KR20140144433A - 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 육질개선용 사료첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 혈액 내 지질을 감소시키고, HMG-CoA 환원효소 활성을 감소시키며, 스테롤과 담즙산의 분변을 통한 배출을 증대시키는 효과가 우수하다. 따라서 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 고지혈증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로서 약리학적 조성물과 같은 의약품은 물론이고, 기능성 사료첨가제 등으로 활용할 수 있어 의약산업 및 축산 사료산업에 응용될 경우 그 가치가 매우 높을 것으로 기대된다. 특히 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 천연물로부터 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating hyperlipidemia comprising fly maggot ethanol extracts}

본 발명은 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 육질개선용 사료첨가제에 관한 것이다.

고지혈증이란 혈액 중의 지방의 양이 정상수치보다 많은 상태를 말한다. 혈액 중에 지방의 양이 지나치게 증가하면 혈관 내벽에 지방 덩어리가 침착되며, 시간이 경과함에 따라 그 지방 덩어리는 동맥의 내경을 좁게 하고 혈류를 차단하는 죽상경화증이라고 불리는 상황을 유발하게 된다. 이로 인해 심장근육에 혈액을 공급하는 동맥인 관상동맥에 협착이 생기면, 심장이 충분한 산소와 영양분을 공급받지 못하여 협심증 또는 심근경색과 같은 관상동맥질환이 발생하게 되고, 뇌로의 혈류가 저하되면 허혈성 뇌졸중이 유발되고, 하지로 가는 혈류가 적어지면 혈액공급의 부족으로 인한 사지의 괴사가 유발된다. 고지혈증은 크게 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 저밀도지단백 콜레스테롤혈증 등으로 분류할 수 있다.

이러한 고지혈증이 원인이 되어 발생되는 심혈관계 질환은 국내 사망원인 1위를 차지하고 있으며, 이는 현대인의 운동부족, 스트레스, 및 외식문화 등으로 인하여 계속 증가하고 있다. 한국인의 평균 혈중 콜레스테롤 농도는 60 년대 (139-166mg/dl), 70 년대 (154-189mg/dl), 80 년대 (175mg/dl), 90 년대 (184mg/dl), 2000 년대(203mg/dl)로 심혈관 질환의 발병율 증가와 유사하게 해마다 증가하고 있는 추세에 있다.

고지혈증 치료를 위한 다양한 약물이 개발되어 왔다. 특히 HMG-CoA 환원효소 억제제는 수 십년 동안 고지질혈증을 치료하는데 사용되어 왔다. 이들 화합물은 인체 내의 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤을 저하시키고, 일부 개체 내의 HDL-콜레스테롤 수치를 상승시키는 효과를 제공하는 것으로 알려져 있다. HMG-CoA가 메발로네이트로 전환되는 단계는 콜레스테롤의 생합성 과정 중 초기 단계이다. 메발로네이트의 생성을 방해하는 HMG-CoA 환원효소의 억제는, HMG-CoA 환원효소 억제제가 이들의 총콜레스테롤 저하 효과 및 LDL-콜레스테롤 저하 효과를 발휘하는 것에 준하여 이루어진다[Grundi S. M., N Engl J Med, 319(1): 24-32, 25-26, 31(1998)].

HMG-CoA 환원효소 억제제의 예로는 메바스타틴(미국특허 제3,983,140호), 메비놀린이라고도 불리는 로바스타틴(미국특허 제4,231,938호), 프라바스타틴(미국특허 제4,346,227호 및 제4,410,629호), 프라바스타틴의 락톤(미국특허 제4,448,979호), 신비놀린이라고 불리는 벨로스타틴 및 심바스타틴(미국특허 제4,448,784호 및 제4,450,171호), 리바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴 및 세리바스타틴을 들 수 있다.

그러나 2001년 횡문근융해증이나 근육병증(myopathy)과 같은 심각한 부작용 발생으로 세리바스타틴이 미국 식약청의 승인을 취소받은 이후 이들 스타틴 제제의 부작용에 대한 관심이 높아졌다. 스타틴 제제의 흔한 부작용으로 위장관계 증상과 근육통, 드문 부작용으로 근육병증, 발진, 말초신경병증, 불면증, 수면이나 집중력과 관련된 증상 등이 있으며, 스타틴과 관련하여 가장 관심을 가지고 있는 부작용으로 약물 투여용량에 따른 간 독성, 근육병증, 소화불량, 복통 등의 증세를 발생시킬 우려가 있는 것으로 알려져 있다. 이는 장기적으로 꾸준히 약물을 투여함으로써 관리하여야 하는 고지혈증의 치료에 있어 문제가 되고 있다.

따라서 장기간 복용 시 독성이나 부작용의 가능성을 현저히 낮출 수 있는 천연물질 소재 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 천연물질을 이용한 기능성 약제학적 소재를 연구하던 중, 파리유충 에탄올 추출물이 혈액 내 지질을 감소시키고, HMG-CoA 환원효소 활성을 감소시키며, 스테롤과 담즙산의 분변을 통한 배출을 증대시키는 효과를 가짐에 따라 지질대사와 관련된 질환, 특히 고지혈증의 예방 또는 치료에 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2011-0126020호

따라서 본 발명의 목적은 장기간 사용에도 인체에 안정하면서 고지혈증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 가축의 육질 내 중성지방 및 콜레스테롤 감소를 통해 효과적으로 육질을 개선시킬 수 있는 사료첨가제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파리유충 에탄올 추출물은 건조된 파리유충을 150℃의 고온의 조건에서 압착하여 1차 지질을 제거하는 단계; 상기 1차 지질이 제거된 파리유충 건조물을 헥산을 이용하여 2차 지질을 제거하여 탈지 유충 잔사를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 탈지 유충 잔사에 에탄올 용매를 가하여 추출물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파리유충 에탄올 추출물은 혈액 내 지질을 감소시키고, HMG-CoA 환원효소 활성을 감소시키며, 스테롤과 담즙산의 분변을 통한 배출을 증대시키는 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파리유충 에탄올 추출물은 SREPB-1a와 SREPB-2 유전자 발현의 하향조절 및 PPAR-α 유전자 발현의 상향조절 기작을 통해 지질대사를 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 육질개선용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파리유충 에탄올 추출물은 가축의 육질 내 중성지방 및 콜레스테롤을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 사료첨가제는 페퍼민트(Peppermint), 로즈마리(Rosemary), 라벤더(Lavender), 레몬밤(Lemon Balm) 및 오레가노(Oregano)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 혈액 내 지질을 감소시키고, HMG-CoA 환원효소 활성을 감소시키며, 스테롤과 담즙산의 분변을 통한 배출을 증대시키는 효과가 우수하다. 따라서 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 고지혈증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로서 약리학적 조성물과 같은 의약품은 물론이고, 기능성 사료첨가제 등으로 활용할 수 있어 의약산업 및 축산 사료산업에 응용될 경우 그 가치가 매우 높을 것으로 기대된다. 특히 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 천연물로부터 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1은 고콜레스테롤 실험모델(흰쥐)에 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 농도별 경구투여에 따른 혈액 내 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 L이-콜레스테롤의 양을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 고콜레스테롤 실험모델(흰쥐)에 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 농도별 경구투여에 따른 HMG-CoA 환원효소 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 고콜레스테롤 실험모델(흰쥐)에 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 농도별 경구투여에 따른 분변으로 분리 배출되는 스테롤 및 담즙산의 양을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(3a: 총 스테롤, 3b: 총 중성스테롤, 3c: 총 콜레스테롤, 3d: 코프로스타놀, 3e: 총 산성스테롤, 3f: 총 담즙산, 3g: 리토콜산, 3h: 디옥시콜산, 3i: 콜산, 3j: 케노데옥시콜산).
도 4는 고콜레스테롤 실험모델(흰쥐)에 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 농도별 경구투여에 따른 SREPB-1α, SREPB-2 및 PPAR-α의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 건조된 파리유충의 지질을 제거한 후 에탄올을 용매로 이용하여 수득한 추출물로서, 자세하게는 건조된 파리유충을 150℃의 고온의 조건에서 압착하여 1차 지질을 제거하는 단계; 상기 1차 지질이 제거된 파리유충 건조물을 헥산을 이용하여 2차 지질을 제거하여 탈지 유충 잔사를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 탈지 유충 잔사에 에탄올 용매를 가하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 혈액 내 지질을 감소시키고, HMG-CoA 환원효소 활성을 감소시키며, 스테롤과 담즙산의 분변을 통한 배출을 증대시키는 효과를 가지므로, 궁극적으로 고지혈증과 같은 지질대사 질환의 예방 또는 치료의 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 하기 실시예<1-3>에서는 고콜레스테롤식이를 섭취한 흰쥐를 대상으로 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 적용에 따른 혈액지질의 변화를 살펴본 결과, 대조군(파리유충 에탄올 추출물 무처리군)과 비교하여 파리유충 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 중성지방, 총 콜레스테롤 및 L이-콜레스테롤이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 반해 HDL-콜레스테롤은 대조군과 비교하여 파리유출 에탄올 추출물 처리구에서 유의하게 증대되는 것을 확인할 수 있었다(표 1 및 도 1 참조).

또한, 하기 실시예<1-4>에서는 고콜레스테롤식이를 섭취한 흰쥐를 대상으로 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 적용에 따른 HMG-CoA 환원효소 활성을 측정한 결과, 대조군과 비교하여 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 HMG-CoA 환원효소 활성이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(표 2 및 도 2 참조).

또한, 하기 실시예<1-5>에서는 고콜레스테롤식이를 섭취한 흰쥐를 대상으로 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물 적용에 따른 흰쥐의 배설물(분변) 내 스테롤과 담즙산 배출량을 분석한 결과, 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물 경구투여 농도에 의존적으로 분변으로 분리 배출되는 중성스테롤, 산성스테롤, 총 콜레스테롤 및 담즙산 배출량이 증대되는 것을 확인할 수 있었다(표 3 및 도 3 참조).

뿐만 아니라, 하기 실시예<1-6>에서는 파리유충 에탄올 추출물이 지질대사와 관련된 유전자 발현에 영향을 미치는지를 살펴보기 위하여, 고콜레스테롤식이를 섭취한 흰쥐를 대상으로 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물 적용에 따른 간 조직에서 SREPBs 및 PPAR-α의 mRNA 수준을 RT-PCR에 의해서 측정하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물을 경구 투여한 실험군에서 SREPB-1a, SREPB-2의 전사 수준이 각각 0.25-0.54 및 0.22-0.59로 상대적으로 낮게 나타난 반면에, PPAR-α의 전사 수준은 상대적으로 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 혈액 내 지질 감소 효과, HMG-CoA 환원효소 활성 감소 효과 및 스테롤과 담즙산의 분변을 통한 배출 증대 효과를 통해 궁극적으로는 고지혈증을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 특히, 이러한 효과는 SREPB-1a와 SREPB-2 유전자 발현의 하향조절 및 PPAR-α 유전자 발현의 상향조절이라는 분자적 기작을 통해 조절된다는 사실을 실험적으로 입증하였다.

그러므로 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 고지혈증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물로서 이러한 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 조성물에 1 내지 300μM의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 질환으로는, 지질대사와 관련된 질환으로서 비만, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간 등이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 고지혈증의 치료에 효과적이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 파리유충 에탄올 추출물 이외에 추가로 고지혈증 치료 효과를 갖는 물질을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 고지혈증 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 고지혈증 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 파리유충 에탄올 추출물을 투여하는 것을 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구투여 방식으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 고지혈증의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 파리유충 에탄올 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 파리유충 에탄올 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 파리유충 에탄올 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 파리유충 에탄올 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 파리유충 에탄올 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한, 본 발명은 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 육질개선용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 파리유충 에탄올 추출물을 가축에 급여하는 경우, 가축의 육질 내 중성지방, 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤을 감소와 동시에, HDL-콜레스테롤을 증진시킬 수 있는바 가축의 육질개선 용도의 기능성 사료첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 육질개선용 사료첨가제는 유효성분으로서 파리유충 에탄올 추출물 이외에 페퍼민트(Peppermint), 로즈마리(Rosemary), 라벤더(Lavender), 레몬밤(Lemon Balm) 및 오레가노(Oregano)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 제조

30℃의 공기순환 건조기에서 건조한 파리유충(2~3-day-old) 500g을 (주)골든킹바이오(Seoul Korea)로부터 제공받았다. 파리유충 건조물은 150℃의 고온의 조건에서, 1,000 PSI로 30분간 압착하여 95% 이상의 지질을 1차 제거한 다음, 상기 1차 지질이 제거된 유충 100 g과 헥산 1리터를 삼각플라스크에 넣고 혼합하였다. shaking incubator에 넣고 서서히 흔들어 주면서 30분간 방치한 다음 거즈 3겹을 이용해서 여과하여 거즈위에 남은 탈지 유충잔사를 얻어서 후드에서 헥산을 완전히 제거하였다. 이 후 상기 수득한 탈지 유충 잔사를 순수한 에탄올과 1:10의 비율로 혼합한 후 환류 냉각장치를 이용해서 파리유충 에탄올 추출물을 수득하였다. 이렇게 수득한 파리유충 에탄올 추출물은 50℃ 수욕 상에서 회전식 감압농축기(Eyela N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Japan)를 사용하여 감압·농축하였으며, 냉장보관하면서 하기 실험의 시료로 사용하였다. 상기의 방법으로부터 5 kDa의 항균 펩타이드를 함유하는 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물 4.30%를 얻었다.

<실시예 2>

본 발명에 따른 파리유충 에탄올 추출물의 혈액지질 감소 효과

<2-1> 실험설계

동물실험은 유럽실험동물 취급면허 기준(European laboratory animal handling license standard (Scot, 1994))에서 제시된 윤리적이고 과학적인 절차에 따라서 수행하였으며 강원대학교 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인을 얻었다.

실험을 위해, 흰쥐(Sprague-Dawley strain) 수컷 40마리(평균체중 200-210g)를 ㈜대한바이오링크에서 구입하여 사용하였으며 일주일 동인 사육환경에 적응시킨 후 4주간 실험처리를 하였다. 이때 4처리구 1반복(케이지 당 10마리)으로 완전 임의배치하였으며, 각 처리구는 대조군(파리유충 에탄올 추출물을 투여하지 않은 고콜레스테롤식이군), 실험군1(체중 100g 당 파리유충 에탄올 추출물 5.0mg 경구투여군), 실험군2(체중 100g 당 파리유충 에탄올 추출물 7.0mg 경구투여군), 실험군3(체중 100g 당 파리유충 에탄올 추출물 9.0mg 경구투여군)로 구분하였다.

실험식이는 AIN-93(Reeves et al. 1993)에 기초한 정제식이를 조제 후 펠렛 처리하였으며, 조단백 및 총에너지 함량을 동일하게 조절하였다. 기초실험식이의 조성은 카제인 20.0%(w/w), 옥수수전분 39.75%, 말토덱스트린 13.20%, 설탕 10.0%, 대두 오일 7.0%, 셀룰로오스 파우더 5.0%, AIN 93G 미네랄 혼합제 3.5%, AIN 93G 비타민 혼합제 1.00%, L-시스틴 0.30%, 콜린바이타트레이트(choline bitartrate) 0.25 % 및 t-부틸하이드로퀴논 0.0014% 로 구성되었다. 고콜레스테롤식이는 hyper-VLDL-cholesterolaemia를 유도하기 위해서 소듐 콜레이트(sodium cholate) 0.25%와 콜레스테롤 0.5% (Sigma Chemical Co,, St, Louis, MO, USA)를 기초실험식이의 조성 가운데 옥수수전분의 양을 낮추어서 첨가 제조하였다. 대조군은 생리식염수 1 mL, 파리유충 에탄올 추출물 투여군은 서로 다른 추출물의 경구투여량(5.0, 7.0, 9.0 mg/100 g 체중)을 생리식염수 1mL에 용해 후 매일 일정한 시간에 직경 1mm의 gavage을 이용해서 경구투여 하였다. 물과 식이에 자유롭게 접근할 수 있는 표준환경 하에서 6주간 유지하였다. 사육실은 온도 21-23℃, 상대습도 55-57%, 12-h light/dark cycle (lights on from 07:00 to 19:00)로 조절하였다.

<2-2> 통계분석

얻어진 결과는 SAS 프로그램을 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)에 의해서 분석하였다. 모든 자료는 평균±표준편차 (n=10 rats/group)로 나타냈으며 그룹간의 차이는 Duncan's multiple range test에 의하여 p<0.05에서 유의성을 검정하였다.

<2-3> 혈액지질 변화

본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 적용에 따른 혈액지질의 변화를 살펴보기 위하여, 실험동물(흰쥐)은 6주 후 희생 10시간 전에 식이공급을 중단하였고 에틸에스테르로 가볍게 마취시킨 후 cardiac puncher에 의해서 전혈 2 mL를 혈청분리튜브 (SST tube, BD, Falcon, SanJose, CA, USA) 내로 주입하였으며, 2,200g 원심분리를 통해 혈청을 분리하였다. 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤의 농도는 상업용으로 조제된 효소 키트(Sigma Co., Louis, MO, USA)로 정량 후 자동분석장치(Hitachi 917, Japan)를 통해 측정하였다.

그 결과 하기 표 1 및 도 1에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 파리유충 에탄올 추출물을 처리구에서 농도 의존적으로 중성지방, 총 콜레스테롤 및 L이-콜레스테롤이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 각 처리구 사이의 통계적인 유의차가 있는 것으로 나타났다(p<0.05). 이에 반해, HDL-콜레스테롤은 대조군과 비교하여 파리유출 에탄올 추출물 처리구에서 141.43% 까지 유의하게 증대되는 것을 확인할 수 있었다(p<0.05).

파리유충 에탄올 추출물의 실험동물(흰쥐)에 처리에 따른 혈액지질 변화(mg/dL)

지질대사지표 (Lipid profiles)	처리구
	대조군	실험군1 (5mg/100g 체중)	실험군2 (7mg/100g 체중)	실험군3 (9mg/100g 체중)
중성지방	123.18±1.25	104.15±0.76	103.31±0.81	98.36±1.17
총 콜레스테롤	90.41±1.43	78.51±1.93	74.04±2.12	73.44±2.17
HDL-콜레스테롤	15.51±0.44	18.85±0.24	19.18±0.33	21.42±0.47
LDL-콜레스테롤	38.17±1.44	30.17±1.38	27.77±1.09	27.69±1.27

<2-4> HMG - CoA 환원효소 활성

본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 적용에 따른 HMG-CoA 환원효소 활성에 미치는 영향을 살펴보았다. 참고로, 3-히드록시-3-메틸글루타릴 CoA(HMG-CoA) 환원효소는 콜레스테롤 생합성에 있어서 대표적인 속도제한 효소로서, 고콜레스테롤증을 치료하고 심장질환의 위험을 낮추기 위한 수많은 연구에 있어서 기본적인 타겟 효소가 되어 왔다.

HMG-CoA 환원효소 활성은 Quain and Haslam (1979)의 방법을 약간 변형해서 측정하였다. Qureshi et al. (1983)의 방법에 따라서 homogenizing buffer를 이용하여 105,000 g에서 3회의 원심분리에 의해서 얻은 마이크로솜 20mg을 1 mM의 EDTA 및 1 mM DTT(dithiothreitol)가 첨가된 인산완충버퍼(100 mM, pH 7.4)에 현탁한 후 균질화하여 20μL(microsomal protein 50~300 μg)의 균질물을 수득하였다. 트리톤 X-100 (0.5%, v/v)을 이용하여 0℃에서 60분 배양 후 10분 동안 8,000g에서 원심분리한 다음 얻어진 상청액을 생화학적 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. NADPH, HMG-CoA 환원효소를 이용하여 제조된 각각의 혼합용액을 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시켰다. 340nm에서 반응 직전과 반응 후의 광학밀도를 Jasco-UVIDEC-610 double beam spectrophotometer (Japan)를 이용하여 측정하였다. NADPH의 endogenous oxidation을 측정하여 그 값을 보정해주었고 HMG-CoA 환원효소 활성은 NADPH의 산화에 의해 감소된 양으로서 표시하였다.

HMG-CoA 환원효소 활성 = pmoles NADPH oxidised/mg microsomal protein/min

그 결과 하기 표 2 및 도 2에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 HMG-CoA 환원효소 활성이 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며, 최대 19.85%까지 유의하게 낮아지는 것으로 나타났다(p<0.05).

HMG-CoA 환원효소 활성(pmole NADPH oxidized/mg microsomal protein/min)

평가항목	처리구
	대조군	실험군1 (5mg/100g 체중)	실험군2 (7mg/100g 체중)	실험군3 (9mg/100g 체중)
HMG-CoA 환원효소 활성	209.44±0.22	180.97±0.27	181.04±0.20	167.87±0.26

<2-5> 스테로이드 배출

배설된 중성스테롤과 담즙산 분석은 Park and Jang (Park BS and Jang A 2008 Dietary β-cyclodextrin reduces the cholesterol levels in meats and backfat of finishing pigs. J. Sci. Food Agric. 88 81318)의 방법에 따라서 진행하였다. 실험종료 5일 동안 배설물(분변)을 수집하였으며 동결 건조기를 (SFDSF12, Samwon Co. Ltd, Busan, Korea) 이용하여 동결·건조하였다.

배설물(분변) 내의 중성스테롤과 담즙산은 분변의 10배 부피의 알칼리성 에탄올(KOH 0.5 moL/L)을 이용하여 70℃에서 2시간 동안 2회 추출하였다. 담즙산은 3-α-hydroxysteroid dehydrogenase (Sigma, USA)에 의한 촉매반응으로 정량하였다. 100μL의 알칼리성 에탄올 용액 내의 중성 스테롤들은 내부표준물질로써 5-α-cholestane (Sigma, USA)을 첨가 후 헥산(500 μL)을 이용하여 3회 추출하였다. TMS 에테르(trimethylsilyl ethers)로 유도된 헥산 추출물은 200 μL로 농축하였으며, 기체 액체 크로마토그래피(Gas-liquid chromatography, Packard model 439, USA) 내로 주입하였다. 캐리어 가스(carrier gas)로써 헬륨을 사용하였고, 스테로이드 분리를 위해서 260℃의 온도를 유지하였다. 분할비율(Split ratio)은 10:1이었으며 스테롤 농도는 내부표준물질의 영역에 대한 상대적인 피크 영역으로부터 계산되었다.

그 결과 하기 표 3 및 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물 처리 농도에 의존적으로 분변으로 분리 배출되는 총 스테롤의 농도가 26.78%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 자세하게는, 파리유충 에탄올 추출물을 처리한 실험군1에서 분리 배출되는 총 중성 스테롤, 총 콜레스테롤, 코프로스타놀 농도가 각각 23.76, 36.25, 5.55%까지 유의하게 증가하였다(p<0.05). 또한, 총 산성 스테롤 및 담즙산의 경우도 파리유충 에탄올 추출물의 처리 농도에 의존적으로 배출량이 증대되는 것으로 나타났다. 자세하게는, 대조군과 비교하여 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물 처리구에서 리토콜산(lithocholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 콜산(cholic acid) 및 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid)의 배출 농도가 각각 17.65, 21.48, 30.10, 107.87% 더욱 증대되는 것을 확인할 수 있었다.

분변을 통한 스테롤 배출량(mg/day/rat)

평가항목	처리구
	대조군	실험군1 (5mg/100g 체중)	실험군2 (7mg/100g 체중)	실험군3 (9mg/100g 체중)
총 중성스테롤	33.17±0.28	40.68±0.32	41.01±1.00	41.05±0.91
총 콜레스테롤	23.21±0.58	30.17±1.09	31.37±0.49	31.62±0.57
코프로스타놀	9.96±0.18	10.51±0.07	9.64±0.06	9.43±0.05
총 산성스테롤	22.84±0.37	26.75±0.53	28.87±0.63	29.96±0.91
총 담즙산	13.64±0.5	15.14±0.78	17.06±0.92	18.19±0.85
리토콜산	4.89±0.09	5.48±0.03	5.55±0.07	5.75±0.07
디옥시콜산	0.33±0.03	0.40±0.02	0.47±0.04	0.48±0.04
콜산	3.09±0.07	3.88±0.09	4.05±0.08	4.02±0.09
케노데옥시콜산	0.89±0.05	1.85±0.06	1.69±0.06	1.52±0.05
총 스테롤	56.01±1.01	67.43±0.58	69.88±1.15	71.01±1.88

<2-6> SREPBs 및 PPAR -α 유전자 발현 수준

본 실험에서는 이러한 파리유충 에탄올 추출물이 지질대사와 관련된 유전자 발현에 영향을 미치는지를 살펴보기 위하여, 간 조직에서 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 SREPBs(sterol regulatory element binding proteins) 및 PPAR-α(Peroxisome proliferator-activated receptors-alpha) mRNA 수준을 RT-PCR에 의해서 측정하였다.

참고로, SREPBs는 콜레스테롤, 지방산, 중성지방 및 인지질의 합성 및 흡수에 포함된 30개 이상의 유전자발현을 직접적으로 활성화하는 중요한 전사활성인자로서, SREBP-1a, SREPB-1c 및 SREPB-2 등이 알려져 있다. 자세하게는, SREBP-1a는 콜레스테롤과 지방산 합성효소 및 LDL 수용체 전사 발현을 상향조절하며, SREPB-1c는 중성지방과 지방산 합성에 포함된 유전자를 선택적으로 활성화하고, SREPB-2는 HMG-CoA 합성효소, HMG-CoA 환원효소, LDL 수용체 전사의 발현을 상향조절 함으로써 콜레스테롤 항상성에 중요한 유전자를 조절하는 것을 알려져 있다. 또한, PPAR-α는 간 조직에서 높은 콜레스테롤과 관련하여 콜레스테롤 대사를 조절하는 유전자로 알려져 있다.

본 실험을 위해 파리유충 에탄올 추출물을 농도별로 경구 투여한 흰쥐를 희생하여 간 조직을 채취한 후 액체질소에 급속 동결해서 -80℃ 보관하였다. 30mg의 간 조직에 Xprep Tissue RNA Mini Kit (Philekorea Technology, PKT)의 용해버퍼를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. RNA 농도는 NanoDrop ND-1000 스펙트로포토미터(USA)를 사용하여 260nm에서 흡광도에 의해서 측정하였으며 추출된 RNA 300-500ng/μL를 얻었다. 추출된 1μg RNA를 cDNA synthesis kit (PKT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 70℃ 5분, 42℃ 30분, 85℃ 5분 배양하여 증폭하였다. RT-PCR은 QuantiMix SYBR Kit (PKT)를 이용하였으며 cDNA를 증류수로써 1/5로 희석한 후 각 프라이머(포워드 및 리버스)를 혼합하여 수행하였다. 유전자 발현은 Eco Real-Timc PCR (Illumina Inc.)에서 제시한 유전자 발현 프로토콜의 지시에 따라서 실행하였다. GAPDH는 항존유전자(house keeping gene)로써 mRNA 수준의 대조군으로써 사용하였다. 하기 표 4에서는 RT-PCR에서 사용된 프라이머 세트를 나타내었다.

프라이머 세트

유전자	프라이머 서열
SREPB-1α	포워드	5'-ATGGACGAGCTGCCCTTCGGTGAGGCGGCT-3'
	리버스	5'-CCTGGCGAT GGCTGTGTGCTG-3'
SREPB-2	포워드	5'-TTTGTCAGCAATCAAGTGGGAGAGTTC-3'
	리버스	5'-GCTGCGTTCTGGTATATCAAAGGCTGC-3'
PPARα	포워드	5'-CCCTCTCTCCAGCTTCCAGCCC-3'
	리버스	5'-CCACAAGCGTCTTCTCAGCCATG-3'
GAPDH	포워드	5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'
	리버스	5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물을 경구 투여한 실험군에서 SREPB-1a, SREPB-2의 전사 수준이 각각 0.25-0.54 및 0.22-0.59로 상대적으로 나타난 반면에, PPAR-α의 전사 수준은 상대적으로 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(p<0.05). 또한, 실험군1과 비교하여 실험군2 및 실험군실3에서 SREPB-1a, SREPB-2 각각의 전사 발현 수준이 0.25-0.29, 0.32-0.37로 더 낮아지는 것으로 나타났으며, 이와 반해 실험군1과 비교하여 실험군2 및 실험군실3에서 PPAR-α mRNA의 전사 발현 수준이 0.16-0.20 유의하게 높게 나타났다(p<0.05).

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 파리유충 에탄올 추출물의 경우 SREPB-1a와 SREPB-2 유전자 발현의 하향조절 및 PPAR-α 유전자 발현의 상향조절을 통해 지질대사를 조절하는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

SREPBs: sterol regulatory element binding proteins
PPAR-α: Peroxisome proliferator-activated receptors-alpha

Claims (7)

1. 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 파리유충 에탄올 추출물은 건조된 파리유충을 150℃의 고온의 조건에서 압착하여 1차 지질을 제거하는 단계; 상기 1차 지질이 제거된 파리유충 건조물을 헥산을 이용하여 2차 지질을 제거하여 탈지 유충 잔사를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 탈지 유충 잔사에 에탄올 용매를 가하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 파리유충 에탄올 추출물은 혈액 내 지질을 감소시키고, HMG-CoA 환원효소 활성을 감소시키며, 스테롤과 담즙산의 분변을 통한 배출을 증대시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 파리유충 에탄올 추출물은 SREPB-1a와 SREPB-2 유전자 발현의 하향조절 및 PPAR-α 유전자 발현의 상향조절 기작을 통해 지질대사를 조절하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
5. 파리유충 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 육질개선용 사료첨가제.
6. 제5항에 있어서,
   상기 파리유충 에탄올 추출물은 가축의 육질 내 중성지방 및 콜레스테롤을 감소시키는 것을 특징으로 하는 육질개선용 사료첨가제.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
   상기 사료첨가제는 페퍼민트(Peppermint), 로즈마리(Rosemary), 라벤더(Lavender), 레몬밤(Lemon Balm) 및 오레가노(Oregano)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 육질개선용 사료첨가제.

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