KR101446873B1 - 수면 무호흡증 진단용 생체 표지자 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 아라키돈산 및 그 유도체 검출용 물질을 포함하는 수면 무호흡증 진단용 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 본원에 따른 조성물, 키트 및 방법은 생물학적 시료에서 생체 표지자의 검출을 통해 간편하고 신속하게 수면 무호흡 증상의 유무 및 질환의 중증도, 치료 효과 판정 또는 경과추적이 가능하다.

Description

수면 무호흡증 진단용 생체 표지자 및 그 용도 {Biomarkers for diagnosing sleep apnea and its uses}

본원은 수면 무호흡증의 진단 기술 분야이다.

수면 무호흡은 수면 중 호흡 정지가 빈번하게 발생하는 것으로서, 수면 무호흡 환자의 대부분이 상기도 공간이 좁아지는 해부학적 특성을 가지고 있는 폐쇄성 수면 무호흡증(obstructive sleep apnea, OSA)으로, 비만으로 목 부위에 지방이 축적되거나, 혀, 편도 등의 조직이 비대해져 상기도가 좁아지게 되어 수면 무호흡 증상이 나타나게 된다.

폐쇄성 수면 무호흡증은 상기도가 폐쇄되어 수면 중 전신적 저산소증(systemic hypoxia)에 노출되는 질환으로서 30세 이상 남자의 4%, 여자의 2%에서 관찰되는 매우 흔한 질환이며, 북미의 경우 모든 성인의 17-24% 까지 유병율이 보고되고 있다 (Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. Am J Respir Crit Care Med 2002;165:1217-39.). 특히, 40대부터 급격히 증가하기 시작하여 70대에 20%를 상회하고 있으며, 비만도와 연령이 증가함에 따라 수면무호흡증의 유병률이 증가하고 있다.

폐쇄성 수면 무호흡증은 돌연사뿐만 아니라 고혈압, 심부전, 부정맥, 허혈성 심장질환, 뇌졸증, 폐성 고혈압 등의 심혈관 합병증을 동반할 수 있으며, 무호흡지수(분당 무호흡의 횟수)가 20이상인 사람에서 통계적으로 유의한 사망률 증가가 보고되고 있으며(Obstructive sleep apnea: implications for cardiac and vascular disease. JAMA 2003;290:1906-14.), 이 외에도 수면분절로 인한 심한 주간기면 및 피로감, 과다졸음의 이차적 증상으로 역행성 기억상실, 주의집중력 저하, 판단력 저하, 다양한 성격 변화(공격적 성격, 자극과민성, 불안감, 우울증), 발기부전 등을 가져올 수 있다(Latest advances in sleep medicine: obstructive sleep apnea. Chest. 2012 Dec;142(6):1645-51.). 미국에서 치료받지 못한 수면 무호흡증은 34억불의 추가적인 의료비용을 야기하는 것으로 추정되고 있으며, 수면 무호흡증 환자를 치료하지 않았을 때는 사전에 검사 및 치료를 시행한 경우보다 2배 이상의 사회비용이 소모되므로 수면 무호흡증의 치료는 사회 경제적으로 매우 중요하다.

현재 수면 무호흡증의 진단은 수면다원검사가 필수적으로 이용되고 있지만, 다음과 같은 문제점이 있다. 즉 이는 낯선 수면환경에서 이루어지는 것으로서 평상시의 수면을 정확히 반영하기 어려우며, 고가의 의료 장비를 전문적인 교육을 받은 수면기사에게 검사받아야 하므로 시간과 비용이 과다하고 장비나 전문 인력의 수 또한 제한되어 있어 많은 잠재적 환자들이 제대로 진단을 받는 것이 현실적으로 불가능하다. 무엇보다 수면다원검사를 위해서 환자는 60여가지 이상의 전극이나 탐지기들을 체표면에 부착시키고 수면을 취해야 하기 때문에 환자가 받는 불편함으로 검사에 실패하는 경우도 많다.

한국특허등록 제1096089호에는 수면 무호흡을 검출 및 판단하는 장치로서 피검자의 광전용적맥파를 측정하기 위한 PPG 센서와, 피검자의 움직임을 감지하기 위한 3축 가속도 센서와, PPG 센서에서 측정된 광전용적맥파를 이용하여 수면 무호흡 여부를 판단하고, 3축 가속도 센서를 이용하여 수면 무호흡의 유형을 진단하는 진단장치를 개시하고 있다.

WO2011/077433에는 혀의 주변에 배치 가능한 요소와 적어도 하나의 위치 요소와 상호 작용하는 구성 판독기를 포함하는 사람의 혀의 위치를 모니터링하여 폐쇄성 수면 무호흡증의 발생을 예측하는 시스템 및 방법에 관한 것이 개시되어 있다.

그러나, 위와 같이 지금까지 개발되는 수면 무호흡증의 진단 방법은 환자에게 불편을 야기하고 평소와 다른 수면 상태로 인하여 정확한 검사 결과를 기대하기 어려운 단점들을 여전히 내포하고 있으며, 시료에서 간편하게 진단할 수 있는 생체표지자의 발굴이 필요하다.

본원은 수면 무호흡 증상의 유무 및 질환의 중증도를 간편하게 조기에 진단하는 생체 표지자를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 아라키돈산 또는 그 유도체 검출용 물질을 포함하는 수면 무호흡증 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 상기 아라키돈산 유도체는 상기 아리키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체인, 예를 들면 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-H_PETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5-옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노익산 (5-oxoETE)를 포함한다. 본원에 따른 진단용 조성물은 중증도 판별에 사용될 수 있으며, 예를 들면 상기 5-HETE 및 5-oxoETE는 중증도에서 그 양이 증가하여 중증도 수면 무호흡증 진단에 사용될 수 있다.

본원에 따른 조성물은 다양한 생물학적 시료 예를 들면 땀, 타액, 눈물 등을 포함하는 체액, 전혈, 혈장, 혈청, 세포, 조직 또는 뇨(urine)에서 수행될 수 있다.

본원에 따른 조성물은 일 구현예에서 검출용 물질로서, 예를 들면 아라키돈산 또는 그 유도체를 특이적으로 인식하는 물질 예를 들면 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)등이 사용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 조성물은 다른 구현예에서 검출용 물질로서, 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피질량분광분석방법에 사용되는 물질을 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정용 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 수면 무호흡증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법으로서, 검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 아라키돈산 및 그 유도체를 검출하는 것을 포함하는 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법은 다양한 생물학적 시료 예를 들면 땀, 타액 및 눈물 등과 같은 체액, 전혈, 혈장, 혈청, 세포, 조직 또는 뇨(urine)를 이용하여 수행될 수 있다.

본원에 따른 방법에서 상기 아라키돈산 유도체는 상기 아리키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 유도체로 예를 들면 아라키돈산 유도체는 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-H_PETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5-옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노익산 (5-oxoETE)를 포함한다. 본원에 따른 방법은 수면무호흡증의 중증도 판별에 사용될 수 있으며, 대사경로를 따라 5-HETE 및 5-oxoETE의 양은 중증 환자에서 그 양이 증가된다.

본원에 따른 방법에서 상기 아라키돈산 또는 그 유도체 측정은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법 중 하나 이상에 의해 수행될 수 있으며, 상기 분석에 사용되는 물질은 당업계에 공지된 것으로 당업자라면 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이다.

본원은 수면 무호흡증 환자 또는 수면 무호흡증이 의심되는 환자에서 아리키돈산 대사체의 검출을 통해 정확하면서도, 간편하고 신속하게 수면 무호흡의 유무 및 중증도를 판별하여 조기진단 및 중증도의 진단이 가능하다. 또한 치료 후 수면 무호흡증의 개선 정도에 대한 효과 판정 및 질환의 경과 추적 관찰이 가능하다. 이를 통해 수면 무호흡증의 조기 진단이 가능하여 사회경제적으로 의료비용을 감소시킬 수 있으며, 환자에게 신속하고 정확하며, 편리한 의료 서비스를 제공할 수 있다.

도 1은 아라키돈산의 5-리폭시게나제 (5-LO) 경로 및 대사체를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 수면 무호흡증(OSA) 환자의 아침 첫 뇨에서 아라키돈산 대사체가 증가하는 것을 나타낸 결과이다.
도 3은 수면 무호흡증 환자의 소변에서 증가하는 아라키돈산 대사체와 최저산소포화도와의 상관관계를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 수면 무호흡증 환자의 소변에서 증가하는 대사체와 무호흡-저호흡 지수(AHI)와의 상관관계를 그래프로 나타낸 것이다.

본원은 수면무호흡증 환자에서 특징적으로 발견되는 생체 표지자의 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 아라키돈산 및 그 유도체 검출용 물질을 포함하는 수면 무호흡증 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 질환의 진행상태 판별 또는 치료에 대한 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 용어 진단용 생체 표지자 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 정상시료와 환자시료, 혹은 치료 후 호전된 환자의 시료와 호전되지 않은 환자의 시료를 구분 또는 판별할 수 있는 것을 의미한다. 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 시료 또는 환자에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 지질, 당지질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본원에서 수면무호흡증 환자에서 그 양의 증가되는 아라키돈산 및 그 유도체를 포함한다.

본원에 따른 생체 표지자는 하나 또는 두 개 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 또한 필요한 경우 기존의 진단 방법과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.

본원에서 수면무호흡증은 수면 중 호흡 정지가 빈번하게 발생하는 것으로서, 폐쇄성과 중추성 수면 무호흡증으로 나눌 수 있다. 수면 무호흡 환자의 대부분이 상기도 공간이 좁아지는 해부학적 특성을 가지고 있으며, 비만으로 목 부위에 지방이 축적되거나, 혀, 편도 등의 조직이 비대해져 상기도가 좁아지면 수면 무호흡 증상이 나타나며, 대부분은 상기도가 폐쇄되어 수면중 전신적 저산소증(systemic hypoxia)에 노출되는 폐쇄성 수면 무호흡증(obstructive sleep apnea)이다. 주요 증상으로는 만성 간헐성 저산소증 (chronic intermittent hypoxia)이 나타나며, 수면시 혈중 산소 포화도가 반복적으로 저하되는 것으로, 수면 중 상기도 폐쇄로 산소 포화도가 60%-90% (산소마스크 착용이 필요한 정도임)로 감소하였다가 강력한 호흡자극이 유발되면서 산소포화도가 회복되는 과정이 매일 밤 반복되는 것이다(Sympathetic neural mechanisms in obstructive sleep apnea. J Clin Invest 1995;96:1897-904). 또한, 폐쇄성 수면 무호흡증은 이차적으로 교감 신경을 흥분시키고 이는 지방세포에서 지방분해를 촉진하여 혈중 자유 지방산(free fatty acid)의 양을 증가시켜 심혈과 합병증의 원인으로 작용하며 (Burst-like control of lipolysis by the sympathetic nervous system in vivo. J Clin Invest 2003;111:257-64.), 저산소-산소 재공급은 ROS(reactive oxygen species)의 생성을 촉진하여 산화성 조직 손상을 야기하고(Enhanced release of superoxide from polymorphonuclear neutrophils in obstructive sleep apnea. Impact of continuous positive airway pressure therapy. Am J Respir Crit Care Med 2000;162:566-70.), CRP, IL-6 및 TNF-a 등의 사이토카인이 염증반응을 유도한다(The relationship between serum cytokine levels with obesity and obstructive sleep apnea syndrome. Cytokine 2004;28:87-91.). 이 밖에도 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 레시스틴(resistin)과 같은 아디포카인(adipokines)을 증가시키고 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 및 L-selectin과 같은 세포부착분자(adhesion molecule)의 증가, 그리고 비폴딩 단백질(unfolded protein)의 축적으로 소포체(endoplasmic reticulum) 스트레스를 증가(Sleep oxygen desaturation and circulating leptin in obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome. Chest 2005;127:716-21.)시킨다. 이와 같이 폐쇄성 수면 무호흡증은 돌연사뿐만 아니라 고혈압, 심부전, 부정맥, 허혈성 심장질환, 뇌졸증, 폐성 고혈압 등의 심혈관 합병증을 동반할 수 있으며, 무호흡지수(시간당 무호흡의 횟수)가 20이상인 사람에서 통계적으로 유의한 사망률 증가가 보고되고 있으며(Obstructive sleep apnea: implications for cardiac and vascular disease. JAMA 2003;290:1906-14.), 이 외에도 수면분절로 인한 심한 주간기면 및 피로감, 과다졸음의 이차적 증상으로 역행성 기억상실, 주의집중력 저하, 판단력 저하, 다양한 성격 변화(공격적 성격, 자극과민성, 불안감, 우울증), 발기부전 등을 가져올 수 있다(Latest advances in sleep medicine: obstructive sleep apnea. Chest. 2012 Dec;142(6):1645-51.).

본원의 생체 표지자는 이러한 다양한 증상 및 특징을 갖는 폐쇄성 및 중추성 수면 무호흡증의 진단 및 예후 측정에 사용될 수 있으며, 또한 중증도 판단에 사용될 수 있다.

본원에서 생물학적 시료, 검체란 생체 표지자의 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 땀, 타액, 눈물과 같은 체액, 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 한 구현예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 농도 측정을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 생체 표지자는 아라키돈산 및 그 유도체이다. 아라키돈산 (arachidonic acid, AA)은 세포막에서 가장 많이 존재하는 폴리불포화지방산으로, 두 가지의 주 경로, 즉 리폭시게나제 (Lipoxygenase, LO)을 통해 하이드록시 유도체로 되는 대사경로, 및 시클로옥시게나제 (Cycloxygenase, COX)를 통해 프로스타글란딘으로 전환되는 대사경로를 통해 분해된다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 조성물은 특히 LO 경로에서 생성되는 AA 대사체의 검출용 물질을 포함한다. LO 경로는 도 1에 도식적으로 기재되어 있으며, 도 1에 나타난 바와 같이 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에온산은 아라키돈산이 류코트리엔 A4(leukotriene A4)으로 생성되는 과정의 중간 생성물이며, 아리키도네이트 5-리폭시게나제(arachidonate 5-lipoxygenase)에 의하여 생성될 수 있다. 5-하이드록시에이코사테트라에노익산은 류코트리엔 생합성의 중간체이며, 도 1에 나타난 바와 같이 퍼옥시데이즈(peroxidase)에 의하여 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산으로부터 생성될 수 있다. 5-옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노익산은 5-하이드록시에이코사노이드 디하이드로게나제(5-hydroxyeicosanoid dehydrogenase (5-HEDH))에 의하여 산화되어 생성될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 LO 경로를 통한 대사체는, 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid, 5-H_PETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5- 옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노익산 (5-oxoETE)를 포함한다.

본원에 따른 AA 및 그 대사산물 즉 그 대사체 또는 유도체는 공지된 다양한 방법을 통해 검출될 수 있으며, 당업자수준에서 적절한 검출방법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44; E.J. Want et al., Nature Protocols 2010; 5: 1005 - 1018 및 Stanke-Labesque F et al. J Allergy Clin Immunol 2009;124:364-70)

본원에 따른 일 구현예에서는 아라키돈산 및 그 유도체를 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 이용하여 검출된다. 상기 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피질량분광분석방법 등에 사용될 수 있으며, 당연히 상기 방법이 본원에 따른 생체표지자 검출에 사용될 수 있다.

본원 일 구현예에 따르면 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 생체표지자를 검출할 수 있으며, 예를 들면 Applied Biochemistry and Biotechnology Jul-Sep 2000, Volume 88, Issue 1-3, pp 33-44을 참조할 수 있다.

또 다른 구현예에서는 항체 분석법이 사용될 수 있다. 항체 분석은 본원에 따른 AA 또는 그 유도체를 특이적으로 인식하는 물질, 예를 들면 폴리클로날항체, 모노클로날 항체, 수용체, 리간드, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체를 이용하여 분석하는 것으로, 예를 들면, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 기질, 펩타이드 앱타머, 상기 표지자와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다.

상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 포함하는 수면 무호흡증의 진단용 키트를 제공한다. 본원의 키트는 검사 대상 또는 검사 대상의 생물학적 검체 또는 시료에서 AA 및 그 대사체의 정량 및/또는 정성적 분석을 통해, 수면 무호흡증의 발병 또는 진행 정도 및/또는 예후를 진단할 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 다양한 검출 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, ELISA키트, 화학발광분석용 키트 및 루미넥스(luminexⓡ)키트 등을 들 수 있다. ELISA 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 생체 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클론항체, 폴리클론항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

루미넥스 키트는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 분석물을 동시에 측정할 수 있는 대용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 ELISA나 ELISPOT을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이는 96-웰 플레이트에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 분석방법으로 두 종류의 레이져 검출기를 이용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도의 차이를 보이며 그 사이의 비드들은 레드와 오렌지 색의 비율이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 물질에 대한 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 생체표지자의 정량이 가능하다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 생체 표지자에 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 생체 표지자에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 표지자에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 물질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미세입자(micro particle)와 접합된 항체일 수 있으며, 또한 상기 미세입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 수면 무호흡증 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 수면 무호흡증 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 수면 무호흡증 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드; (b) 시료 내의 생체 표지자 물질과 결합하는 결합 패드; (c) 생체 표지자에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선 및 대조선이 처리되어 있는 반응 막; (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드; 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 면역크로마토그래피 스트립에 사용되는 각 표지자에 특이적인 항체는 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 표지자에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 수면 무호흡증의 진단 및/또는 예후 측정에 필요한 정보를 의사 또는 환자에게 제공하기 위하여 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법으로서, 검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, AA 및/또는 그 유도체의 정량 및/또는 정석 분석을 통한 검출을 수행하는 것을 특징으로 하는 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검체로부터 분리된 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 조직, 세포 또는 환자의 뇨(urine)일 수 있으며, 본원의 일 실시예에서는 환자로부터 분리된 뇨로서 특히 아침 첫소변이 사용된다. 아침 첫소변은 농축된 소변으로 대사체들의 농도가 높아 검출이 용이하고, 수면 무호흡증의 경우 수면 중에만 저산소에 노출되므로 수면 무호흡증을 진단하는데 보다 용이할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, AA 및 그 유도체의 정성 및 정량 분석이 가능하며, 이를 대조군과 비교함으로써 수면 무호흡증의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 수면 무호흡 환자의 뇨(urine)을 수득하여 상기 뇨 중의 아라키돈산, 5-H_PETE, 5-HETE, 또는 5-oxoETE를 LC/MS(액체 크로마토그래피/질량 분석기, Liquid Chromatography/Mass Spectrometer) 방법을 수행하여 각 환자의 시료로부터 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 대조군과 비교하여 진단 및/또는 예후 측정에 사용될 수 있다.

그 예로 수면 무호흡증이 없는 정상 대조군에서 해당 생체 표지자의 정상범위의 임계값(cutoff, 증가하는 생체표지자의 경우에는 상한치/감소하는 생체표지자의 경우에는 하한치)을 결정하여, 질환이 의심되는 환자의 경우 해당 생체표지자의 양이 임계값보다 약 2 배이상 증가한 경우 수면 무호흡증 환자로 진단할 수 있다. 특히 해당 생체표지자의 양이 임계값보다 약 3 배 이상 증가 중증도 수면 무호흡증 환자로 조기 감별진단이 가능하다. 또한 수면 무호흡증 환자에서 치료 후 해당 생체 표지자가 정상 범위 내로 회복되는 지를 확인하여 치료 성과에 대한 판정 및 추적 관찰이 가능하다. 이러한 본원에 따른 생체표지자를 이용한 수면 무호흡증 진단은 단독으로 또는 공지된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면 무호흡 저호흡 지수(Apnea-hypopnea index, AHI)는 수면무호흡증의 중증도를 판단하는 지표로, 수면 1시간당 발생하는 무호흡, 부분호흡(저호흡) 횟수를 나타내며, 정상 0-4, 경증 5-14, 중간정도 15-30, 및 중증 30 초과로 분류할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 피험자의 모집 및 실험군/대조군의 설정

코골이 또는 수면무호흡증으로 서울대학교 병원 이비인후과 또는 서울수면센터를 내원한 10대부터 60대까지의 환자 중 수면다원검사를 시행하고 연구에 동의한 환자를 대상으로 피험자를 선정하였으며, 종양의 과거력이 있거나 수술 및 수면다원검사에 부적합한 환자, 신장질환 등으로 뇨의 채취가 불가한 환자는 제외하였다. 수면다원검사(polysomnography)를 시행한 후 무호흡 저호흡 지수(Apnea-Hypopnea Index, AHI)를 기준으로 단순 코골이 환자(AHI<5)와 수면 무호흡증 환자(AHI>5)로 감별하여, 단순 코골이 환자 또는 불면증 환자를 대조군으로 하여 수면 무호흡증 환자인 실험군의 결과와 비교 분석하였다.

[표 1]

시험군과 대조군 모두에서 성별, 나이, 신장, 체중, 목둘레, 허리둘레 등의 환자의 기본 정보를 조사하고, 수면 무호흡 환자에서 필수적으로 확인하는 기초 혈액 검사(CBC, admission panel, 등)와 방사선 검사(cephalometry) 결과를 수집하였다.

무호흡 저호흡 지수(Apnea-hypopnea index, AHI)는 수면무호흡증의 중증도를 판단하는 지표로, 수면 1시간당 발생하는 무호흡, 부분호흡(저호흡) 횟수를 나타내며, 정상 0-4, 경증 5-14, 중간정도 15-30, 및 중증 30 초과를 기준으로 분류하였다.

실시예 2 생체 표지자 선별

실험군과 대조군에서 수면 무호흡의 유무와 정도를 알아보는 수면다원검사를 실시하여 다양한 지표들을 수집하였다. 그리고 환자군과 대조군의 아침 첫소변을 질량분석 방법을 통해 대사체를 하기에 기재된 방법과 같이 동정 및 정량하여 환자군에서 증가 혹은 감소하는 생체 표지자를 스크리닝하였다. 확보된 생체표지자의 후보군들과 임상 증상, 수면다원검사 중 주요 지표들과의 상관관계를 분석하여, 최종적으로 AA 및 5-H_PETE, 5-HETE, 5-oxoETE를 생체표지자로 선정하였다.

각 생체 표지자는 소변 내 존재하는 크레아틴의 양으로 보정하여 구한 상대 정량 값과 수면다원검사에서 무호흡증의 중증도 지표인 AHI (값이 클수록 중증의 수면 무호흡증을 나타냄) 및 최저 산소포화도 (정상치 95% 이상, 값이 작을수록 중증의 수면 무호흡증을 나타냄) 간의 상관성을 공지된 바와 같이 피어슨 상관계수 Pearson’s correlation test 를 통해 분석하였다.

① 분석 샘플의 준비

1.5 ml 마이크로 튜브에 4℃ H₂O (400μl)와 소변 샘플 (100 μl)을 넣어 희석시키고, 볼텍서를 이용하여 상기 샘플을 잘 혼합시킨 후에, 4℃, 14,000 g에서 20 분 동안 여과/원심분리 후 상층액을 취하여 분석 바이알(vial)에 따로 모아 두었다. 또한 QC (quality control) 분석을 위하여, 각 환자의 상기 희석 샘플 50μl씩을 모두 혼합 (pooling)하였다.

② LC/Q-TOF MS 분석에 의한 대사체 분석 및 동정

소변 내 대사체를 역상 컬럼인 Zorbax SB-C18, 50 X 2.1 mm, 1.8 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 Binary Agilent 1200 series HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 장착한 시스템에 의하여 분리하였으며, 이 때 5 μl의 분석 샘플이 40℃로 가열된 컬럼을 통과하도록 주입하였다. 98% 용매 A (H₂O 중의 포름산 암모늄 2mM과 포름산 0.1%)와 2% 용매 B (메탄올 중의 포름산 0.1%)에서 400nl/min으로 21분 동안 대사체 샘플의 구배 용리를 수행하였으며, 교차 오염을 피하기 위하여 샘플 조작 사이에서 블랭크 조작 (blank run)을 수행하였다.

HPLC에 Agilent 6530 quadrupole time-of-flight (Q-TOF) 질량 분석기 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 커플링 시켜 ESI 알고리즘을 사용하였고, 100-1100 m/z로부터 한 스펙트럼 당 1초에 4개의 센트로이드 (centroid) 데이터를 얻었고, 모든 스펙트럼의 m/z은 외부에서 넣어 준 참조 값으로부터 실시간으로 교정하였다.

질량 스펙트럼(mass spectra)으로부터의 대사체 동정은 먼저 소프트웨어 (Agilent MassHunter Qualitative Analysis (version B.05.00), Agilent Mass Profiler Professional (version B.02.02))를 사용하여 HMDB (http://www.hmdb.ca/)와 METLIN (http://metlin.scripps.edu/) 데이터베이스에 대하여 수행하였다. 이후에 해당 대사체의 LC/MS/MS 분석에 의한 쪼개짐 패턴을 실제 표준 물질(Cayman, Ann Arbor, MI)과 비교하여 추가적인 확인 작업을 수행하였다.

③ LC/Q-TOF MS를 이용한 대사체 정량 분석

소변의 농도는 크레아티닌(creatinine)을 이용하여 보정하였다. 각각 대사체의 크로마토그램 면적을 크레아티닌(creatinine)의 크로마토그램 면적으로 나누어 해당 대사체의 상대적 농도를 계산하였다.

실시예 4 환자 및 대조군에서 생체 표지자의 측정

대조군 및 폐쇄성 수면 무호흡증 환자에서 실시예 3에 기재된 방법으로 대사체를 검출하고, 같은 날 측정한 수면다원검사에서 수집된 최저 산소포화도의 상관관계를 Pearson’s correlation test를 이용하여 관찰하였으며, 대사체는 소변 내의 크레아티닌(creatinin(cre))으로 보정하여 정량하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 아라키돈산, 5-HpETE, 5-HETE 및 5-oxoETE 대사체 모두 최저 산소포화도가 낮을수록 더 높게 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5-HETE와 5-oxETE는 최저 산소포화도와 밀접한 상관관계를 보였으며, 이는 저산소 상태에 더 오래 그리고 더 심하게 노출되는 중증 수면 무호흡증은 5-HETE와 5-oxETE가 더 많이 증가하는 것을 확인하는 결과이다.

즉, 아라키돈산, 5-HpETE를 거쳐 5-HETE, 그리고 5-oxoETE으로 대사가 진행될수록 폐쇄성 수면 무호흡증 환자의 소변에서 더 높게 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5-HETE와 5-oxoETE의 경우 경증 보다 중증 수면 무호흡증 환자의 소변에서 더 높게 검출되어 질환의 중증도를 반영할 수 있음을 확인하였다.

데이터들은 평균과 표준편차를 사용하였고 동일 환자의 서로 다른 조직간의 차이는 비모수검정법인 Wilcoxon signed rank test를 사용하였고, 실험군과 대조군 간의 차이는 Mann-Whitney test를 사용하여 분석하였다. 선정된 바이오마커들과 기존의 주요 질환 지표들 간의 상관분석을 시행하였으며 필요에 따라 층화 분석을 실시하였다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (13)

1. 아리키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 아라키돈산 유도체 검출용 물질을 포함하는 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 아라키돈산 유도체는 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라에오닉산(5-H_PETE), 5-하이드록시-6,8,11,14-에이코사테트라에노산 (5-HETE), 또는 5- 옥소-6,8,11,14-에이코사테트라에노익산 (5-oxoETE)인 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정용 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 5-HETE 및 5-oxoETE는 중증도 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정에 사용되는 것인, 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정용 조성물.
   
5. 제 1 항 또는 제 3 항 있어서, 상기 검출용 물질은 상기 아라키돈산 유도체를 특이적으로 인식하는 수용체, 리간드, 기질, 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하는 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정용 조성물.
   
6. 제 1 항 또는 제 3 항 있어서, 상기 검출용 물질은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법에 사용되는 물질인, 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정용 조성물.
   
7. 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 조성물을 포함하는 수면 무호흡증 진단 또는 예후 측정용 키트.
   
8. 수면 무호흡증의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법으로서, 검체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 상기 진단 마커로서 아리키돈산의 5-리폭시게나제 대사경로에서 생성된 아라키돈산 유도체를 검출하는 것을 포함하는 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체액, 전혈, 혈장, 혈청, 세포, 조직 또는 뇨(urine)인 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법.
   
10. 삭제
11. 제 8 항에 있어서, 상기 아라키돈산 유도체는 5-H_PETE, 5-HETE, 또는 5-oxoETE인 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 5-HETE 및 5-oxoETE는 수면 무호흡증의 중증도 검출에 사용되는 것인, 수면 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법.
    
13. 제 8 항에 있어서, 상기 아라키돈산 유도체 측정은 항체분석, 화학발광분석, 또는 액체크로마토그래피 질량분광분석방법 중 하나 이상에 의해 수행되는 것인, 무호흡증 진단 마커를 검출하는 방법.

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