KR20150020539A

KR20150020539A - 방사선 멸균 내성 단백질 조성물

Info

Publication number: KR20150020539A
Application number: KR20147031797A
Authority: KR
Inventors: 유카코 가게야마; 겐타로 후지나가; 아유코 야마구치; 유스케 아키야마; 소우이치로우 가토우; 유키코 기무라; 스스무 혼다; 마코토 사타케; 히로아키 가네코; 아유미 이시와리; 마사키 히라시마
Original assignee: 데이진 가부시키가이샤; 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼; 데이진 화-마 가부시키가이샤
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2015-02-26
Also published as: BR112014028441A2; EP2851083A4; KR102112375B1; CN104271145B; CA2873655C; EP2851083B8; US20150132279A1; JP2016053063A; CA2873655A1; TW201350146A; PT2851083T; MX2014013723A; RU2014150497A; PL2851083T3; RU2678828C2; JP6317307B2; JPWO2013172467A1; TWI590836B; MX355012B; ES2682024T3

Abstract

첨가제로서, 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물, 및/또는 셀룰로오스에테르 유도체를 포함하는, 방사선 멸균 내성을 갖는 단백질 조성물.

Description

방사선 멸균 내성 단백질 조성물{RADIATION-STERILIZATION-RESISTANT PROTEIN COMPOSITION}

본 발명은 특정한 아미노산군 및/또는 셀룰로오스에테르 유도체를 포함하는, 방사선 멸균 내성을 갖는 단백질 조성물에 관한 것이다.

최근, 천연 및 합성 단백질은 약제로서 그 중요성이 증대되고 있다. 또, 의료 용도로 사용하는 경우, 제품이 멸균되어 있는 것이 필수이다. 멸균 방법으로서, 오토클레이브에 의한 가열 멸균, γ 선이나 전자선에 의한 전리 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스에 의한 가스 멸균, 과산화수소에 의한 플라즈마 멸균, 글루타르알데히드 제제를 사용한 화학 멸균제 및 필터를 사용한 분리 멸균 등이 알려져 있다. 그러나, 생리 활성 단백질 등의 단백질은, 열이나 방사선에 의한 멸균에 의해 활성이 저하된다. 에틸렌옥사이드에 의한 멸균은, 화학 반응에 의해 부생성물이 생성될 가능성이 있을 뿐만 아니라, 독성이 강하여, 잔류 가스가 인체 등에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 화학 멸균제에 의한 멸균은, 단백질의 멸균제에 대한 내성, pH 의 변화, 이온 강도의 변화 또는 온도의 변화를 고려할 필요가 있다는 문제가 있었다. 그래서, 단백질을 함유·고정시킨 의약품·의료품을 제조하는 경우에는, 제조 프로세스를 전부 무균 상태로 하여 제조해야 하여, 막대한 제조 비용이 필요한 것이 현황이다.

또, 단백질을 포함하는 용액은 필터에 의해 분리 멸균하고 있지만, 큰 입자를 포함하는 조성물, 또는 고체 혹은 반고체 조성물에는 적용이 곤란하였다.

EP0437095호에는 헤파린 또는 헤파린 프래그먼트와 복합하는 중화 산화셀룰로오스 생성물 (nORC) 을 감마선 조사로 멸균할 수 있는 것이 나타나 있다. 그러나, 이 문헌에는 단백질이 결합되어 있는 ORC 또는 nORC 를 멸균하는 것은 나타나 있지 않다.

EP0562864호에는 콜라겐 스펀지 매트릭스, 제 2 생체 흡수성 폴리머 (예를 들어 산화 재생 셀룰로오스 (ORC) 의 분산 섬유), 및 활성제 (예를 들어 펩티드) 를 포함하는 복합 상처 치료 물질이 나타나 있다. 활성제는 매트릭스 또는 생체 흡수성 폴리머, 또는 그들의 양방에 포함할 수 있어, 그 복합 스펀지 물질을 패키지하여 멸균할 수 있는 것이 기재되어 있다.

US5730933호에는 생물학적으로 활성인 펩티드를 그 생물학적 활성을 소실시키지 않고 감마선 또는 전자빔 조사로 멸균하는 방법이 나타나 있다. 이 방법은, 생물학적으로 활성 펩티드와 젤라틴 등의 외래 단백질을 포함하는 혼합물을 형성하여, 이 혼합물을 동결 또는 동결 건조시키고, 다음으로 이 혼합물을 조사하는 공정을 포함하는 기술이며, 외래 단백질의 존재가 펩티드를 안정화하여 펩티드의 활성 저하를 방지한다고 기재되어 있다.

국제 공개 WO2000/033893호에는 치료 펩티드와, 산화 재생 셀룰로오스, 중화 산화 재생 셀룰로오스, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리삭카라이드의 복합체가 기재되어 있다. 그리고 전리 방사선으로 멸균하기 전에 펩티드를 유효량의 폴리삭카라이드와 함께 제제함으로써, 전리 방사선으로 멸균하여도 펩티드 치료제의 생물학적 활성은 소실되지 않고 안정화된다고 기재되어 있다.

그러나, 이들 문헌은, 전리 방사선으로 멸균할 때의 단백질의 실활을 셀룰로오스에테르 유도체나 특정한 아미노산군과 공존시킴으로써 억제할 수 있는 것은 시사하고 있지 않다.

한편, 일본 공개특허공보 2011-47089호에는 효소 활성이 우수한 효소 함유 나노 파이버의 제조 방법이 기재되어 있다. 이 방법은, 효소와 비수용매에 용해시킨 폴리머를 함유하는 방사액을, 정전 방사법에 의해 방사하여 효소 전구 나노 파이버를 형성한 후, 물을 부여하고 건조시키는 것이다. 그러나, 이 문헌에는 효소 함유 나노 파이버를 멸균하는 것에 관한 기술은 없다.

본 발명의 목적은 방사선 멸균에 대해 내성을 갖는 단백질 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 놀랍게도 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물, 및/또는 셀룰로오스에테르 유도체를 공존시킴으로써, 방사선 멸균에 대한 단백질의 내성이 향상되는 것을 알아내어, 본 발명에 도달하였다.

즉, 본 발명은 첨가제로서, 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물, 및/또는 셀룰로오스에테르 유도체를 포함하는 단백질 조성물이다.

도 1 은 본 발명의 셀룰로오스에테르 유도체와 특정 첨가제의 조합에 의한 단백질의 멸균 내성 효과 (세로축 : 겔 강도 상대값 (멸균 전 : 100)) 를 나타낸다.
도 2 는 본 발명의 셀룰로오스에테르 유도체와 특정 첨가제의 조합에 의한 멸균 내성 효과 (세로축 : 단백질 응집체 증가량 (％)) 를 나타낸다.

본 발명은 첨가제로서, 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물, 및/또는 셀룰로오스에테르 유도체를 포함하는 단백질 조성물이다.

본 발명에서 사용되는 단백질은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 피브리노겐이나 트롬빈으로 대표되는 지혈성 단백질, 아스파라기나아제, 카탈라아제, 슈퍼옥사이드디스무타아제, 리파아제로 대표되는 효소, 헤모글로빈, 혈청 알부민, 저밀도 리포 단백질로 대표되는 수송 단백질, 액틴, 미오신으로 대표되는 근육 단백질, 항체, 보체로 대표되는 방어 단백질, 디프테리아 독소, 보툴리누스 독소, 뱀독으로 대표되는 독소 단백질, 인슐린, 증식 인자, 사이토카인으로 대표되는 단백질 호르몬, 난알부민, 페리틴으로 대표되는 저장 단백질, 콜라겐, 케라틴으로 대표되는 구조 단백질, 상피 성장 인자 (Epidermal growth factor : EGF), 인슐린형 성장 인자 (Insulin-like growth factor : IGF), 트랜스포밍 성장 인자 (Transforming growth factor : TGF), 신경 성장 인자 (Nerve growth factor : NGF), 뇌유래 신경 영양 인자 (Brain-derived neurotrophic factor : BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자 (Vesicular endothelial growth factor : VEGF), 과립구 코로니 자극 인자 (Granulocyte-colony stimulating factor : G-CSF), 과립구 매크로 퍼지 코로니 자극 인자 (Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor : GM-CSF), 혈소판 유래 성장 인자 (Platelet-derived growth factor : PDGF), 에리스로포에틴 (Erythropoietin : EPO), 트롬보포에틴 (Thrombopoietin : TPO), 염기성 선유아 세포 증식 인자 (basic fibroblast growth factor : bFGF 또는 FGF2), 간세포 증식 인자 (Hepatocyte growth factor : HGF) 로 대표되는 성장 인자를 들 수 있다. 그 중에서도 바람직한 것은, 지혈성 단백질, 효소, 수송 단백질, 근육 단백질, 방어 단백질, 독소 단백질, 단백질 호르몬, 저장 단백질, 구조 단백질, 및 성장 인자이며, 특히 피브리노겐이 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용되는 단백질은, 동물 유래의 것이어도 되고 유전자 변형 기술에 의해 제조한 것이어도 된다. 동물 유래이면 인간 유래가 바람직하다. 또, 유전자 변형 기술에 의해 제조된 단백질은, 본질적인 생물 활성이 동일하면 아미노산 배열을 다른 아미노산 배열로 치환한 개변체이어도 된다. 또, 이들 단백질을 수식한 것, 및 이들 혼합물을 사용할 수도 있다.

또, 본 발명에서 사용되는 단백질은, 당해 성분에 추가하여, 약학적으로 허용할 수 있는 안정제나 첨가제를 첨가하여도 된다 (이하, 이것을 「안정제 등」이라고 표현하고, 본 발명에 있어서 방사선 멸균 내성을 부여하기 위해 단백질과 공존시키는 첨가제와는 구별한다). 그와 같은 안정제 등의 예로는, 아르기닌, 이소류신, 글루타민산, 시트르산류, 염화칼슘, 염화나트륨, 프로테아제 억제제 (예를 들어 아프로티닌), 알부민, 계면활성제, 인지질, 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산나트륨, 글리세린, 트레할로오스 및 당 알코올 (예를 들어 글리세롤, 만니톨) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 바람직한 것은, 아르기닌, 염화나트륨, 트레할로오스, 만니톨, 및 시트르산류에서 선택되는 1 종 이상이며, 특히 시트르산류가 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 단백질과 안정제 등의 혼합물은, 단백질을 당해 혼합물 100 중량부에 대해, 35 중량부 이하, 바람직하게는 30 중량부 이하 함유한다.

본 발명에서 사용하는 첨가제가 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물인 경우, 첨가제와 단백질의 합계 100 중량부에 대해, 글리신은 통상적으로, 5 중량부 이상 90 중량부 이하, 바람직하게는 15 중량부 이상 60 중량부 이하, 더욱 바람직하게는 20 중량부 이상 40 중량부 이하, 페닐알라닌은 통상적으로 1 중량부 이상 80 중량부 이하, 바람직하게는 2 중량부 이상 40 중량부 이하, 더욱 바람직하게는 4 중량 이상 20 중량부 이하, 히스티딘은 통상적으로 2 중량부 이상 70 중량부 이하, 바람직하게는 5 중량부 이상 40 중량부 이하, 더욱 바람직하게는 8 중량부 이상 20 중량부 이하 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 첨가제가 셀룰로오스에테르 유도체인 경우, 본 발명에서 사용되는 단백질 또는 단백질과 안정제 등의 혼합물은, 셀룰로오스에테르 유도체 위에 담지되어 있어도 되지만, 셀룰로오스에테르 유도체 중에 함유 (여기서 함유란, 단백질의 적어도 일부분이 셀룰로오스에테르 유도체 내부에 비집고 들어가 있는 상태를 말한다) 된 상태로 존재하고 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 셀룰로오스에테르 유도체 중에 단백질이나 안정제 등의 분자가 분산되어 존재하고 있어도 되지만, 단백질 분자나 안정제 등의 분자가 각각 모인 것이 더 모인 입자 (이하 안정제 등과의 혼합 입자를 포함하여 「단백질 입자」라고 기재하는 경우가 있다) 로서 분산되어 존재하는 것이 바람직하다.

이러한 단백질이나 단백질 입자의 셀룰로오스에테르 유도체에 있어서의 바람직한 존재 양태는, 첨가제가 셀룰로오스에테르 유도체뿐만 아니라, 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물 및 셀룰로오스에테르 유도체인 경우도 동일하다.

본 발명에 있어서 사용되는 셀룰로오스에테르 유도체의 구체예로는, 하이드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 및 이들의 혼합물을 예시할 수 있다.

이들 중에서도, 바람직하게는 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군 에서 선택되고, 가장 바람직하게는 하이드록시프로필셀룰로오스이다.

또, 본 발명에서 사용하는 셀룰로오스에테르 유도체의 분자량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 농도 2 ％, 20 ℃ 에서 점도 측정을 실시한 경우, 1 ∼ 10000 mPa·s, 바람직하게는 2 ∼ 5000 mPa·s, 보다 바람직하게는 2 ∼ 4000 mPa·s 의 점도를 나타내는 분자량이 선택된다.

본 발명의 단백질 조성물에 있어서는, 그 목적을 저해하지 않는 범위에서, 다른 폴리머나 다른 화합물을 병용하여도 된다.

본 발명에서 사용하는 셀룰로오스에테르 유도체는 고순도인 것이 바람직하고, 특히 셀룰로오스에테르 유도체 중에 포함되는 첨가제나 가소제, 잔존 촉매, 잔존 모노머, 성형 가공이나 후가공에 사용한 잔류 용매 등의 잔류물은 적은 편이 바람직하다. 특히, 의료에 사용하는 경우에는, 안전성의 기준치 미만으로 억제할 필요가 있다.

본 발명의 단백질 조성물의 형상은 부정형의 것을 포함하여 특별히 한정되는 것이 아니라, 예를 들어 필름, 섬유, 시트, 판상체, 관상체, 선상체, 봉상체, 쿠션재, 발포체, 다공질체 등을 들 수 있다. 성형품을 제조할 때의 성형 방법은, 단백질의 활성이 저하되지 않는 방법이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 압출 성형, 사출 성형, 캘린더 성형, 압축 성형, 블로우 성형, 진공 성형, 분말 성형, 유연 성형, 주형 등의 적당한 성형 방법을 채용할 수 있다. 그 중에서도, 본 발명의 단백질 조성물은 필름 및 섬유 형상이 적합하다. 여기서 섬유 형상이란, 얻어진 1 개 또는 복수 개의 섬유가 적층되어, 직조, 편직 혹은 그 밖의 수법에 의해 형성된 3 차원의 성형체를 말한다. 구체적인 섬유의 형태로서는, 예를 들어 부직포를 들 수 있다. 또한, 그것을 기초로 가공한 튜브, 메시 등도 섬유 형상에 포함된다.

그들 제조에 있어서는 필름 또는 플라스틱 섬유의 제조에 종래부터 채용되고 있는 어느 방법도 채용할 수 있고, 예를 들어 유연법 (캐스트법), 일렉트로 스피닝법, 인플레이션 압출 성형법, T 다이 압출 성형법 등의 압출 성형법, 캘린더법 등을 들 수 있다. 상기 성형은, 용액 성형에 의해 실시하여도 되고, 또는 용융 성형에 의해 실시하여도 되지만, 단백질의 기능 저하를 방지하기 위해 단백질 또는 단백질 입자를 용이하게 분산시키기 위해서는 용액 성형이 바람직하다.

본 발명 중, 필름 형상을 갖는 단백질 조성물의 제조법을, 유연법을 예를 들어 설명한다. 단백질의 동결 건조 분말을 유발 등으로 분쇄하여 용매로의 분산에 적당한 평균 입자 직경 (통상적으로 0.1 ∼ 200 ㎛, 바람직하게는 1 ∼ 100 ㎛) 을 갖는 단백질 입자를 제조한다. 이것을 셀룰로오스에테르 유도체를 용해 가능하고, 또한 단백질 입자와 현탁액을 형성하고, 필름 제조 단계에서 증발되어 필름을 형성 가능한 1 종 또는 복수의 적당한 용매 (2-프로판올이나 에탄올 등) 에 분산시킨 후, 셀룰로오스에테르 유도체 추가로 필요에 따라 마크로골 등의 가소제를 용해시켜, 단백질 입자가 셀룰로오스에테르 유도체 용액 중에 분산된 도프액을 조제한다. 얻어진 도프액을 사용하여 유연법에 의해 필름을 제조한다.

본 발명 중 필름 형상을 갖는 단백질 조성물에 있어서, 단백질 또는 단백질 입자는, 셀룰로오스에테르 유도체에 대해, 단백질이나 셀룰로오스에테르 유도체의 종류에 따라서도 상이하지만, 통상적으로 100 중량％ 이상, 바람직하게는 500 중량％ 이상, 보다 바람직하게는 800 ∼ 950 중량％ 함유한다. 이들보다 적으면, 단백질의 기능이 충분히 발휘되지 않는 경우가 있고, 많으면 필름의 성형성이 불량해지는 경우가 있다.

본 발명 중 필름 형상을 갖는 단백질 조성물의 필름의 평균 두께 (두께) 는, 용도에 따라서도 상이하지만, 10 ∼ 1000 ㎛ 인 것이 바람직하다.

본 발명 중, 섬유 형상을 갖는 단백질 조성물은, 그 평균 섬유 직경은, 예를 들어 0.01 ∼ 50 ㎛ 이지만, 당업자이면 사용 목적에 따라 적절히 결정할 수 있다. 또, 장섬유로 이루어지는 것이어도 된다. 장섬유란, 구체적으로는 방사로부터 섬유 성형체로의 가공에 이르는 공정 중에서, 섬유를 절단하는 공정을 추가하지 않고 형성되는 섬유를 말하며, 일렉트로 스피닝법, 스판본드법, 멜트 블로우법 등으로 형성할 수 있지만, 열을 가하지 않고 성형할 수 있어, 단백질의 기능 저하를 억제할 수 있는 점에서 일렉트로 스피닝법이 바람직하게 사용된다.

일렉트로 스피닝법은, 폴리머가 용해되어 있는 액에 고전압을 인가함으로써, 전극 상에 섬유 성형체를 얻는 방법이다. 공정으로서는, 폴리머가 용해되어 있는 방사액을 제조하는 공정과, 그 용액에 고전압을 인가하는 공정과, 그 용액을 분출시키는 공정과, 분출시킨 용액으로부터 용매를 증발시켜 섬유 성형체를 형성시키는 공정과, 임의로 실시할 수 있는 공정으로서 형성된 섬유 성형체의 전하를 소실시키는 공정과, 전하 소실에 의해 섬유 성형체를 누적시키는 공정을 포함한다.

이하, 일렉트로 스피닝법을 예로 들어, 본 발명 중, 섬유 형상 또는 부직포 형상을 갖는 단백질 조성물의 제조법을 설명한다.

일렉트로 스피닝법에 있어서의, 방사액을 제조하는 단계에 대하여 설명한다. 본 발명에 있어서의 방사액은, 셀룰로오스에테르 유도체 용액과 단백질 입자로 이루어지는 현탁액을 사용하는 것이 바람직하다.

그 현탁액에 있어서의 셀룰로오스에테르 유도체의 농도는 1 ∼ 30 중량％ 인 것이 바람직하다. 셀룰로오스에테르 유도체의 농도가 1 중량％ 보다 낮으면 섬유 성형체를 형성하는 것이 곤란해져 바람직하지 않다. 또, 30 중량％ 보다 높으면 얻어지는 섬유 성형체의 섬유 직경이 커지고, 또 현탁액의 점도가 높아져 바람직하지 않다. 보다 바람직한 현탁액에 있어서의 셀룰로오스에테르 유도체의 농도는 1.5 ∼ 20 중량％ 이다.

셀룰로오스에테르 유도체의 용매는, 셀룰로오스에테르 유도체를 용해 가능하고, 또한 단백질 입자와 현탁액을 형성하고, 방사하는 단계에서 증발되어, 섬유를 형성 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 또 1 종을 단독으로 사용하여도 되고 복수의 용매를 조합하여도 된다. 예를 들어 클로로포름, 2-프로판올, 톨루엔, 벤젠, 벤질알코올, 디클로로메탄, 사염화탄소, 시클로헥산, 시클로헥사논, 트리클로로에탄, 메틸에틸케톤, 아세트산에틸, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 1-프로판올, 페놀, 피리딘, 아세트산, 포름산, 헥사플루오로-2-프로판올, 헥사플루오로아세톤, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 아세토니트릴, N-메틸-2-피롤리디논, N-메틸모르폴린-N-옥사이드, 1,3-디옥솔란, 물, 및 이들 용매의 혼합 용매를 들 수 있다. 이들 중, 취급성이나 물성 등으로부터, 2-프로판올, 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

셀룰로오스에테르 유도체 용액과 단백질 입자를 혼합하여 현탁액을 조제하는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 초음파나 각종 교반 방법을 사용할 수 있다. 교반 방법으로서는, 호모게나이저와 같은 고속 교반이나 애트라이터, 볼 밀 등의 교반 방법도 사용할 수 있다. 그 중에서도 초음파 처리에 의한 분산 방법이 바람직하다.

또, 용매와 단백질 입자로 현탁액을 형성한 후, 셀룰로오스에테르 유도체를 첨가하여 방사액을 조제할 수도 있다.

또, 현탁액을 조제하기 전에 단백질 입자를 미세 처리할 수 있다. 미세 처리로서는, 건식 분쇄와 습식 분쇄가 있으며, 본 발명에 있어서는, 어느 방식도 채용할 수 있고, 양자를 조합할 수도 있다.

건식 분쇄 처리로서는, 볼 밀을 사용한 처리, 유성 밀이나 진동 밀을 사용한 처리, 유발을 사용하여 유봉에 의해 갈아 으깨는 처리, 매체 교반형 분쇄기, 제트 밀, 맷돌을 사용하여 갈아 으깨는 처리 등을 들 수 있다.

한편, 습식 분쇄 처리로서는, 적당한 분산매에 단백질 입자를 분산시킨 상태에서, 높은 전단력의 교반 장치, 혼련 장치 등에 의해 교반하는 처리나, 매체 중에 분산시킨 상태에서의 볼 밀, 비즈 밀 처리 등을 들 수 있다.

나아가서는, 스프레이 드라이어에 의해 제조한 단백질 입자를 사용할 수도 있다.

본 발명 중, 섬유 형상 또는 부직포 형상을 갖는 단백질 조성물에 있어서, 단백질 입자의 사이즈는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 0.01 ∼ 100 ㎛ 의 범위에 있는 것이 바람직하다. 0.01 ㎛ 보다 작은 단백질 분말을 제조하는 것은 기술적으로 곤란하고, 100 ㎛ 보다 크면 분산성이 나빠, 섬유 성형체가 취약해져 바람직하지 않다.

본 발명의 단백질 조성물에서 사용하는 멸균 방법은 방사선 멸균이다. 방사선으로서는, 알파선, 베타선, 감마선, 중성자선, 전자선, 및 X 선을 들 수 있다. 그 중에서도 감마선 혹은 전자선이 바람직하고, 가장 바람직한 것은 전자선이다. 이들 멸균 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 방사선의 조사량으로서는 10 ∼ 80 kGy, 바람직하게는 20 ∼ 30 kGy 이다. 온도 조건으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만 -80 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 -80 ∼ 30 ℃ 이다.

알파선, 양전자선, 감마선, 중성자선, 전자선, X 선 등의 방사선은, 물질에 닿으면 물질을 구성하는 분자·원자로부터 전자를 떼어낸다. 이 때 분자 결합이 절단되어, 반응성이 높은 라디칼 등이 발생하여, 주변 물질과 2 차적으로 화학 반응한다.

단백질은 방사선 조사에 의해 기능 (활성) 을 잃기 쉬운 것이 잘 알려져 있다. 이것은 조사에 의해 분자 결합이 끊어져, 기능 발현의 근원인 「고차 구조」가 파괴되는 것에 의한 것으로 생각된다. 그러나, 본 발명의 단백질 조성물은 방사선 조사하여도 그 기능 저하가 억제되고 있다. 이것은 본 발명 조성물 중의 단백질의 고차 구조가 유지되고 있는 것을 의미하며, 이것은 단백질 일반에 있어서 공통의 효과이다. 이 효과는 투과하는 셀룰로오스에테르 유도체의 두께로부터 고려하여 차폐에 의한 것이라고는 생각되지 않고, 억제 기구는 확실하지 않다. 또, 당해 셀룰로오스에테르 유도체의 효과가, 특정한 아미노산군의 첨가에 의해 현저하게 향상되는 현상의 기구도 불명료하다.

본 발명의 단백질 조성물은, 또한 전자·이온 포착제, 에너지 이동제, 라디칼 포착제, 산화 방지제, 가소제를 포함하여도 된다. 전자·이온 포착제로서는, N,N-테트라메틸페닐렌디아민, 디페닐렌디아민, 피렌, 퀴논 등을 들 수 있다. 에너지 이동제로서는, 아세나프텐 등을 들 수 있다. 라디칼 포착제로서는, 메르캅탄, 옥타하이드로페난트렌, 모노알킬디페닐에테르, 토코페롤, 시트르산, 부틸화하이드록시아니솔, 부틸화하이드록시톨루엔, t-부틸하이드로퀴논, 갈산프로필, 아스코르브산 유도체 등을 들 수 있다. 산화 방지제로서는, BHT, 아인산트리에스테르, 페놀계 노화 방지제, 유기 티오산염류 등을 들 수 있다. 그 중에서도 식품이나 의약품에 사용하기에 안전하다고 일반적으로 인정되어 있는 첨가제가 바람직하다. 첨가제의 양은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 단백질 조성물에 있어서의 셀룰로오스에테르 유도체에 대해 0.01 ∼ 10 중량％ 의 첨가제를 포함할 수 있다.

또, 멸균 공정에 있어서의 단백질을 함유하는 셀룰로오스에테르 유도체는 수분을 포함하고 있지 않은 것이 바람직하다. 수분율은 10 중량％ 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 4 중량％ 이하, 더욱 바람직하게는 실질적으로 무수의 것이다.

또, 본 발명의 단백질 조성물은, 포장재에 포장하여 방사선 멸균하여도 된다. 이러한 포장 재료로서, 알루미늄과 같은 가스 배리어성이 높은 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 탈산소제나 건조제와 함께 밀봉 포장하여도 되고, 탈기 후에 불활성 가스를 충전한 상태에서 포장하여도 되며, 이들 양방을 실시하여도 된다. 이러한 탈산소제 및 건조제는, 인체에 해가 없고, 방사선 멸균시에 실활되지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 단백질 조성물은, 예를 들어 단백질의 기능 및 멸균성이 요구되는 의료용 재료로서 사용할 수 있다.

또, 본 발명에는, 본 발명의 단백질 조성물을 방사선 멸균하여 이루어지는 멸균 단백질 조성물이 포함된다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명의 실시형태를 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1 ∼ 4 및 비교예 1 ∼ 2 에 대한 측정법

1. 평균 섬유 직경 :

얻어진 섬유 성형체의 표면을 주사형 전자 현미경 (키엔스 주식회사 : 상품명 「VE8800」) 에 의해, 배율 3000 배로 촬영하여 얻은 사진으로부터 무작위로 20개 지점을 선택하여 섬유의 직경을 측정하고, 모든 섬유 직경의 평균값을 구하여 평균 섬유 직경으로 하였다. n ＝ 20 이다.

2. 평균 두께 :

50 ㎜ × 100 ㎜ 의 사이즈로 컷한 섬유 성형체를 고정밀도 디지털 측장기 (주식회사 미츠토요 : 상품명 「라이트매틱 VL-50」) 를 이용하여 측장력 0.01 N 에 의해 n ＝ 15 로 섬유 성형체의 막두께를 측정한 평균값을 산출하였다. 또한, 본 측정에 있어서는 측정 기기가 사용 가능한 최소의 측정력으로 측정을 실시하였다.

3. ELISA 측정

(1) 피브리노겐

ELISA 플레이트 (NUNC 468667) 에 항인간 피브리노겐 항체 (DAKO A0080) 를 10 ㎕/㎖ 로 고정화하였다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정한 후, 블록 에이스 (DS 파머바이오메디칼 UK-B80) 를 각 웰에 첨가하고, 마스킹을 실시한다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정한 후, 검체를 첨가하였다. 표준품으로서 인간 피브리노겐 (Enzyme Research Laboratories No.FIB3) 을 이용하여 검량선을 작성하였다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정한 후, HRP 표식 항인간 피브리노겐 항체 (CPL5523) 를 첨가하고, 반응 후, 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정하고, TMB 시약 (KPL 50-76-02 50-65-02) 을 첨가하고, 6 분간 가만히 정지시켜 발색시켰다. 1MH₃PO₄ 를 첨가하여 발색을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더로 OD 450-650 ㎚ 를 측정하였다.

(2) 트롬빈

ELISA 플레이트 (NUNC 468667) 에 항인간 트롬빈 항체 (Affinity Biological 사, No.SAHT-AP) 를 5 ㎕/㎖ 로 고정화하였다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정한 후, 블록 에이스 (DS 파머바이오메디칼 UK-B80) 를 각 웰에 첨가하고, 마스킹을 실시하였다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정한 후, 검체를 첨가하였다. 표준품으로서 인간 트롬빈 (헤마토로직 테크놀로지사 : HCT-0020) 을 이용하여 검량선을 작성하였다. 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정한 후, HRP 표식 항인간 트롬빈 항체 ((Affinity Biological 사, No.SAHT-HRP) 를 0.1 ㎕/㎖ 로 첨가하였다. 반응 후, 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 세정하고, TMB 시약 (DaKo S1599) 을 첨가하고, 10 분간 가만히 정지시켜 발색시켰다. 0.5 M H₂SO₄ 를 첨가하여 발색을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더로 OD 450-650 ㎚ 를 측정하였다.

4. 트롬빈 활성 측정

BD 사 제조 폴리스티렌 튜브에 시료 20 ㎕ 와 활성 측정용 희석 용액 (0.01 ％ F-68, 50 m㏖/ℓ NaCl, 50 m㏖/ℓ Tris-HCl, pH 8.4) 80 ㎕ 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 분 인큐베이션하였다. 표준품으로서 재조합 트롬빈 (JPU Thrombin Standard 400 U/㎖ 또는 WHO/US Thrombin Standard, 110 IU/㎖ : 자사 조정품) 을 동 버퍼로 JPU 의 경우, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 U/㎖, IU 의 경우, 6, 3, 1.5, 0.75, 0.375 IU/㎖ 에 희석한 것을 사용하였다. 그 반응액에 테스트팀 발색 기질 S-2238 (1 mM : 다이이치 화학 약품 공업) 을 100 ㎕ 첨가하여 교반 혼합하고, 37 ℃ 에서 7 분간의 반응 후, 0.1 M 시트르산 용액을 800 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 200 ㎕ 를 96 웰 플레이트에 옮겨, OD405/650 을 측정하였다.

실시예 1

2-프로판올에 피브리노겐 동결 건조 분말 (보르힐 (등록 상표, 이하 동일) 조직 접착용 : 바이알 1) 을 분산시킨 후, 16 wt％ 가 되도록 하이드록시프로필셀룰로오스 (6-10 mPa·s 와코 쥰야쿠 제조) 를 용해시켜, 피브리노겐 함유 입자/하이드록시프로필셀룰로오스 ＝ 20 (피브리노겐으로서 9.2)/100 (w/w) 의 방사액을 조제하였다. 온도 22 ℃, 습도 26 ％ 이하에서 일렉트로 스피닝법에 의해 방사를 실시하여, 시트상의 섬유 성형체를 얻었다. 분출 노즐의 내경은 0.8 ㎜, 전압은 11 ㎸, 방사액 유량은 1.2 ㎖/h, 분출 노즐로부터 평판까지의 거리는 15 ㎝ 였다. 얻어진 섬유 성형체의 평균 섬유 직경은 0.86 ㎛, 평균 두께는 137 ㎛ 였다. 얻어진 시트를 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 멸균한 시트를 0.5 ㎝ × 0.5 ㎝ 로 절단하고, 62.5 ㎕ 의 생리 식염수로 단백질을 추출하여 ELISA 측정을 실시하였다. 그 결과, 고정화 단백질량은 0.15 ㎎/㎠ 였다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 시트에 대해서도 동일하게 ELISA 측정을 실시한 결과, 고정화 단백질량은 0.16 ㎎/㎠ 였다. 이상으로부터, 미멸균 시트에 대한 멸균 시트에 대한 단백 회수율은 94 ％ 였다.

실시예 2

2-프로판올에 피브리노겐 동결 건조 분말 (보르힐 조직 접착용 : 바이알 1) 을 분산시킨 후, 16 wt％ 가 되도록 하이드록시프로필셀룰로오스 (6-10 mPa·s 와코 쥰야쿠 제조) 를 용해시켜, 피브리노겐 동결 건조 분말/하이드록시프로필셀룰로오스 ＝ 40 (피브리노겐으로서 18)/100 (w/w) 의 방사액을 조제하였다. 온도 22 ℃, 습도 26 ％ 이하에서 일렉트로 스피닝법에 의해 방사를 실시하여, 시트상의 섬유 성형체를 얻었다. 분출 노즐의 내경은 0.8 ㎜, 전압은 12.5 ㎸, 방사액 유량은 1.2 ㎖/h, 분출 노즐로부터 평판까지의 거리는 15 ㎝ 였다. 얻어진 섬유 성형체의 평균 섬유 직경은 0.43 ㎛, 평균 두께는 152 ㎛ 였다. 얻어진 시트를 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 멸균한 시트를 0.5 ㎝ × 0.5 ㎝ 로 절단하고, 62.5 ㎕ 의 생리 식염수로 단백질을 추출하여 ELISA 측정을 실시하였다.

그 결과, 고정화 단백질량은 0.27 ㎎/㎠ 였다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 시트에 대해서도 동일하게 ELISA 측정을 실시한 결과, 고정화 단백질량은 0.30 ㎎/㎠ 였다. 이상으로부터, 미멸균 시트에 대한 멸균 시트의 단백 회수율은 90 ％ 였다.

실시예 3

2-프로판올에 피브리노겐 동결 건조 분말 (보르힐 조직 접착용 : 바이알 1) 을 분산시킨 후, 16 wt％ 가 되도록 하이드록시프로필셀룰로오스 (6-10 mPa·s, 와코 쥰야쿠 제조) 를 용해시켜, 피브리노겐 동결 건조 분말/하이드록시프로필셀룰로오스 ＝ 100 (피브리노겐으로서 46)/100 (w/w) 의 방사액을 조제하였다. 온도 22 ℃, 습도 26 ％ 이하에서 일렉트로 스피닝법에 의해 방사를 실시하여, 시트상의 섬유 성형체를 얻었다. 분출 노즐의 내경은 0.8 ㎜, 전압은 12.5 ㎸, 방사액 유량은 1.2 ㎖/h, 분출 노즐로부터 평판까지의 거리는 15 ㎝ 였다. 얻어진 섬유 성형체의 평균 섬유 직경은 0.35 ㎛, 평균 두께는 191 ㎛ 였다. 얻어진 시트를 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 멸균한 시트를 0.5 ㎝ × 0.5 ㎝ 로 절단하고, 62.5 ㎕ 의 생리 식염수로 단백질을 추출하여 ELISA 측정을 실시하였다.

그 결과, 고정화 단백질량은 0.78 ㎎/㎠ 였다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 시트에 대해서도 동일하게 ELISA 측정을 실시한 결과, 고정화 단백질량은 0.76 ㎎/㎠ 였다. 이상으로부터, 미멸균 시트에 대한 멸균 시트의 단백 회수율은 102 ％ 였다.

비교예 1

피브리노겐 동결 건조 분말 (보르힐 조직 접착용 : 바이알 1) 을 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 1 ㎖ 의 생리 식염수로 단백질을 추출하여 ELISA 측정을 실시하였다. 그 결과, ELISA 측정값은 31 ㎕/㎖ 였다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 피브리노겐 동결 건조 분말 (보르힐) 에 대해서도 동일하게 ELISA 측정을 실시한 결과, ELISA 측정값은 90 ㎕/㎖ 였다. 이상으로부터, 미멸균 시트에 대한 멸균 시트의 단백질 회수율은 34 ％ 였다.

실시예 4

2-프로판올에 트롬빈 함유 입자 (리컴비넌트트롬빈 1 ㎎/㎖, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 염화칼슘 및 만니톨을 함유하는 pH 7 의 수용액을 동결 건조시킨 것) 를 분산시킨 후, 13 중량％ 가 되도록 하이드록시프로필셀룰로오스 (2.0-2.9 mPa·s 닛폰 소다 제조) 를 용해시켜, 트롬빈 함유 입자/하이드록시프로필셀룰로오스 ＝ 100/100 (w/w) 의 도프액을 조제하였다. 일렉트로 스피닝법에 의해 방사를 실시하여, 시트상의 섬유 성형체를 얻었다. 얻어진 섬유 성형체의 두께는 204 ㎛, 겉보기 중량은 2.08 ㎎/㎠, 부피 밀도 101 ㎎/㎤ 였다. 얻어진 시트를 직경 1 ㎝ 로 잘라내어, 200 ㎕ 의 생리 식염수로 단백질을 추출하여 활성 측정을 실시하였다. 그 결과, 활성 측정값은 110.3 U/㎠ 였다. 얻어진 시트는, 30 kGy 의 전자선을 조사하여 멸균한 후, 트롬빈 활성을 측정하였다. 전자선 조사 직후의 트롬빈 활성은, 멸균 전을 100 ％ 로 했을 때, 68.4 ％ 의 유지율이었다.

비교예 2

트롬빈 함유 입자 (리컴비넌트트롬빈 1 ㎎/㎖, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 염화칼슘 및 만니톨을 함유하는 pH 7 의 수용액을 동결 건조시킨 것) 에 30 kGy 의 전자선을 조사하여 멸균한 후, 트롬빈 활성을 측정하였다. 조사 전의 트롬빈 활성은 404.73 U/바이알이었다. 전자선 조사 직후의 트롬빈 활성은, 멸균 전을 100 ％ 로 했을 때, 51.8 ％ 의 유지율이었다.

실시예 5 ∼ 6 및 비교예 3 ∼ 4 에 대한 측정법

1. 평균 두께 :

적당한 사이즈로 컷한 조성물을 고정밀도 디지털 측장기 (주식회사 미츠토요 : 상품명 「라이트매틱 VL-50」) 를 이용하여 측장력 0.01 N 에 의해 n ＝ 9 로 섬유 성형체의 막두께를 측정한 평균값을 산출하였다. 또한, 본 측정에 있어서는 측정 기기가 사용 가능한 최소의 측정력으로 측정을 실시하였다.

2. 효소 활성 측정

리파아제의 활성 측정에는 Continuous Fluorometric Lipase Test 키트 (PROGEN BIOTECHNIK GMBH 제조) 를 사용하였다. 이하의 식에 의해 활성 유지율을 산출하였다. 활성 효소량은 활성값으로부터 농도 환산하여 산출하였다.

활성 유지율 (％) ＝ {멸균 후의 활성 효소량 (㎎/㎠)/멸균 전의 활성 효소량 (㎎/㎠)} × 100

한편, β-글루코시다아제의 활성 측정에는 Tokyogreen (등록 상표, 이하 동일) -βGlu (세키스이 메디칼 주식회사) 를 사용한 형광 측정에 의해 실시하였다. 이하의 식에 의해 활성 회수율을 산출하였다. 고정화 효소 이론 중량은, 주입 효소 분말 중량％ 와 조성물의 중량으로부터 산출하였다.

활성 회수율 (％) ＝ {활성 효소량 (㎎)/(고정화 효소 이론 중량 (㎎)} × 100

이하의 식에 의해 활성 유지율을 산출하였다.

활성 유지율 (％) ＝ {멸균 후의 활성 회수율 (％)/멸균 전의 활성 회수율 (％)} × 100

실시예 5

2-프로판올에 리파아제 분말 (돼지 췌장 유래, 와코 쥰야쿠 제조, 이하 동일) 을 분산시킨 후, 13 wt％ 가 되도록 하이드록시프로필셀룰로오스 (6-10 mPa·s 와코 쥰야쿠 제조) 를 용해시켜, 리파아제 분말/하이드록시프로필셀룰로오스 ＝ 50/100 (w/w) 의 방사액을 조제하였다. 온도 27 ℃, 습도 27 ％ 이하에서 일렉트로 스피닝법에 의해 방사를 실시하여, 시트상의 섬유 성형체를 얻었다. 분출 노즐의 내경은 0.8 ㎜, 전압은 18 ㎸, 방사액 유량은 1.2 ㎖/h, 분출 노즐로부터 평판까지의 거리는 16.5 ㎝ 였다. 얻어진 섬유 성형체 (10 ㎝ × 14 ㎝) 의 평균 두께는 168 ㎛ 였다. 얻어진 섬유 성형체를 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 멸균한 섬유 성형체를 1 ㎝ × 1 ㎝ 로 절단한 후, 키트에 포함되는 Lipase buffer 1 ㎖ 로 리파아제를 추출하여 활성 측정을 실시하였다. 그 결과, 활성 효소량은 0.46 ㎎/㎠ 였다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 시트에 대해서도 동일하게 활성 측정을 실시한 결과, 활성 효소량은 0.40 ㎎/㎠ 였다. 이상으로부터, 미멸균 섬유 성형체에 대한 멸균 섬유 성형체의 활성 유지율은 115 ％ 이고, 전자선 멸균에 의해 실활되어 있지 않은 것을 알 수 있었다.

실시예 6

2-프로판올에 리파아제 분말을 분산시킨 후, 13 wt％ 가 되도록 하이드록시프로필셀룰로오스 (6-10 mPa·s, 와코 쥰야쿠 제조) 를 용해시켜, 리파아제 분말/하이드록시프로필셀룰로오스 ＝ 50/100(w/w) 의 캐스트액을 조제하였다. 독터 블레이드 (YOSHIMITSU 제조, YBA-3 형) 를 이용하여, 도포폭 15 mil 로 캐스팅하여 시트를 얻었다. 얻어진 시트 (4 ㎝ × 6 ㎝) 의 평균 두께는 180 ㎛ 였다. 얻어진 시트를 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 멸균한 시트를 1 ㎝ × 1 ㎝ 로 절단한 후, 키트에 포함되는 Lipase buffer 1 ㎖ 로 리파아제를 추출하여 활성 측정을 실시하였다. 그 결과, 활성 효소량은 0.69 ㎎/㎠ 였다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 시트에 대해서도 동일하게 활성 측정을 실시한 결과, 활성 효소량은 0.64 ㎎/㎠ 였다. 이상으로부터, 미멸균 시트에 대한 멸균 시트의 활성 유지율은 108 ％ 이고, 전자선 멸균에 의해 실활되어 있지 않은 것을 알 수 있었다.

실시예 7

2-프로판올에 β-글루코시다아제 분말 (아몬드 유래, 오리엔탈 효모 공업 제조, 이하 동일) 을 분산시킨 후, 13 wt％ 가 되도록 하이드록시프로필셀룰로오스 (6-10 mPa·s 와코 쥰야쿠 제조) 를 용해시켜, β-글루코시다아제 분말/하이드록시프로필셀룰로오스 ＝ 38/62(w/w) 의 방사액을 조제하였다. 온도 27 ℃, 습도 27 ％ 이하에서 일렉트로 스피닝법에 의해 방사를 실시하여, 시트상의 섬유 성형체를 얻었다. 분출 노즐의 내경은 0.9 ㎜, 전압은 18 ㎸, 방사액 유량은 1.2 ㎖/h, 분출 노즐로부터 평판까지의 거리는 16.5 ㎝ 였다. 얻어진 섬유 성형체 (10 ㎝ × 10 ㎝) 의 평균 두께는 207 ㎛ 였다. 얻어진 섬유 성형체를 2 ㎝ × 2 ㎝ 로 절단한 후, 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 얻어진 멸균 시트를 생리 식염수 1 ㎖ 로 β-글루코시다아제를 추출하여 Tokyogreen-βGlu 로 활성 측정을 실시하였다. 그 결과, 활성 회수율은 42 ％ 였다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 시트에 대해서도 동일하게 활성 측정을 실시한 결과, 활성 회수율은 46 ％ 였다. 이상으로부터, 미멸균 섬유 성형체에 대한 멸균 섬유 성형체의 활성 유지율은 91 ％ 이고, 셀룰로오스에테르 유도체에 포함됨으로써 효소의 실활을 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다.

비교예 3

리파아제 분말을 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 분말 1 ㎎ 에 1 ㎖ 의 Lipase buffer 를 첨가하여 활성 측정을 실시하였다. 그 결과, 활성값은 0.25 p㏖/㎖·min. 이었다. 한편, 멸균 처리되어 있지 않은 리파아제 분말에 대해서도 동일하게 활성 측정을 실시한 결과, 활성값은 0.34 pmol/㎖·min. 이었다.

이상으로부터, 미멸균 분말에 대한 멸균 분말의 활성 유지율은 74 ％ 였다.

비교예 4

β-글루코시다아제 분말을 20 kGy 로 전자선 멸균하였다. 분말 2 ㎎ 을 1 ㎖ 의 생리 식염수에 용해시켜, Tokyogreen-βGlu 로 활성 측정을 실시하였다. 그 결과, 활성 유지율은 81 ％ 였다.

실시예 8 ∼ 10 에 대한 측정법

피브리노겐 동결 건조 분말 (피브리노겐 함유 입자) 에 대해 전자선을 조사했을 때, 피브리노겐의 변화 (응집체 증가, 겔 강도 저하) 가 발생한다. 전자선 조사에 의한 피브리노겐의 변화를 억제하는 효과 (멸균 내성 효과) 를 조사하기 위해, 피브리노겐의 벌크액을 조제하여, 5 ㎖ 의 유리 바이알에 1 ㎖ 를 충전한 후에 동결 건조를 실시하였다. 동결 건조가 종료된 일부의 바이알에 대해 30 kGy 의 전자선을 조사하고, 멸균 전후의 비교를 각 동결 건조품에 대해 실시하였다.

비교 평가는, 소형 탁상 시험기 EZTest (시마즈 제작소 제조) 에 의한 겔 강도 측정 및 BioSep-SEC-s4000 (Phenomenex 사 제조) 에 의한 응집체 함량 측정 (분석 조건 : 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 아르기닌염산염을 이동상으로 하여, 유속 1.0 ㎖/min 으로 분획, 280 ㎚ 의 파장에 의해 목적 물질을 검출 ; 단량체 피크보다 빨리 검출되는 피크를 응집체로 하여 정량) 을 실시하였다.

분석에 있어서의 검체 (분석용 검체) 조제 순서는, 미멸균 동결 건조품 및 멸균제 동결 건조품의 바이알을 1 ㎖ 의 증류수에 의해 용해. 그 용액을 원심 튜브 15000 rpm × 5 분간 원심하고, 0.45 ㎛ 의 여과 필터를 통액한 후, 분석용 검체로서 사용하였다.

실시예 8

이하의 방법에 의해 셀룰로오스에테르 유도체와 특정 첨가제의 조합에 의한 단백질의 멸균 내성 효과를 조사하였다.

(방법) 「셀룰로오스에테르 유도체 ＋ 특정 첨가제」 조성 (하기 표 1 의 No.1 ∼ 6 에 나타내는 조성 ①) 및 이들로부터 셀룰로오스에테르 유도체를 제외한 조성에 상당하는 조성 ② 의, 피브리노겐의 벌크액을 이용하여 그 겔 강도를 측정함으로써 피브리노겐으로서의 기능을 평가하고 멸균 전후의 겔 강도를 비교함으로써 멸균 내성 효과를 조사하였다. 결과를 표 2 에 나타내었다.

조성 ① (동결 건조 분말과 하이드록시프로필셀룰로오스를 2-프로판올에 현탁한 후 시트화), 조성 ② (동결 건조 분말) 모두, 각 시료를 1 ％ Fbg 농도가 되도록 물로 용해시킨 후, 10 mM 아르기닌, 270 mM 염화나트륨, pH 8.5 의 완충액으로 2 ㎎/㎖ 의 농도가 되도록 희석하였다.

2 ㎖ 폴리프로필렌 튜브에 피브로가민 (240 단위/㎖) 10 ㎕, 트롬빈 용액 (0.2 ㎎/㎖, 100 mM 염화칼슘을 포함한다) 110 ㎕ 를 첨가하고, 피펫팅 후에 2 ㎎/㎖ 의 피브리노겐 용액 900 ㎕ 를 기포가 들어가지 않도록 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 소형 탁상 시험기 EZTest (시마즈 제작소 제조) 로 겔의 강도를 측정하였다.

[표 1]

조성 ② : 특정 첨가제 조성

상기 조성 ① 에 대해 셀룰로오스에테르 유도체 (하이드록시프로필셀룰로오스 : HPC) 를 함유하지 않는 것.

(결과)

멸균 전을 100 으로 한 경우의 멸균 후의 겔 강도의 값을 표 2 및 도 1 에 나타낸다.

[표 2]

셀룰로오스 유도체와 특정 첨가제의 조합에 의한 단박질의 멸균 내성 효과

조성 No.1 에서 셀룰로오스에테르 유도체의 존재에 의한 멸균 내성 향상 효과가 확인되지 않은 것에 반해, 조성 No.2 ∼ 6 에서는 셀룰로오스에테르 유도체의 존재에 의한 동일 효과가 확인되었고, 특히 조성 No.3 ∼ 6 에서 현저하였다.

실시예 9

실시예 8 과 동일한 방법에 의해, 하기 표 3 의 조성 (2 종) 에 의해 글리신의 멸균 내성 효과를 조사하였다. 결과를 표 4 에 나타내었다.

[표 3]

글리신에 의한 멸균 내성 효과 평가 조성

[표 4]

글리신에 의한 멸균 내성 효과 평가 결과

글리신 첨가에 의해 피브리노겐 응집체 함량 증가를 억제하였다.

실시예 10

실시예 8 과 동일한 방법에 의해, 셀룰로오스에테르 유도체와 특정 첨가제의 조합에 의한 멸균 내성 효과를 조사하였다.

셀룰로오스에테르 유도체로서 하이드록시프로필셀룰로오스 (HPC) 및 하기 표 5 의 8 종의 조성의 피브리노겐의 벌크 용액을 사용하였다. 1.0 ％ 피브리노겐, 110 mM 염화나트륨, 1.0 ％ 글리신, 0.2 ％ 만니톨은 하기 8 종의 조성에 대하여 공통이다. 결과를 표 6 과 도 2 에 나타내었다.

[표 5]

셀룰로오스에테르 유도체와 특정 첨가제의 조합에 의한 멸균 내성 효과

[표 6]

셀룰로오스에테르 유도체와 특정 첨가제의 조합에 의한 멸균 내성 효과 평가

셀룰로오스에테르 유도체 첨가에 의해, 단백질 응집체 함량의 증가가 억제되었다. 또, 셀룰로오스에테르 유도체의 존재에 의한 동 함량의 증가 억제 효과는, 페닐알라닌과 히스티딘이 공존하는 조성 2 ∼ 4 에서 현저하였다. 이것으로부터, 실시예 7 에 있어서 조성 No.1 에서 셀룰로오스에테르 유도체의 존재에 의한 멸균 내성 향상 효과가 확인되지 않은 것에 반해, 조성 No.3 ∼ 6 에서 확인되고 또한 현저했던 것은, 조성 No.3 ∼ 6 의 페닐알라닌과 히스티딘이 셀룰로오스에테르 유도체와 공존함으로써 현저한 단백의 멸균 내성 효과를 초래하고 있기 때문이라고 생각되었다.

발명의 효과

본 발명의 단백질 조성물은 방사선 멸균 내성을 갖는다. 본 발명의 멸균 조성물은, 멸균되어 있으면서 단백질의 구조나 기능이 유지되고 있다.

산업상 이용가능성

본 발명의 단백질 조성물은, 예를 들어 단백질의 기능 및 멸균성이 요구되는 의료품의 제조업에서 이용된다.

Claims

첨가제로서, 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물, 및/또는 셀룰로오스에테르 유도체를 포함하는 단백질 조성물.
제 1 항에 있어서,
첨가제가 셀룰로오스에테르 유도체이고, 단백질이 셀룰로오스에테르 유도체에 함유된 상태로 존재하는 단백질 조성물.
제 1 항에 있어서,
첨가제가 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물인 단백질 조성물.
제 1 항에 있어서,
첨가제가 글리신과 페닐알라닌과 히스티딘으로 이루어지는 혼합물, 및 셀룰로오스에테르 유도체이고, 단백질이 셀룰로오스에테르 유도체에 함유된 상태로 존재하고 있는 단백질 조성물.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
셀룰로오스에테르 유도체가 하이드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질 조성물.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
셀룰로오스에테르 유도체가 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질 조성물.
제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
셀룰로오스에테르 유도체가 하이드록시프로필셀룰로오스인 단백질 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
단백질이 효소, 수송 단백질, 근육 단백질, 방어 단백질, 독소 단백질, 단백질 호르몬, 저장 단백질, 구조 단백질, 성장 인자, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
단백질이 피브리노겐인 단백질 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
필름 형상인 단백질 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
섬유 형상 또는 부직포 형상인 단백질 조성물.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
방사선 멸균된 단백질 조성물.