WO2014200178A1 - 저산소증 검출 또는 이와 관련된 질환의 진단 방법 - Google Patents

저산소증 검출 또는 이와 관련된 질환의 진단 방법 Download PDF

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신현우
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이재서
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    • G01N2800/7038—Hypoxia

Definitions

  • the present application is in the art of detecting hypoxia or related disease diagnosis.
  • Hypoxia is the collective name for a pathological condition in which the body does not receive the amount of oxygen needed to sustain life.
  • Systemic hypoxia is known to play a key role in a wide variety of diseases, including obstructive sleep apnea, asthma, chronic lung disease (COPD), pulmonary hypertension and pulmonary edema, pulmonary embolism, heart failure, hypoxic ischemic encephalopathy, and perinatal asphyxia. (Savransky et al. Am J Respir Crit Care Med. 2007; 175 (12): 1290-7).
  • Local hypoxia is also a central pathophysiological component of major deaths such as cerebrovascular, cardiovascular and tumor. Living organisms can be exposed to hypoxia frequently due to various causes such as environmental changes (such as alpine zones) or respiratory diseases, but oxygen homeostasis is very precisely controlled at the individual and tissue levels by various compensation mechanisms.
  • hypoxia-related diseases Determining how much systemic or specific organs are exposed to hypoxia in such hypoxia-related diseases is key to understanding and diagnosing the etiology of the disease.
  • diagnosis of hypoxia remains at the level measuring oxygen saturation of blood at a certain moment.
  • optical oxygen saturation meter to measure oxygen saturation non-invasively through the difference in absorbance according to the degree of oxygen binding of hemoglobin. More invasively, the arterial blood of the patient can be collected and the content of oxygen, carbon dioxide, etc. in the blood can be measured through the arterial blood gas analysis test. Both of these methods only measure the oxygen supply in the blood at any given moment, but do not provide any indication of hypoxic exposure over a period of time.
  • hypoxia not only accurately identifies the pathophysiology of hypoxia-related diseases, but also enables the correlation analysis between the severity of the disease and the degree of hypoxia exposure, which is essential in diagnosing, monitoring, and preventing diseases related to hypoxia. .
  • Hypoxia inducible factor known as a hypoxic inducer
  • a hypoxic inducer is a transcription factor that regulates over 60 genes required for the hypoxic adaptation of cells in a hypoxic environment.
  • HIF target proteins are angiogenesis and expansion, energy production, cell proliferation and survival, Or cell migration (Brahimi-Horn MC, et al. J Mol Med. 2007; 85 (12): 1301-7; Wykoff et al. Cancer Res. 2000; 60 (24): 7075-83 Park JW et al. J Pharmacol Sci. 2004; 94 (3): 221-32; and Gort et al. Curr Mol Med. 2008; 8 (1): 60-7).
  • US Patent Publication No. 2004-0265926 relates to a hypoxic fluid marker of tissue, and discloses ORP 150 (oxygen related protein 150), a protein marker capable of detecting hypoxia as a feature of clinical symptoms of heart disease.
  • the present application is to provide a biomarker capable of detecting hypoxia and a method for detecting or diagnosing related diseases using the same.
  • the present disclosure provides a composition or a method for diagnosing hypoxia or diagnosing hypoxia-related diseases, including a substance for detecting arachidonic acid or a derivative thereof.
  • the arachidonic acid derivatives included herein are derivatives produced from the 5-lipoxygenase metabolic pathway of the arachidonic acid, in particular the arachidonic acid derivatives are 5-hydroperoxyeicosatetraethonic acid (5-HPETE ), 5-hydroxy-6,8,11,14-eicosatetraenoic acid (5-HETE), or 5-oxo-6,8,11,14-eicosatetraenoic acid (5-oxoETE) Including but not limited to.
  • 5-HPETE 5-hydroperoxyeicosatetraethonic acid
  • 5-HETE 5-hydroxy-6,8,11,14-eicosatetraenoic acid
  • 5-oxoETE 5-oxo-6,8,11,14-eicosatetraenoic acid
  • the detection material included in the composition of the present invention is not limited as long as it can be detected as a material capable of specifically recognizing arachidonic acid or a derivative thereof.
  • a receptor, a ligand, a substrate, an antibody, an antibody fragment, an antibody mimetic but not limited to, aptamer, avider multimer or peptidomimetics.
  • the detection material according to the present invention may be detected by a method suitable for the material, for example, may be detected by antibody analysis, chemiluminescence analysis, or liquid chromatography mass spectrometry, but is not limited thereto.
  • Hypoxia-related diseases in one embodiment according to the present invention include cases where the disease is caused by hypoxia, for example obstructive sleep apnea, asthma, chronic lung disease (COPD, Lung fibrosis), pulmonary hypertension and pulmonary edema, pulmonary embolism , Heart failure, hypoxic ischemic encephalopathy, perinatal choking, cerebrovascular, cardiovascular disease, or tumor.
  • hypoxia for example obstructive sleep apnea, asthma, chronic lung disease (COPD, Lung fibrosis), pulmonary hypertension and pulmonary edema, pulmonary embolism , Heart failure, hypoxic ischemic encephalopathy, perinatal choking, cerebrovascular, cardiovascular disease, or tumor.
  • hypoxia according to the present is to include acute or chronic systemic or local hypoxia.
  • acute or chronic hypoxia is a classification according to the progress of hypoxia, and acute hypoxia is asthma, pulmonary edema, pulmonary embolism, airway obstruction, perinatal asphyxia, carbon monoxide poisoning, cerebrovascular and cardiovascular occlusion or bleeding.
  • Chronic hypoxia includes, but is not limited to obstructive sleep apnea, chronic lung disease (COPD, lung fibrosis), pulmonary hypertension, heart failure, anemia, haemoglobin abnormal diseases, tumors, and the like.
  • systemic hypoxia in the present application is obstructive sleep apnea, asthma, chronic lung disease (COPD, Lung fibrosis), pulmonary hypertension and pulmonary edema, pulmonary embolism, heart failure, airway obstruction, pneumothorax, perinatal choke, anemia, hemoglobin abnormal disease, carbon monoxide poisoning, It may be accompanied by cyanide poisoning, the local hypoxia may be accompanied by, but not limited to, ischemic tissue damage, including cerebrovascular, cardiovascular, tumor, hypoxic ischemic encephalopathy.
  • pulmonary edema is simply a disease in which the water in the lung parenchyma is filled with no gas exchange between the alveoli and the pulmonary vessels, and this disease suddenly progresses, for example, usually within three months, and other acute diseases progress from earlier days to weeks. It can be acute if you have a history of pulmonary disease, and can be classified as chronic if it is secondary to other pulmonary edema.
  • hypoxia seen in clinical disease in this aspect may include various aspects such as intermittent or persistent chronic hypoxia, acute hypoxia, hypoxic hypoxia, anemia hypoxia, congestive hypoxia, histotoxic hypoxia, or water-soluble hypoxia.
  • the present disclosure also provides a kit for detecting hypoxia or diagnosing hypoxia associated disease comprising a composition according to the present application.
  • the disclosure provides a method of detecting hypoxia markers for providing information necessary for detecting hypoxia or diagnosing hypoxia related diseases, in one embodiment the method comprises arachidonic acid in a biological sample isolated from the subject. Or detecting derivatives thereof, such as derivatives produced in the 5-lipoxygenase metabolic pathway of arachidonic acid, such as 5-HpETE, 5-HETE, or 5-oxoETE.
  • the measurement of arachidonic acid or derivatives thereof may be performed by one or more of antibody analysis, chemiluminescence analysis, or liquid chromatography mass spectrometry, but is not limited thereto.
  • the present disclosure provides arachidonic acid or a derivative thereof for use in detecting hypoxia or diagnosing hypoxia related diseases.
  • arachidonic acid or its derivatives, compositions, kits, and methods may be used for various biological samples, such as whole blood, plasma, serum, saliva, tears, sweat, urine, and the like, capable of detecting the derivatives according to the present invention. It may be used for, but not limited to, hair, cells, and tissues.
  • the present application enables accurate and easy and rapid determination of hypoxia exposure through the detection of arachidonic acid metabolites in patients with hypoxia or patients suspected of hypoxia, and thus enables early diagnosis of hypoxia diseases such as sleep apnea.
  • the diagnosis can be made to prevent various complications due to sleep apnea.
  • 5-LO 5-lipoxygenase pathway
  • Figure 2 shows arachidonic acid derived metabolites that are increased by hypoxia in THP-1 cell line of monocyte origin.
  • N normoxia (21% O 2 );
  • H hypoxia (1% 0 2 );
  • ReOxy reoxygenation. * P ⁇ 0.05.
  • N normoxia (21% O 2 ); H, hypoxia (1% 0 2 ); R, reoxygenation. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • N normoxia (21% O 2 ); H, hypoxia (1% 0 2 ); R, reoxygenation. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • FIG. 6 shows that target metabolites decrease upon hypoxic inducer inhibition in human primary monocytes.
  • N normoxia (21% O 2 );
  • H hypoxia (1% 0 2 );
  • IH intermittent hypoxia;
  • R reoxygenation; siH1, silencing HIF-1alpha. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • Glutathione Peroxidase which converts 5-HpETE to 5-HETE, is increased in a hypoxic environment.
  • N normoxia (21% O 2 );
  • H hypoxia (1% 0 2 );
  • R reoxygenation. * P ⁇ 0.05.
  • FIG. 9 is a graph showing the correlation between the arachidonic acid metabolites and the lowest oxygen saturation in the urine of sleep apnea patients.
  • FIG. 10 is a graph showing the correlation between metabolites increasing in urine of sleep apnea patients and apnea-low breathing index (AHI).
  • the present application is based on the discovery of biomarkers that are characteristically found in hypoxia samples.
  • the present application provides a hypoxia detection / diagnosis or composition for diagnosing hypoxia disease, including arachidonic acid and a substance for detecting the derivative thereof, and a hypoxia detection / diagnosis or hypoxia of a patient using the same, for example, a patient with hypoxia or suspected hypoxia. It relates to a method for diagnosing sexual disease.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of a subject's disease to a particular disease or condition, determining whether or not he or she currently has a particular disease or condition, Determining prognosis (eg, determining disease progression or determining responsiveness to treatment) or terrametrics (eg, monitoring the condition of an object to provide information about treatment efficacy). Include.
  • the term “detection” is used to determine the presence or degree of hypoxia and may be interpreted in the same sense as the diagnosis. For example, if the disease itself is a hypoxia-like disease such as sleep apnea, detecting the presence of hypoxia can be diagnosed, and determining the degree of hypoxia can be a diagnosis of severity. In other cases, when the disease is caused by hypoxia, for example, pulmonary hypertension, hypoxic ischemic encephalopathy, it is detected whether the entire body of a patient or a specific organ of the body is hypoxic, and thus prevents or prematurely prevents the disease. It can be used for diagnosis.
  • hypoxia for example, pulmonary hypertension, hypoxic ischemic encephalopathy
  • the term "diagnostic / detection biomarker or marker” means that a normal sample and a patient sample or a sample of an improved patient and a sample of an incompatible patient can be distinguished or discriminated.
  • Organic biomolecules such as lipids, glycolipids, and the like, which increase or decrease in diseased samples or patients as compared to normal samples. Included herein are increased amounts of arachidonic acid and derivatives thereof in hypoxia patients.
  • biomarkers according to the invention can be used in one or two or more combinations, and can also be used with existing diagnostic methods if necessary. Those skilled in the art will be able to select combinations of markers that meet the desired sensitivity and specificity through analysis using biological samples of subjects, including normal subjects and patients, such as the methods described herein.
  • hypoxia or hypoxia refers to a disorder in oxygen transport and utilization, and means a state in which oxygen in tissues decreases below normal or required amount due to a decrease in arterial blood oxygen content or an increase in tissue oxygen demand.
  • Types include chronic intermittent or persistent hypoxia, acute hypoxia, hypoxic hypoxia, anemia hypoxia, congestive hypoxia, histotoxic hypoxia, and soluble hypoxia caused by decreased oxygen partial pressure in arterial blood.
  • the marker of the present application can act as a cumulative marker reflecting the extent and duration of hypoxia and is used in this regard for the diagnosis of persistent hypoxia or chronic intermittent hypoxia, in particular persistent hypoxia.
  • hypoxia includes systemic or local hypoxia.
  • Systemic hypoxia is obstructive sleep apnea, asthma, chronic lung disease (COPD, Lung fibrosis), pulmonary hypertension and pulmonary edema, pulmonary embolism, heart failure, airway obstruction, pneumothorax, perinatal choking, anemia, hemoglobin abnormal disease, carbon monoxide poisoning, cyanate poisoning (Cyanide poisoning) is accompanied by a variety of diseases, such as, but not limited to.
  • Local hypoxia is also associated with, but not limited to, ischemic tissue damage, including cerebrovascular, cardiovascular, tumor, and hypoxic ischemic encephalopathy.
  • hypoxia is accompanied by sleep apnea.
  • Hypoxia associated with sleep apnea causes repeated decreases in oxygen saturation in the blood, and oxygen saturation is reduced to 60% -90% (required to wear an oxygen mask), although the upper airway obstruction does not limit this to sleep.
  • the process of restoring oxygen saturation with intense respiratory irritation is repeated every night (Somers VK et al. J Clin Invest 1995; 96: 1897-904).
  • oxygen saturation can drop to less than 60%, in which case there is a high probability of sudden death.
  • Sleep apnea herein is a frequent occurrence of respiratory arrest during sleep, can be divided into obstructive and central sleep apnea. Most patients with sleep apnea have anatomical characteristics that narrow the upper respiratory tract, and obesity accumulates fat in the neck area, enlarges tissues such as the tongue and tonsils, and the upper respiratory tract causes symptoms of sleep apnea. Is obstructive sleep apnea that is closed and exposed to systemic hypoxia during sleep.
  • the main symptom is chronic intermittent hypoxia, and blood oxygen saturation is repeatedly decreased during sleep, and oxygen saturation is 60% to 90% due to upper airway obstruction during sleep (required to wear oxygen mask)
  • the process of restoring oxygen saturation every night with a strong respiratory stimulus Somers VK et al. J Clin Invest 1995; 96: 1897-904.
  • obstructive sleep apnea secondaryly excites the sympathetic nerve, which promotes lipolysis in adipocytes, increasing the amount of free fatty acids in the blood, causing cardiovascular complications (Hucking K. et al. J.).
  • hypoxic-oxygen resupply promotes the production of reactive oxygen species (ROS) resulting in oxidative tissue damage (Schulz R. et al. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162 : 566-70), cytokines such as CRP, IL-6 and TNF-a induce inflammatory responses (Ciftci TU et al. Cytokine 2004; 28: 87-91). In addition, it increases adipokines such as leptin, adiponectin, and lecithin, and adhesions such as ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and L-selectin.
  • ROS reactive oxygen species
  • endoplasmic reticulum stress is increased (Tatsumi K et al. Chest 2005; 127: 716-21) with the increase of the molecule and the accumulation of unfolded protein.
  • obstructive sleep apnea may be accompanied by cardiovascular complications such as hypertension, heart failure, arrhythmia, ischemic heart disease, stroke, and pulmonary hypertension, as well as sudden death, and statistically significant in people with apnea index (number of apneas per hour) of 20 or more.
  • Increased mortality rates have been reported (Shamsuzzaman AS et al.
  • the biomarkers herein can be used for the diagnosis and prognosis of hypoxia with these various symptoms and characteristics, and can also be used for the determination of severity.
  • the severity can be determined according to the correlation with the amount of metabolites through quantitative analysis of the detected metabolites. Higher amounts of metabolites are detected in persistent hypoxia, for example, as disclosed in FIG. 5 according to the present application.
  • a biological sample, or sample refers to a substance or mixture of substances that includes one or more components capable of detecting a biomarker, such as cells, tissues or body fluids derived from an organism, in particular humans, such as sweat, saliva, tears, Include, but are not limited to, body fluids, whole blood, hair, urine, plasma, and serum. It also includes cells or tissues derived directly from an organism as well as cultured in vitro. In one embodiment, urine, whole blood, serum and / or plasma may be used. In another embodiment, a fraction or derivative of said blood, cell or tissue is included. When using a cell or tissue, the cell itself or a fusion of the cell or tissue may be used.
  • a biomarker such as cells, tissues or body fluids derived from an organism, in particular humans, such as sweat, saliva, tears, Include, but are not limited to, body fluids, whole blood, hair, urine, plasma, and serum. It also includes cells or tissues derived directly from an organism as well as cultured in vitro. In one embodiment, urine, whole
  • Detection herein includes quantitative and / or qualitative analysis, including the detection of presence, absence, and measurement of concentration. Such methods are known in the art and those skilled in the art can select appropriate methods for the practice of the present application. There will be.
  • the biomarker according to the present application is arachidonic acid and its derivatives.
  • Arachidonic acid (AA) is the polyunsaturated fatty acid most commonly found in cell membranes. It is a metabolic pathway that leads to hydroxy derivatives through two main pathways: Lipoxygenase (LO), and cyclooxygenase. It is degraded via metabolic pathways that are converted to prostaglandins via Cycloxygenase (COX).
  • the composition of the present disclosure in particular comprises a substance for the detection of AA metabolites produced in the LO pathway.
  • the LO pathway is illustrated schematically in FIG. 1, and as shown in FIG. 1, 5-hydroperoxyeicosatetraionic acid is an intermediate product of the process in which arachidonic acid is produced as leukotriene A4, and arachidone 5 It can be produced by lipoxygenase (arachidonate 5-lipoxygenase).
  • 5-Hydroxyeicosatetraenoic acid is an intermediate of leukotriene biosynthesis and can be produced from 5-hydroperoxyeicosatetraionic acid by peroxidase as shown in FIG. 1.
  • 5-oxo-6,8,11,14-eicosatetraenoic acid can be produced by oxidation by 5-hydroxyeicosanoid dehydrogenase (5-HEDH).
  • the metabolite via the LO pathway is 5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (5-HpETE), 5-hydroxy-6,8,11,14- Eicosatetraenoic acid (5-HETE), or 5-oxo-6,8,11,14-eicosatetraenoic acid (5-oxoETE).
  • AA and its metabolites, i.e., metabolites or derivatives thereof, according to the present application can be detected through various known methods, and appropriate detection methods may be selected at the level of those skilled in the art. See, eg, Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44; E.J. Want et al. Nature Protocols 2010; 5: 1005-1018 and Stanke-Labesque F et al. J Allergy Clin Immunol 2009; 124: 364-70.
  • the present invention is a receptor, ligand, substrate, antibody, antibody fragment, aptamer, avider (avidity multimer) or peptidomimetics that specifically recognizes arachidonic acid and its derivatives Is detected.
  • the detection material may be used for antibody analysis, chemiluminescence analysis, liquid chromatography, mass spectrometry, or the like, and of course, the method may be used for detecting a biomarker according to the present application.
  • biomarkers may be detected using mass spectrometry, for example, Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44 Reference may be made.
  • antibody assays can be used.
  • Antibody assays include substances that specifically recognize AA or derivatives thereof, such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, receptors, ligands, antibody fragments, antibody mimetics, aptamers, avimers (avidity multimer) or peptidomimetic analysis, for example, sandwich-type immunoassay such as ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) can be used.
  • sandwich-type immunoassay such as ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) can be used.
  • This method involves a biological sample on a first antibody bound to a solid substrate such as beads, membranes, slides or microtiterplates made of glass, plastic (eg polystyrene), polysaccharides, nylon or nitrocellulose.
  • the labeling material can be directly or indirectly detected, for example, labeled with a radioactive material such as 3H or 125 I, fluorescent material, chemiluminescent material, hapten, biotin, digoxygenin, or the like, or through action with a substrate.
  • a radioactive material such as 3H or 125 I, fluorescent material, chemiluminescent material, hapten, biotin, digoxygenin, or the like, or through action with a substrate.
  • Proteins can be detected qualitatively or quantitatively through binding of conjugated antibodies with enzymes such as colored or luminescent horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and malate dehydrogenase.
  • immunoelectrophoresis such as Ouchterlony plates, Western blots, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE, which can simply detect markers through antigen antibody binding, can be used.
  • Reagents or materials used in such methods include, for example, antigen-antibody reactions, substrates that specifically bind to the markers, peptide aptamers, receptors or ligands or cofactors that specifically interact with the markers. It can be detected through reaction with or a mass spectrometer can be used.
  • Reagents or materials that specifically interact with or bind to the markers of the present disclosure may be used with chip or nanoparticles.
  • the immunoassay or method of immunostaining is described in Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 and the like.
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • kits of the present disclosure may diagnose the onset or progression and / or prognosis of hypoxia disease through quantitative and / or qualitative analysis of AA and its metabolites in a test subject or a biological sample or sample.
  • kits in the present invention can be used in the various detection methods described above.
  • examples of the types of kits in the present invention include immunochromatography strip kits, ELISA kits, chemiluminescence assay kits, and luminex kits.
  • ELISA kits include antibodies specific for biomarkers. Antibodies are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or recombinant antibodies with high specificity and affinity for each biomarker and little cross-reactivity to other biomarkers.
  • the ELISA kit can also include antibodies specific for the control.
  • Other ELISA kits can bind reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg conjugated with the antibody) and substrates or antibodies thereof. Other materials and the like.
  • Luminex Kit is a high-throughput quantitative method that can simultaneously measure up to 100 different analytes without pretreatment of small (10-20 ⁇ l) patient samples. It is an analytical method that can replace the existing ELISA or ELISPOT because it can be quantified quickly (3-4 hours).
  • the LUMINEX assay is a multiplex fluorescence microplate analysis method that can simultaneously analyze 100 or more biological samples in each well of a 96-well plate, and performs signal transmission in real time using two types of laser detectors. Polystyrene beads of more than 100 different color groups are distinguished and quantified. The 100 beads are configured to be distinguished in the following manner.
  • red fluorescence beads are divided into ten or more stages, and on the other side, orange fluorescence beads are divided into ten stages, showing the difference in intensity.
  • the proportions are mixed in different proportions, making up a total of 100 color-coded bead sets.
  • each bead is attached to the antibody to the material to be analyzed, it is possible to quantify the biomarker by immune antibody response using the same.
  • the Luminex kit capable of carrying out the Luminex assay of the present invention comprises an antibody specific for the biomarker.
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each biomarker and little cross-reactivity to other markers, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • Luminex kits can also include antibodies specific for the control material.
  • Other Luminex kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and their substrates or other substances that can bind to antibodies, and the like. It may include.
  • the antibody may be an antibody conjugated with microparticles, and the microparticles may be colored latex or colloidal gold particles.
  • the hypoxic disorder diagnostic kit comprising a diagnostic immunochromatography strip includes essential elements necessary for performing a rapid test capable of knowing the assay result within 5 minutes. It may be a diagnostic kit characterized in that.
  • the immunochromatography strip may comprise (a) a sample pad in which the sample is absorbed; (b) a binding pad that binds the biomarker material in the sample; (c) reaction membranes treated with a response line and a control line comprising monoclonal antibodies directed against biomarkers; (d) an absorbent pad in which the remaining sample is absorbed; And (e) a support.
  • Antibodies specific for each marker used in an immunochromatography strip are antibodies that have high specificity and affinity and have little cross-reactivity to other proteins, such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. Rapid test kits may also include antibodies specific for control markers. Other rapid test kits include reagents that can detect bound antibodies, such as nitrocellulose membranes to which specific and secondary antibodies are immobilized, membranes bound to beads to which antibodies are bound, absorbent pads and sample pads, and the like. Other substances necessary for diagnosis, and the like.
  • the present disclosure also provides a method for detecting a hypoxia diagnostic marker to provide a physician or patient with information necessary for detecting / diagnosing hypoxia, diagnosing and / or prognostic hypoxia, and in a biological sample isolated from a sample, AA And / or detecting through a quantitative and / or crystallographic analysis of the derivative thereof.
  • the biological sample isolated from the sample may be blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, hair, tissue, cells, or urine of the patient, and in one embodiment of the present invention, hair or urine isolated from the patient, in particular the first urine in the morning. This can be used.
  • the present invention enables qualitative and quantitative analysis of AA and its derivatives through the above-described detection methods, and compares the control group with the control group to determine the onset, progression, or prognosis of hypoxia or hypoxia accompanied by hypoxia. Predict and diagnose.
  • the urine of hypoxia patients is obtained (urine) and the arachidonic acid, 5-HpETE, 5-HETE, or 5-oxoETE in the urine LC / MS (liquid chromatography / mass spectrometer, Liquid Chromatography / Mass Spectrometer) may be used to determine the quantity from each patient's sample, and then the measurements may be used for diagnosis and / or prognosis by comparison with the control.
  • LC / MS liquid chromatography / mass spectrometer, Liquid Chromatography / Mass Spectrometer
  • the control group herein refers to a person who has not had hypoxia-related diseases such as sleep apnea, for example, a simple snoring patient (AHI ⁇ 5) and a sleep apnea patient (AHI) based on the Apnea-Hypopnea Index (AHI). > 5), a simple snoring patient can be a control group, or a sleep disorder other than sleep apnea (eg, a simple insomnia patient) with AHI ⁇ 5 and even no snoring can be a control group.
  • a simple snoring patient can be a control group
  • a sleep disorder other than sleep apnea eg, a simple insomnia patient
  • the threshold of the normal range of the biomarker (cutoff, upper limit for increasing biomarkers / lower limit for decreasing biomarkers) is determined, and the amount of the biomarker for patients suspected of disease. About 50% more than this threshold can be diagnosed as hypoxia. In particular, the amount of the biomarker increases more than twice the threshold, and early differential diagnosis is possible for patients with severe hypoxia.
  • the value is not limited thereto and may vary depending on the type of specific sample used for detecting hypoxia or diagnosing related diseases. For example, when blood or urine is used as the detection sample, the biomarker is likely to be concentrated, so that the rise may be large, and the numerical value may be determined in consideration of this point.
  • This diagnosis of hypoxia using the biomarkers according to the present application can be used alone or in combination with known methods.
  • Biomarkers were performed through the following cells (Example 1-1) and sample analysis from the subject (Example 1-2).
  • the human monocyte-derived THP-1 cell line was cultured under normal oxygen (21% oxygen), low oxygen (1% oxygen), and normal oxygen (reoxygenation) conditions after hypoxia, and then the metabolites contained in the culture were subjected to LC / Q.
  • -TOF MS analysis was used to identify and quantify as follows.
  • hypoxic stimulation was performed on blood cells for a short period of time (within a few days) to measure and present a change in the metabolites. Metabolic changes in body fluids (including blood and urine) when exposed to acute hypoxia It is identified.
  • THP-1 Human-derived mononuclear cells (THP-1) (Korean Cell Line Bank, KCLB No. 40202) in 5x10 ⁇ 5 mL / 4mL medium at 37 ° C in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% FBS (fetal bovine serum)
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the medium except for the cells was separated to obtain an assay sample.
  • the medium was centrifuged at 3000 ° C. at 4 ° C. to separate only the supernatant, aliquoted, stored in a -70 ° C. cryogenic freezer, and thawed immediately before testing.
  • the sample prepared as described above was separated by a system equipped with a Binary Agilent 1200 series HPLC (Agilent Technologies), a reverse phase column Zorbax SB-C18, 50 X 2.1 mm, 1.8 ⁇ m (Agilent Technologies, USA). ⁇ l of analytical sample was injected through a column heated to 40 ° C. A gradient elution of the metabolite samples was performed for 21 minutes at 400 nl / min in 98% solvent A ( 2 mM ammonium formate in H 2 O and 0.1% formic acid) and 2% solvent B (0.1% formic acid in methanol). Blank runs were performed between sample runs to avoid.
  • solvent A 2 mM ammonium formate in H 2 O and 0.1% formic acid
  • solvent B 0.1% formic acid in methanol
  • the Agilent 6530 quadrupole time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer (Agilent Technologies) was coupled to the HPLC, using four centroids per second per spectrum from 100-1100 m / z. ) Data were obtained and m / z of all spectra were corrected in real time from external reference values.
  • Metabolite identification from the mass spectra was first performed using the software (Agilent MassHunter Qualitative Analysis (version B.05.00), Agilent Mass Profiler Professional (version B.02.02)) in HMDB (http: //www.hmdb. ca /) and METLIN (http://metlin.scripps.edu/) databases. Subsequently, additional identification was performed by comparing the cleavage pattern by LC / MS / MS analysis of the metabolite with the actual standard (Cayman, Ann Arbor, MI).
  • the relative concentrations of the metabolites were calculated using the chromatogram areas of the metabolites in the cultures obtained from the same amount of cells.
  • the subjects were selected from patients in their teens to 60s who visited Seoul National University Hospital otolaryngology or Seoul sleep center for snoring or sleep apnea. Patients who were ineligible for surgery and polysomnography and who were unable to collect urine due to kidney disease were excluded. After performing polysomnography, the patients were classified into simple snoring patients (AHI ⁇ 5) and sleep apnea patients (AHI> 5) based on the Apnea-Hypopnea Index (AHI). Patients or insomnia patients were compared with the results of the experimental group of sleep apnea patients.
  • This example is to measure the change in the metabolites in the urine of patients with obstructive sleep apnea showing a disease period of several years to decades, to observe the changes in the metabolites in the body fluid caused by chronic hypoxia.
  • Apnea-hypopnea index is an indicator for determining the severity of sleep apnea. It indicates the number of apnea and partial breathing (low breathing) that occur per hour of sleep. On the basis of moderate 15-30, and greater than 30 severe.
  • Various indicators were collected by conducting a sleep polymorphism test to determine the presence and extent of sleep apnea in the experimental and control groups. And the first urine in the morning of the patient group and the control group were identified and quantified by mass spectrometry as described below to screen biomarkers that increase or decrease in the patient group. The correlation between the candidate groups of acquired biomarkers, clinical symptoms, and major indicators during the polysomnography was analyzed. Finally, AA, 5-HpETE, 5-HETE, and 5-oxoETE were selected as biomarkers.
  • Each biomarker is a relative quantitative value determined by the amount of creatine present in the urine, AHI (higher value indicates more severe sleep apnea) and lower oxygen saturation (normal value 95% or more). The smaller the value, the more severe sleep apnea) was analyzed by Pearson's correlation test as known.
  • Metabolites contained in the subject's urine were identified and quantified as described in Example 1-1 using LC / Q-TOF MS analysis. However, in the quantitative analysis of metabolites using LC / Q-TOF MS, the concentration of urine was corrected using creatinine. The chromatogram area of each metabolite was divided by the chromatogram area of creatinine to calculate the relative concentration of the metabolite.
  • Example 1-1 two kinds of arachidonic acid derivatives 5-HETE and 5-oxoETE were elevated, and in Examples 1-2, arachidonic acid, 5-HpETE, 5-HETE and 5-oxoETE were elevated.
  • the prevalence period of the arachidonic acid or 5-HpETE in addition to 5-HETE or 5-oxoETE is due to hypoxic stimulation for a longer period of time ('chronic') because the disease period is usually several years longer than 10 years. Increased to).
  • Example 1-1 which examined the effects of pure hypoxic stimulation in terms of discovering biomarkers of hypoxic exposure, and metabolism of the subjects in which 1-2 metabolic changes were observed in patients undergoing hypoxic exposure. It supports the possibility of hypoxic markers in sieves.
  • Example 1-1 After culturing THP-1 cells as in Example 1-1 under normal oxygen, hypoxic and hypoxic normal oxygen (reoxygenation) conditions, the metabolites contained in the culture medium were AA and 5-HpETE, 5-HETE, 5 -oxoETE was quantified using LC / Q-TOF MS analysis as in Example 1.
  • Hypoxia-inducible factor (HIF) -1 a major biomodulator in hypoxic environment
  • si-RNA si-RNA
  • si-HIF-1a # 1 and si-HIF-1a # 2 si-RNA
  • metabolite analysis The results are described in FIG.
  • 5-HETE and 5-oxoETE decreased in hypoxic condition (H).
  • 5-HETE and 5- were increased in hypoxic conditions (H) when treated with HIF-1 inhibitors 2-methoxyestradiol (2ME2), 17-N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) and YC-1.
  • oxoETE was decreased, which means that 5-HETE and 5-oxoETE increased in HIF-1 dependent manner in the hypoxic condition (H).
  • HIF-1 hypoxic condition
  • the increase of 5-HETE and 5-oxoETE under hypoxic conditions reflects hypoxic specific in vivo changes.
  • HIF dependent increase indicates that this increase in metabolites according to the present application is closely related to the hypoxic environment.
  • THP-1 cells a human-derived blood cell line
  • a human-derived blood cell line were reconfirmed using primary human polymorphonuclear cells from PromoCell, Germany.
  • Mononuclear Cell Medium (C-28030) manufactured by PromoCell was used, and the analysis was performed according to the method of Example 1.
  • the results are described in FIG. As shown in FIG. 5, 8 hours of hypoxic condition (H8) and 8 hours of intermittent hypoxic condition (IH8, 30 minutes every hour, 1% oxygen, every 30 minutes after 21% oxygen) ), 5-HETE and 5-oxoETE were elevated.
  • 5-HETE and 5-oxoETE were also elevated.
  • 5-oxoETE it was increased even when cultured under normal oxygen conditions (IH8R16) for 16 hours after 8 hours of intermittent oxygen conditions.
  • GPX Glutathione Peroxidase
  • GPX activity was measured using a GPX assay kit (ab102530, Abcam), and the principle of measuring GPX activity in the kit is as follows. GPX first converts reduced glutathione (GSH) into oxidized glutathione (GSSG), which consumes NADPH when it is reduced back to GSH by glutathione reductase (GR). Therefore, the activity of GPX can be defined by measuring the degree of reduction of NADPH by measuring the absorbance at 340 nm using a spectrophotometer.
  • hypoxia exposure can be determined by detecting the concentration of arachidonic acid, 5-HpETE, 5-HETE, and 5-oxoETE markers according to the present application.
  • Metabolites were detected in the control and obstructive sleep apnea patients using the method described in Example 1-2-2, and the correlation between the lowest oxygen saturation collected in the sleep polysomnography measured on the same day was observed using Pearson's correlation test. Metabolites were quantified by correction with creatinin (cre) in urine.
  • 5-HpETE As metabolism progressed through arachidonic acid, 5-HpETE, 5-HETE, and 5-oxoETE, it was confirmed that the higher the urine of obstructive sleep apnea patients was.
  • 5-HETE and 5-oxoETE were detected higher in urine of patients with severe sleep apnea than mild to reflect the severity of the disease.
  • the data were calculated using mean and standard deviation, and the difference between tissues of the same patient was analyzed using Wilcoxon signed rank test, a nonparametric test, and the difference between experimental and control group was analyzed using Mann-Whitney test. Correlation analysis was performed between selected biomarkers and existing major disease markers, and stratification analysis was performed as necessary.

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Abstract

본원은 아라키돈산 및 그 유도체 검출용 물질을 포함하는 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 본원에 따른 조성물, 키트 및 방법은 생물학적 시료에서 생체 표지자의 검출을 통해 간편하고 신속하게 저산소증의 유무 검출 및 이를 이용하여, 저산소증에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 조기 진단, 질환의 중증도, 치료 효과 판정 또는 경과추적 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

저산소증 검출 또는 이와 관련된 질환의 진단 방법
본원은 저산소증 검출 또는 이와 관련된 질환 진단 기술분야이다.
저산소증은 인체가 생명을 유지하는데 필요한 양의 산소를 공급받지 못하는 병적 상태를 통칭하는 것이다. 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 주산기 질식 등 매우 다양한 질환에서 핵심적인 병인으로 작용하는 것으로 알려져 있다 (Savransky et al. Am J Respir Crit Care Med. 2007;175(12):1290-7). 또한 국소적 저산소증은 뇌혈관, 심혈관 질환, 종양과 같은 주요 사망 질환의 중심적인 병태생리 요소이다. 생체는 환경적인 변화(고산지대 등)나 호흡기 질환 등 여러 가지 원인으로 자주 저산소 상태에 노출될 수 있으나 다양한 보상 기작에 의해 산소의 항상성은 개체와 조직 수준에서 매우 정교하게 조절되고 있다.
이러한 저산소증 관련 질환에서 전신 또는 특정 기관(organ)이 저산소증에 얼마나 노출되어 있는지를 판정하는 것은 질환의 병인을 이해하고, 진단하는데 있어 핵심이 된다. 그러나 지금까지 저산소증의 진단은 특정 순간 혈액의 산소포화도를 측정하는 수준에 머물러 있다. 현재 널리 사용되는 광학적 산소포화도 측정기는 헤모글로빈의 산소 결합 정도에 따른 흡광도의 차이를 통해 비관혈적으로 산소포화도를 계측한다. 보다 침습적으로는 환자의 동맥혈을 채취하여 동맥혈 가스분석검사를 통해 혈액내 산소, 이산화탄소 등의 함량을 계측할 수 있다. 이 두 가지 방법 모두 특정 순간의 혈액내 산소공급 정도를 가늠할 수 있을 뿐, 일정 기간 동안의 저산소 노출 정도를 알려주지 못한다. 또한 환자에게 측정기를 부착하여야 하거나, 동맥 천자와 같은 침습적인 행위를 피할 수 없다. 따라서 만성 저산소증의 평가는 저산소증 관련 질병의 병태생리를 정확히 규명하는 것임은 물론, 질환의 중증도와 저산소증 노출 정도 간의 상관분석을 가능하게 하여 저산소증과 관련된 질환의 진단, 경과 관찰, 예방함에 있어 핵심이 된다.
저산소유도인자로 알려진 HIF (Hypoxia inducible factor)는 저산소 환경에서, 세포의 저산소 적응에 필요한 60여종의 유전자를 조절하는 전사인자로서, HIF 표적 단백질은 혈관신생 및 확장, 에너지 생산, 세포 증식과 생존, 또는 세포 이동 등에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Brahimi-Horn MC, et al. J Mol Med. 2007;85(12):1301-7; Wykoff et al. Cancer Res. 2000;60(24):7075-83; Park JW et al. J Pharmacol Sci. 2004 ;94(3):221-32; 및 Gort et al. Curr Mol Med. 2008 ;8(1):60-7).
미국 특허 공개공보 제2004-0265926호는 조직의 저산소증 체액 마커에 관한 것으로, 심장 질환의 임상적 증상의 한 특징으로서의 저산소증을 검출할 수 있는 단백질 마커인 ORP 150 (oxygen related protein 150)을 개시한다.
세포는 저산소 적응 과정 속에서 다양한 대사체를 생성 분비하며, 이러한 대사체의 종류나 양은 정상 산소 환경에서 분비되는 대사체와 크게 다를 것으로 추정되나 (Majmundar, et al. Mol Cell. 2010;40(2):294-309), 이에 관하여는 아직 보고된 바는 없으며, 세포로부터 분비되는 대사체의 발굴을 통한 저산소증 표지자 발굴이 요구된다.
본원은 저산소증을 검출할 수 있는 생체 표지자 및 이를 이용한 관련 질환의 검출 또는 진단 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 아라키돈산 또는 그 유도체 검출용 물질을 포함하는, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 조성물 또는 진단 방법을 제공한다.
일 구현예에서 본원에 포함되는 아라키돈산 유도체는 상기 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체이며, 특히 상기 아라키돈산 유도체는 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-HPETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5-옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-oxoETE)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의 조성물에 포함되는 검출용 물질로는 아라키돈산 또는 그 유도체를 특이적으로 인식할 수 있는 물질로 검출가능한 것이면 제한되지 않으며, 예를 들면 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 검출용 물질은 상기 물질에 적합한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법으로 검출될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일구현예에서 저산소성 관련 질환은 저산소증에 의해 질환이 유발되는 경우를 포함하는 것으로 예를 들어 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 저산소성 허혈 뇌병증, 주산기 질식, 뇌혈관, 심혈관 질환, 또는 종양을 포함하나 이로 제한하는 것이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 저산소증은 급성 또는 만성의 전신성 또는 국소성 저산소증을 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 급성 또는 만성의 저산소증이라 함은 저산소증의 진행 양태에 따른 분류로, 급성 저산소증은 천식, 폐부종, 폐전색, 기도폐색, 주산기 질식, 일산화탄소 중독, 뇌혈관 및 심혈관의 폐색이나 출혈 등을 포함하며, 만성 저산소증에는 폐쇄성 수면 무호흡증, 만성 폐질환(COPD, lung fibrosis), 폐동맥고혈압, 심부전, 빈혈, 혜모글로빈 이상 질환, 종양 등이 포함되나 이로 제한하는 것은 아니다.
또한 본원에서 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 기도폐색, 기흉, 주산기 질식, 빈혈, 헤모글로빈 이상 질환, 일산화탄소 중독, 시안산 중독(cyanide poisoning)에 수반될 수 있으며, 상기 국소성 저산소증은 뇌혈관, 심혈관, 종양, 저산소성 허혈 뇌병증을 포함한 허혈성 조직 손상에 수반될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
상기 언급한 만성 또는 급성의 전신성 또는 국소성이라는 표현은 단정적인 것이 아니다. 즉 동일한 질환이라도 여러 조합의 질병 양상이 존재할 수 있으며, 본원에 기술된 다양한 질환은 특별한 임상 상황이라기 보다는 저산소증의 존재에 의한 변화이다. 예를 들어 폐부종은 간단히 폐실질내 물이 차서 폐포와 폐혈관 사이에 기체교환이 일어나지 않는 질환으로, 이러한 질환이 갑작스럽게 예를 들면 통상 3개월 이내, 다른 급성 질환은 이보다 이른 수일 에서 수주이내 진행하는 경과를 갖는 경우, 급성이 될 수도 있으며, 폐부종 다른 기전질환에 의해 2차적으로 발생하는 경우, 만성으로 분류될 수도 있다. 또한 폐부종이 경한 상태에서는 부종이 동반된 폐 주변부만 산소공급을 못 받고 부종이 동반되지 않은 다른 정상 폐 부위에서 기체교환이 일어나서 전신적으로 산소공급이 원활한 상황은 국소적(폐의 일부에만) 저산소증 이라 할수 있겠지만, 만일 폐부종이 심해서 폐의 대부분이 기체교환을 못하는 상황이 되면 전신으로 산소공급이 안되고 전신적 저산소증을 초래하게된다. 이런 측면에서 임상 질환에서 보여지는 저산소증은 간헐성 또는 지속성 만성 저산소증, 급성 저산소증, 저산소성저산소증, 빈혈저산소증, 울혈저산소증, 조직독성저산소증, 또는 수용성 저산소증 등 다양항 양태를 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 저산소증 검출 또는 저산소성 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 저산소증 마커를 검출하는 방법을 제공하며, 일 구현예에서 상기 방법은 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 아라키돈산 또는 그 유도체, 예를 들면 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체, 예를 들면 5-HpETE, 5-HETE, 또는 5-oxoETE를 검출하는 것을 포함한다.
본원에 따른 방법에서 아라키돈산 또는 그 유도체 측정은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법 중 하나 이상에 의해 수행될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
또 다른 양태에서 본원은 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단에 사용되는 아라키돈산 또는 그 유도체를 제공한다.
본원에 따른 생체 표지자로서 아라키돈산 또는 그 유도체, 조성물, 키트 및 방법은 본원에 따른 유도체의 검출이 가능한 다양한 생물학적 시료 예를 들면 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 눈물, 땀, 뇨 등을 포함하는 체액, 머리카락, 세포, 조직에 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원은 저산소성 질환 환자 또는 저산소증이 의심되는 환자에서 아라키돈산 대사체의 검출을 통해 정확하면서도, 간편하고 신속하게 저산소증 노출 유무의 판별이 가능하며, 이를 통해 저산소성 질환 예를 들면 수면무호흡증의 조기진단 또는 진단이 가능하여, 수면무호흡증으로 인한 다양한 합병증의 예방할 수 있다. 또한 치료 후 저산소증의 개선 정도에 대한 효과 판정 및 질환의 경과 추적 관찰이 가능하다.
도 1은 아라키돈산의 5-리폭시게나제 (5-LO) 경로 및 대사체를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 단핵구 기원의 THP-1 세포주에서 저산소에 의해 증가하는 아라키돈산 유래 대사체를 나타낸다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); ReOxy, reoxygenation. *P < 0.05.
도 3은 저산소 유도인자 억제 시 표적 대사체가 감소하는 것을 나타내는 결과이다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); R, reoxygenation. *P<0.05, **P<0.01.
도 4는 저산소 유도인자 억제약물 투여시 표적 대사체가 감소하는 것을 나타내는 결과이다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); R, reoxygenation. *P<0.05, **P<0.01.
도 5는 인간 일차 단핵세포 (primary monocyte)에서 저산소에 의해 증가하는 아라키돈산 유래 대사체를 나타낸다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); IH, intermittent hypoxia; R, reoxygenation. *P<0.05, **P<0.01.
도 6은 인간 일차 단핵세포에서 저산소 유도인자 억제 시 표적 대사체가 감소하는 것을 나타내는 결과이다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); IH, intermittent hypoxia; R, reoxygenation; siH1, silencing HIF-1alpha. *P<0.05, **P<0.01.
도 7은 5-HpETE를 5-HETE로 변환시키는 Glutathione Peroxidase (GPX)의 활성이 저산소 환경에서 증가하는 것을 나타낸다. N, normoxia (21% O2); H, hypoxia (1% O2); R, reoxygenation. *P<0.05.
도 8은 수면 무호흡증(OSA) 환자의 아침 첫 뇨에서 아라키돈산 대사체가 증가하는 것을 나타낸 결과이다.
도 9는 수면 무호흡증 환자의 소변에서 증가하는 아라키돈산 대사체와 최저산소포화도와의 상관관계를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 수면 무호흡증 환자의 소변에서 증가하는 대사체와 무호흡-저호흡 지수(AHI)와의 상관관계를 그래프로 나타낸 것이다.
상기 도면에 기재된 결과에서 모든 통계 분석은 IBM SPSS 18 (SPSS, Inc, Chicago, Ill)통계 프로그램을 사용하였고, Mann-Whitney U test를 이용하여 검정하였다.
본원은 저산소증 시료에서 특징적으로 발견되는 생체 표지자의 발견에 근거한 것이다.
한 양태에서 본원은 아라키돈산 및 그 유도체 검출용 물질을 포함하는 저산소증 검출/진단 또는 저산소성 질환 진단용 조성물 및 이를 이용한 대상체 예를 들면 저산소성 질환 환자 또는 저산소증이 의심되는 환자의 저산소증 검출/진단 또는 저산소성 질환 진단 방법에 관한 것이다.
본원에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 질환의 진행상태 판별 또는 치료에 대한 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
본원에서 용어 "검출"은 저산소증의 존재 유무 또는 정도를 판단하는 것으로, 진단과 동일한 의미로 해석될 수도 있다. 예를 들면 수면 무호흡증처럼 질환자체가 저산소증을 일으키는 질환인 경우 저산소증의 유무를 검출하는 것이 질환의 진단이 될 수 있으며, 저산소증의 정도를 판정하는 것이 중증도의 진단이 될 수 있다. 다른 경우에는 저산소증에 의해 질환이 유발되는 경우, 예를 들어 폐고혈압, 저산소성 허혈 뇌병증과 같은 경우에는 환자의 전신 또는 그 신체의 특정 기관이 저산소 상태인지 여부를 검출하여, 해당 질환의 예방, 조기 진단에 활용될 수 있다.
본원에서 용어 "진단용/검출용 생체 표지자 또는 마커"란 정상시료와 환자시료, 혹은 치료 후 호전된 환자의 시료와 호전되지 않은 환자의 시료를 구분 또는 판별할 수 있는 것을 의미한다. 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 시료 또는 환자에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 지질, 당지질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본원에서 저산소증 환자에서 그 양의 증가되는 아라키돈산 및 그 유도체를 포함한다.
본원에 따른 생체 표지자는 하나 또는 두 개 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 또한 필요한 경우 기존의 진단 방법과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.
본원에서 저산소증 또는 저산소성 질환은 산소운반과 활용 과정에서의 장애를 일컫는 것으로 동맥혈 산소함량의 감소 자체 혹은 조직내 산소 필요량의 증가로 인해, 조직내의 산소가 정상치 또는 필요량 아래로 감소한 상태를 의미한다. 그 종류로는 동맥혈의 산소분압이 감소하여 초래된 만성 간헐성 또는 지속성 저산소증, 급성 저산소증, 저산소성저산소증, 빈혈저산소증, 울혈저산소증, 조직독성저산소증, 수용성저산소증을 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원의 표지자는 저산소증의 정도와 기간을 반영하는 누적표지자로서 작용할 수 있으며, 이러한 관점에서 지속성 저산소증 또는 만성 간헐성 저산소증, 특히 지속성 저산소증 진단에 사용된다.
다른 측면에서 저산소증은 전신성 또는 국소적 저산소증을 포함하는 것이다. 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 기도폐색, 기흉, 주산기 질식, 빈혈, 헤모글로빈 이상 질환, 일산화탄소 중독, 시안산 중독(cyanide poisoning) 등과 같은 매우 다양한 질환에 수반되는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 국소적 저산소증은 뇌혈관, 심혈관, 종양, 저산소성 허혈 뇌병증을 포함한 허혈성 조직 손상에 수반되는 것이나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서 저산소증은 수면 무호흡증에 수반되는 것이다. 수면 무호흡증에 수반되는 저산소증은 혈중 산소 포화도의 반복적인 저하가 발생하는 것으로, 수면 중 상기도 폐쇄로 산소 포화도가 이로 제한하는 것은 아니나 60%-90% (산소마스크 착용이 필요한 정도)로 감소하였다가 강력한 호흡자극이 유발되면서 산소포화도가 회복되는 과정이 매일 밤 반복되는 것이다(Somers VK et al. J Clin Invest 1995;96:1897-904). 특정한 경우에 산소포화도가 60%미만까지 내려가기도 하며 이 경우 돌연사의 발생 가능성이 높다.
본원에서 수면무호흡증은 수면 중 호흡 정지가 빈번하게 발생하는 것으로서, 폐쇄성과 중추성 수면 무호흡증으로 나눌 수 있다. 수면 무호흡 환자의 대부분이 상기도 공간이 좁아지는 해부학적 특성을 가지고 있으며, 비만으로 목 부위에 지방이 축적되거나, 혀, 편도 등의 조직이 비대해져 상기도가 좁아지면 수면 무호흡 증상이 나타나며, 대부분은 상기도가 폐쇄되어 수면중 전신적 저산소증(systemic hypoxia)에 노출되는 폐쇄성 수면 무호흡증(obstructive sleep apnea)이다. 주요 증상으로는 만성 간헐성 저산소증 (chronic intermittent hypoxia)이 나타나며, 수면시 혈중 산소 포화도가 반복적으로 저하되는 것으로, 수면 중 상기도 폐쇄로 산소 포화도가 60%-90% (산소마스크 착용이 필요한 정도임)로 감소하였다가 강력한 호흡자극이 유발되면서 산소포화도가 회복되는 과정이 매일 밤 반복되는 것이다(Somers VK et al. J Clin Invest 1995;96:1897-904). 또한, 폐쇄성 수면 무호흡증은 이차적으로 교감 신경을 흥분시키고 이는 지방세포에서 지방분해를 촉진하여 혈중 자유 지방산(free fatty acid)의 양을 증가시켜 심혈관 합병증의 원인으로 작용하며 (Hucking K. et al. J Clin Invest 2003;111:257-64), 저산소-산소 재공급은 ROS(reactive oxygen species)의 생성을 촉진하여 산화성 조직 손상을 야기하고(Schulz R. et al. Am J Respir Crit Care Med 2000;162:566-70), CRP, IL-6 및 TNF-a 등의 사이토카인이 염증반응을 유도한다(Ciftci TU et al. Cytokine 2004;28:87-91). 이 밖에도 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 레시스틴(resistin)과 같은 아디포카인(adipokines)을 증가시키고 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 및 L-selectin과 같은 세포부착분자(adhesion molecule)의 증가, 그리고 비접힘 단백질(unfolded protein)의 축적으로 소포체(endoplasmic reticulum) 스트레스를 증가(Tatsumi K et al.Chest 2005;127:716-21)시킨다. 이와 같이 폐쇄성 수면 무호흡증은 돌연사뿐만 아니라 고혈압, 심부전, 부정맥, 허혈성 심장질환, 뇌졸증, 폐성 고혈압 등의 심혈관 합병증을 동반할 수 있으며, 무호흡지수(시간당 무호흡의 횟수)가 20이상인 사람에서 통계적으로 유의한 사망률 증가가 보고되고 있으며(Shamsuzzaman AS et al. JAMA 2003;290:1906-14), 이 외에도 수면분절로 인한 심한 주간기면 및 피로감, 과다졸음의 이차적 증상으로 역행성 기억상실, 주의집중력 저하, 판단력 저하, 다양한 성격 변화(공격적 성격, 자극과민성, 불안감, 우울증), 발기부전 등을 가져올 수 있다(Simon S. et al. Chest. 2012 Dec;142(6):1645-51).
본원의 생체 표지자는 이러한 다양한 증상 및 특징을 갖는 저산소증의 진단 및 예후 측정에 사용될 수 있으며, 또한 중증도 판단에 사용될 수 있다. 중증도 판단의 경우, 검출되는 대사체의 정량적 분석을 통해 대사체의 양과의 상관관계에 따라 중증도를 판단할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 도 5에 개시된 바와 같이 지속적 저산소증에서 더 많은 양의 대사체가 검출된다.
본원에서 생물학적 시료, 또는 검체란 생체 표지자의 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 땀, 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 머리카락, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 한 구현예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.
본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 생체 표지자는 아라키돈산 및 그 유도체이다. 아라키돈산 (arachidonic acid, AA)은 세포막에서 가장 많이 존재하는 폴리불포화지방산으로, 두 가지의 주 경로, 즉 리폭시게나제 (Lipoxygenase, LO)을 통해 하이드록시 유도체로 되는 대사경로, 및 시클로옥시게나제 (Cycloxygenase, COX)를 통해 프로스타글란딘으로 전환되는 대사경로를 통해 분해된다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원의 조성물은 특히 LO 경로에서 생성되는 AA 대사체의 검출용 물질을 포함한다. LO 경로는 도 1에 도식적으로 기재되어 있으며, 도 1에 나타난 바와 같이 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에온산은 아라키돈산이 류코트리엔 A4(leukotriene A4)으로 생성되는 과정의 중간 생성물이며, 아라키도네이트 5-리폭시게나제(arachidonate 5-lipoxygenase)에 의하여 생성될 수 있다. 5-하이드록시에이코사테트라에노산은 류코트리엔 생합성의 중간체이며, 도 1에 나타난 바와 같이 퍼옥시데이즈(peroxidase)에 의하여 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산으로부터 생성될 수 있다. 5-옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산은 5-하이드록시에이코사노이드 디하이드로게나제(5-hydroxyeicosanoid dehydrogenase (5-HEDH))에 의하여 산화되어 생성될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 LO 경로를 통한 대사체는, 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오노산(5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid, 5-HpETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5- 옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-oxoETE)를 포함한다.
본원에 따른 AA 및 그 대사산물 즉 그 대사체 또는 유도체는 공지된 다양한 방법을 통해 검출될 수 있으며, 당업자수준에서 적절한 검출방법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44; E.J. Want et al. Nature Protocols 2010; 5: 1005 - 1018 및 Stanke-Labesque F et al. J Allergy Clin Immunol 2009;124:364-70를 참조할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 아라키돈산 및 그 유도체를 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 이용하여 검출된다. 상기 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피질량분광분석방법 등에 사용될 수 있으며, 당연히 상기 방법이 본원에 따른 생체표지자 검출에 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면 질량분광분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 생체표지자를 검출할 수 있으며, 예를 들면 Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44을 참조할 수 있다.
또 다른 구현예에서는 항체 분석법이 사용될 수 있다. 항체 분석은 본원에 따른 AA 또는 그 유도체를 특이적으로 인식하는 물질, 예를 들면 폴리클로날항체, 모노클로날 항체, 수용체, 리간드, 항체단편, 항체모방체, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체를 이용하여 분석하는 것으로, 예를 들면, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.
다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다.
이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 기질, 펩타이드 앱타머, 상기 표지자와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다.
상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 저산소증 질환 진단용 키트를 제공한다. 본원의 키트는 검사 대상 또는 검사 대상의 생물학적 검체 또는 시료에서 AA 및 그 대사체의 정량 및/또는 정성적 분석을 통해, 저산소증 질환의 발병 또는 진행 정도 및/또는 예후를 진단할 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 다양한 검출 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, ELISA키트, 화학발광분석용 키트 및 루미넥스(luminex)키트 등을 들 수 있다. ELISA 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 생체 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클론항체, 폴리클론항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
루미넥스 키트는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 분석물을 동시에 측정할 수 있는 대용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 ELISA나 ELISPOT을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이는 96-웰 플레이트에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 분석방법으로 두 종류의 레이져 검출기를 이용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도의 차이를 보이며 그 사이의 비드들은 레드와 오렌지 색의 비율이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 물질에 대한 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 생체표지자의 정량이 가능하다.
본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 물질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미세입자(micro particle)와 접합된 항체일 수 있으며, 또한 상기 미세입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.
본 발명의 저산소성 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 저산소성 질환 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드; (b) 시료 내의 생체 표지자 물질과 결합하는 결합 패드; (c) 생체 표지자에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선 및 대조선이 처리되어 있는 반응 막; (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드; 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 면역크로마토그래피 스트립에 사용되는 각 표지자에 특이적인 항체는 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 표지자에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 저산소증 검출/진단, 저산소성 질환의 진단 및/또는 예후 측정에 필요한 정보를 의사 또는 환자에게 제공하기 위하여 저산소증 진단 마커를 검출하는 방법으로서, 검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, AA 및/또는 그 유도체의 정량 및/또는 정석 분석을 통한 검출을 수행하는 것을 특징으로 하는 저산소증 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 검체로부터 분리된 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 머리카락, 조직, 세포 또는 환자의 뇨(urine)일 수 있으며, 본원의 일 실시예에서는 환자로부터 분리된 머리카락 또는 뇨로서 특히 아침 첫소변이 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, AA 및 그 유도체의 정성 및 정량 분석이 가능하며, 이를 대조군과 비교함으로써 저산소증, 또는 저산소증이 수반되는 저산소성 질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 저산소증 환자의 뇨(urine)을 수득하여 상기 뇨 중의 아라키돈산, 5-HpETE, 5-HETE, 또는 5-oxoETE를 LC/MS(액체 크로마토그래피/질량분석기, Liquid Chromatography/Mass Spectrometer) 방법을 수행하여 각 환자의 시료로부터 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 대조군과 비교하여 진단 및/또는 예후 측정에 사용될 수 있다.
본원에서 대조군이란 저산소증 관련 질환 예를 들면 수면 무호흡증이 걸리지 않은 사람으로 예를 들면 무호흡 저호흡 지수(Apnea-Hypopnea Index, AHI)를 기준으로 단순 코골이 환자(AHI<5)와 수면 무호흡증 환자(AHI>5)로 감별하여, 단순 코골이 환자를 대조군으로 할 수 있거나, 또는 AHI<5 이며 코골이 조차 없는 수면무호흡증 이외의 수면질환자 (예로 단순 불면증 환자)가 대조군이 될 수 있다.
그 예로 대조군에서 해당 생체 표지자의 정상범위의 임계값(cutoff, 증가하는 생체표지자의 경우에는 상한치/감소하는 생체표지자의 경우에는 하한치)을 결정하여, 질환이 의심되는 환자의 경우 해당 생체표지자의 양이 임계값보다 약 50% 이상 증가한 경우 저산소증 환자로 진단할 수 있다. 특히 해당 생체표지자의 양이 임계값보다 약 2 배 이상 증가 중증도 저산소증 환자로 조기 감별진단이 가능하다. 하지만 수치는 이에 한정되는 것이 아니고, 저산소증 검출 또는 관련 질환의 진단을 위해 사용되는 구체적 시료의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 검출 시료로서 혈액 또는 소변을 사용하는 경우, 생체표지자가 농축될 가능성이 높아 상승폭이 클 수도 있으며, 이러한 점을 고려하여, 수치를 결정할 수 있을 것이다. 또한 저산소증 환자에서 치료 후 해당 생체 표지자가 정상 범위 내로 회복되는 지를 확인하여 치료 성과에 대한 판정 및 추적 관찰이 가능하다. 이러한 본원에 따른 생체표지자를 이용한 저산소증 진단은 단독으로 또는 공지된 방법과 함께 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 생체 표지자 선별
생체 표지자는 다음과 같은 세포 (실시예 1-1) 및 피험자 유래의 시료 분석 (실시예 1-2)을 통해 수행되었다.
실시예 1-1 THP-1 세포주를 이용한 생체 표지자 선별
인체 단핵구 유래 세포주인 THP-1 세포주를 정상산소 (21% 산소), 저산소 (1% 산소), 그리고 저산소 후 정상산소(재산소화) 조건에서 배양한 뒤, 배양액에 포함된 대사체를 LC/Q-TOF MS 분석법을 이용하여 다음과 같이 동정 및 정량하였다.
본 실시예는 혈구 세포에 다양은 저산소 자극을 단기간(수일 이내) 처치하여, 해당 대사체의 변화를 측정 및 제시한 것으로 급성 저산소증에 노출시 체액(혈액 및 소변 등을 포함)내의 대사체 변화를 규명한 것이다.
① 세포 배양
5x10^5 개/4mL 배지의 인체 유래 단핵구 세포 (THP-1)(Korean Cell Line Bank, KCLB No. 40202)를 10% FBS (fetal bovine serum)이 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37℃에서 정상산소 조건(21% O2, 5% CO2) 또는 저산소 조건(1% O2, 5% CO2)에서 24시간 동안 또는 저산소후 정상산소 (재산소화) 조건에서 각각 8시간 및 16 시간 배양하였다.
이어 세포를 제외한 배지를 분리하여 분석 시료를 수득하였다. 배지는 3000rpm으로 4℃에서 원심분리하여 상층액만을 분리하고, 이를 분주하여 -70℃ 초저온냉동고에 보관한 뒤 시험 직전 해동하여 사용하였다.
저산소 환경에서 주요 생체 조절자인 Hypoxia-inducible factor(HIF)-1의 발현을 감소시키기 위해서 si-HIF-1alpha 2종(#1, 5' -CAAAGUUAAAGCAUCAGG-3' ; #2, 5' -UGUACUGUCCUGUGGUGA-3' )을 제작하여, Lipofectamine RNA iMAX reagents (Life Technologies, USA)를 이용하여 제조자의 방법대로 전달이입하였다. 또한 HIF-1 억제약물인 2-methoxyestradiol (2ME2), 17-N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG)는 Selleck chemicals로부터 구입하였으며, YC-1은 A.G. Scientific으로부터 구입하여 사용하였다. 2ME2 와 17-AAG 모두 100μM의 농도로 저산소 환경 노출시간 동안 함께 처리하였다.
② 분석시료 준비
1.5 ml 마이크로튜브에 4℃ H2O (400μl)와 배지 시료 (100μl)을 넣어 희석하였다. 이어 볼텍서(vortexer)를 이용하여 상기 시료를 잘 혼합한 후에, 4℃, 14,000 g에서 20 분 동안 여과/원심분리 후 상층액을 취하여 분석 바이알(vial)에 따로 수집하였다. 또한 QC (quality control) 분석을 위하여, 모든 시료로부터의 상기 희석 샘플 50μl씩을 모두 혼합 (pooling) 하였다.
③ LC/Q-TOF MS 분석에 의한 대사체 분석
상술한 바와 같이 준비한 시료를 역상 컬럼인 Zorbax SB-C18, 50 X 2.1 mm, 1.8 μm (Agilent Technologies, USA)을 Binary Agilent 1200 series HPLC (Agilent Technologies)에 장착한 시스템에 의하여 분리하였으며, 이 때 5 μl의 분석 샘플이 40℃로 가열된 컬럼을 통과하도록 주입하였다. 98% 용매 A (H2O 중의 포름산 암모늄 2mM과 포름산 0.1%)와 2% 용매 B (메탄올 중의 포름산 0.1%)에서 400nl/min으로 21분 동안 대사체 샘플의 구배 용리를 수행하였으며, 교차 오염을 피하기 위하여 샘플 조작 사이에서 블랭크 조작 (blank run)을 수행하였다.
HPLC에 Agilent 6530 quadrupole time-of-flight (Q-TOF) 질량 분석기 (Agilent Technologies)를 커플링 시켜 ESI 알고리즘을 사용하였고, 100-1100 m/z로부터 한 스펙트럼 당 1초에 4개의 센트로이드 (centroid) 데이터를 얻었고, 모든 스펙트럼의 m/z은 외부에서 넣어 준 참조 값으로부터 실시간으로 교정하였다.
질량 스펙트럼(mass spectra)으로부터의 대사체 동정은 먼저 소프트웨어 (Agilent MassHunter Qualitative Analysis (version B.05.00), Agilent Mass Profiler Professional (version B.02.02))를 사용하여 HMDB (http://www.hmdb.ca/)와 METLIN (http://metlin.scripps.edu/) 데이터베이스에 대하여 수행하였다. 이후에 해당 대사체의 LC/MS/MS 분석에 의한 쪼개짐 패턴을 실제 표준 물질(Cayman, Ann Arbor, MI)과 비교하여 추가적인 확인 작업을 수행하였다.
④ LC/Q-TOF MS를 이용한 대사체 정량 분석
동량의 세포로부터 얻어진 배양액에서 각각 대사체의 크로마토그램 면적을 이용하여 해당 대사체의 상대적 농도를 계산하였다.
정산산소 조건의 세포 배양액보다 저산소 조건 배양액에서 유의미하게 증가하는 대사체를 스크리닝 하였고, 5-HETE와 5-oxoETE 두 대사체가 저산소 배양 조건에서 통계적으로 유의미한 상승이 동반되었다. 이에 5-HETE와 5-oxoETE 및 이의 상위 대사체 AA 및 5-HpETE를 생체표지자로 선정하였다.
실시예 1-2 피험자를 이용한 생체 표지자의 선별
실시예 1-2-1 피험자 모집 및 실험군/대조군 설정
코골이 또는 수면무호흡증으로 서울대학교 병원 이비인후과 또는 서울수면센터를 내원한 10대부터 60대까지의 환자 중 수면다원검사를 시행하고 연구에 동의한 환자를 대상으로 피험자를 선정하였으며, 종양의 과거력이 있거나 수술 및 수면다원검사에 부적합한 환자, 신장질환 등으로 뇨의 채취가 불가한 환자는 제외하였다. 수면다원검사(polysomnography)를 시행한 후 무호흡 저호흡 지수(Apnea-Hypopnea Index, AHI)를 기준으로 단순 코골이 환자(AHI<5)와 수면 무호흡증 환자(AHI>5)로 감별하여, 단순 코골이 환자 또는 불면증 환자를 대조군으로 하여 수면 무호흡증 환자인 실험군의 결과와 비교 분석하였다.
본 실시예는 보통 수년에서 수십년의 유병기간을 보이는 폐쇄성 수면 무호흡증 환자의 소변에 해당 대사체의 변화를 계측한 것으로, 만성 저산소증에 의한 체액에서의 해당 대사체의 변화를 관찰하기 위한 것이다.
[표 1]
Figure PCTKR2014003770-appb-I000001
시험군과 대조군 모두에서 성별, 나이, 신장, 체중, 목둘레, 허리둘레 등의 환자의 기본 정보를 조사하고, 수면 무호흡 환자에서 필수적으로 확인하는 기초 혈액 검사(CBC, admission panel, 등)와 방사선 검사(cephalometry) 결과를 수집하였다.
무호흡 저호흡 지수(Apnea-hypopnea index, AHI)는 수면무호흡증의 중증도를 판단하는 지표로, 수면 1시간당 발생하는 무호흡, 부분호흡(저호흡) 횟수를 나타내며, 정상 0-4, 경증 5-14, 중간정도 15-30, 및 중증 30 초과를 기준으로 분류하였다.
실시예 1-2-2 생체 표지자 선별
실험군과 대조군에서 수면 무호흡의 유무와 정도를 알아보는 수면다원검사를 실시하여 다양한 지표들을 수집하였다. 그리고 환자군과 대조군의 아침 첫소변을 질량분석 방법을 통해 대사체를 하기에 기재된 방법과 같이 동정 및 정량하여 환자군에서 증가 혹은 감소하는 생체 표지자를 스크리닝하였다. 확보된 생체표지자의 후보군들과 임상 증상, 수면다원검사 중 주요 지표들과의 상관관계를 분석하여, 최종적으로 AA 및 5-HpETE, 5-HETE, 5-oxoETE를 생체표지자로 선정하였다.
각 생체 표지자는 소변 내 존재하는 크레아틴의 양으로 보정하여 구한 상대 정량 값과 수면다원검사에서 무호흡증의 중증도 지표인 AHI (값이 클수록 중증의 수면 무호흡증을 나타냄) 및 최저 산소포화도 (정상치 95% 이상, 값이 작을수록 중증의 수면 무호흡증을 나타냄) 간의 상관성을 공지된 바와 같이 피어슨 상관계수 Pearson's correlation test 를 통해 분석하였다.
피험자의 소변에 포함된 대사체를 LC/Q-TOF MS 분석법을 이용하여 실시예 1-1에 기재된 바와 같이 동정 및 정량하였다. 단, LC/Q-TOF MS를 이용한 대사체 정량 분석에서 소변의 농도는 크레아티닌(creatinine)을 이용하여 보정하였다. 각각 대사체의 크로마토그램 면적을 크레아티닌(creatinine)의 크로마토그램 면적으로 나누어 해당 대사체의 상대적 농도를 계산하였다.
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 기술된 바와 같이 두 가지 방법 모두에서 아라키돈산 및 그 유도체가 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (도 1 내지 도 6, 도 8 내지 10 참조). 구체적으로
실시예 1-1에서는 두 종의 아라키돈산 유도체 5-HETE 및 5-oxoETE가 상승하였고, 실시예 1-2에서는 아라키돈산, 5-HpETE, 5-HETE 및 5-oxoETE가 상승한 것으로 나타났다. 실시예 1-2의 경우는 유병기간이 보통 수년 길게는 10년 이상이므로 저산소 자극이 더 오랜 시간(‘만성’) 작용하여 5-HETE 나 5-oxoETE외에 아라키돈산이나 5-HpETE라는 전구체(precursor)까지 증가된 것으로 사료된다.
저산소 노출의 생체 표지자를 발굴한다는 측면에서 순수한 저산소 자극의 효과를 시험한 실시예 1-1 및 저산소 노출을 경험하고 있는 환자에서의 해당 대사체의 변화를 본 1-2 결과 모두 본원에서 주장하는 대사체들의 저산소 마커 가능성을 뒷받침하는 것이다.
실시예 2 생체 표지자의 검증
실시예 2-1 세포주를 이용하여 선별된 생체 표지자 검증
정상산소, 저산소, 그리고 저산소 후 정상산소(재산소화) 조건에서 실시예 1-1과 같이 THP-1 세포를 배양한 뒤, 배양액에 포함된 대사체를 AA 및 5-HpETE, 5-HETE, 5-oxoETE를 실시예 1과 같이 LC/Q-TOF MS 분석법을 이용하여 정량하였다.
결과는 도 2에 기재되어 있으며, 이들은 모두 아라키돈산 (AA)의 유도체로서, AA에서 5-lipoxygenase(5-LO) 및 Peroxidase의 효소 작용을 통해 5-HpETE를 거쳐 유도되는 대사체이다.
이어 실시예 1-1에 기재된 방법대로 저산소 환경에서 주요 생체 조절자인 Hypoxia-inducible factor(HIF)-1의 발현을 si-RNA를 이용하여 그 발현을 인위적으로 감소 (si-HIF-1a#1 및 si-HIF-1a#2)시킨 후 대사체 분석을 수행하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 저산소 조건(H)에서 증가하였던 5-HETE 및 5-oxoETE이 감소하는 것을 확인 하였다. 마찬가지로 HIF-1 억제약물인 2-methoxyestradiol (2ME2), 17-N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) 및 YC-1을 처리하였을 때에도 저산소 조건(H)에서 증가하였던 5-HETE 및 5-oxoETE이 감소함을 확인하였으며, 이는 저산소 조건(H)에서 증가하였던 5-HETE 및 5-oxoETE가 HIF-1 의존적으로 증가하였음을 의미한다. 특히 HIF-1이 저산소 적응 및 대사조절에 주요한 조절자임을 감안 할 때, 저산소 조건에서 5-HETE 및 5-oxoETE의 증가는 저산소 특이적인 생체내 변화를 반영하고 있음을 나타내는 것이다. HIF 의존적으로 증가는 이러한 본원에 따른 대사체의 증가가 저산소 환경에 밀접한 연관이 있음을 나타내는 것이다.
또한 인체 유래 혈구세포주인 THP-1 세포에서 확인한 결과를 인간 일차 다형핵세포 (primary human polymorphonuclear cell from PromoCell, Germany)를 이용하여 재확인 하였다. 세포 배지로는 PromoCell사의 Mononuclear Cell Medium (C-28030)을 사용하였으며, 분석은 실시예 1의 방법대로 수행되었다. 결과는 도 5에 기재되어 있다. 도 5에 나타난 바와 같이 정상 산소 조건에 비해 8시간 저산소 조건(H8) 및 8시간 간헐적 저산소 조건(IH8, 매 시간 마다 30분은 1% 산소조건, 이후 30분은 21% 산소조건에서 교대로 배양)에서 5-HETE 및 5-oxoETE가 상승하는 것을 확인하였다.
나아가 8시간 저산소 조건 후 16시간 정상산소조건(H8R16)에서 배양한 경우 역시 5-HETE 및 5-oxoETE가 상승하는 것으로 나타났다. 5-oxoETE의 경우에는 8시간 간헐적 산소조건 후 16시간 정상산소조건(IH8R16)에서 배양한 경우에서도 상승하였다.
또한 도 6에 나타난 바와 같이, 인간 일차 다형핵세포에서, THF-1에서와 같이 HIF-1alpha를 si-RNA의 전달이입에 의해 감소시켰을 때, 저산소 조건에서 상승한 5-HETE 및 5-oxoETE이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 저산소 조건에서의 5-HETE 및 5-oxoETE 증가가 HIF-1 의존적인 것을 나타낸다.
아라키돈산의 5-LO 대사 경로에서 (도 1 참조), 저산소 자극시 5-HETE부터 상승하는 것을 고려하면, 5-HpETE에서 5-HETE로 전환되는 과정이 저산소 조건에서 활성화되는 것으로 판단할 수 있다. 이에 5-HpETE를 5-HETE로 전환시키는 효소인 Glutathione Peroxidase (GPX)의 활성을 측정하였다. GPX 활성은 GPX 분석 키트 (ab102530, Abcam)을 이용하여 측정하였으며, 상기 키트에서의 GPX 활성 측정 원리는 다음과 같다. 먼저 GPX는 환원된 글루타치온 (reduced glutathione, GSH)을 산화 글루타치온(oxidized glutathione, GSSG)으로 바꾸는데, 이 GSSG가 글루타치온 환원효소 (glutathinoe reductase, GR)에 의해 다시 GSH로 환원될 때 NADPH를 소모하게 된다. 따라서 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 340nm에서의 흡광도를 재서 NADPH의 감소 정도를 측정하여 GPX의 활성을 정의할 수 있다.
결과는 도 7에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 24시간 저산소 조건(H24) 및 8시간 저산소 조건 후 16시간 정상 산소 조건(H8R16)에서 세포를 배양하였을 때, 모두 GPX 활성이 증가하는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 본원에 따른 아라키돈산, 5-HpETE, 5-HETE, 그리고 5-oxoETE 표지자의 농도 검출을 통해 저산소증 노출여부 판별이 가능하다는 것을 나타낸다.
실시예 2-2 환자 및 대조군에서 생체 표지자의 검증
대조군 및 폐쇄성 수면 무호흡증 환자에서 실시예 1-2-2에 기재된 방법으로 대사체를 검출하고, 같은 날 측정한 수면다원검사에서 수집된 최저 산소포화도의 상관관계를 Pearson's correlation test를 이용하여 관찰하였으며, 대사체는 소변 내의 크레아티닌(creatinin(cre))으로 보정하여 정량하였다.
그 결과, 도 8 내지 10에 나타난 바와 같이 아라키돈산, 5-HpETE, 5-HETE 및 5-oxoETE 대사체 모두 최저 산소포화도가 낮을수록 더 높게 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5-HETE와 5-oxETE는 최저 산소포화도와 밀접한 상관관계를 보였으며, 이는 저산소 상태에 더 오래 그리고 더 심하게 노출되는 중증 수면 무호흡증은 5-HETE와 5-oxETE가 더 많이 증가하는 것을 확인하는 결과이다.
즉, 아라키돈산, 5-HpETE를 거쳐 5-HETE, 그리고 5-oxoETE으로 대사가 진행될수록 폐쇄성 수면 무호흡증 환자의 소변에서 더 높게 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5-HETE와 5-oxoETE의 경우 경증 보다 중증 수면 무호흡증 환자의 소변에서 더 높게 검출되어 질환의 중증도를 반영할 수 있음을 확인하였다.
데이터들은 평균과 표준편차를 사용하였고 동일 환자의 서로 다른 조직간의 차이는 비모수검정법인 Wilcoxon signed rank test를 사용하였고, 실험군과 대조군 간의 차이는 Mann-Whitney test를 사용하여 분석하였다. 선정된 바이오마커들과 기존의 주요 질환 지표들 간의 상관분석을 시행하였으며 필요에 따라 층화 분석을 실시하였다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (12)

  1. 대상체의 생물학적 시료를 수득하는 단계;
    상기 시료로부터 아라키돈산 또는 그 유도체를 검출하는 단계; 및
    상기 시료의 아라키돈산 또는 그 유도체의 양이 대조군과 비교하여 증가된 경우, 상기 피험자를 저산소증으로 진단하는 단계를 포함하는, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 아라키돈산 유도체는 상기 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 아라키돈산 유도체는 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-HpETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5- 옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-oxoETE)인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 눈물, 땀, 양수, 뇨(소변)을 포함하는 체액, 머리카락, 세포 또는 조직인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분석방법에 사용되는 물질인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 저산소증은 급성 또는 만성의 전신성 또는 국소성 저산소증인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 전신성 저산소증은 폐쇄성 수면 무호흡증, 천식, 만성폐질환(COPD, Lung fibrosis), 폐고혈압 및 폐부종, 폐전색, 심부전, 기도폐색, 기흉, 주산기 질식, 빈혈, 헤모글로빈 이상 질환, 일산화탄소 중독, 시안산 중독(cyanide poisoning)에 수반되는 것이며,
    상기 국소성 저산소증은 뇌혈관, 심혈관, 종양, 저산소성 허혈 뇌병증을 포함한 허혈성 조직 손상에 수반되는 것인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 급성 저산소증은 천식, 폐부종, 폐전색, 기도폐색, 주산기 질식, 일산화탄소 중독, 뇌혈관 또는 심혈관의 폐색이나 출혈을 포함하며,
    상기 만성 저산소증에는 폐쇄성 수면 무호흡증, 만성 폐질환(COPD, lung fibrosis), 폐동맥고혈압, 심부전, 빈혈, 혜모글로빈 이상 질환, 또는 종양을 포함하는 것인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 저산소증은 급성 또는 만성 저산소증을 포함하는 것으로,
    상기 급성 저산소증은 5-HETE 및/또는 5-oxoETE를 검출하는 것이고,
    상기 만성 저산소증은 아라키돈산, 5-HpETE, 5-HETE 및/또는 5-oxoETE를 검출하는 것인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  10. 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단에 사용되는 아라키돈산 또는 그 유도체.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 아라키돈산 유도체는 상기 아라키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 아라키돈산 유도체는 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-HpETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5- 옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-oxoETE)인, 저산소증 검출 또는 저산소증 관련 질환 진단 방법.
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