KR20150016553A - 숙신산의 정제 - Google Patents

Abstract

숙신산의 여과된 발효액의 정제 방법이 설명된다. 상기 방법은 비-관능화 크로마토그래피 수지를 사용하여 원 여과된 액 중의 다른 유기 산 및 염으로부터 숙신산을 분리시키는 것을 포함한다. 상기 작업은 유리 숙신산을 수득하기 위한 등용매 용리로서, 또는 숙시네이트 염을 생성하기 위한 기울기 또는 이성분 용리로서 수행될 수 있다.

Description

숙신산의 정제{PURIFICATION OF SUCCINIC ACID}

우선권 주장

본원은 2012년 5월 7일 출원된 가 출원 번호 61/643,405를 우선권 주장한다.

본 발명은 발효액(fermentation broth)으로부터 숙신산 및/또는 이염기성 숙시네이트의 분리 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 비-관능화(non-functionalized) 수지 상에서 크로마토그래피를 사용하는 것을 포함하는 숙신산 및/또는 그 염의 정제 방법에 관한 것이다.

숙신산 및 그 유도체는 중합체, 연료 첨가제, 잉크, 화장품의 제조에서, 및 식품 및 의약품에서 첨가제로서 널리 사용되는 유용한 기본(platform) 화학물질이다. 예를 들어, 숙신산은 안료, 용매, 세제, 금속 도금 및 폴리부틸렌 숙시네이트 중합체의 제조에서 투입물(input)로서 사용될 수 있는데, 상기 중합체는 가용성 포장, 농업용 필름 및 퇴비화가능한 백(bag)과 같은 응용예에서 통상적인 플라스틱을 대체하는데 사용될 수 있다.

숙신산은, 제한되고 고가이며 오염 문제를 일으키는 석유화학물질로부터 전통적으로 제조되어 왔다. 다양한 응용예 때문에, 바이오-숙신산의 대안적인 제조 방법이 지난 몇 년간 주목받아 왔다. 큰 관심을 얻은 더욱 환경적으로 친화적인 방법은, 글루코스로부터 혐기성 세균에 의해 숙신산을 발효적으로 제조하는 것이다. 숙신산의 발효적 제조는, 재생가능한 기질이 그 제조를 위해 사용될 뿐 아니라 발효 동안 CO₂가 숙신산 내로 혼입되기 때문에 녹색 기술로서 간주될 수 있다. 따라서, 발효성 숙신산은 합성 수지, 생분해가능한 중합체, 및 화학물질 중간체의 제조를 위한 녹색, 바이오-유래 공급원료를 제공한다.

숙신산의 발효적 제조가 석유화학에 기반하는 방법에 비하여 많은 이점이 있다 하더라도, 석유화학적 제조와 경쟁하는 바이오기술 방법에 대해서는 제조 비용을 최소화시켜야 함이 요망된다(예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌[James McKinlay et al., "Prospects for a Bio-based Succinate Industry," APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., (2007) 76:727-740] 참조). 전체 제조 비용의 약 60%가 하류 처리(downstream processing), 예를 들어 발효액에서 생성물의 단리 및 정제에 의해서 발생한다. 발효액으로부터 숙신산의 정제는, 이 산을 회수하는 성공적이고 비용 효과적인 방법의 개발에 있어서 중요한 단계이다.

수 년 동안 숙신산을 단리시키기 위해서 다양한 방법들이 개발되어 왔다. 이러한 기술은, 한외여과, 수산화칼슘 또는 암모니아를 사용한 침전, 결정화, 전기투석, 액체-액체 추출, 수착(sorption) 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것을 포함하였다(본원에 참조로 포함된 문헌[Tanja Kurzrock et al., "Recover of Succinic Acid from Fermentation Broth," Review, BIOTECHNOLOGY LETTER, (2010) 32:331-339] 참조). 염, 유기 산 및 남아있는 바이오매쓰(biomass) 전부를 포함하는 다양한 불순물은, 순수 숙신산의 단리 또는 숙신산 함유 스트림의 하류 처리를 방해할 수 있다. 이것 때문에, 다양한 상이한 방법들이 숙신산의 정제를 위해 제안되었지만, 이러한 방법들은 단점이 있다.

예를 들어, 탐구되어온 일부 방법의 문제는, 목적하는 숙신산을 분리시키는 통상적인 이온 교환 방법의 비교적 제한된 용량이다. 이온 교환은 상업적인 규모의 작동으로 변형될 수 있는 실행가능한 처리 기술로 입증되지 않았다. 현재까지, 수지는 숙신산에 대해 효율적인 수착 공정을 제공할만큼 충분히 큰 용량을 갖는 것으로 보여지지 않는다. 그러므로, 흡착 크로마토그래피는 숙신산에 대해서 선택성 및 용량 둘 모두에 의해 제한을 받는다. 발효 스트림에 대해 염을 제거하기 위해서 이온 교환의 사용이 적용될 수 있지만, 여기서는 수지를 재생시키기 위한 산 및 염기의 사용이 요구되고 비교적 적은 수준의 염이 존재하는 경우에만 효율적이다. 발효액 중 염 함량이 높다면, 이온 교환 시스템은 지연될 것이고 낮은 처리량 때문에 비효율적일 것이다. 그러므로, 이온 교환 수지는 다른 유기 산으로부터 염을 분리시키기에는 덜 효율적일 것이다. 따라서, 이것은 높은 수준의 염을 갖는 경우에는 효율적이지 않다. 더욱이, 전통적인 이온 교환 기술은 액 중에 존재하는 다양한 유기 산의 분리가 용이하지 않다. 전기-탈이온화(EDI)는 멤브레인 오염과 관련된 문제 때문에 높은 처리량의 응용예에 대해서 실행가능한 정도로 다양한 유기 산을 분리시키지 않는다. 다른 방법들, 예컨대 반응성 추출은 유기 용매 및 고가 시약을 필요로 한다.

이러한 기술 모두가 어느 정도 성공적이었다 하더라도, 이들은 비용, 부산물-폐기물 발생, 또는 규모의 경제성 중 어느 하나에 의해서 제한을 받는다. 그러므로, 이러한 이유로, 공정을 간편화시킬 수 있고 하류 처리 비용 및 폐기물을 감소시킬 수 있는, 숙신산을 회수하기 위한 보다 우수하거나 보다 직접적인 방법이 필요하다.

본 발명은, 발효액 내 불순물로부터 숙신산 또는 이염기성 숙시네이트의 정제 방법을 설명한다. 구체적으로, 상기 방법은, 발효액을 여과하는 단계; 약 3.0 이하의 pH 값을 갖는 숙시네이트 함유 여액이 생성되도록 그 pH를 조정하는 단계; 산성화된 여액을 비-관능화 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼을 통하여 약 20℃ 내지 약 100℃ 범위의 작동 온도에서 선택적으로 흘려보내서 적어도 두 개의 명확한 분획을 얻는데, 상기 분획 중 적어도 하나는 유리 숙신산 또는 숙시네이트 염을 함유하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 발효액을 여과하여 청정화 액(clarified broth)을 생성시키는 단계; 상기 청정화 액을 3.0 미만의 pH 값으로 제공하거나 산성화시키는 단계; 청정화 여액을, 유리 숙신산을 분리시키는데 사용된 특정 수지에 대하여 사전결정된 작동 온도에서 비-관능화 수지를 갖는 연속 크로마토그래피 장치 내로 도입시키는 단계; 및 숙신산을 결정화시키는 단계를 포함하는, 발효액으로부터 유리 숙신산의 정제 방법을 설명한다.

상기 방법의 이점은 유리 산이 결정화되어, 단일 결정화 후에 90% 이상 순도의 생성물을 얻을 수 있다는 것이다. 이염기성 숙시네이트 염을 분리시키기 위해서, 상기 유리 산은 크로마토그래피 분리 동안 강한 무기 염기를 사용하여 나중에 용리될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 숙시네이트 염의 제조 방법을 설명한다. 상기 방법은, 발효액을 여과하여 3.0 미만의 pH를 갖는 숙시네이트 함유 여액을 생성시키는 단계; 여액을 약 70℃ 이하의 온도에서 액체 크로마토그래피 컬럼을 통하여 비-관능화 수지 위로 처리하고 강한 염기 또는 유기 용매를 사용하여 용리시켜서 숙신산 염을 형성시키는 단계를 포함한다.

또한, 또 다른 이점은, 이염기성 종, 예컨대 숙신산 이암모늄의 스트림을 단리시킬 수 있다는 것인데, 이에 의해 다양한 질소 함유 유도체, 예컨대 N-메틸 숙신아미드, N-메틸-피롤리디논, 피롤리디논 및 N-비닐피롤리돈으로의 가능한 직접적인 변형이 가능해진다. 특성으로서, 본 발명은, 하류 처리에서 전환을 위한 더욱 깨끗한 전구 물질이 얻어지게 하는, 더욱 용이하고 더욱 간편하고 더욱 비용 효과적인 방법을 개시한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 구상을 높은 처리량 또는 연속 분리를 위해 변형시킬 수 있다. 주요 응용예에 대해 모의된 이동층(SMB) 크로마토그래피 시스템을 실시할 수 있다.

본 정제 방법의 추가 특징 및 이점은 하기 상세한 설명에서 개시될 것이다. 상기 요약 및 하기 상세한 설명 및 실시예는 단지 본 발명을 대표하는 것이며, 이것은 청구된 발명을 이해하기 위한 개요를 제공하도록 의도된다.

도 1은 본 발명의 구현예에 따른 처리 단계를 나타내는 흐름도이다.
도 2는, pH 2에 있는 발효액으로부터의 여액이 약 50℃의 온도에서 컬럼을 통하여 흘려 보내지는 본 발명의 반복에 따른 등용매 분리로부터 유래한 펄스 시험(pulse test)을 그래프로 예시한다.
도 3은 약 60℃의 온도에서 실시된, 도 2에서와 같은 등용매 분리에 대한 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 4는 약 75℃의 온도에서 실시된, 도 2에서와 같은 등용매 분리에 대한 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 5는 약 90℃의 온도에서 실시된, 도 2에서와 같은 등용매 분리에 대한 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 6a, 6b 및 6c는 각각 60℃의 온도에서 실시되었지만 공급물에 대해 가변된 pH 값(도 6a는 2.5의 pH에 있고, 6b는 3.0의 pH에 있고, 도 6c는 4.3의 pH에 있다)을 갖는, 등용매 분리에 대한 일련의 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 7은 약 60℃의 온도에서 실시된, 도 3에서와 같은 등용매 분리의 펄스 시험의 플롯을 도시한다. 상기 플롯은 숙신산에 대한 명확한 피크 및 다른 유기 산으로부터 그 분리를 도시한다.
도 8은 본 발명의 또 다른 구현예에 따른 약 40℃의 작동 온도 및 2의 공급물 pH에서 염기(예를 들어, NaOH)를 사용한 기울기 또는 이성분(binary) 용리로부터 유래한 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 9는 25℃의 온도 및 2의 공급물 pH에서 실시된, 도 8에서와 같은 이성분 용리에 대한 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 10a는 25℃의 온도 및 2의 공급물 pH에서 실시된, NH₄OH를 사용한 이성분 용리에 대한 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 10b는 도 10a에서와 같지만, 숙시네이트가 급격한 피크를 가지면서 주위 온도에서 염으로서 용리됨을 입증하기 위해 염기가 나중에 첨가되는, 기울기 용리에 대한 펄스 시험의 플롯을 도시한다.
도 11은 본 발명의 반복에 따라 (양성자화된) 숙신산을 용리시키도록 변형된, 모의된 이동층 크로마토그래피 시스템의 개략적인 대표도를 도시한다.
도 12는 탈양성자화된 숙신산 염(예를 들어, 숙신산 이암모늄)을 용리시키도록 변형된, 모의된 이동층 크로마토그래피 시스템의 개략적인 대표도이다.

제I 부분 - 정의

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 특정 구현예를 설명하는데 사용된 용어는 제한적인 것으로 의도되지 않음이 이해된다. 이 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥이 명확하게 다른 것을 나타내지 않는다면 복수 지시물을 포함한다. 문맥에서 다른 것으로 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해된 그 일반적인 의미를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "발효"는, 유기 산, 알콜 및 관심있는 다른 화학물질의 바이오-전환 및 바이오-제조 과정을 지칭한다. 상기 용어는 단독으로, 순차적으로 또는 함께, 및 미생물의 임의 성장 상태(정지, 침체, 복제 등)에서 일어나는 하나 이상의 전환 또는 제조 과정을 포함한다.

용어 "발효액"은, 관심있는 다른 유기 물질이 생성되도록 미생물이 유기 탄소 공급원을 전환시키는 액체 매체를 지칭한다.

용어 "탄소 공급원"은, 미생물에 의해서 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 지칭하는데, 여기서 상기 공급원은 적어도 하나의 탄소 원자를 함유한다. 탄소 공급원은 예를 들어, 다양한 탄수화물, 예컨대 덱스트로스, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 전분 등, 알콜, 유기 산 및 그 상응하는 염, 또는 식물 또는 동물로부터의 오일, 지방 및 트리글리세리드를 포함할 수 있다.

용어 "층 부피" 또는 "컬럼 부피"는, 패킹 물질 및 틈새 액체로 된 전체 부피를 지칭한다. 상기 컬럼 내 규정된 양의 흡수제(sorbent)를 적시는데 필요한 용매의 최소 부피는 흡수제의 특성에 따라서 가변될 수 있다(예를 들어, 실리카 겔 흡수제 60Å 500 mg 당 약 600 ㎕에 비교되는, 실리카 겔 흡수제 60Å 100 mg 당 약 120 ㎕).

용어 "크로마토그래피 분리능(resolution)"은, 크로마토그래피 컬럼으로부터 나타나는 연속적인 분석물 사이에서의 분리도를 지칭한다.

용어 "등용매 용리"는, 이동 상의 조성이 분리 공정 전체를 통하여 일정하게 유지되는 액체 크로마토그래피(LC) 분리를 지칭한다. 등용매 용리는 전형적으로 정지 상에 대한 친화도가 크게 다르지 않는 샘플 성분의 분리에서 효과적이다.

용어 "기울기 용리"는, 이동 상의 조성이 크로마토그래피 분석 동안에 변화되거나 가변되는 분리를 지칭한다. 특히, 용어 "이성분 용리"는 두 개의 상이한 종류의 용리 매체를 사용하는 분리를 지칭한다.

제II 부분 - 설명

본 발명은 부분적으로, 발효액으로부터 유래한 유리 유기 산으로부터 화학 공급원료 분자를 제조하는 방법을 설명한다. 본원에 사용된 용어 "유리 유기 산"은, 용액 중에 있는 경우에 그 양성자화된 상태로 있는(즉, 그 pKa 값 이하에 있는) 유기 산 화합물을 지칭한다. 본 분리 방법은 유리 산 또는 그 염 중 하나를 회수하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 유리 산의 분리는 등용매 용리이고 염 생성은 기울기 또는 이성분 용리이다. 등용매 용리 방법은 다른 유기 산, 당, 및 염 등으로부터 숙신산을 분리시키는, 큰 부피 및 비용 효과적인 방법에 대해 유용하다.

본 발명의 방법은 크로마토그래피 정제를 위해 소수성의 비-관능화 수지 층을 사용한다. 본 발명의 방법이 액 여액 중에 존재하는 다른 유기 산, 염, 및 용해된 글루코스로부터 유리 숙신산 또는 숙시네이트 염을 분리시키는 능력이, 특히 흥미롭다. 크로마토그래피 조건에 따라 다르게, 정제된 숙신산 또는 이염기성 숙시네이트의 어느 한 스트림이 단리될 수 있다. 용리 조건을 가변시킴에 의해서 숙신산 또는 이염기성 숙시네이트를 단리시키도록 상기 분리 방법을 선택적으로 작동시킬 수 있다. 작동 온도는 약 20℃ 내지 약 100℃의 범위일 수 있다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 특정 크로마토그래피 수지에 따라 다르게, 숙신산은 고온에서 단리되고, 이염기성 숙시네이트는 이성분 용리를 사용하여 보다 낮은 온도에서 단리된다. 분리를 위한 작동 온도는 평형 결합 상수, 피크 형상 및 불순물에 대한 숙신산의 분리능에 의해서 결정된다.

이러한 유형의 정제는, 다른 정제 방법과 관련된 본질적인 문제의 일부, 예컨대 전기투석 멤브레인의 오염, 유기 용매의 사용, 이온 교환 수지의 낮은 용량, 및 결정화 선택성은 회피하면서, 이것이 한 단계에서 잔류 염, 질소 함유 불순물 및 다른 유기 산 전부로부터 숙시네이트 스트림을 단리시키는 확고한 방법이기 때문에 유익하다. 재생을 위해 산/염기의 사용을 필요로 하고 흡수 공정에서 숙신산에 대해 낮은 용량을 보여준 통상적인 이온 교환 수지의 단점을 고려하였을 때, 크로마토그래피를 사용하는 정제 방법에 대해 새로우며 더욱 효율화된 방법은 높이 평가될 것이다.

통상적인 이온 교환 크로마토그래피와는 다르게, 비-관능화 수지 층은 염을 교환시키지 않으며 또한 재생시킬 필요도 없다. 그러므로, 본 발명의 방법은, 불연속적인 회분식(batch), 또는 최적으로는 연속적인 공정 크로마토그래피로 분리를 실시하는 경우에 시간 및 비용 둘 모두를 절감시킨다.

구체적으로, 발효액으로부터 숙신산을 정제하는 방법은, 발효액을 여과하는 단계; 약 3.0 이하의 pH 값을 갖는 숙신산 함유 여액을 생성시키도록 pH를 조정하는 단계; 사용된 특정 수지에 대해 최적화되는 작동 온도에서 비-관능화 수지를 사용하면서, 산성화된 여액을 크로마토그래피 시스템, 예컨대 모의된 이동층(SMB) 시스템을 통하여 흘려보내는 단계를 포함한다. 특정 비-관능성 폴리(스티렌-디비닐 벤젠)(PS-DVB) 수지에 대한 작동 온도는 평형 결합 상수, 체류 시간 및 피크 분리능에 대한 경험 데이터의 수집을 통하여 결정된다. 예를 들어, 비-관능화 크로마토그래피 수지, 예컨대 XAD-4에 대하여, 적어도 두 개의 명확한 분획이 얻어지도록 작동 온도는 a) 유리 숙신산을 생성시키도록 50℃ 초과, 또는 b) 숙신산의 염을 생성시키도록 50℃ 미만일 수 있다. 그러나, 다른 수지에서는 이염기성 숙시네이트를 생성시키기 위해서 작동 온도는 더 높거나 더 낮게, 예를 들어 약 65℃ 또는 약 70℃ 이하로 연장되도록 허용되거나 요구될 수도 있다.

이 방법은 단일 작업으로 발효액 중에서 전형적으로 확인되는 다수의 큰 다른 오염물로부터 숙신산의 스트림을 정제하는 가능한 방법을 제공한다. 본 발명의 이점은 사전 정제없이 크로마토그래피 후에 1회의 결정화에서 고순도(≥90%) 숙신산 또는 그 염을 얻을 수 있다는 것이다. 최적화와 함께, 상기 방법은, 예를 들어 약 92% 또는 95% 내지 약 97% 또는 99%만큼 높을 수 있는 순도 수준을 달성할 수 있다.

본 분리 방법의 특성에 따르면, 숙신산의 명확한 피크가 3층 부피 내에서 나타난다. 전형적으로, 약 1.0 층 부피와 약 2.75 층 부피 사이에서 명확한 피크가 관찰된다. 염 및 다른 유기 산, 및 부산물 화합물은 목적하는 숙신산 추출로부터 용이하게 분리될 수 있다. 이 특성은, 매우 적은 생성물 손실과 함께 숙신산/숙시네이트의 "깨끗한" 스트림(즉, ≥85% 또는 90%)의 단리를 초래할 수 있다. 여과된 발효액으로부터 유리 산 및 염 형태의 적어도 약 68% 또는 70%(전형적으로, 약 72% 또는 75%) 회수를 달성할 수 있다. 원(raw) 여액으로부터의 회수율은 약 80%, 85% 또는 그 이상일 수 있고, 최적화를 사용하면 초기 공급원료로부터 약 90% 내지 95% 이상의 수율로 상기 산 또는 염 형태를 회수할 수 있다.

A.

부분적으로, 본 발명은 정제하기 어려운 유기 종에 대한 크로마토그래피 분리 기술의 개선에 기여한다. 본 발명의 방법은, 현재 방법보다 더욱 효율적이고 비용 효과적일 수 있다는 점에서 통상적인 방법에 대해 우호적으로 비교된다. 본 발명의 특성은, 크로마토그래피 공정 전 및 동안에 온도, pH 및 용리 조건을 포함하는 여러 파라미터의 균형에 의해서 생성된 작동 계획(operational regime)의 발견을 포함한다.

본 발명의 특성에 따르면, 본 출원인은 발효액 중에서 전형적으로 확인되는 대다수의 큰 다른 오염물로부터 숙신산의 스트림을 단일 작업으로 정제하도록 액체 크로마토그래피(LC) 기술을 변형시켰다. LC는 전형적으로 컬럼에 함유된 다양한 유형의 정지 상(즉, 흡수제); 컬럼을 통해 이동 상 및 샘플 성분을 이동시키는 펌프; 및 샘플 성분에 대해 특징적인 체류 시간 및 검출기를 통과하는 각각의 분석물의 양을 반영하는 영역 카운트(area count)를 제공할 수 있는 검출기를 사용한다. 분석물 체류 시간은, 정지 상, 사용된 이동 상의 조성 및 유속과 상기 분석물과의 상호작용의 강도, 및 컬럼 치수에 따라서 가변된다. 여기서, 압력을 회피하기 위해서 비교적 큰 직경의 컬럼 및 큰 입자 크기가 사용된다.

앞서 설명하였듯이, 숙신산을 정제하기 위하여 반응성 추출, 전기투석, 결정화 및 이온 교환을 포함하는 다양한 방법이 탐구되었지만, 각각은 문제에 부딪쳤다. 그러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 비-관능화 수지를 사용한다. 상기 비-관능화 수지는 이온성 전하에 의해 상이한 종을 결합시키지 않고, 오히려 비-관능화 수지는 친수성 및 소수성 친화도의 균형에 의해서 작용한다. 설명된 구현예에서, 흡착성 수지는 개질되지 않고 소수성 수지인 것으로 간주된다. 따라서, 소수성 유기 종은 흡착성 수지에 결합되어 수성 시스템 중에 보유될 수 있다.

상기 수지가 관능화되지 않기 때문에, 숙신산이 상기 수지에 대해 친화도를 갖게 하기 위해서 투입 물질의 pH 조정이 필수적이다. 그러므로, 발효액으로부터의 원 여액은 약 3 미만의 pH 값을 갖는 산성이어야 한다. 여과된 액은 고유 산성 pH 값을 가질 수 있거나, 3 미만의 pH로 산성화되도록 처리될 수 있다. 특히, 상기 여액은 약 1.0 내지 약 3.0 범위의 pH 값을 갖는다. 전형적으로, pH는 약 1.2 또는 2.0 내지 약 2.8 또는 2.9이고, 바람직하게는 pH는 약 1.3 또는 1.5 내지 약 2.5 또는 2.7의 범위이다.

구현예에서, 숙신산의 분리에 사용된 수지 유형은 흡착성 폴리(스티렌-디비닐 벤젠)(PS-DVB) 수지로 분류될 수 있다. 폴리스티렌은 디비닐 벤젠과 가교된다. PS-DVB 수지는 1 내지 14의 pH 범위에 걸쳐서의 그 안정성 때문에 다양한 유형의 화합물의 추출 및 분리를 위한 매력있는 흡착제이다. PS-DVB 수지는 극성 화합물은 적게 보유하면서 비극성 화합물은 매우 많이 소수성 표면을 갖는 것으로 공지되어 있다.

소수성 유형의 PS-DVB 수지는 다양한 판매처(예를 들어, 다우 케미컬 캄퍼니(Dow Chemical Company), 롬 앤드 하스 코.(Rohm & Haas Co.), 미츠비시 케미컬 코포레이션(Mitsubishi Chemical Corporation), 퓨롤라이트 코포레이션(Purolite Corporation), 랑제스 코포레이션(Lanxess Corporation) 등)로부터 상업적으로 입수가능하다. 각각의 수지 유형의 제조업자 및 특수한 사양에 따라 다르게, 수지는 다양한 상이한 다공 크기(pore size) 및 표면적을 가질 수 있고, 이것은 수지의 물리적 및 화학적 특성, 분리 품질, 및 따라서 다양한 프로토콜에 필요한 온도에 영향을 미칠 수 있다. 약 120 ㎡/g 또는 150 ㎡/g 내지 약 1100 ㎡/g 또는 1200 ㎡/g 범위의 표면적을 갖는 수지를 사용할 수 있다. 전형적으로, 수지의 표면적은 약 150 ㎡/g 또는 200 ㎡/g 내지 약 800 ㎡/g 또는 1000 ㎡/g에 있다. 특정 유기 용액(예를 들어, 옥수수 시럽, 과일 주스, HFCS, 폴리페놀, 또는 천연 추출물)에 대해 특수하게 적용된 수지는 약 250 또는 300 ㎡/g 내지 약 600 또는 750 ㎡/g의 표면적을 갖는다. 평균 다공 직경은 약 50Å 또는 100Å 내지 약 600Å 또는 700Å; 전형적으로 약 100Å 또는 150Å 내지 약 450Å 또는 500Å의 범위일 수 있다. 수지 입자의 평균 직경은 약 300 ㎛ 또는 350 ㎛ 내지 약 750 ㎛ 또는 800 ㎛; 전형적으로 약 400 ㎛ 또는 500 ㎛ 내지 약 650 ㎛ 또는 700 ㎛의 범위일 수 있다. 수지는 약 0.90 또는 0.95 ml/g 내지 약 1.40 또는 1.52 ml/g; 전형적으로 약 0.97 ml/g 내지 약 1.18 또는 1.25 ml/g 범위의 다공도(porosity)를 나타낸다.

흡착성 수지가 비극성 또는 소수성의 경향을 나타내기 때문에, 이는 이 수지가 물에 매우 가용성인 유기 화합물을 용이하게 흡착함을 의미한다. 예를 들어, 롬 앤드 하스로부터의 상업적인 이온 교환 수지의 한 부류는 앰버라이트(AMBERLITE)^TM XAD^TM 중합체성 흡착제인데, 이것은 고도로 가교된 거대망상 폴리스티렌 중합체 기재의 매우 다공성의 구형 중합체이다. 그 높은 내부 표면적은 이들이 사용되는 환경에 따라 다르게 매우 다양한 상이한 종을 흡착한 다음 탈착할 수 있다. 예를 들어, 극성 용매, 예컨대 물 중에서, 중합체성 흡착제는 비극성 또는 소수성 거동을 나타내며, 난용성인 유기 종을 흡착할 수 있다. 이러한 소수성은 스티렌계 흡착제에서 가장 두드러진다. (비극성 용매, 예컨대 탄화수소 등과 비교하여, 대부분의 흡착제는 약간의 극성 또는 친수성 특성을 나타내며 그래서 약간의 극성을 갖는 종을 흡착할 것이다. 이러한 극성은 아크릴계 흡착제 및 페놀계 흡착제에서 가장 두드러진다.) 하기 표 1에는 앰버라이트^TM 브랜드 수지의 물리적 및 화학적 특징의 일부가 요약되어 있다.

다른 업체들은 그러한 성능 특성을 이용하기 위한 정제 전략을 개발하였다. 예를 들어, 포획/농축 모드에서, 앰버라이트^TM XAD^TM 매체는 페놀계 화합물 또는 염소화 탄화수소의 회수에서 우수한 제1 정제 단계를 제공한다. 어떤 응용예에서, XAD 수지는 탈색을 실시한다. 앰버라이트^TM XAD^TM 흡착제는 회분식 및 (바람직하게는) 연속식 작동에서 사용되도록 변형될 수 있다. 다른 상업적으로 입수가능한 폴리스티렌 흡착성 수지, 예컨대 퓨로라이트로부터의 퓨로소브(PuroSorb)^TM PAD 흡착제는 깨끗한 단량체로 제조되며 임의 오염물질, 예컨대 염, 금속 및 다른 광물질을 함유하지 않는 높은 표면적을 갖는데, 이 점은 이 수지를 식품 및 의약품에서의 사용에 대해 특히 적합하게 한다. 그러나, 그러한 수지는 유기 산의 산업적인 분리를 위해, 특히 숙신산/숙시네이트에서의 사용을 위해 제안되거나 변형되지 않은 것으로 보인다.

B.

도 1은 본 발명의 구현예에 따른 분리 및 정제 방법의 개략적인 대표도인데, 이것은 다양한 처리 단계의 각각으로부터의 주요 생성물을 보여준다. 일반적으로, 상기 분리 방법은 유기 산, 예컨대 숙신산의 발효액 유래한 공급원 (1)을 사용하고, 발효액 (1)을 여과하여 (2) 바이오매쓰를 제거하고 원 여액 매체 (3)를 생성시키는 것을 포함한다. 원 여액 (3)은 고유한 산성 pH 값을 가질 수 있거나, 여액을 비-관능화 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼(6) 내로 공급하기 전에 상기 매체를 산성화시키도록 (4, 5) 처리된다. 분리는, 목적하는 생성물: 양성자화된 산 또는 이염기성 염에 따라 다른 두 개의 상이한 프로토콜에 따라서 선택적으로 실시될 수 있다. 유리 산 생성 분리 (7)에서, 공급물은 전형적으로 고온(예를 들어, XAD-4에 대해서 약 50℃ 이상, 전형적으로 약 52℃ 내지 약 87℃의 작동 온도)에서 탈이온수 용리를 사용하여 등용매적으로 처리된다. 임의로, 필요에 따라, 원 유리 산 (9)을 그 후 결정화시켜서 (11) 정제된 숙신산 (13)을 생성시킬 수 있다. 염 생성 분리 (8)에서, 공급물은 더 낮은 온도(예를 들어, XAD-4에 대해서는 약 50℃ 미만, 약 20℃ 내지 약 45℃의 작동 온도)에서 또는 유기 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 아세톤을 사용하여 탈이온수 및 강 염기의 이성분 용리로 처리된다. 다른 PV-DVB 수지는 다양한 친화도를 가질 수 있고, 그러므로 이 수지는 일반적인 파라미터에 따라서 다양한 온도에서 처리될 수 있다. 임의의 강한 무기, 암모니아 또는 카르보네이트 염기가 공정에 사용될 수 있다(예를 들어, NaOH, KOH, LiOH, NH₃, Na₂CO₃). 대안적으로, 도 1에 나타나 있듯이, 고온에서 등용매 용리를 실시하고, 숙신산을 단리시킨 다음, 수성 염기로 처리하여 이염기성 숙시네이트 (10)(예를 들어, 숙신산 이암모늄 (14))를 생성시킬 수 있다. 어느 한 루트로부터의 생성물은 순차적으로 화학적으로 처리되어 (12) 다른 상업적으로 중요한 화학물질 (15)(예를 들어, 테트라히드로푸란, 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 1,4-부탄디올, 1,4-디아미노부탄, 숙시노니트릴, 숙신디아미드, 또는 이염기성 숙신산 에스테르)을 생성시킬 수 있다. 본원에서 일반적인 용어로 설명되어 있듯이, 본 발명에 따라서 다양한 상이한 순열 및 반복이 구상된다; 그러므로, 상기 과정상 단계의 임의 것은 방법 순서에서 임의의 다른 단계와 조합될 수 있다.

등용매 용리에서, 피크 폭은 체류 시간과 함께 증가한다. 일반적으로, 이러한 특성은 늦게 용리되는 피크가 매우 평평하고 넓어지는 단점으로 이어진다; 그러므로, 그 형상 및 폭은 이들이 피크로 인지되는 것을 방해할 수 있다. 본 등용매 용리 시스템에서, 이점 중 하나는 샘플 체류 시간이 통상적인 작동 파라미터로부터 단축되었다는 것이다. 더 나중에 용리되는 종의 피크는 집중되고 증폭되었다. 이 특성은 짧은 지속기간 및 경제적이고 효율적인 방식으로 높은 처리량의 처리에 대한 가능성을 크게 증가시켰다. 특히, 보다 낮은 온도(＜40℃)에서 XAD-4와 같은 수지를 사용하는 경우에, 숙신산은 긴 용리 시간에서 및 넓은 피크 형상을 가진 채로 용리된다. 온도를 증가시킴에 의해서, 피크 형상 및 체류 시간 둘 모두가 개선된다. 또한, 염기성 용액 또는 유기 용매를 사용하여 이성분 용리를 실시함에 의해서, 늦게 용리되는 숙신산 피크가 훨씬 더 빠르게 그리고 더 높은 농도에서 용리된다. 이러한 처리 둘 모두에 의해서 경제적이고 효율적인 방식으로 높은 처리량의 처리에 대한 가능성이 크게 증가한다.

XAD-4를 사용한 첨부되는 펄스 시험이 예시하듯이, 숙신산의 분리에서는 용리 피크가 나타나고 상기 피크가 주위 온도에서 매우 넓어지는 경향이 있기 전에 삼(3) 초과의 층 부피에 대한 분리를 실시하는 것이 필요할 수 있는데, 상기 피크 넓어짐은 용리를 식별하기 매우 어렵게 만든다. 대조적으로, 본 발명에 따르면, 작동 온도를 조정함에 의해서 삼(3) 층 부피 내에서 액 여액 중의 다른 유기 산, 용해된 염 및 당 등으로부터 숙신산의 우수하고 명확한 분리를 실시할 수 있다. 전형적으로, 약 2.8 층 부피 내에서 명확한 피크가 나타난다. 첨부된 도 2 내지 9에 도시되어 있듯이, 약 0.8 또는 1.0 층 부피와 약 2.5 또는 2.75 층 부피 사이에서 숙신산의 명확한 피크를 관찰할 수 있다. 숙시네이트 피크와 염 및 다른 유기 산의 피크 사이에서의 크로마토그래피 분리능(즉, 분리도)은 약 0.1 또는 0.2 층 부피 내지 약 0.5, 0.75 또는 1.0 층 부피 사이에 있을 수 있다. 투입 농도에 따라 다르게, 리터 당 생성된 숙신산의 양은 다른 유기 산의 양보다 훨씬 더 많을 수 있다.

다양한 비-관능성 수지의 작동 온도가 평형 결합 상수, 체류 시간 및 피크 분리능을 기초로 변화될 수 있다 하더라도, XAD-4에 대해서, 유리 산 분리를 위한 작동 온도는 전형적으로 약 50℃ 내지 약 90℃인 반면, 염 생성을 위한 작동 온도는 약 20℃ 내지 약 50℃이다. 정제 공정이 약 50℃ 또는 그보다 높은 온도에서 실시되는 경우에, 분리능, 피크 형상 및 체류 시간, 및 가능하게는 또한 분리 속도 및 효율이 유리 산에 대해서 개선됨이 관찰되었다. 온도가 증가하는 경우에, 등용매 조건 하에서 숙신산의 체류 시간은 약 2.0 층 부피 아래로 개선될 수 있는데, 이에 의해서 예컨대 도 2, 3, 4 및 5에 도시된 바와 같이 효율적인 SMB 시스템이 얻어진다. 보다 높은 작동 온도는 포괄적인 약 50℃ 또는 53℃ 내지 약 88℃ 또는 90℃ 범위이다. 보다 구체적으로, 상기 온도는 약 55℃ 또는 58℃ 내지 약 83℃ 또는 85℃, 및 바람직하게는 약 60℃ 또는 65℃ 내지 약 78℃ 또는 80℃이다. 약 55℃ 또는 60℃ 내지 약 70℃, 75℃ 또는 85℃의 작동 온도 범위가 산업적인 처리에 대해 바람직할 수 있다. 비-관능성 수지의 작동 온도는 약 150℃ 이하일 수 있고, 특정 수지는 약 65 내지 90℃, 전형적으로는 약 72℃ 내지 약 80℃의 온도에 있다.

염으로부터 숙시네이트를 분리시키는 것에 추가하여, 본 발명의 방법에서는 숙시네이트가 필터 케이크로 손실되거나 숙시네이트를 회수 조건에 노출시키지 않고 필요에 따라 라피네이트(raffinate)로부터 금속 염을 침전 및 회수할 수 있다. 등용매 용리가 XAD-4를 사용하여 주위 실온(즉, 약 20℃ 내지 25℃)에서 실시되는 경우에, 상기 용리는 비교적 완속인 경향이 있었고 고 용적의 상업적인 처리, 예컨대 SMB 크로마토그래피에 대해서는 실용적이거나 적합하지 않은 경향이 있었다. 개별 숙신산 피크가 출현하기까지는 종종 2.75 또는 3층 부피를 초과하는 체류 시간이 걸릴 것이다. 이성분 용리는 나중에 용리되는 성분이 더욱 신속하게 용리되도록 상기 성분의 체류를 감소시켜서, 대부분의 성분에 대해 더욱 좁은(및 더욱 높은) 피크를 생성시킨다. 용리제의 증가하는 농도는 피크의 꼬리 부분(tailing part)을 전방으로 밀기 때문에, 이것은 또한 꼬리(tailed) 피크에 대한 피크 형상을 개선시킨다. 이것은 또한 피크 높이를 증가시키는데(피크가 "더욱 가파르게" 보임), 이것은 효율에 대해서 중요하다. XAD-4에 대해서, 염 분리를 위한 작동 온도는 22℃ 또는 24℃ 내지 약 44℃ 또는 48℃이다.

기울기 또는 이성분 용리는 나중에 용리되는 성분의 체류를 감소시키는데, 이에 의해서 숙신산에 대해 개선된 피크 형상이 얻어졌다. 나중에 용리되는 성분은 더욱 신속하게 용리되는 것으로 보이는데, 이에 의해서 대부분의 성분에 대해 더욱 좁은(및 더욱 높은) 피크가 얻어진다. 차례로, 이것은 보다 높은 농도의 생성물 및 보다 효율적인 크로마토그래피 공정을 초래한다. 이것은 또한 용리제가 피크의 꼬리 부분을 전방으로 밈에 따라 숙신산의 농도를 증가시키는데, 이는 피크 높이를 증가시키고(즉, 피크가 "더욱 가파르게" 보임), 이는 미량 분석에서 중요하다. 기울기 프로그램은 유기 성분의 백분율에서 갑작스런 "단계" 증가, 또는 다양한 시간에서 다양한 슬로프를 포함할 수 있다 - 모두는 최소 시간에서 최적의 분리에 대한 열망에 따른 것임. 염 분리를 위한 작동 온도는 약 22℃ 또는 24℃ 내지 약 44℃ 또는 48℃이다.

도 3은 또한 본 발명의 분리 방법이, 여과 후 용액 중에 남아있을 수 있는 염 및 질소 함유 화합물, 예컨대 아미노산 또는 우레아 둘 모두를 용이하게 제거할 수 있음을 보여준다. 상기 질소 화합물은 제1 층 부피 내에서 초기에 제거된다. 상이한 종 사이에서의 명확한 분리능은 훨씬 우수한 분리를 위해 모의된 연속 이동 상 시스템에서 증폭될 수 있다.

첨부되는 도 6a 내지 6c에 예시되어 있듯이, 공급원료 매체는 약 3.0 이하의 낮은 pH 값에서 처리되어야 한다. 전형적으로, 우수한 크로마토그래피 성능을 위해 pH 값은 약 2.8 또는 2.5 이하이다. 도 6a는, 분리가 2.5의 공급물 pH를 사용하여 실시되는 펄스 시험의 플롯을 도시한다. 펄스 시험은 숙신산, 염, 및 다른 유기 산 사이에서의 우수한 분해능, 및 각각의 종에 대한 명확한 피크를 보여준다. 유사하게 도 6b는 3.0의 공급물 pH에 대한 펄스 시험의 플롯이다. 숙신산, 염 및 다른 유기 산의 분리능은 여전히 우수하지만, 숙신산 분리 곡선에서 약 0.5 층 부피와 0.9 층 부피 사이에서 작은 상승이 관찰되기 때문에 소량의 숙신산이 라피네이트로 잠재적으로 손실될 수 있다. 도 6c의 펄스 시험은 약 4.3의 공급물 pH를 사용하여 실시된다. 도 6c에서 자명하듯이, 공급원료가 약 3.0보다 높은 pH를 갖는 경우에, 다른 염 및 불순물은 숙신산 추출과 밀접하게 겹치는 경향이 있고, 그러므로 염으로부터의 숙신산의 분리는 명확하게 분리되지 않는 경향이 있다.

도 7은 다양한 상이한 종류의 유기 산을 분리시키기 위한 본 발명의 방법의 상대적인 효과를 보여준다. 숙신산으로부터의 말산, 락트산 및 아세트산에 대한 분리능은 연속 크로마토그래피 시스템(예를 들어, 모의된 이동층(SMB))에서 얻어질 수 있다.

따라서, 본 출원인은, 본 발명의 방법에 의해서 SMB 크로마토그래피를 사용하여 비-관능화 수지 상에서 발효액으로부터 숙시네이트의 분리가 실행가능하며 상업적으로 효율적이게 되는 구현예를 구상한다. SMB는 전형적으로 컬럼 중에 함유된 다양한 유형의 정지 상(즉, 흡수제), 액체 흐름에 대하여 역류로 정지 상을 이동시키기 위해 다양한 이동 상 및 일부 종류의 장치를 이동시키는 펌프를 사용한다. 하기 부분에서 논의된 펄스 시험은 SMB 크로마토그래피에서 사용하기 위한 다양한 조건 및 수지를 평가하기 위한 토대를 제공한다. SMB 크로마토그래피는 연속 방식으로 숙신산의 스트림을 정제하도록 최적화될 수 있다.

제III 부분 - 경험적 실시예

본 발명의 구현예에 따라서, 숙시네이트의 공급원은 발효로부터 유래한다. 시작 단계로, 분리 및 정제 방법은 세포 덩어리, 세포 파편, 단백질 및 다른 불용성 물질을 제거하도록 발효액을 한외여과하여 숙시네이트 함유 원 여액을 생성시키는 것을 포함한다. 상기 여액은 약 3 이하의 고유한 pH 값을 가질 수 있거나, 이 여액은 3.0 미만의 pH로 산성화될 수 있다. 그 후, 크로마토그래피 컬럼을 통하여 원 여액을 처리하거나 흘려보낸다.

경험적 실시예에서의 모든 펄스 시험은 비-관능화 크로마토그래피 수지 상에서 실시하였다. 분리를 위한 특정 작동 온도 범위는 다른 제조업자로부터의 다른 비-관능성 수지를 사용하는 경우에 달라질 수 있거나 조정될 수 있다. SMB 시스템의 기능적인 실행가능성을 입증하기 위하여 펄스 시험을 사용한다. 당업자는, 다른 특정 비-관능성 수지의 분리 성능은 본 실시예의 결과 및 범위에서 보여지는 것보다 좋거나 나쁠 수 있고, 각각의 개별적인 경우가 나타낼 수 있듯이 조정되고 최적화되어야 함을 이해한다.

크로마토그래피 파라미터

비-관능성 소수성 수지(롬 앤드 하스 코. 제품인 앰버라이트^TM XAD-4)를 사용하여, 다수의 펄스 시험을 실시한다. 상기 시험은 숙신산과 다양한 불순물 사이에서의 우수한 분리를 입증한다. 실시예에서, 모든 펄스 시험은 100 ml 수지를 갖는 1.5 cm 외피형성된(jacketed) 유리 컬럼 중에서 실시하였다. 컬럼 내 크로마토그래피 수지는 하향류를 사용하여 슬러리로서 패킹된다. 상기 수지를 시험 전에 탈이온수로 철저하게 세척하였다. 공급물의 6 ml 펄스를 채우고, 3 ml/min의 유속에서 탈이온(DI)수로 용리시켰다. 배압이 관찰되지 않았다.

A. 작동 온도 범위

XAD-4에 대해서, 본 출원인은, 보다 높은 온도가 등용매 조건 아래 합리적인 용리 부피 내에서 더 양호한 분리 결과를 촉진시킴을 발견하였다. 분리가 고온에서 실시되는 경우에, 염, 질소 화합물, 다른 유기 산(예를 들어, 말산, 락트산 또는 아세트산)으로부터 숙신산이 단리될 수 있다. 첨부되는 도면에서의 펄스 시험이 입증하고 있듯이, 유리 숙신산은, 물 헹굼으로 용이하게 용리되는 다른 모든 염으로부터 명확하게 분리된다. 펄스 시험에서 관찰된 크로마토그래피 분리를 기초로, 양성자화된 숙신산은 소수성 수지에, 그런 다음 다른 유기 산을 포함하는 불순물에 더욱 강력하게 결합된다. 일반적으로, 평형 상수 또는 동적 결합이 낮을수록, 결합된 종이 수지로부터 더욱 신속하게 용리되는 경향이 있을 것이다. 아마도, 평형 상수가 높을수록 상기 종은 더욱 느리게 용리되고 더 많이 보유되는 경향이 있을 것이라는 점에서, 반대의 경우 또한 실현된다. XAD-4에 대한 시험이 숙신산의 효율적인 용리를 위해 고온이 필요함을 나타낸다 하더라도, 정확한 작동 온도는 사용된 특정 비-관능화 수지의 작동 파라미터 및/또는 관심 종에 따라서 달라질 수 있다.

실시예 1, 2, 3 및 4는, XAD-4 비-관능화 크로마토그래피 수지를 사용하여 발효액 공급원료로부터 숙신산을 분리시키는 효율에 대한 온도의 효과를 예시한다. 외피형성된 유리 컬럼(1.5 cm 직경)에 100 ml의 XAD-4를 넣었다. 상기 수지를 수조를 사용하여 지시된 온도로 가열한다. 수지를 약 500 ml의 물로 세척하였다. 공급물의 6 ml 펄스를 채우고, 3 ml/min의 유속에서 탈이온(DI)수로 용리시켰다. 배압이 관찰되지 않았다.

펄스 시험 결과가 나타내듯이, SMB 시스템에 적용하는 경우에, 덜 효율적으로 분리되는 것으로 보이는 50℃보다 낮은 작동 온도에서 실시된 분리는 더 많은 용리의 사용 및 그러므로 목적하는 생성물의 더 많은 희석을 필요로 할 것이다. 그러므로, 실시예 내 데이터가 지지하듯이, 여액 내 다른 염 및 유기 산으로부터 유리 숙신산을 효율적으로 분리시키는 능력은 XAD-4를 사용하여 약 50℃ 내지 약 90℃의 온도 범위에서 실시된다. 전형적으로, 작동 온도는 약 53℃ 또는 55℃ 내지 약 75℃ 또는 80℃, 및 바람직하게는 약 57℃ 또는 65℃ 내지 약 70℃ 또는 72℃이다.

실시예 1: pH 2 및 50℃에서 발효액으로부터 숙신산의 정제

도 2는 본 발명의 순열에 따라 50℃에서 실시된 펄스 시험의 결과를 도시한다. 숙신산과 다른 유기 산 및 염 사이에서의 명확한 크로마토그래피 분리능이 도시된다. 염 피크는 약 0.7 층 부피에서 피크를 가지면서 약 0.4 층 부피에서 분리된다. 다른 유기 산은 약 1.2 층 부피에서 피크를 보여준다. 숙신산은 약 0.9 또는 1.0 층 부피에서 분리되기 시작하고 약 1.5 또는 1.6 층 부피에서 피크에 도달한다. 숙신산의 거의 전부가 약 2.8 층 부피까지 분리되었다.

실시예 2: pH 2 및 60℃에서 발효액으로부터 숙신산의 정제

실시예 1과 유사하게, 본 발명에 따른 실시예 2에서의 분리는 수조를 사용하여 60℃로 가열된 컬럼에서의 외피 온도를 사용하여 실시하였다. 도 3에는 60℃에서 실시된 펄스 시험의 결과가 요약되어 있다. 이에 의해서 숙신산의 완전한 용리가 얻어졌다. 또한, 도면은, 숙신산이 발효액 중 일반적인 오염물인 질소 함유 물질 및 다른 유기 산으로부터 효과적으로 분리되었음을 도시한다.

예측될 것이듯이, 시스템 내 전기 전도성은 다른 염의 탈착을 밀접하게 추적한다. 도 7에서의 추가 상세사항은, 원 여액 중의 말산, 락트산 및 아세트산에 대한 숙신산의 뚜렷하고 명확한 분리능을 보여준다. 숙신산의 곡선은 약 1.5 층 부피에서 피크에 도달하는 반면, 다른 산 종 곡선의 피크는 약 0.75 내지 약 1.25 층 부피에서 서로 밀접하게 겹친다.

실시예 3: pH 2 및 75℃에서 발효액으로부터 숙신산의 정제

50℃ 및 60℃에서 실시된 이전 실시예에서와 같이, 75℃에서의 용리는 염 및 숙신산의 거의 완전한 크로마토그래피 분리를 보여준다. 또한, 다른 유기 산의 용리도 비교적 우수하였다.

실시예 4: pH 2 및 90℃에서 발효액으로부터 숙신산의 정제

크로마토그래피 분리를 약 90℃의 온도에서 실시하는 경우에, 상이한 종의 피크는 수렴되기 시작한다. 이 특성은 숙신산의 라피네이트 부분으로의 증가된 손실을 야기할 수 있는데, 이는 용리액 내 숙시네이트 양을 최대화시키기 위한 본 발명의 목적을 방해하기 시작한다. 이 결과는 90℃ 초과의 작동 온도가 유익하지 않을 수 있음과, 적어도 특정 종류의 사용된 비-관능화 수지에 대해서 작동 온도 상한이 존재할 수 있음을 시사한다.

실시예 5: pH 2 및 25℃에서 발효액으로부터 숙신산 이암모늄의 정제

유사한 펄스 시험을 주위 온도에서 실시하였지만, NH₄OH는 약 2.4 층 부피까지는 첨가되지 않았다. 이 시험에서, 숙신산이 약 1.5 층 부피에서 용리되기 시작하고 NH₄OH가 용리를 가속화시킴이 관찰되었다.

B. pH 값의 범위

앞 부분에서의 실시예와 유사하게, 도 6a 내지 6c는 크로마토그래피 분리에 대한 pH의 효과를 예시한다. 도 6a에서는 pH 2.5인 공급물이 사용되고; 도 6b에서는 pH 3.0인 공급물이 사용되고; 도 6c에서는 pH 4.3인 공급물이 사용된다. 공급원료에 대한 pH 값은 3 미만이어야 한다. 첨부되는 도면으로부터 확인할 수 있듯이, pH 2.5에서의 펄스 시험 결과는 우수한 분리 및 용리를 나타내지만, 일단 pH 값이 3 또는 그 초과로 상승되기만 하면, 숙신산 피크는 양봉(bimodal) 모드가 된다. 이는 라피네이트로의 생성물의 손실을 야기할 것이다. 분리시에 목적하는 숙신산에 대한 양봉 모드 피크의 출현을 최소화시키기 위해서는, pH 값에 대한 우수한 작동 범위가 약 2.5와 3 사이에서 시작되고, 약 1.3 또는 1.0 또는 그보다 더 아래로 낮아지는 경향이 있을 수 있어 보인다.

C. 이성분 용리

실시예 6: pH 2.0 및 40℃에서 발효액으로부터 숙신산 이나트륨의 정제

도 8은, 약 50 g/L 숙신산을 함유하는 6 ml의 발효액을 주위 온도에서 컬럼 상으로 로딩시킨 다음, 탈이온수를 사용하여 3 ml/min에서 용리시키는 초기 펄스 시험을 도시한다. 전도성 감소(염이 용리됨)를 관찰한 후에, 용리제를 5% NaOH로 전환시켰다. 얻어지는 분석은, 염이 숙신산 이나트륨으로부터 완전히 분리되었음을 나타냈다.

실시예 7: pH 2.0 및 25℃에서 발효액으로부터 숙신산 이나트륨의 정제

도 9는 실시예 6에서의 펄스 시험과 유사한 펄스 시험을 도시하지만, 25℃의 온도가 사용되었다. 다시 한번, 숙시네이트와 염 사이에서 완전한 분리가 있었다.

실시예 8: pH 2.0에서 발효액으로부터 숙신산 이암모늄의 정제

도 10a는 실시예 6에서의 펄스 시험과 유사하게 실시된 또 다른 펄스 시험을 도시한다; 그러나, NH₄OH가 제2 용리제로 사용되었다. 이에 의해서, 하류 처리에서 잠재적으로 사용되어 다른 질소 함유 생성물, 예컨대 상업적으로 바람직한 N-메틸 피롤리디논을 형성시킬 수 있는, 숙신산 이암모늄의 스트림이 얻어졌다.

D. 용리 조건

이성분 용리:

XAD-4를 사용한 이염기성 숙시네이트의 베이스 용리에 대하여, 작동 온도 범위는 약 20℃ 내지 약 40℃이다. 주위 온도에서 염 및 다른 산으로부터 숙시네이트를 직접적으로 분리해내는데 비-관능성 수지를 사용할 수 있었다. 한 실시예에서, 외피형성된 유리 컬럼(1.5 cm 직경)에 100 ml의 XAD-4 수지를 로딩한다. 상기 수지를 수조를 사용하여 적절한 온도(약 22 내지 25℃)로 가열한다. 상기 수지를 약 500 ml의 탈이온수로 세척하였다. 발효 유래한 공급물의 6 ml 펄스를 채우고, 3 ml/min의 유속에서 탈이온수를 사용하여 용리시킨다. 적절한 시간에서(예를 들어, 포괄적인 약 1.2 내지 2.0 또는 약 2.5 내지 3.0 층 부피 내에서), 5 내지 10 중량%의 베이스 용액을 용리제로 사용하여 숙시네이트 염을 생성시켰다. (비록 NaOH 및 NH₄OH 둘 모두를 사용하였다 하더라도, 임의의 강한 무기 염기, 예컨대 NH₃, LiOH 또는 KOH가 작용할 수 있다.) 배압이 관찰되지 않는다. 이염기성 숙시네이트의 베이스 용리를 위한 추가 실험을 용리를 위해 NaOH 또는 KOH를 사용하여 40℃에서 실시한다. 도 8 내지 10에 요약된 경험적 데이터로부터, 일단 온도가 40℃ 초과로 상승하기만 하면, 다른 유기 산으로부터 숙신산을 정제하는 능력이 XAD-4 상에서는 어려울 것이고; 그러므로, 등용매 정제가 우수한 방법이 될 것으로 보인다.

등용매 용리:

이상에서와 같이, 100 ml의 XAD-4 수지를 외피형성된 유리 컬럼(1.5 cm 직경) 내로 로딩한다. 상기 수지를 수조를 사용하여 약 60℃로 가열한다. 상기 수지를 약 500 ml의 탈이온수로 헹군다. 발효 유래한 공급물의 6 ml 펄스를 채우고, 3 ml/min의 유속에서 탈이온수로 용리시킨다. 온도는 용리 내내 일정하게 유지된다. 배압이 관찰되지 않는다.

관심 화합물의 불완전한 용리는, 흡수제 질량이 사용된 용매의 부피에 비해 지나치게 큰 경우에 일어날 것이다. 관심 화합물의 불완전한 체류는 흡수제 질량이 불충분한 경우에 일어날 것이고, 이에 의해 세척 용매 중에서 또는 부분적으로 용리되는 화합물이 얻어질 것이다. 그러한 경우는 회수율 저하를 야기할 수 있다.

크로마토그래피에서의 당업자에게는, 첨부되는 도면에 요약된 결과가, 본 발명의 방법이 모의된 이동층 크로마토그래피를 사용한 숙신산의 연속 분리에 적합함을 시사한다. 본 출원인은, 특정 수지의 성능을 최적화하기 위해서 아마도 고온인 작동 온도를 변형시키고 등용매 조건을 사용하는 것을 구상한다. 또한, 상기 결과를 모의된 이동층 크로마토그래피를 사용한 이염기성 숙시네이트의 연속 분리에 적용할 수 있다. 이 예에서, 이것은 물 및 염기성 용액 둘 모두를 사용한 4 내지 5 구역 시스템에서일 것이다. 이 방법은, 다른 화학물질에 대한 전구 물질로 사용될 수 있는 숙신산 이암모늄을 생성시키기 위한, 숙시네이트와 NH₄OH를 반응시키는 더욱 간단하고 깨끗한 방법을 제공할 수 있다. 또한, 숙신산은 도 12에서와 유사한 장치에서 용리제로 유기 용매, 예컨대 알콜을 사용함으로써 용매/물에서의 스트림으로서 단리될 수 있음이 구상된다. 이것은 하류 처리에서 직접적으로 사용될 수 있는 숙신산의 스트림을 생성시킬 것이다.

본 발명을 일반적으로 및 예를 들어 상세하게 설명하였다. 당업자는, 본 발명이 구체적으로 개시된 구현예에 반드시 제한되지 않지만, 하기 청구범위, 또는 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 현재 공지되어 있거나 개발될 다른 등가 성분을 포함하는 그의 등가물에 의해서 규정된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변형 및 변경이 실시될 수 있음을 이해한다. 따라서, 다른 변화가 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다면, 상기 변화는 본원에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (35)

1. 발효액(fermentation broth)을 여과하는 단계;
   약 3.0 이하의 pH 값을 갖는 숙시네이트 함유 여액이 수득되도록 pH를 조정하는 단계;
   상기 산성화된 여액을 비-관능화 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼을 통하여 약 20℃ 내지 약 100℃ 범위의 작동 온도에서 선택적으로 흘려보내서 적어도 두 개의 명확한(distinct) 분획을 얻는데, 상기 분획 중 적어도 하나는 숙신산 또는 숙시네이트 염을 함유하는 단계를 포함하는,
   발효액으로부터 숙신산의 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 작동 온도가 a) 유리 숙신산을 생성시키도록 50℃ 초과이거나, b) 숙신산의 염을 생성시키도록 50℃ 미만인, 정제 방법.
3. 제2항에 있어서, 유리 숙신산에 대한 상기 작동 온도가 약 50℃ 내지 약 90℃인, 정제 방법.
4. 제2항에 있어서, 유리 숙신산에 대한 상기 작동 온도가 약 55℃ 내지 약 85℃인, 정제 방법.
5. 제2항에 있어서, 숙신산의 염에 대한 상기 작동 온도가 약 20℃ 내지 약 50℃인, 정제 방법.
6. 제2항에 있어서, 숙신산의 염에 대한 상기 작동 온도가 약 22℃ 내지 약 45℃인, 정제 방법.
7. 제1항에 있어서, 유리 숙신산을 결정화시키는 단계를 추가로 포함하는, 정제 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 유리 숙신산이 단일 결정화 후에 90%이상의 순도를 나타내는, 정제 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙신산의 명확한 피크가 3층 부피 내에서 나타나는, 정제 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 숙신산의 명확한 피크가 약 1.0 층 부피와 약 2.75 층 부피 사이에서 나타나는, 정제 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 여액이 약 1.0 내지 약 3.0 범위의 pH를 갖는, 정제 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 여액이 약 1.5 내지 약 2.8 범위의 pH를 갖는, 정제 방법.
13. 제2항에 있어서, 유리 숙신산 생성 작업이 탈이온수의 등용매 용리인, 정제 방법.
14. 제2항에 있어서, 염 생성 작업이 탈이온수 및 수성 강 염기의 이성분 용리(binary elution)인, 정제 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 염 생성 작업이 탈이온수 및 유기 용매의 이성분 용리인, 정제 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 유기 용매가 메탄올, 에탄올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 정제 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 비-관능화 수지가 소수성 폴리스티렌-디-비닐벤젠(PS-DVB)인, 정제 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 크로마토그래피 컬럼이 연속 분리 장치의 일부인, 정제 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 연속 분리 장치가 모의된 이동층(SMB) 시스템인, 정제 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 수지가 발효액 중에서 확인된 다른 불순물보다 숙신산에 대해 더 큰 친화도를 나타내는, 정제 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 숙신산이 상기 여액 중에 존재하는 다른 유기 산, 염, 및 당으로부터 분리되는, 정제 방법.
22. 발효액을 여과하여 3.0 미만의 pH를 갖는 숙시네이트 함유 여액을 수득하는 단계;
    상기 여액을 70℃ 이하의 온도에서 액체 크로마토그래피 컬럼을 통하여 비-관능화 수지 위로 처리하고, 강 염기 또는 유기 용매를 사용하여 용리시켜서 숙신산 염을 형성시키는 단계를 포함하는,
    숙시네이트 염의 제조 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 강 염기가 무기 염기인, 제조 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 무기 염기가 NH₃이고, 상기 숙신산 염이 숙신산 이암모늄인, 제조 방법.
25. 제22항에 있어서, 상기 온도가 약 20℃ 내지 약 45℃인, 제조 방법.
26. 제22항에 있어서, 유리 숙신산 또는 숙시네이트 염의 명확한 피크가 3층 부피 내에서 나타나는, 제조 방법.
27. 제22항에 있어서, 상기 수지가 발효액 중에서 확인된 다른 불순물보다 숙신산에 대해 더 큰 친화도를 나타내는, 제조 방법.
28. 제22항에 있어서, 상기 크로마토그래피 컬럼이 연속 크로마토그래피 장치의 일부인, 제조 방법.
29. 발효액을 여과시켜 청정화 액(clarified broth)을 수득하는 단계;
    상기 청정화 액을 3.0 미만의 pH 값으로 제공하거나 산성화시키는 단계;
    상기 청정화 여액을, 유리 숙신산을 분리시키는데 사용된 특정 수지에 대하여 사전결정된 작동 온도에서 비-관능화 수지를 갖는 연속 크로마토그래피 장치 내로 도입시키는 단계;
    상기 숙신산을 결정화시키는 단계를 포함하는,
    발효액으로부터 숙신산의 정제 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 숙신산이 상기 청정화 액 중의 다른 유기 산, 당 및 염으로부터 분리되는, 정제 방법.
31. 제29항에 있어서, 상기 결정화에 의해 단일 결정화 후 적어도 90%의 순도를 갖는 숙신산이 생성되는, 정제 방법.
32. 제29항에 있어서, 유리 숙신산의 상기 분리가 3 층 부피 내에서 적어도 두 개의 명확한 크로마토그래피 피크를 나타내는, 정제 방법.
33. 제29항에 있어서, 유리 숙신산의 상기 분리가 약 1.0 층 부피와 2.75 층 부피 사이에서 숙신산 피크를 나타내는, 정제 방법.
34. 제29항에 있어서, 상기 분리가 등용매 용리인, 정제 방법.
35. 제29항에 있어서, 상기 작동 온도가 약 20℃ 내지 100℃인, 정제 방법

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