KR20140145222A - 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 기능성 된장 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장 및 그 제조방법에 관한 것으로, 원료 콩을 정선하여 증류수에 20~24시간 침지 후, 물 배기를 한 다음 증자기에서 1.21 lb/㎠, 121℃에서 30분 가압증자 하는 제1공정;과 상기 증자된 콩을 품온 40℃이하로 냉각한 후, 원료 콩 건조중량 대비 10~20중량부의 볶은 보리쌀가루를 넣어 균일하게 혼합하는 제2공정;과 상기 제2공정의 혼합물을 두개의 군으로 나누어 준비하고 각각의 군의 혼합물에 일정중량비로 미생물로서 아스퍼질러스 오리재 스타터와 리조푸스 오리재 스타터를 각각 접종하여 준비한 후, 발효시켜 아스퍼질러스 오리재 메주(AOM)와 리조푸스 오리재 메주(ROM)를 준비하는 제3공정;과 상기 제3공정의 발효가 끝난 각각의 메주는 파쇄하여 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재 메주를 혼합하고, 그 혼합물 100중량부에 대하여 볶은 보리쌀가루 50~150중량부, 천일염 40~60중량부, 물 100~200중량부를 균일하게 혼합하는 제4공정; 및 상기 제4공정의 혼합물을 담금하여 옹기에 담고 온도 15~28℃에서 5~10주간 발효시키는 제5공정을 포함하여 이루어지는 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장의 제조방법 및 그에 의해 제조된 기능성 된장이 개시된다.

Description

이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 기능성 된장 및 그 제조방법{Soybean paste and method for producing it that are improved the contents of isoflavones and β-glucan}

본 발명은 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서로 다른 생육환경과 발효능을 가지는 미생물 균주로 증숙된 콩을 발효시켜 메주로 가공하고, 그 가공된 각각의 메주를 일정 중량비로 혼합하고, 그 혼합물과 부원료인 보리와 기타 첨가물을 혼합한 다음 담금하여 제조된 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장 및 그 제조방법에 관한 것이다.

우리 민족의 전통발효식품인 된장제조에 관한 고문헌의 기록을 살펴보면 高麗史志(1028), 三國史記(1145), 讚頌房(1541), 東醫寶鑑(1611), 救荒攝要(1639), 農家集成(1655), 新刊救荒攝要(1660), 治山要覽(1691), 山林經濟(1715), 增補山林經濟(1760) 등의 구황서에, 중국은 史記(기원전 109-91), 說文解子(東漢代 許愼 著) 및 齊民要術(1023-1031)에, 일본은 廷喜式과 萬葉集에 수록되어 있다.

된장의 주원료인 대두(Glycine max)는 각종 영양 성분이 풍부하고, 건강증진을 위한 생리활성 물질인 식이섬유, 인지질, isoflavones(genistein, daidzein etc.), phenolic acids, saponins, trypsin inhibitor, phytic acid, 배당체 등의 성분이 들어있어 항암 효과(유방암, 대장암, 폐암 등), 항노화, 변비 완화, 항신부전, 항알레르기, 항비만, 담석증 예방, 이뇨작용, 치매 예방, 고지혈증 억제, 동맥경화 예방, 심장병 예방, 당뇨병 예방, 골다공증 억제 등 성인병 예방, 갑상선 비대, 항바이러스 및 항지혈 효과 등의 기능이 있다고 알려져 있다.

이러한 효능을 보유한 대두(콩)를 장류식품으로 만들기 위해서 증자하여 미생물을 접종한 후 배양한 것을 메주(Meju) 또는 코오지(koji)라 부르고 있다.

메주 제조방식은 황태(대두)를 충분하게 수침한 후 건져 증자한 대두를 으깨어 용도에 따라 직사각 또는 원 모양으로 만드는 것이 일반적이나, 영양성분의 유실을 적게 하고, 공정개선 및 경비절감을 위하여 증자된 대두를 으깨지 않고 낱알상태로 직접 발효시켜 만드는 콩알메주의 이용 빈도가 높아지고 있다.

된장은 메주의 제조 및 담금 방식에 의하여 전통식 된장과 개량식 된장으로 대별하고 있다. 전통식 된장은 콩만으로 메주를 만들고, 이것을 소금물에 담구어 발효가 끝나면 액체부분은 간장으로 만들고 메주덩어리를 건져내어 다른 항아리에 재워서 보관하는 것을 일반적으로 전통식 된장이라고 부르고 있다. 개량식 된장은 쌀이나 보리쌀 및 대두와 같은 전분질 원료에 단백질과 전분질을 잘 분해시키는 된장 곰팡이 Aspergillus sp.를 인공적으로 접종, 배양하여 코오지를 만들어 삶은 콩과 소금을 혼합하여 숙성시킨 다음 마쇄하여 제품으로 한다.

두류 또는 두류를 발효시켜 만든 가공품에 함유되어 있는 이소플파본은 에스트로겐 유사작용, 심혈관질환의 위험감소, 전립선, 유방암 및 대장암의 발생저하, 골밀도 개선 등의 생리적 기능이 있는 것으로 알려져 있다.

현재, 된장에 관한 연구는 주로 품질 향상, 부원료 소재의 대체 또는 기능성 소재를 첨가하여 생리활성을 향상시킨 콩의 함유성분 중 다양한 생리활성을 보유한 것으로 밝혀진 폴리페놀(polyphenol)화합물의 하나인 이소플라본의 글루코사이드(glucoside)형을 생리활성이 더 좋은 아글리콘(aglycone)형으로 전환시켜 기능성을 극대화 할 수 있는 연구는 전무한 상황으로 이에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

1. 대한민국등록특허공보 제10-0401811호(2003.10.01) "대두된장의 제조방법" 2. 대한민국등록특허공보 제10-0618146호(2006.08.23) "영양강화 된장 및 그 제조방법" 3. 대한민국공개특허공보 제10-2012-0021418호(2012.03.09) "보리된장 제조방법"

Park, S. K., Seo, K. I., Choi, S. H., Moon, J. S., Lee, Y. H. : Quality assessment to commercial doenjang prepared by traditional method. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 29, 211-217 (2000)

본 발명에서는 이소플라본의 급원식품으로써 된장의 이소플라본(isoflavones)의 함량이 낮아 이를 향상시킬 목적으로 템페 및 전통장류의 발효에 관여하는 미생물인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 라이조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)로 각각 발효시킨 콩알메주와 볶은 보리가루를 조합하여 담근 된장을 발효시키는 방법을 개발하여 전통된장보다 생물학적 변환(bioconversion)에 의하여 아글리콘(aglycone)형 이소플라본의 함량이 높은 새로운 기능성 된장 및 그 된장의 제조방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.

상기한 과제를 해결한 본 발명의 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장의 제조방법은 원료 콩을 정선하여 증류수에 20~24시간 침지 후, 물 배기를 한 다음 증자기에서 1.21 lb/㎠, 121℃에서 30분 가압증자 하는 제1공정;

상기 증자된 콩을 품온 40℃이하로 냉각한 후, 원료 콩 건조중량 대비 10~20중량부의 볶은 보리쌀가루를 넣어 균일하게 혼합하는 제2공정;

상기 제2공정의 혼합물을 두개의 군으로 나누어 준비하고 각각의 군의 혼합물에 일정중량비로 미생물로서 아스퍼질러스 오리재 스타터와 리조푸스 오리재 스타터를 각각 접종하여 준비한 후, 발효시켜 아스퍼질러스 오리재 메주(AOM)와 리조푸스 오리재 메주(ROM)를 준비하는 제3공정;

상기 제3공정의 발효가 끝난 각각의 메주는 파쇄하여 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재 메주를 혼합하고, 그 혼합물 100중량부에 대하여 볶은 보리쌀가루 50~15중량부, 천일염 40~60중량부, 물 100~200중량부를 균일하게 혼합하는 제4공정; 및

상기 제4공정의 혼합물을 담금하여 옹기에 담고 온도 15~28℃에서 5~10주간 발효시키는 제5공정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 제3공정에서 사용된 각각의 미생물은 상기 제2공정에서 준비된 혼합물 100중량부에 대하여 각각 3~5중량부를 접종하고, 아스퍼질러스 오리재 접종군은 온도 26±2℃, 습도 85~90%의 환경에서, 리조푸스 오리재 접종군은 온도 24±2℃, 습도 85~90%의 환경에서 각각 3일간 발효시키는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 제3공정의 혼합물은 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재를 8:2 내지 4:6의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서는 상기 개시되는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 기능성 된장을 제공한다.

본 발명은 이소플라본의 급원식품으로써 된장의 isoflavones 함량이 낮아 이를 향상시킬 목적으로 템페 및 전통장류의 발효에 관여하는 미생물인 Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae로 발효시킨 콩알메주 그리고 볶은 보리쌀가루를 조합하여 담근 된장을 발효시키는 방법으로 전통된장보다 bioconversion에 의하여 aglycone형 이소플라본의 함량이 높은 생체내 흡수율이 증가되는 새로운 기능성 된장을 제공할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 된장 제조시 Aspergillus oryzae 뿐만 아니라 Rhizopus oryzae를 함께 이용함으로써 된장 특유의 냄새는 저하시키면서 기능성이 향상된 제품을 생산할 수 있는 장점이 있다.

또한, 된장 제조 원료로 볶은 보리쌀가루를 첨가함으로써 맛이 증진된 기능성 된장 제품을 생산할 수 있는 장점이 있다.

또한, 기존의 된장 제조 기술에 본 발명을 적용함으로서 생리활성 효과가 더 우수한 aglycone형 isoflavones이 많이 함유된 된장을 제조하는 기술을 확립할 수 있다.

도 1 은 Aspergillus oryzae와 Rhizopus oryzae KCCM 35223에 의해 발효된 콩메주를 도시한 사진이다.
도 2 는 본 발명의 일실험예에 따른 각각의 된장담금한 옹기를 도시한 사진이다.
도 3 은 본 발명의 일실험예에 따른 HPLC에 의해 glycoside-isoflavones와 malonyl-isoflavones의 표준 피크 지역에서 얻은 선형 방정식과 R2값을 도시한 그래프이다.
도 4 는 본 발명의 일실험예에 따른 HPLC에 의해 acetyl-isoflavones 및 aglycone isoflavones의 표준 피크 지역에서 얻은 선형 방정식과 R2 값을 나타낸 그래프이다.
도 5 는 이소플라본 구성요소의 표준 HPLC크로마토그램이다.
도 6 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 산도의 변화를 도시한 그래프이다.
도 7 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 총당의 변화를 도시한 그래프이다.
도 8 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 환원당의 변화를 도시한 그래프이다.
도 9 는 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 α-amylase 활성의 변화를 도시한 그래프이다.
도 10 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 β-amylase 활성의 변화를 도시한 그래프이다.
도 11 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 protease 활성의 변화를 도시한 그래프이다.
도 12 는 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 알코올 함량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 13 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 amino-N의 함량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 14 는 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 ammonia-N의 함량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 15 내지 17은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 된장의 색도의 변화를 도시한 그래프이다.
도 18 은 본 발명의 일실험예에 따라 10주간 된장을 숙성한 후의 된장의 외관을 도시한 사진이다.
도 19 는 본 발명의 일실험예에 따라 10주간 된장 숙성 후, 된장의 관능평가를 도시한 그래프이다.
도 20 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 총페놀함량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 21 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 된장의 전자공여능의 변화를 도시한 그래프이다.
도 22 는 본 발명의 일실험예에 따른 숙성된 된장의 아질산염 소거능을 조사 비교한 결과를 도시한 그래프이다.
도 23 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 총 플라보노이드 함량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 24 는 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 된장의 이소플라본의 함량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 25 는 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 글리코사이드 이소플라보노이드의 동태를 도시한 그래프이다.
도 26 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 Malonyl- 와 Acetyl-glycoside isoflavonoids의 동태를 도시한 그래프이다.
도 27 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 aglycon-isoflavonoide 함량의 변화를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 28 은 본 발명의 일실험예에 따른 된장의 숙성기간 동안 총 이소플라보노이드의 함량의 변화를 도시한 그래프이다.
도 29 는 본 발명의 일실험예에 따른 된장 숙성 10주 후 β-glucan의 함량을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 발명자들은 콩에 함유된 isoflavones는 당과 결합된 glycoside형, acetyl기 결합형, malonyl기 결합형과 당이 분리된 aglycone형으로 나눌 수 있으며, 소화시 흡수가 용이 할뿐 아니라 생리활성이 좋은 것은 당, acetyl radical, malonyl radical이 유리된 aglycone형의 isoflavones임. 따라서 aglycone형 isoflavones의 함량을 높일 수 있는 방안을 탐색하고자 하였으며, 콩알메주로 담근 된장의 발효과정 중 glycoside, acetyl radical, malonyl radical 및 aglycone isoflavones 함량 변화를 측정하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서로 다른 새육환경과 발효능을 가지는 미생물 균주로 증숙된 콩을 발효시켜 메주로 가공하고, 그 가공된 각각의 메주를 일정 중량비로 혼합하고, 그 혼합물과 부원료인 보리와 기타 첨가물을 혼합한 다음 담금하여 제조된 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장의 제조방법은 하기의 공정을 포함하여 이루어진다.

원료 콩을 정선하여 증류수에 20~24시간 침지 후, 물 배기를 한 다음 증자기에서 1.21 lb/㎠, 121℃에서 30분 가압증자 하는 제1공정;

상기 증자된 콩을 품온 40℃이하로 냉각한 후, 원료 콩 건조중량 대비 10~20중량부의 볶은 보리쌀가루를 넣어 균일하게 혼합하는 제2공정;

상기 제2공정의 혼합물을 두개의 군으로 나누어 준비하고 각각의 군의 혼합물에 일정중량비로 미생물로서 아스퍼질러스 오리재 스타터와 리조푸스 오리재 스타터를 각각 접종하여 준비한 후, 발효시켜 아스퍼질러스 오리재 메주(AOM)와 리조푸스 오리재 메주(ROM)를 준비하는 제3공정;

상기 제3공정의 발효가 끝난 각각의 메주는 파쇄하여 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재 메주를 혼합하고, 그 혼합물 100중량부에 대하여 볶은 보리쌀가루 50~150중량부, 천일염 40~60중량부, 물 100~200중량부를 포함하도록 균일하게 혼합하는 제4공정; 및

상기 제4공정의 혼합물을 담금하여 옹기에 담고 온도 15~28℃에서 5~10주간 발효시키는 제5공정.

이때, 상기 제2공정에서 볶은 보리쌀가루의 첨가는 미생물생육에 적합한 수분함량을 조절하고, 미생물 생육영양원의 공급을 목적으로 첨가하는 것으로, 그 볶은 보리쌀가루의 혼합량이 10중량부 미만일 경우에는 미생물생육에 적합한 수분조절의 효과를 얻기 어려우며, 영양원 공급이 미미한 단점이 있을 수 있고, 20중량부를 초과할 경우에는 과다수분조절로 인하여 미생물생육에 적합한 적정수분함량 이하로 떨어져 미생물 생육을 더디기 하는 문제가 있을 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 제4공정에서 준비된 혼합물에 대해서, 볶은 보리쌀가루는 베타글루칸 및 유리당을 얻기 위해 혼합하는 것으로 그 혼합량이 50중량부 미만일 경우에는 된장의 맛과 생리활성 증진에 도움이 되는 유리당 및 베타글루칸의 유효함량 수준을 기대하기 어렵고, 150중량부를 초과할 경우에는 단백질 함량이 감소되어 된장의 품질규격을 충족시키지 못하는 단점이 있다. 보다 바람직하게는 상기 볶은 보리쌀가루는 80~120중량부를 첨가하여 혼합하는 것이 좋다. 더욱 좋게는 100~110중량부를 혼합하는 것이다.

또한, 상기 천일염의 경우에는 된장의 미생물 오염억제 및 정상발효로 품질이 우수한 것을 얻기 위해 혼합하는 것으로, 그 혼합량이 40중량부 미만일 경우에는 된장의 저염화로 잇점이 있으나 관리가 소홀하면 잡균이 증식되어 된장의 품질이 저하되는 단점이 있고, 60중량부를 초과할 경우에는 잡균의 오염억제는 효과적이나 된장으로부터 염의 섭취량이 많아져 성인병의 이병율이 증가되는 단점이 있다. 보다 바람직하게는 상기 천일염의 혼합량은 50~55중량부를 첨가하는 것이 더욱 좋다.

그리고, 물의 경우에는 그 혼합량이 100중량부 미만일 경우에는 상대적으로 염농도가 높아져 발효가 지연되는 단점이 있고, 200중량부를 초과할 경우에는 염농도가 낮아져 잡균오염억제가 어렵게 되는 문제가 있을 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 물의 혼합량은 120~180중량부를 첨가하는 것이 더욱 좋다.

본 발명에 따르면, 상기 제3공정에서 사용된 각각의 미생물은 상기 제2공정에서 준비된 혼합물 100중량부에 대하여 각각 3~5중량부를 포함하도록 접종하고, 아스퍼질서스 오리재 접종군은 온도 26±2℃, 습도 85~90%의 환경에서, 리조푸스 오리재 접종군은 온도 24±2℃, 습도 85~90%의 환경에서 각각 3일간 발효시킨다.

발효시간을 3일로 한정하는 것은 곰팡이의 포자 형성량이 많아질 수록 콩알메주의 효소활성이 저하 될 수 있으므로 가급적 3일이내로 발효시간을 준수하는 것이 바람직하다.

여기서, 상기 각각의 미생물의 접종량이 3중량부 미만일 경우에는 증자된 콩알에 곰팡이의 균사생육이 불완전하여 균일 한 콩알 메주를 얻기가 어려운 단점이 있고, 5중량부를 초과할 경우에는 종균의 과다사용 및 균사의 활착이 빠르게 되어 포자가 형성되어 효소활성이 낮아질 뿐만 아니라 생산원가가 상승되는 문제가 있을 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 제3공정의 혼합물, 즉, 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재를 일정비율로 혼합한 혼합물은 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재를 8:2 내지 4:6의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다. 만일, 상기 중량비의 범위를 벗어날 경우에는 본 발명에서 목적하는 이소플라본과 β-글루칸의 함량의 향상을 얻기 어렵다. 즉, 각각의 미생물을 단독으로 사용한 전통된장과 유사한 함량을 보여 기대한 만큼의 효과를 얻기 어려운 것이다.

이상에서 개시된 바와 같은 본 발명의 방법에 따르면, 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 이소플라본 3.13~4.03%, β-글루칸 2.62~4.19%를 함유한 기능성 된장을 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 바람직한 실험예를 들어 보다 상세히 설명하기로 한다. 단, 하기에 기술되는 실험예로 본 발명이 한정되는 것은 아니며, 본 발명을 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 얼마든지 변형가능한 것이다.

[실험예]

1. 재료

콩은 2011년도 산 황태(전북 부안군 계하면), 보리쌀(전북 부안군 계하면 창북리 370-15, 창북정제소 산)을 충북 옥천의 안남상회에서 구입하였고, 천일염(전남, 신안상사 산)을 사용하였다.

2. 콩알메주(또는 koji)의 제조

원료 콩은 정선하여 증류수에 하룻밤(9시간) 침지 후 건져 물 빼기를 하여 1.21 Lb/cm², 121℃ 에서 30분 가압증자 하고, 증자된 콩의 품온이 40로 낮아지면 수분의 함량을 조절하고자, 콩 건조중량의 10%에 상응하는 볶은 보리쌀가루를 넣어 균일하게 코팅하여 Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae KCCM 35223 균주로 만든 starter를 5% 접종하여 각각 26℃, 24℃(Rhi. oligoporus 35~38℃) 및 습도(RH)는 85~90%로 유지하여 3일 동안 발효시켜 Aspergillus oryzae Meju (AOM), Rhizopus oryzae KCCM 35223 Meju (ROM)를 만들었다. 발효가 끝난 콩알메주는 파쇄하여 된장 담금에 사용하였다.

발효가 끝난 콩알메주는 첨부도면 도 1에 도시된 바와 같다. 도 1의 (a)는 Aspergillus oryzae를 접종한 후 발효시킨 것이고, 도 1의 (b)는 Rhizopus oryzae KCCM 35223 균주를 접종하여 발효시킨 것이다.

3. 된장의 담금

된장 담금의 원료는 앞서 제조된 Aspergillus oryzae Meju (AOM), Rhizopus oryzae KCCM 35223 Meju (ROM), 볶은 보리쌀가루, 천일염, 증류수를 하기 표 1과 같은 조성비로 Asp., Rhi., A(AOM 8 : ROM 2), B(AOM 6 : ROM 4), C(AOM 6 : ROM 4)의 5개 군으로 담금하여 도 2에 도시된 바와 같이, 각각의 그룹을 옹기에 담아 20℃에서 10주간 발효시켰다.

4. 성분의 분석

된장의 성분분석은 식품공전 및 기준미증분석법(基準味增分析法)에 준하여 총질소는 Kjeldahl 법, 아미노태 질소는 Formal 적정법, 암모니아태 질소는 Sorensen 적정법, 수분함량은 건조감량법, 조지방은 Rapid soxhlet 추출법(Det-Gras N, JP Selecta S.A.spain), 총당 및 환원당은 Somogyi 변법, Ethanol 함량은 증류법, 적정산도는 중화법, pH는 pH meter(Model HM-30R, TOA, Japan), 염도는 염도계(Model Demetra TM-30D, Takemura Electric Works LTD., Japan)로 측정하였다.

5. 효소활성 측정

효소활성은 상기 표 1과 같은 조성비로 담금하여 발효시킨 각각의 된장 10g에 증류수 100㎖로 정용 한 후, 실온에서 가끔 진탕하면서 1시간 추출한 후 여과하여 조효소액으로 사용하였다.

가. α-amylase의 활성도

α-amylase의 활성도는 편창(片倉) 등의 Blue value 변법으로 측정하였다. 즉 기질은 1% 전분용액 2 mL와 Mcilvaine buffer(pH 5.2) 2 mL를 섞어 40℃에서 3분간 예열 후 추출한 조효소액 1 mL를 첨가하여 30분간 반응시킨다. 0.4M TCA 용액 5 mL를 가하여 반응을 정지시키고, 37℃에서 20분간 정치 후 여과지(No. 5B)로 여과한 반응액 1 mL를 취하여 0.005% 요오드 용액 10 mL를 넣어 578 nm에서 흡광도를 측정 한 후 효소액 I mL의 활성을 계산하였다.

나. β-amylase의 활성도

β-amylase의 활성도는 방하(芳賀) 등의 방법으로 측정하였다. 즉, 기질은 2% 전분용액 2 mL와 Mcilvaine buffer(pH 5.6) 2 mL를 섞어 40℃에서 3분간 예열 후 추출한 조효소액 1 mL를 첨가하여 1시간 반응 후 여과(No. 5B)한 효소 반응액 1 mL를 미리 준비한 DNS 용액 1 mL가 들어 있는 시험관을 끓는 수조에 넣어 정확하게 10분간 발색시킨 후 증류수 10 mL를 넣어 575 nm에서 비색 정량하였다. Maltose를 사용하여 표준곡선을 작성하였고, 효소액 l mL가 maltose 1 mg을 유리시키는 역가를 unit로 표시하였다.

다. Protease의 활성도

Protease의 활성도는 Anson-추원법(萩原法)으로 측정하였다. 즉, casein(Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.)을 Mcilvaine buffer(pH 7.2)에 녹인 0.6% casein용액을 사용하였다. 시험관에 기질로 0.6% casein용액 5 mL를 취하여 40℃에서 3분간 예열 후 추출한 조효소액 1 mL를 첨가하여 10분간 반응 후 0.4 M trichloroacetic acid(TCA) 용액 5 mL를 가하여 교반 후 37℃에서 20분간 정치한다. 이 용액을 여과지(No. 5B)로 여과한 여액 2 mL를 취하고, 여기에 0.4 M Na₂CO₃ 10 mL와 Folin reagent 2 mL(1:3)를 넣고 35℃에서 20분간 반응시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정하였다.

별도의 실험으로 L-tyrosine에 대하여, 같은 방법으로 측정하여 작성한 표준곡선 으로부터 시료용액에 의한 tyrosine 유리량(E ㎍)을 계산 하였다. 한편 대조구에 대한 tyrosine량(B ㎍)을 측정하였다. 이 조건 하에서 l 분간에 tyrosine 1 ㎍을 유리시키는 효소량을 unit하여 효소역가를 다음 식 1과 같이 계산하였다.

(식 1) Protease actvity = (E - B) × 11/2 × 1/10 × F

상기 식 1에서 F는 효소액의 희석배수이다.

6. 생리활성 측정

가. 총 페놀 화합물 측정

Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae KCCM 35223로 만든 메주로 담근 된장 추출액의 총페놀성화합물 함량은 Folin-Denis법에 의해 비색정량 하였다. 즉, 추출액을 100배 희석한 검액 5 mL에 Folin-Ciocalteu 시약 5 mL를 가하여 혼합하고 3분 후 10% Na₂CO₃ 5 mL를 넣어 진탕하고 1시간 실온에서 방치하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 검액 대신 증류수를 넣어 동일하게 처리하였다. 이때 표준물질로는 tannic acid를 5~50㎍/mL의 농도로 조제하여 검량곡선의 작성에 사용하였다.

나. 전자공여능(electron donating ability, EDA; 항산화능)

Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae KCCM 35223로 만든 메주로 담근 된장 추출액의 DPPH radeical-scavenging activity test는 Moon 등 의 방법에 의해 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl(DPPH; Sigma, MO, USA) ethanol 용액(100 M) 900 L와 시료(75% MeOH 추출물) 용액 100 L를 시험관에 넣고 30초간 진탕한 후 암소에서 10분간 반응시켜 분광광도계(Shimadzu UV-1601PC, Japan)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 대신 80% MeOH을 첨가한 용액을 대조액으로 하여 하기 식 2에 의하여 항산화능을 확인한다.

(식 2)

다. 아질산염 소거능 측정

Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae KCCM 35223로 만든 메주로 담근 된장 추출액의 발암성 nitrosamine 생성의 전구물질인 아질산염을 소거하거나, 또는 분해하는 작용을 알아보기 위하여 Do 등과 Gray의 방법으로 520nm에서 비색정량 하였다. 즉, 1 mM NaNO₂용액 1 mL에 소정 농도의 된장 추출액을 첨가하고 여기에 0.1N HCl(pH 1.2)과 0.2 M 구연산 완충액(pH 3.0, 4.2 및 6.0)을 사용하여, 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 4.2, 6.0으로 조정하여 반응용액의 부피를 10㎖로 하였다. 이를 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 얻은 반응용액을 각각 1 mL씩 취하고 여기에 2% 초산용액 5 mL를 첨가한 다음, Griess 시약(30% acetic acid로 각각 조제한 1% sulfanilic acid와 1% α-naphtylamine을 1:1비로 혼합한 것으로 사용직전에 조제) 0.4mL를 가하여 잘 혼합시킨 다음 실온에서 15분간 방치시킨 후 분광광도계(Shimadzu UV-1601PC, Japan)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하고 하기의 식 3에 의하여 아질산염 소거율을 구하였다.

(식 3)

N : 아질산염소거율

A : 1 mM NaNO₂ 용액에 시료를 첨가하여 1시간 방치시킨 후의 흡광도

B : 1 mM NaNO₂ 용액에 증류수를 첨가하여 1시간 방치시킨 후의 흡광도

C : 시료 자체의 흡광도

라. Flavonoid

플라보노이드 함량은 시료 0.1g에 Davis변법에 따라 80% methanol을 가하여 실온에서 하룻밤 동안 추출한 다음 이 검액 1mL를 시험관에 취하고 10mL의 diethylen glycol을 가하여 잘 혼합하였다. 다시 여기에 1 N-NaOH 0.1 mL를 잘 혼합시켜 37℃의 수욕상에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 80%(v/v) methanol 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 rutin(Aldrich Co., USA)을 이용하여 적성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

마. Isoflavonoids의 분석

Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae KCCM 35223로 만든 메주로 담근 5종 된장의 isoflavonoides 추출은 80%(v/v) methanol 10 mL에 된장 0.2 g을 뚜껑이 있는 갈색 시험관에 넣어 70℃ 진탕 항온조에서 250 rpm으로 15시간 진탕 추출한 후 원심분리(3000 rpm, 10 min)하여 얻은 추출액을 0.45㎛ membrane filter로 여과하여 HPLC(Agilent 1100 series, U.S.A.)로 분리하였다. 이때 칼럼은 Symetry shield RP C₁₈(4.6 mm x 250 mm x 5 , Waters Co.)을 35℃로 유지 되도록 하고, 용매는 acetonitrile : solution A (13-30 : 70-87) [solution A = glacial acetic acid : DW (0.1 : 99.9)]의 비율로 섞인 것을 분당 1 mL로 용리되게 하였다. Detector는 DAD로서 260 nm에서 70분 동안 분리된 각 peak는 표준 isoflavone(Sigma chemical Co, USA)의 retention time과 비교하여 동정 및 정량하였다.

바. 수용성 β-glucan 정량

Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae KCCM 35223로 만든 메주로 담근 된장의 β-glucan 함량은 Carr법을 개량하여 측정하였다. 즉, 된장 10 g에 5% EtOH 120 mL를 가하여 65℃로 1시간 환류추출 후 원심분리기(Hanil Model , Rotor No. 6 )로 5℃, 3000 rpm, 20 min. 동안 원심분리하여 얻은 상등액을 회수하고, 회수액의 1.5배(v/v) 용량의 95% EtOH을 가하여 4℃의 냉장실에서 하룻밤 정치하여 생성된 침전물을 회수하여 95% EtOH로 2회 세척하여 동결건조 후 무게를 측정하여 수용성 β-glucan량을 구하였다.

사. 색도 및 관능검사

된장의 색도는 색차계(Chromameter, Model CR-300, Minolta Co., Japan)로 L, a, b 값을 측정하여 평균값으로 나타내었다. 색도의 색좌표 값이 L=97.06, a=0.04, b=1.84인 표준백색판(Calibration Plate, CR-143) 위에 놓고 측정하였다.

관능검사의 경우 평가자는 관능검사 30분전부터 음식물의 섭취를 제한하였고, 균주와 메주조합을 달리한 조건으로 제조하여 냉장 보관중인 된장을 꺼내어 실온에서 1시간 방치한 후 칭량용 프라스틱 접시에 담아서 제시하였다. 평가 기준은 맛(단, 짠, 신, 쓴, 떫은 맛), 냄새, 기호도의 경우 매우 좋다: 5점, 좋다: 4점, 보통이다: 3점, 나쁘다: 2점, 매우 나쁘다: 1점으로 구분하여 관능검사를 실시 한 결과는 산술 평균 값으로 표시하였다. 관능평가에 참여한 평가자에 대한 정보는 하기 표 2와 같다.

7. 통계처리

실험에서 얻은 결과들은 엑셀소프트웨어를 사용하여 평균 및 표준오차를 작성하였다. 또한, One way ANOVA에 의해 p<0.05에서 Duncan's multiple range test를 이용하여 군간 유의차를 검증하였다.

[결과 및 고찰]

1. 원료의 성분 분석

된장 제조 시 사용한 원료 콩과 보리의 일반성분을 분석한 결과 하기 표 3과 같다. 본 발명에서는 일반성분에 대해 수분, 조단백질, 조지방질, 조회분을 검사하였으며, 3회 반복 실험 후 평균값과 표준편차값을 나타내었다. 콩의 수분 함량은 6.36±0.01%이었으며, 조단백질 함량은 39.17±0.27%, 조탄수화물 함량은 31.79±0.12%,조지방질 함량은 18.15±0.03%, 조회분 함량은 4.53±0.00%이었다. 보리의 수분 함량은 4.22±0.06%이었으며, 조단백질 함량은 18.24±0.08%, 조탄수화물 함량은 74.89±0.23%, 조지방질 함량은 1.64±0.00%, 조회분 함량은 1.01±0.01%이었다.

2. 일반성분

보리를 첨가하고 균주를 달리하여 제조한 된장의 수분 함량, 조단백질, 조지방질, 조회분 함량의 변화를 측정한 결과는 표 4와 같다.

수분 함량은 모든 시료에서 숙성기간이 길어질수록 증가하는 경향을 보였다. Rhi. ory만을 사용하여 제조한 된장이 숙성 10주 후에 55.65±0.02%를 나타내었고, Asp. ory만을 사용하여 제조한 된장은 숙성 10주 후에 54.35±0.07%를 나타내어 Rhi. ory만을 사용하여 제조한 된장이 약간 높은 수분 함량을 보였다. 균주를 일정 비율로 혼합하여 제조한 된장의 경우 숙성기간에 따라 큰 차이를 나타내지는 않았지만, Rhi. ory의 비율이 높은 된장이 약간 높은 수분 함량을 나타내었다. 일반적으로 된장의 수분 함량은 숙성 과정에서 각종 분해효소의 작용으로 고형분이 분해되어 증가하는 것으로 알려져있는데 본 발명에서도 같은 경향을 보였으며, Rhi. ory균의 전분질이나 단백질, 섬유질 등의 분해 정도가 높아 Rhi. ory만을 사용하여 제조한 된장이나 Rhi. ory의 비율이 높은 된장의 수분 함량이 높은 것으로 생각된다.

조단백질 함량은 숙성 초기 12.27~12.92% 수준으로 시작하여 이후에는 약간 감소하였지만 숙성기간에 따라 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 시료 간에도 큰 차이를 나타내지 않았다. Asp. ory만을 사용하여 제조한 된장은 숙성 초기 12.27±0.23%에서 숙성 10주 후에 11.26±0.14%로 감소하였으며, Rhi. ory만을 사용하여 제조한 된장은 숙성 초기 12.28±1.39%에서 숙성 10주 후에 11.33±1.05%로 감소하는 것으로 나타났다.

조지방질 함량은 규칙적이지는 않지만 숙성기간이 길어질수록 약간 감소하였다. Asp. ory만을 사용하여 제조한 된장은 숙성 초기 1.99±0.08%에서 숙성 10주 후에 1.39±0.04%로 감소하였으며, Rhi. ory만을 사용하여 제조한 된장은 숙성 초기 1.66±0.03%에서 숙성 10주 후에 1.18±0.0%로 감소하는 것으로 나타났다. 균주를 일정 비율로 혼합하여 제조한 된장의 경우도 시료 간에 큰 차이를 보이지 않으면서 비슷한 수준으로 감소하는 것으로 나타났다.

조회분 함량도 모든 시료에서 숙성기간에 따라 유의적인 차이가 없었으나, Asp. ory만을 사용하여 제조한 된장이 11.45~11.76%의 분포를 보인 반면 Rhi. ory만을 사용하여 제조한 된장이 10.66~10.84%의 분포를 나타내어 약간 낮은 함량을 보였다. 이는 Rhi. ory만을 사용하여 제조한 된장의 수분 함량이 약간 높기 때문에 상대적으로 낮은 경향을 보인 것으로 추정된다.

3. pH, 염도 및 적정산도

숙성과정 중 된장 시료의 pH,염도 및 산도의 변화를 측정한 결과는 표 5와 같다.

pH의 경우 숙성기간이 길어질수록 큰 차이는 아니지만 전반적으로 감소하는 것으로 나타났다. Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주만을 사용하여 제조한 된장은 숙성 초기 5.91에서 숙성 10주 후에 5.51로, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주만을 사용하여 제조한 된장은 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주만을 사용하여 제조한 된장보다 약간 낮은 값인 숙성 초기 5.60에서 숙성 10주 후에 5.24로 감소하였다. 균주를 일정 비율로 혼합하여 제조한 된장의 경우도 Rhizopus oryzae 비율이 높은 C가 다른 혼합 시료군보다 약간 낮은 pH의 값을 나타내었다. 된장 숙성 중 pH가 감소하는 것은 단백질 또는 당질에 미생물 효소가 작용하여 여러 가지 휘발성 및 비휘발성 유기산을 생성하여 산도를 증가시키기 때문이라는 보고와 결과가 일치하였다.

염도에 있어서는 숙성기간에 따라 큰 변화 없이 일정한 수준을 나타내었으며, Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주만을 사용하여 제조한 된장이 9.2~10.6의 분포를 나타내어 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주만을 사용하여 제조한 된장의 8.6~9.5보다 약간 높은 값을 나타내었다.

적정산도는 도 6에서 보는 바와 같이 숙성기간에 따라 증가하는 경향을 보여 pH 저하와 부합하였다.

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 5개 군 된장의 적정산도는 숙성기간이 경과할수록 모두 증가하는 경향을 보였는데 그 정도는 Asp. ory.는 11.2~20.86 ml/10g, Rhi. ory.는 10.80~18.85 ml/10g, A(AOM 8 : ROM 2)는 12.75~19.60 ml/10g, B(AOM 6 : ROM 4)는 11.13~20.3 ml/10g, C(AOM 4 : ROM 6)는 12.22~18.92 ml/10g의 범위였다. 특히 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주로 제조한 된장 보다 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주를 사용하여 제조한 된장이 높은 수준을 나타내어 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주로 담근 된장의 유기산 생성 능력이 다소 높은 것으로 추정된다. Aspergillus oryzae와 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 일정 비율로 혼합하여 제조한 된장의 경우도 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주 비율이 높아질수록 유기산의 생성량이 8 주째까지의 경우 C < A < B 순으로 증가하는 경향을 보이나 10 주째에는 적정산도 값이 거의 비슷한 수준으로 안정화되는 경향을 보이고 있으나, 전체적인 경향은 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주의 첨가량과는 달리 B구의 된장보다 약간 높은 산도 값을 나타내어 pH의 경우와 약간 달랐는데 이와 같은 경향은 발효과정에서 생성되는 아미노산, 지방산, 유기산 등과 염류가 결합하여 생성되는 완충작용 때문으로 생각된다.

4. 총당의 변화

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 총당 생성량의 변화는 도 7과 같다.

도 7의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM 과 ROM 의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안 총당 함량은 담금 2 주째가 가장 높았으나 이후 감소하는 경향이었다. 이들 된장의 숙성기간 동안 총당 함량은 Asp. ory.는 9.16~12.52%, Rhi. ory.는 7.97~12.10%, A(AOM 8 : ROM 2)는 7.93~11.02%, B(AOM 6 : ROM 4)는 7.65~12.2%, C(AOM 4 : ROM 6)는 7.95~10.88%의 범위였다. 총당 함량은 숙성기간 동안 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 경우 가장 높았던 반면 C(AOM 4 : ROM 6)로 담근 된장의 경우 가장 낮은 경향을 보였다. 또 AOM 과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 총당 함량은 AOM의 비율 증가와는 일치되지 않아 A < C < B 된장 순이었다. 즉, 숙성 10 주째 된장들의 총당 함량은 A된장 < C된장 < B된장 <Rhi. ory.된장 < Asp. ory.된장 순이었다.

5. 환원당의 변화

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 환원당 생성량의 변화는 도 8 과 같다.

도 8 의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안 환원당 함량은 담금 2 주째가 가장 증가하였다가 이후 감소하는 경향이었다. 이들 된장의 숙성기간 동안 환원당 함량은 Asp. ory.는 1.57~2.47%, Rhi. ory.는 1.45~1.82 %, A(AOM 8 : ROM 2)는 1.23~1.99%, B(AOM 6 : ROM 4)는 1.35~2.30%, C(AOM 4 : ROM 6)는 1.212.10%의 범위였다. 환원당 함량은 숙성기간 동안 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 경우 가장 높았던 반면 C(AOM 4 : ROM 6)로 담근 된장의 경우 가장 낮은 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 도 7의 총당 함량과 유사하였다. 또 AOM 과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 환원당 함량은 AOM의 비율 증가와는 일치되지 않아 C < A < B 된장 순이었다. 즉, 숙성 10 주째 된장의 총당 함량은 A된장 < C된장 < B된장 <Rhi. ory.된장 < Asp. ory.된장 순으로 도 7의 총당의 함량변화와 유사한 경향이었다.

6. 효소의 활성

가. α-amylase의 활성도

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 전분의 액화효소인 α-amylase 효소활성(액화력) 변화는 eh 9와 같다.

도 9의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 α-amylase 활성(액화력)은 담금 초기가 가장 높았으나 10주 숙성기간 동안 점진적으로 모두 감소하는 경향이었다. 이들 된장 숙성기간 동안의 효소활성은 Asp. ory.는 658.95~389.2 unit/ml, Rhi. ory.는 619.47~373.1 unit/ml, A(AOM 8 : ROM 2)는 609.56~351.70 unit/ml, B(AOM 6 : ROM 4)는 624.39~368.00 unit/ml, C(AOM 4 : ROM 6)는 602.42~357.90 unit/ml의 범위였다.

Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 α-amylase 활성(액화력)이 숙성기간동안 가장 높았던 반면 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 된장의 α-amylase 활성(액화력)이 가장 낮았다. 또 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 α-amylase 활성(액화력)은 AOM의 비율 증가와는 일치하지 않아 앞으로 더 깊이 있는 연구가 요구되었고, α-amylase 활성(액화력)은 A < C < B 순으로 AOM 보다는 낮은 반면 ROM 보다는 높았다. 즉, 된장들의 전체적인 α-amylase 활성은 4 주째까지는 C된장 < A된장 < B된장 < Rhi. ory.된장 < Asp. ory.된장 순이나 6 주째 부터는 A된장 < C된장 < B된장 < Rhi. ory.된장< Asp. ory.된장 순이었다.

나. β-amylase 의 활성도

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 전분의 액화효소인 β-amylase 효소활성(당화력) 변화는 도 10과 같다.

도 10의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 β-amylase 활성(당화력)은 담금 2 주째가 가장 높았으나, 이후 10주 까지의 숙성기간 동안 점진적으로 모두 감소하는 경향이었다. 이들 된장 숙성기간 동안의 효소활성은 Asp. ory.는 46.73~36.17 ug/ml, Rhi. ory.는 41.80~33.39 ug/ml, A(AOM 8 : ROM 2)는 40.80~28.36 ug/ml, B(AOM 6 : ROM 4)는 45.64~31.41 ug/ml, C(AOM 4 : ROM 6)는 43.34~27.25 ug/ml의 범위였다. Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 β-amylase 활성(당화력)이 숙성기간동안 가장 높았던 반면 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장의 β-amylase 활성(당화력)은 4 주째 까지 가장 낮았으나 그 후에는 Asp. ory.된장 다음으로 증가하였다. 또 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 β-amylase 활성(당화력)은 AOM의 비율 증가와는 일치하지 않아 A=C < B 된장 순이었다. 즉, 된장들의 전체적인 β-amylase 활성은 4 주째까지는 Rhi. ory.된장 < C된장 < A된장 < B된장 < Asp. ory.된장 순이나 6 주째 부터는 Rhi. ory.된장 < C된장 = A된장 < B된장 < Asp. ory.된장 순이었다.

다. Protease 활성

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 단백질 분해효소인 중성 protease활성 변화는 도 11과 같다.

도 11의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 protease활성은 담금 2 주째가 가장 높았으나 이후 10주 까지의 숙성기간 동안 점진적으로 모두 감소하는 경향이었다. 이들 된장 숙성기간 동안의 효소활성은 Asp. ory.는 112.12~152.19 ㎍/ml, Rhi. ory.는 140.42~95.11㎍/ml, A(AOM 8 : ROM 2)는 145.07~96.89 ㎍/ml, B(AOM 6 : ROM 4)는 147.00~108.87 ㎍/ml, C(AOM 4 : ROM 6)는 146.41~98.01 ㎍/ml의 범위였다. Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 protease 활성이 숙성기간동안 가장 높았던 반면 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장의 protease 활성은 6 주째 다른 된장보다 약간 증가하였으나 전제적인 경향은 가장 낮았다. 또 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 protease 활성은 AOM의 비율 증가와 4주째 까지는 증가하는 경향을 보이나 6 주째 이후의 경우 일치되지 않아 C < A < B 된장 순 이었다. 즉, 된장들의 전체적인 protease 활성은 Rhi. ory.된장 < C된장 < A된장 < B된장 < Asp. ory.된장 순이었다.

7. 알코올

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 알코올 생성량의 변화는 도 12와 같다.

도 12의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안 에탄올 함량은 담금 2 주째가 가장 높았으나 이후 4 주째 까지 감소하다가 다시 약간 증가하는 경향이었다. 이들 된장 숙성기간 동안의 에탄올 함량은 Asp. ory.는 0.256~0.476%, Rhi. ory.는 0.229~0.430%, A(AOM 8 : ROM 2)는 0.246~0.454%, B(AOM 6 : ROM 4)는 0.256~0.470%, C(AOM 4 : ROM 6)는 0.244~0.454%의 범위였다. 에탄올 함량은 숙성기간 동안 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 경우 가장 높았던 반면 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장의 경우 가장 낮았다.

또, AOM 과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 에탄올 함량은 AOM의 비율 증가와는 일치되지 않아 A < C < B 된장 순이었다. 즉 된장들의 전체적인 에탄올 생성량은 Rhi. ory.된장 < A된장 < C된장 < B된장 < Asp. ory.된장 순이었다.

8. Amino-N(Amino nitrogen)

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 Amino-N량의 변화는 도 13과 같다.

도 13의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안 amino-N 함량은 점진적으로 증가하는 경향이었고 8 주째부터 증가폭이 완화되는 경향을 보였다.

Amino-N 함량은 된장의 맛을 좋게 하는 하나의 인자로 숙성기간 동안 amino-N 함량은 Asp. ory,는 0.43~1.42%, Rhi. ory.는 0.26~1.03%, A(AOM 8 : ROM 2)는 0.24~1.26%, B(AOM 6 : ROM 4)는 0.346~1.35%, C(AOM 4 : ROM 6)는 0.23~1.20%의 범위였다.

Amino-N 함량은 숙성기간 동안 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 경우 가장 높았던 반면 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장의 경우 가장 낮았다. 또 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 amino-N 함량은 AOM의 비율 증가와는 일치되지 않아 C < A < B 된장 순이었다. 즉 된장들의 전체적인 amino-N 생성량은 Rhi. ory.된장 < C된장 < A된장 < B된장 < Asp. ory.된장 순이었다.

9. Ammonia-N(Ammonia nitrogen)

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 숙성기간 동안 Ammonia-N 함량의 변화는 도 14와 같다.

도 14의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM 과 ROM 의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안 Ammonia-N 함량은 점진적으로 증가하는 경향이었고 8 주째 부터 증가폭이 완화되는 경향을 보였다. 이들 된장 숙성기간 동안의 ammonia-N 함량은 Asp. ory.는 0.10~0.37%, Rhi. ory.는 0.13~0.34%, A(AOM 8 : ROM 2)는 0.12~0.38%, B(AOM 6 : ROM 4)는 0.10~0.38%, C(AOM 4 : ROM 6)는 0.11~0.35%의 범위였다.

된장의 품질에 부정적인 영향을 끼칠 수 있는 ammonia-N 함량은 숙성기간 동안 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 된장의 경우 가장 낮았던 반면 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장의 경우 5 가지 된장 가운데 중간 수준이었다.

또 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 ammonia-N 함량은 AOM의 비율 증가와는 일치되지 않아 C < A < B 된장 순이었다. 즉, 5종 된장의 전체적인 ammonia-N 생성량은 Rhi. ory.된장 < C된장 < A된장 < B된장 < Asp. ory.된장 순이었다. Ammonia-N의 생성량이 상대적으로 낮았던 원인은 숙성기간 동안 실내의 온도가 202로 유지되어 아미노산의 분해반응이 억제되었기 때문으로 생각된다.

10. 된장의 색도

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 이들을 단독 또는 이들을 일정 비율로 담금한 Asp. ory., Rhi. ory., A(AOM 8 : ROM 2), B(AOM 6 : ROM 4), C(AOM 4 : ROM 6)의 5개 군의 된장숙성 기간 동안 색도를 조사한 결과는 도 15, 16 및 17과 같다.

도 15의 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 5개 군 된장의 L값(명도)은 숙성기간이 경과할수록 모두 감소하는 경향을 보였는데 그 정도는 Asp. ory.는 47.80~38.99, Rhi. ory.는 50.90~40.33, A(AOM 8 : ROM 2)는 47.46~39.38, B(AOM 6 : ROM 4)는 47.50~38.24, C(AOM 4 : ROM 6)는 49.69~40.65의 범위였다.

도 16의 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 5개 군 된장의 a값(적색도)은 숙성기간이 경과할수록 8주까지는 증가하는 경향을 보이다 10 주째에는 약간 감소하였는데 전체적으로는 약간 증가하는 경향을 보였고, 그 정도는 Asp. ory.는 5.07~7.79, Rhi. ory.는 5.04~7.84, A(AOM 8 : ROM 2)는 5.03~7.80, B(AOM 6 : ROM 4)는 5.38~8.12, C(AOM 4 : ROM 6)는 5.02~7.65의 범위였다.

도 17의 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 5개 군 된장의 b값(황색도)은 숙성기간이 경과할수록 6주까지는 감소하는 경향을 보이다 8주째에 급속히 증가한 후 다기 10 주째에는 약간 감소하였는데, 그 정도는 Asp. ory.는 12.90~19.50, Rhi. ory.는 13.86~19.37, A(AOM 8 : ROM 2)는 12.64~19.37, B(AOM 6 : ROM 4)는 11.52~18.87, C(AOM 4 : ROM 6)는 10.87~20.03의 범위였다.

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 5개 군 된장의 도 15의 L, 도 16의 a, 도 17의 b 변화는 숙성이 진행될수록 L값은 감소를 보인데 반하여 a, b값은 미약한 증가를 보여 된장의 전체적인 색은 어두어지는 경향을 보였다. Park등은 유통되는 전통된장의 평균적인 L값은 37.7, a값은 7.5, b값은 19.6이라고 보고한 연구결과 보다는 본 발명의 된장의 경우 모두 L값은 높았고, a 와 b 값은 모두 낮은 결과를 보였다.

따라서 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 4개 군의 된장이 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담그어 10주 동안 숙성시킨 된장의 경우 색도가 낮음을 알 수 있었다.

11. 된장의 외관

도 18은 10주간 숙성된 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 5개 군 된장의 외관을 비교하고자 칭량접시에 담아 촬영하였다.

도 18에서 보는 바와 같이 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주, 그리고 이들 메주를 일정비율로 하여 담금한 A, B, C 된장들 간의 색의 차이가 크지 않았으나, Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주를 100%, Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주를 80% + Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 20%로 조합하여 담근 된장의 경우 윤기가 있어 보였다.

12. 된장의 관능평가

Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주를 이용하여 담근 된장의 10주 숙성 후 관능평가 결과는 도 19와 같다.

도 19의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 10주간 숙성 후의 관능평가 결과는 단맛의 점수는 1.86~3.86 범위로 Rhi. ory.장 < B 된장 = C 된장 < A 된장 < Asp. ory.된장 순, 짠맛의 점수는 2.43~4.14 범위로 Asp. ory.된장 < Rhi. ory.된장 = C 된장 < A 된장 < B 된장 순, 신맛의 점수는 1.00~2.14 범위로 Asp. ory.된장 < B 된장 = C 된장 < Rhi. ory.된장 < C 된장 순, 쓴맛의 점수는 1.57~3.86 범위로 Asp. ory.된장 < B 된장 < C 된장 < Rhi. ory.된장 < A 된장 순, 떫은맛의 점수는 1.00~3.00 범위로 Rhi. ory.된장 < C 된장 < B 된장 =< A 된장 < Asp. ory.된장 순, 향미의 점수는 2.71~3.57 범위로 A 된장 ≤ B 된장 < Asp. ory.된장 < C 된장 < Rhi. ory.된장 순, 색상의 점수는 2.43~3.29 범위로 Rhi. ory.된장=Asp. ory. 된장 < A 된장 < C 된장 = B 된장 순, 전체적인 기호도의 점수는 1.57~4.43 범위로 Rhi. ory.된장 < C 된장 < B 된장 < A 된장 < Asp. ory.된장 순이었다. 관능평가 항목별로 높은 점수를 얻은 된장을 보면 단맛은 Asp. ory.된장, 짠맛은 B 된장, 신맛은 C 된장, 쓴맛은 A 된장, 떫은맛은 Asp. ory.된장, 향미는 Rhi. ory.된장, 색상은 B 된장이었으며, 이들 항목 중 향미에서 Rhi. ory.된장의 경우가 높은 점수를 획득하였는데 이는 젊은 연령층의 경우 된장 고유의 냄새를 싫어하여 냄새가 적게 나는 된장에 높은 점수를 준 결과로 생각되나 기호도는 Rhi. ory.된장이 가장 낮은 점수를 획득하였다.

전체적인 관능평가 결과를 바탕으로 냄새가 적은 된장을 만드는데 Rhizopus oryzae를 활용할 가치가 있음을 확인하였다.

13. 생리활성물질

가. 폴리페놀(총페놀) 화합물

대두를 증자하여 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 KCCM 35223 균주를 접종하여 만든 콩알메주를 이용하여 단독, 또는 이들 두가지 메주를 조합하여 담근 된장의 숙성기간 동안 총페놀 함량의 변화를 조사한 결과는 도 20과 같다.

도 20의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 폴리페놀(총 페놀)함량은 숙성 전 기간 동안 정도의 차이는 있으나 경시적으로 모두 증가하는 경향이었다.

이들 된장 숙성기간 동안의 폴리페놀(총 페놀)함량은 Asp. ory.는 11.32~153.95 ㎍/g, Rhi. ory.는 26.63~173.28 ㎍/g, A(AOM 8 : ROM 2)는 14.25~148.76 ㎍/g, B(AOM 6 : ROM 4)는 10.42~158.81 ㎍/g, C(AOM 4 : ROM 6)는 15.42~142.33 ㎍/g의 범위였다. Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 된장의 폴리페놀(총 페놀)함량이 숙성기간동안 가장 높았던 반면 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM) 6 : Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(ROM) 4의 비율로 담근 C된장의 폴리페놀(총 페놀)함량이 가장 낮았다.

또 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 폴리페놀(총 페놀)함량은 AOM의 비율 증가와 일치되지는 않아 C < A < B 된장 순이었다. 즉, 10주 동안 숙성된 된장들의 폴리페놀(총 페놀) 함량은 C된장 < A된장 < Asp. ory.된장 < B된장 < Rhi. ory.된장 순이었다.

나. 전자공여능(electron donating ability, EDA; 항산화능)

대두를 증자하여 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 KCCM 35223 균주를 접종하여 만든 콩알메주를 이용하여 된장을 담그어 숙성된 된장의 전자공여능(electron donating ability, EDA; 항산화능)을 조사한 결과는 도 21과 같다.

도 21의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 전자공여능(electron donating ability, EDA; 항산화능)은 숙성 전 기간 동안 정도의 차이는 있으나 경시적으로 모두 증가하는 경향이었다. 이들 된장 숙성기간 동안의 전자공여능은 Asp. ory.된장은 7.69~24.53, Rhi. ory.된장은 6.87~23.48, A(AOM 8 : ROM 2)된장은 10.12~17.00, B(AOM 6 : ROM 4)된장은 8.78~22.91, C(AOM 4 : ROM 6)된장은 6.87~20.37의 범위였다. 이들 된장의 28 주째의 항산화성은 경향이 일정치 않았으며, 숙성 종료 시점인 10 주째 AOM과 ROM 단독 및 이들의 조합비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 전자공여능은 AOM의 비율 증가와 일치되지는 않아 A < C < B 된장 순이었다. 즉, 10주 째의 숙성된 된장들의 전자공여능은 A 된장 < C된장 < B된장 < Rhi. ory.된장 < Asp. ory.된장 순이었다.

다. 아질산염 소거능(Nitrite Scavenging Ability)

대두를 증자하여 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 KCCM 35223 균주를 접종하여 만든 콩알메주를 이용하여 된장을 담그어 10 주 동안 숙성시킨 된장의 아질산염 소거능을 조사 비교한 결과는 도 22와 같다.

도 22는 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장을 10 주간 숙성시켜 80% MeOH 추출액으로 pH 1.2의 조건에서 아질산염 소거능(Nitrite Scavenging Ability)은 Asp. ory.된장 28.74%, Rhi. ory.된장 21.37%, A(AOM 8 : ROM 2)된장 23.50%, B(AOM 6 : ROM 4)된장 22.06%, C(AOM 4 : ROM 6)된장 20.12% 이었고, 아질산염의 소거능이 제일 작은 C 된장을 기준으로 Asp. ory.된장, Rhi. ory.된장, A된장, B된장은 각각 1.43배, 1.06배, 1.12배, 1.10배 증가하였다.

pH 3.0의 조건에서 아질산염 소거능은 Asp. ory.된장 33.76%, Rhi. ory.된장 30.37%, A(AOM 8 : ROM 2)된장 29.84%, B(AOM 6 : ROM 4)된장 33.20%, C(AOM 4 : ROM 6)된장 21.74% 이었고, 아질산염의 소거능이 제일 작은 C 된장을 기준으로 Asp. ory.된장, Rhi. ory.된장, A된장, B된장은 각각 1.55배, 1.40배, 1.37배, 1.53배 증가하였다.

pH 4.2의 조건에서 아질산염 소거능은 Asp. ory.된장 29.89%, Rhi. ory.된장 26.52%, A(AOM 8 : ROM 2)된장 23.33%, B(AOM 6 : ROM 4)된장 24.98%, C(AOM 4 : ROM 6)된장 19.72% 이었고, 아질산염의 소거능이 제일 작은 C 된장을 기준으로 Asp. ory.된장, Rhi. ory.된장, A된장, B된장은 각각 1.52배, 1.35배, 1.18배, 1.27배 증가하였다.

pH 6.0의 조건에서 아질산염 소거능은 Asp. ory.된장 2.10%, Rhi. ory.된장 1.66%, A(AOM 8 : ROM 2)된장 1.57%, B(AOM 6 : ROM 4)된장 1.82%, C(AOM 4 : ROM 6)된장 1.34%이었고, 아질산염의 소거능이 제일 작은 C 된장을 기준으로 Asp. ory.된장, Rhi. ory.된장, A된장, B된장은 각각 1.57배, 1.24배, 1.17배, 1.36배 증가하였다.

10 주간 숙성시킨 된장의 아질산염 소거능은 pH조건에 따라서 소거능이 현저한 차이를 보이고 있음을 알 수 있으며, pH별 평균적인 아질산염 소거능은 pH 6.0 < pH 1.2 < pH 4.2 < pH 3.0 순이었다.

라. 총 플라보노이드

Flavonoid는 식물의 2차 대사산물로 얻어지는데, IUPAC 명명법에 따라 flavonoids는 2-phenyl-chromen-4-one(또는 2-phenyl-1,4-benzopyrone), isoflavonoids는 3-phenyl-chromen-4-one(또는 3-phenyl-1,4-benzopyrone), neoflavonoids는 4-phenyl coumarine(또는 4-phenyl-1,2-benzopyrone) 구조로부터 유리되어 분류된다.

Flavonoids의 생리기능은 항산화능이 가장 잘 알려져 있고, 항 알러지, 항염증, 항균성, 그리고 여러 기작(종양의 침입 억제와 암세포를 사멸시키는데 도움)에 의하여 항암작용 과 심장질환에 대항하는 기능을 보유하는 것으로 알려져 있으며, 식이로 과일과 채소를 많이 섭취하면 심장혈관질환(CVD)의 위험을 감소시킬수 있고, 실제 flavonoids를 고식이로 섭취하면 CVD의 위험이 감소, 내피기능, 혈압저하, LDLl의 산화억제, 혈소판 응집억제, 감염반응의 조절, 지질대사 변경, insulin 반응성 개선 등이 가능할 것으로 추정, flavonoids의 자원은 citrus fruits, berries, onions, parsley, legumes, green tea, red wine, seabuckthorn, dark chocolatez(cocoa) 등이며, 이들로부터 분리된 flavonoids는 hesperidin, rutin(a glycoside quercetin), luteolin, tangeritin, catechins(catechin, epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate), oligomeric proanthocyanins 등이다.

상기한 flavonoids의 유익성이 알려져 대두를 증자하여 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae로 KCCM 35223 균주를 접종 후 발효시켜 만든 콩알메주를 이용하여 된장을 담그어 10 주 동안 숙성시킨 된장의 총 플라보노이드 함량을 조사한 결과는 도 23과 같다.

도 23의 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안 총 플라보노이드 함량은 담금 6 주째 까지는 Asp. ory.된장, Rhi. ory.된장, B된장의 함량이 그 외의 A 된장과 C 된장 보다 약간 높았으나 큰 차이가 없었다.

이들 된장의 숙성기간 동안 총 플라보노이드 함량은 Asp. ory.는 2.64~8.03%, Rhi. ory.는 2.81~11.79%, A(AOM 8 : ROM 2)는 2.34~6.38%, B(AOM 6 : ROM 4)는 2.36~11.28%, C(AOM 4 : ROM 6)는 2.11~8.41%의 범위였다. 또 AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 총 플라보노이드 함량은 AOM의 비율 증가와는 일치되지 않아 A < C < B 된장 순이었다. 즉 된장들의 전체적인 총 플라보노이드 함량은 A된장 < Asp. ory.된장 < C된장 < B된장 < Rhi. ory.된장 순이었다.

총 플라보노이드의 함량은 증자된 대두가 발효과정에서 미생물이 분비하는 폴리페놀 분해효소들에 의하여 고분자 구조의 결합이 분해되어 저분자의 폴리페놀들로 전환되는 과정에서 증가되는 것으로 메주 및 된장의 발효 과정에 관여하는 미생물에 의하여 생성되었기 때문으로 생각되었다.

마. 이소플라보노이드(Isoflavonoids)

Isoflavonoid 화합물이 함유된 식물에 대하여 정리한 결과 나자식물류인 낙우송목, 나송목, 피자식물류인 국화목, 명아주목, 장미목, 운향목, 무환자목, 동백목, 제비꽃목, 그리고 단자엽류인 수선목, 벼목, 백합목 등이었는데 두류(콩)는 나자식물로 장미목 장미과에 속한다.

Isoflavonoid 화합물의 기본 골격은 isoflavonoid, isoflavan, isoflavanone, coumestan, rotenoid, pterocarpan, coumaronochromone의 7개로 분류되어진다. 모든 두과식물에서 7종의 isoflavonoid 중 isoflavone 89%, isoflavanone 100%, coumestan 100%, pterocarpan 100% 그리고 ratenoid 95%가 함유되어 있음이 확인되었다.

전술한 내용으로부터 flavonoids의 종류가 다양함을 알 수 있어 대두를 증자하여 Aspergillus oryzae 및 Rhizopus oryzae KCCM 35223 균주를 접종 후 발효시켜 만든 콩알메주로 된장을 담그어 10주 숙성기간 동안 경시적인 이소플라보노이드(Isoflavonoids) 동태를 조사한 결과는 도 24, 25, 26, 27 및 28과 같다.

도 24에서 보면 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장과 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안 글리코사이드 이소플라보노이드 중 Daidzin 함량의 경우 Asp. ory.된장은 29.77~204.70 mg/100g 범위, Rhi. ory.된장은 88.10~936.27 mg/100g 범위, A된장은 4.14~264.63mg/100g 범위, B된장은 32.33~929.16 mg/100g 범위, C된장은 5.48~627.88 mg/100g 범위, Glycitin 함량의 경우 5종의 된장에서 미검출 되었으며, Genistin 함량의 경우 Asp. ory.된장은 79.61~727.77 mg/100g 범위, Rhi. ory.된장은 483.55~2113.49 mg/100g 범위, A된장은 97.42~1032.74 mg/100g 범위, B된장은 105.25~2613.99 mg/100g 범위, C된장은 87.02~2049.44 mg/100g 범위임을 알 수 있었다.

Malonyl-daidzin 함량의 경우 Rhi. ory.된장은 99.71~19.41 mg/100g 범위, B된장은 0.00~74.25 mg/100g 범위, malonyl-glycitin 함량의 경우 5종의 된장 모두 미검출 되었으며, malonyl-genistin 함량의 경우 Rhi. ory.된장은 131.66~300.93 mg/100g 범위, A된장은 153.46~230.59 mg/100g 범위, B된장은 131.66~214.37 mg/100g 범위, C된장은 213.48~233.85 mg/100g 범위임을 알 수 있었다.

Acetyl-daidzin 함량의 경우 A된장은 107.41~320.12 mg/100g 범위, B된장은 0.00~179.19 mg/100g 범위, C된장은 0.00~176.19 mg/100g 범위, Acetyl-glycitin 함량의 경우 Asp. ory.된장에서만 0.00~98.70 mg/100g 범위로 검출 되었으며, Acetyl-genistin 함량의 경우 Asp. ory.된장은 137.65~276.97 mg/100g 범위, Rhi. ory.된장은 0.00~220.86 mg/100g 범위, A된장은 29.02~248.46 mg/100g 범위, B된장은 0.00~444.16 mg/100g 범위, C된장은 0.00~251.16 mg/100g 범위임을 알 수 있었다.

Aglycon-daidzein 함량의 경우 Asp. ory.된장은 680.80~1,060.50 mg/100g 범위, Rhi. ory.된장은 696.55~1,167.54 mg/100g 범위, A된장은 755.11~1,150.38 mg/100g 범위, B된장은 645.09~1,085.40 mg/100g 범위, C된장은 628.90~1,073.70 mg/100g 범위이었다.

Aglycon-glycitein 함량의 경우 함량의 경우 Asp. ory.된장은 1,919.93~2,605.73 mg/100g 범위, Rhi. ory.된장은 2,046.89~3,519.16 mg/100g 범위, A된장은 2,101.93~2,944.02 mg/100g 범위, B된장은 2,097.26~3,061.37 mg/100g 범위, C된장은 2,352.99~3,019.70 mg/100g 범위이었다.

Aglycon-genistein 함량의 경우 Asp. ory.된장은 1,911.04~2,593.13 mg/100g 범위, Rhi. ory.된장은 2,160.06~4,010.28 mg/100g 범위, A된장은 1,922.05~3,044.83 mg/100g 범위, B된장은 1,898.15~3,352.90 mg/100g 범위, C된장은 2,819.95~3,239.13 mg/100g 범위 임을 알 수 있었다.

Glycoside isoflavonoides 가운데 glycitin의 경우 검출되지 않은 이유는 침지 및 증자 과정에서의 용출과 콩알메주의 발효과정에서 분비되는 폴리페놀 분해 효소들에 의하여 쉽게 결합이 분해되기 때문으로 생각되었고, 이를 뒷밭침하는 USDA-IOWA State University isoflavonoes data base의 NDB No. 99093의 한국산 대두의 분석결과에도 분석된 결과가 없는 것으로 기록되어있다.

바. Glycoside isoflavonoides의 동태

Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장과 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 isoflavonoides함량을 분석하여 Daidzin, Glycitin , Genistin의 함량을 분석한 결과는 도 25와 같다.

도 25는 5종 된장의 숙성기간 동안 isoflavonoides 가운데 glycoside-isoflavonoides인 Daidzin, Glycitin, Genistin의 함량을 분석한 결과로 숙성 전 기간 동안 Genistin의 함량이 가장 높았고, Daidzin은 검출된 반면에 Glycitin은 검출되지 않았다. 된장의 종류에 관계없이 숙성이 진행될수록 Daidzin 및 Genistin 함량이 감소되는 경향이 뚜렷하여, 숙성 초기 0주째 함량보다 숙성 종료 시점인 10주째에 Genistin은 감소가 현저하였으나 모든 된장에서 검출된 반면에 Daidzin은 Asp. ory.된장, Rhi. ory.된장 그리고 B(Asp 6: Rhi 4)된장에서만 검출되었다.

이와 같은 결과는 효소들에 의한 Genistin의 분해 속도가 빠르기 때문인 것으로 생각된다.

사. Malonyl- 와 Acetyl-glycoside isoflavonoides의 동태

Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장과 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 malonyl- 또는 acetyl- isoflavonoides인 malonyl-daidzin, malonyl-glycitin , malonyl-genistin, acetyldaidzin, acetyl-glycitin , acetyl-genistin의 함량을 분석한 결과는 도 26과 같다.

도 26은 종 된장의 숙성기간 동안 malonyl-glycoside isoflavonoides인 malonyl-daidzin, malonyl-glycitin, malonyl-genistin, acetyl-glycoside isoflavonoides인 acetyl-daidzin, acetyl-glycitin, acetyl-genistin의 함량을 분석한 결과로 malonyl-glycitin은 검출되지 않았으나 malonyl-daidzin은 0주째 A(Asp 8 : Rhi 2)된장에서만 검출되었을 뿐이었고, 발효과정에서 쉽게 malonyl-glycitin과 acetyl-glycitin이 aglycon isoflavonoides로 전환되는 것으로 추정되었다.

Malonyl-genistin은 0, 2주까지는 Asp. ory.된장을 제외한 4종 된장 모두에서 확인되었고, 4 주째는 B(Asp 6 : Rhi 4)된장, 6주째는 Rhi. ory.된장에서 확인 되었을 뿐 이후에는 검출되지 않았다. Acetyl-genistin은 0, 2, 4 주 까지는 5종의 모든 된장에서 검출되었으나 6주째는 Rhi. ory.된장을 제외한 4종의 된장, 8주째는 Asp. ory.된장, 10 주째는 Asp. ory.된장과 A(Asp 8 : Rhi 2)된장에서 검출되어 숙성이 진행됨에 따라서 aglycon isoflavonoids로의 전환속도가 malonyl-glycoside isoflavonoides와 acetyl-glycoside isoflavonoides 가운데 가장 느린 것으로 생각된다. 또한 5종의 된장가운데 acetyl-daidzin은 0 주째 A(Asp 8 : Rhi 2)된장, A(Asp 6 : Rhi 4)된장, C(Asp 4 : Rhi 6)된장, 2 주째 A(Asp 8 : Rhi 2)된장, 6주째 Asp. ory.된장, 8 주째 C(Asp 4 : Rhi 6)된장에서만 검출되었다. 이러한 결과로부터 malonyl-glycoside isoflavonoides와 acetyl-glycoside isoflavonoides로부터 aglycon isoflavonoides로의 전환속도는 acetyl-genistin < malonyl-genistin < acetyl-daidzin < malonyl-daidzin acetyl-glycitin malonyl-glycitin 순으로 추정되었다.

5종의 된장 모두 숙성기간 0주에서부터 10주까지의 결과를 보면 mlonyl-glycitin의 경우 검출되지 않았고, malonyl-daiazin의 경우 0주째의 A(Asp 8 : Rhi 2)된장 에서만 검출되어 221.57mg/100g이었던 결과에 비하여 malonyl-genistin은 0, 2, 4, 6 주째 까지 검출되고 있어 열에 대한 안정성은 mlonyl-glycitin < malonyl-daiazin < malonyl-genistin 순이었다.

아. Daidzein, Glycitein , Genistein의 동태

Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장과 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 glycoside isoflavonoides가 효소작용에 의하여 glucose가 분해되어 aglycon isoflavonoides로 전환된 daidzein, glycitein, genistein의 함량을 분석한 결과는 도 27과 같다.

도 27은 5종 된장의 숙성기간 동안 aglycon isoflavonoides인 daidzein, glycitein, genistein의 함량을 분석한 결과로 0, 2주째까지는 glycitein < genistein < didzein 순이었으나, 4주 이후 10주까지는 glycitein < didzein < genistein 순으로 바뀌었다.

Glycitein은 숙성 초기부터 숙성이 완료된 시점까지 점진적으로 감소하는데 비하여 didzein과 genistein은 숙성이 완료 될 때까지 점진적으로 증가하고 있음이 확인되었다.

특히 5종의 된장 모두 숙성이 진행될수록 genistein의 함량이 증가하는 결과를 확인 할 수 있었고, Aspergillus oryzae 와 Rhizopus oryzae를 이용하여 만든 메주들로 담근 된장가운데 Rhizopus oryzae로 만든 메주로 담근 된장의 경우 함량이 높아짐을 확인하여 생리활성이 우수한 genstein이 품부한 된장을 담그기위한 균주로 가치가 인정되었다.

종래의 연구결과에 따르면, 대두로부터 분리된 genistein(4,5,7-trihydroxyflavone)은 세포실험 및 동물 실험을 통하여 체중감소, 지방분해, 지방전구 세포 성숙저해, 항비만효과, 지방세포의 괴사유도 등에 효과가 있음이 보고되어 있으며, antifibrotic 효과 및 hepatic stellate cells의 출현 효과, 동물과 사람에서 암, 골다공증, 심장질환에 대한 예방과 치료효과가 있음이 알려져 있다.

또한 genistein은 단백질합성에 관여하는 tyrosine protein kinase 저해 능력이 있는 즉, growth factor 또는 cytokine에 자극된 정상세포와 암세포 둘 사이 모두의 증식을 약화시킨다. 간의 병리생리학 및 생리학에서의 genistein의 역할은 마지막에 분해된다고 하였다.

또한 genistein을 in vitro조건에서 암세포의 성장을 억제하는 농도 IC₅₀ 값은 2~12 ㎍/ml 로 아주 낮은 수준에서 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

유방암 세포의 증식을 촉진하는 genistein 농도는 10 nM~2μM 수준이나 2μM 이상에서는 억제, isoflavone의 농도가 10 nM~10μM일 때 유방암세포의 estrogen 수용체의 발현을 증가시켜 세포성장을 촉진하나 25μM~100μM 수준에서는 유방암 세포 성장에 관여하는 tyrosine protein kinase 와 topoisomerase II의 활성을 저해하여 유방암세포의 성장이 억제된다고 알려져 있다.

In vitro 실험에서 genistein은 전립선암 세포의 생성과 관계가 있는 androgen receptor의 성장억제에 관여하는 효소의 하나인 5-reductase acitivity를 감소, prostate carcinoma cell을 이식시킨 쥐에 genistein을 50 mg/kg bw(?)을 먹였을 때 prostate tumor 발생율이 저하된다고 알려져 있다.

본 발명에서 된장의 숙성이 종료된 10주째의 genistein 함량 증가는 기능성 강화 측면에서 매우 바람직한 것으로 판단된다.

자. Sum of total isoflavonoids(glycoside-, malonyl-, acetyl-, aglycon-)의 동태

Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장과 Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장의 숙성기간 동안의 isoflavonoides함량을 분석하여 glycoside-isoflavonoides, malonyl-isoflavonoides, acetyl-isoflavonoides, aglycon-isoflavonoides들을 합산한 결과는 도 28과 같다.

도 28은 된장의 숙성기간이 진행될수록 glycoside-isoflavonoides는 감소되는 경향이 뚜렷하여 숙성 초중기인 0, 2, 4, 6 주째 까지는 비교적 함량이 높으나 8, 10 주째에는 현저하게 감소된 것을 확인 할 수 있었다.

Malonyl-isoflavonoides 함량은 숙성 초기부터 검출된 함량이 낮아 된장의 숙성 초중기인 0, 2, 4, 6주째 이후에는 검출되지 않았다. 또 Acetyl-isoflavonoides 함량은 된장의 숙성 전 기간 동안에 검출되고 있으나 함량이 낮은 수준이며 발효가 진행될수록 감소하는 경향이었다. 그러나 aglycon-isoflavonoides 함량은 발효 초기부터 검출된 함량이 높았는데 된장의 숙성이 진행 될수록 증가하는 경향이 뚜렷하였으며, 특히 Rhizopus oryzae KCCM 35223로 만든 메주(ROM)로 담그어 숙성시킨 된장의 경우 aglycon-isoflavonoides 함량이 높아져 ROM으로 된장을 담그면 생리활성이 좋은 된장을 제조할 수 있음을 확인하였다.

이들의 동태와 함량을 보면 malonyl-isoflavonoides < acetyl-isoflavonoides < glycoside-isoflavonoides < aglycon-isoflavonoides 순으로 함량이 증가됨을 보여주었다.

차. β-Glucan

β-glucan은 대장에서 대장균에 의해 단쇄 지방산으로 분해되는데, 이들의 작용은 간에서 HMG-CoA reductase 활성 및 콜레스테롤 합성능을 억제하고, 특히 butyric acid의 대장내 증가는 인간의 대장암에 대한 보호효과를 가질 수 있고, 혈중 포도당 농도를 조절하는 작용을 하여 glucose 반응을 낮추는 것으로 알려져 있다. 고콜레스테롤과 고혈당의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있어 의약품과 건강식품산업에 잠재적인 활용가치가 큰 것으로 전망되고 있다.

전술한 내용을 근거로 하여 된장 담금에 전분질로서 활용하면 β-glucan에 의한 기능성을 더욱 강화 시킬 수 있을 것으로 생각되어 보리를 볶아서 된장 담금에 사용하고 숙성된 된장 중에 함유된 β-Glucan의 함량을 조사한 결과는 도 29와 같다.

도 29는 Aspergillus oryzae로 만든 콩알메주(AOM)로 담근 Asp. ory.된장, Rhizopus oryzae로 만든 콩알메주(ROM)로 담근 Rhi. ory.된장, AOM과 ROM의 비율을 달리하여 담근 A, B, C 된장을 10 주간 숙성시킨 된장을 추출하여 얻은 β-Glucan의 함량으로 Asp. ory.된장 4.19%, Rhi. ory.된장 4.02%, A된장 3.49%, B된장 3.35%, C된장 2.62%가 함유되어 있어 β-Glucan의 기능성을 부여 할 수 있을 것으로 생각된다.

이상에서 설명된 바와 같은 상기 실험예는 본 발명을 설명하기 위한 일예로 상기 실험예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니며, 당해 기술자라면 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 얼마든지 변형가능한 것이다.

Claims (4)

1. 원료 콩을 정선하여 증류수에 20~24시간 침지 후, 물 배기를 한 다음 증자기에서 1.21 lb/㎠, 121℃에서 30분 가압증자 하는 제1공정;
   상기 증자된 콩을 품온 40℃이하로 냉각한 후, 원료 콩 건조중량 대비 10~20중량부의 볶은 보리쌀가루를 넣어 균일하게 혼합하는 제2공정;
   상기 제2공정의 혼합물을 두개의 군으로 나누어 준비하고 각각의 군의 혼합물에 일정중량비로 미생물로서 아스퍼질러스 오리재 스타터와 리조푸스 오리재 스타터를 각각 접종하여 준비한 후, 발효시켜 아스퍼질러스 오리재 메주(AOM)와 리조푸스 오리재 메주(ROM)를 준비하는 제3공정;
   상기 제3공정의 발효가 끝난 각각의 메주는 파쇄하여 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재 메주를 혼합하고, 그 혼합물 100중량부에 대하여 볶은 보리쌀가루 50~150중량부, 천일염 40~60중량부, 물 100~200중량부를 포함하도록 균일하게 혼합하는 제4공정; 및
   상기 제4공정의 혼합물을 담금하여 옹기에 담고 온도 15~28℃에서 5~10주간 발효시키는 제5공정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장의 제조방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 제3공정에서 사용된 각각의 미생물은 상기 제2공정에서 준비된 혼합물 100중량부에 대하여 각각 3~5중량부를 포함하도록 접종하고, 아스퍼질서스 오리재 접종군은 온도 26±2℃, 습도 85~90%의 환경에서, 리조푸스 오리재 접종군은 온도 24±2℃, 습도 85~90%의 환경에서 각각 3일간 발효시키는 것을 특징으로 하는 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장의 제조방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 제3공정의 메주 혼합물은 아스퍼질러스 오리재 메주와 리조푸스 오리재 메주를 8:2 내지 4:6의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 된장의 제조방법.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항 기재의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 이소플라본과 β-글루칸의 함량이 향상된 기능성 된장.
   

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