KR20150010696A - RAL GTPases를 타겟으로 하는 항암용 화합물 및 이의 사용방법 - Google Patents

RAL GTPases를 타겟으로 하는 항암용 화합물 및 이의 사용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물의 Ral GTPase를 억제함에 따라 포유동물의 암의 성장 또는 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 Ral GTPases의 소분자 억제제(small molecule inhibitors) 및 본 발명의 치료적으로 유효한 화합물을 함유하는 약학적 조성물, 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

RAL GTPases를 타겟으로 하는 항암용 화합물 및 이의 사용방법{Anti-cancer compounds targeting Ral GTPases and methods of using the same}
본 발명은 치료학적 화합물, 이를 함유하는 약학적 조성물 및 본 발명에서 이들의 사용 또는 암의 치료와 관련이 있다.
Ras는 다른 어느 암 유전자(oncogene)보다 더욱 빈번하게 암에서 변이된다. 따라서, Ras는 합리적으로 디자인된 항암제의 개발을 위하여 주목되었지만, 아직까지 성공적인 개발이 이루어지지 않았다. 1989년에, 몇몇 그룹들은 Ras 막 연합 및 변화에 필수적인 파르네실 지질(farnesyl lipids)에 의한 Ras 단백질의 번역 후 변형(posttranslational modification)을 밝혀냈다. 파르네실전달효소 (FTase)는 이후 정제되었고 및 특징지어졌으며 및 얼마 지나지 않아, 제라닐제라닐 지질(geranylgeranyl lipid)과 함께 Ras를 변화시키는 제2의 프레닐전달효소(second prenyltransferase)인, 제라닐제라닐전이효소(geranylgeranyltransferase) 타입 I (GGTase-I)이 발견되었다. GGTase-I 억제제 (GGTIs)들이 연구되어 졌으며 및 GGTI-2417과 같은 적어도 하나의 억제제는 MiaPaCa2 췌장 세포 라인의 체외 성장(in vitro growth) 및 생존을 억제하는 것으로 나타났다. 하지만, 이러한 억제 효과들은 미미한 것으로 어떠한 GGTIs의 임상 실험도 수행되지 않았다.
RalA 및 RalB는 약 85% 아미노산 일체성(아미노 acid identity)을 갖고, 엔도시토시스(endocytosis), 엑소시토시스(exocytosis), 세포골격의 역학 액틴(actin cytoskeletal dynamics), 및 전사(transcription)의 규제 역할을 하는 Ras 모노머의 G 단백질의 패밀리(family) 내 파라로그(paralogs)이다. Ras와 같이, Ral 단백질은 또한 종양 형성(tumorigenesis) 및 전이(metastasis)에 연루되어 져 있다. Ral GTPases는 아마 라스 의존 방법(Ras-dependent manner)에서, RalGDS를 포함하는 몇몇 구아니딘 뉴클레오티드 교환 인자를 경유하여 활성화된다. Ral 경로(pathway)의 활성은 인간 세포의 변형을 위한 필요요건인 것으로 나타났으며(Rangarajan A, Hong SJ, Gifford A,Weinberg RA. Species- 및 cell type-specific requirements for cellular transformation. Cancer Cell 2004;6:171-83; Hamad NM, Elconin JH, Karnoub AE, et al. Distinct requirements for Ras oncogenesis in human versus mouse cells. Genes Dev 2002;16:2045-57), 및 Ras-매개 변화(Ras-mediated transformation)가 RalA의 활성에 의존한다는 것으로 나타났다(Lim KH, Baines AT, Fiordalisi JJ, et al. Activation of RalA is critical for Ras-induced tumorigenesis of human cells. Cancer Cell 2005;7:533-45). RalA 및 RalB는 또한 방광(bladder) 및 다른 암들 내 전이-연관 유전자(metastasis-associated gene)인, CD24의 전사조절 역할을 수행한다(Smith SC, Oxford G,Wu Z, et al. The metastasis associated gene CD24 is regulated by Ral GTPase 및 is a mediator of cell proliferation 및 survival in human cancer. Cancer Res 2006;66:1917-22).
따라서, Ral GTPases는 고형 종양 및 암 전이 예방 및 치료를 위한 유망한 치료 타겟으로 나타났으며, 및 암의 치료 및 예방을 위한 Ral GTPases 억제의 효과적인 방법이 필요한 실정이다.
본 발명은 Ral GTPases를 억제할 수 있는 분자뿐만 아니라 포유동물에서 암의 성장 및 전이를 예방 또는 늦추기 위한 이러한 분자들의 치료상의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 RalA 단백질 결정구조 내 뉴클레오티드 결합 위치로부터 멀리 위치하고 있고 및 GDP (비활성)에 존재하지만 GTP (활성)에는 없는 단백질 형태인 포켓(pocket)을 확인하기 위하여 신규한 연산 알고리즘을 사용하였다. RalA에 근거한 RalB의 나삿니가 있는(threaded) 3D 모델 (RalB는 결정화 되지 않는다)은 이러한 포켓이 RalA 및 RalB 파라로그(paralogs) 둘 다에 공통적인 것을 나타내기 위하여 사용되었으며, 작은 분자가 이러한 알로스테릭한 위치에 결합하면 그들은 비활성 형태에서 RalA 또는 RalB를 붙잡는다. 500,000 화합물의 컴퓨터를 사용한 스크리닝은 이 포켓에 들어가는 88개의 고 엄격성 후보물질(high stringency candidates)을 발견하였다.
RalB 단백질로 가득 찬 GDP와 함께 92,167 멤버의 결합 라이브러리(combinatorial library)에 기반을 둔 인코딩된 비드(encoded bead)를 사용한 비편향 스크린(unbiased screen)은 비활성 RalB에 결합하는 11개의 화합물을 발견하였다. 이러한 화합물들의 추정상의 도킹 위치(putative docking sites)의 계산적 결정(Computational determination)은 Ral 파라로그(paralogs) 둘 다에 존재하는 단일 위치를 산출하였고, RalA 구조를 사용한 계산적 스크리닝(Computational screening)에 의하여 발견된 포켓(pocket)에 동일하다.
따라서, 이러한 상호 보완적인 접근을 사용한 본 발명자들은 파라로그(paralogs) 둘 다에 존재하지만, 이러한 단백질 내 뉴클레오티드 결합 포켓과는 별개의 것인 비슷한 타겟 위치를 발견하였다. 이러한 분석은 Ral 단백질이 Ral 관련 단백질인 exo84, sec5 및 RalBP1과 결합하는 것을 방해하는 Ral GTPase 억제제를 밝혀냈다. 밝혀진 Ral GTPase 억제제는 GTP 결합에 사용되는 RalA와 관련된 형태 변화를 막는데 사용될 수 있으며, 따라서 이는 반응기 참여(effector engagement) 및 후속의 신호(downstream signaling)를 예방한다. 이러한 억제제는 효소의 활성 위치에 존재하는 뉴클레오티드 결합 구멍으로부터 멀리 위치해 있는 Ral 단백질 포켓에 결합한다. 추가적으로, Ral 단백질의 다른 결합 위치를 통해 Ral과 결합하는, filamin A, PLD1 및 ZONAB를 포함하는, 다른 Ral 결합 단백질은 아마도 본 발명에서 밝혀진 억제제 화합물들의 존재 하에서 Ral과의 결합이 예방될 것이다.
화합물들은 체외(in vitro)에서 인간 암 세포, 특히, 방광, 췌장, 전립선, 대장, 피부 및 폐에서의 암의 성장을 억제하는 본 발명의 치료방법에 이르는 화합물들의 효능(efficacy)이 평가되었다.
따라서, 본 발명은 Ral GTPases를 억제할 수 있는 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 화합물들을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 화합물들 및 약학적 조성물을 암의 예방 또는 치료에 사용하는 방법을 제공한다.
일실시예는 Ral GTPase 억제 활성을 갖고 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pct00001
상기 화학식 1에서,
n = 0 - 5이고;
X, Y, Y', Z 및 Z'는 독립적으로 C, N, 또는 N-옥사이드이고;
R1 - R9는 독립적으로 (X, Y 또는 Z가 C일 경우를 포함하여) 수소, 할로겐, -OH, -O-R10, C1-C24 알킬, C3-C24 알케닐, C4-C24 디에닐, C6-C24 트리에닐, C8-C24 테트라에닐, C6-C18 아릴, 치환된 C6-C18 아릴, C1-C14 알콕시, 카복시, 시아노, C1-C14 알카노일옥시, C1-C14 알킬싸이오, C1-C14 알킬설포닐, C2-C14 알콕시카보닐, C2-C14 알카노일아미노, S-R10, -SO2-R10, -NHSO2R10 및 -NHCO2R10으로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
R10은 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C1-C6 알콕시, 할로겐, 및 C4-C20 하이드록시헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환기가 선택적으로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
상기 헤테로원자는 황, 질소, 및 산소로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 및
*은 카이랄 중심이다.
다른 일실시예는 Ral GTPase 억제 활성을 갖고 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 2] [화학식 3]
Figure pct00002
상기 화학식 2 또는 화학식 3에서,
n = 0 - 5이고;
A, B, M, 및 D는 독립적으로 C, N, 또는 N-옥사이드이고;
R1, R2, R8, R9, R11, R12, R13은 독립적으로 (B, M 또는 D가 C일 경우를 포함하여) 수소, 할로겐, -OH, -O-R14, C1-C24 알킬, C3-C24 알케닐, C4-C24 디에닐, C6-C24 트리에닐, C8-C24 테트라에닐, C6-C18 아릴, 치환된 C6-C18 아릴, C1-C14 알콕시, 카복시, 시아노, C1-C14 알카노일옥시, C1-C14 알킬싸이오, C1-C14 알킬설포닐, C2-C14 알콕시카보닐, C2-C14 알카노일아미노, S-R14, -SO2-R12, -NHSO2R14 및 -NHCO2R14로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
R14는 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C1-C6 알콕시, 할로겐, 및 C4-C20 하이드록시헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환기가 선택적으로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
상기 헤테로원자는 황, 질소, 및 산소로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
*는 카이랄 중심이다.
다른 일실시예는 Ral GTPase 억제 활성을 갖고 하기 화합물 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 화합물:
Figure pct00003
및
이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염을 제공한다.
본 발명의 일실시예는 Ral GTPase 효소 활성을 억제하는 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 사용한 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여함에 따라 암을 치료하는 방법이다. 이 실시예의 한 측면에서, 화합물은 적어도 하나의 Ral GTPase의 파라로그(paralog)를 억제하며 (RalA 또는 RalB), 따라서 암의 성장 또는 전이를 억제한다. 이 실시예의 바람직한 측면에서, 화합물은 RalA 및 RalB 파라로그(paralogs) 둘 다를 억제한다. 이 실시예의 다른 측면에서, 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 화합물이다:
Figure pct00004
RBC8(6-아미노-4-(2,5-디메톡시페닐)-3-(나프탈렌-2-일)-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴);
Figure pct00005
RBC10(11-(2-클로로페닐)-10-펜타노일-2,3,4,5,10,11-헥사하이드로-1H-디벤조[b,e][1,4]디아제핀-1-온);
Figure pct00006
RBC6(6-아미노-4-(3,5-디클로로-2-하이드록시페닐)-3-프로필-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴);
Figure pct00007
RBC84(2-(6-(4-에틸페닐)-2-p-톨릴-2,3,4,5-테트라하이드로피리미딘-4-일)페놀); 및
Figure pct00008
RBC83(2-(2-(2-메톡시페닐)-6-(4-메톡시페닐)-2,3,4,5-테트라하이드로피리미딘-4-일)페놀), 및
이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염을 제공한다.
포유동물에서 암을 치료 또는 예방하는 이러한 방법은 특정 실시예에서, 화합물은 본 발명의 약학적 조성물로써 포유동물에게 투여된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 캐리어(carrier)와 함께 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 함유하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 다른 실시예는 암의 전이 또는 암을 갖는 것으로 추정되거나 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 본 발명에 따른 적어도 하나의 화합물을 치료학적으로 유효한 양을 투여함으로써 암 전이, 특히 췌장, 전립선, 폐, 방광, 피부 및/또는 대장암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법이다.
본 발명의 다른 실시예는 본 발명에 따른 적어도 하나의 화합물을 하나 또는 그 이상의 다른 알려진 항암 또는 항염증 치료와 함께 치료학적으로 유효한 조합으로 투여함으로써 암을 치료하는 방법이다. 예를 들면, 다른 항암 치료는 아마도 GGTase-I (geranylgeranyltransferase type I) 억제제, 수술(surgery), 화학요법(chemotherapy), 방사선(radiation), 면역요법(immunotherapy), 또는 이들의 조합을 포함하는, 프레닐전달효소 억제제를 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 어느 약학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양을, 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 암의 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물, 예를 들면, 본 발명의 화합물을 적어도 하나 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 화합물을 치료학적으로 유효한 양만큼 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 암의 전이를 예방하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 약학적 조성물로써 본 발명에 따른 적어도 하나의 화합물을 치료학적으로 유효한 양으로 포함하는 약학적 패키지를 제공한다. 약학적 조성물은 다른 화합물들 또는 포유동물 암의 예방, 치료 또는 개선의 치료법과 함께 별도로, 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 이러한 패키지는 또한 처방 정보 및/또는 용기를 포함할 수 있다. 만약 존재한다면, 처방 정보는 투여, 및/또는 이러한 약학적 조성물을 단독 또는 포유동물 암의 예방, 치료 또는 개선에 사용되는 다른 치료법들과 함께 조합하여 사용하는 방법을 설명할 것이다.
본 발명의 다른 실시예는 추정상의 억제제의 투여로 포유동물의 종양 크기 또는 암세포 개수의 감소 또는 성장 억제로 나타내는 포유동물의 반응을 테스트함으로써 Ral GTPase 활성의 추정상의 억제제를 사용하여 치료하기 위한 폐암을 갖는 포유동물의 민감성(susceptibility)을 테스트하는 방법이다.
본 발명의 다른 측면은 후술할 실시예와 동반하여 나타날 것이고, 본 발명에 따른 수행으로 인하여 학습 되거나 또는 설명되어 분명해질 것이다. 그러나, 실시예에 대한 설명은 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 당업자에게 명백하여야 하며, 이후 예시로서 주어진 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야한다.
도 1은 인간 폐암세포 라인의 성장에서, 본 발명에 따른 두 화합물, RBC8 및 RBC10의 복용-억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 추정상의(putative) Ral GTPase 억제제의 병소 감염 진단 테스트 스크린(Elisa screen)의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 8개의 Ral GTPase 억제제의 Ral 활성 풀-다운 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 Ral GTPase 억제 화합물의 50μM 존재 하에 RalBP1-RalA 결합 억제의 ALPHA 스크린 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 마이크로 몰의 복용 범위 이상에서, 본 발명에 따른 8개의 Ral GTPase 억제 화합물의 RalBP1-RalA 결합 억제의 ALPHA 스크린 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물의 1μM 농도에서의 체외(in vitro) 암세포 성장 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7A은 KRAS 야생형(wildtype) 암세포 라인에서 농도 범위 이상의 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물의 체외(in vitro) 성장 억제 효과를 나타내는 그래프이다. 도 7B는 KRAS 돌연변이 암세포 라인에서 농도 범위 이상의 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물의 체외(in vitro) 성장 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 H2122 세포에서 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물의 체외(in vitro) 세포내 흡입(cellular uptake)을 나타내는 그래프이다.
도 9는 IP 투여 후 H2122 이종 이식(xenografts)에서 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물의 조직 농도를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물의 일일 투여 후, H2122 쥐 이종 이식 종양(xenograft tumor) 부피를 나타내는 그래프이다.
도 11은 RalA- 및 RalB-감손 siRNA와 함께 세포의 치료를 수행한 후, H2122 쥐 이종 이식 종양(xenograft tumor) 부피를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 화합물에 의한 H2122 쥐 이종 이식(xenografts)에서 체내(in vivo) RalA 및 RalB GTPase 활성 억제를 나타내는 그래프이다.
종양 발생 및 전이에서 그들의 강력한 임상적 의의에 근거하여, 본 발명자들은 Ral GTPases를 분자 타겟으로 확인하고 사용하였다. 모든 GTPases와 함께, Ral의 활성은 비활성 (GDP-결합) 및 활성 (GTP-결합) 형태 사이 순환에 의존한다. 활성 Ral 단백질은 Ral 결합 단백질 1 (RalBP1, RLIP76 or RIP1(37)), Sec5/Exo85, 필라민(filamin), 및 포스폴리파아제 D1을 포함하는 그들만의 반응기 세트를 통해 후속 프로세스를 중재한다. 따라서, Ral-GDP에 결합하지만 Ral-GTP에 결합하지 않는 화합물은 입체적으로 반응기의 결합을 방해하거나 및/또는 GTP 결합 상태와 관련되는 형태 변화를 억제하여, 신호 전달을 차단하게 이끌어 Ral-의존 암세포의 성장을 감소시키거나 세포소멸(apoptosis)로 이르게끔 사용될 것이다. 이러한 화합물들은 조합 화학 라이브러리(combinatorial chemical libraries)의 가상 및 물리적인 스크리닝의 병행 사용으로 인하여 확인되었다.
발명자들에 의하여 개발된 계산적 접근(Computational approaches)은 반응기 단백질들과 함께 상호작용하는 RalA 단백질을 선택적으로 억제하는 것을 활용할 수 있는 잠재적인 위치를 확인하기 위한 RalA의 3차원적인 구조를 분석하기 위하여 사용된다. 이러한 분석들은 exo84 및 sec5와의 복합물에서 RalA-GDP 및 RalA-GTP의 사용을 포함한다. 잠재적인 단백질 결합 위치들은 GTP 결합을 하는 RalA의 형태 변화와 연관되는 작용을 억제하여, 반응기 참여(effector engagement) 및 후속의 신호(downstream signaling)를 예방하는데 사용될 수 있는 분자를 수용하기에 충분히 거대한, Ral-GDP에는 존재하지만 Ral-GTP에는 존재하지 않는, 크레바스(crevasses) 및 함몰부(depressions)에 의하여 특징화된다. 이러한 포켓들은 효소의 활성 위치에 위치해 있는 뉴클레오티드 결합 구멍으로부터 멀리 위치해 있다.
상업적으로 이용가능한 화합물 라이브러리(libraries)의 계산적 스크리닝(Computational screening)은 이러한 알로스테릭한(allosteric) 단백질 포켓에 들어가는 작은 분자들을 확인하는데 사용된다. 이에, RalA-GDP를 도킹(docking)하기 위하여 준비하고, ChemDiv 라이브러리(500,000 화합물을 포함하지만, '약-유사성' 파라미터 이외에 놓여있는 ADME/유독성, 또는 물리화학적 성질로 알려진, 반응성을 갖는 그룹이 배재 되어 있는 v2006.5(Lipinski's rule of 5 및 Veber's Rule of 2))를 pH 7에서 ZINC 데이터베이스로부터 다운로드 한 후(Irwin JJ, Shoichet BK. ZINC - A free database of commercially available compounds for virtual screening. J Chem Inf Model 2005;45:177-82), 확인된 알로스테릭한 위치에 넣었다. 리간드 분자들은 AutoDockTools에서 제공되는 리간드 준비 모듈(ligand preparation module)에 의한 Gasteiger 전하(charges)가 할당된다. AutoDock4는 라마르크학설의 유전 알고리즘(Lamarckian genetic algorithm)을 사용하여 형태학적인 공간을 찾아 리간드 결합 에너지를 평가하기 위하여 사용된다. 자유 결합 에너지의 정확한 예측을 위하여 개발된 방법을 사용하여 순위가 정해진, 상위 88개의 화합물들은 평가를 위하여 선택되었다.
RalB의 결정구조가 정의되지 않았으므로, 본 발명자들은 92,167 멤버로 인코딩된 비드-기반 라이브러리(bead-based library)에 대한 GDP-loaded RalB 단백질을 스크린 하였다. 상기 스크린은 500nM 비드 풀(pools of beads)에서 FLAG-RalB의 직접적인 결합 분석으로써 수행되었다. 각 풀(pool)은 인코딩된 고정 화합물의 다중 카피(multiple copies)를 함유한다. 쥐의 anti-FLAG, 염소의 anti-mouse 알칼리 포스파타아제 콘쥬게이트, 및 침전 기질 BCIP와 함께, ELISA에 의한 FLAG-RalB 결합으로 가시적인 파란색이 발생하였다. 파란색의 비드는 물리적으로 분리되었으며 질량 분광학(mass spectroscopy)에 의하여 해독되었다. 이러한 연구는 평가를 더 하기 위한 11개의 화합물을 확인하는 것으로 결론지어졌다.
발명자들은 종래에 알려진 RalA 결정구조로부터 나사깎기 알고리즘(threading algorithms)을 사용하여 RalB의 3D 구조를 구축하였다(Nicely NI, Kosak J, de Serrano V, Mattos C. Crystal structures of Ral-GppNHp and Ral-GDP reveal two binding sites that are also present in Ras and Rap. Structure (Camb) 2004;12:2025-36). 확인된 이론상의 저-에너지 결합 포켓의 "인실리코(In silico)" 분자 모델은 가장된(simulated) RalB의 표면에 결합 히트(combinatorial hits)를 확인하기 위하여 사용되었다. 놀랍게도, 상기 접근을 사용하여 확인된 히트(hits)는 계산 모형(computational modeling) 접근으로 인하여 확인된 RalA의 동일한 상동(homologous) 포켓에 결합하였다. 따라서, RalA 및 RalB 모델에 대한 두 가지의 상이한 접근을 통해 둘 다의 단백질에서 뉴클레오티드 (GDP) 결합 위치와는 다른 동일한 분자 타켓 위치가 존재한다는 것을 확인하였다.
상기 인실리코(In silico) 모델에 근거하여, 필요한 추정상의(putative) Ral 억제제를 디자인 및 구매 또는 합성하였다. 생세포(living cells)에서 추정상의(putative) GTPase 억제제를 평가하기 위하여 기능적 특징(Functional characterization)을 사용하였다. 두 개의 상호 보완적인 스크린은 분자 타겟 위치에 결합하여 Ral 활성을 억제하는 99개의 화합물을 결정하기 위하여 사용되었다. 두 분석은 생세포 내부로 약물 침투가 요구되는 어떤 관찰되는 기능 효과를 확신하기 위한 근거인 세포이다.
생화학의 2차 스크린은 ELISA이고, 이는 활성 (GTP-결합)단백질이 RalA 또는 RalB와 함께 RalBP1를 형성하는 표준 결합 원리에 기반을 두고 있다. ELISA 분석은 광범위하게 사용되는 Ral 활성 풀-다운 분석법으로부터 개작되었다(Oxford G, Owens CR, Titus BJ, et al. RalA and RalB: antagonistic relatives in cancer cell migration. Cancer Res 2005;65:7111-20). GST 친화에 의하여 박테리아로부터 정제되고 His6 tag를 경유하여 금속-킬레이트 유도된 96-웰 마이크로판에 직접적으로 흡수되는 재조합 GST-His6-RalBP1 융합 단백질은 FLAG-RalA 또는 FLAG-RalB를 발현하는, 안정적으로 감염된 UMUC3 세포 라인과 함께 컨쥬게이션(conjugation) 하는 데 사용되었다. 이소성의(ectopic) 단백질은 Ral 활성을 위한 리포터(reporter)로서 기능을 하고, FLAG tag는 매우 민감하고 특정하게 단백질을 탐지하는 것을 가능하게 한다. RalA 또는 RalB를 위한 어떤 상업적 항체도 ELISA 포맷(format)에서 시료를 탐지하기에 적합하지 않으므로, 본 발명자들은 UMUC3에서 FLAG-Ral의 안정발현에 의존하였다. 로우버스트(robust) 신호대 잡음비(signal to noise ratio) (>100:1)는 anti-FLAG 일차 항체 및 HRP-복합 anti-mouse 이차 항체를 전체 세포 용해물의 0.3에서부터 10 mcg 까지 단백질을 주입하는 것과 비례하는 신호와 함께 사용할 수 있다. 이는 분석을 위하여 회복될 수 있는, 충분한 양의 전체 세포 단백질을 갖는 96 웰 마이크로판에서 배양된 세포 용해물을 사용할 수 있게 한다.
기능적 2차 스크린(functional secondary screen)은 세포를 재-플레이티드(re-plated)할 때, RalA에 의한 지질 라프트 이동(lipid raft trafficking)의 매개를 근거로 한다. 따라서, RalA를 블로킹(blocking)하는 것은(siRNA 디플리션(depletion) 또는 우성 음성(dominant negative)) 파이브로넥틴-코팅된 커버슬립에서 일반적인, 흡작-의존 뮤린 태아 섬유아세포(murine embryo fibroblasts, MEF)의 분산을 억제한다. 중요하게, Cav1-/- MEFSs는 RalA 디플리션(depletion)에 저항성이 있고, 따라서 이러한 세포들 및 그들의 야생형 대응물(wild type counterparts)은 실리코(silico)에서 확인된 추정상의(putative) Ral GTPase 억제제를 스크린하기 위하여 사용된다.
ELISA 및 세포분산 분석뿐만 아니라, 계산(computational) 및 조합(combinatorial) 스크린에서 활성을 나타내는 화합물들은 용량 반응 평가(dose response evaluation)를 위하여 선택되었다. 바람직한 후보 화합물들은 ELISA 및 세포분산 분석에서 IC50's의 농도가 1-2μM 범위인 것으로 확인되었으며, 성공적으로 RalB에 결합하였다. 바람직한 화합물들은 체외(in vitro)에서 인간 암세포 라인을 사용하고, 체내(in vivo)에서 쥐 모델을 사용하여 약물 동력학이 평가되었다.
따라서, 본 발명은 Ral GTPase 억제 화합물을 제공한다. 이러한 화합물들은 Ral 단백질과 exo84, sec5 및 RalBP1와 같은 Ral-관련 단백질들과의 결합을 방해할 수 있다. 확인된 Ral GTPase 억제제는 GTP 결합에 사용되는 Ral 단백질과 관련된 형태 변화를 막는데 사용될 수 있으며, 따라서 이는 반응기 참여(effector engagement) 및 후속의 신호(downstream signaling)를 예방한다. 이러한 억제제는 filamin A, PLD1 및 ZONAB와 같은 단백질을 포함하는, Ral 단백질에 위치한 다른 결합 위치를 통해 Ral과 함께 결합하는 단백질에 Ral 단백질이 결합하는 것을 또한 방해할 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 포유동물에서 Ral GTPase를 억제하여 포유동물에서 암의 성장 및/또는 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 바람직한 일실시예에 있어서, Ral GTPase는 RalA 및 RalB 파라로그(paralogs) 중 적어도 하나이다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 본 발명에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 적어도 하나 투여함에 따라 포유동물에 암의 성장 및/또는 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
"파라로그(paralog)" 용어는 동일한 게놈(genome)에서 다른 위치를 차지하기 위하여 이중으로 된(duplicated) 유기체의 유전자를 표시하기 위하여 사용된다.
여기서 사용된, "화합물" 용어는 단일 또는 복합 유기분자, 펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)와 같은 화학적 또는 생물학적 분자를 의미한다.
"약학적으로 허용 가능한" 구는 여기서 화합물, 재료(materials), 조성물, 및/또는 복용 형태를 언급하며, 이들은 소리 의학 검진(sound medical judgment)의 범위 내에 있고, 인간 또는 동물의 조직과 접촉하는데 사용하기에 적합하도록 과도한 독성, 자극, 효용/위험 비율과 비례하는 다른 문제 또는 합병증이 없는 것이 동원된다.
"약학적으로-허용 가능한 염"은 모 화합물(parent compound)이 산 또는 염기 염으로 변형된, 노출된(disclosed) 화합물의 유도체를 언급한다. 약학적으로 허용 가능한 염의 예시는 무기물(mineral) 또는 아민과 같은 염기 잔유물의 유기산염 또는 알칼리(alkali) 또는 카복실산과 같은 산 잔유물의 유기 염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 약학적으로-허용 가능한 염은 일반적인 비-독성 염 또는 예를 들면, 비-독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물(parent compound)의 사차 암모늄염을 포함한다. 일반적인 비 독성 염은 염화수소의, 브롬화수소의, 유황의, 설파믹(sulfamic), 인의, 질소의 및 기타 종류와 같은 무기산; 아세틱(acetic), 프로피온산의, 호박산의(succinic), 글리콜의, 스테아르산의, 젖의(lactic), 말산의(malic), 타르타릭(tartaric), 구연산의(citric), 아스코르빅(ascorbic), 파모익(pamoic), 말레익(maleic), 하이드록시말레익(hydroxymaleic), 페닐아세틱(phenylacetic), 글루타믹(glutamic), 벤조익(benzoic), 살리실산의(salicylic), 설파닐릭(sulfanilic), 2-아세톡시벤조익, 푸마릭(fumaric), 톨루엔설포닉, 메탄설포닉, 에탄 디설포닉, 옥살릭(oxalic), 이세티오닉(isethionic) 및 기타 종류와 같은 유기산;으로부터 유래되는 것을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 과도한 독성, 자극, 효용/위험 비율과 비례하는 다른 문제 또는 합병증이 없는 인간 및 동물의 조직과 접촉하는데 사용하기에 적합한 화합물의 형태이다.
여기서 제공된 화합물의 약학적으로-허용 가능한 염 형태는 일반적인 화학적 방법에 의한 염기성 또는 산성 부분을 함유하는 본 발명에 따른 화합물로부터 합성된다. 일반적으로, 염들은, 예를 들면, 이러한 화합물들의 자유 산 또는 염 형태와 물 또는 유기용매, 또는 두 개의 혼합물; 일반적으로, 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토나이트릴과 같은 비수용성 매체에 용해된 적절한 염기 또는 산의 화학량적인 양을 함께 반응시킴으로써 준비된다. Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985의 페이지 1418에 적절한 염들이 목록 화 되어있는 것이 발견되었다.
본 발명에 따른 화합물의 "치료적으로 유효한 양" 또는 "치료량" 용어는 암을 갖는 포유동물에게 투여를 한 후, 암의 형성 또는 진행이 효과적으로 억제될 때의 양을 의미한다.
"용매 화합물(solvate)" 용어는 용매와 화합물의 상호작용에 따라 형성된 화합물을 언급한다. 바람직한 용매 화합물은 일수화물(monohydrates) 및 반-수화물(hemi-hydrates)을 포함하는, 수화물과 같은 약학적으로 허용 가능한 용매 화합물이다.
본 발명에 따른 화합물이 카이랄 중심을 가질 수 있고, 고립될(isolated) 수 있고, 선택적으로 활성을 갖고, 및 라세믹(racemic)이 형성된다는 것은 당업자로부터 인정받을 것이다. 본 발명에 따른 화합물은, 여기서 서술된 치료학적으로 유용한 특성을 갖는 라세믹(racemic), 광학-활성(optically-active), 위치 이성질체성(regioisomeric) 또는 입체 이성질체성(stereoisomeric) 중 어느 형태든지 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 화합물이 적어도 하나의 카이랄 중심을 가진다면, 상기 화합물은 아마도 광학 이성질체(enantiomers)가 존재할 것이다. 본 발명에 따른 화합물이 두 개 또는 그 이상의 카이랄 중심을 가진다면, 상기 화합물은 아마도 기하학적 이성질체(diastereomers)가 존재할 것이다. 본 발명에 따른 화합물의 준비 과정에서 입체 이성질체(stereoisomers)의 혼합물이 생성되며, 상기 이성질체는 조제용 크로마토그래피(preparative chromatography)와 같은 일반적인 방법을 통해 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 입체특이적 합성(stereospecific synthesis)을 통해 또는 분할(resolution)을 통해 라세믹 형태 또는 각각의 광학 이성질체 또는 기하학적 이성질체로 준비될 것이다. 상기 화합물은 (-)-디-p-톨루오일-D-타르타르산 및/또는 (+)-디-p-톨루오일-L-타르타르산과 같은, 광학활성 산을 사용한 염 형성을 통한 입체이성질체 쌍(stereoisomeric pairs)을 형성하고, 분별 결정(fractional crystallization) 및 유리 염기(free base)의 재생(regeneration)과 같은, 일반적인 방법을 통해 이들의 구성요소인 광학 이성질체 또는 기하학적 이성질체로 분리될 수 있다. 상기 화합물은 또한 입체 이성질체의 에스테르 또는 아민을 형성한 후, 크로마토그래피 분리 및 카이랄 보조제(chiral auxiliary)의 제거를 통해 분리될 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명에 따른 화합물은 카이랄 HPLC 컬럼을 사용하여 분리될 수 있다. 모든 입체 이성질체(stereoisomers), 라세믹 혼합물(racemic mixtures), 기하학적 이성질체(diastereomers) 및 광학 이성질체(enantiomers)는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
광학 활성 형태를 준비하는 방법은 해당 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들면, 라세믹 형태 분리 방법, 재결정화를 통한 방법, 광학-활성 출발물질의 합성을 통한 방법, 카이랄 합성을 통한 방법, 또는 비대칭 고정상을 사용한 크로마토그래피 분리를 통한 방법). 본 발명은 또한 존재할 수 있는, 다양한 이성질체뿐만 아니라 형성될 수 있는, 다양한 이성질체 혼합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 화합물의 분리(resolution)에서, 이들의 출발 물질 및/또는 중간체는 종래에 알려진 과정, 예를 들면., 4 권의 개요서인 Optical Resolution Procedures for Chemical Compounds: Optical Resolution Information Center, Manhattan College, Riverdale, N.Y., and in Enantiomers, Racemates and Resolutions, Jean Jacques, Andre Collet and Samuel H. Wilen; John Wiley & Sons, Inc., New York, 1981에 전체적으로 포함되어 설명되어 져 있는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 기본적으로, 화합물의 분리는 기하학적 이성질체(diastereomers)는 광학 이성질적으로 순수한 잔기(moiety)가 존재하여 이에 따른 결과로, 물리적 특성뿐만 아니라, 화학적 또는 효소적 차이에 근거하여 분별 결정(fractional crystallization), 증류법(distillation) 또는 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물을 제조하는데 사용되는 화합물은 상업적으로 구매될 수 있다. 상기 화합물의 염을 포함하는, 본 발명에 따른 화합물은 또한, 유기 합성의 분야에서 통상적으로 알려진 기술 방법으로 인하여 준비될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 사용되는 시료 및 재료(materials)에 적합하고 시행되는 변화에 바람직한 용매 내에서 수행되는 반응을 사용하여 준비될 수 있다. 분자의 다양한 부분에 존재하는 작용기(functionality)는 제안된 시료 및 반응에 호환이 가능하여야 유기합성의 당업자에게 이해될 수 있다. 반응 조건과 호환되는 치환기의 제한은 당업자가 쉽게 알 수 있으며, 이후 다른 방법이 사용되어야 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 화합물 및 동물, 특히 포유동물에 생물학적으로 활성인 시료를 전달하기 위하여, 해당 분야에 일반적으로 사용되는 매개(media)인 약학적으로-허용 가능한 캐리어(carrier)를 함유한다. 약학적으로-허용 가능한 캐리어는 해당 분야의 종래기술 범위 내에서 결정되고 수용되는 많은 요소에 따라 제제화된다. 이는 하기를 포함하며, 이에 제한되지 않는다: 제제화되는 시료의 타입(type) 및 성질; 투여되는 시료-함유 조성물의 조건; 조성물의 의도된 투여 경로; 및, 목표로 된 치료상의 지표(therapeutic indication). 약학적으로-허용 가능한 캐리어는 다양한 고체 및 반-고체 복용 형태뿐만 아니라, 수용성 및 비-수용성 액체 매개(media)를 포함한다. 상기와 같은 캐리어는 많은 상이한 성분 및 첨가물에 더하여 활성 시료를 포함할 수 있으며, 상기 추가적인 성분은 제제화할 때 다양한 이유, 예를 들면, 해당 분야에서 일반적인 방법으로 잘 알려진 활성 시료를 안정화시키기 위하여 포함된다. 바람직한 약학적으로-허용 가능한 캐리어의 설명, 및 이에 포함되는 요소들은 쉽게 이용 가능한 다양한 문헌, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985에서 찾을 수 있다.
본 발명은 여기서 제공되는 약학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여 암으로 고통받는 포유동물을 치료하거나 또는 포유동물의 암 전이를 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 일반적으로 암을 효과적으로 예방, 개선, 완화 또는 억제하는데 본 발명에 따른 화합물을 치료학적으로 유효한 양으로 함유한다. 상기 양은, 투여될 때 포유동물의 몸무게인 킬로그램 당 화합물을 약 0.1 내지 100 mg으로 구성되는 것이 일반적이다. 치료학적으로 유효한 양은 해당 분야의 일반적인 방법으로 충분히 복용 양생법(dosing regimen)에 따라 투여될 수 있다.
투여 방법은, 예를 들면, 다양한 비경구 투여가 가능하다. 비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 수용성 덱스트로오스(aqueous dextrose) 및 식염수(saline solutions)과 같은 다양한 수용성 매개(media); 또한 캐리어로써 유용한 글리콜 용액, 바람직한 유효성분으로써 수용성 염을 함유하고, 적절한 안정화제, 및 필요하다면, 완충화제(buffering agents)를 포함한다. 아황산수소나트륨(sodium bisulfite), 아황산 나트륨(sodium sulfite), 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 단독 또는 조합한 항산화 시료(Antioxidizing agents)는 적절한 안정화제이고; 또한 구연산(citric acid) 및 이의 염, 및 EDTA가 사용된다. 추가적으로, 주사액(parenteral solutions)은 염화 벤즈알코늄(benzalkonium chloride), 메틸- 또는 프로필-파라벤, 및 클로로부탄올과 같은 방부제(preservatives)를 함유할 수 있다.
그렇지 않으면, 조성물은 캡슐, 정제 및 파우더와 같은 고체 복용형태(solid dosage forms); 또는 엘릭시르제(elixirs), 시럽, 및/또는 현탁액과 같은 액체 형태로 경구 투여될 수 있다. 젤라틴 캡슐(Gelatin capsules)은 락토오스, 탄수화물, 마그네슘, 스테아르산염(stearate), 스테아르산(stearic acid), 또는 셀룰로오스 유도체와 같은, 하지만 이에 제한하지 않는 유효성분 및 적절한 캐리어를 함유하는데 사용될 수 있다. 압축 정제를 만들기 위하여 비슷한 희석제(diluent)가 사용될 수 있다. 일정 기간 동안 약물의 지속적인 방출을 제공하기 위한 지효성 약(release products) 생성물로써 정제 및 캡슐 둘 다 제조될 수 있다. 압축 정제는 불쾌한 맛을 가리거나, 또는 유효성분을 주변환경으로부터 보호하기 위하여, 또는 위장관(gastrointestinal tract)에서 정제의 선택적인 분해를 유도하기 위하여 당-코팅되거나 또는 필름-코딩될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 제형은 암의 예방, 치료 또는 개선을 위한 비경구 또는 경구 투여에 적절한 단-상의(mono-phasic) 약학적 조성물이며, 상기 조성물은 본 발명에 따른 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 치료학적으로-유효한 양만큼 함유한다.
적절한 수용성 및 비수용성 캐리어의 예시는 물, 에탄올, 폴리올스(polyols) (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 기타 종류), 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레산염(ethyl oleate)과 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 레시틴(lecithin)과 같은 코팅 재료(coating materials)를 사용하거나, 분산제(dispersions)의 경우처럼 요구되는 입자 크기를 유지하거나, 및 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 또한 습윤제(wetting agents), 유화제(emulsifying agents) 및 분산제(dispersing agents)와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 조성물에 당류(sugars), 염화나트륨, 및 기타 종류와 같은 등장성의 시료를 포함할 수 있다. 추가적으로, 주사 가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테레이트(monosterate) 및 젤라틴(gelatin)과 같이 흡수를 지연시키는 시료를 포함시켜 이루어내었다.
어떤 경우에는, 약효를 연장하기 위해서, 피하의(subcutaneous) 또는 근육 내(intramuscular) 주사로부터 약의 흡수를 늦추는 것이 요구된다. 이는 결정체(crystalline)의 액체 현탁액 또는 수용성이 낮은 무정형재료(amorphous material)을 사용함으로써 달성된다. 약의 흡수 속도는 결정 크기 및 결정체 형태에 의한 용해 속도에 의존한다. 그 대신에, 비경구-투여된 약의 지연된 흡수는 오일 운반체(oil vehicle) 내에 있는 약의 용해 또는 서스펜딩(suspending)에 의하여 성취된다.
주사 가능한 데포(depot) 형태는 폴리락타이드-폴리글리코라이드(polylactide-polyglycolide)와 같은 생분해(biodegradable) 고분자에서 약의 미세 캡슐화된 형틀(microencapsulated matrices)을 형성함으로써 만들어진다. 고분자에 약의 비율, 및 사용된 고분자의 특정한 성질에 의존하여, 약의 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 고분자의 예시로, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사 가능한 제형(Depot injectable formulations)은 또한 생체 조직과 호환이 되는 리포솜(liposomes) 또는 마이크로 에멀션(microemulsions)에서 약을 포괄(entrapping)함으로써 준비된다. 주사 가능한 재료(injectable materials)는 박테리아-고정 필터(bacterial-retaining filter)를 통한 필터를 통해 살균될 수 있다.
정제와 같은 고체 조성물을 준비하기 위하여, 주된 유효성분이 본 발명에 따른 화합물의 동종의(homogeneous) 혼합물을 함유하는 고체 조제형 조성물(preformulation composition)을 형성하기 위한 약학적 첨가제(excipient)와 함께 혼합될 수 있다. 이러한 동종의(homogeneous) 조제형 조성물은 유효성분이 조성물 전체에 통틀어 균일하게 분산되어 조성물이 정제, 알약 및 캡슐과 같은 동등하고 효율적인 단위복용 형태로 쉽게 부분할 될 수 있게끔 할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 고체 조제형은 상기 서술된 타입(type)의 단위복용량 형태로, 예를 들면, 본 발명에 따른 치료상의 화합물을 0.1 내지 500 mg 함유하도록 부분할 될 수 있다.
경구 투여로 적합한 본 발명에 따른 제형은 캡슐, 카시에(cachets), 알약, 정제, 파우더, 과립제 또는 수용성 또는 비-수용성 액체에 용해되는 용액 또는 현탁액, 또는 수중유(oil-in-water) 또는 유중 수적형(water-in-oil) 액상 에멀션, 또는 엘릭서, 또는 시럽, 또는 캔디(pastilles) (젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아와 같은 불활성 염기를 사용한) 및 기타 종류의 형태일 수 있고, 각각의 형태는 화합물 또는 본 발명에 따른 화합물을 유효성분으로써 예정된 양을 함유할 수 있다. 화합물 또는 본 발명에 따른 화합물은 또한 약의 한 회 분(bolus), 연약(electuary) 또는 반죽(paste)으로써 투여될 수 있다.
경구 투여(캡슐, 정제, 알약, 사탕(dragees), 파우더, 과립제 및 기타 종류)를 위한 본 발명에 따른 고체 복용 형태에서, 유효성분은 구연산나트륨(sodium citrate) 또는 인산 이칼슘(dicalcium phosphate) 및/또는 하기의 어느 것과 같은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어(carriers)와 혼합할 수 있다: (1) 탄수화물, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 마니톨, 및/또는 규산과 같은 충전제(fillers) 또는 전색제(extenders); (2) 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산 염류, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스 및/또는 아카시아와 같은 결합제(binders); (3) 글리세롤과 같은 습윤제(humectants); (4) 한천(agar-agar), 탄산칼슘, 감자(potato) 또는 타피오카 녹말(tapioca starch), 알긴산(alginic acid), 특정 규산염(certain silicates), 및 탄산나트륨과 같은 붕해제(disintegrating agent); (5) 파라핀(paraffin)과 같은 용해 억제 시료(solution retarding agents); (6) 사차 암모늄 화합물와 같은 흡수 가속제(absorption accelerators); (7) 세틸 알코올(cetyl alcohol) 및 글리세롤 모노스테레이트(glycerol monosterate)과 같은 습윤제(wetting agents); (8) 카올린(kaolin) 및 벤토나이트 점토(bentonite clay)과 같은 흡착제(absorbents); (9) 탈크(talc), 스테아르산칼슘(calcium stearate), 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 고체 폴리에틸렌 글리콜(solid polyethylene glycols), 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate), 및 이들의 혼합물과 같은 윤활유(lubricants); 및 (10) 착색제(coloring agents). 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약학적 조성물은 또한 완충화제(buffering agents)를 포함할 수 있다. 비슷한 타입(type)의 고체 조성물은 고분자인 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 종류뿐만 아니라, 락토오스 또는 유당(milk sugars)과 같은 첨가제(excipients)를 사용한 부분적으로 및 꽉 채워진 젤라틴 캡슐의 충전제(fillers)로써 사용될 수 있다.
정제는 하나 또는 그 이상의 부 성분(accessory ingredients)을 선택적으로 함께 압축 또는 몰딩(molding)함으로써 만들어질 수 있다. 압축 정제는 바인더(binder) (예를 들면, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활유(lubricant), 불활성 희석제(inert diluent), 방부제, 붕괴제(disintegrant) (예를 들면, 소듐 탄수화물 글리콜산염(sodium starch glycolate) 또는 가교된 소듐 카복시메틸 셀룰로오스), 표면-활성 또는 분산제를 사용하여 준비될 수 있다. 몰드(molded)된 정제는 적합한 기계(suitable machine)에 분말로 된 젖은 화합물의 혼합물을 불활성의 액체 희석액과 함께 몰딩(molding)하여 만들어질 수 있다.
사탕(dragees), 캡슐, 알약 및 과립제와 같은, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 정제 및 다른 고체 복용 형태는, 장용성 제피(enteric coatings) 및 약학적-제형 분야에서 잘 알려진 다른 코팅과 같은, 코팅(coatings) 및 쉘(shells)과 함께 선택적으로 스코어 되거나(be scored) 또는 준비될 수 있다. 그것들은 또한 유효성분의 방출을 천천히 또는 조절된 양만큼 제공하기 위하여, 예를 들면, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스를 다양한 비율로 사용하여 요구되는 방출량을 제공하거나, 다른 고분자 매트릭스(polymer matrices), 리포솜 및/또는 마이크로입자(microspheres)를 사용하여, 제제화될 수 있다. 그것들은, 예를 들면, 박테리아-고정 필터(bacterial-retaining filter)를 통한 필터를 통해 살균될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 불투명화제(opacifying agents) 및 위장관의 특정 부분에서 선택적으로, 오직 유효성분만을 바람직하게 서방출하는 조성물을 선택적으로 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물(embedding compositions)의 예시는 폴리머 물질(polymeric substances) 및 왁스(waxes)를 포함할 수 있다. 유효성분은 또한 마이크로 캡슐형으로 될 수 있다.
본 발명에 따른 정제 또는 알약은 코팅되거나 또는 지속성 작용(prolonged action)의 이점이 있는 복용 형태를 제공하기 위하여 배합(compounded)될 수 있다. 예를 들면, 정제 또는 알약은 내부 복용 및 외부 복용 요소를 포함할 수 있으며, 후자의 경우, 전자를 감싼 형태로 사용된다. 두 가지 구성요소는 위에서의 분해를 억제하는 장용층(enteric layer)에 의하여 분리될 수 있으며, 이는 내부 구성요소가 온전하게 십이지장(duodenum) 내부로 통과할 수 있도록 하거나 또는 서방출을 유도한다. 다양한 소재가 장용층(enteric layers) 또는 코팅을 위하여 사용될 수 있으며, 상기 소재는 많은 폴리머 산(polymeric acids) 및 폴리머 산과 셸락(shellac), 세틸 알코올(cetyl alcohol), 및 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate)의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 경구투여용 액상 복용 형태는 약학적으로 허용 가능한 에멀션(emulsions), 미세에멀션(microemulsions), 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르제를 포함한다. 유효성분에 더하여, 액상 복용 형태는 물 또는 다른 용매들과 같이 해당 분야에 통상적으로 사용하는 불활성 희석제(inert diluents), 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조산염, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실(cottonseed), 땅콩(groundnut), 곡식(corn), 세균(germ), 올리브(olive), 비버향(castor) 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퓨란 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄(sorbitan) 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물과 같은 가용화제(solubilizing agents) 및 유화제(emulsifiers)를 함유할 수 있다.
불활성 희석제(inert diluents) 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제(wetting agents), 에멀션화(emulsifying) 및 현탁화제(suspending agents), 감미료(sweetening), 조미료(flavoring), 색소(coloring), 향료(perfuming) 및 방부제(preservative agents)와 같은 보조제(adjuvants)를 더 포함할 수 있다.
현탁액, 활성 화합물은 추가적으로, 예를 들면, 에톡실레이티드 이소스테아릴 알코올(ethoxylated isostearyl alcohols), 폴리옥시에칠렌소르비톨(polyoxyethylene sorbitol) 및 소르비탄에스테르(sorbitan esters), 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 알루미늄 메타하이드록사이드(aluminum metahydroxide), 벤토나이트(bentonite), 한천(agar-agar) 및 트라가칸트(tragacanth) 및 이들의 혼합물과 같은 현탁화제를 함유할 수 있다.
직장의(rectal) 또는 질의(vaginal) 투여를 위한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 화합물과, 코코아 기름(cocoa butter), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 좌약 왁스(suppository wax) 또는 살리실산염(salicylate)으로 구성되고, 상온에서는 고체형태를 갖지만, 체온에서는 액체형태를 가져 직장(rectum) 또는 질강(vaginal cavity)에서 녹아 활성 화합물을 방출하는 하나 또는 그 이상의 적절한 무자극성(nonirritating) 첨가제 또는 캐리어(carriers)를 혼합함으로써 준비되는 좌약(suppository) 형태를 가질 수 있다. 질의 투여(vaginal administration)에 적절한 본 발명에 따른 제형은 또한 해당 분야에 적절하게 알려진 캐리어(carriers)와 같은 것을 함유하는 질 좌약(pessaries), 탐폰(tampons), 크리임 제(creams), 젤(gels), 반죽(pastes), 발포(foams) 또는 분무(spray) 제형을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 국소(topical) 또는 경피(transdermal) 투여를 위한 복용 형태는 파우더(powders), 분무(sprays), 연고(ointments), 반죽(pastes), 크림(creams), 로션(lotions), 젤(gels), 용액(solutions), 패치(patches), 물약(drops) 및 흡입제(inhalants)를 포함한다. 유효성분은 약학적으로 허용 가능한 캐리어(carrier)와, 요구되는 어떤 완충제(buffers), 또는 분사제(propellants)를 무균 조건(sterile conditions)하에서 혼합될 수 있다.
연고(ointments), 반죽(pastes), 크림(creams) 및 젤(gels)은 이들이 함유하는, 유효성분에 더하여, 동물 및 식물 지방, 오일, 왁스(waxes), 파라핀(paraffins), 탄수화물(starch), 트라가칸트(tragacanth), 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘(silicones), 벤토나이트(bentonites), 규산(silicic acid), 탈크(talc) 및 산화 아연(zinc oxide), 또는 이들의 혼합물과 같은 첨가제를 더 함유할 수 있다.
파우더(Powders) 및 분무(sprays)는 이들이 함유할 수 있는, 유효성분에 더하여, 락토오스(lactose), 탈크(talc), 규산(silicic acid), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), 규산 칼슘(calcium silicates) 및 폴리아마이드 파우더(polyamide powder) 또는 이 물질들의 혼합물과 같은 첨가제를 더 함유할 수 있다. 분무(Sprays)는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본(chlorofluoro-hydrocarbons)과 같은 관례적인 압축가스(customary propellants) 및, 부탄(butane) 및 프로판(propane)과 같은 휘발성의 비치환 탄화수소(volatile unsubstituted hydrocarbons)를 함유할 수 있다.
경피용 패치(Transdermal patches)는 신체에 본 발명에 따른 화합물의 조절된 전달을 제공할 수 있는 추가적인 이점을 갖는다. 이러한 복용 형태는 탄성 중합체의 매트릭스 재료(elastomeric matrix material)와 같은 적절한 매체에서, 용해, 분산 또는 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 화합물을 결합시켜 만들어질 수 있다. 흡착증강제(Absorption enhancers)는 또한 화합물의 유동(flux)을 증가시켜 피부를 통과할 수 있게끔 하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 유동(flux) 속도는 속도 제어막(rate-controlling membrane)을 제공하거나 또는 고분자 매트릭스 또는 젤에 화합물을 분산함으로써 조절될 수 있다.
약학적 제형은 흡입(inhalation), 또는 흡입제(insufflation), 또는 비강(nasal), 또는 안구 내 투여에 의한, 적절한 투여를 포함한다. 상부 (비강) 또는 흡입에 의한 하기도(lower respiratory tract) 투여를 위하여, 본 발명에 따른 화합물은 취입기(insufflator), 분무기(nebulizer), 또는 가압 팩(pressurized pack), 또는 에어로졸 스프레이(aerosol spray) 전달의 다른 편리한 수단으로부터 편리하게 전달될 수 있다. 가압 팩(pressurized pack)은 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 다른 적절한 가스와 같은, 적절한 압축가스(propellant)를 포함할 수 있다. 가압 에어로졸(pressurized aerosol)의 경우, 단위 투여는 계량된 양(metered amount)을 전달하기 위한 값을 제공함으로써 결정된다.
그 대신에, 흡입(inhalation) 또는 흡입제(insufflation)에 의한 투여의 경우, 조성물은, 예를 들면, 본 발명에 따른 항암용 화합물을 하나 또는 그 이상을 혼합한 파우더인 건성 파우더(dry powder) 및 락토오스 또는 탄수화물과 같은 적절한 파우더 베이스(powder base)의 형태를 갖는다. 파우더 조성물은, 예를 들면, 흡입기(inhalator), 취입기(insufflator) 또는 정량흡입기(metered-dose inhaler)의 도움을 받아 투여되는 파우더로부터 캡슐 또는 카트리지(cartridges), 또는, 예를 들면, 젤라틴(gelatin) 또는 블리스터 팩(blister packs) 형태의 단위 복용 형태로 존재할 수 있다.
경비 투여(intranasal administration)를 위하여, 본 발명에 따른 화합물은 점비약(nose drops) 또는, 플라스틱병 분무기(plastic bottle atomizer) 또는 정량흡입기(metered-dose inhaler)에 의한 액체 분무(liquid spray)에 의하여 투여될 수 있다. 전형적인 분무기로는 Mistometer (Wintrop) 및 Medihaler (Riker)가 있다.
점안약(eye drops) 또는 점비약(nose drops)과 같은 물약은 또한 하나 또는 그 이상의 분산제(dispersing agents), 가용화제(solubilizing agents) 또는 현탁화제(suspending agents)로 구성되는 수용성 또는 비수용성 염기와 함께 제형화 될 수 있다. 액체 분무는(Liquid sprays) 가압 팩으로부터 편리하게 전달될 수 있다. 물약은 간단한 안구 점적기-캡핑된(dropper-capped) 병 또는 특별한 모양의 마개에 의하여 액체 내용물을 점적하기 위한 목적을 갖는 플라스틱병에 의하여 전달될 수 있다.
제형은, 예를 들면, 앰풀(ampules) 및 바이알(vials)과 같은 단위-복용 또는 다수-복용의 밀폐된 용기로 존재할 수 있고, 살균 액체 캐리어(sterile liquid carrier), 예를 들면, 사용하기 직전에 주사를 위한 물의 첨가가 단지 요구되는 감압 하 동결 건조상태(lyophilized condition)로 저장될 수 있다. 즉각적인 주사 용액 및 현탁액은 상기 서술된 타입(type)의 멸균 파우더(sterile powders), 과립제(granules) 및 정제로부터 준비될 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 복용 제형은 본 발명에 따른 치료상의 화합물을 단독으로 또는 다른 치료학적으로 활성인 성분, 및 약학적으로 허용가능한 불활성 첨가제와 함께 조합한 것을 함유할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 불활성 첨가제" 용어는 적어도 하나의 희석액(diluents), 결합제(binders), 윤활유/활주제(lubricants/glidants), 착색제(coloring agents) 및 방출 변경 고분자(release modifying polymers)를 포함한다.
적절한 항산화제(antioxidants)는 해당 분야에 잘 알려진 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용 가능한 항산화제로부터 선택될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 항산화제의 예시는 부틸 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 아스코르브산나트륨(sodium ascorbate), 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 아황산 나트륨(sodium sulfite), 구연산(citric acid), 말산(malic acid) 및 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함할 수 있다. 항산화제(antioxidants)는 복용 제형의 무게에 따라, 약 0.001% 내지 약 5% 사이의 농도에서, 본 발명에 따른 복용 제형으로 존재할 수 있다.
적절한 킬레이트제(chelating agents)는 해당 분야에 잘 알려진 하나 또는 그 이상의 킬레이트제로부터 선택될 수 있다. 적절한 킬레이트제의 예시는 에데트산이나트륨(disodium edetate, EDTA), 에데트산(edetic acid), 구연산(citric acid) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 킬레이트제는 복용 제형의 무게에 따라, 약 0.001% 및 약 5% 사이의 농도로 존재할 수 있다. 복용 형태는 락토오스, 당류(sugar), 콘스타치(cornstarch), 변조된 콘스타치(modified cornstarch), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 및/또는 목재 셀룰로오스(wood cellulose) 및 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose)와 같은 셀룰로오스 유도체를, 전형적으로 약 20% 내지 약 80% 범위의 무게 양으로 포함할 수 있다.
복용 형태는 하나 또는 그 이상의 결합제(binders)를 약 60% w/w 이상의 양으로 포함할 수 있다. 적절한 결합제의 예시는 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 유드라지트(eudragits), 에틸 셀룰로오스, 젤라틴, 아라비아 고무(gum arabic), 폴리비닐 알코올, 풀루란(pullulan), 카보머(carbomer), 전호화분 녹말(pregelatinized starch), 한천(agar), 트라가칸트(tragacanth), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 및 기타 종류를 포함한다.
적절한 붕괴제(disintegrants)의 예시는 소듐 탄수화물 글리콜산염(sodium starch glycolate) 크로스카멜로스 소듐(croscarmellose sodium), 크로스포비돈(crospovidone), 저 치환 하이드록시프로필(hydroxypropyl) 셀룰로오스 및 기타 종류를 포함한다. 농도는 복용 형태에서 무게로 0.1% 내지 15%로 다양할 수 있다.
윤활유/활주제(lubricants/glidants)의 예시는 콜로이드 이산화규소(colloidal silicon dioxide), 스테아르산(stearic acid), 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산칼슘(calcium stearate), 탈크(talc), 수소첨가된 피마자기름(hydrogenated castor oil), 지방산의 수크로오스에스테르류, 미정질 왁스(microcrystalline wax), 황납(yellow beeswax), 백납(white beeswax) 및 기타 종류를 포함한다. 농도는 복용 형태에서 무게로 0.1% 내지 15%로 다양할 수 있다.
본 발명에 따른 치료상의 화합물을 함유하는 확장된 방출 제형을 형성하기 위하여 방출 변조 고분자(Release modifying polymers)가 사용될 수 있다. 상기 방출 변조 고분자는 수용성 고분자, 또는 비수용성 고분자이다. 수용성 고분자의 예로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 하이드록시 프로필셀룰로오스(hydroxy propylcellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 비닐 아세테이트 공중합체(vinyl acetate copolymers), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 다당류 (알긴산염, 잔탄검 등과 같은), 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 비수용성 고분자의 예로는 메타크릴레이트(methacrylates), 아크릴산 공중합체(acrylic acid copolymers)와 같은 아크릴레이트(acrylates); 에틸셀룰로오스 또는 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 및 고분자인 폴리비닐알코올을 포함한다.
본 발명은 또한 하기를 포함하여 Ral GTPase를 억제함에 따라 폐암의 전이를 예방, 치료 또는 억제하는 잠재적인 약제를 스크리닝(screening)하는 방법을 포함한다: (a) Ral GTPase와 잠재적인 치료상의 화합물이, 이들이 상호작용할 수 있는 조건에서 결합, 및; (b) Ral GTPase의 효소 활성을 관찰; 이때, 상기 잠재적인 치료상의 화합물은 어떠한 잠재적인 치료상의 화합물이 첨가되지 않은 제어 샘플과 비교하여 효소활성을 억제하는, 후술할 연구로부터 선택된다. 일실시예에 있어서, 잠재적인 치료상의 화합물은 약학적 시료, 시토킨(cytokine), 저분자 약, 세포-투과성 저분자 약, 호르몬, 인터류킨(interleukins)의 조합, 렉틴(lectin), 이중특이성 항체(bispecific antibody), 및 펩타이드 유사(peptide mimetic)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 일실시예는 포유동물에서 암 또는 암의 전이를 치료 또는 예방하기 위하여 사용하는 본 발명에 따른 화합물과 관련된다. 본 발명과 관련되는 일실시예는 포유동물에서 암 또는 암의 전이를 치료 또는 예방하기 위하여 사용하는 본 발명의 조성물과 관련된다.
본 발명에 따른 다른 일실시예는 포유동물에서 암의 성장 또는 전이를 억제하기 위한 약제의 준비에서, 본 발명에 따른 어떤 화합물 또는 조성물의 사용과 관련된다.
본원에 인용된 각각의 간행물 또는 특허는 그 전체가 본원의 참조로 인용된다.
실시예들
후술할 실시예들은 본 발명의 특정 측면, 일실시예, 및 형태를 설명하기 위하여 제공되며, 본 발명이 첨부된 청구항으로부터 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 - 추정상의 ( putative ) Ral GRPase 억제제의 스크리닝:
RalB의 결정구조가 정의되지 않았으므로, 본 발명자들은 92,167 멤버로 인코딩된 비드-기반 라이브러리(bead-based library)에 대한 GDP-loaded RalB 단백질을 스크린 하였다. 상기 스크린은 500nM 비드 풀(pools of beads)에서 FLAG-RalB의 직접적인 결합 분석으로써 수행되었다. 각 풀(pool)은 인코딩된 고정 화합물의 다중 카피(multiple copies)를 함유한다. 쥐의 anti-FLAG, 염소의 anti-mouse 알칼리 포스파타아제 콘쥬게이트, 및 침전 기질 BCIP와 함께, ELISA에 의한 FLAG-RalB 결합으로 가시적인 파란색이 발생하였다. 파란색의 비드는 물리적으로 분리되었으며 질량 분광학(mass spectroscopy)에 의하여 해독되었다. 이러한 연구는 평가를 더 하기 위한 11개의 화합물을 확인하는 것으로 결론지어졌다.
발명자들은 종래에 알려진 RalA 결정구조로부터 나사깎기 알고리즘(threading algorithms)을 사용하여 RalB의 3D 구조를 구축하였다(Nicely NI, Kosak J, de Serrano V, Mattos C. Crystal structures of Ral-GppNHp and Ral-GDP reveal two binding sites that are also present in Ras and Rap. Structure (Camb) 2004;12:2025-36). 확인된 이론상의 저-에너지 결합 포켓의 "인실리코(In silico)" 분자 모델은 가장된(simulated) RalB의 표면에 결합 히트(combinatorial hits)를 확인하기 위하여 사용되었다. 놀랍게도, 상기 접근을 사용하여 확인된 히트(hits)는 계산 모형(computational modeling) 접근으로 인하여 확인된 RalA의 동일한 상동(homologous) 포켓에 결합하였다. 따라서, RalA 및 RalB 모델에 대한 두 가지의 상이한 접근을 통해 둘 다의 단백질에서 뉴클레오티드 (GDP) 결합 위치와는 다른 동일한 분자 타켓 위치가 존재한다는 것을 확인하였다.
상기 인실리코(In silico) 모델에 근거하여, 필요한 추정상의(putative) Ral 억제제를 디자인 및 구매 또는 합성하였다. 생세포(living cells)에서 추정상의(putative) GTPase 억제제를 평가하기 위하여 기능적 특징(Functional characterization)을 사용하였다. 두 개의 상호 보완적인 스크린은 분자 타겟 위치에 결합하여 Ral 활성을 억제하는 99개의 화합물을 결정하기 위하여 사용되었다. 두 분석은 생세포 내부로 약물 침투가 요구되는 어떤 관찰되는 기능 효과를 확신하기 위한 근거인 세포이다. 예를 들면, 도 1은 인간 폐암세포 라인의 성장에서, 본 발명에 따른 두 화합물, RBC8 및 RBC10의 복용-억제 활성을 나타낸다. Calu-6: 인간 폐 선암(adenocarcinoma). H157: 편평상피암(squamous cell carcinoma). H358: 세기관지암(bronchioalveolar carcinoma). Calu-3: 장액샘 근원(serous gland origin)의 사람 기도 상피 세포 라인(human airway epithelial cell line). 88개의 스크린된 화합물을 표 1(스크리닝된 화합물의 화학구조)에 나타내었다.
연구 ID 구조
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실시예 2 - 추정상의 ( putative ) Ral GRPase 억제제의 합성
본 발명에 따른 특정 일실시예가 하기 합성 스킴에 나타나 있다.
스킴 1 화학식 1과 관련된 화합물의 일반적인 준비 경로
Figure pct00097

스킴 2 화학식 2와 관련된 화합물의 일반적인 준비 경로
Figure pct00098
실시예의 화학적 합성:
일반적인 절차 A; 3- 메틸 -1- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E1 :
에탄올 (130 mL)에 용해된 에틸 아세토아세테이트 (9.02 mL, 71.2 mmol, 1.1 equ.) 용액을 0℃에서 페닐-하이드라진 (7.00 g, 64.7 mmol, 1.0 equ.)으로 처리하였다. 상기 반응 혼합물의 온도를 상온으로 맞춘 다음, 60℃로 가열하였다(3h). 용매는 진공 내에서 제거하고 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헥산; 1:1)를 통해 정제하여 3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (7.60 g, 43.6 mmol, 67%)을 연한 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.87-7.85 (d, 2H), 7.41-7.37 (t, 2H), 7.19-7.16 (t, 1H), 3.42 (s, 2H), 2.19 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 170.5, 156.2, 138.0, 128.8, 125.0, 118.8, 43.0, 17.0; LC/MS-MS: 175.0 → 77.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 56, CE = 25, CXP = 4, tR = 3.52 min.
1,3-디메틸-1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E2 : '일반적인 절차 A'에 따라; 에탄올 (200 mL)에 용해된 에틸 아세토아세테이트 (15.1 mL, 119 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진 (5.00 g, 109 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 결정화(DCM 및 n-헥산)에 의한 정제를 통해 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (8.02 g, 71.5 mmol, 66%)을 흰색 고체형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 3.25 (s, 3H), 3.16 (s, 2H), 2.08 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 172.2, 155.4, 138.0, 41.3, 31.0, 16.8.
1- 메틸 -3- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E3 : '일반적인 절차 A'에 따라; 에탄올 (180 mL)에 용해된 에틸 벤조일아세테이트 (18.4 mL, 95.5 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진 (4.57 mL, 86.8 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 결정화(에탄올)에 의한 정제를 통해 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (11.0 g 63.1 mmol, 73%)을 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.67-7.65 (m, 2H), 7.42-7.41 (m, 3H), 3.60 (s, 2H), 3.41 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 171.8, 154.2, 131.0, 130.3, 128.8, 125.6, 37.9, 31.4. LC/MS-MS: 175.0 → 77.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 43, CXP = 4, tR = 3.45 min.
1,3- 디페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E4 : '일반적인 절차 A'에 따라; 에탄올 (130 mL)에 용해된 에틸 벤조일아세테이트 (12.2 mL, 71.2 mmol, 1.1 equ.)에 페닐하이드라진 (7.00 g, 71.2 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트; 4:1) 및 결정화(에탄올)에 의한 정제를 통해 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (6.75 g, 28.6 mmol, 44%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 11.84 (s, 1H), 7.84-7.82 (d, 4H), 7.50-7.40 (m, 4H), 7.34-7.27 (m, 2H), 6.02 (s, 1H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 154.2, 150.0, 139.3, 133.8, 129.3, 129.0,128.2, 126.1, 125.5, 121.5, 85.5; LC/MS-MS: 237.0 → 77.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 81, CE = 68, CXP = 4, tR = 4.15 min.
1-벤질-3- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E5 : 에탄올 (60 mL)에 용해된 에틸 벤조일아세테이트 (4.80 mL, 28.2 mmol, 1.1 equ.) 용액에 벤질하이드라진 (5.00 g, 25.6 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리하였다. 반응 혼합물을 상온까지 온도를 올린 후, 60℃로 가열하였다(16h). 반응 혼합물을 농축하고 에탄올 (100 mL)을 사용하여 희석시킨 후 3.0 g의 나트륨 에톡시드(sodium ethoxide)를 첨가하고 교반하였다(40h). 고체를 필터하고 용매를 진공을 통해 제거하였다. 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (4:1 n-헥산:에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 1-벤질-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (0.255 g,1.02 mmol, 4%)을 연한 오렌지 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 11.17 (s, 1H), 7.71-7.70 (d, 2H), 7.37-7.31 (m, 4H), 7.27-7.20 (m, 4H), 5.85 (s, 1H), 5.13 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 153.6, 148.6, 138.3, 134.4, 128.8, 128.8,127.6, 127.6, 125.1, 83.7, 50.0; LC/MS-MS: 251.1 → 91.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 2, CE = 33, CXP = 14, tR = 4.01 min.
3-(3,4- 디메톡시페닐 )-1- 메틸 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E6 : '일반적인 절차 A'를 사용하여; 에탄올 (60 mL)에 용해된 에틸 3,4-디메톡시벤조일아세테이트 (5.00 g, 19.8 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진 (0.95 mL,19.8 mmol, 1.0 equiv.)을 0℃에서 처리한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트; 4:1 내지 1:1)를 통해 정제하여 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (1.86 g, 7.94 mmol, 44 %)을 연한 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.35-7.35 (d, 1H), 7.06-7.04 (dd, 1H), 6.87-6.85 (d, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.39 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 171.6, 154.1, 151.1, 149.4, 124.1, 119.6, 110.7, 107.3, 55.9, 55.9, 38.0, 31.3; LC/MS-MS: 235.1 → 219.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 33, CXP = 14, tR = 3.26 min.
3-(3,4- 디메톡시페닐 )-1- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E7 : '일반적인 절차 A'를 사용하여; 에탄올 (60 mL)에 용해된 에틸 3,4-디메톡시벤조일아세테이트 (3.00 g, 11.9 mmol, 1.1 equ.)에 페닐하이드라진 (1.17 mL,10.8 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 결정화(에탄올)를 통해 정제하여 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (920 mg, 2.32 mmol, 22%)을 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 8.00-7.97 (d, 1H), 7.48-7.42 (m, 3H), 7.25-7.21 (t, 1H), 7.17-7.14 (dd, 1 H), 6.91-6.89 (d, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.83 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 170.1, 154.4, 151.4, 149.4, 138.1, 128.8, 125.2, 123.8, 120.1, 119.1, 110.7, 107.6, 56.0, 56.0, 39.7; LC/MS-MS: 297.0 → 218.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 96, CE = 37, CXP = 18, tR = 3.98 min.
3-(4- 메톡시페닐 )-1- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E8 : '일반적인 절차 A'를 사용하여; 에탄올 (100 mL)에 용해된 에틸-4-메톡시벤조일아세테이트 (7.00 g, 27.8 mmol, 1.1 equ.)에 페닐하이드라진 (2.50 mL, 25.3 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 결정화(에탄올)을 통해 정제하여 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (5.21 g, 19.6 mmol, 78%)을 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.99-7.97 (d, 1H), 7.66-7.64 (d, 2H), 7.44-7.40 (t, 2H), 7.22-7.18 (t, 1H), 6.94-6.92 (d, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 170.1, 161.5, 154.4, 138.2, 128.8, 127.5, 125.0, 123.5, 118.8, 114.2, 55.3, 39.6; LC/MS-MS: 267.0 → 77.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 81, CE = 65, CXP = 4, tR = 4.15 min.
3-(4- 메톡시페닐 )-1- 메틸 -1H- 피라졸 -5(4H)-온 UC - E9 : '일반적인 절차 A'를 사용하여;
에탄올 (100 mL)에 용해된 에틸-4-메톡시벤조일아세테이트 (7.00 g, 27.8 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진(1.30 mL, 25.2 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 에탄올을 사용한 결정화를 통해 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (3.00 g, 14.7 mmol, 58%)을 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 10.94 (s, 1H), 7.63-7.60 (d, 2H), 6.92-6.90 (d, 2H), 5.70 (s, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.54 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 161.1, 153.4, 147.9, 126.3, 114.6, 114.4, 83.1, 59.7, 31.3; LC/MS-MS: 205.0 → 190.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 51, CE = 29, CXP = 12, tR = 3.44 min.
6-아미노-3- 메틸 -1,4- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이 트릴 UC - E10 : 무수 DCM (60 mL)에 용해된 벤즈알데하이드(290 μL, 2.87 mmol), 말로노나이트릴(190 mg, 2.87 mmol) 및 3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol)의 교반된 용액에 무수 Na2SO4 (407 mg, 2.87 mmol) 및 에틸하이드로쿠프레인 하이드로클로라이드 (46 mg, 0.122 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 교반하였다(25h). 필터하고 DCM을 사용하여 세척한 후, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조 혼합물을 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트; 1:1)를 통해 6-아미노-3-메틸-1,4-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (270 mg, 0.822 mmol, 29%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.69-7.66 (d, 2H), 7.50-7.46 (t, 2H), 7.39-7.26 (m, 6H), 4.68 (s, 1H), 4.67 (s, 2H), 1.91 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 158.1, 146.4, 143.8, 141.9, 137.5, 129.2, 128.8, 127.8, 127.5, 126.7, 121.2, 119.0, 98.3, 64.0, 37.4, 12.8; LC/MS-MS: 329.1 → 263.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 56, CE = 31, CXP = 18, tR = 4.18 min.
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-3- 메틸 -1- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피 라졸-5- 카보나이트릴 UC - E11 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (356 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)의 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 침전물을 필터하고 에탄올을 사용하여 재-결정화하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-3-메틸-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (85.0 mg, 0.245 mmol, 9%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.68-7.66 (d, 2H), 7.50-7.46 (t, 2H), 7.34-7.32 (t, 1H), 7.28-7.22 (m, 2H) 7.08-7.04 (t, 2H), 4.68 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 158.0, 146.2, 143.7, 137.8, 137.5, 129.4, 129.2, 126.8, 121.2, 118.8, 115.8, 115.6, 98.1, 63.8, 36.7, 12.8; LC/MS-MS: 347.1 → 281.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 11, CE = 31, CXP = 18, tR = 4.16 min.
6-아미노-1,3-디메틸-4- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이 트릴 UC - E12 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)의 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (322 mg, 2.87 mmol, 1 equiv.)를 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고 에탄올 및 헥산을 사용하여 세척하였다. 원료(crude material)를 SiO2 컬럼 크로마토그래피 (n-헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트) 및 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 정제하여 6-아미노-1,3-디메틸-4-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (263 mg, 0.988 mmol, 34%)을 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.34-7.32 (m, 2H), 7.25-7.23 (t, 1H), 7.19-7.17 (d, 2H), 7.05 (s, 2H), 4.57 (s, 1H), 3.60 (s, 3H), 1.66 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.9, 144.6, 144.4, 142.9, 128.8, 128.0, 127.3, 120.6, 96.5, 58.7, 37.5, 33.8, 12.8; LC/MS-MS: 267.0 → 201.3 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 29, CXP = 12, tR = 3.74 min.
6-아미노-1- 메틸 -3,4- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이 트릴 UC - E13 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)로 구성된 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 21시간 후 반응 혼합물을 농축한 후, 에탄올 및 헥산을 사용하여 세척하고; 에탄올을 사용한 재-결정화한 후, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-1-메틸-3,4-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (282 mg, 8.58 mmol, 30%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.41-7.38 (m, 2H), 7.28-7.24 (m, 2H), 7.21-7.18 (m, 6H), 4.88 (s, 1H), 4.77 (s, 2 H), 3.83 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 158.1, 146.0, 144.8, 144.6, 133.2, 128.7, 128.5, 127.9, 127.8, 127.1, 126.4, 120.5, 95.7, 59.9, 38.2, 34.5; LC/MS-MS: 329.1 → 263.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 31, CXP = 18, tR = 4.00 min.
6-아미노-1,3,4- 트리페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트 릴 UC - E14 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)의 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (678 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 침전물을 필터한 후, 에탄올 및 헥산으로 세척하고, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-1,3,4-트리페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (330 mg, 0.845 mmol, 29%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.82-7.80 (d, 2H), 7.55-7.50 (m, 4H), 7.41-7.37 (t, 1H), 7.32-7.22 (m, 8H), 4.96 (s, 1H), 4.68 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 157.5, 147.7, 144.9, 142.6, 137.5, 132.2, 129.3, 128.8, 128.2, 128.2, 127.5, 127.4, 127.1, 126.9, 121.6, 118.9, 97.5, 64.8, 38.2; LC/MS-MS: 391.1 → 325.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 91, CE = 33, CXP = 22, tR = 4.33 min.
6-아미노-3-(4- 메톡시페닐 )-1,4- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5-카 보나이트 릴 UC - E15 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)의 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (764 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용하여 재-결정화하고, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-3-(4-메톡시페닐)-1,4-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (695 mg, 1.65 mmol, 58%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.94-7.92 (d, 2H), 7.58-7.53 (m, 2H), 7.41-7.37 (t, 1H), 7.27-7.16 (m, 7H), 6.83-6.81 (d, 2H), 5.04 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.5, 159.0, 146.6, 145.6, 144.5, 137.9, 129.8, 128.9, 128.3, 128.0, 127.3, 127.1, 125.1, 121.1, 120.3, 114.1, 97.5, 59.8, 55.5, 37.9; LC/MS-MS: 421.2 → 355.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 33, CXP = 24, tR = 4.28 min.
6-아미노-3-(4- 메톡시페닐 )-1- 메틸 -4- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 UC - E16 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)의 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (583 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하였다. 원료를 컬럼 크로마토그래피(헥산 내 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 하고, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-4-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (80.9 mg, 8%, 0.226 mmol)를 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.42-7.40 (d, 2H), 7.23-7.21 (m, 2H), 7.15-7.13 (d, 3H), 7.06 (s, 1H), 6.77-6.75 (d, 2H), 4.93 (s, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.1, 159.0, 145.9, 144.8, 144.5, 128.8, 127.8, 127.7, 127.1, 125.8, 120.5, 113.9, 95.0, 59.9, 55.4, 38.2, 34.4; LC/MS-MS: 359.1 → 293.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 76, CE = 31, CXP = 20, tR = 3.96 min.
6-아미노-3-(3,4- 디메톡시페닐 )-1- 메틸 -4- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c] 피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E17 : 에탄올 (5.0 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (145 μL, 1.44 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (90.0 mg, 1.44 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (200 μL, 1.44 mmol, 1.0 equ.)의 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (336 mg, 1.44 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하였다. 원료를 컬럼 크로마토그래피(헥산 내 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 하고, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-4-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (48.5 mg, 9%, 0.124 mmol)을 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.29-7.28 (d, 2H), 7.23-7.21 (d, 2H), 7.00-6.98 (d, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.72-6.70 (d, 2H), 4.84 (s, 1H), 4.75 (s, 2H), 3.82 (s, 6H), 3.60 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 157.6, 148.7, 148.6, 146.1, 145.7, 143.1, 128.9, 127.5, 127.4, 125.6, 119.3, 119.3, 110.9, 109.7, 94.7, 64.4, 55.7, 55.6, 38.3, 34.1; LC/MS-MS: 389.1 → 323.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 31, CXP = 22, tR = 3.82 min.
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-1,3- 디메틸 -1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E18 : 에탄올 (8.0 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 mL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (322 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올로 재-결정화하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1,3-디메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (335 mg, 41%, 1.17 mmol)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.23-7.20 (m, 2H), 7.16-7.12 (m, 2H), 7.07 (s, 2H), 4.61 (s, 1H), 3.60 (s, 3H), 1.67 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.7, 159.9, 144.6, 142.9, 140.7, 129.9, 120.6, 115.6, 115.4, 96.3, 59.6, 56.4, 36.7, 33.8, 12.8; LC/MS-MS: 285.1 → 219.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 27, CXP = 14, tR = 3.80 min.
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E19 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 20시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올로 재-결정화하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (182 mg, 0.525 mmol, 18%)를 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.50-7.48 (d, 2H), 7.22-7.18 (m, 5H), 7.11 (s, 2H), 7.05-6.98 (t, 2H) 5.04 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.5, 159.1, 146.0, 144.6, 140.9, 133.1, 129.8, 128.5, 127.9, 126.5, 120.4, 115.5, 115.3, 95.5, 59.7, 37.4, 34.5; LC/MS-MS: 347.1 → 281.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 31, CXP = 14, tR = 4.00 min.
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-1,3- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 UC - E20 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (678 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 필터하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올로 재-결정화하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1,3-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (240 mg, 0.588 mmol, 20%)를 흰색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.94-7.92 (d, 2H), 7.61-7.55 (m, 4H), 7.42-7.38 (t, 1H), 7.28-7.24 (m, 7H), 7.06-7.02 (t, 2H), 5.15 (s, 1H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.6, 159.0, 146.8, 145.6, 140.6, 137.8, 132.5, 130.0, 129.9, 129.8, 128.6, 128.6, 127.3, 127.0, 121.3, 120.2, 115.6, 115.4, 97.9, 59.6, 37.0; LC/MS-MS: 410.4 → 242.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 21, CE = 47, CXP = 16, tR = 4.63 min.
6-아미노-3-(3,4- 디메톡시페닐 )-4-(4- 플루오로페닐 )-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 UC - E21 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (672 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 필터하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올로 재-결정화하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1,3-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (782 mg, 1.93 mmol, 67%)를 흰색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.20-7.18 (m, 2H), 7.09-7.03 (m, 5H), 6.96-6.95 (d, 1H), 6.80-6.78 (d, 2H), 5.02 (s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.62 (s, 3H) 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.6, 159.0, 148.7, 146.0, 144.6, 141.0, 141.0, 129.8, 129.7, 125.9, 120.4, 119.0, 115.7, 115.4, 111.8, 109.8, 94.7, 55.8, 55.7, 37.3, 34.4; LC/MS-MS: 407.1 → 341.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 33, CXP = 22, tR = 3.86 min.
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-3-(4-메톡시 페닐 )-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 UC - E22 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (764 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 필터하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (800 mg, 1.83 mmol, 64%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.93-7.91 (d, 2H), 7.55-7.53 (m, 4H), 7.41-7.37 (t, 1H), 7.26-7.23 (m, 4H), 7.07-7.05 (t, 2H), 6.84-6.82 (d, 2H), 5.11 (s, 1H), 3.72 (s, 3H) 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.6, 159.6, 159.0, 146.6, 145.5, 140.7, 140.6, 137.9, 130.0, 129.9, 129.8, 128.3, 127.1, 125.0, 121.1, 120.2, 115.6, 115.4, 114.1, 97.3, 59.6, 55.5, 37.0; LC/MS-MS: 439.2 → 373.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 35, CXP = 24, tR = 4.28 min.
6-아미노-3-(3,4- 디메톡시페닐 )-4-(4- 플루오로페닐 )-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 UC - E23 : 에탄올 (3.0 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (70.0 μL, 0.675 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (45.0 mg, 0.675 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (90.0 μL, 0.675 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (200 mg, 0.675 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 원료를 컬럼 크로마토그래피(헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하였다. 노란색 고체를 에탄올을 사용한 재-결정화로 더 정제하여 6-아미노-3-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-플루오로페닐)-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (164 mg, 0.350 mmol, 12%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.80-7.78 (d, 2H), 7.52-7.48 (t, 2H), 7.38-7.35 (t, 1H), 7.25-7.21 (m, 2H), 7.05-6.95 (m, 4H), 6.75-6.73 (d, 1H), 4.91 (s, 1H), 4.84 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 163.2, 157.8, 149.2, 148.7, 147.5, 144.9, 138.6, 137.4, 129.3, 129.1, 129.0, 127.1, 125.0, 121.5, 119.8, 119.0, 115.9, 115.7, 110.8, 109.9, 96.6, 64.0, 55.8, 55.7, 37.5; LC/MS-MS: 469.3 → 403.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 6, CE = 35, CXP = 26, tR = 4.16 min.
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-3-(4-메톡시 페닐 )-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 UC - E24 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (586 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 침전물을 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용하여 재-결정화하고, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (350 mg, 0.930 mmol, 32%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.43-7.40 (d, 2H), 7.20-7.16 (m, 2H), 7.10 (s, 2H), 7.06-7.02 (t, 2H), 6.78-6.76 (d, 2H), 4.99 (s, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.5, 159.1, 145.8, 144.6, 141.0, 141.0, 129.8, 129.7, 127.8, 125.7, 120.5, 115.6, 115.4, 113.9, 94.9, 59.7, 55.4, 3 7.4, 34.4; LC/MS-MS: 377.1 → 311.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 33, CXP = 20, tR = 3.98 min.
6-아미노-4-(4-메톡시 페닐 )-3-메틸-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E25 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물을 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 통한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (800 mg, 78%, 2.23 mmol)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.80-7.78 (d, 2H), 7.51-7.47 (t, 2H), 7.32-7.28 (t, 1H), 7.18-7.16 (m, 4H), 6.91-6.89 (d, 2H), 4.62 (s, 1H), 3.74 (s, 3H), 1.79 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.7, 158.6, 145.7, 144.2, 138.0, 136.0, 129.7, 129.2, 126.5, 120.5, 120.3, 114.3, 99.3, 59.0, 55.4, 36.4, 13.0; LC/MS-MS: 359.2 → 293.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 29, CXP = 20, tR = 4.14 min.
6-아미노-4-(4-메톡시 페닐 )-1,3- 디메틸 -1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E26 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (321 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 원료를 컬럼 크로마토그래피 (헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하였다. 노란색 고체를 에탄올 및 헥산으로 세척하고, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-1,3-디메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (370 mg, 1.25 mmol, 44%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.12-7.10 (d, 2H), 6.85-6.83 (d, 2H), 4.61 (s, 2H), 4.55 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 1.80 (s, 3H) 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 158.8, 157.9, 144.5, 144.4, 134.5, 128.8, 119.3, 114.0, 96.4, 64.2, 55.2, 36.7, 33.7, 12.7; LC/MS-MS: 297.0 → 231.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 27, CXP = 16, tR = 3.71 min.
6-아미노-4-(4-메톡시 페닐 )-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E27 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물을 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (210 mg, 20%, 0.586 mmol)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.50-7.48 (d, 2H), 7.21-7.17 (m, 3H), 7.05-7.02 (m, 4H), 6.76-6.74 (d, 2H), 4.91 (s, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 158.9, 158.3, 146.0, 144.6, 136.9, 133.2, 128.9, 128.5, 127.8, 126.4, 120.6, 114.1, 95.9, 60.3, 55.3, 37.5, 34.5; LC/MS-MS: 359.2 → 293.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 29, CXP = 20, tR = 3.98 min.
6-아미노-4-(4- 메톡시페닐 )-1- 메틸 -3- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 UC - E28 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (678 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물을 에탄올 및 헥산으로 세척하였다. 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (1.05 g, 87%, 2.50 mmol)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.94-7.92 (d, 2H), 7.63-7.61 (d, 2H), 7.57-7.53 (t, 2H), 7.40-7.36 (t, 1H), 7.29-7.23 (m, 3H) 7.15 (s, 2H), 7.13-7.11 (d, 2H), 6.78-6.76 (d, 2H), 5.02 (s, 1H), 3.65 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 158.9, 158.4, 146.7, 145.6, 137.9, 136.5, 132.6, 129.8, 129.0, 128.7, 128.5, 127.2, 127.0, 121.2, 120.3, 114.2, 98.3, 60.2, 55.3, 37.1; LC/MS-MS: 421.2 → 355.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 81, CE = 35, CXP = 24, tR = 4.32 min.
6-아미노-3,4-비스(4-메톡시 페닐 )-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E29 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (764 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물을 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-3,4-비스(4-메톡시페닐)-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (1.06 g, 2.35 mmol, 82%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.93-7.91 (d, 2H), 7.56-7.52 (m, 4H), 7.38-7.35 (t, 1H), 7.15-7.11 (m, 4H), 6.83-6.78 (m, 4H), 4.98 (s, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.5, 158.9, 158.4, 146.6, 145.5, 137.9, 136.6, 129.8, 129.0, 128.3, 127.0, 125.2, 121.0, 120.4, 114.2, 114.1, 97.7, 60.3, 55.5, 55.3, 37.1; LC/MS-MS: 452.3 → 89.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 36, CE = 39, CXP = 4, tR = 3.47 min.
6-아미노-3,4-비스(4-메톡시 페닐 )-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 UC - E30 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (689 mg, 2.87 mmol, 1 equiv.)을 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물을 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-3,4-비스(4-메톡시페닐)-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (690 mg, 1.78 mmol, 62%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.42-7.40 (d, 2H), 7.05-7.03 (d, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.78-6.75 (dd, 4H), 4.86 (s, 1H), 3.73 (s, 3H), 3 .68 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.0, 158.9, 158.3, 145.9, 144.5, 136.9, 128.9, 127.7, 125.9, 120.6, 114.1, 113.9, 95.3, 60.3, 55.4, 55.3, 37.5, 34.3; LC/MS-MS: 389.2 → 323.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 29, CXP = 22, tR = 3.94 min.
Figure pct00099
일반적인 절차 A; 3- 메틸 -1- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: 에탄올 (130 mL)에 용해된 에틸 아세토아세테이트 (9.02 mL, 71.2 mmol, 1.1 equ.) 용액에 페닐-하이드라진 (7.00 g, 64.7 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리하였다. 반응 혼합물을 상온까지 온도를 올린 후, 60℃로 가열하였다(3h). 용매를 진공 내에서 제거하고 잔여물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헥산; 1:1)를 통해 정제하여 3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (7.60 g, 43.6 mmol, 67%)를 연한 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.87-7.85 (d, 2H), 7.41-7.37 (t, 2H), 7.19-7.16 (t, 1H), 3.42 (s, 2H), 2.19 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 170.5, 156.2, 138.0, 128.8, 125.0, 118.8, 43.0, 17.0; LC/MS-MS: 175.0 → 77.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 56, CE = 25, CXP = 4, tR = 3.52 min.
Figure pct00100
1,3-디메틸-1H- 피라졸 -5(4H)-온: '일반적인 절차 A’를 따라; 에탄올 (200 mL)에 용해된 에틸 아세토아세테이트 (15.1 mL, 119 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진 (5.00 g, 109 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 결정화 (DCM 및 n-헥산)를 통해 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (8.02 g, 71.5 mmol, 66%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 3.25 (s, 3H), 3.16 (s, 2H), 2.08 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 172.2, 155.4, 138.0, 41.3, 31.0, 16.8.
Figure pct00101
1- 메틸 -3- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: '일반적인 절차 A’를 따라; 에탄올 (180 mL)에 용해된 에틸 벤조일아세테이트 (18.4 mL, 95.5 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진 (4.57 mL, 86.8 mmol, 1.0 equ.)를 0℃에서 처리하고, 결정화(에탄올)를 통한 정제로 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (11.0 g 63.1 mmol, 73%)를 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.67-7.65 (m, 2H), 7.42-7.41 (m, 3H), 3.60 (s, 2H), 3.41 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 171.8, 154.2, 131.0, 130.3, 128.8, 125.6, 37.9, 31.4. LC/MS-MS: 175.0 → 77.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 43, CXP = 4, tR = 3.45 min.
Figure pct00102
1,3- 디페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: '일반적인 절차 A’를 따라; 에탄올 (130 mL)에 용해된 에틸 벤조일아세테이트 (12.2 mL, 71.2 mmol, 1.1 equ.)에 페닐하이드라진 (7.00 g, 71.2 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트; 4:1) 및 결정화(에탄올)를 통해 정제하여 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (6.75 g, 28.6 mmol, 44%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 11.84 (s, 1H), 7.84-7.82 (d, 4H), 7.50-7.40 (m, 4H), 7.34-7.27 (m, 2H), 6.02 (s, 1H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 154.2, 150.0, 139.3, 133.8, 129.3, 129.0,128.2, 126.1, 125.5, 121.5, 85.5; LC/MS-MS: 237.0 → 77.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 81, CE = 68, CXP = 4, tR = 4.15 min.
Figure pct00103
1-벤질-3- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: 에탄올 (60 mL)에 용해된 에틸 벤조일아세테이트 (4.80 mL, 28.2 mmol, 1.1 equ.) 용액에 벤질하이드라진 (5.00 g, 25.6 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리하였다. 혼합물은 천천히 상온까지 온도를 올린 후, 60℃로 가열하였다(16h). 반응 혼합물을 농축하고, 에탄올 (100 mL)을 사용하여 희석한 후, 3.0 g의 나트륨 에톡시드(sodium ethoxide)를 첨가하고, 교반하였다(40h). 고체를 필터한 후, 용매를 진공 내에서 제거하였다. 잔여물은 실리카겔 컬럼 그로마토그래피(4:1 n-헥산:에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 1-벤질-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (0.255 g,1.02 mmol, 4%)를 연한 오렌지 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 11.17 (s, 1H), 7.71-7.70 (d, 2H), 7.37-7.31 (m, 4H), 7.27-7.20 (m, 4H), 5.85 (s, 1H), 5.13 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 153.6, 148.6, 138.3, 134.4, 128.8, 128.8,127.6, 127.6, 125.1, 83.7, 50.0; LC/MS-MS: 251.1 → 91.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 2, CE = 33, CXP = 14, tR = 4.01 min.
Figure pct00104
3-(3,4- 디메톡시페닐 )-1- 메틸 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: '일반적인 절차 A’를 사용하여; 에탄올 (60 mL)에 용해된 에틸 3,4-디메톡시벤조일아세테이트 (5.00 g, 19.8 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진 (0.95 mL,19.8 mmol, 1.0 equiv.)을 0℃에서 처리한 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트; 4:1 내지 1:1)를 통해 정제하여 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (1.86 g, 7.94 mmol, 44 %)을 연한 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.35-7.35 (d, 1H), 7.06-7.04 (dd, 1H), 6.87-6.85 (d, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.39 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 171.6, 154.1, 151.1, 149.4, 124.1, 119.6, 110.7, 107.3, 55.9, 55.9, 38.0, 31.3; LC/MS-MS: 235.1 → 219.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 33, CXP = 14, tR = 3.26 min.
Figure pct00105
3-(3,4- 디메톡시페닐 )-1- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: '일반적인 절차 A’를 따라; 에탄올 (60 mL)에 용해된 에틸 3,4-디메톡시벤조일아세테이트 (3.00 g, 11.9 mmol, 1.1 equ.)에 페닐하이드라진 (1.17 mL,10.8 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 결정화(에탄올)를 통해 정제하여 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (920 mg, 2.32 mmol, 22%)을 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 8.00-7.97 (d, 1H), 7.48-7.42 (m, 3H), 7.25-7.21 (t, 1H), 7.17-7.14 (dd, 1 H), 6.91-6.89 (d, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.83 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 170.1, 154.4, 151.4, 149.4, 138.1, 128.8, 125.2, 123.8, 120.1, 119.1, 110.7, 107.6, 56.0, 56.0, 39.7; LC/MS-MS: 297.0 → 218.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 96, CE = 37, CXP = 18, tR = 3.98 min.
Figure pct00106
3-(4- 메톡시페닐 )-1- 페닐 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: '일반적인 절차 A’를 사용하여; 에탄올 (100 mL)에 용해된 에틸-4-메톡시벤조일아세테이트 (7.00 g, 27.8 mmol, 1.1 equ.)에 페닐하이드라진 (2.50 mL, 25.3 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 결정화(에탄올)를 통해 정제하여 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (5.21 g, 19.6 mmol, 78%)을 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.99-7.97 (d, 1H), 7.66-7.64 (d, 2H), 7.44-7.40 (t, 2H), 7.22-7.18 (t, 1H), 6.94-6.92 (d, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 170.1, 161.5, 154.4, 138.2, 128.8, 127.5, 125.0, 123.5, 118.8, 114.2, 55.3, 39.6; LC/MS-MS: 267.0 → 77.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 81, CE = 65, CXP = 4, tR = 4.15 min.
Figure pct00107
3-(4- 메톡시페닐 )-1- 메틸 -1H- 피라졸 -5(4H)-온: '일반적인 절차 A’를 사용하여; 에탄올 (100 mL)에 용해된 에틸-4-메톡시벤조일아세테이트 (7.00 g, 27.8 mmol, 1.1 equ.)에 메틸하이드라진 (1.30 mL, 25.2 mmol, 1.0 equ.)을 0℃에서 처리한 후, 에탄올을 사용한 결정화를 통해 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (3.00 g, 14.7 mmol, 58%)을 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 10.94 (s, 1H), 7.63-7.60 (d, 2H), 6.92-6.90 (d, 2H), 5.70 (s, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.54 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 161.1, 153.4, 147.9, 126.3, 114.6, 114.4, 83.1, 59.7, 31.3; LC/MS-MS: 205.0 → 190.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 51, CE = 29, CXP = 12, tR = 3.44 min.
Figure pct00108
6-아미노-3- 메틸 -1,4- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이 트릴: 무수 DCM (60 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol) 및 3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol)이 교반된 용액에 무수 Na2SO4 (407 mg, 2.87 mmol) 및 에틸하이드로쿠프레인 하이드로클로라이드 (46 mg, 0.122 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 교반하였다(25h). 필터하고 DCM으로 세척한 후, 용매를 감압 내에서 제거하였다. 조 혼합물을 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트; 1:1)를 통해 6-아미노-3-메틸-1,4-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (270 mg, 0.822 mmol, 29%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.69-7.66 (d, 2H), 7.50-7.46 (t, 2H), 7.39-7.26 (m, 6H), 4.68 (s, 1H), 4.67 (s, 2H), 1.91 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 158.1, 146.4, 143.8, 141.9, 137.5, 129.2, 128.8, 127.8, 127.5, 126.7, 121.2, 119.0, 98.3, 64.0, 37.4, 12.8; LC/MS-MS: 329.1 → 263.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 56, CE = 31, CXP = 18, tR = 4.18 min.
Figure pct00109
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-3- 메틸 -1- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (356 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 침전물을 필터하고 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-3-메틸-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (85.0 mg, 0.245 mmol, 9%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.68-7.66 (d, 2H), 7.50-7.46 (t, 2H), 7.34-7.32 (t, 1H), 7.28-7.22 (m, 2H) 7.08-7.04 (t, 2H), 4.68 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 158.0, 146.2, 143.7, 137.8, 137.5, 129.4, 129.2, 126.8, 121.2, 118.8, 115.8, 115.6, 98.1, 63.8, 36.7, 12.8; LC/MS-MS: 347.1 → 281.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 11, CE = 31, CXP = 18, tR = 4.16 min.
Figure pct00110
6-아미노-1,3-디메틸-4- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이 트릴: 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (322 mg, 2.87 mmol, 1 equiv.)을 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 에탄올 및 헥산으로 세척하였다. 원료를 SiO2 컬럼 크로마토그래피 (n-헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트) 및 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 정제하여 6-아미노-1,3-디메틸-4-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (263 mg, 0.988 mmol, 34%)을 노란색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.34-7.32 (m, 2H), 7.25-7.23 (t, 1H), 7.19-7.17 (d, 2H), 7.05 (s, 2H), 4.57 (s, 1H), 3.60 (s, 3H), 1.66 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.9, 144.6, 144.4, 142.9, 128.8, 128.0, 127.3, 120.6, 96.5, 58.7, 37.5, 33.8, 12.8; LC/MS-MS: 267.0 → 201.3 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 29, CXP = 12, tR = 3.74 min.
Figure pct00111
6-아미노-1- 메틸 -3,4- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5- 카보나이 트릴: 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 21시간 후 반응 혼합물을 농축하고 에탄올 및 헥산으로 세척한 후; 에탄올을 사용한 재-결정화를 하고, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-1-메틸-3,4-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (282 mg, 8.58 mmol, 30%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.41-7.38 (m, 2H), 7.28-7.24 (m, 2H), 7.21-7.18 (m, 6H), 4.88 (s, 1H), 4.77 (s, 2 H), 3.83 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 158.1, 146.0, 144.8, 144.6, 133.2, 128.7, 128.5, 127.9, 127.8, 127.1, 126.4, 120.5, 95.7, 59.9, 38.2, 34.5; LC/MS-MS: 329.1 → 263.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 31, CXP = 18, tR = 4.00 min.
Figure pct00112
6-아미노-1,3,4- tri페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라졸 -5-카보나이트릴: 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (678 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 침전물을 필터하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 하여 6-아미노-1,3,4-tri페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (330 mg, 0.845 mmol, 29%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.82-7.80 (d, 2H), 7.55-7.50 (m, 4H), 7.41-7.37 (t, 1H), 7.32-7.22 (m, 8H), 4.96 (s, 1H), 4.68 (s, 2H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 157.5, 147.7, 144.9, 142.6, 137.5, 132.2, 129.3, 128.8, 128.2, 128.2, 127.5, 127.4, 127.1, 126.9, 121.6, 118.9, 97.5, 64.8, 38.2; LC/MS-MS: 391.1 → 325.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 91, CE = 33, CXP = 22, tR = 4.33 min.
Figure pct00113
6-아미노-3-(4- 메톡시페닐 )-1,4- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c] 피라졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (764 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 하고, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-3-(4-메톡시페닐)-1,4-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (695 mg, 1.65 mmol, 58%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.94-7.92 (d, 2H), 7.58-7.53 (m, 2H), 7.41-7.37 (t, 1H), 7.27-7.16 (m, 7H), 6.83-6.81 (d, 2H), 5.04 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.5, 159.0, 146.6, 145.6, 144.5, 137.9, 129.8, 128.9, 128.3, 128.0, 127.3, 127.1, 125.1, 121.1, 120.3, 114.1, 97.5, 59.8, 55.5, 37.9; LC/MS-MS: 421.2 → 355.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 33, CXP = 24, tR = 4.28 min.
Figure pct00114
6-아미노-3-(4- 메톡시페닐 )-1- 메틸 -4- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (290 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (583 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하였다. 원료를 컬럼 크로마토그래피 (헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)로 정제하고, 에탄올을 사용한 재-결정화를 한 후, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-4-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (80.9 mg, 8%, 0.226 mmol)를 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.42-7.40 (d, 2H), 7.23-7.21 (m, 2H), 7.15-7.13 (d, 3H), 7.06 (s, 1H), 6.77-6.75 (d, 2H), 4.93 (s, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.1, 159.0, 145.9, 144.8, 144.5, 128.8, 127.8, 127.7, 127.1, 125.8, 120.5, 113.9, 95.0, 59.9, 55.4, 38.2, 34.4; LC/MS-MS: 359.1 → 293.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 76, CE = 31, CXP = 20, tR = 3.96 min.
Figure pct00115
6-아미노-3-(3,4- 디메톡시페닐 )-1- 메틸 -4- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c] 피라졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (5.0 mL)에 용해된 벤즈알데하이드 (145 μL, 1.44 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (90.0 mg, 1.44 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (200 μL, 1.44 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (336 mg, 1.44 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하였다. 원료를 컬럼 크로마토그래피 (헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)로 정제하고, 에탄올을 사용한 재-결정화를 한 후, 헥산 및 에탄올로 세척하여6-아미노-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-4-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (48.5 mg, 9%, 0.124 mmol)을 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.29-7.28 (d, 2H), 7.23-7.21 (d, 2H), 7.00-6.98 (d, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.72-6.70 (d, 2H), 4.84 (s, 1H), 4.75 (s, 2H), 3.82 (s, 6H), 3.60 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 157.6, 148.7, 148.6, 146.1, 145.7, 143.1, 128.9, 127.5, 127.4, 125.6, 119.3, 119.3, 110.9, 109.7, 94.7, 64.4, 55.7, 55.6, 38.3, 34.1; LC/MS-MS: 389.1 → 323.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 31, CXP = 22, tR = 3.82 min.
Figure pct00116
6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1,3- 디메틸 -1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (8.0 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 mL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (322 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1,3-디메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (335 mg, 41%, 1.17 mmol)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.23-7.20 (m, 2H), 7.16-7.12 (m, 2H), 7.07 (s, 2H), 4.61 (s, 1H), 3.60 (s, 3H), 1.67 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.7, 159.9, 144.6, 142.9, 140.7, 129.9, 120.6, 115.6, 115.4, 96.3, 59.6, 56.4, 36.7, 33.8, 12.8; LC/MS-MS: 285.1 → 219.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 27, CXP = 14, tR = 3.80 min.
Figure pct00117
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-1- 메틸 -3- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피 라졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 20시간 후 반응 혼합물을 진공 내에서 농축하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (182 mg, 0.525 mmol, 18%)를 연한 노란색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.50-7.48 (d, 2H), 7.22-7.18 (m, 5H), 7.11 (s, 2H), 7.05-6.98 (t, 2H) 5.04 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.5, 159.1, 146.0, 144.6, 140.9, 133.1, 129.8, 128.5, 127.9, 126.5, 120.4, 115.5, 115.3, 95.5, 59.7, 37.4, 34.5; LC/MS-MS: 347.1 → 281.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 31, CXP = 14, tR = 4.00 min.
Figure pct00118
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-1,3- 디페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (678 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 필터하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용하여 재-결정화하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1,3-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (240 mg, 0.588 mmol, 20%)을 흰색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.94-7.92 (d, 2H), 7.61-7.55 (m, 4H), 7.42-7.38 (t, 1H), 7.28-7.24 (m, 7H), 7.06-7.02 (t, 2H), 5.15 (s, 1H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.6, 159.0, 146.8, 145.6, 140.6, 137.8, 132.5, 130.0, 129.9, 129.8, 128.6, 128.6, 127.3, 127.0, 121.3, 120.2, 115.6, 115.4, 97.9, 59.6, 37.0; LC/MS-MS: 410.4 → 242.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 21, CE = 47, CXP = 16, tR = 4.63 min.
Figure pct00119
6-아미노-3-(3,4- 디메톡시페닐 )-4-(4- 플루오로페닐 )-1- 메틸 -1,4- 디하이드로 피라노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (672 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 생성된 침전물을 필터하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-1,3-디페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (782 mg, 1.93 mmol, 67%)를 흰색 파우더 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.20-7.18 (m, 2H), 7.09-7.03 (m, 5H), 6.96-6.95 (d, 1H), 6.80-6.78 (d, 2H), 5.02 (s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.62 (s, 3H) 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.6, 159.0, 148.7, 146.0, 144.6, 141.0, 141.0, 129.8, 129.7, 125.9, 120.4, 119.0, 115.7, 115.4, 111.8, 109.8, 94.7, 55.8, 55.7, 37.3, 34.4; LC/MS-MS: 407.1 → 341.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 33, CXP = 22, tR = 3.86 min.
Figure pct00120
6-아미노-4-(4- 플루오로페닐 )-3-(4- 메톡시페닐 )-1- 페닐 -1,4- 디하이드로피라 노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (764 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 생성된 침전물을 필터하고, 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (800 mg, 1.83 mmol, 64%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.93-7.91 (d, 2H), 7.55-7.53 (m, 4H), 7.41-7.37 (t, 1H), 7.26-7.23 (m, 4H), 7.07-7.05 (t, 2H), 6.84-6.82 (d, 2H), 5.11 (s, 1H), 3.72 (s, 3H) 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.6, 159.6, 159.0, 146.6, 145.5, 140.7, 140.6, 137.9, 130.0, 129.9, 129.8, 128.3, 127.1, 125.0, 121.1, 120.2, 115.6, 115.4, 114.1, 97.3, 59.6, 55.5, 37.0; LC/MS-MS: 439.2 → 373.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 35, CXP = 24, tR = 4.28 min.
Figure pct00121
6-아미노-3-(3,4- 디메톡시페닐 )-4-(4- 플루오로페닐 )-1- 페닐 -1,4- 디하이드로 피라노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 : 에탄올 (3.0 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (70.0 μL, 0.675 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (45.0 mg, 0.675 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (90.0 μL, 0.675 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(3,4-디메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (200 mg, 0.675 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 원료를 컬럼 크로마토그래피 (헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하였다. 노란색 고체는 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 더 정제하여 6-아미노-3-(3,4-디메톡시페닐)-4-(4-플루오로페닐)-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (164 mg, 0.350 mmol, 12%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.80-7.78 (d, 2H), 7.52-7.48 (t, 2H), 7.38-7.35 (t, 1H), 7.25-7.21 (m, 2H), 7.05-6.95 (m, 4H), 6.75-6.73 (d, 1H), 4.91 (s, 1H), 4.84 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.71 (s, 3H),13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 163.2, 157.8, 149.2, 148.7, 147.5, 144.9, 138.6, 137.4, 129.3, 129.1, 129.0, 127.1, 125.0, 121.5, 119.8, 119.0, 115.9, 115.7, 110.8, 109.9, 96.6, 64.0, 55.8, 55.7, 37.5; LC/MS-MS: 469.3 → 403.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 6, CE = 35, CXP = 26, tR = 4.16 min.
Figure pct00122
6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[ 2,3-c]피라졸 -5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 4-플루오로벤즈알데하이드 (300 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (586 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 19시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 침전물은 에탄올 및 헥산으로 세척하고, 에탄올을 사용하여 재-결정화한 후, 헥산 및 에탄올로 세척하여 6-아미노-4-(4-플루오로페닐)-3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (350 mg, 0.930 mmol, 32%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.43-7.40 (d, 2H), 7.20-7.16 (m, 2H), 7.10 (s, 2H), 7.06-7.02 (t, 2H), 6.78-6.76 (d, 2H), 4.99 (s, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 162.5, 159.1, 145.8, 144.6, 141.0, 141.0, 129.8, 129.7, 127.8, 125.7, 120.5, 115.6, 115.4, 113.9, 94.9, 59.7, 55.4, 3 7.4, 34.4; LC/MS-MS: 377.1 → 311.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 33, CXP = 20, tR = 3.98 min.
Figure pct00123
6-아미노-4-(4- 메톡시페닐 )-3- 메틸 -1- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)을 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물은 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (800 mg, 78%, 2.23 mmol)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.80-7.78 (d, 2H), 7.51-7.47 (t, 2H), 7.32-7.28 (t, 1H), 7.18-7.16 (m, 4H), 6.91-6.89 (d, 2H), 4.62 (s, 1H), 3.74 (s, 3H), 1.79 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.7, 158.6, 145.7, 144.2, 138.0, 136.0, 129.7, 129.2, 126.5, 120.5, 120.3, 114.3, 99.3, 59.0, 55.4, 36.4, 13.0; LC/MS-MS: 359.2 → 293.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 71, CE = 29, CXP = 20, tR = 4.14 min.
Figure pct00124
6-아미노-4-(4- 메톡시페닐 )-1,3-디메틸-1,4- 디하이드로피라노[2,3-c] 피라졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (321 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 원료는 컬럼 크로마토그래피 (헥산에 용해된 25% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하였다. 노란색 고체는 에탄올 및 헥산으로 세척하고, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-1,3-디메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (370 mg, 1.25 mmol, 44%)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) CDCl3: 7.12-7.10 (d, 2H), 6.85-6.83 (d, 2H), 4.61 (s, 2H), 4.55 (s, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 1.80 (s, 3H) 13C-NMR (100 MHz) CDCl3: 158.8, 157.9, 144.5, 144.4, 134.5, 128.8, 119.3, 114.0, 96.4, 64.2, 55.2, 36.7, 33.7, 12.7; LC/MS-MS: 297.0 → 231.2 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 61, CE = 27, CXP = 16, tR = 3.71 min.
Figure pct00125
6-아미노-4-(4- 메톡시페닐 )-1- 메틸 -3- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (500 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후반응 혼합물을 농축하고, 침전물은 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (210 mg, 20%, 0.586 mmol)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.50-7.48 (d, 2H), 7.21-7.17 (m, 3H), 7.05-7.02 (m, 4H), 6.76-6.74 (d, 2H), 4.91 (s, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 158.9, 158.3, 146.0, 144.6, 136.9, 133.2, 128.9, 128.5, 127.8, 126.4, 120.6, 114.1, 95.9, 60.3, 55.3, 37.5, 34.5; LC/MS-MS: 359.2 → 293.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 29, CXP = 20, tR = 3.98 min.
Figure pct00126
6-아미노-4-(4- 메톡시페닐 )-1- 메틸 -3- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 1,3-디페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (678 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물은 에탄올 및 헥산으로 세척하였다. 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-4-(4-메톡시페닐)-1-메틸-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (1.05 g, 87%, 2.50 mmol)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.94-7.92 (d, 2H), 7.63-7.61 (d, 2H), 7.57-7.53 (t, 2H), 7.40-7.36 (t, 1H), 7.29-7.23 (m, 3H) 7.15 (s, 2H), 7.13-7.11 (d, 2H), 6.78-6.76 (d, 2H), 5.02 (s, 1H), 3.65 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 158.9, 158.4, 146.7, 145.6, 137.9, 136.5, 132.6, 129.8, 129.0, 128.7, 128.5, 127.2, 127.0, 121.2, 120.3, 114.2, 98.3, 60.2, 55.3, 37.1; LC/MS-MS: 421.2 → 355.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 81, CE = 35, CXP = 24, tR = 4.32 min.
Figure pct00127
6-아미노-3,4- 비스 (4- 메톡시페닐 )-1- 페닐 -1,4- 디하이드로피라노[2,3-c]피라 졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.)을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-페닐-1H-피라졸-5(4H)-온 (764 mg, 2.87 mmol, 1 equ.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물은 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-3,4-비스(4-메톡시페닐)-1-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (1.06 g, 2.35 mmol, 82%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.93-7.91 (d, 2H), 7.56-7.52 (m, 4H), 7.38-7.35 (t, 1H), 7.15-7.11 (m, 4H), 6.83-6.78 (m, 4H), 4.98 (s, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.5, 158.9, 158.4, 146.6, 145.5, 137.9, 136.6, 129.8, 129.0, 128.3, 127.0, 125.2, 121.0, 120.4, 114.2, 114.1, 97.7, 60.3, 55.5, 55.3, 37.1; LC/MS-MS: 452.3 → 89.1 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 36, CE = 39, CXP = 4, tR = 3.47 min.
Figure pct00128
6-아미노-3,4-비스(4-메톡시페닐)-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5- 카보나이트릴 : 에탄올 (10 mL)에 용해된 아니스알데하이드 (350 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.), 말로노나이트릴 (190 mg, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 및 트리에틸아민 (400 μL, 2.87 mmol, 1.0 equ.) 혼합물을 1분 동안 교반한 후, 3-(4-메톡시페닐)-1-메틸-1H-피라졸-5(4H)-온 (689 mg, 2.87 mmol, 1 equiv.)를 첨가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 농축하고, 침전물은 에탄올 및 헥산으로 세척한 후, 에탄올을 사용한 재-결정화를 통해 6-아미노-3,4-비스(4-메톡시페닐)-1-메틸-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴 (690 mg, 1.78 mmol, 62%)를 흰색 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz) DMSO: 7.42-7.40 (d, 2H), 7.05-7.03 (d, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.78-6.75 (dd, 4H), 4.86 (s, 1H), 3.73 (s, 3H), 3 .68 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 13C-NMR (100 MHz) DMSO: 159.0, 158.9, 158.3, 145.9, 144.5, 136.9, 128.9, 127.7, 125.9, 120.6, 114.1, 113.9, 95.3, 60.3, 55.4, 55.3, 37.5, 34.3; LC/MS-MS: 389.2 → 323.0 m/z; GS1 및 GS2 at 30, DP = 66, CE = 29, CXP = 22, tR = 3.94 min.
실시예 3 - ELISA 스크린:
Elisa 스크린은 활성 (GTP-결합) 단백질이 RalA 또는 RalB와 함께 RalBP1로 복합체를 형성하는 표준 결합 원리에 기반을 두고 있다. ELISA 분석은 광범위하게 사용되는 Ral 활성 풀-다운 분석법으로부터 개작되었다(Cancer Res. 2005; 65: 7111-7120). 재조합 GST-His6-RalBP1 융합 단백질은 GST 친화에 의하여 박테리아로부터 정제되었고 His6 tag를 경유하여 금속-킬레이트 유도된 96-웰 마이크로판에 직접적으로 흡수되었다. FLAG-RalA 또는 FLAG-RalB를 발현하는, 안정적으로 감염된 UMUC3 세포 라인이 생성되었으며, 이는 이소성의(ectopic) 단백질이 Ral 활성을 위한 리포터(reporter)로서 기능을 하고, FLAG tag가 매우 민감하고 특정하게 단백질을 탐지하는 것을 가능하게끔 한다; 우리는 UMUC3에서 FLAG-Ral의 안정발현에 의존하였다. anti-FLAG 일차 항체 및 HRP-복합 anti-mouse 이차 항체를 전체 세포 용해물의 0.3에서부터 10 mcg 까지 단백질을 주입하는 것과 비례하는 신호와 함께 사용하는 로우버스트(robust) 신호대 잡음비(signal to noise ratio) (>100:1)는 분석을 위하여 회복될 수 있는, 충분한 양의 전체 세포 단백질을 갖는 96 웰 마이크로판에서 배양된 세포로부터 얻어졌다. 본 발명자들은 Ral GTPase 억제 활성을 위한 화합물을 스크린 하기 위하여 상기 분석을 사용하였다. 도 2는 본 발명에 따른 31 추정상의(putative) Ral GTPase 억제제를 위한 Elisa 스크리닝 데이터를 나타낸다. Ral GTPase 억제제 RBC10은 방광암 세포 라인 A549, H358, H460, H2009, SW1573, CRL2169, J82, KU7, MGHU4, LULU2, UMUC3에서 MEK 억제제인 AZD6244와 함께 Ral GTPase의 조합 테스트에 사용되었으며, 상승효과(synergistic efficacy)를 나타내었다. Ral GTPase 억제제 RBC10은 폐암 세포 라인 A549, H2009, H358, H460, SW1573에서 MEK 억제제인 AZD6244와 함께 Ral GTPase의 조합 테스트에 사용되었으며, 상승효과(synergistic efficacy)를 나타내었다. 그 후에, 본 발명에 따른 Ral GTPase 억제제 및 RalA GTPase 억제에 대한 용량 반응 곡선(dose response curves)이 결정되었다. 추가적으로, 상기 세포에서 세포 확장을 위한 용량 반응 곡선(dose response curves)을 포함하는 쥐의 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)에서 본 발명에 따른 Ral GTPase 억제제를 처리함으로써 세포 확장 분석(cell spreading assays)을 수행하였다. 체외(in vitro)에서 본 발명에 따른 4개의 Ral GTPase 억제제를 대장암 세포 WiDr, HT29, HCT116, HCT15, DLD1, 및 Caco-2에 처리하여 암세포의 생존을 테스트한 결과, 무처리군과 비교하여 억제제를 처리한 군에서는 암세포 성장이 주요하게 감소하는 것으로 나타났다. 비슷하게, 체외(in vitro)에서 본 발명에 따른 7개의 Ral GTPase 억제제를 췌장암 세포 BXPC3, HPAC, 및 MiaPACA2에 처리하여 암세포의 생존을 테스트한 결과, 무처리군과 비교하여 억제제를 처리한 군에서는 암세포 성장이 주요하게 감소하는 것으로 나타났다. 도 3은 본 발명에 따른 8개의 Ral GTPase 억제제에 대한 Ral 활성 풀-다운 분석의 결과를 나타낸다. 테스트한 각각의 약은 정기적인(regular) 10% J82 메디움(medium) 50um에서 두시간 동안 배양하였다. DMSO 처리 용해물은 평균 및 상기 평균에 대하여 계산된 % 처리(% control)인, 두 가지 풀다운(two pulldowns)을 위하여 사용되었다.
실시예 4 - ALPHA 스크린:
Alpha(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) 스크린은 본 발명에 따른 화합물의 Ral-GTPase 억제에 의하여 유발되는 Ral 단백질-단백질 상호작용의 중단을 측정하기 위하여 수행되었다. ALPHA 분석은 관심 물질(interest)중 하나의 분해 물질(analyte) (예를 들면, His-tagged BP1)과 결합하는 억셉터 비드(acceptor bead)와 관심 물질(interest)중 두 번째 분해 물질(analyte) (예를 들면, BP2)과 결합하는 도너 비드(donor bead)와 연관된다. 자극과 함께(With excitation), 도너 비드 내 감광제(photosensitizer)는 주변 산소(ambient oxygen)를 반응성이 있는 일중항 산소(singlet oxygen)로 전환한다. 도너 및 억셉터가 200nm 이내일 때, 일중항 산소 종들은 370nm에서 발하는 화학 발광의(chemiluminescent) 신호를 발생시키기 위하여 억셉터 비드 내 티옥센(thioxene) 화합물과 반응한다. 에너지는 즉시 동일한 억셉터 비드 내에 들어있으며, 방사 파장이 520-620nm로 효율적으로 이동하는 형광염료(fluorophores)로 전이된다. 도너 비드는 680nm에서 여기되고, 대략 억셉터 비드는 520 nm-620 nm의 범위에서 빛을 발할 것이다(GST-tagged BP2). 이러한 화학 발광의(chemiluminescent) 반응은 단백질의 배양에 의하여 즉시 측정될 수 있다. 화학 발광(Chemiluminescence)는 비드들이 매우 인접하여 테스트 되는 단백질들 사이에 단백질-단백질 상호작용이 온전할 때에만 관찰된다. 이러한 방법으로, 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물에 의하여 유발되는 Ral-BP1 → RalA 결합 중단이 평가되었다.
초기의 ALPHA 스크린은 본 발명에 따른 Ral GTPase 억제 화합물이 50μM 존재할 때 RalBP1-RalA 결합 억제를 측정하기 위하여 수행되었다(도 4). 그 후에, ALPHA 스크린은 마이크로 몰의 화합물 농도 범위 이상에서 본 발명에 따른 특정 Ral-GTPase 억제 화합물의 단백질 결합 억제를 측정하기 위한 투약-반응 방법(dose-response manner)으로 수행되었다(도 5).
실시예 5 - 체내( in vivo ) 약물 동력 평가:
본 발명에 따른 특정 Ral-GTPase 억제 화합물의 약물 동력을 쥐를 사용하여 평가하였다. 복강 내 주사(intraperitoneal injection) 또는 경구 투여를 하고, 몇 시간 동안 혈액 샘플을 수집한 후, 전파 시간(Time of Flight, TOF) 분광 분석(spectrometry)과 연결된 모세관에 의하여 약물 농도를 증가하였다. 세 가지의 테스트에 대한 모범적인 결과를 표 2(본 발명에 따른 화합물을 경구(PO) 또는 복강 내(intraperitoneal) 투여에 따른 약물 동력 파라미터)에 나타내었다:
화합물-
경로 		Cmax
(μM) 		tmax
( hr ) 		AUC 0 -t
( ng · mL -
1· hr ) 		AUC 0 -∞
( ng · mL -
1· hr ) 		t 1 /2
( hr ) 		Cl /F
( mL · hr -1)
RBC8 - IP 1.3 2 1964 2204 4.6 0.476
RBC10 - IP 23.4 1 30329 30540 3.7 0.033
RBC10 - PO 2.3 1 4752 5225 1.9 0.191
실시예 6 - 체외( in vitro ) 인간 암세포 성장 억제 평가:
본 발명에 따른 특정 Ral-GTPase 억제 화합물의 성장 억제 특성을 체외(in vitro)에서 평가하였다. 상이한 조직(different histologies) 및 K-Ras 돌연변이 상태(mutant status)와 함께 인간 암세포 라인에 본 발명에 따른 2가지의 Ral-GTPase 억제 화합물 1μM 농도를 체외(in vitro)에서 처리할 때, 성장 억제 정도를 평가하기 위하여 사용되었다(도 6).
실시예 7 - 체외( in vitro ) 인간 암세포에 대한 용량 반응 곡선:
상이한 K-Ras 돌연변이 상태(mutant status)와 함께 인간 폐암 세포 라인에서 본 발명에 따른 Ral-GTPase 억제 화합물의 마이크로 몰의 농도 범위 이상에서 체외(in vitro) 성장 억제효과를 평가하기 위하여 사용되었다(도 7A 및 7B).
실시예 8 - 세포 흡수 실험( cell uptake experiments ):
RBC8 및 RBC10의 체외(in vitro)에서 세포 흡수를 측정하기 위하여 H2122 세포를 1시간 이상 사용하였다. RBC8 및 RBC10 화합물은 독립적으로 (10μM)로 3회 복용되었고, 세포는 상이한 시간마다 고립되었다(1, 5, 15, 30 및 60 분). RBC8 및 RBC10의 농도는 LC/MS-MS 방법을 사용하여 결정되었다. 도 8A는 1시간 이상 RBC8의 세포 흡수를 나타낸다. 도 8B는 1시간 이상 RBC10의 세포 흡수를 나타낸다. 각 시간마다 n = 3 +/- SD.
실시예 9 - 약물 동력 데이터:
쥐에서 이종이식(xenografts)을 발현하기 위하여 H2122 세포를 사용하였다. RBC8 및 RBC10는 50 mg/kg IP에서 전달되었고, 조직 샘플은 1 및 2시간 접종 후(post inoculation) 수집되었다. RBC8 및 RBC10의 농도는 LC/MS-MS 방법을 사용하여 결정되었다. 도 9A는 Tmax에서 RBC8의 조직 농도를 나타낸다. 도 9B는 Tmax에서 RBC10의 조직 농도를 나타낸다. (혈장 데이터는 ng/ml. 조직 데이터를 적절하게 비교하기 위하여, 혈장 농도는 혈장 부피가 곱해져야 한다.)
실시예 10 - 체내( in vivo ) 효능 데이터:
군당 10마리의 누드 쥐에게 각각 200,000 H2122 인간 폐암 세포 중 하나를 접종하였다. 약물 처리는 IP 전달방식, 50 mg/kg/day로 주말을 제외하고 매일 접종하였다. 도 10A는 22일 동안 RBC8를 처리하였을 때 종양 부피를 나타낸다. 도 10B는 18일 동안 RBC10을 처리하였을 때 종양 부피를 나타낸다.
실시예 11 - 체내( in vivo ) Ral 억제 데이터 ( siRNA ):
군당 10마리의 누드 쥐에게 각각 200,000 H2122 인간 폐암 세포 중 하나를 접종하였다. 24시간 후, 세포에 RalA 및 RalB 둘 다 감소시키는 siRNA를 함께 처리하였다. 도 11은 20일 동안 처리 및 무처리 세포의 종양 부피를 나타낸다.
실시예 12 - 체내( in vivo ) Ral 억제 데이터 (본 발명에 따른 화합물):
인간 폐암 세포 라인 H2122이 암컷 누드 쥐의 피하 내에 접종하고 종양의 평균 크기가 200mm3에 도달할 때까지 성장하게끔 하였다. 상기 쥐에게 50mg/Kg의 RBC8, RBC10 또는 DMSO 처리를 단일 IP 방식으로 복용시켰다. 2h (RBC10) 또는 3h (RBC8) 주사 후, 이종이식 종양(Xenograft tumors)이 수집되었다. 종양 내 RalA 및 RalB는 RalBP1 아가로스(agarose) 비드를 사용한 풀-다운 분석에 의하여 측정되었으며, 전체 단백질로 정규화되었다. 도 12A는 RBC8 및 RBC10에 의하여 종양의 RalA 억제를 나타낸다. 도 12B는 RBC8 및 RBC10에 의하여 종양의 RalB 억제를 나타낸다.
본 발명에 따른 상기 예시들은 삽화(illustration) 및 서술(description)을 목적으로 나타내어졌다. 더욱이, 이러한 예시들은 본 명세서에서 밝혀진 형태의 발명을 제한하지 않는다. 결과적으로, 본 발명이 가르치는 내용, 관련된 문헌의 기술 또는 지식을 변화 및 변형하는 것은 본 발명의 범주에 속한다. 여기서 제공된 실시예에 서술된 특정 일실시예는 본 발명을 수행하기 위한 가장 바람직한 방식인 것임을 더 설명하기 위한 의도였으며, 해당 분야의 당업자가 본 발명에 따른 일실시예와 특정한 적용을 위하여 요구되는 다양한 변형 또는 이를 사용하기 위하여 본 발명을 이용할 수 있게 하였다. 첨부된 청구항은 다른 일실시예로부터 선행기술에 의하여 허용되는 정도를 포함하도록 해석되게끔 의도하였다.

Claims (21)

  1. Ral GTPase를 억제하는 화합물을 치료적으로 유효한 양으로 이를 필요로 하는 개인에게 투여하는 것을 포함하는 암을 예방, 치료, 개선 또는 암의 전이를 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 RalA 또는 RalB 중 적어도 어느 하나를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 RalGDP에는 결합하되, RalGTP에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00129

    (6-아미노-4-(2,5-디메톡시페닐)-3-(나프탈렌-2-일)-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴);
    Figure pct00130

    (11-(2-클로로페닐)-10-펜타노일-2,3,4,5,10,11-헥사하이드로-1H-디벤조[b,e][1,4]디아제핀-1-온);
    Figure pct00131

    (6-아미노-4-(3,5-디클로로-2-하이드록시페닐)-3-프로필-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보나이트릴);
    Figure pct00132

    (2-(6-(4-에틸페닐)-2-p-톨릴-2,3,4,5-테트라하이드로피리미딘-4-일)페놀);
    Figure pct00133

    (2-(2-(2-메톡시페닐)-6-(4-메톡시페닐)-2,3,4,5-테트라하이드로피리미딘-4-일)페놀), 및
    이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00134

    및
    이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염인 것을 특징으로 하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure pct00135

    (상기 화학식 1에서,
    n = 0 - 5이고;
    X, Y, Y', Z 및 Z'는 독립적으로 C, N, 또는 N-옥사이드이고;
    R1 - R9는 독립적으로 (X, Y 또는 Z가 C일 경우를 포함하여) 수소, 할로겐, -OH, -O-R10, C1-C24 알킬, C3-C24 알케닐, C4-C24 디에닐, C6-C24 트리에닐, C8-C24 테트라에닐, C6-C18 아릴, 치환된 C6-C18 아릴, C1-C14 알콕시, 카복시, 시아노, C1-C14 알카노일옥시, C1-C14 알킬싸이오, C1-C14 알킬설포닐, C2-C14 알콕시카보닐, C2-C14 알카노일아미노, S-R10, -SO2-R10, -NHSO2R10 및 -NHCO2R10으로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R10은 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C1-C6 알콕시, 할로겐, 및 C4-C20 하이드록시헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환기가 선택적으로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
    상기 헤테로원자는 황, 질소, 및 산소로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 및
    *은 카이랄 중심이다).
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염인 것을 특징으로 하는 방법:
    [화학식 2] [화학식 3]
    Figure pct00136

    (상기 화학식 2 또는 화학식 3에서,
    n = 0 - 5이고;
    A, B, M, 및 D는 독립적으로 C, N, 또는 N-옥사이드이고;
    R1, R2, R8, R9, R11, R12, R13은 독립적으로 (B, M 또는 D가 C일 경우를 포함하여) 수소, 할로겐, -OH, -O-R14, C1-C24 알킬, C3-C24 알케닐, C4-C24 디에닐, C6-C24 트리에닐, C8-C24 테트라에닐, C6-C18 아릴, 치환된 C6-C18 아릴, C1-C14 알콕시, 카복시, 시아노, C1-C14 알카노일옥시, C1-C14 알킬싸이오, C1-C14 알킬설포닐, C2-C14 알콕시카보닐, C2-C14 알카노일아미노, S-R14, -SO2-R12, -NHSO2R14 및 -NHCO2R14로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R14는 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C1-C6 알콕시, 할로겐, 및 C4-C20 하이드록시헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환기가 선택적으로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
    상기 헤테로원자는 황, 질소, 및 산소로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    *는 카이랄 중심이다).
  8. 제1항에 있어서,
    상기 화합물이 약학적 조성물로써 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 치료적으로 유효한 양의 화합물, 및 약학적으로 허용 가능한 캐리어(carrier)가 필수적으로 구성되는 비경구(parenteral) 또는 경구(oral) 투여에 적합한 단상의(mono-phasic) 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 화합물은 하나 이상의 GGTase-I (geranylgeranyltransferase type I) 억제제, 수술(surgery), 화학요법(chemotherapy), 방사선(radiation), 면역요법(immunotherapy), 또는 이들의 조합과 함께 활용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염:
    [화학식 1]
    Figure pct00137

    (상기 화학식 1에서,
    n = 0 - 5이고;
    X, Y, Y', Z 및 Z'는 독립적으로 C, N, 또는 N-옥사이드이고;
    R1 - R9는 독립적으로 (X, Y 또는 Z가 C일 경우를 포함하여) 수소, 할로겐, -OH, -O-R10, C1-C24 알킬, C3-C24 알케닐, C4-C24 디에닐, C6-C24 트리에닐, C8-C24 테트라에닐, C6-C18 아릴, 치환된 C6-C18 아릴, C1-C14 알콕시, 카복시, 시아노, C1-C14 알카노일옥시, C1-C14 알킬싸이오, C1-C14 알킬설포닐, C2-C14 알콕시카보닐, C2-C14 알카노일아미노, S-R10, -SO2-R10, -NHSO2R10 및 -NHCO2R10으로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R10은 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C1-C6 알콕시, 할로겐, 및 C4-C20 하이드록시헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환기가 선택적으로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
    상기 헤테로원자는 황, 질소, 및 산소로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    *는 카이랄 중심이다).
  12. 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 광학 이성질체(enantiomers), 부분입체 이성질체(diastereomers), 라세미 화합물(racemates), 및 염:
    [화학식 2] [화학식 3]
    Figure pct00138

    (상기 화학식 2 또는 화학식 3에서,
    n = 0 - 5이고;
    A, B, M, 및 D는 독립적으로 C, N, 또는 N-옥사이드이고;
    R1, R2, R8, R9, R11, R12, R13은 독립적으로 (B, M 또는 D가 C일 경우를 포함하여) 수소, 할로겐, -OH, -O-R14, C1-C24 알킬, C3-C24 알케닐, C4-C24 디에닐, C6-C24 트리에닐, C8-C24 테트라에닐, C6-C18 아릴, 치환된 C6-C18 아릴, C1-C14 알콕시, 카복시, 시아노, C1-C14 알카노일옥시, C1-C14 알킬싸이오, C1-C14 알킬설포닐, C2-C14 알콕시카보닐, C2-C14 알카노일아미노, S-R14, -SO2-R12, -NHSO2R14 및 -NHCO2R14로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    R14는 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, C1-C6 알콕시, 할로겐, 및 C4-C20 하이드록시헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 치환기가 선택적으로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
    상기 헤테로원자는 황, 질소, 및 산소로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    *는 카이랄 중심이다).
  13. 제4-7항 및 제10-12항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 화합물 및 적어도 하나의 약학적 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제13항의 약학적 조성물을 포함하는 약학적 패키지.
  15. 제13항의 약학적 조성물, 조성물의 처방 정보, 및 용기를 함유하는 약학적 키트.
  16. GTP결합을 유도하는 Ral 단백질의 형태 변화를 막는 화합물과 Ral 단백질을 접촉시키는 것을 포함하는 Ral-GTPase 단백질 결합 활성을 억제하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 화합물은 제4-7항 및 제10-12항 중 어느 한 항의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 화합물은 Ral 단백질이 exo84, sec5 및 RalBP1(RalA Binding Protein 1)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 Ral-관련 단백질(Ral-associated protein)과의 결합을 방해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 화합물은 Ral 단백질이 필라민 A(filamin A), PLD1(phospholipase D1) 및 ZONAB(ZO-1-associated nucleic acid binding proteins)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 Ral-관련 단백질(Ral-associated protein)과의 결합을 방해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 투여 대상에서, exo84, sec5, RalBP1(RalA Binding Protein 1), 필라민 A(filamin A), PLD1(phospholipase D1) 및 ZONAB(ZO-1-associated nucleic acid binding proteins)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Ral 단백질의 결합을 억제하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    개인에게서 상기 단백질 결합은 제4-7항 및 제10-12항 중 어느 한 항의 화합물의 존재 하에서 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
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