CN107245032B - 一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法。该方法包括八个步骤：(1)加入Al2O3絮凝法去除沉淀杂质；(2)加入乙醇去除沉淀杂质；(3)加入石油醚萃取除去上清杂质；(4)使用大孔树脂柱吸附粗制，解吸附；(5)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(6)乙醚萃取，加水浓缩去乙醚，冷冻干燥；(7)使用使用Agilent Zorbax SB‑C18(9.4×250mm×5μm)色谱柱；(8)使用Agela Venusil ASB‑C18(4.6×150mm×5μm)色谱柱。两次高效液相半制备，获得较高纯度琥珀酸，纯度在95％以上。
Description
技术领域
本发明属于分析化学、有机化学、生物化学领域。具体涉及的是从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法。
背景技术
琥珀酸，琥珀酸学名为丁二酸。分子量为118.09，无色结晶体，味酸，可燃。有二种晶形，相对密度1.572(25/4℃)。溶解特性：1g溶于13ml冷水、1ml沸水、18.5ml乙醇、6.3ml甲醇、36ml丙酮、20ml甘油和11ml乙醚，几乎不溶于苯、二硫化碳、四氯化碳和石油醚。分子结构如下所示：
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)发酵液的上清对草生欧文氏杆菌有明显的抑菌作用，经过分离纯化、核磁和质谱分析确定该抑菌物质为琥珀酸。发酵液的上清对草生欧文氏杆菌抑菌特性表明，与某些Bt菌株发酵所生物合成的Zwittermicin A(简写ZwA)特性相似。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)晶体蛋白对害虫具有毒杀性、同时对人类健康不构成危害，这一点已经被世界认可。一方面，Bt菌剂在外源上防治虫害；另一方面，该杀虫蛋白基因已经被广泛地用于转基因植物，从内源上控制虫害。无论哪种形式，由于害虫不断地进化，导致某些害虫对某特定基因型的杀虫蛋白逐渐表现出抗性，杀虫效果逐渐失去意义。解决该问题最好的方法是找到某种物质，提高杀虫蛋白的毒力活性。Bt中的Zwittermicin A(简写ZwA)拥有这个特性。张小朋等(2006)以相同的草生欧文氏杆菌为指示菌，利用来自于蜡状芽胞杆菌(B.cereus Bc)编号UW85的菌株发酵，获得了ZwA，并建立了对ZwA的检测方法和标准曲线。在其随后的研究中发现，ZwA协同晶体蛋白提高了对棉铃虫害虫和甜菜夜蛾害虫的药效。
参考文献：张小朋.2006.对甜菜夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌Dl-23菌株的选育及其发酵优化[D].武汉:华中农业大学博士学位毕业论文.
发明内容
本发明的目的是提供一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法。
为了实现上述的目的，本发明的发明人进行了辛勤的研究，将琥珀酸从Bt发酵液中分离纯化出来，整套方法由八个串联步骤组成。这八个步骤有先后次序，且缺一不可。包括(1)Al2O3去絮凝沉淀物；(2)无水乙醇去醇不溶性沉淀物；(3)石油醚去除醚溶性上清物；(4)非极性大孔树脂对琥珀酸吸附；(5)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(6)乙醚萃取，加水浓缩去乙醚，冷冻干燥；(7)使用Agilent Zorbax SB-C18(9.4×250mm×5μm)高效液相色谱柱半制备；(8)使用Agela Venusil ASB-C18(4.6×150mm×5μm)高效液相色谱柱半制备，琥珀酸纯度在95％以上。
具体步骤为：
(一)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质
(1)去除絮凝沉淀物；取10L初始发酵液，按照1％的浓度加入Al2O3，充分搅拌后置于4℃冰箱静止12小时，取出后8000r/min离心10min，收集上清。用1mol/L的HCl调至pH4.0，50℃真空浓缩，真空度-0.095至-0.088Mpa范围，浓缩至200mL备用；
(2)去除醇不溶性沉淀物；取步骤(1)所制得的备用液体200ml，加入200mL无水乙醇，静置1小时后再次离心，8000r/min离心10min，取上清备用；
(3)去除醚溶性上清物；取步骤(2)所制得的备用液体，用等体积的石油醚萃取，反复3次，收集下层相，即得抗生素粗提液，保存于4℃冰箱备用；
(二)样品的粗制
(4)取非极性大孔树脂，按树脂重量与步骤(3)所制得的备用粗提液体积1:2的比例混合上样，湿法装柱，装入量的高度40cm，室温静态吸附2-3小时，先用去离子水洗脱4-6BV，1BV为1倍柱体积，洗脱液为未吸附相，洗脱流速约0.5mL/min，收集洗脱液，减压浓缩后用去离子水定容至原体积；
(三)样品的精制
(5)取步骤(4)所制得的液体200ml，使用冷冻干燥机，将样品冻干，加入400ml无水乙醇萃取，取上清液使用0.45μm有机系滤膜过滤后，加水并减压蒸馏除去乙醇，体积浓缩至50ml，再次使用冻干机冻干样品；
(6)使用步骤(5)同样的方法，加入乙醚萃取，上清液过滤后减压蒸馏，并加水除去乙醚，得到精制品；
(四)高效液相半制备琥珀酸
(7)第一次半制备；取步骤(6)所制得的液体，使用Agilent Zorbax SB-C18(9.4×250mm×5μm)色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长为210nm，流速为2ml/min；洗脱方法为：
0-10min：甲醇:超纯水＝5:95；
10-15min：甲醇:超纯水＝5:95梯度变为甲醇:超纯水＝80:20；
15-25min：甲醇:超纯水＝80:20；
25-30min：甲醇:超纯水＝80:20梯度变为甲醇:超纯水＝5:95；
30-35min：甲醇:超纯水＝5:95；
多次收集6.5-7.5min组分，减压蒸馏除去甲醇，样品冷藏备用；
(8)第二次半制备；取步骤(7)所制得的备用液体，使用Agela Venusil ASB-C18(4.6×150mm×5μm)色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长为210nm，流速为1ml/min，洗脱方法为:
0-10min：甲醇:超纯水＝0.2:99.8；
多次收集4-5min时间段组分，减压蒸馏除去甲醇，即得到了高纯度琥珀酸；
依据上述方法，能够将琥珀酸从Bt发酵液中分离纯化出来，且纯度高。
附图说明
图1为本发明的样品质谱图。
图2为本发明的红外图谱。
图3为本发明的核磁共振碳谱。
图4为本发明的核磁共振氢谱。
具体实施方式
实施例：
本发明实施例为首次从芽胞Bt中分离纯化琥珀酸。
所述方法包括以下步骤：
(1)大孔树脂柱的制备。
制备方法为湿法装柱。一定量的非极性大孔树脂，分别先后用弱酸及弱碱浸泡、清洗，最后用去离子水反复清洗至中性。树脂经过离心脱水，之后在80℃恒温干燥48小时，取出称重备用。取长60cm、直径5cm的玻璃层析柱备用。
(2)制备发酵液
2.1初始发酵培养基：葡萄糖20.0g；蛋白胨20.0g；CaCl2 0.08g；K2HPO4 1.3g；MgSO4 0.2g；MnSO4 0.08g；pH 7.0-7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用。
2.2扩大生产发酵培养基：牛肉膏5.0g，大豆分离蛋白4.0g；葡萄糖3.0g；氯化钠2.0g；MgSO4·7H2O 0.3g；K2HPO4 0.3g；MnSO4 0.05g；pH7.5，定容至1L，121℃灭菌30min备用。
2.3种子培养基：酵母膏5.0g；蛋白胨10.0g；氯化钠10.0g；pH 7.0-7.2；定容至1L，121℃灭菌30min备用。
2.4苏云金芽胞杆菌：编号Bt菌株。
2.5菌株在种子培养中的扩增：将保存在-20℃冰箱的菌种Bt取出，放到室温复苏，至完全解冻，将其接种到含有种子培养基的斜面上，30℃过夜培养，取出后保存于4℃冰箱备用。
2.6菌株在种子培养中的活化：从保存好的Bt斜面培养基上取0.5㎝×1.0㎝大小的培养物接种于300mL摇瓶内，含有种子培养基100mL，30℃、220r/min摇床培养16-18小时。
2.7初始发酵：将活化好的菌液以2％的接种量接种初始发酵培养基中，培养基不超过容器体积的2/3，30℃摇瓶培养32-36小时，4℃冰箱保存备用。
(3)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质
3.1去除絮凝沉淀物：取10L初始发酵液，按照1％的浓度加入Al2O3，充分搅拌后置于4℃冰箱静止12小时。取出后，8000r/min离心10min、收集上清。用1mol/L的HCl调至pH4.0。50℃真空浓缩，真空度-0.095至-0.088Mpa范围，浓缩至200mL备用。
3.2去除醇不溶性沉淀物：取3.1所制得的备用液体200ml，加入200mL无水乙醇，静置1小时后再次离心，8000r/min离心10min，取上清备用。
3.3去除醚溶性上清物：取3.2所制得的备用液体，用等体积的石油醚萃取，反复3次。收集下层相，即得粗提液，保存于4℃冰箱备用。
(4)样品的粗制
取非极性大孔树脂，按树脂重量与3.3所制得的备用粗提液体积1:2的比例混合上样，湿法装柱，装入量的高度40cm。室温静态吸附2-3小时，先用去离子水洗脱4-6BV。1BV为1倍柱体积。洗脱液为未吸附相，洗脱流速0.5mL/min，收集洗脱液，减压浓缩后用去离子水定容至原体积。
(5)样品的精制
取200ml上述液体，使用冷冻干燥机，将样品冻干，加入400ml无水乙醇萃取，取上清液使用0.45μm有机系滤膜过滤后，加水并减压蒸馏除去乙醇，体积浓缩至50ml。再次使用冻干机冻干样品，使用同样的方法，加入乙醚萃取，上清液过滤后减压蒸馏，并加水除去乙醚，得到精制品。
(6)高效液相半制备琥珀酸
6.1第一次半制备：取步骤(5)所制得的液体，使用Agilent 1260Infinity，Agilent ZorbaxSB-C18(9.4×250mm×5μm)色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长210nm，流速2ml/min。洗脱方法为:
0-10min:甲醇:超纯水＝5:95；
10-15min:甲醇:超纯水＝5:95梯度变为甲醇:超纯水＝80:20；
15-25min:甲醇:超纯水＝80:20；
25-30min:甲醇:超纯水＝80:20梯度变为甲醇:超纯水＝5:95；
30-35min:甲醇:超纯水＝5:95；
多次收集6.5-7.5min组分，减压蒸馏除去甲醇，样品冷藏备用。
6.2第二次半制备：取6.1所制得的备用液体，使用Agilent 1260Infinity，AgelaVenusilASB-C18(4.6×150mm×5μm)色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长210nm，流速1ml/min。洗脱方法为：
0-10min：甲醇:超纯水＝0.2:99.8；
多次收集4-5min时间段组分，减压蒸馏除去甲醇，即得到了高纯度样品。
质谱、红外线、核磁共振分析如下：
(7)质谱检测
使用Thermo公司的Q-Exactive超高分辨质谱，样品质谱分析，将样品溶于超纯水中，质量体积浓度为万分之一。
使用C18色谱柱，流动相50％水+50％乙腈，进样后得到的谱图数据。质谱为阴离子模式。如图1。从图1可见，该物质的相对分子量为118。
(8)红外检测
使用Nicolet iz10傅里叶变换显微红外成像光谱仪，进行红外分析。方法为压片法，如图2。从图2可见，在吸收频率1470cm-1处和1680-1700cm-1处均有明显峰，该样品具有烷基或烯基或炔基和羧基。
(9)核磁检测
使用Bruker 500M，分别进行氢谱和碳谱分析，溶剂为氘代二甲基亚砜。碳谱(图3)和氢谱(图4)。从图3碳谱可见，该物质含有甲基或烯基或炔基和羰基；图4氢谱可见，为-CH2-和-OH。质谱和红外及核磁分析表明，确定样品中C归属为CH2和C＝O，存在对称结构，结构式为HOOC-CH2-CH2-COOH，该物质为琥珀酸，学名丁二酸。
Claims (1)
1.一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法，其特征在于整套方法由八个串联步骤组成，这八个步骤有先后次序，且缺一不可；包括(1)Al2O3去絮凝沉淀物；(2)无水乙醇去醇不溶性沉淀物；(3)石油醚去除醚溶性上清物；(4)非极性大孔树脂对琥珀酸吸附；(5)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(6)乙醚萃取，加水浓缩去乙醚，冷冻干燥；(7)使用Agilent Zorbax SB-C18型号的9.4×250mm×5μm色谱柱半制备；(8)使用Agela VenusilASB-C18型号的4.6×150mm×5μm色谱柱半制备，琥珀酸纯度在95％以上；
具体步骤为：
(一)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质
(1)去除絮凝沉淀物；取10L初始发酵液，按照1％的浓度加入Al2O3，充分搅拌后置于4℃冰箱静止12小时，取出后8000r/min离心10min，收集上清，用1mol/L的HCl调至pH4.0，50℃真空浓缩，真空度-0.095至-0.088Mpa范围，浓缩至200mL备用；
(2)去除醇不溶性沉淀物；取步骤(1)所制得的备用液体200ml，加入200mL无水乙醇，静置1小时后再次离心，8000r/min离心10min，取上清备用；
(3)去除醚溶性上清物；取步骤(2)所制得的备用液体，用等体积的石油醚萃取，反复3次，收集下层相，即得抗生素粗提液，保存于4℃冰箱备用；
(二)样品的粗制
(4)取非极性大孔树脂，按树脂重量与步骤(3)所制得的备用粗提液体积1:2的比例混合上样，湿法装柱，装入量的高度40cm，室温静态吸附2-3小时，先用去离子水洗脱4-6BV，1BV为1倍柱体积，洗脱液为未吸附相，洗脱流速约0.5mL/min，收集洗脱液，减压浓缩后用去离子水定容至原体积；
(三)样品的精制
(5)取步骤(4)所制得的液体200ml，使用冷冻干燥机，将样品冻干，加入400ml无水乙醇萃取，取上清液使用0.45μm有机系滤膜过滤后，加水并减压蒸馏除去乙醇，体积浓缩至50ml，再次使用冻干机冻干样品；
(6)使用步骤(5)同样的方法，加入乙醚萃取，上清液过滤后减压蒸馏，并加水除去乙醚，得到精制品；
(四)高效液相半制备琥珀酸
(7)第一次半制备；取步骤(6)所制得的液体，使用Agilent Zorbax SB-C18型号的9.4×250mm×5μm色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长为210nm，流速为2ml/min；洗脱方法为：
0-10min：甲醇:超纯水＝5:95；
10-15min：甲醇:超纯水＝5:95梯度变为甲醇:超纯水＝80:20；
15-25min：甲醇:超纯水＝80:20；
25-30min：甲醇:超纯水＝80:20梯度变为甲醇:超纯水＝5:95；
30-35min：甲醇:超纯水＝5:95；
多次收集6.5-7.5min组分，减压蒸馏除去甲醇，样品冷藏备用；
(8)第二次半制备；取步骤(7)所制得的备用液体，使用Agela VenusilASB-C18型号的4.6×150mm×5μm色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长为210nm，流速为1ml/min，洗脱方法为:
0-10min：甲醇:超纯水＝0.2:99.8；
多次收集4-5min时间段组分，减压蒸馏除去甲醇，即得到了高纯度琥珀酸；
依据上述方法，能够将琥珀酸从Bt发酵液中分离纯化出来，且纯度高。
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