SI20306A

SI20306A - Sterilni kompleks terapevtskega peptida, vezanega na polisaharid

Info

Publication number: SI20306A
Application number: SI9920021A
Authority: SI
Inventors: Breda Cullen; Derek Silcock; Leeuwen Peter Van; Wilson Harvey
Original assignee: Johnson & Johnson Medical Limited
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2001-02-28
Also published as: HK1032362A1; GB2344519B; EP1053029B1; PL342242A1; AU771733B2; CA2319327A1; CA2319327C; WO2000033893A1; GB9826897D0; CN1290180A; BR9907679A; ATE249249T1; DE69911172T2; GB2344519A; JP2002531532A; EP1053029A1; JP4606587B2; AU1577000A; DE69911172D1; KR20010040687A

Abstract

Izum zagotavlja sterilne sestavke, ki obsegajo kompleks terapevtskega peptida in polisaharida, izbranega iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi, pri čemer je kompleks steriliziran z ionizirajočim sevanjem. Prisotnost polisaharidov presenetljivo stabilizira terapevtske peptide proti razgradnji pod ionizirajočimi pogoji, še zlasti pod gama-obsevanjem. Zahtevana je tudi zaščita za postopke za pripravo sterilnih sestavkov in za postopke za pripravo sterilnih terapevtskih peptidov.ŕ

Description

Johnson + Johnson Medical Limited

Sterilni kompleks terapevtskega peptida, vezanega na polisaharid

Predloženi izum se nanaša na sterilne sestavke, ki obsegajo enega ali več terapevtskih f · · peptidov. Predloženi izum se nanaša tudi na postopke za pripravo takšnih sestavkov in na postopke za pripravo sterilnih terapevtskih peptidov.

Naravne in sintetične peptidne spojine prevzemajo naraščajočo pomembnost kot aktivna sredstva v zdravljenju. Še zlasti obstaja zanimanje za uporabo rastnih faktorjev kot so epidermalni rastni faktor (EGF - epidermal growth factor), fibroblastni rastni faktor (FGF - fibroblast growth factor), kostni morfogenetski protein, trombocitno izveden rastni faktor (PDGF - platelet derived growth factor) in transformirajoči rastni faktorji (TGF - transforming growth factors), še zlasti v zdravljenju ran. Rastni faktorji postajajo na razpolago v znatnih količinah iz rekombinantnih DNA sinteznih tehnik, kar povečuje potrebo po sterilnih formulacijah za dajanje rastnih faktorjev.

Značilnost zdravil, ki temeljijo na peptidih, je, da večina peptidov ni primernih za enterično dajanje, saj v prebavnem traktu razpadejo. Zaradi tega je potrebno večino peptidnih zdravil dajati parenteralno in še zlasti z lokalnim ali intravenskim dajanjem. Za takšne metode dajanja je bistveno to, da mora biti peptidni sestavek sterilen. To pomeni, da mora biti sestavek v bistvu brez življenja sposobnih mikroorganizmov, virusov in DNA fragmentov.

Težava nastane, kadar poizkušamo sterilizirati sestavke, ki obsegajo terapevtske peptide. Konvencionalni sterilizacijski postopki kot je segrevanje v avtoklavu ali gama obsevanje, pogosto degradirajo biološko aktivnost terapevtskih peptidov, še zlasti, če je sterilizacija izvedena v prisotnosti vode. Prav tako so neprimerna kemična sterilizacijska sredstva zaradi občutljivosti peptidov na oksidacijska sredstva, spremembe v pH, spremembe v ionski jakosti ali spremembe v temperaturi. Steriliziranje z etilen oksidom je prav tako neprimerno zaradi reaktivnosti etilen oksida z nekaterimi peptidi in nadalje zaradi nesprejemljivih ostankov etilen oksida in njegovih škodljivih reakcijskih produktov v produktih.

V preteklosti so zdravila, ki temeljijo na peptidih, formulirali iz sterilnih izhodnih materialov pod aseptičnimi pogoji. Takšno aseptično izdelovanje je razmeroma drago in težko izvedljivo. Raztopine, ki so vsebovale peptide, so sterilizirali tudi z ultrafiltracijo, toda ta metoda ni primerna za sestavke, ki vsebujejo makromolekule, ali za trdne ali pol-trdne sestavke.

EP-A-0238839 opisuje obveze za rane, ki vsebujejo vpojno celulozno plast, impregnirano z encimom kot je tripsin. Obveze za rane so pripravljene in posušene pod aseptičnimi pogoji, očitno brez naknadne sterilizacije.

EP-A-0312208 opisuje gelne formulacije, ki vsebujejo polipeptidne rastne faktorje s humano mitogensko ali angiogensko aktivnostjo. Gelne formulacije so primerne za lokalno aplikacijo na rane in vključujejo celulozne derivate, za katere je navedeno, da so sposobni stabilizirati polipeptidne rastne faktorje proti izgubi biološke aktivnosti, do katere običajno pride, kadar se rastni faktorji hranijo v vodni raztopini. Prednosti so metilcelulozni in hidroksialkilcelulozni derivati. Geli so sterilizirani pred dodatkom peptidnih rastnih faktorjev, čemur sledi dodajanje peptidnih rastnih faktorjev pod sterilnimi pogoji. Potemtakem kaže, da po formulaciji ni nobene sterilizacije sestavkov. Podobni sestavki so opisani v EP-A-0267015.

EP-A-030823 8 opisuje stabilne liofilizirane sestavke, ki obsegajo polipeptidne rastne faktorje. Liofilizacija stabilizira rastne faktorje proti izgubi aktivnosti zaradi hidrolize v vodi. Liofilizirani sestavki vključujejo ekstenderje kot so v vodi topni ali v vodi nabrekajoči polimeri, vključno s celuloznimi derivati. Opis opisuje avtoklavno sterilizacijo izhodnih materialov, razen rastnih faktorjev, in sterilno filtracijo rastnih faktorjev z namenom proizvesti sterilen liofiliziran produkt. Prijava očitno ne obravnava sterilizacije končnega liofiliziranega peptidnega sestavka.

WO 95/02411 opisuje vodne sestavke, ki obsegajo polipeptidni rastni faktor, ki izražajo dolgotrajno biokemično stabilnost rastnega faktorja pri 4 °C. Rastni faktor je stabiliziran tako, daje zagotovljen sestavek z nizkim pH v območju 2,8 do 3,8. Vendar pa v tem opisu ni opisana sterilizacija sestavkov, ki vsebujejo rastne faktorje.

< ♦ ·

EP-A-0437095 opisuje postopek za pripravo nevtraliziranega oksidiranega celuloznega produkta (nORC) z obdelavo ORC z raztopino natrijevega acetata ali podobnega. Nevtraliziran produkt je lahko impregniran s kislinsko občutljivimi hemostatičnimi sredstvi kot je trombin, da se pospeši njegove hemostatične lastnosti, ali s kislinsko občutljivimi sredstvi, ki preprečujejo adhezijo, kot je tkivni plazminogenov aktivator (t-PA - tissue plasminogen activator), da se pospešijo njegove lastnosti preprečevanja adhezije. V drugih izvedbah je tkanina impregnirana z zdravilom, kot so rastni faktorji.

Tako ORC kot n-ORC se lahko sterilizirata z gama obsevanjem in EP-A-0437095 tudi navaja, da se lahko n-ORC, ki ima nase kompleksiran heparin ali heparinske fragmente, sterilizira tudi z gama obsevanjem. Vendar pa referenca ne opisuje sterilizacije ORC ali n-ORC, s katero je povezan peptid.

EP-A-0562864 opisuje kompozitne materiale za obveze za rane, ki obsegajo matriks iz kolagenske gobe, podstrukturo drugega bioabsorbirajočega polimera, ki je lahko na primer dispergirano vlakno oksidirane regenerirane celuloze (ORC), in aktivno sredstvo, kije lahko peptid. Aktivno sredstvo je lahko v matriksu ali v podstrukturi, ali pa v obeh. Kompozitni gobasti materiali so lahko pakirani in sterilizirani. Materiali, opisani v tej referenci, so inherentno nehomogeni. Obsegajo podstrukturo vlaken, filmov ali kosmičev, ki zagotavljajo fazno sproščanje aktivnih sredstev in, prednostno, usmerjeno celično notranje vraščanje.

W0 98/00180 opisuje uporabo kompleksov ORC s kolagenom za zdravljenje kroničnih ran. Opis navaja, da ORC tvori stabilne komplekse s celičnimi rastnimi faktorji.

US-A-5730933 opisuje postopek za sterilizacijo biološko aktivnih peptidov s sevanjem z gama žarki ali žarkom elektronov brez izgube biološke aktivnosti. Postopek obsega korake: tvorbo zmesi, ki obsega biološko aktiven peptid in zunanji protein kot je želatina, zamrzovanje ali liofilizacijo zmesi, čemur sledi obsevanje zmesi. Navedeno je, da prisotnost zunanjega proteina stabilizira peptid proti izgubi biološke aktivnosti. Zmes lahko nadalje obsega sredstvo za odstranjevanje prostih radikalov, tako da se še nadalje izboljša stabilnost med obsevanjem. Ni pa navedeno, da lahko polisaharidi dosežejo stabilizacijo peptidov med obsevanjem.

Predmet predloženega izuma je zagotoviti izboljšan postopek za sterilizacijo biološko aktivnih peptidov, tako da se po sterilizaciji ohrani biološka aktivnost peptidov.

Predloženi izum temelji na presenetljivi ugotovitvi, da lahko peptidna terapevtska sredstva, in še zlasti rastne faktorje, stabiliziramo proti izgubi biološke aktivnosti med sterilizacijo z ionizirajočim sevanjem, če so peptidi pred sterilizacijo formulirani z učinkovito količino izbranega polisaharida.

V prvem vidiku predloženi izum zagotavlja sterilni sestavek, ki obsega kompleks terapevtskega peptida in polisaharida, izbranega iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi, pri čemer je omenjeni kompleks steriliziran z ionizirajočim sevanjem.

Peptid je lahko katerikoli terapevtsko aktiven peptid, vključno s hormoni, protitelesi, protitelesnimi fragmenti, naravnimi in sintetičnimi peptidnimi antigeni in antigenskimi fragmenti. Primerni peptidi vključujejo oksitocin, vazopresin, kortikotrofin, aprotinin, kalcitonin, prolaktin, inhibitin, interferone, somatostatin, insulin, glukagon, avrikulami natriuretični faktor (ANF), endorfin, inhibitor renina, hormon, ki sprošča luteinizirajoči hormon (LHRH), hormon, ki sprošča rastni hormon (GHRH), peptid T ali njihove sintetične homologe ali analoge. Prednostno je peptid terapevtsko aktiven, tako da pospešuje zdravljenje ran. Primerni peptidi vključujejo hemostatična sredstva kot je trombin in anti-adhezivna sredstva kot je t-PA. Vključeni so tudi terapevtski fragmenti naravnih proteinov, kot so kolagenski fragmenti. Izum je primeren tako za v vodi topne, kot v vodi netopne peptide. Peptid ima lahko kakršnokoli molekulsko maso, naprimer, v območju 1000-100000, prednostno 4000-60000.

Prednostno peptid obsega rastni faktor, bolj prednostno rastni faktor, ki ima humano mitogensko ali angiogensko aktivnost. Bolj prednostno rastni faktor izberemo iz skupine, katero sestavljajo fibroblastni rastni faktor (FGF), trombocitno izveden rastni faktor (PDGF), transformirajoči rastni faktoiji (TGF-a, TGF-βι, TGF-p₂), živčni rastni faktorji (NGF-a, NGF-β), epidermalni rastni faktor (EGF), kostni morfogenetski protein, insulinu podoben rastni faktor (IGF-I ali IGF-II) in njihove zmesi.

Tukajšnji izumitelji so ugotovili, da so določene skupine polisaharidov, tako naravnih kot kemično modificiranih, učinkovite tako, da stabilizirajo peptide pred sterilizacijo z ionizacijskim sevanjem. Učinkoviti polisaharidi, ki so bili identificirani, so: (a) celulozni derivati; (b) citin in citozani, in (c) galaktomanani. Ostali polisaharidi, kot so natrijev hialuronat, pektin, β-glukan ali kalcijev alginat niso primerni, bodisi zaradi tega, ker ne Ščitijo biološke aktivnosti peptidov med sterilizacijo, bodisi zato, ker se ne pričakuje, da bodo sprostili biološko aktiven peptid v telesu. Sterilne produkte, ki so rezultat takšne sterilizacije peptidnih kompleksov, lahko identificiramo po njihovi visoki biološki aktivnosti in karakterističnih ionizacij skih razpadnih fragmentih, ki so prisotni v sestavkih.

Izraz celulozni derivat se nanaša na kakršnokoli kemično modificirano celulozo. Prednostno modificirana celuloza vključuje vsaj eno karboksilatno skupino na vsakih 100 saharidnih ostankov, in bolj prednostno obsega karboksimetilcelulozo, oksidirano celulozo ali njihove soli.

Oksidirano celulozo pripravimo z oksidacijo nekaterih izmed -CH₂OH skupin na celulozi v karboksilatne skupine z obdelavo z dušikovim dioksidom ali drugim oksidacijskim sredstvom. Oksidirano celulozo lahko uporabimo za pripravo bioresorpcije sposobnih in vpojnih matriksov, ki so primerni za običajne aplikacije na tkivnih površinah. Oksidirani regenerirani celulozni (ORC) materiali so Še zlasti prednostni, saj jih lahko tvorimo z okidacijsko obdelavo regeneriranih celuloznih materialov kot so materiali tipa rayon. Dva primera takšnih ORC materialov sta INTERCEED (registrirana blagovna znamka firme Johnson & Johnson Medical, Inc.) in SURGICEL (registrirana blagovna znamka firme Johsnon & Johnson Medical, Inc.). Material INTERCEED se uporablja kot adhezijska bariera v kirurgiji. Material SURGICEL se uporablja kot hemostat v kirurgiji in v drugih aplikacijah. ORC nudi pomembne prednosti v primeijavi z nemodificiranimi celuloznimi materiali, še zlasti sposobnost bioresorpcije in vivo in hemostatične lastnosti.

Ustrezno ORC lahko pripravimo s postopkom iz US-A-3122479 ali iz tržno razpoložljivih materialov INTERCEED® ali SURGICEL®, ali pa v uprašeni ali vlaknati obliki z mletjem takšnih materialov. Nevtralizirano ORC lahko pripravimo kot je opisano v EP-A-0437095. Fragmente ORC z nižjo molekulsko maso, vključno z v vodi topnimi fragmenti, lahko pripravimo z alkalijsko hidrolizo ORC kot je opisana vWO 98/00446.

V predloženem izumu so učinkoviti tudi citin, citozan in vsi intermediatni delno deacilirani citozani.

V predloženem izumu so učinkoviti tudi galaktomanani, se pravi polisaharidi, ki obsegajo tako galaktozne kot manozne ostanke. Prednostni galaktomanani vključujejo guar gumi in gumi rožičevca.

Kompleks terapevtsko učinkovitega peptida s polisaharidom, uporabljen v predloženem izumu, lahko nadalje obsega druge naravne in pol-sintetične biokompatibilne polimere v zmesi z zgoraj definiranimi polisaharidi. Primerni dodatni biopolimeri vključujejo: strukturne proteine kot je kolagen, fibrin in laminin; modificirane strukturne proteine kot je atelokolagen ali pepsinsko solubiliziran kolagen, nadalje polisaharide kot so celuloza, škrob, alginati, modificirani škrobi ali mukopolisaharidi in njihove zmesi. Prednostno so dodatni biopolimeri izbrani iz skupine, katero sestavljajo nativni in modificirani strukturni proteini in polianionski polisaharidi. Izraz anionski polisaharid obsega mukopolisaharide kot so heparin, hialuronska kislina, heparan sulfat, hondroitin sulfat in njihovi fragmenti in soli.

Izraz strukturni protein se v tem opisu nanaša na kolagen in druge strukturne proteine kot je fibrin ali laminin. To niso terapevtsko aktivni peptidi v običajnem pomenu besede. Kompleksi med takšnimi strukturnimi peptidi in alginatom so opisani v US-A-4614794. Kompleksi med strukturnimi proteini in ORC so opisani v GB-A2314842. Takšni kompleksi so koristni pri uporabi za zdravljenje ran, še zlasti za zdravljenje kroničnih ran. Prednostno strukturni protein sestoji v bistvu iz nativnega vlaknatega kolagena.

Sestavek po tem vidiku izuma prednostno vsebuje terapevtsko učinkovito količino peptida za nameravano uporabo. V primeru sestavkov za lokalno aplikacijo na rane, bo le-ta značilno v območju od 0,1 do 10.000 ppm, masno, bolj prednostno 1 do 1000 ppm, masno. Prednostno je masno razmerje terapevtskega peptida proti polisaharidu v sestavku od 1 : 10⁶ do 1 : 10, bolj prednostno od 1 : 10⁵ do 1 : 100 in najbolj prednostno od 1 : 10⁴ do 1 : 1000.

Terapevtski peptid je kompleksiran na polisaharid. Se pravi, da je znatna frakcija molekul terapevtskega peptida povezana z molekulami polisaharida s kovalento, ionsko ali Van der Waalsovo vezavo. To lahko dosežemo, na primer, s prevlečenjem tanke plasti na porozen ali tekstilni polisaharidni substrat, ali s temeljitim pomešanjem peptida in polisaharida. Prednostno terapevtski peptid ni kovalentno vezan na polisaharid.

Nadaljnja prednost polisaharidov, uporabljenih v predloženem izumu, je, da se lahko vezan peptid dokaj zlahka sprosti iz kompleksa. Prednostno se lahko iz kompleksa v vodno raztopino sprosti vsaj 20 % in bolj prednostno vsaj 40 % peptidne biološke aktivnosti (temelječe na aktivnosti peptida pred vezavo) enostavno z namakanjem kompleksa v vodi ali serumu pri 20°C 24 ur.

Kompleks značilno tvorimo s temeljitim pomešanjem terapevtskega peptida in polisaharida na molekularnem nivoju, na primer s so-dispergiranjem terapevtskega peptida in polisaharida v topilu, čemur sledi odstranitev topila.

Prednostno je kompleks terapevtskega peptida in polisaharida v obliki trdnih ali koloidnih delcev, dispergiranih v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu. Prednostno so delci v premeru manjši od 50 pm, bolj prednostno manjši od 10 pm, in najbolj prednostno manjši od 2 pm. Farmacevtsko sprejemljiv nosilec je lahko trdna površina ali trden matriks. Vendar pa je prednostno nosilec vodna tekočina ali gel, v kateri/em sta disperigirana terapevtski peptid in polisaharid. V določenih prednostnih izvedbah je sterilni sestavek v smislu predloženega izuma viskozna tekočina ali gel, ki ima prednostno viskoznost vsaj 100 Ns/m pri 20°C in je primerna za lokalno dajanje na človeško ali živalsko telo, še zlasti na rane.

V drugih prednostnih izvedbah je sterilni sestavek v smislu predloženega izuma tekočina, na primer zapufrana slanica, ki vsebuje terapevtski peptid in polisaharid, in kije primerna za intravensko dajanje na človeško ali živalsko telo.

V drugih prednostnih izvedbah lahko sterilni sestavek v smislu predloženega izuma obsega trden farmacevtski nosilec, pri čemer sta terapevtski peptid in polisaharid prevlečena na površino nosilca. Prednostno je trden nosilec tkan ali netkan material, polimerni film ali tkanina, primeren/na za aplikacijo na površino rane. Se zlasti prednostni trdni nosilci so bioabsorpcije sposobni trdni nosilci, še zlasti tkana ali netkana ORC tkanina. Te izvedbe lahko, na primer, izdelamo tako, da terapevtski peptid prevlečemo na trden nosilec polisaharida (ali na trden nosilec prevlečen s polisaharidom), posušimo, da se na površini trdnega nosilca tvori kompleks peptid/polisaharid in steriliziramo.

Prednostno sterilne sestavke v smislu predloženega izuma sterilno paketiramo. To pomeni, da so prednostno paketirani v sterilne, za mikroorganizme neprepustne vsebnike.

V drugem vidiku predloženi izum zagotavlja postopek za pripravo sterilnih terapevtskih sestavkov, ki obsega stopnje: zagotovitev kompleksa terapevtskega peptida s polisaharidom, sterilizacijo kompleksa; in dispergiranje kompleksa v ali na farmacevtsko sprejemljivem nosilcu, pri čemer je omenjeni polisaharid izbran iz skupine, katero tvorijo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi.

Prednostni so tisti terapevtski peptid, polisaharid in farmacevtsko sprejemljivi nosilec, ki so tukaj definirani predhodno z ozirom na prvi vidik izuma.

Prednostno tvorimo kompleks z dispergiranjem terapevtskega peptida in polisaharida v topilu, čemur sledi odstranitev topila, da ostane kompleks. Prednostno je topilo vodno topilo in bolj prednostno sestoji v bistvu iz vode. Prednostno topilo odstranimo z liofilizacijo ali solventnim sušenjem. To ima splošno za rezultat visoko porozno polisaharidno gobo, na katero je vezan terapevtski peptid. Ta material lahko zatem zmeljemo za naknadno dispergiranje v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu.

V ostalih prednostnih postopkih je polisaharid v obliki tkanega ali netkanega materiala, polimernega filma, tkanine ali gobe in je prevlečen s terapevtskim peptidom, prednostno tako, da se polisaharid potopi v raztopino terapevtskega peptida. Nato se topilo odstrani z uparitvijo, tako da ostane polisaharidni nosilec, ki ima na svoji površini terapevtski peptidni kompleks.

Stopnjo sterilizacije kompleksa prednostno izvedemo na kompleksu terapevtski peptid/polisaharid, ki prednostno vsebuje manj kot 10 mas.% vode, bolj prednostno manj kot 4 % in je najbolj prednostno v bistvu brezvoden. Sterilizacijo lahko izvedemo s katerimkoli izmed konvencionalnih postopkov, vključno z avtoklaviranjem in z obdelavo z etilen oksidom. Prednostno izvedemo sterilizacijo z obdelavo s plinsko plazmo, na primer v STERAD (registrirana blagovna znamka) stroju. Prednostno izvedemo sterilizacijo z ionizirajočim sevanjem kot je ultravijolična svetloba, elektronski žarki ali gama obsevanje. Bolj prednostno je ionizirajoče sevanje gama sevanje, najbolj prednostno v sterilizacijski dozi vsaj 1 do 50 kGy kobalt-60 sevanja, prednostno 20-30 kGy. Recimo, prednostno, z okoli 0,01 mGy do 0,03 mGy (1 do 3mRad) gama sevanja. Presenetljivo obsevanje terapevtskih peptidov, kompleksiranih na izbrani polisaharid, znatno ne degradira aktivnosti terapevtskega peptida, kljub dobro znani tendenci peptidov k degradaciji ob gama-obsevanju. Ne da bi želeli biti vezani s katerokoli teorijo, je presenetljiva stabilnost terapevtskih peptidov, kompleksiranih na te polisaharide, lahko posledica tega, da polisaharidi delujejo kot past za proste radikale, proizvedene z obsevanjem.

Kompleks biološko aktivnega peptida in polisaharida, uporabljen v predloženem izumu, lahko nadalje obsega sredstvo za odstranjevanje prostih radikalov. Odstranjevalna sredstva, primerna za uporabo, obsegajo antioksidante kot je tokoferol, citronska kislina, butiliran hidroksianizol, butiliran hidroksitoluen, terciarni butil hidrokinon, propilgalat, askorbat in ostale antioksidante, ki so splošno priznani kot vami za uporabo v hrani in zdravilih. Prednostno kompleks obsega okoli 0,01 do 10 mas. odstotkov sredstva za odstranjevanje prostih radikalov, bolj prednostno od 0,1 do 5 mas. odstotkov sredstva za odstranjevanje prostih radikalov.

Prednostno stopnjo dispergiranja izvedemo pod aseptičnimi pogoji po stopnji sterilizacije. To je še zlasti uporabno za steriliziranje suhih kompleksov terapevtskih peptidov s polisaharidom, čemur sledi dispergiranje steriliziranega kompleksa v tekočini, gelu ali pol-trdnem nosilcu pod aseptičnimi pogoji, da se tvori sterilni terapevtski sestavek.

V tretjem vidiku predloženi izum zagotavlja postopek za pripravo sterilnega terapevtskega peptida, ki obsega stopnje: zagotovitev terapevtskega peptida; tvorbo kompleksa med terapevtskim peptidom in polisaharidom; sterilizacijo kompleksa; kateri sledi ločevanje terapevtskega peptida od kompleksa pod aseptičnimi pogoji, da dobimo sterilen terapevtski peptid, pri čemer polisaharid izberemo iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi.

Ta vidik izuma ponovno izrablja izredno sposobnost polisaharidov, da stabilizirajo terapevtske peptide proti razgradnji pod standardnimi sterilizacijskimi pogoji. Prednostni terapevtski peptidi, polisaharidi in sterilizacijski postopki so takšni, kot so opisani zgoraj za prvi in drugi vidik predloženega izuma.

Prednostno terapevtski peptid ločimo od steriliziranega kompleksa enostavno s solventno ekstrakcijo, prednostno z vodnim topilom. Tako, na primer, lahko kompleks, ki obsega topen terapevtski peptid z v vodi netopnim polisaharidom, ločimo enostavno tako, da dispergiramo ali suspendiramo kompleks v vodi, čemur sledi filtracija ali mikro-filtracija, da ločimo raztopljen terapevtski peptid od polisaharida. Še posebna prednost ORC in citozanov je, da se zdi, da v vodni raztopini zlahka sprostijo vezane peptide. Seveda lahko uporabimo tudi ostale konvencionalne aseptične postopke ločevanja, kot je kromatografija. Sterilni terapevtski peptid je lahko nadalje očiščen s kromatografijo ali podobnim in lahko ga koncentriramo z liofilizacijo. Prednostno je sterilni terapevtski peptid v bistvu čist.

Da povzamemo, predloženi izum stabilizira terapevtske peptide proti razgradnji pod standardnimi sterilizacijskimi pogoji tako, da se tvori kompleks med terapevtskim peptidom in izbranim polisaharidom. Prednostno je kompleks brezvoden t.j. liofiliziran kompleks. Nastali sterilni kompleks lahko formuliramo v konvencionalne terapevtske produkte za lokalno ali parenteralno dajanje.

Tako lahko vidimo, da predloženi izum zagotavlja uporabo polisaharida, izbranega iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi, za pripravo kompleksa s terapevtskim peptidom, za uporabo v sterilizaciji terapevtskega peptida z ionizirajočim sevanjem z zmanjšano izgubo biološke aktivnosti. Prednostno se lahko iz steriliziranega kompleksa ponovno pridobi vsaj 20 % originalne biološke aktivnosti peptida in bolj prednostno vsaj 40 %.

Alternativno predloženi izum zagotavlja postopek za sterilizacijo biološko aktivnega peptida z zmanjšano izgubo biološke aktivnosti, pri čemer postopek obsega tvorbo kompleksa med peptidom in polisaharidom, izbranim iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi, in sterilizacijo kompleksa z uporabo ionizirajočega sevanja.

V nadaljevanju bodo opisane izvedbe predloženega izuma s sklicevanjem na spremljajoče slike, kjer:

Slika 1 prikazuje diagram aktivnosti liofiliziranega PDGF (primerjalni primer) pred in po sterilizaciji z gama-obsevanjem.

Slika 2 prikazuje diagram aktivnosti PDGF kompleksiranega z (i) samo kolagenom, (ii) samo ORC in (iii) kompozitom kolagen/ORC, pred (neosenčeni stolpci) in po (osenčeni stolpci) sterilizaciji z gama-obsevanjem.

Slika 3 prikazuje diagram izmerjene aktivnosti PDGF v raztopini proti ekstrakcijskemu času za naslednje komplekse: (i) PDGF kompleksiran na citozan brez gama-obsevanja; (ii) PDGF kompleksiran na kolagen/citozan 55 : 45 zmes; (iii) PDGF kompleksiran na citozan in steriliziran z gama-obsevanjem; in (iv) PDGF kompleksiran na kolagen/citozan 55 : 45 mešanico in steriliziran z gama-obsevanjem.

Slika 4 prikazuje diagram izmerjene aktivnosti PDGF v raztopini proti ekstrakcijskemu času za naslednje komplekse: (i) PDGF kompleksiran na natrijev hialuronat (NaHA) brez gama-obsevanja; (ii) PDGF kompleksiran na kolagen/NaHa 55 : 45 zmes; (iii) PDGF kompleksiran na NaHA in steriliziran z gama obsevanjem; in (iv) PDGF kompleksiran na kolagen/NaHA 55:45 mešanico in steriliziran z gamaobsevanjem.

Slika 5 prikazuje diagram izmerjene aktivnosti PDGF v raztopini proti ekstrakcijskemu času za naslednje komplekse; (i) PDGF kompleksiran na pektin brez gama-obsevanja; (ii) PDGF kompleksiran na kolagen/pektin 55:45 zmes; (iii) PDGF kompleksiran na pektin in steriliziran z gama-obsevanjem; in (iv) PDGF kompleksiran na kolagen/pektin 55:45 mešanico in steriliziran z gama-obsevanjem.

Slika 6 prikazuje diagram izmerjene aktivnosti PDGF v raztopini proti ekstrakcijskemu času za naslednje komplekse: (i) PDGF kompleksiran na gumi rožičevca brez gama obsevanja; (ii) PDGF kompleksiran na kolagen/gumi rožičevca 55:45 zmes; (iii) PDGF kompleksiran na gumi rožičevca in steriliziran z gama obsevanjem; in (iv) PDGF kompleksiran na kolagen/gumi rožičevca 55:45 mešanico in steriliziran z gama-obsevanjem.

Slika 7 prikazuje diagram izmerjene aktivnosti PDGF v raztopini proti ekstrakcijskemu času za naslednje komplekse: (i) PDGF kompleksiran na beta glukan brez gama obsevanja; (ii) PDGF kompleksiran na kolagen/beta glukan 55:45 zmes; (iii) PDGF kompleksiran na beta glukan in steriliziran z gama-obsevanjem; in (iv) PDGF kompleksiran na kolagen/beta glukan 55:45 mešanico in steriliziran z gamaobsevanjem.

Slika 8 prikazuje diagram izmerjene aktivnosti PDGF v raztopini proti ekstrakcijskemu času za naslednje komplekse: (i) PDGF kompleksiran na alginat brez gama-obsevanja; (ii) PDGF kompleksiran na kolagen/alginat 55:45 zmes; (iii) PDGF kompleksiran na alginat in steriliziran z gama-obsevanjem; in (iv) PDGF kompleksiran na kolagen/alginat 55:45 mešanico in steriliziran z gama-obsevanjem.

Primer 1 (primerjalni)

Trdno gobo vlaknatega kolagena, kompleksiranega na trombocitno izveden rastni faktor (PDGF), smo pripravili in sterilizirali kot sledi.

Pripravili smo vodno suspenzijo kislinsko-nabreklih nativnih kolagenskih vlaken, izvedenih iz bovinega koriuma, kot je opisano v US-A-4614794 ali US-A-4320201, katerih celotna vsebina je tu izrecno vključena z referenco. Vsebnost trdnih snovi v suspenziji je bila 1 mas.%. Suspenzijo smo nakisali z 0,05 M ocetno kislino, da so kolagenska vlakna nabreknila. Nato smo k vzorcem suspenzije dodali PDGF (Sigma

Chemical Co.) v koncentracijah 0 mas.% (kontrola), 0,1 mas.%, 0,33 mas.% in 1 mas.% glede na maso kolagena. Suspenzijo smo razplinili. 30 g vsakega suspenzijskega vzorca smo vlili v 100 cm² petrijevko, hitro zamrznili in nato preko noči liofilizirali.

Nastale kolagenske gobe smo razrezali na pol in eno polovico vsake gobe sterilizirali z obsevanjem z 2,5 kGy ⁶⁰Co gama-sevanja. Drugo polovico vsake gobe smo pustili nesterilno kot kontrolo.

Vzorce smo testirali na elucijo PDGF in biološko aktivnost kot je opisano spodaj v postopku 1.

Značilni rezultati so prikazani na sliki 2. Vidimo lahko, da se aktivnost PDGF, kompleksiranega na sam kolagen, bistveno spremeni s sterilizacijo.

Izvedli smo primerjalno študijo na čistem liofiliziranem PDGF. Rezultat, prikazan na sliki 1, ponazarja veliko zmanjšanje v aktivnosti PDGF kadar izvedemo sterilizacijo na čistem rastnem faktorju PDGF.

Nadaljnji kontrolni vzorci kolagena, brez dodanega PDGF, niso pokazali nobene aktivnosti bodisi pred sterilizacijo ali po njej.

Primer 2

Trdno gobo vlaknatega kolagena/ORC, kompleksiranega na PDGF, smo pripravili tako, kot je opisano v primeru 1, toda z dodatkom 80 mas.% (na osnovi mase kolagena) zmletih SURGICEL® ORC vlaken h kolagenski suspenziji pred dodatkom PDGF. Nastali produkti so kolagen/ORC gobe, ki vsebujejo 0 (primerjalna), 0,1, 0,33 in 1,0 mas.% PDGF na osnovi mase kolagena plus ORC.

Značilni rezultati so prikazani na sliki 2. Vidimo lahko, da se aktivnost PDGF, kompleksiranega na sam kolagen/ORC, s sterilizacijo v bistvu ne spremeni. Presenetljivo lahko vidimo, da je elucija biološko aktivnega PDGF iz steriliziranega kompleksa celo boljša od elucije iz nesterilnega kompleksa.

Primer 3

Trden matriks ORC, prevlečene s PDGF, smo pripravili kot sledi.

SURGICELL® ORC tkanino (2 cm²) smo namočili v 1 % vodno raztopino PDGF, posušili pri sobni temperaturi in razrezali na pol. Eno polovico smo sterilizirali z gama-obsevanjem kot je opisano v primeru 1, drugo polovico pa smo ohranili za primerjavo.

Značilni rezultati so prikazani na sl. 2. Vidimo lahko, da se biološka aktivnost PDGF, kompleksiranega na samo ORC s sterilizacijo v bistvu ne spremeni. Nadalje se PDGF lažje eluira iz ORC kompleksa kot iz kolagenskega kompleksa, tako pred sterilizacijo kot po njej.

Primer 4

Trdno gobo kolagena/ORC, kompleksiranega na aprotinin, smo pripravili kot je opisano v primeru 2, toda izpustili smo PDGF in dodali bovini pljučni aprotinin (Sigma Chemical CO.) v količini 0 mas.% (kontrola) in 10 mas.% glede na maso kolagena +ORC.

Komplekse smo testirali na vezavo aprotinina in aktivnost kot je opisano v postopku 2. Rezultati so pokazali, da se je po gama-obsevanju ohranila znatna frakcija aprotininske aktivnosti, kadar je bil aprotinin kompleksiran na kolagen/ORC.

Presenteljivo so rezultati pokazali, da se je aprotinin hitreje sprostil iz obsevanega kolagen/ORC matriksa kot pa iz neobsevanega kolagen/ORC matriksa.

Primer 5

Sposobnost citozana, da se reverzibilno veže na peptide in da stabilizira peptide proti izgubi biološke aktivnosti ob sterilizaciji, smo preizkovali kot sledi.

Trdne gobe citozana in 55/45 kolagena/citozana, na katere je kompleksiran PDGF, smo pripravili tako, kot je opisano v primerih 1 in 2, toda z nadomestitvijo kolagena v primeru 1 s citozanom in z nadomestitvijo ORC v primeru 2 s citozanom v količini 45 mas.% glede na maso kompleksa.

Vzorce kompleksov smo sterilizirali z gama obsevanjem kot je opisano v primeru 1.

Nato smo na vzorcih izvedli postopek 1, da smo ovrednotili količino biološko aktivnega PDGF, ekstrahiranega iz vzorca s serumsko raztopino, kot funkcijo časa. Podatke smo zbrali tako za sterilne kot nesterilne vzorce.

Rezultati, ponazorjeni na sl. 3, kažejo, da se znatna frakcija originalnega PDGF sprosti iz obeh kompleksov, tako pred sterilizacijo kot po njej. PDGF se sprosti rahlo lažje iz citozanskega kot iz kolagen/citozanskega kompleksa. Biološka aktivnost PDGF ni prizadeta s sterilizacijo v prisotnosti citozana ali kolagena/citozana.

Primer 6 (primerjalni)

Sposobnost natrijevega hialuronata, da se reverzibilno veže na peptide in da stabilizira peptide proti izgubi biološke aktivnosti ob sterilizaciji, smo preučevali kot je opisano zgoraj v primeru 5, toda z nadomestitvijo citozana iz primera 5 z natrijevim hialuronatom.

Rezultati iz postopka 1 so prikazani na sl. 4. Vidimo lahko, da se PDGF zlahka sprosti iz kompleksov tako pred sterilizacijo kot po njej. Vendar pa je opazno zmanjšanje v biološki aktivnosti ekstrahiranega PDGF po sterilizaciji v prisotnosti natrijevega hialuronata. Zmanjšanje biološke aktivnosti je manj opazno za komplekse kolagen/natrijev hialuronat, ker ima kolagen nekaj stabilizirajočega učinka na PDGF, kot je to omenjeno zgoraj v primeru 1. Zaključimo lahko, da natrijev hialuronat ne stabilizira PDGF proti izgubi biološke aktivnosti med sterilizacijo.

Primer 7 (primerjalni')

Sposobnost pektina, da se reverzbilno veže na peptide in da stabilizira peptide proti izgubi biološke aktivnosti ob sterilizaciji, smo preiskovali kot je opisano zgoraj v primeru 5, toda z nadomestitvijo citozana iz primera 5 s pektinom.

Rezultati iz postopka 1 so prikazani na sliki 5. Vidimo lahko, da se PDGF zlahka sprosti iz kompleksov tako pred sterilizacijo kot po njej. Vendar pa je opazno zmanjšanje biološke aktivnosti ekstrahiranega PDGF po sterilizaciji v prisotnosti pektina. Zmanjšanje biološke aktivnosti je manj opazno za komplekse kolagen/pektin, ker ima kolagen nekaj stabilizirajočega učinka na PDGF, kot je navedeno zgoraj v primeru 1. Zaključimo lahko, da pektin ne stabiliza PDGF proti izgubi biološke aktivnosti med sterilizacijo.

Primer 8

Sposobnost gumija rožičevca, da reverzibilno veže peptide in da stabilizira peptide proti izgubi biološke aktivnosti ob sterilizaciji, smo preiskovali kot je opisano zgoraj v primeru 5, toda z nadomestitvijo citozana primera 5 z gumijem rožičevca.

Rezultati iz postopka 1 so prikazani na sliki 6. Vidimo lahko, da se razmeroma malo biološke aktivnosti PDGF sprosti iz kompleksov bodisi pred sterilizacijo ali po njej. Vendar pa je zmanjšanje biološke aktivnosti ekstrahiranega PDGF po sterilizaciji v prisotnosti gumija rožičevca razmeroma majhno. Nadalje lahko vidimo, da daje gumi rožičevca stabilizirajoč učinek čez in nad učinek zaradi karšnegakoli kolagena, prisotnega v kompleksih. Zaključimo lahko, da gumi rožičevca stabilizira PDGF proti izgubi biološke aktivnosti med sterilizacijo.

Primer 9 (primerjalni)

Sposobnost beta glukana, da se reverzibilno veže na peptide in da stabilizira peptide proti izgubi biološke aktivnosti ob sterilizaciji, smo preiskovali kot je opisano zgoraj v primeru 5, toda z nadomestitvijo citozana iz primera 5 z beta glukanom.

Rezultati iz postopka 1 so prikazani na sliki 7. Vidimo lahko, da se razmeroma malo PDGF aktivnosti sprosti iz kompleksov tako pred sterilizacijo kot po njej. Nadalje je opazno zmanjšanje biološke aktivnosti ekstrahiranega PDGF po sterilizaciji v prisotnosti beta glukana. Zaključimo lahko, da beta glukan ne stabilizira PDGF proti izgubi biološke aktivnosti med sterilizacijo.

Primer 10 (primerjalni)

Sposobnost natrijevega alginata, da se reverzibilno veže na peptide in da stabilizira peptide proti izgubi biološke aktivnosti ob sterilizaciji, smo preiskovali kot je opisano zgoraj v primeru 5, toda z nadomestitvijo citozana iz primera 5 z natrijevim alginatom.

Rezultati iz postopka 1 so prikazani na sl.8. Vidimo lahko, daje PDGF močno vezan na komplekse tako pred sterilizacijo kot po njej. Vezava je tako močna, da iz sproščenega PDGF ni jasno, ali alginat stabilizira PDGF proti izgubi biološke aktivnosti ob sterilizaciji. Zaključimo lahko, da ni verjetno, da bi bil natrijev alginat uporaben za stabilizacijo PDGF proti izgubi biološke aktivnosti med sterilizacijo.

Primer 11

Sterilen farmacevtski gel za lokalno dajanje za pospeševanje zdravljenja ran smo formulirali kot sledi (odstotki v mas.%):

karboksimetilceluloza 2,4 % hidroksietilceluloza 0,3 % natrijev klorid 0,24 % propilen glikol 20,2 % kolagen/ORC/PDGF 1 mas.% 2,0 % voda ravnotežje

Kolagen/ORC/1 mas.% PDGF smo pripravili kot je opisano v primeru 2, zdrobili do velikosti delcev okoli 1-10 pm, sterilizirali z gama obsevanjem in nato zmešali z ostalimi komponentami pod aseptičnimi pogoji, da smo dobili sterilen vodni gel, primeren za aplikacijo na rane za pospešitev zdravljenja ran.

Primer 12

Sterilen, v bistvu čist PDGF smo pripravili kot sledi.

% PDGF/kolagensko gobo, pripravljeno v primeru 1, smo zmleli do velikosti delcev manj kot 10 pm, nato pa sterilizirali z gama obsevanjem. Sterilni kompleks smo obdelovali s sterilno slanico (pH 8) 1 uro pri 35°C, da smo ekstrahirali sterilni PDGF, čemur je sledila filtracija in liofilizacija pod aseptičnimi pogoji, da smo dobili sterilen PDGF.

Postopek 1

Učinke kompleksacije in sterilizacije na aktivnost PDGF smo določili kot sledi:

Preostalo snov vsakega vzorca po 24-urah smo pripravili tako, da smo izsekane biopsij ske vzorce (premera 6 mm) namestili v 1 ml Dulbeccovega modificiranega eaglovega medija (DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium) in inkubirali pri 37°C, 5 % CO_2; v inkubatorju celične kulture z navlaženo atmosfero. Vsak vzorčni eluant smo testirali vdvojniku.

Biološko aktivnost PDGF smo določili s proliferacijo ob uporabi testa z metilen modrim za kvantifikacijo števila celic. Na kratko, AHDF (adult human dermal fibroblasts - dermalni fibroblasti odraslega človeka) smo gojili do 95% konfluence, tripsinirali, prešteli in ponovno zasejali v 10 % FBS/DMEM z gostoto celic 3 χ 10⁴celic / ml v mikrotitrsko ploščo s 96 jamicami (100 pm/jamico - 3000 celic/jamico). Celice smo v inkubatorju celične kulture z navlaženo atmosfero pri 37°C, 5% CO₂pustili, da so se v tem mediju preko noči oprijele in razširile. Medij smo nato odstranili, celično monoplast sprali s PBS in vsaki jamici dodali 100 μΐ / jamico testnega vzorca ali standarda. Vsak testni vzorec smo testirali 8 x, sterilnost pa smo dosegli s filtriranjem skozi injekcijski filter (0,2 pm). Vsak vzorec smo razredčili v odvisnosti od ocenjene koncentracije vključenega PDGF. To je bilo nujno za to, da se omogoči kvantifikacija PDGF preko linearnega območja. Kot standard smo uporabili humani rekombinantni PDGF-BB, razredčen v SF-DMEM, in uporabili v koncentracijskem območju 500 ng/ml - 1 ng/ml. Stimulans smo inkubirali s celicami še tri nadaljnje dni pri 37°C, 5 % CO2, nakar smo medij odstranili in celično monoplast fiksirali s FORMOL® slanico. Celice smo obarvali z metilen modrim, prebitno barvilo odstanili in barvilo eluirali iz celične monoplasti z nakisanim etanolom. Solubilizirano barvilo smo kvantificirali pri 630 nm z uporabo mikrotitrskega ploščnega spektrofotometra in podatke analiziriali z uporabo programske opreme BIOLINX®.

Celokupni nivo PDGF, sproščenega iz vsakega vzorca, smo določili z ELISA. Monoklonalno zajemalno protitelo (monoclonal capture antibody) za PDGF-BB smo uporabili pri 0,5 pg/ml 0,025 M-NaHCO₃, 0,025-Na2C0₃, 0,025 M-Na2CO₃, pH 9,7 (100 μΙ/jamico) in inkubirali preko noči pri 4°C. Preostala vezivna mesta smo blokirali s 3 % BSA/PBS 1 uro pri 37°C, nakar smo dodali testni vzorec ali standard. Vsak vzorec smo testirali v trojniku in standardna krivulja je bila v območju od 500 ng/ml do 1 ng/ml. Vsak vzorec smo testirali pri različnih razredčitvah, da smo omogočili točno oceno koncentracije. Nivo PDGF, prisotnega v testnem vzorcu, smo kvantificirali z uporabo primarnega poliklonalnega protitelesa za PDGF (1/1000 razredčenje) in sekundarnega anti-kunčjega IgG s peroksidaznim konjugatom (1/5000 razredčenje). Nato smo kvantificirali nivo peroksidaze z uporabo topnega substrata TMB, ki najprej tvori modro barvo, ki se po dodatku IM-žveplove kisline spremeni v rumeno. Barvo smo opazovali spektrofotometrično pri 450 nm.

Postopek 2

Učinke kompleksacije in sterilizacije na aktivnost aprotinina smo določili kot sledi.

mm izsekane biopsijske vzorce smo v dvojniku odvzeli iz kolagena/ORC, kolagena/OCR, ki vsebuje aprotinin (obsevan), in kolagena/ORC, ki vsebuje aprotinin. Dva izsekana biopsij ska vzorca iz vsake gobe smo dodali k 1 ml DMEM v sterilnem plastičnem vsebniku. DMEM smo odstranili po Številnih časovnih točkah, ki so segale od nič - 48 ur inkubacije pri 37°C. Sproščene snovi smo hranili pri -20°C dokler jih nismo potrebovali za funkcionalno analizo aprotininske aktivnosti.

Učinek obsevanja na aprotininsko funkcionalno aktivnost smo testirali z meijenjem sposobnosti aprotinina da inhibira vzorec očiščenega plazmina. Na kratko, 10 pls sproščene snovi smo dodali k celotnemu testnemu volumnu 100 pls, ki vsebuje 40 μΝ plazmina (40 ng), 10 μΜ plazminskega fluorogenskega substrata in Tris-HCl pufer (pH 8,1), ki vsebuje 0,5 % TRITON®-a. Pozitivne kontrole smo izvedli brez sproščene snovi.

Poleg tega smo izdelali standamo krivuljo za inhibicijo plazmina preko množice aprotininskih koncentracij od 0,5 ng/ml - 10 ng/ml in jo uporabili kot osnovo za izračune.

Test smo opazovali 1 uro pri 37°C in detektirali količino fluorescence z uporabo fluorogenskega ploščnega čitalnika (emisija 445 nm, ekscitacija 383 nm).

Gornje primere smo opisali le za namen ponazoritve. Strokovnjaku bodo očitne številne druge izvedbe predloženega izuma, ki spadajo v obseg spremljajočih risb.

Za

Johnson + Johnson Medical Limited:

Claims

Patentni zahtevki

1. Sterilni sestavek, označen s tem, da obsega kompleks terapevtskega peptida in polisaharida, izbranega iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi, pri čemer je omenjeni kompleks steriliziran z ionizirajočim sevanjem.
2. Sterilni sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da je izbrani peptid izbran iz skupine, katero sestavljajo rastni faktorji, hemostatična sredstva, antimikrobna sredstva, antibakterijska sredstva, anti-adhezijska sredstva in kolagenski fragmenti.
3. Sterilni sestavek po zahtevku 2, označen s tem, da peptid obsega rastni faktor, ki ima humano mitogensko ali angiogensko aktivnost.
4. Sterilni sestavek po zahtevku 3, označen s tem, da je rastni fakot izbran iz skupine, katero sestavljajo fibroblastni rastni faktor (FGF), trobmocitno izveden rastni faktor (PDGF), transformirajoči rastni faktorji (TGF-a, TGF-βι, TGF-p₂), živčni rastni faktorji (NGF-cc, NGF-β), epidermalni rastni faktor (EGF), kostni morfogenetski protein, insulinu podobni rastni faktorji (IGF-I ali IGF-II) in njihove zmesi.
5. Sterilni sestavek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, da sestavek nadalje obsega biopolimer, izbran iz skupine, katero sestavljajo strukturni proteini, polianionski polisaharidi in njihove zmesi.
6. Sterilni sestavek po zahtevku 5, označen s tem, da so omenjeni strukturni proteini izbrani iz skupine, katero sestavljajo nativni-kolagenski tipi, atelokolagen, pepsinsko solubiliziran kolagen, želatina, fibronektin in laminin.
7. Sterilni sestavek po zahtevku 6, označen s tem, da omenjeni strukturni proteini sestojijo v bistvu iz nativnega vlaknatega kolagena.
8. Sterilni sestavek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, da je omenjeni polisaharid izbran iz skupine, katero sestavljajo oksidirane celuloze, citozani in njihove soli in zmesi.
9. Sterilni sestavek po zahtevku 8, označen s tem, da je omenjeni polisaharid izbran iz skupine, katero sestavljata ORC in nORC.
10. Sterilni sestavek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, da omenjeni sestavek obsega zmes nativnega vlaknatega kolagena in ORC.
11. Sterilni sestavek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, daje masno razmerje omenjenega terapevtskega peptida proti polisaharidu od l:10⁶ do 1:10.
12. Sterilni sestavek po zahtevku 11, označen s tem, daje omenjeno masno razmerje od 1 proti 10⁵do 1:100.
13. Sterilni sestavek po zahtevku 12, označen s tem, daje omenjeno masno razmerje od 1 proti 10⁴ do 1:1000.
14. Sterilni sestavek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, da omenjeni sestavek obsega liofilizirano ali solventno posušeno gobo.
15. Sterilni sestavek po zahtevku 14, označen s tem, da nadalje obsega sredstvo za odstranjevanje prostih radikalov.
16. Sterilni sestavek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, daje omenjeni sestavek viskozna tekočina ali gel za lokalno dajanje človeškemu ali živalskemu telesu.
17. Sterilni sestavek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 15, označen s tem, da je omenjeni sestavek tekočina za intravensko dajanje čoveškemu ali živalskemu telesu.
18. Sterilni sestavek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 13, označen s tem, da sta terapevstki peptid in polisaharid prevlečena na površino trdnega nosilca.
19. Sterilni sestavek po zahtevku 18, označen s tem, daje trdni nosilec tkan ali netkan material, polimerni film ali tkanina, primeren/na za uporabo na površini rane.
20. Sterilni sestavek po zahtevku 18 ali 19, označen s tem, da ima omenjeni trdni nosilec sposobnost bioabsorpcije.
21. Sterilni sestavek po zahtevku 20, označen s tem, da omenjeni trdni nosilec obsega tkano in netkano ORC tkanino.
22. Sterilni sestavek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, ki je sterilno paketiran.
23. Postopek za pripravo sterilnega terapevtskega sestavka, označen s tem, da obsega stopnje:

zagotovitev kompleksa terapevtskega peptida s polisaharidom in sterilizacijo omenjenega kompleksa, čemur sledi dispergiranje omenjenega kompleksa v ali na farmacevtsko sprejemljivem nosilcu, pri čemer je omenjeni polisaharid izbran iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galaktomanani in njihove zmesi.
24. Postopek po zahtevku 23, označen s tem, da omenjena stopnja zagotovitve obsega mešanje omenjenega terapevtskega peptida z omenjenim polisaharidom v topilu, čemur sledi odstranitev topila, da zapusti omenjeni kompleks.
25. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, daje omenjeno topilo vodno topilo.
26. Postopek po zahtevku 24 ali 25, označen s tem, daje omenjeno topilo odstranjeno z liofilizacijo ali solventnim sušenjem.
27. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 23 do 26, označen s tem, daje omenjena stopnja sterilizacije izvedena z ionizirajočim sevanjem ali z obdelavo s plinsko plazmo.
28. Postopek po zahtevku 27, označen s tem, da je omenjeno ionizirajoče sevanje gama sevanje.
29. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 23 do 28, označen s tem, da omenjeni kompleks obsega manj kot 4 mas.% vode med omenjeno stopnjo sterilizacije.
30. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 23 do 29, označen s tem, da se stopnja disperigiranja izvede pod aseptičnimi pogoji po omenjeni stopnji sterilizacije.
31. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 23 do 30 za pripravo sterilnega sestavka po kateremkoli od zahtevkov 1 do 22.
32. Postopek za pripravo sterilnega terapevtskega peptida, označen s tem, da obsega stopnje:

zagotovitev terapevtskega peptida;

tvorbo kompleksa med terapevtskim peptidom in polisaharidom; sterilizacijo omenjenega kompleksa, čemur sledi ločevanje terapevtskega peptida od omenjenega kompleksa pod aseptičnimi pogoji, da dobimo omenjeni sterilni terapevtski peptid, pri čemer je omenjeni polisaharid izbran iz skupine, katero sestavljajo celulozni derivati, citin, citozani, galakotmanani in njihove zmesi.
33. Postopek po zahtevku 32, označen s tem, da omenjena stopnja ločevanja obsega ekstrakcijo terapevtskega peptida iz kompleksa z vodnim topilom.

Za

Johnson + Johnson Medical Limited: