CN104307005A - 一种辐照灭菌条件下维持骨形态发生蛋白-2活性的方法 - Google Patents

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杨贤金
卢云峰
李朝阳
李雪
崔振铎
原续波
王思颖
汪亚运
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Abstract

本发明涉及一种利用射线辐照维持BMP-2活性的方法。将BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co、137Cs、192Ir源射线辐照，设定剂量为0.01-100kGy；实现对BMP-2的辐照过程。本发明的优点在于有效解决了BMP-2辐照过程中失活问题，推动了负载BMP-2的医疗器械的研究发展，大大提高了其应用前景。

Description

一种辐照灭菌条件下维持骨形态发生蛋白-2活性的方法
技术领域
本发明涉及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)辐照灭菌过程中的活性保持，其辐照对象为BMP-2，采用60Co、137Cs、192Ir发射源，辐照剂量为0.01-100kGy。
背景技术
骨形态发生蛋白(BMP)被广泛应用，主要是因为它可以诱导骨和软骨的形成，可作为治疗骨折和牙周缺陷的治疗剂，并能够在植入物和人工假体周围诱导骨生长。传统的基因剔除实验表明，骨形态发生蛋白拥有着多种多样的生物活性，比如在早期的胚胎发生、多方位的器官形成等方面都能通过调节细胞的增殖、分化和凋亡来实现功能。通过体外和体内试验，一系列人骨形态发生蛋白已经被证实可以刺激骨形成，同时重组人骨形成蛋白也被应用。至今，已经有超过20种BMP被鉴定和表征，他们都是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员。其中，BMP-2具有几乎和自体骨相当的骨修复能力，被认为具有最强的骨诱导活性。
灭菌是BMP-2及负载BMP-2医疗器械临床使用前必需的操作。但是现行的几种常规灭菌方式都会使BMP-2失去活性。环氧乙烷可与蛋白类物质发生化学反应而使BMP-2失活；高压蒸汽灭菌使BMP-2变性而失活。
辐照灭菌是通过放射性物质发出辐射线杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法，在整个灭菌过程中，温度并不明显升高，对于热敏性化合物是很好的灭菌方式。
发明内容
本发明的目的在于射线辐照有效地对BMP-2灭菌同时维持其活性。
本发明的技术方案如下：
本发明将BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co、137Cs、192Ir源射线辐照，设定剂量为0.01-100kGy，优选设定剂量为15-50kGy；实现对BMP-2的辐照过程。
然后将细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组，细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。通过ALP含量的高低来确定BMP-2的活性高低，实现对BMP-2活性的检测。
本发明检测BMP-2活性的原理是ALP是细胞向成骨细胞分化的重要指标，BMP-2活性高，细胞向成骨细胞分化的趋势明显，则ALP表达量高，通过ALP的含量高低可以检测BMP-2活性的高低。
本发明的优点在于有效解决了BMP-2辐照灭菌过程中失活问题，提高了其应用前景。
附图说明
图1：60Co射线25kGy辐照后细胞中ALP含量变化；
图2：60Co射线50kGy辐照后细胞中ALP含量变化；
图3：60Co射线35kGy辐照后细胞中ALP含量变化。
具体实施方法
下面通过例子对本发明专利进行进一步的阐述。
实施例1：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co源射线辐照，设定剂量为0.01kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例2：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用137Cs源射线辐照，设定剂量为0.01kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例3：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用192Ir源射线辐照，设定剂量为0.01kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例4：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co源射线辐照，设定剂量为100kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例5：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用137Cs源射线辐照，设定剂量为100kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例6：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用192Ir源射线辐照，设定剂量为100kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例7：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co源射线辐照，设定剂量为25kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。实验结果如附图1所示。
实施例8：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co源射线辐照，设定剂量为50kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。实验结果如附图2所示。
实施例9：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co源射线辐照，设定剂量为35kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。实验结果如附图3所示。
实施例10：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用137Cs源射线辐照，设定剂量为25kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例11：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用192Ir源射线辐照，设定剂量为50kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例11：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用192Ir源射线辐照，设定剂量为28kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例12：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用60Co源射线辐照，设定剂量为15kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。
实施例13：
1.准备BMP-2溶液加入离心管中，用封口膜封好，放入保温瓶中，装满冰，用137Cs源射线辐照，设定剂量为15kGy。
2.脐带血间充质干细胞在DF12完全培养液中常规培养，分别设立未辐照的BMP-2组、辐照的BMP-2组。细胞培养7天后检测每个孔ALP含量。
3.通过对ALP含量的分析，我们可以看到，BMP-2辐照之后，其ALP表达量与未辐照的BMP-2的ALP表达量相近，并没有显著性差异，从而证明辐照之后BMP-2活性得到维持。

Claims (2)

1.利用射线辐照维持BMP-2活性的方法，其特征在于：射线发射源为60Co、137Cs或192Ir，辐照剂量为0.01-100kGy。
2.如权利要求书1所述的方法，其特征在于：辐照剂量为25-50kGy。
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