KR20150007701A

KR20150007701A - 간헐성 저산소증 검출 또는 이와 관련된 질환의 진단을 위한 생체 표지자 및 그 용도

Info

Publication number: KR20150007701A
Application number: KR1020130082024A
Authority: KR
Inventors: 박종완; 신현우; 조주연
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2015-01-21

Abstract

본원은 아라키돈산 및 그 유도체 검출용 물질을 포함하는 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 본원에 따른 조성물, 키트 및 방법은 생물학적 시료에서 생체 표지자의 검출을 통해 간편하고 신속하게 저산소증의 유무 검출 및 이를 이용하여, 저산소증에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 조기 진단, 질환의 중증도, 치료 효과 판정 또는 경과추적등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

저산소증 검출 또는 이와 관련된 질환의 진단을 위한 생체 표지자 및 그 용도 {Biomarkers for detecting hypoxic stress or diagnosing disease related thereto and its uses}

본원은 저산소증 검출 또는 이와 관련된 질환 진단 기술분야이다.

저산소증은 인체가 생명을 유지하는데 필요한 양의 산소를 공급받지 못하는 병적 상태를 통칭하는 것이다. 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 주산기 질식 등 매우 다양한 질환에서 핵심적인 병인으로 작용하는 것으로 알려져 있다 (Savransky et al. Am J Respir Crit Care Med. 2007;175(12):1290-7). 또한 국소적 저산소증은 뇌혈관, 심혈관 질환, 종양과 같은 주요 사망 질환의 중심적인 병태생리 요소이다. 생체는 환경적인 변화(고산지대 등)나 호흡기 질환 등 여러 가지 원인으로 자주 저산소 상태에 노출될 수 있으나 다양한 보상 기작에 의해 산소의 항상성은 개체와 조직 수준에서 매우 정교하게 조절되고 있다.

이러한 저산소증 관련 질환에서 전신 또는 특정 기관(organ)이 저산소증에 얼마나 노출되어 있는지를 판정하는 것은 질환의 병인을 이해하고, 진단하는데 있어 핵심이 된다. 그러나 지금까지 저산소증의 진단은 특정 순간 혈액의 산소포화도를 측정하는 수준에 머물러 있다. 현재 널리 사용되는 광학적 산소포화도 측정기는 헤모글로빈의 산소 결합 정도에 따른 흡광도의 차이를 통해 비관혈적으로 산소포화도를 계측한다. 보다 침습적으로는 환자의 동맥혈을 채취하여 동맥혈 가스분석검사를 통해 혈액내 산소, 이산화탄소 등의 함량을 계측할 수 있다. 이 두 가지 방법 모두 특정 순간의 혈액내 산소공급 정도를 가늠할 수 있을 뿐, 일정 기간 동안의 저산소 노출 정도를 알려주지 못한다. 또한 환자에게 측정기를 부착하여야 하거나, 동맥 천자와 같은 침습적인 행위를 피할 수 없다. 따라서 만성 저산소증의 평가는 저산소증 관련 질병의 병태생리를 정확히 규명하는 것임은 물론, 질환의 중증도와 저산소증 노출 정도 간의 상관분석을 가능케하여 저산소증과 관련된 질환의 진단, 경과 관찰, 예방함에 있어 핵심이 된다.

저산소유도인자로 알려진 HIF (Hypoxia inducible factor)는 저산소 환경에서, 세포의 저산소 적응에 필요한 60여종의 유전자를 조절하는 전사인자로서, HIF 표적 단백질은 혈관신생 및 확장, 에너지 생산, 세포 증식과 생존, 또는 세포 이동 등에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Brahimi-Horn MC, et al. J Mol Med. 2007;85(12):1301-7; Wykoff et al. Cancer Res. 2000;60(24):7075-83; Park JW et al. J Pharmacol Sci. 2004 ;94(3):221-32; 및 Gort et al. Curr Mol Med. 2008 ;8(1):60-7).

미국 특허 공개공보 제2004-0265926호는 조직의 저산소증 체액 마커에 관한 것으로, 심장 질환의 임상적 증상의 한 특징으로서의 저산소증을 검출할 수 있는 단백질 마커인 ORP 150 (oxygen related protein 150)을 개시한다.

세포는 저산소 적응 과정 속에서 다양한 대사체를 생성 분비하며, 이러한 대사체의 종류나 양은 정상 산소 환경에서 분비되는 대사체와 크게 다를 것으로 추정되나 (Majmundar, et al. Mol Cell. 2010;40(2):294-309), 이에 관하여는 아직 보고된 바는 없으며, 세포로부터 분비되는 대사체의 발굴을 통한 저산소증 표지자 발굴이 요구된다.

본원은 저산소증을 검출할 수 있는 생체 표지자를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 아라키돈산 또는 그 유도체 검출용 물질을 포함하는, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 포함되는 아라키돈산 유도체는 상기 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체이며, 특히 상기 아라키돈산 유도체는 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-H_PETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5-옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-oxoETE)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 조성물에 포함되는 검출용 물질로는 아라키돈산 또는 그 유도체를 특이적으로 인식할 수 있는 물질로 검출가능한 것이면 제한되지 않으며, 예를 들면 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 검출용 물질은 상기 물질에 적합한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법으로 검출될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일구현예에서 저산소성 관련 질환은 저산소증에 의해 질환이 유발되는 경우를 포함하는 것으로 예를 들어 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 주산기 질식, 뇌혈관, 심혈관 질환, 또는 종양을 포함하나 이로 제한하는 것이다.

또 다른 구현예에서, 본원에 따른 저산소증은 전신성 저산소증 또는 급성 저산소증을 포함하는 것으로, 특히 상기 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 또는 주산기 질식에 수반될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니며, 상기 급성 저산소증은 뇌혈관, 심혈관 질환, 종양에 수반될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

또 다른 구현예에서 저산소증은 간헐성 또는 지속성 만성 저산소증, 급성 저산소증, 저산소성저산소증, 빈혈저산소증, 울혈저산소증, 조직독성저산소증, 또는 수용성 저산소증을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 저산소증 검출 또는 저산소성 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 저산소증 마커를 검출하는 방법을 제공하며, 일 구현예에서 상기 방법은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 아라키돈산 또는 그 유도체, 예를 들면 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체, 예를 들면 5-H_PETE, 5-HETE, 또는 5-oxoETE를 검출하는 것을 포함한다.

본원에 따른 방법에서 아라키돈산 또는 그 유도체 측정은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법 중 하나 이상에 의해 수행될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 조성물, 키트 및 방법은 본원에 따른 유도체의 검출이 가능한 다양한 생물학적 시료 예를 들면 체액 전혈, 혈장, 혈청, 머리카락, 세포, 조직 또는 뇨에 사용될 수 있다.

본원은 저산소성 질환 환자 또는 저산소증이 의심되는 환자에서 아라키돈산 대사체의 검출을 통해 정확하면서도, 간편하고 신속하게 저산소증 노출 유무의 판별이 가능하며, 이를 통해 저산소성 질환의 예방 또는 조기진단이 가능하다. 또한 치료 후 저산소성 질환의 개선 정도에 대한 효과 판정 및 질환의 경과 추적 관찰이 가능하다.

도 1은 아라키돈산의 5-리폭시게나제 (5-LO) 경로 및 대사체를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 THP-1 세포주에서 저산소에 의해 증가하는 아라키돈산 유래 대사체를 나타낸다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); ReOxy, reoxygenation. *P<0.05.
도 3은 저산소 유도인자 억제 시 표적 대사체가 감소하는 것을 나타내는 결과이다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); R, reoxygenation. *P<0.05, **P<0.01.
도 4는 저산소 유도인자 억제약물 투여시 표적 대사체가 감소하는 것을 나타내는 결과이다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); R, reoxygenation. *P<0.05, **P<0.01.
도 5는 인간 일차 단핵세포 (primary monocyte)에서 저산소에 의해 증가하는 아라키돈산 유래 대사체를 나타낸다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); IH, intermittent hypoxia; R, reoxygenation. *P<0.05, **P<0.01.
도 6은 인간 일차 단핵세포에서 저산소 유도인자 억제 시 표적 대사체가 감소하는 것을 나타내는 결과이다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); IH, intermittent hypoxia; R, reoxygenation; siH1, silencing HIF-1alpha. *P<0.05, **P<0.01.
도 7은 5-HpETE를 5-HETE로 변환시키는 Glutathione Peroxidase (GPX)의 활성이 저산소 환경에서 증가하는 것을 나타낸다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); R, reoxygenation. *P<0.05.
상기 도면에 기재된 결과에서 모든 통계 분석은 Mann-Whitney U test를 이용하여 수행되었다.

본원은 저산소증 시료에서 특징적으로 발견되는 생체 표지자의 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 아라키돈산 및 그 유도체 검출용 물질을 포함하는 저산소증 검출/진단 또는 저산소성 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 질환의 진행상태 판별 또는 치료에 대한 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.

본원에서 용어 검출은 저산소증의 존재 유무 또는 정도를 판단하는 것으로, 진단과 동일한 의미로 해석될 수도 있다. 예를 들면 수면 무호흡증처럼 질환자체가 저산소증을 일으키는 질환인 경우 저산소증의 유무를 검출하는 것이 질환의 진단이 될 수 있으며, 저산소증의 정도를 판정하는 것이 중증도의 진단이 될 수 있다. 다른 경우에는 저산소증에 의해 질환이 유발되는 경우, 예를 들어 폐고혈압, 저산소성 허혈 뇌병증과 같은 경우에는 환자의 전신 또는 그 신체의 특정 기관이 저산소 상태인지 여부를 검출하여, 해당 질환의 예방, 조기 진단에 활용될 수 있다.

본원에서 용어 진단용 생체 표지자 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 정상시료와 환자시료, 혹은 치료 후 호전된 환자의 시료와 호전되지 않은 환자의 시료를 구분 또는 판별할 수 있는 것을 의미한다. 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 시료 또는 환자에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 지질, 당지질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본원에서 저산소증 환자에서 그 양의 증가되는 아라키돈산 및 그 유도체를 포함한다.

본원에 따른 생체 표지자는 하나 또는 두 개 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 또한 필요한 경우 기존의 진단 방법과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.

본원에서 저산소증 또는 저산소성 질환은 산소운반과 활용 과정에서의 장애를 일컫는 것으로 동맥혈 산소함량의 감소 자체 혹은 조직내 산소 필요량의 증가로 인해, 조직내의 산소가 정상치 또는 필요량 아래로 감소한 상태를 의미한다. 그 종류로는 동맥혈의 산소분압이 감소하여 초래된 만성 간헐성 또는 지속성 저산소증, 급성 저산소증, 저산소성저산소증, 빈혈저산소증, 울혈저산소증, 조직독성저산소증, 수용성저산소증을 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원의 표지자는 저산소증의 정도와 기간을 반영하는 누적표지자로서 작용할 수 있으며, 이러한 관점에서 지속성 저산소증 또는 만성 간헐성 저산소증, 특히 지속성 저산소증 진단에 사용된다.

다른 측면에서 저산소증은 전신선 또는 국소적 저산소증을 포함하는 것이다. 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 주산기 질식 등 매우 다양한 질환에 수반되는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 국소적 저산소증은 뇌혈관, 심혈관 질환, 종양과 같은 질환에 수반되는 것이나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서 저산소증은 수면 무호흡증에 수반되는 것이다. 수면 무호흡증에 수반되는 저산소증은 혈중 산소 포화도의 반복적인 저하가 발생하는 것으로, 수면 중 상기도 폐쇄로 산소 포화도가 이로 제한하는 것은 아니나 60%-90% (산소마스크 착용이 필요한 정도)로 감소하였다가 강력한 호흡자극이 유발되면서 산소포화도가 회복되는 과정이 매일 밤 반복되는 것이다(Sympathetic neural mechanisms in obstructive sleep apnea. J Clin Invest 1995;96:1897-904). 특정한 경우에 산소포화도가 60%미만까지 내려가기도 하며 이 경우 돌연사의 발생 가능성이 높다.

본원의 생체 표지자는 이러한 다양한 증상 및 특징을 갖는 저산소증의 진단 및 예후 측정에 사용될 수 있으며, 또한 중증도 판단에 사용될 수 있다. 중증도 판단의 경우, 검출되는 대사체의 정량적 분석을 통해 대사체의 양과의 상관관계에 따라 중증도를 판단할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 도 5에 개시된 바와 같이 지속적 저산소증에서 더 많은 양의 대사체가 검출된다.

본원에서 생물학적 시료, 피검체란 생체 표지자의 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 땀, 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 머리카락, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 한 구현예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 생체 표지자는 아라키돈산 및 그 유도체이다. 아라키돈산 (arachidonic acid, AA)은 세포막에서 가장 많이 존재하는 폴리불포화지방산으로, 두 가지의 주 경로, 즉 리폭시게나제 (Lipoxygenase, LO)을 통해 하이드록시 유도체로 되는 대사경로, 및 시클로옥시게나제 (Cycloxygenase, COX)를 통해 프로스타글란딘으로 전환되는 대사경로를 통해 분해된다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 조성물은 특히 LO 경로에서 생성되는 AA 대사체의 검출용 물질을 포함한다. LO 경로는 도 1에 도식적으로 기재되어 있으며, 도 1에 나타난 바와 같이 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에온산은 아라키돈산이 류코트리엔 A4(leukotriene A4)으로 생성되는 과정의 중간 생성물이며, 아라키도네이트 5-리폭시게나제(arachidonate 5-lipoxygenase)에 의하여 생성될 수 있다. 5-하이드록시에이코사테트라에노산은 류코트리엔 생합성의 중간체이며, 도 1에 나타난 바와 같이 퍼옥시데이즈(peroxidase)에 의하여 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산으로부터 생성될 수 있다. 5-옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산은 5-하이드록시에이코사노이드 디하이드로게나제(5-hydroxyeicosanoid dehydrogenase (5-HEDH))에 의하여 산화되어 생성될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 LO 경로를 통한 대사체는, 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오노산(5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid, 5-HPETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5- 옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-oxoETE)를 포함한다.

본원에 따른 AA 및 그 대사산물 즉 그 대사체 또는 유도체는 공지된 다양한 방법을 통해 검출될 수 있으며, 당업자수준에서 적절한 검출방법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44; E.J. Want et al., Nature Protocols 2010; 5: 1005 - 1018 및 Stanke-Labesque F et al. J Allergy Clin Immunol 2009;124:364-70를 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 아라키돈산 및 그 유도체를 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 이용하여 검출된다. 상기 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피질량분광분석방법 등에 사용될 수 있으며, 당연히 상기 방법이 본원에 따른 생체표지자 검출에 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 생체표지자를 검출할 수 있으며, 예를 들면 Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44을 참조할 수 있다.

또 다른 구현예에서는 항체 분석법이 사용될 수 있다. 항체 분석은 본원에 따른 AA 또는 그 유도체를 특이적으로 인식하는 물질, 예를 들면 폴리클로날항체, 모노클로날 항체, 수용체, 리간드, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체를 이용하여 분석하는 것으로, 예를 들면, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 기질, 펩타이드 앱타머, 상기 표지자와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다.

상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 저산소증 질환 진단용 키트를 제공한다. 본원의 키트는 검사 대상 또는 검사 대상의 생물학적 검체 또는 시료에서 AA 및 그 대사체의 정량 및/또는 정성적 분석을 통해, 저산소증 질환의 발병 또는 진행 정도 및/또는 예후를 진단할 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 다양한 검출 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, ELISA키트, 화학발광분석용 키트 및 루미넥스(luminex®)키트 등을 들 수 있다. ELISA 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 생체 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클론항체, 폴리클론항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

루미넥스 키트는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 분석물을 동시에 측정할 수 있는 대용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 ELISA나 ELISPOT을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이는 96-웰 플레이트에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 분석방법으로 두 종류의 레이져 검출기를 이용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도의 차이를 보이며 그 사이의 비드들은 레드와 오렌지 색의 비율이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 물질에 대한 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 생체표지자의 정량이 가능하다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 물질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미세입자(micro particle)와 접합된 항체일 수 있으며, 또한 상기 미세입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 저산소성 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 저산소성 질환 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드; (b) 시료 내의 생체 표지자 물질과 결합하는 결합 패드; (c) 생체 표지자에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선 및 대조선이 처리되어 있는 반응 막; (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드; 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 면역크로마토그래피 스트립에 사용되는 각 표지자에 특이적인 항체는 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 표지자에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 저산소증 검출/진단, 저산소성 질환의 진단 및/또는 예후 측정에 필요한 정보를 의사 또는 환자에게 제공하기 위하여 저산소증 진단 마커를 검출하는 방법으로서, 검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, AA 및/또는 그 유도체의 정량 및/또는 정석 분석을 통한 검출을 수행하는 것을 특징으로 하는 저산소증 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검체로부터 분리된 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 머리카락, 조직, 세포 또는 환자의 뇨(urine)일 수 있으며, 본원의 일 실시예에서는 환자로부터 분리된 머리카락 또는 뇨로서 특히 아침 첫소변이 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, AA 및 그 유도체의 정성 및 정량 분석이 가능하며, 이를 대조군과 비교함으로써 저산소증, 또는 저산소증이 수반되는 저산소성 질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 저산소증 환자의 뇨(urine)을 수득하여 상기 뇨 중의 아라키돈산, 5-H_PETE, 5-HETE, 또는 5-oxoETE를 LC/MS(액체 크로마토그래피/질량 분석기, Liquid Chromatography/Mass Spectrometer) 방법을 수행하여 각 환자의 시료로부터 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 대조군과 비교하여 진단 및/또는 예후 측정에 사용될 수 있다.

그 예로 정상 대조군에서 해당 생체 표지자의 정상범위의 임계값(cutoff, 증가하는 생체표지자의 경우에는 상한치/감소하는 생체표지자의 경우에는 하한치)을 결정하여, 질환이 의심되는 환자의 경우 해당 생체표지자의 양이 임계값보다 약 50% 이상 증가한 경우 저산소증 환자로 진단할 수 있다. 특히 해당 생체표지자의 양이 임계값보다 약 2 배 이상 증가 중증도 저산소증 환자로 조기 감별진단이 가능하다. 하지만 수치는 이에 한정되는 것이 아니고, 저산소증 검출 또는 관련 질환의 진단을 위해 사용되는 구체적 시료의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 검출 시료로서 혈액 또는 소변을 사용하는 경우, 생체표지자가 농축될 가능성이 높아 상승폭이 클 수도 있으며, 이러한 점을 고려하여, 수치를 결정할 수 있을 것이다. 또한 저산소증 환자에서 치료 후 해당 생체 표지자가 정상 범위 내로 회복되는 지를 확인하여 치료 성과에 대한 판정 및 추적 관찰이 가능하다. 이러한 본원에 따른 생체표지자를 이용한 저산소증 진단은 단독으로 또는 공지된 방법과 함께 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 생체 표지자 선별

인체 단핵구 유래 세포주인 THP-1 세포주를 정상산소 (21% 산소), 저산소 (1% 산소), 그리고 저산소 후 정상산소(재산소화) 조건에서 배양한 뒤, 배양액에 포함된 대사체를 LC/Q-TOF MS 분석법을 이용하여 다음과 같이 동정 및 정량하였다.

① 세포 배양

5x10^5 개/4mL 배지의 인체 유래 단핵구 세포 (THP-1)(Korean Cell Line Bank, KCLB No. 40202)를 10% FBS (fetal bovine serum)이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37℃에서 정상산소 조건(21% O₂, 5% CO₂) 또는 저산소 조건(1% O₂, 5% CO₂)에서 24시간 동안 또는 저산소후 정상산소 (재산소화) 조건에서 각각 8시간 및 16 시간 배양하였다.

이어 세포를 제외한 배지를 분리하여 분석 시료를 수득하였다. 배지는 3000rpm으로 4℃에서 원심분리하여 상층액만을 분리하고, 이를 분주하여 -70℃ 초저온냉동고에 보관한 뒤 시험 직전 해동하여 사용하였다.

저산소 환경에서 주요 생체 조절자인 Hypoxia-inducible factor(HIF)-1의 발현을 감소시키기 위해서 si-HIF-1alpha 2종(#1, 5’-CAAAGUUAAAGCAUCAGG-3’; #2, 5’-UGUACUGUCCUGUGGUGA-3’)을 제작하여, Lipofectamine RNA iMAX reagents (Life Technologies, USA)를 이용하여 제조자의 방법대로 전달이입하였다. 또한 HIF-1 억제약물인 2-methoxyestradiol (2ME2), 17-N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG)는 Selleck chemicals로부터 구입하였으며, YC-1은 A.G. Scientific으로부터 구입하여 사용하였다. 2ME2 와 17-AAG 모두 100μM의 농도로 저산소 환경 노출시간 동안 함께 처리하였다.

② 분석시료 준비

1.5 ml 에펜도르프 튜브에 4℃ H₂O (400μl)와 배지 시료 (100μl)을 넣어 희석하였다. 이어 볼텍서(vortexer)를 이용하여 상기 시료를 잘 혼합한 후에, 4℃, 14,000 g에서 20 분 동안 여과/원심분리 후 상층액을 취하여 분석 바이알(vial)에 따로 수집하였다. 또한 QC (quality control) 분석을 위하여, 모든 시료로부터의 상기 희석 샘플 50μl씩을 모두 혼합 (pooling) 하였다.

③ LC/Q-TOF MS 분석에 의한 대사체 분석

상술한 바와 같이 준비한 시료를 역상 컬럼인 Zorbax SB-C18, 50 X 2.1 mm, 1.8 μm (Agilent Technologies, USA)을 Binary Agilent 1200 series HPLC (Agilent Technologies)에 장착한 시스템에 의하여 분리하였으며, 이 때 5 μl의 분석 샘플이 40℃로 가열된 컬럼을 통과하도록 주입하였다. 98% 용매 A (H₂O 중의 포름산 암모늄 2mM과 포름산 0.1%)와 2% 용매 B (메탄올 중의 포름산 0.1%)에서 400nl/min으로 21분 동안 대사체 샘플의 구배 용리를 수행하였으며, 교차 오염을 피하기 위하여 샘플 조작 사이에서 블랭크 조작 (blank run)을 수행하였다.

HPLC에 Agilent 6530 quadrupole time-of-flight (Q-TOF) 질량 분석기 (Agilent Technologies)를 커플링 시켜 ESI 알고리즘을 사용하였고, 100-1100 m/z로부터 한 스펙트럼 당 1초에 4개의 센트로이드 (centroid) 데이터를 얻었고, 모든 스펙트럼의 m/z은 외부에서 넣어 준 참조 값으로부터 실시간으로 교정하였다.

질량 스펙트럼(mass spectra)으로부터의 대사체 동정은 먼저 소프트웨어 (Agilent MassHunter Qualitative Analysis (version B.05.00), Agilent Mass Profiler Professional (version B.02.02))를 사용하여 HMDB (http://www.hmdb.ca/)와 METLIN (http://metlin.scripps.edu/) 데이터베이스에 대하여 수행하였다. 이후에 해당 대사체의 LC/MS/MS 분석에 의한 쪼개짐 패턴을 실제 표준 물질(Cayman, Ann Arbor, MI)과 비교하여 추가적인 확인 작업을 수행하였다.

④ LC/Q-TOF MS를 이용한 대사체 정량 분석

동량의 세포로부터 얻어진 배양액에서 각각 대사체의 크로마토그램 면적을 이용하여 해당 대사체의 상대적 농도를 계산하였다.

정산산소 조건의 세포 배양액보다 저산소 조건 배양액에서 유의미하게 증가하는 대사체를 스크리닝 하였고, 5-HETE와 5-oxoETE 두 대사체가 저산소 배양 조건에서 통계적으로 유의미한 상승이 동반되었다. 이에 5-HETE와 5-oxoETE 및 이의 상위 대사체 AA 및 5-H_PETE를 생체표지자로 선정하였다

실시예 2 생체 표지자의 검증

정상산소, 저산소, 그리고 저산소 후 정상산소(재산소화) 조건에서 실시예 1과 같이 THP-1 세포를 배양한 뒤, 배양액에 포함된 대사체를 AA 및 5-H_PETE, 5-HETE, 5-oxoETE를 실시예 1과 같이 LC/Q-TOF MS 분석법을 이용하여 정량하였다.

결과는 도 2에 기재되어 있으며, 이들은 모두 아라키돈산 (AA)의 유도체로서, AA에서 5-lipoxygenase(5-LO) 및 Peroxidase의 효소 작용을 통해 5-HPETE를 거쳐 유도되는 대사체이다.

이어 실시예 1에 기재된 방법대로 저산소 환경에서 주요 생체 조절자인 Hypoxia-inducible factor(HIF)-1의 발현을 si-RNA를 이용하여 그 발현을 인위적으로 감소 (si-HIF-1a#1 및 si-HIF-1a#2)시킨 후 대사체 분석을 수행하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 저산소 조건(H)에서 증가하였던 5-HETE 및 5-oxoETE이 감소하는 것을 확인 하였다. 마찬가지로 HIF-1 억제약물인 2-methoxyestradiol (2ME2), 17-N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) 및 YC-1을 처리하였을 때에도 저산소 조건(H)에서 증가하였던 5-HETE 및 5-oxoETE이 감소함을 확인하였으며, 이는 저산소 조건(H)에서 증가하였던 5-HETE 및 5-oxoETE가 HIF-1 의존적으로 증가하였음을 의미한다. 특히 HIF-1이 저산소 적응 및 대사조절에 주요한 조절자임을 감안 할 때, 저산소 조건에서 5-HETE 및 5-oxoETE의 증가는 저산소 특이적인 생체내 변화를 반영하고 있음을 나타내는 것이다. HIF 의존적으로 증가는 이러한 본원에 따른 대사체의 증가가 저산소 환경에 밀접한 연관이 있음을 나타내는 것이다.

또한 인체 유래 혈구세포주인 THP-1 세포에서 확인한 결과를 인간 일차 다형핵세포 (primary human polymorphonuclear cell from PromoCell, Germany)를 이용하여 재확인 하였다. 세포 배지로는 PromoCell사의 Mononuclear Cell Medium (C-28030)을 사용하였으며, 분석은 실시예 1의 방법대로 수행되었다. 결과는 도 5에 기재되어 있다. 도 5에 나타난 바와 같이 정상 산소 조건에 비해 8시간 저산소 조건(H8) 및 8시간 간헐적 저산소 조건(IH8, 매 시간 마다 30분은 1% 산소조건, 이후 30분은 21% 산소조건에서 교대로 배양)에서 5-HETE 및 5-oxoETE가 상승하는 것을 확인하였다.

나아가 8시간 저산소 조건 후 16시간 정상산소조건(H8R16)에서 배양한 경우 역시 5-HETE 및 5-oxoETE가 상승하는 것으로 나타났다. 5-oxoETE의 경우에는 8시간 간헐적 산소조건 후 16시간 정상산소조건(IH8R16)에서 배양한 경우에서도 상승하였다.

또한 도 6에 나타난 바와 같이, 인간 일차 다형핵세포에서, THF-1에서와 같이 HIF-1alpha를 si-RNA의 전달이입에 의해 감소시켰을 때, 저산소 조건에서 상승한 5-HETE 및 5-oxoETE이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 저산소 조건에서의 5-HETE 및 5-oxoETE 증가가 HIF-1 의존적인 것을 나타낸다.

아라키돈산의 5-LO 대사 경로에서 (도 1 참조), 저산소 자극시 5-HETE부터 상승하는 것을 고려하면, 5-HpETE에서 5-HETE로 전환되는 과정이 저산소 조건에서 활성화되는 것으로 판단할 수 있다. 이에 5-HpETE를 5-HETE로 전환시키는 효소인 Glutathione Peroxidase (GPX)의 활성을 측정하였다. GPX 활성은 GPX 분석 키트 (ab102530, Abcam)을 이용하여 측정하였으며, 상기 키트에서의 GPX 활성 측정 원리는 다음과 같다. 먼저 GPX는 환원된 글루타치온 (reduced glutathione, GSH)을 산화 글루타치온(oxidized glutathione, GSSG)으로 바꾸는데, 이 GSSG가 글루타치온 환원효소 (glutathinoe reductase, GR)에 의해 다시 GSH로 환원될 때 NADPH를 소모하게 된다. 따라서 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 340nm에서의 흡광도를 재서 NADPH의 감소 정도를 측정하여 GPX의 활성을 정의할 수 있다.

결과는 도 7에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 24시간 저산소 조건(H24) 및 8시간 저산소 조건 후 16시간 정상 산소 조건(H8R16)에서 세포를 배양하였을 때, 모두 GPX 활성이 증가하는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 본원에 따른 아라키돈산, 5-HpETE, 5-HETE, 그리고 5-oxoETE 표지자의 농도 검출을 통해 저산소증 노출여부 판별이 가능하다는 것을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

아라키돈산 또는 그 유도체 검출용 물질을 포함하는, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 아라키돈산 유도체는 상기 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 아라키돈산 유도체는 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-H_PETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5- 옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-oxoETE)인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출용 물질은 상기 아라키돈산 또는 그 유도체를 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하는, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법에 사용되는 물질인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저산소성 관련 질환은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 주산기 질식, 뇌혈관, 심혈관 질환, 또는 종양인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저산소증은 전신성 저산소증 또는 급성 저산소증인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 주산기 질식에 수반되는 것이며, 상기 급성 저산소증은 뇌혈관, 심혈관 질환, 종양에 수반되는 것인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 저산소증은 간헐성 또는 지속성 만성 저산소증, 급성 저산소증, 저산소성저산소증, 빈혈저산소증, 울혈저산소증, 조직독성저산소증, 또는 수용성 저산소증인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 저산소증은 간헐성 또는 지속성 만성 저산소증인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 키트.
저산소증 검출 또는 저산소성 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 저산소증 마커를 검출하는 방법으로서, 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 아라키돈산 또는 그 유도체를 검출하는 것을 포함하는 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 마커를 검출하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체액, 전혈, 혈장, 혈청, 머리카락, 세포, 조직 또는 뇨인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 마커를 검출하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 아라키돈산 유도체는 상기 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 마커를 검출하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 아라키돈산 유도체는 5-H_PETE, 5-HETE, 또는 5-oxoETE인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 마커를 검출하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 아라키돈산 또는 그 유도체 측정은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법 중 하나 이상에 의해 수행되는 것인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 마커를 검출하는 방법.