KR20010040687A - 치료용 펩타이드와 다당류가 결합된 멸균 복합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료용 펩타이드와 셀룰로즈 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다당류와의 복합체(당해 복합체는 이온화 방사선으로 멸균된다)를 포함하는 멸균 조성물을 제공한다. 놀랍게도 다당류가 존재하면 이온화 조건, 특히 γ-방사선하에 치료용 펩타이드가 분해되지 않도록 안정화시킨다. 또한, 본 발명은 멸균 조성물의 제조방법 및 멸균 치료용 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

Description

치료용 펩타이드와 다당류가 결합된 멸균 복합체{Sterile complex of therapeutic peptide bond to a polysaccharide}

본 발명은 하나 이상의 치료용 펩타이드를 포함하는 멸균 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당해 조성물의 제조방법 및 치료용 멸균 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

천연 및 합성 펩타이드 화합물은 치료에 있어서 활성제로서 중요성이 점점 더 증가하고 있다. 특히 상처를 치료하는 데 성장 인자, 예를 들면, 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 골 형태발생 단백질, 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF) 및 전환 성장 인자(TGF)의 사용이 특히 중요하다. 성장 인자는 재조합 DNA 합성 기술로부터 실질적인 양으로 얻을 수 있게 되어, 성장 인자 투여용 멸균 조성물에 대한 수요가 증가되고 있다.

펩타이드를 기본으로 하는 약제의 특징은, 대부분의 펩타이드가 소화관에서 분해되기 때문에 장 투여에 적합하지 않다는 것이다. 따라서, 대부분의 펩타이드 약제는 비경구적으로 투여해야 하고, 특히 국소적 또는 정맥내로 투여해야 한다. 이러한 투여 방법을 위해, 펩타이드 조성물을 멸균시켜야 한다. 즉, 당해 조성물은 실질적으로 생존가능한 미생물, 바이러스 및 DNA 단편을 포함하지 않아야 한다.

치료용 펩타이드를 포함하는 조성물을 멸균시키고자 하는 경우에 어려움이 있다. 특히 물의 존재하에 멸균을 수행하는 경우, 통상의 멸균방법, 예를 들면, 오토클레이브에서의 가열 또는 γ-방사선은, 종종 치료용 펩타이드의 생물학적 활성을 감소시킨다. 또한, 화학적 멸균제는 산화제에 대한 펩타이드의 민감도, pH 변화, 이온 강도 또는 온도 변화 때문에 적합하지 않다. 에틸렌 옥사이드를 사용하는 멸균도, 에틸렌 옥사이드와 특정 펩타이드와의 반응성 및 추가로 생성물 내의 허용되지 않는 에틸렌 옥사이드 잔기 및 유해 반응 생성물 때문에 부적합하다.

과거에, 펩타이드를 기본으로 하는 약제는 무균 조건하에 멸균된 출발 물질로부터 제형화되었다. 이러한 무균 제조는 비교적 비용이 많이 들고 수행하기가 어렵다. 펩타이드 함유 용액은 또한 한외여과로 멸균시키지만, 이 방법은 거대분자를 함유하는 조성물 또는 고체 또는 반고체 조성물에는 적합하지 않다.

EP-A 제0238839호에는 트립신과 같은 효소를 함침시킨 흡수성 셀룰로즈 시트를 포함하는 상처 드레싱이 기재되어 있다. 상처 드레싱은 무균 조건하에 제조 및 건조시키고, 명백하게 이후에 멸균을 수행하지 않는다.

EP-A 제0312208호에는 사람의 유사분열촉진 활성 또는 맥관형성 활성을 갖는 폴리펩타이드 성장 인자를 함유하는 겔 조성물이 기재되어 있다. 겔 조성물은 상처에 국소 도포하는 데 적합하고, 성장 인자가 수성 용액에 저장되는 경우에 일반적으로 발생하는 생물학적 활성 손실에 대해 폴리펩타이드 성장 인자를 안정화시킬 수 있다고 알려진 셀룰로즈 유도체를 포함한다. 메틸 셀룰로즈 및 하이드록시알킬 셀룰로즈 유도체가 바람직하다. 겔은 펩타이드 성장 인자를 첨가하기 전에 안정화시키고, 이어서 멸균 조건하에 펩타이드 성장 인자를 첨가한다. 따라서, 제형화 후에 조성물을 멸균시키지 않는 것 같다. 이와 유사한 조성물이 EP-A 제0267015호에 기재되어 있다.

EP-A 제0308238호에는 폴리펩타이드 성장 인자를 포함하는 안정한 동결 건조 조성물이 기재되어 있다. 동결 건조는 물 속에서의 가수분해에 의한 활성 손실에 대해 성장 인자를 안정화시킨다. 동결 건조된 조성물은 증량제, 예를 들면, 셀룰로즈 유도체를 포함한 수용성 또는 수팽창성 중합체를 포함한다. 당해 특허문헌의 명세서에는 성장 인자 이외의 출발 물질을 오토클레이브 멸균시키고 성장 인자를 멸균 여과시켜 멸균 동결 건조 제품을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 명백하게도 당해 특허원에는 최종 동결 건조 펩타이드 조성물의 멸균이 고려되어 있지 않다.

WO 제95/02411호에는 4℃에서 성장 인자의 장기간 생화학적 안정성을 나타내는 폴리펩타이드 성장 인자를 포함하는 수성 조성물이 기재되어 있다. 성장 인자는 pH 2.8 내지 3.8의 조성물을 제공함으로써 안정화된다. 그러나, 성장 인자를 함유하는 조성물의 멸균법은 당해 명세서에 기재되어 있지 않다.

EP-A 제0437095호에는 ORC를 나트륨 아세테이트 용액 등으로 처리함으로써 중화된 산화 셀룰로즈 생성물(nORC)의 제조방법이 기재되어 있다. 중화된 생성물은 트롬빈과 같은 산 민감성 지혈제에 함침시켜 이의 지혈성을 향상시키거나, 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA)와 같은 산 민감성 유착 방지제에 함침시켜 이의 유착 방지 특성을 향상시킬 수 있다. 다른 양태에 있어서, 직물을 성장 인자와 같은 약제에 함침시킨다.

ORC 및 n-ORC는 둘 다 γ-방사선으로 멸균시킬 수 있고, EP-A 제0437095호에는 또한 헤파린 또는 헤파린 단편과 복합체를 형성한 n-ORC를 γ-방사선으로 멸균시킬 수 있는 것으로 교시되어 있다. 그러나, 당해 공보에는 펩타이드가 결합되어 있는 ORC 또는 n-ORC의 멸균방법은 기재되어 있지 않다.

EP-A 제0562864호에는 콜라겐 스폰지로 이루어진 매트릭스, 예를 들어 산화된 재생 셀룰로즈(ORC)의 분산 섬유일 수 있는 제2 생체흡수성 중합체로 이루어진 하부구조물, 및 펩타이드일 수 있는 활성제를 포함하는 복합 상처 드레싱 물질이 기재되어 있다. 활성제는 매트릭스, 하부구조물 또는 이들 둘 다에 제공될 수 있다. 복합 스폰지 물질은 포장되고 멸균될 수 있다. 당해 공보에 기재되어 있는 물질은 본질적으로 균질하지 않다. 이들은 활성제의 상 방출(phasic release)을 제공하고, 바람직하게는 세포 내로 파고드는 섬유, 필름 또는 플레이크로 이루어진 하부구조물을 포함한다.

WO 제98/00180호에는 만성 상처 치료를 위한 ORC와 콜라겐의 복합체의 용도가 기재되어 있다. 당해 공보에는 ORC가 세포 성장 인자와 함께 안정한 복합체를 형성하는 것으로 기재되어 있다.

US-A 제5730933호에는 생물학적 활성 펩타이드를 생물학적 활성의 손실없이 γ선 또는 전자빔으로 멸균시키는 방법이 기재되어 있다. 당해 방법은 젤라틴과 같은 외부 단백질과 생물학적 활성 펩타이드와의 혼합물을 형성시키는 단계, 혼합물을 동결시키거나 동결 건조시키는 단계 및 혼합물을 조사(irradation)하는 단계를 포함한다. 외부 단백질의 존재는 생물학적 활성의 손실에 대해 펩타이드를 안정화시킨다. 혼합물은 방사선 안정성을 더욱 향상시키기 위해서 유리 라디칼 스캐빈저를 추가로 함유할 수 있다. 다당류가 조사 동안에 펩타이드를 안정화시킬 수 있다는 제안은 없다.

본 발명의 목적은 펩타이드의 생물학적 활성이 멸균 후에도 유지되도록 생물학적 활성 펩타이드를 멸균시키는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 펩타이드가 멸균되기 전에 유효량의 선택된 다당류와 제형화되는 경우, 펩타이드 치료제, 특히 성장 인자가 이온화 방사선으로 멸균되는 동안에 생물학적 활성의 손실에 대해 안정화될 수 있다는 놀라운 발견에 근거한다.

제1 양태에 있어서, 본 발명은 치료용 펩타이드와, 셀룰로즈 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다당류의 복합체(당해 복합체는 이온화 방사선으로 멸균된다)를 포함하는 멸균 조성물을 제공한다.

펩타이드는 호르몬, 항체, 항체 단편, 천연 및 합성 펩타이드 항원 및 항원 단편을 포함하여 모든 치료학적 활성 펩타이드일 수 있다. 적합한 펩타이드에는 옥시토신, 바소프레신, 코르티코트로핀, 아프로티닌, 칼시토닌, 프롤락틴, 인히비틴, 인터페론, 소마토스타틴, 인슐린, 글루카곤, 심방성 나트륨 배설증가 인자(ANF), 엔도르핀, 레닌 억제제, 황체형성호르몬 방출 호르몬(LHRH), 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), 펩타이드 T 또는 이의 합성 동족체 또는 유사체가 있다. 바람직하게는, 펩타이드는 상처 치료를 촉진시키는 데 치료학적으로 활성이다. 적합한 펩타이드에는 트롬빈과 같은 지혈제 및 t-PA와 같은 항유착제가 있다. 콜라겐 단편과 같은 천연 단백질의 치료 단편도 있다. 본 발명은 수용성 펩타이드와 수불용성 펩타이드 둘 다에 적합하다. 펩타이드의 분자량은, 예를 들면, 1000 내지 100000, 바람직하게는 4000 내지 60000이다.

바람직하게는, 펩타이드는 성장 인자, 보다 바람직하게는 사람의 유사분열촉진 활성 또는 맥관형성 활성을 갖는 성장 인자를 포함한다. 보다 바람직하게는, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 변환 성장 인자(TGF-α, TGF-β₁, TGF-β₂), 신경 성장 인자(NGF-α, NGF-β), 표피 성장 인자(EGF), 골 형성발생 단백질, 인슐린형 성장 인자(IGF-I 또는 IGF-II) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명자들은 천연 다당류 및 화학적으로 개질된 다당류의 특정 그룹이 펩타이드를 이온화 방사선에 의한 멸균에 대해 안정화시키는 데 유효함을 밝혀냈다. 확인된 유효한 다당류는 (a) 셀룰로즈 유도체, (b) 키틴 및 키토산 및 (c) 갈락토만난이다. 나트륨 히알루로네이트, 펙틴, β-글루칸 또는 칼슘 알기네이트와 같은 기타 다당류는 멸균 동안에 펩타이드의 생물학적 활성을 보호하지 못하거나 체내에서 생물학적 활성 펩타이드를 방출시키지 못할 것으로 예상되기 때문에 적합하지 않다. 펩타이드 복합체의 멸균으로부터 생성된 멸균 생성물은 이의 높은 생물학적 활성과 조성물에 존재하는 특징적인 이온화 분해 단편으로 확인 가능하다.

용어 "셀룰로즈 유도체"는 화학적으로 개질된 셀룰로즈를 의미한다. 바람직하게는, 개질된 셀룰로즈는 각각 100개의 당 잔기에 대해 하나 이상의 카복실레이트 그룹을 포함하고, 보다 바람직하게는 카복실메틸 셀룰로즈, 산화된 셀룰로즈 또는 이의 염을 포함한다.

산화된 셀룰로즈는 이산화질소 또는 다른 산화제로 처리함으로써 셀룰로즈 상의 -CH₂OH 그룹 일부를 카복실레이트 그룹으로 산화시켜 제조한다. 산화된 셀룰로즈는 조직 표면에 편리하게 적용할 수 있는 생체재흡수성 및 흡수성 매트릭스를 제조하는 데 사용할 수 있다. 산화된 재생 셀룰로즈(ORC) 직물이 특히 바람직한데, 왜냐하면 이들은 레이온계 직물과 같은 재생 셀룰로즈 직물의 산화 처리에 의해 형성될 수 있기 때문이다. 이러한 ORC 직물의 두가지 예는 인터시드(INTERCEED)[존슨 앤드 존슨 메디칼, 인코포레이티드(Johnson ＆ Johnson Medical, Inc.)의 등록 상표명] 및 서지셀(SURGICEL)[존슨 앤드 존슨 메디칼, 인코포레이티드의 등록 상표명]이다. 인터시드 직물은 수술시 유착 차단체로서 사용된다. 서지셀 직물은 수술시 지혈제로서 사용되고 다른 용도로도 사용된다. ORC는 개질되지 않은 셀룰로즈 직물에 비해 중요한 잇점, 특히 생체내에서의 생체재흡수성 및 지혈성을 제공한다.

적합한 ORC는 US-A 제3122479호의 방법에 의해 또는 시판되는 인터시드 또는 서지셀 직물로부터 또는 직물을 분쇄하여 수득된 분말 형태 또는 섬유상 형태로 제조할 수 있다. 중화된 ORC는 EP-A 제0437095호에 기재되어 있는 바와 같이 제조할 수 있다. 수용성 단편을 포함하는 저분자량 ORC 단편은 국제공개공보 제WO98/00446호에 기재되어 있는 바와 같이 ORC의 알칼리 가수분해로 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서 키틴, 키토산, 및 모든 중간체를 부분적으로 탈아실화한 키토산이 또한 유효하다.

본 발명에 있어서, 갈락토만난, 즉 갈락토스와 만노스 잔기를 둘 다 포함하는 다당류도 유효하다. 바람직한 갈락토만난에는 구아 검 및 로커스트 빈 검이 있다.

본 발명에 사용되는 치료학적 활성 펩타이드와 다당류의 복합체는 기타 천연 또는 반합성 생체적합성 중합체를 위에서 언급한 다당류와의 혼합물로 추가로 포함할 수 있다. 적합한 추가의 생중합체에는 콜라겐, 피브린 및 라미닌과 같은 구조 단백질; 아텔로콜라겐 또는 펩신 용해된 콜라겐과 같은 개질된 구조 단백질; 셀룰로즈, 전분, 알기네이트, 개질된 전분 또는 뮤코다당류와 같은 추가의 다당류 및 이들의 혼합물이 있다. 바람직하게는, 추가의 생중합체는 천연 구조 단백질, 개질된 구조 단백질 및 다가음이온성 다당류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 용어 "음이온성 다당류"는 뮤코다당류, 예를 들면, 헤파린, 히알루론산, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 이의 단편 및 이의 염을 포함한다.

본 명세서에서 용어 구조 단백질은 콜라겐과, 피브린 또는 라미닌과 같은 기타 구조 단백질을 의미한다. 이들은 단어의 통상적인 의미로 치료학적 활성 펩타이드가 아니다. 이러한 구조 단백질과 알기네이트간의 복합체가 US-A 제4614794호에 기재되어 있다. 이러한 구조 단백질과 ORC간의 복합체는 GB-A 제2314842호에 기재되어 있다. 이러한 복합체는 상처 치료시, 특히 만성 상처 치료에 대해 잇점을 제공한다. 바람직하게는, 구조 단백질은 필수적으로 천연 섬유상 콜라겐으로 이루어진다.

본 발명의 이러한 양태에 따르는 조성물은 바람직하게는 의도하는 사용을 위해 치료학적 유효량의 펩타이드를 함유한다. 통상적으로, 상처에 대한 국소 도포용 조성물의 경우, 이의 범위는 0.1 내지 10,000중량ppm, 보다 바람직하게는 1 내지 1,000중량ppm이다. 바람직하게는 조성물 속의 치료용 펩타이드 대 다당류의 중량비는 1:10 내지 1:10⁶, 보다 바람직하게는 1:100 내지 1:10⁵, 가장 바람직하게는 1:1000 내지 1:10⁴이다.

치료용 펩타이드는 다당류와 복합체를 형성한다. 즉, 치료용 펩타이드의 분자의 상당한 분획이 공유 결합, 이온 결합 또는 반데르발스 결합에 의해 다당류의 분자에 결합한다. 이는, 예를 들면, 다공성 또는 직물 다당류 기질에 박층을 도포하거나 펩타이드와 다당류를 균일하게 혼합함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는 치료용 펩타이드는 다당류에 공유 결합되지 않는다.

결합된 펩타이드가 복합체로부터 매우 용이하게 방출될 수 있다는 것이 본 발명에 사용되는 다당류의 또 다른 잇점이다. 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상의 펩타이드 생물학적 활성(결합하기 전의 펩타이드의 활성 기준)이 복합체를 20℃에서 24시간 동안 물 또는 혈청 속에 단순히 침지시킴으로써 복합체로부터 수용액 속으로 방출될 수 있다.

복합체는 통상적으로 치료용 펩타이드와 다당류를 분자 수준으로 균일하게 혼합함으로써, 예를 들면, 치료용 펩타이드와 다당류를 용매에 동시에 분산시킨 후, 용매를 제거함으로써 형성시킨다.

바람직하게는, 치료용 펩타이드와 다당류의 복합체는 약제학적으로 허용되는 담체 속에 분산되어 있는 고형 또는 콜로이드성 입자 형태이다. 바람직하게는, 입자 직경은 50㎛ 미만, 보다 바람직하게는 10㎛ 미만, 가장 바람직하게는 2㎛ 미만이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 고형 표면 또는 고형 매트릭스일 수 있다. 그러나, 바람직하게는 담체는 치료용 펩타이드와 다당류가 분산되는 수성 액체 또는 겔이다. 특정 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따르는 멸균 조성물은 바람직하게는 20℃에서의 점도가 100Ns/m 이상인 점성 액체 또는 겔이고, 사람 또는 동물 몸체, 특히 상처에 국소 투여하기에 적합하다.

또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따르는 멸균 조성물은 치료용 펩타이드와 다당류를 함유하는 액체, 예를 들면, 완충 염수이고, 사람 또는 동물 몸체에 정맥내 투여하기에 적합하다.

또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 멸균 조성물은 고형 약제학적 담체를 포함할 수 있고, 치료용 펩타이드와 다당류는 담체의 표면에 피복된다. 바람직하게는, 고형 담체는 상처의 표면에 적용하기에 적합한 직물 또는 부직포, 중합체 필름 또는 웹이다. 특히 바람직한 고형 담체는 생체흡수성 고형 담체, 특히 ORC 직물 또는 ORC 부직포이다. 이들 양태는, 예를 들면, 다당류의 고형 담체(또는 다당류로 도포된 고형 담체)에 치료용 펩타이드를 도포하고, 건조시켜 고형 담체의 표면에 펩타이드/다당류 복합체를 형성시킨 후, 멸균시킴으로써 제조될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 멸균 조성물은 멸균 포장된다. 즉, 멸균 미생물-불침투성 용기내에 이들을 포장하는 것이 바람직하다.

두번째 양태에서, 본 발명은 치료용 펩타이드와 셀룰로즈 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다당류와의 복합체를 제공하는 단계,

당해 복합체를 멸균시키는 단계 및

이어서 당해 복합체를 약제학적으로 허용되는 담체 내에 또는 약제학적으로 허용되는 담체 위에 분산시키는 단계를 포함하여, 멸균 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

바람직한 치료용 펩타이드, 다당류 및 약제학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 첫번째 양태와 관련하여 이전에서 정의한 바와 같다.

바람직하게는 복합체는, 치료용 펩타이드 및 다당류를 용매에 분산시킨 다음, 용매를 제거하여 복합체를 잔류시킴으로써 형성시킨다. 바람직하게는, 용매는 수성 용매이고, 보다 바람직하게는 필수적으로 물로 이루어진다. 바람직하게는, 용매는 동결 건조시키거나 용매 건조시켜 제거한다. 이로써 치료용 펩타이드가 접촉되어 있는, 다공성 다당류 스펀지(sponge)가 일반적으로 생성된다. 이어서 이 물질을 분쇄시킨 후 약제학적으로 허용되는 담체중에 분산시킬 수 있다.

다른 바람직한 양태에서, 다당류는 직물 또는 부직포, 중합체 필름, 웹 또는 스펀지의 형태이고, 바람직하게는 다당류를 치료용 펩타이드 용액중에 침지시킴으로써 치료용 펩타이드로 피복시킨다. 이어서, 용매를 증발시켜 제거함으로써 표면에 치료용 펩타이드 복합체를 갖는 다당류 담체를 잔류시킨다.

복합체의 멸균 단계는 바람직하게는 물 10중량% 미만, 보다 바람직하게는 4중량% 미만을 포함하고, 가장 바람직하게는 실질적으로 무수 상태인 치료용 펩타이드/다당류 복합체에 대해 수행하는 것이 바람직하다. 멸균은 오토클레이빙(autoclaving) 및 에틸렌 옥사이드 처리를 포함하는 임의의 통상적인 방법으로 수행할 수 있다. 바람직하게는 멸균은, 예를 들어 스테라드(STERAD)(등록상표) 기기상에서 기체 플라즈마로 처리하여 수행한다. 바람직하게는, 멸균은 자외선, 전자 빔 또는 γ-방사선과 같은 이온화 방사선으로 수행한다. 이온화 방사선은, 가장 바람직하게는 1 내지 50kGy 이상, 바람직하게는 20 내지 30kGy의 코발트-60방사선의 멸균량의 감마 방사선이 더욱 바람직하다. 즉, 약 1 내지 3mRad의 감마 방사선이 바람직하다. 놀랍게도, 선택된 다당류와 복합체를 형성한 치료용 펩타이드의 조사는, γ-방사선에 의해 펩타이드가 분해되는 경향이 있는 것으로 익히 공지되어 있음에도 불구하고, 실질적으로 치료용 펩타이드의 활성을 저하시키지 않는다. 특정한 이론에 한정됨이 없이, 상기한 다당류와 복합체를 형성한 치료용 펩타이드의 놀라운 안정성은 방사선에 의해 생성되는 유리 라디칼에 대한 포획제로서 작용하는 다당류에 기인할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 생물학적 활성 펩타이드와 다당류의 복합체는 유리 라디칼 스캐빈저를 추가로 포함할 수 있다. 사용하기에 적합한 스캐빈저에는 토코페롤, 시트르산, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 3급 부틸 하이드로퀴논, 프로필갈레이트, 아스코르베이트와 같은 항산화제와 식품 및 약물용으로 안전한 것으로 일반적으로 인지되고 있는 다른 항산화제가 포함된다. 바람직하게는 복합체는 유리 라디칼 스캐빈저를 약 0.01 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5중량%로 포함한다.

바람직하게는, 분산 단계는 멸균 단계 이후에 무균 상태하에서 수행한다. 이는, 치료용 펩타이드와 다당류의 무수 복합체를 멸균시킨 다음, 무균 조건하에 멸균된 복합체를 액체, 겔 또는 반고체 담체에 분산시켜 멸균 치료 조성물을 형성하는 경우에 특히 유용하다.

세번째 양태에서, 본 발명은 치료용 펩타이드를 제공하는 단계,

치료용 펩타이드와 셀룰로즈 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다당류와의 복합체를 형성시키는 단계,

당해 복합체를 멸균시키는 단계 및

이어서 무균 조건하에 당해 복합체로부터 치료용 펩타이드를 분리하여 멸균 치료용 펩타이드를 수득하는 단계를 포함하여, 멸균 치료용 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이러한 양태는 표준 멸균 상태하에 분해로부터 치료용 펩타이드를 안정화시키는 다당류의 탁월한 능력을 다시 이용하는 것이다. 바람직한 치료용 펩타이드, 다당류 및 멸균 방법은 본 발명의 첫번째 및 두번째 양태에서 명시한 바와 같다.

바람직하게는, 치료용 펩타이드는 용매 추출, 바람직하게는 수성 용매 추출에 의해 간단히 멸균 복합체로부터 분리시킨다. 따라서, 예를 들어 수불용성 다당류와 함께 가용성 치료용 펩타이드를 포함하는 복합체는, 복합체를 물에 분산시키거나 현탁시킨 다음, 여과 또는 미세여과시켜 용해된 치료용 펩타이드를 다당류로부터 분리시킴으로써 간단히 분리할 수 있다. ORC 또는 키토산이 수용액에서 결합된 펩타이드를 용이하게 방출시키기는 것으로 나타나기 때문에, 특히 유리하다. 크로마토그래피와 같은 다른 통상적인 무균 분리 방법을 또한 사용할 수도 있다. 멸균 치료용 펩타이드는 크로마토그래피 등으로 추가로 정제할 수 있고, 동결 건조에 의해 농축시킬 수 있다. 바람직하게는, 멸균 치료용 펩타이드는 실질적으로 정제된다.

요약하면, 본 발명은, 치료용 펩타이드와 선택된 다당류와의 복합체를 형성시킴으로써 표준 멸균 조건하에 치료용 펩타이드를 분해되지 않도록 안정화시킨다. 바람직하게는, 복합체는 무수 상태, 즉 동결 건조된 복합체이다. 생성된 멸균 복합체는 국소 또는 비경구 투여를 위한 통상적인 치료용 생성물로서 제형화시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 생물학적 활성 손실이 감소된, 이온화 방사선을 사용하여 치료용 펩타이드를 멸균시키는데 사용하기 위한 치료용 펩타이드와의 복합체를 제조하기 위한, 셀룰로스 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다당류의 용도를 제공한다. 바람직하게는 펩타이드의 원래의 생물학적 활성의 20% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상이 멸균된 복합체로부터 회수될 수 있다.

또한, 본 발명은 펩타이드와 셀룰로스 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다당류와의 복합체를 형성시키고, 이온화 방사선을 사용하여 이러한 복합체를 멸균시킴을 포함하여, 생물학적 활성 손실이 감소된 생물학적 활성 펩타이드를 멸균시키는 방법을 포함한다.

본 발명의 특정 양태는 수반되는 도면을 참조로 추가로 기술될 것이다.

도 1은 γ-방사선으로 멸균시키기 전 및 멸균시킨 후의 동결 건조된 PDGF(비교 실시예)의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 γ-방사선으로 멸균시키기 전(그늘지지않은 막대) 및 멸균시킨 후(그늘진 막대)의 (i) 콜라겐만으로, (ii) ORC만으로 및 (iii) 콜라겐/ORC 혼합물과 복합체를 형성한 PDGF 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 (i) γ-방사선을 사용하지 않은, 키토산과 복합체를 형성한 PDGF; (ii) 55:45의 콜라겐/키토산 혼합물과 복합체를 형성한 PDGF; (iii) 키토산과 복합체를 형성하고 γ-방사선으로 멸균된 PDGF 및 (iv) 55:45의 콜라겐/키토산 블렌드와 복합체를 형성하고 γ-방사선에 의해 멸균된 PDGF 복합체의 경우, 추출 시간에 대한 용액중에서 측정된 PDGF 활성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 (i) γ-방사선을 사용하지 않은, 나트륨 히알루로네이트(NaHA)와 복합체를 형성한 PDGF; (ii) 55:45의 콜라겐/NaHA 혼합물과 복합체를 형성한 PDGF; (iii) NaHA와 복합체를 형성하고 γ-방사선으로 멸균된 PDGF 및 (iv) 55:45의 콜라겐/NaHA 블렌드와 복합체를 형성하고 γ-방사선에 의해 멸균된 PDGF 복합체의 경우, 추출시간에 대한 용액중에서 측정된 PDGF 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 (i) γ-방사선을 사용하지 않은, 펙틴과 복합체를 형성한 PDGF; (ii) 55:45의 콜라겐/펙틴 혼합물과 복합체를 형성한 PDGF; (iii) 펙틴과 복합체를 형성하고 γ-방사선으로 멸균된 PDGF 및 (iv) 55:45의 콜라겐/펙틴 블렌드와 복합체를 형성하고 γ-방사선에 의해 멸균된 PDGF 복합체의 경우, 추출 시간에 대한 용액중에서 측정된 PDGF 활성을 나타낸 그래프이다.

도 6은 (i) γ-방사선을 사용하지 않은, 로커스트 빈 검과 복합체를 형성한 PDGF; (ii) 55:45의 콜라겐/로커스트 빈 검 혼합물과 복합체를 형성한 PDGF; (iii) 로커스트 빈 검과 복합체를 형성하고 γ-방사선으로 멸균된 PDGF 및 (iv) 55:45의 콜라겐/로커스트 빈 검 블렌드와 복합체를 형성하고 γ-방사선에 의해 멸균된 PDGF 복합체의 경우, 추출 시간에 대한 용액중에서 측정된 PDGF 활성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 (i) γ-방사선을 사용하지 않은, 베타 글루칸과 복합체를 형성한 PDGF; (ii) 55:45의 콜라겐/베타 글루칸 혼합물과 복합체를 형성한 PDGF; (iii) 베타 글루칸과 복합체를 형성하고 γ-방사선으로 멸균된 PDGF 및 (iv) 55:45의 콜라겐/베타 글루칸 블렌드와 복합체를 형성하고 γ-방사선에 의해 멸균된 PDGF 복합체의 경우, 추출 시간에 대한 용액중에서 측정된 PDGF 활성을 나타낸 그래프이다:

도 8은 (i) γ-방사선을 사용하지 않은, 알기네이트와 복합체를 형성한 PDGF; (ii) 55:45의 콜라겐/알기네이트 혼합물과 복합체를 형성한 PDGF; (iii) 알기네이트와 복합체를 형성하고 γ-방사선으로PDGF 및 (iv) 55:45의 콜라겐/알기네이트 블렌드와 복합체를 형성하고 γ-방사선에 의해 멸균된 PDGF 복합체의 경우, 추출 시간에 대한 용액중에서 측정된 PDGF 활성을 나타낸 그래프이다.

실시예 1(비교)

혈소판 유도된 성장 인자(PDGF)와 복합체를 형성한 섬유상 콜라겐의 고체 스펀지는 다음과 같이 제조하고 멸균시킨다.

소의 진피로부터 유도된, 산 팽윤된 천연 콜라겐 섬유의 수성 슬러리는, 전문이 본원에서 참조 문헌으로 인용되는, 미국 특허원 제4614794호 또는 미국 특허원 제4320201호에 기술되어 있는 바와 같이 제조한다. 슬러리의 고체 함량은 1중량%이다. 슬러리는 0.05M 아세트산을 사용하여 산성화시킴으로써 콜라겐 섬유를 팽윤시킨다. 이어서, PDGF(Sigma Chemical Co.)는, 콜라겐 중량을 기본으로 하여 0중량%(대조), 0.1중량%, 0.33중량% 및 1중량%의 농도로 슬러리 샘플에 가한다. 슬러리는 탈기시킨다. 각각의 슬러리 샘플 30g을 100㎠의 페트리-디쉬에 붓고, 급속 동결시킨 다음, 밤새 동결 건조시킨다.

생성된 콜라겐 스펀지는 반으로 절단하고, 각각의 스펀지의 반쪽을⁶⁰Co γ-방사선 2.5kGy로 조사시켜 멸균시킨다. 각각의 스펀지의 다른 반쪽은 대조군으로서 멸균시키지 않고 둔다

샘플은 방법 1에서 기술한 바와 같이 PDGF 용출 및 생물학적 활성에 대해 시험한다.

전형적인 결과는 도 2에 나타내었다. 단독의 콜라겐과 복합체를 형성한 PDGF의 활성은 멸균에 의해 실질적으로 변화되지 않는 것으로 볼 수 있다.

비교 연구는 순수한 동결 건조된 PDGF상에서 수행한다. 도 1에 나타낸 결과는, 순수한 PDGF 성장 인자상에서 멸균을 수행하는 경우 PDGF 활성이 크게 감소된다는 것을 입증한다.

추가로, PDGF를 가하지 않은 콜라겐의 대조 샘플은 멸균 전 또는 후에 활성을 나타내지 않는다.

실시예 2

PDGF와 복합체를 형성한 섬유상 콜라겐/ORC의 고체 스펀지는, PDGF를 가하기 전에 콜라겐 슬러리에 분쇄된 SURGICEL^RORC 섬유 80중량%(콜라겐 중량 기준)를 가하는 것을 제외하고는, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조한다. 생성된 생성물은 콜라겐과 ORC의 중량을 기준으로 하여, 0(비교), 0.1, 0.33 및 1.0중량%의 PDGF를 포함하는 콜라겐/ORC 스펀지이다.

샘플은 방법 1에서 기술한 바와 같이 PDGF 용출 및 생물학적 활성에 대해 시험한다.

전형적인 결과는 도 2에 나타내었다. 콜라겐/ORC만으로 복합체를 형성한 PDGF의 활성은 멸균에 의해 실질적으로 변화되지 않는 것으로 볼 수 있다. 놀랍게도 멸균된 복합체로부터 생물학적으로 활성인 PDGF를 용출시키는 것이, 멸균되지 않은 복합체로부터 용출시키는 것보다 훨신 양호하다는 것을 알 수 있다.

실시예 3

PDGF로 피복된 ORC의 고체 매트릭스를 다음과 같이 제조한다.

SURGICEL^RORC 직물(2cm²)을 1% PDGF 수용액에 침지시키고 실온에서 건조시키며 절반으로 절단한다. 하나의 반쪽을 실시예 1에 기술한 바와 같이 γ-방사선으로 멸균시키고 다른 반쪽을 비교하기 위해 그대로 유지시킨다.

하기 방법 1에 기술된 바와 같이 PDGF 용출 및 생물학적 활성에 대해 샘플을 시험한다.

전형적인 결과는 도 2에 나타낸다. 단독의 ORC와 복합체를 형성한 PDGF의 생물학적 활성은 실질적으로 멸균에 의해 변화되지 않는다는 것을 알 수 있다. 더욱이, PDGF는 멸균 전후 모두에 있어서 콜라겐 복합체에서 보다 ORC 복합체에서 보다 용이하게 용출된다.

실시예 4

PDGF를 첨가하지 않고 소 폐 아프로티닌(Sigma Chemical Co.)을 콜라겐 + ORC의 중량을 기준으로 0중량%(대조구) 내지 10중량%의 양으로 첨가한다는 것을 제외하고는 아프로티닌과 복합체를 형성한 콜라겐/ORC의 고체 스폰지를 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조한다.

방법 2에 기술된 바와 같이, 아프로티닌 결합 및 활성에 대해 복합체를 시험한다. 아프로티닌이 콜라겐/ORC와 복합체를 형성한 경우, 결과는 실질적인 아프로티닌의 분획에 해당되는 활성이 γ-방사선후에도 보존된다는 것을 보여준다.

놀랍게도, 또한 결과는 아프로티닌이 비-조사된 콜라겐/ORC 매트릭스에서 보다 조사된 콜라겐/ORC 매트릭스로부터 보다 신속하게 방출된다는 것을 보여준다.

실시예 5

펩타이드와 가역적으로 결합하고 멸균시 생물학적 활성의 손실로부터 펩타이드를 안정화시키는 키토산의 능력을 다음과 같이 연구한다.

복합체의 중량을 기준으로 45중량%의 양으로 실시예 1에서는 콜라겐을 키토산으로 대체하고 실시예 2에서는 ORC를 키토산으로 대체하는 것을 제외하고는 고체 스폰지의 키토산, 및 이에 PDGF가 복합체를 형성한 55/45 콜라겐/키토산을 실시예 1 및 2에서 기술한 바와 같이 제조한다.

복합체의 샘플을 실시예 1에 기술된 바와 같이 γ-방사선으로 멸균시킨다.

혈청 용액에 의해 샘플로부터 방출되는, 생물학적으로 활성인 PDGF의 양을 시간의 함수로서 평가하기 위해 샘플에 대해 방법 1을 수행한다. 멸균된 샘플 및 멸균되지 않은 샘플 모두에 대한 데이터를 수집한다.

도 3에 설명된 결과는 최초 PDGF의 실질적인 분획이 멸균 전후에 있어서 복합체 모두로부터 방출된다는 것을 보여준다. PDGF가 콜라겐/키토산 복합체에서보다 키토산으로부터 약간 보다 용이하게 방출된다. PDGF의 생물학적 활성은 키토산 또는 콜라겐/키토산의 존재하에 멸균에 의해 영향받지 않는다.

실시예 6(비교)

펩타이드와 가역적으로 결합하고 멸균시 생물학적 활성의 손실에 대해 펩타이드를 안정화시키는 나트륨 히알루로네이트의 능력은 실시예 5의 키토산을 나트륨히알루로네이트로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기술된 바와 같이 연구한다.

방법 1에서의 결과는 도 4에 나타낸다. PDGF가 멸균 전후에 복합체로부터 용이하게 방출한다는 것을 알 수 있다. 그러나 나트륨 히알루로네이트의 존재하에서 멸균후에 방출된 PDGF의 활성이 현저하게 감소한다. 실시예 1에서 주지한 바와 같이 콜라겐이 PDGF에 대해 약간의 안정화 효과를 갖기 때문에 콜라겐/나트륨 히알루로네이트의 생물학적 활성이 덜 감소한다. 나트륨 히알루로네이트가 멸균동안에 생물학적 활성의 손실에 대해 PDGF를 안정화시키지 못하는 것으로 결론지을 수 있다.

실시예 7(비교)

펩타이드와 가역적으로 결합하고 멸균시 생물학적 활성의 손실에 대해 펩타이드를 안정화시키는 펙틴의 능력은 실시예 5의 키토산을 펙틴으로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기술된 바와 같이 연구한다.

방법 1에서의 결과는 도 5에 나타낸다. PDGF가 멸균 전후에 복합체로부터 용이하게 방출한다는 것을 알 수 있다. 그러나 펙틴의 존재하에서 멸균후에 방출된 PDGF의 활성이 현저하게 감소한다. 실시예 1에서 주지한 바와 같이 콜라겐이 PDGF에 대해 약간의 안정화 효과를 갖기 때문에 콜라겐/펙틴 복합체의 생물학적 활성이 덜 감소한다. 펙틴이 멸균동안에 생물학적 활성의 손실에 대해 PDGF를 안정화시키지 못하는 것으로 결론지을 수 있다.

실시예 8

펩타이드와 가역적으로 결합하고 멸균시 생물학적 활성의 손실에 대해 펩타이드를 안정화시키는 로커스트 빈 검의 능력은 실시예 5의 키토산을 로커스트 빈 검으로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기술된 바와 같이 연구한다.

방법 1에서의 결과는 도 6에 나타낸다. 비교적 적은 생물학적 활성의 PDGF가 멸균 전후에 복합체로부터 방출한다는 것을 알 수 있다. 그러나 로커스트 빈 검의 존재하에서 멸균후에 방출된 PDGF의 활성이 비교적 적게 감소한다. 추가로, 로커스트 빈 검이, 복합체에 존재하는 임의의 콜라겐에 의한 효과 이상으로 안정화 효과를 부여한다는 것을 알 수 있다. 로커스트 빈 검이 멸균동안에 생물학적 활성의 손실에 대해 PDGF를 안정화시키는 것으로 결론지을 수 있다.

실시예 9(비교)

펩타이드와 가역적으로 결합하고 멸균시 생물학적 활성의 손실에 대해 펩타이드를 안정화시키는 베타 글루칸의 능력은 실시예 5의 키토산을 베타 글루칸으로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기술된 바와 같이 연구한다.

방법 1에서의 결과는 도 7에 나타낸다. 비교적 적은 활성의 PDGF가 멸균 전후에 복합체로부터 방출한다는 것을 알 수 있다. 더욱이, 베타 글루칸의 존재하에서 멸균후에 방출된 PDGF의 활성이 현저하게 감소한다. 베타 글루칸이 멸균동안에 생물학적 활성의 손실에 대해 PDGF를 안정화시키지 못하는 것으로 결론지을 수 있다.

실시예 10(비교)

펩타이드와 가역적으로 결합하고 멸균시 생물학적 활성의 손실에 대해 펩타이드를 안정화시키는 알긴산나트륨의 능력은 실시예 5의 키토산을 알긴산나트륨으로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기술된 바와 같이 연구한다.

방법 1에서의 결과는 도 8에 나타낸다. PDGF가 멸균 전후에 복합체와 강력하게 결합한다는 것을 알 수 있다. 결합이 너무 강력하여 알긴산이 멸균시 생물학적 활성의 손실에 대해 PDGF를 안정화시키는지의 여부가 명백하지 않다. 알긴산나트륨이 멸균동안에 생물학적 손실에 대해 PDGF를 안정화시키는데 유용할 것 같지 않은 것으로 결론지을 수 있다.

실시예 11

상처 치유를 촉진시키기 위한 멸균된 국소 투여용 약제학적 겔은 하기와 같이 제형화된다(중량%).

카복시메틸 셀룰로스 2.4%

하이드록시에틸 셀룰로스 0.3%

염화나트륨 0.24%

프로필렌 글리콜 20.2%

콜라겐/ORC/PDGF 1중량% 2.0%

물 밸런스

콜라겐/ORC/1중량% PDGF를 실시예 2에서 기술한 바와 같이 제조하고 이를 약 1 내지 10㎛의 입자 크기로 분쇄하고 γ-방사선으로 멸균시키고 무균 조건하에서 또 다른 화합물과 혼합하여 상처 치유를 촉진시켜 상처에 사용되기에 적합한 멸균된 수성 겔을 수득한다.

실시예 12

실질적으로 순수한 멸균된 PDGF를 하기와 같이 제조한다.

실시예 1에 제조된 1% PDGF/콜라겐 스폰지를 10㎛ 미만의 입자 크기로 분쇄하고 이어서 γ-방사선으로 멸균한다. 멸균된 복합체를 멸균 식염수(pH 8)로 35℃에서 1시간동안 처리하여 멸균된 PDGF를 추출하고 이어서 무균 조건하에 여과하고 동결건조시켜 멸균된 PDGF를 수득한다.

방법 1

PDGF의 활성에 대한 복합체 형성 및 멸균의 효과를 하기와 같이 평가한다.

펀치 생검 (직경 6mm)을 1ml 듈베코의 개질된 이글스 배지(DMEM)중에 넣고 이를 습한 대기 세포 배양기내에서 5% CO₂및 37℃에서 배양하여 각각의 샘플에 대한 24시간의 방출물을 제조한다. 각각의 샘플 용출물을 2회 시험한다.

증식된 세포수를 정량하기 위한 메틸렌 블루 검정법으로 PDGF의 생물학적 활성을 평가한다. 간략하게 AHDF(성인 사람 피부 섬유아세포)를 95% 컨플루언시(confluency)할때까지 성장시키고 트립신으로 처리하며 이의 수를 계산하고 96-웰 미세역가 플레이트(100㎕/웰 내지 3000 세포/웰)내에 세포 밀도 3 x 10⁴세포/ml로 10% FBS/DMEM중에 재분주한다. 세포가 상기 배지내 37℃, 5% CO₂의 습한 대기 세포 배양기내에서 밤새 서로 부착하여 증식하도록 한다. 이어서 배지를 제거하고 세포 단일층을 PBS로 세척하고 시험 샘플 또는 표준물을 웰당 100㎕로 첨가한다. 각각의 시험 샘플을 8회 시험하고 주사기 필터(0.2㎛)로 여과하여 멸균시킨다. 각각의 샘플을 혼입된 PDGF의 평가된 농도에 따라 희석한다. 이것은 선형 범위로 PDGF를 정량하는데 필요하다. 사람 재조합 PDGF-BB를 SF-DMEM에 희석된 표준물로서 사용하고 500ng/ml 내지 1ng/ml의 농도 범위에서 사용한다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 추가의 3일동안 자극제로 항온처리한후 배지를 제거하고 세포 단일층을 FORMAL^R식염수로 고정시킨다. 이어서 세포를 메틸렌 블루로 염색하고 과량의 염색을 제거하고 염료를 산성화된 에탄올을 사용하여 세포 단일층으로부터 용출시킨다. 가용화된 염료를 미세역가 플레이트 분광광도계를 사용하여 630nm에서 정량하고 BIOLINX^R소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.

각각의 샘플 유형으로부터 방출된 PDGF의 총량을 ELISA로 결정한다. 0.5㎍/ml의 0.025M-NaHCO₃, 0.025M-Na₂CO₃, 0.025M-Na₂CO₃, pH 9.7(100㎕/웰)에서 PDGF-BB에 대한 모노클로날 포획 항체를 사용하여 밤새 4℃에서 항온처리한다. 잔여 결합 부위를 1시간동안 37℃에서 3%의 BSA/PBS로 블록킹시킨후 시험 샘플 또는 표준물을 첨가한다. 각각의 샘플을 3회 시험하고 표준 곡선은 500ng/ml 내지 1ng/ml의 범위에 대한 것이다. 각각의 샘플을 다양한 희석 조건에서 시험하여 농도가 정확히 평가되도록 한다. 시험 샘플중에 존재하는 PDGF의 농도를 PDGF에 대한 1차 폴리클로날 항체(1/1000 희석) 및 퍼옥시다제 접합체를 갖는 2차 항-래빗 IgG(1/5000 희석)를 사용하여 정량한다. IM-황산을 첨가하는 즉시 황색으로 변색하는, 처음에 청색을 나타내는 가용성 기질 TMB를 사용하여 퍼옥시다제의 농도를 정량한다. 450nm에서 분광광도계로 색도를 조사한다.

방법 2

아프로티닌의 활성에 대한 복합체의 형성 및 멸균 효과를 다음과 같이 측정한다.

3mm 펀치 생검을 콜라겐/ORC, 아프로티닌 함유 콜라겐/ORC(조사시킴) 및 아프로티닌 함유 콜라겐/ORC로부터 2회 취한다. 각각 스폰지로부터 2개의 펀치 생검을 멸균된 플라스틱 용기내 DMEM의 1ml에 첨가한다. DMEM을 37℃에서 0 내지 48시간 범위중 다수의 시점후에 제거한다. 아프로티닌 활성에 대한 기능성 검정이 요구될때까지 방출물을 20℃에서 저장한다.

정제된 플라스민의 샘플을 억제하기 위한 아프로티닌의 능력을 측정함으로써 아프로티닌 기능 활성에 대한 조사 효과를 시험한다. 간략하게 방출물 10㎕s을, 플라스민 40㎕s(40ng), 10μM 플라스민 형광성 기질 및 0.5% 트리톤^R함유 트리스-HCl 완충액(pH 8.1)을 함유하는 총 검정 용적 100㎕s에 첨가한다. 양성 대조구를 방출물 부재하에 시험한다.

추가로, 0.5ng/ml 내지 10ng/ml 범위의 다양한 아프로티닌 농도에 대한 플라스민 억제율의 표준 곡선을 작성하고 계산을 위한 기준으로서 사용한다.

검정물을 37℃에서 1시간 이상 모니터하고 형광양을 형광성 플레이트 판독기(발광 455nm, 여기 383nm)를 사용하여 검출한다.

상기 실시예는 단지 설명을 목적으로 기술되었다. 첨부된 도면 범위내에 있는 본 발명의 많은 다른 양태가 기술자에게 명백할 것이다.

Claims (33)

1. 치료용 펩타이드와 셀룰로즈 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다당류와의 복합체(당해 복합체는 이온화 방사선으로 멸균된다)를 포함하는 멸균 조성물.
2. 제1항에 있어서, 치료용 펩타이드가 성장 인자, 지혈제, 항미생물제, 항균제, 항유착제(anti-adhesion agent) 및 콜라겐 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 멸균 조성물.
3. 제2항에 있어서, 치료용 펩타이드가 사람의 유사분열촉진(mitogenic) 활성 또는 맥관형성 활성을 갖는 성장 인자를 포함하는 멸균 조성물.
4. 제3항에 있어서, 성장 인자가 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 전환 성장 인자(TGF-α, TGF-β₁, TGF-β₂), 신경 성장 인자(NGF-α, NGF-β), 표피 성장 인자(EGF), 골 형태발생 단백질, 인슐린형 성장 인자(IGF-I 또는 IGF-II) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 멸균 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 구조 단백질, 다가 음이온성 다당류 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생중합체를 추가로 포함하는 멸균 조성물.
6. 제5항에 있어서, 구조 단백질이 천연-콜라겐형, 아텔로콜라겐(atelocollagen), 펩신-용해된 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴 및 라미닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 멸균 조성물.
7. 제6항에 있어서, 구조 단백질이 필수적으로 천연 섬유상 콜라겐으로 이루어진 멸균 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 다당류가 산화된 셀룰로즈, 키토산 및, 이들의 염 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 멸균 조성물.
9. 제8항에 있어서, 다당류가 ORC[산화 재생 셀룰로즈(oxidised regenerated cellulose)] 및 nORC(중화된 ORC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 멸균 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 천연 섬유상 콜라겐과 ORC와의 혼합물을 포함하는 멸균 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료용 펩타이드 대 다당류의 중량비가 1:10 내지 1:10⁶인 멸균 조성물.
12. 제11항에 있어서, 치료용 펩타이드 대 다당류의 중량비가 1:100 내지 1:10⁵인 멸균 조성물.
13. 제12항에 있어서, 치료용 펩타이드 대 다당류의 중량비가 1:1000 내지 1:10⁴인 멸균 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 동결 건조 또는 용매 건조된 스폰지를 포함하는 멸균 조성물.
15. 제14항에 있어서, 유리 라디칼 스캐빈저를 추가로 포함하는 멸균 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 또는 동물 몸체에 국소 투여하기 위한 점성 액체 또는 겔인 멸균 조성물.
17. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 또는 동물 몸체에 정맥내 투여하기 위한 액체인 멸균 조성물.
18. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료용 펩타이드와 다당류가 고체 담체의 표면에 도포된 멸균 조성물.
19. 제18항에 있어서, 고체 담체가 상처 표면에 도포하는데 적합한 직물 또는 부직포, 중합체 필름 또는 웹(web)인 멸균 조성물.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 고체 담체가 생체흡수성인 멸균 조성물.
21. 제20항에 있어서, 고체 담체가 ORC 직물 또는 ORC 부직포를 포함하는 멸균 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 멸균 포장된 멸균 조성물.
23. 치료용 펩타이드와 셀룰로즈 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다당류와의 복합체를 제공하는 단계,

    당해 복합체를 멸균시키는 단계 및

    이어서 당해 복합체를 약제학적으로 허용되는 담체 내에 또는 약제학적으로 허용되는 담체 위에 분산시키는 단계를 포함하여, 멸균 치료용 조성물을 제조하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 복합체를 제공하는 단계가 용매 중에서 치료용 펩타이드와 다당류를 혼합한 후, 용매를 제거하여 당해 복합체를 잔류시킴을 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 용매가 수성 용매인 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 용매가 동결 건조 또는 용매 건조에 의해 제거되는 방법.
27. 제23항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 멸균 단계가 이온화 방사선에 의해 또는 기체 플라즈마 처리에 의해 수행되는 방법.
28. 제27항에 있어서, 이온화 방사선이 γ-방사선인 방법.
29. 제23항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 복합체가 멸균 단계 동안 물을 4중량% 미만 포함하는 방법.
30. 제23항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 분산 단계가 멸균 단계 후에 무균 조건하에 수행되는 방법.
31. 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 따르는 멸균 조성물을 제조하는 방법.
32. 치료용 펩타이드를 제공하는 단계,

    치료용 펩타이드와 셀룰로즈 유도체, 키틴, 키토산, 갈락토만난 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다당류와의 복합체를 형성시키는 단계,

    당해 복합체를 멸균시키는 단계 및

    이어서 무균 조건하에 당해 복합체로부터 치료용 펩타이드를 분리하여 멸균 치료용 펩타이드를 수득하는 단계를 포함하여, 멸균 치료용 펩타이드를 제조하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 분리 단계가 수성 용매를 사용하여 복합체로부터 치료용 펩타이드를 추출함을 포함하는 방법.