리관 (SARSTEDT 마이크로관 1.1 mL Z-Gel)을 이용하여 빼내었다. 동물을 그 후 희생시키고, 비장을 추출하고, 비장 세포를 4℃에서, 글리신을 갖는 RPMI 1640 매질 내에서 붕괴시켰다. 적혈구를 용해시키고, 지라세포를 계수하였으며, 그의 농도는 완전 RPMI 매질 내에서 조절하였다. L. 플란타룸을 자극제로서 (지라세포에 대해 10:1의 비율로) 세포 현탁액 복제물 100 ㎕에 첨가하였다. 37℃에서 48 시간의 인큐베이션 후, 세포 현탁액을 원심분리하고, 사이토카인을 함유하는 상등액을 -80℃에서 보존하였다. 사이토카인을 BD 혈구계산 비드 어레이 Th1/Th2/Th17 CBA 키트 (BD, USA 소재)를 통하여 포획하고, 유세포 분석기 (Attune® Acoustic Focusing Cytometer)를 이용하여 측정하였다 .
도 9는 어떻게 L. 플란타룸 (자유, 캡슐화된 또는 물리적 혼합물과 함께)의 경구 투여가 CD4+/CD8+ 비율에서의 감소에 의해 나타나는 세포독성 림프구의 수에서의 약간의 증가를 유도하는지를 보여준다. 이 효과는 박테리아에 의한 장 콜로니화 효과에 따른 상기 증가에 상관하는 참고목록에서 보다 초기에 기재된 데이터와 일치하였다 [Herias et al., 1999; Smelt et al., 2012]. 한편, 캡슐화는 CD4+/CD8+ 비율을 변경시키는 박테리아 능에 영향을 미치지 않은 것으로 관찰된다.
도 10은 받은 처리에 따라 달라지는 인터페론-감마/인터류킨-6 (IL-6) 비율을 나타낸다. 모든 경우에서, L. 플란타룸의 투여는 인터페론-감마 (IFN-g) 합성을 증가시켰다. 그러나, 마이크로입자 내에 캡슐화된 박테리아로 처리된 동물은 나머지 처리들에서 수득된 것보다 유의하게 더욱 큰 비를 나타내었다 (p<0.001; ANOVA, 사후 터키 검증 (post hoc Tukey)). L. 플란타룸의 투여 후 Th1 프로파일을 향한 면역 반응의 이동은 다른 저자들에 의해 수득된 결과들과 일치하였다 [Smelt et al., 2012; Wiese et al., 2012].
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Claims (46)

  1. 매트릭스 및 프로바이오틱 (probiotic) 박테리아를 포함하며, 상기 매트릭스는 카세인 및 키토산으로 이루어지는 마이크로입자.
  2. 제1항에 있어서, 가교결합제를 더 포함하는 마이크로입자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 가교결합제는 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2가 금속 양이온; 3인산염; 바닐린; 제니핀 (genipin); 및 이의 조합인 마이크로입자.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 가교결합제는 Ca2+, 3인산나트륨 및 바닐린으로 이루어지는 군으로부터 선택된 마이크로입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키토산:카세인 중량비는 1:1-150, 바람직하게는 1:5-100, 더욱 바람직하게는 약 1:14-40인 마이크로입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 또는 락토바실러스 (Lactobacillus) 속의 박테리아인 마이크로입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei)로부터 선택된 마이크로입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 그 크기가 1 내지 40㎛, 바람직하게는 약 2 내지 12㎛에 포함되는 마이크로입자.
  9. 카세인 또는 카세인 공급원, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산을 혼합하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 마이크로입자의 수득 방법.
  10. 제9항에 있어서, (i) 카세인 또는 카세인 공급원의 수용액, (ii) 프로바이오틱 박테리아의 현탁액, 및 (iii) 키토산 수용액이 혼합되는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 카세인 공급원은 카세인 나트륨인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 가교결합제를 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 가교결합제는 수용액 형태로 첨가되는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 카세인 또는 카세인 공급원, 프로바이오틱 박테리아 및 키토산, 및 선택적으로 가교결합제의 혼합물을, 100 내지 800 MPa를 포함하는 압력에서 하나 이상의 정수압 사이클 (hydrostatic pressure cycle) 처리하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 형성된 마이크로입자를 함유하는 현탁액을 건조시키는 것을 더 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 마이크로입자를 함유하는 현탁액을 분무 건조에 의하여 건조시키는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 마이크로입자를 함유하는 현탁액을 보호제 존재 하에 건조시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 보호제는 당류인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 보호제는 만니톨인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 보호제는 프리바이오틱 (prebiotic) 물질인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 프리바이오틱 물질은 올리고프룩토오스, 펙틴, 이눌린, 갈락토-올리고당, 락툴로오스, 인간 젖 올리고당, 식이섬유 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법.
  22. 제9항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득가능한 마이크로입자.
  23. 제1항 내지 제 8항 또는 제22항 중 어느 한 항의 방법에 따른 다수의 마이크로입자를 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 마이크로입자의 평균 크기는 1 내지 40㎛, 바람직하게는 2 내지 12㎛인 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 조성물 A 내지 C로부터 선택되는 조성물:
    40중량% 내지 60중량%의 카세인,
    0.1중량% 내지 3.5중량%의 키토산,
    109 CFU/g 내지 5×1012 CFU/g의 프로바이오틱 박테리아,
    0중량% 내지 0.15중량%의 3인산나트륨 및
    0중량% 내지 60중량%의 보호제;
    를 포함하고, 여기에서 중량 비는 조성물의 총 중량에 대한 것인 조성물 A;
    40중량% 내지 60중량%의 카세인;
    0.1중량% 내지 3.5중량%의 키토산;
    109 CFU/g 내지 5×1012 CFU/g의 프로바이오틱 박테리아;
    0중량% 내지 0.6중량%의 바닐린, 및
    0중량% 내지 60중량%의 보호제;
    를 포함하고, 여기에서 중량 비는 조성물의 총 중량에 대한 것인 조성물 B; 및
    40중량% 내지 60중량%의 카세인;
    0.1중량% 내지 3.5중량%의 키토산;
    109 CFU/g 내지 5×1012 CFU/g의 프로바이오틱 박테리아
    0중량% 내지 10중량%의 Ca2+, 및
    0중량% 내지 60중량%의 보호제;
    를 포함하고, 여기에서 중량 비는 조성물의 총 중량에 대한 것인 조성물 C.
  26. 제1항 내지 제8항 또는 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 마이크로입자, 및 식품, 약제, 화장품 또는 뉴트라슈티컬 (nutraceutical)에 허용가능한 비히클 (vehicle)을 포함하는 조성물.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로입자는 건조 분말 형태인 조성물.
  28. 제1항 내지 제8항 또는 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 마이크로입자, 또는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 식품, 약학, 코스메슈티컬 (cosmeceutical) 또는 뉴트라슈티컬 생성물.
  29. 제28항에 있어서, 액체, 반고체 또는 고체 형태인 식품, 약학, 코스메슈티컬 또는 뉴트라슈티컬 생성물.
  30. 제1항 내지 제8항, 또는 제22항 중 어느 한 항에 따른 마이크로입자, 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제28항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 생성물의, 면역계 조절 조성물의 제조에서의 이용.
  31. 제30항에 있어서, 상기 면역계 조절 조성물은 바람직하게는 Th1 반응을 유도 및/또는 Th1를 향해 면역 반응을 이동시키는 조성물인 이용.
  32. 제30항에 있어서, 상기 면역계 조절 조성물은 면역계 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 경구용 조성물인 이용.
  33. 제32항에 있어서, 상기 면역계 장애는 자연적 장애 또는 유도된 장애인 이용.
  34. 제30항에 있어서, 상기 면역계 조절 조성물은:
    - Th2-매개된 이식 거부반응,
    - 알러지 및 알러지-관련 질환,
    - 면역결핍 및 상기 면역결핍으로부터 유래된 병리,
    - 세포내 병원균에 의하여 유발된 감염, 또는
    - 점막 감염
    의 예방 및/또는 치료를 위한 경구용 조성물인 이용.
  35. 제34항에 있어서, 상기 알러지는 식물 꽃가루에 대한 알러지, 동물에 대한 알러지, 식품 알러지, 금속에 대한 알러지 및 이의 조합으로부터 선택되는 이용.
  36. 제34항에 있어서, 상기 알러지-관련 질환은 천식 및 아토피 피부염으로부터 선택되는 이용.
  37. 제34항에 있어서, 상기 면역결핍은 생리학적 면역결핍, 선천적 면역결핍, 또는 후천적 면역결핍인 이용.
  38. 제34항에 있어서, 상기 세포내 병원균은 진핵성 병원균, 원핵성 병원균 또는 바이러스인 이용.
  39. 제38항에 있어서, 상기 진핵성 세포내 병원균은 원생동물 또는 균류인 이용.
  40. 제38항에 있어서, 상기 원핵성 세포내 병원균은 박테리아인 이용.
  41. 제30항에 있어서, 상기 면역계 조절 조성물은 점막 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 경구용 조성물인 이용.
  42. 제41항에 있어서, 상기 점막은 구강 점막, 위장관 점막, 비뇨생식기관 점막 및 기도 점막으로부터 선택되는 이용.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 점막 감염 유발제는 유발제는 장내 세균, 장내 바이러스 또는 원생동물인 이용.
  44. 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역계 조절 조성물은 식품, 약제 또는 뉴트라슈티컬에 허용가능한 비히클인 이용.
  45. 제44항에 있어서, 상기 면역계 조절 조성물은 약학 조성물, 뉴트라슈티컬 조성물이거나 또는 식품으로 구성된 이용.
  46. 제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로입자는 상기 면역계 조절 조성물 내 건조 분말 형태인 이용.
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