KR20140133940A

KR20140133940A - 인간 항-cd27 항체, 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20140133940A
Application number: KR20147028682A
Authority: KR
Inventors: 존 첸; 조한 프란스손; 나탈리 퍼소브; 다몬 하멜; 토마스 말리아; 갈리나 오브모로바; 타티아나 오알티; 미카엘 리시진; 미카엘 스컬리; 레이먼드 스위트; 알렉세이 테플야코프; 존 휠러; 주앙 카를로스 알마그로
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2014-11-20
Also published as: WO2013138586A1; ZA201407440B; AU2013232087A1; PE20142242A1; HK1206251A1; BR112014022812A2; US9102737B2; CO7071095A2; AR090356A1; EA030828B1; ZA201500887B; PH12014502011A1; GT201400193A; EA201491700A1; CN104284678A; NZ629697A; TWI576354B; PH12017501908A1; MX363946B; TW201345922A

Abstract

인간 CD27에 대하여 면역특이적인 인간 항체는 CD27의 리간드 CD70으로의 CD27 결합을 차단할 수 있고, 비제한적으로 CD27 세포내 신호전달, T-세포 증식 및 활성화, B-세포 증식 및 분화, 형질모세포 형성 및 항체 반응의 경감, CD70에 의한 종양 세포의 자극, 및 T 및 B-세포로부터의 용해성 매개체의 생성을 포함하는 CD27의 생물활성을 중화시킬 수 있다. 항체는 CD27 활성 관련 질환 및 증상의 진단 또는 치료에 유용하다.

Description

인간 항-CD27 항체, 방법 및 용도{HUMAN ANTI-CD27 ANTIBODIES, METHODS, AND USES}

본 발명은 CD27 단백질에 대한 인간 항체 및 그들의 용도, 더욱 특별히는, 인간 CD27 단백질에 대한 인간 항체 및 염증성 장애에서의 그들의 용도에 관한 것이다.

CD27은 I형 막횡단 단백질이며, 대다수의 T 세포, 자연 살해 세포 및 항체 분비 혈장 및 메모리 (memory) B-세포 상에 표면 항원으로서 발현되는 TNF 수용체 상과 (TNFSF27)의 구성원이다. CD70은 종양 괴사 인자 리간드 상과 구성원 7 (TNFSF7)로도 지칭되는 사이토카인이며, CD27에 대한 동족 리간드이다. TNFSF 리간드-수용체 상호작용은 T-의존성 B-세포 분화를 조절하고 (문헌 [Jacquot S. 2000 Immunol Res. 21 (1):23-30]), 상이한 세포에서 세포자멸 세포사를 유도할 수 있다.

CD27:CD70 라이게이션에 의해 정규 및 비정규 NF-kβ 신호전달 경로의 활성화가 야기되며, 이는 차례로 B-세포 및 T-세포 증식, 형질 세포 분화 및 이후의 항체 분비를 자극한다 (문헌 [Yamamoto, H. 1998 J Immunol. 161 (9): 4753-9]). 또한, OX40, 4-1BB를 사용한 CD27 공동-자극은 활성화 T 세포의 생존을 증진시키며 (문헌 [Croft, M. 2003 Cytokine Growth Factor Rev. 14 (3-4): 265-73]), 이에 의해 다수의 이펙터 (effector) 및 메모리 T 세포를 조절하고, 사이토카인, 예를 들어, IL-4 및 IFN감마의 생성을 증진시키거나, 다른 사이토카인, 예를 들어, IL2 및 IL-12의 작용에 대한 T-세포 반응을 조절함으로써 직접적으로 T 세포 기능을 조절한다.

인간 및 동물 양자 모두에서의 연구에 의해, 전신 홍반성 낭창 (SLE) (문헌 [Doerner T Lupus 2004 13 (5):283-9]), 류마티스성 관절염 (문헌 [Tak, PP et al. 1996 clin Immunol Immunopathol 80 (2): 129-38]) 및 다발성 경화증 (문헌 [Hintzen RQ et al.1991 J Neuroimmunol 35 (1-3):211-7])을 포함하는 다양한 면역 관련 질환에서의 CD27:CD70 경로의 중요한 역할이 제시되었다. 반면, CD70은 악성 B 세포 상에서 다양한 정도로 발현되는 것으로 보고되었으며, CD70:CD27 복합체는 항종양 면역성을 활성화시키고, 종양 성장을 감소시킴으로써 항종양 반응을 매개할 수 있다 (문헌 [Borst J, Hendriks J and Xiao Y. 2005. Curr Opin Immunol. 17 (3):275-81]). 또한, CD27은 감염 부위에서 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 축적을 조절할 수 있다 (문헌 [Hendricks et al. 2000 Nature Immunol 1, 433-440]).

CD70은 정상 비-조혈 세포 상에서 발현되지 않는다. CD70 발현은 일시적으로 항원-활성화 T 및 B 세포에 제한되는 것으로 보이며, 그의 발현은 항원 자극이 중단되는 경우에 하향 조절된다. 동물 모델로부터의 증거에 의해, CD70이 면역학적 장애, 예를 들어, 류마티스성 관절염 (문헌 [Brugnoni et al., 1997 Immunol. Lett. 55:99-104]), 건선성 관절염 (문헌 [Brugnoni et al., 1997, Immunol. Lett. 55:99-104]) 및 낭창 (문헌 [Oelke et al., 2004, Arthritis Rheum. 50:1850-60])의 원인이 될 수 있는 것으로 제안되었다. CD70은 또한, 염증성 반응에서의 그의 잠재적 역할에 더하여, B 세포 림프종, 호지킨 (Hodgkin's) 및 리드-스텐버그 (Reed-Sternberg) 세포, 신경 기원의 악성 세포 및 다수의 암종을 포함하는 다양한 형질전환된 세포 상에서 발현된다.

W02008/051424호 (Univ. South Hampton)에 기재된 효능제 CD27 결합 항체는 T-세포 면역성을 증진시키는데 유용한 것으로 보고되어 있으며, 이러한 항체는 CD70에 의해 그들이 영향을 받지 않게 (억제되지 않게) 하는 결합 에피토프를 갖는다.

CD27 및/또는 CD70의 변경을 수반하는 설치류에서의 연구에 의해, 이러한 수용체 리간드 상호작용의 잠재적으로 중요한 역할이 증명되었지만, 인간 CD27에 특이적인 인간 항체, 및 특히 CD70의 부재 하에 CD27-발현 세포에 바람직하지 않은 효능제 영향을 발휘하지 않고, CD27-발현 세포에 임상적으로 유용한 세포독성, 세포증식 억제 (cytostatic) 또는 면역조절 효과를 발휘할 수 있는 다른 CD27:CD70 상호작용 차단제를 제공할 필요가 있다. 이러한 화합물은 CD27-발현 세포에 의해 매개되는 면역 장애 또는 신생 세포 (neoplastic cell)의 발생의 조절에 있어 유용한 치료제일 수 있다.

본 발명은 숙주 대상체 내의 세포, 조직 또는 기관에서 CD27-CD70 상호작용과 관련된 활성을 차단할 수 있는 인간 CD27 결합, 모노클로널 항체를 제공한다. 숙주 세포에서의 발현을 위한 핵산에 의해 암호화된 예시적인 CD27 결합 모노클로널 항체의 아미노산 서열이 제공된다. 또한, 본 발명의 CD27 모노클로널 항체는 본 발명의 항체가 결합되는 경우에 CD70-형 리간드 라이게이션 유도 신호전달 및 다운스트림 생물학적 활성이 방지되는, CD27의 세포외 도메인 상의 적어도 3개의 비중첩 에피토프를 한정한다.

본 발명의 다른 태양은 CD27 단백질의 위치 21 내지 191의 잔기에 의해 형성되는 CD27 단백질 에피토프와 반응성인 분리된 항-CD27 항체이다.

본 발명의 다른 태양은 서열 번호 76, 78, 80, 102-126, 128-136 및 145-147에 나타낸 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호 77, 79, 81-101, 127, 137-144 및 148에 나타낸 서열로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열 (그들 서열의 변이체, 예를 들어, 보존적 치환 포함)을 갖는 분리된 항체이다.

본 발명의 추가의 태양은 서열 번호 1-75 및 151-158에 나타낸 서열로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 CDR 서열 (그들 서열의 변이체, 예를 들어, 보존적 치환 포함)을 갖는 분리된 항체이다.

본 발명의 다른 태양은 본 발명의 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.

다른 태양에서, 본 발명은 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2177 및/또는 C2186 또는 그로부터 생성된 인간 항체가 결합하는 단백질 상의 영역에 의해 형성되는 공통의 에피토프에 결합하거나, CD27 단백질로의 결합을 위하여 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2177 및/또는 C2186 또는 그로부터 생성된 인간 항체와 경쟁하는 항체에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2191 또는 그로부터 생성된 인간 항체가 결합하는 단백질 상의 영역에 의해 형성되는 CD27의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하거나, CD27 단백질로의 결합을 위하여 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2191 또는 그로부터 생성된 인간 항체와 경쟁하는 항체에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2192 또는 그로부터 생성된 인간 항체가 결합하는 단백질 상의 영역에 의해 형성되는 CD27의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하거나, CD27 단백질로의 결합을 위하여 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2192 또는 그로부터 생성된 인간 항체와 경쟁하는 항체에 관한 것이다. 다른 태양에서, 본 발명은 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2177, C2186, C2191 및 C2192 중 하나 이상, 또는 그로부터 생성되는 인간 항체에 의해 나타나는 다른 기능적 결합 특징, 예를 들어, CD70 양성 세포로의 CD27의 결합의 억제를 갖는 표 30 내지 39에 기재된 항체 C2177, C2186, C2191 및 C2192 중 하나 이상, 또는 그로부터 생성되는 인간 항체로부터 유래된 항체 또는 그의 단편을 포함한다.

따라서, 본 발명의 일 태양은 조작된 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 조정된) 중쇄 및 경쇄를 포함하는 조작된 항체에 관한 것이며, 여기서,

(1) 조작된 중쇄 가변 영역은 마우스 항체 C2177, C2191, C2192 및 C2186 중쇄 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 임의로, 하나 이상의 인간 프레임워크 잔기 치환을 갖는 인간 수용자 항체 중쇄 유래의 프레임워크를 포함하거나 그로부터 유래되며,

(2) 조작된 경쇄 가변 영역은 마우스 항체 C2177, C2191, C2192 및 C2186 경쇄 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역 및 임의로, 하나 이상의 인간 프레임워크 잔기 치환을 갖는 인간 수용자 항체 경쇄 유래의 프레임워크를 포함하고,

(3) 조작된 항체는 인간 CD27에 특이적으로 결합하고, CD70과 그의 상호작용을 방해한다.

추가의 실시형태에서, 조작된 항체는 하나 이상의 치환 또는 결실로 추가로 조작된 하나 이상의 CDR, 예를 들어, 항체 C2177, C2191, C2192 및/또는 C2186의 하나 이상의 CDR과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 것들로 이루어질 수 있다.

다른 실시형태는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 항체, 그의 부분 또는 본 발명의 항체 또는 그의 부분의 혼합물을 CD27 생물활성과 관련된 병태 (pathological condition)의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함에 의한 CD27 생물활성과 관련된 병태의 치료 또는 예방에 관한 것이다.

추가의 실시형태에서, 본 발명은 백신의 구성성분으로서 항원 에피토프를 포함한다. 서열 번호 1 잔기 21 내지 191 중 일부 또는 전부의 하위단편 또는 3차원 유사체, 또는 그의 보존적 변화를 포함하는 폴리펩티드 또는 상술된 폴리펩티드 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 항체에 의해 인식된다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 CD27 생물활성과 관련된 병태를 방지하거나 예방할 수 있는 CD27에 대한 항체의 생성을 유도하기 위해 숙주를 능동 면역화시키는데 유용하다.

또한, 본 발명은 치료적 또는 예방적 유효량의 항체 또는 그의 부분을 투여함에 의하여 CD27 생물활성과 관련된 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항체의 생성, 정제, 제형화 및 포장 방법에 관한 것이다.

<도 1>
도 1은 T-세포 증식에 대한 C2177 항체의 영향을 보여주는 그래프이다.
<도 2>
도 2는 CD27:C2177:C2191 삼원 복합체의 결정 구조를 보여준다. CD27 단편의 N- 및 C-말단이 표지되어 있다. Fab의 중쇄는 그들의 경쇄보다 더 진하게 나타나 있다.
<도 3>
도 3은 CD27 단백질-C2177 항체 접촉의 다이어그램이며, CD27 단백질 잔기 (에피토프)는 원 안에, 그리고 C2177 항체 잔기 (파라토프)는 사각형 안에 나타내었다.
<도 4>
도 4는 CD27 단백질-C2191 항체 접촉의 다이어그램이며, CD27 단백질 잔기 (에피토프)는 원 안에, 그리고 C2191 항체 잔기 (파라토프)는 사각형 안에 나타내었다.

약어

CDR - 상보성 결정 영역; CFSE - 카르복시플루오레세인 다이아세테이트, 석신이미딜 에스테르; ECD - 세포외 도메인; FR - 프레임워크; H - 중쇄; GvHD - 이식편대숙주병; L - 경쇄; IFN - 인터페론 (g, 감마); Ig - 면역글로불린; Mab - 모노클로널 항체; MMP - 매트릭스 메탈로프로테이나제; PBMC - 말초 혈액 단핵 세포; VL - 가변 경쇄; VH - 가변 중쇄;

정의

본 명세서에서 사용되는 "항체"는 전 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 또는 단쇄를 포함한다. 따라서, 항체는 면역글로불린 분자의 적어도 한 부분, 예컨대 비제한적으로 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역 또는 그의 임의의 부분 또는 본 발명의 항체 내로 혼입될 수 있는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드 함유 분자를 포함한다. 용어 "항체"는 추가로 항체, 그의 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 하며 이는 항체 모방체 (mimetic)를 포함하거나 단쇄 항체 및 단일 도메인 항체 및 그의 단편을 포함하는, 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능성 단편은 사전선택된 표적에 대한 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F (ab')2 단편, 즉, 힌지 (hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일의 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 이들이 단일 단백질 쇄로서 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 형성하여 1가 분자 (단쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (I 988) Science 242:423-426] 및 문헌 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 또한, 이러한 단쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이 단편은 무손상 (intact) 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝된다. 역으로, scFv 구축물의 라이브러리를 사용하여 항원 결합 능력에 대하여 스크리닝한 다음, 통상의 기술을 사용하여 인간 생식계열 유전자 서열을 암호화하는 다른 DNA로 스플라이싱할 수 있다. 이러한 라이브러리의 일 예는 "HuCAL: 인간 조합 항체 라이브러리 (Human Combinatorial Antibody Library)" (문헌 [Knappik, A. et al. J Mol Biol (2000) 296 (1):57-86])이다.

용어 "CDR"은 항원 결합에 참여하거나 그의 원인이 되는 항체의 상보성 결정 영역 또는 초가변 영역 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 인간 IgG 아형의 초가변 영역 또는 CDR은 카바트 (Kabat) 등 (문헌 [1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.])에 의해 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 문헌 [(Chothia et al., J. Mol. 196: 901-917 (1987))]에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 내의 초가변 루프로부터의 잔기 (즉, 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3)), 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 또는 52-57의 현재 H2 초티아 (Chothia) 정의 및 96-101 (H3)로부터의 잔기를 포함한다.

프레임워크 또는 FR1-4 잔기는 초가변 영역 이외의, 그리고 그를 포괄하는 가변 도메인 잔기이다. 보다 최근에, 보편적인 넘버링 시스템, 인터내셔널 이뮤노지네틱스 인포메이션 시스템 (international ImMunoGeneTics information system)® (IMGT) (문헌 [LaFranc, et al. 2005. Nucl Acids Res. 33:D593-D597])이 개발되고 널리 채용되었다.

본 명세서에서, CDR은 순차적인 넘버링에 의한 경쇄 또는 중쇄 내의 위치 및 아미노산 서열 둘 모두의 면으로 언급된다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 내의 CDR의 "위치"가 종들 간에 보존되고 루프로 지칭되는 구조에 존재함에 따라, 구조 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용함으로써 CDR 및 프레임워크 잔기가 용이하게 확인된다. 이러한 정보는 하나의 종의 면역글로불린으로부터의 CDR 잔기를, 전형적으로 인간 항체로부터의 수용자 프레임워크 내로 그래프팅 (grafting) 또는 대체하는데 사용된다.

용어 "CD27"은 인간 TNF 수용체 상과 (TNFSF27), 인간 CD27L 수용체, MGC20393, S152, T14, T-세포 활성화 항원 CD27로도 지칭되는 인간 유전자 939 (CD27 유전자)의 생성물을 지칭하며, CD27의 변이체, 아이소형 및 종 상동체 모두를 포함한다. 발현된 인간 CD27 (NCBI 수탁 번호 NP_001233)은 N-말단에 20개 아미노산 분비 신호를 갖는 260개 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. 따라서, 본 발명의 항체는 특정 경우에, 인간 이외의 종 유래의 CD27과 상호작용할 수 있다. 다른 경우에, 항체는 인간 CD27에 대하여 완전히 특이적이고, 종 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다. CD27 생물학적 활성이란, 하나 이상의 리간드, 특히, CD70 폴리펩티드 (TNFSF7, NP_001243) 또는 기타 리간드, 예를 들어, SIVA에 의한 CD27의 활성화의 결과로서 CD27 수용체 결합 및/또는 활성화로부터 야기되는 임의의 다운스트림 활성을 의미한다. CD27은 NF-κ--β 및 MAPK8/JNK의 활성화를 야기하는 신호를 전달한다. 어댑터 (adaptor) 단백질 TRAF2 및 TRAF5는 이러한 수용체의 신호전달 과정을 매개하는 것으로 나타났다. 또한, CD27 생물학적 활성은 그들 자체가 생물학적 활성을 나타내는 리간드로의, CD27의 특정 절단 형태 또는 CD27의 단편의 결합으로부터 야기될 수 있으며, 예를 들어, 전장 단백질의 잔기 약 21 내지 191을 포함하는 폴리펩티드는 CD70에 결합할 수 있다. CD27 항원 세포질 테일 (tail), 잔기 213-260은 SIVA 단백질 (세포자멸사-유도 인자: CD27BP로도 공지됨; SIVA1, Siva-1, NP_006418 (175 aa); 및 Siva-2, SIVA2, NP_068355 (110 aa))의 N-말단에 결합한다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화 (grouping)로 이루어지며, 통상 특이적인 3차원 구조적 특징뿐 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 입체형태 및 비입체형태 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 소실되나 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.

"인간화" (리쉐이핑 (reshaping) 또는 CDR 그래프팅이라고도 지칭됨) 또는 "조작"은 이종 공급원 (통상 설치류) 유래의 모노클로널 항체 (mAb)의 면역원성을 저하시키고, 친화성 또는 이펙터 기능 (ADCC, 보체 활성화, C1q 결합)을 향상시키기 위한 확립된 기술이다. 조작된 mAb는 분자 생물학 기술을 사용하여, 파지 디스플레이 무작위 서열을 사용하여 생성되거나, 드 노보 (de novo) 합성될 수 있다. 예를 들어, 비인간 종 유래의 CDR 영역이 혼입된 인간화 항체를 구축하기 위하여, 설계는 변이, 예를 들어, CDR의 잔기 내의 보존적 아미노산 치환, 및 비인간 mAb로부터 인간 프레임워크 영역으로의 잔기의 복귀 치환 (back substitution) (복귀 돌연변이 (backmutation))을 포함할 수 있다. 위치는 서열 비교 방법, 공통 서열 분석 또는 가변 영역의 3차원 구조의 구조 분석에 의해 식별되거나 확인될 수 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 조사하여, 후보 면역글로불린 서열이 기능할 때 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 그의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 또는 단순한 서열 정렬 알고리즘 (예를 들어, 클러스탈 (Clustal) W)에 의해, FR (프레임워크) 잔기가 이러한 공개 이용가능한 데이터베이스, 예를 들어, VBASE 또는 Kabat에서 관찰되는 공지된 항체 서열 및 표적 항원 (들)에 대한 요망되는 항체 특징, 예를 들어, 친화성이 달성되도록 최적화된 공통 서열로부터 선택될 수 있다. 항체 구조에 대한 공지된 파라미터의 데이터세트가 증가함에 따라, 이들 기술이 정교화되고 개선된다. 다른 인간화 방법은 인간 mAb에서 관찰되는 가장 통상적인 잔기를 갖는 설치류 서열의 표면 잔기만을 변형시키는 것으로, "리서페이싱" 또는 "버니어링 (veneering)"으로 명명되었다. 다수의 인간 및 비인간 Ig 서열 둘 모두가 이제 공지되어 있으며, 자유롭게 이용가능하고, 당업자에 의해 이용되며, 예를 들어, 명칭 IMGT로 관찰되는 르프랑 (LeFranc) 등; 미국 국립 생물 센터 (U.S. National Center for Biologics (NCBI))에 의해 관리되는 웹사이트; 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)]에 의해 개발된 데이터베이스 및 도구는 또한 이제 크게 확대되고, 온라인으로 이용가능하며, 각각은 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 조작은 공지된 임의의 방법 또는 인간 면역글로불린 서열 정보를 사용하여 개발된 것들을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 내용이 본 명세서에 참고로 포함되는 윈터 (Winter)의 미국 특허 제6982361호 및 보우디쉬 (Bowdish) 등의 WO03/025019호에 교시되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 K_D는 해리 상수, 구체적으로, 소정의 항원에 대한 항체 K_D를 지칭하며, 이는 특정 표적에 대한 항체의 친화성의 척도이다. 고 친화성 항체는 K_D가 소정의 항원에 대하여 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-9 M 이하, 더더욱 바람직하게는 10^-10 M 이하이다. K_D의 역수는 회합 상수인 K_A이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "k_dis" 또는 "k₂" 또는 k"_d"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하고자 한다. "K_D"는 회합 속도 (k₁) 또는 "결합-속도 (on-rate) (k_on)"에 대한 "분리-속도 (off-rate) (k_off)"로도 불리는 해리 속도 (k₂)의 비이다. 따라서, K_D는 k₂/k₁ 또는 k_off/k_on과 같으며, 몰 농도 (M)로 표현된다. 결과적으로, K_D가 작을수록 결합이 더 강해진다. 따라서, 10^-6M (또는 1 μM)의 K_D는 10^-9 M (또는 1 nM)과 비교하여 약한 결합을 나타낸다. 이들 값은 표면 플라스몬 공명 및/또는 당업계에 공지되어 있는 키넥사 (Kinexa) 방법을 사용하여 계산될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모노클로널 항체" 또는 "모노클로널 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로널 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 또한, 모든 항체가 (a) 동물로부터 분리된 항체, 또는 항체 분비 동물 세포 및 융합 파트너의 융합으로부터 제조되는 하이브리도마 (hybridoma), (b) 예를 들어, 트랜스펙토마 (transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 또는 다른 종 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 분리된 항체와 같이 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나, 생성되거나, 분리됨에 따라, 상기 용어는 "재조합 항체" 및 "재조합 모노클로널 항체"를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나, 인간 CD27의 에피토프, 아이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 예를 들어, 다른 종 유래의 다른 관련 항원 (예를 들어, CD27 종 상동체)에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가, 분리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 사실상 없을 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상이한 특이성을 갖는 "분리된" 모노클로널 항체의 조합은 잘 정의되어 있는 조성으로 조합된다.

본 명세서에서 사용되는 "특이적인 결합", "면역특이적 결합" 및 "면역특이적으로 결합한다"는 소정의 항원에 대한 항체 결합을 말한다. 전형적으로, 항체는 10^-7 M 이하의 해리 상수 (K_D)로 결합하며, 소정의 항원 이외의 비특이적인 항원 (예를 들어, BSA, 카세인, 또는 임의의 다른 특정 폴리펩티드)으로의 결합에 대한 그의 K_D보다 적어도 2배 더 작은 K_D로 소정의 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본 명세서에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 "고도로 특이적인" 결합은 특정 표적 에피토프에 대한 항체의 상대 K_D가 다른 리간드에 대한 항체의 결합에 대한 K_D보다 적어도 10배 더 작은 것을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 분류 (예를 들어, IgM 또는 IgG)를 지칭한다. 일부 항체 분류는 중쇄 불변 영역에 의해서도 암호화되며 불변 영역 도메인 내의 특정 잔기에서 올리고당에 의해 추가로 수식되는 하위분류를 추가로 포함하는데 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 이는 추가로 생물학적 기능을 추가로 부여한다. 예를 들어, 인간 항체 아이소타입에서 IgG1, IgG3과, 더 적은 정도로 IgG2는 쥣과 IgG2a 항체가 그러한 바와 같이 이펙터 기능을 나타낸다.

"이펙터" 기능 또는 "이펙터 양성"은 항체가 수용체 또는 기타 혈액 구성성분, 예컨대 보체와 상호작용하여 예를 들어 대식세포의 동원과 항체의 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 세포의 파괴로 이어지는 사건을 야기할 수 있는 항원 특이적 결합 도메인과 별개의 도메인을 포함하는 것을 의미한다. 항체는 이펙터 분자의 결합에 의해 매개되는 몇몇 이펙터 기능을 가진다. 예를 들어, 보체의 C1 구성성분의 항체로의 결합은 보체 시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 (opsonisation) 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 염증 반응을 자극하며 또한 자가면역 과민성에 연루될 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위가 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 비롯한 상이한 항체 분류에 대해 특이적인 많은 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체로의 항체의 결합은, 항체-코팅 입자의 포식 (engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해 (항체-의존성 세포-매개 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 또는 ADCC로 불림), 염증성 매개체의 분비, 태반 이동 및 면역글로불린 생성의 조절을 비롯한 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.

1. 본 발명의 항체의 조성물

본 발명의 CD27-중화 항체는 시험관 내에서, 동소에서, 및/또는 생체 내에서 적어도 하나의 CD27 활성 또는 CD27 결합을 억제하거나, 차단하거나 간섭하는 항체이며, 이는 CD27 활성 또는 리간드 결합을 증진시키지 않거나, 자극하지 않거나, 유도하지 않거나 또는 효능화 (agonize)시키지 않거나, 항체 결합은 숙주 세포 내에서의 신호 전달과 같은 CD27-리간드 라이게이션, 특히 CD27과 CD70 상호작용의 다운스트림 효과를 모방하지 않는다. 또한, 적절한 CD27-중화 항체, 특정 부분 또는 변이체는 임의로 적어도 하나의 CD27 활성 또는 기능, 예를 들어, 비제한적으로, RNA, DNA 또는 단백질 합성, 단백질 분비, T-세포 활성화, B-세포 증식 또는 분화, 항체 분비, CD27 수용체 신호전달, CD27 절단, CD27-리간드 결합, CD27 또는 CD70 유도, 합성 또는 분비에 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 CD27-중화 항체의 CD27:CD70 공동자극 경로 차단 활성과 관련하여, 상승된 T- 또는 B-세포 이펙터 기능이 있는 자가면역 장애의 치료가 유익할 수 있다.

본 발명은 CD70에 의한 CD27 활성화를 억제할 수 있고, CD70 자극제의 부재 하에 CD27을 자가 활성화시킬 수 없는 항-인간 CD27 모노클로널 항체의 발견을 기반으로 한다. 이러한 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마 및 트랜스펙토마를 생성하였다. NF-kβ 리포터 유전자 검정을 사용하여, CD27 발현 숙주 세포의 CD70-매개의 NF-kβ 리포터 활성화를 억제할 수 있는 몇몇 후보 항체를 확인하였다. 두번째로, 항체는 CD70 자극제의 부재 하에 CD27 결합 루시퍼라제 리포터가 트랜스펙션된 세포와 함께 인큐베이션되는 경우, 용량 의존적 효능제 활성을 유도할 수 없는 것으로 특성화되었다. 세번째로, 항체가 CD70-의존성 인간 나이브 (

) CD4 T-세포 증식을 용량 의존적으로 억제하는 것이 입증되었다. 네번째로, 생성된 CD27-중화 항체는 용량 의존적 방식으로, 인간 일차 B-세포로부터의 형질 세포 생성의 CD70-매개의 자극을 감소시킬 수 있다. 다섯번째로, 시험된 항-CD27 항체를 사용하여 유의미한 용량-의존적 효능제 활성이 일차 T- 또는 B-세포에서 관찰되지 않았다.

본 발명의 항체는 CD27:CD70 라이게이션을 방해할 수 있고, T-세포 이펙터 기능 및 세포 배양에서 형질 세포로의 B-세포 분화 둘 모두를 억제할 수 있으며, 이에 따라, 비제한적으로 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 크론병, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 CD27 발현 세포 개체군의 비정상적인 기능 또는 활성화와 관련된 기타 증후군, 병증, 질환 또는 장애를 포함하는 면역 매개의 질환의 치료에 유리할 수 있다. 본 명세서에 기재된 CD27-결합 항체는 인간 CD27의 세포외 도메인 상의 적어도 3개의 별개의 영역을 인식하며, 이는 항체 또는 유사한 기능 차단 능력을 갖는 다른 화합물의 표적화에 적절한 CD27 상의 다수의 부위의 추가의 발견을 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 아미노산 서열로서 제공된 항체 결합 도메인의 발현 및 정제에 의해, CD27-중화 활성을 나타내는 신규한 분자의 선택 수단일 수 있는 도구가 추가로 제공된다.

일 실시형태에서, 항-인간 CD27 항체는 서열 번호 76 내지 144에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 (VL) 또는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는 결합 영역을 가지며, 이러한 항체 또는 그의 결합 부분은 CD27에 면역특이적으로 결합한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 CD27 단백질에 결합하며, 또한, 항체는 본 발명의 항체의 특정 기능적 특성, 예를 들어,

고정화 인간 CD27로의 결합;

CD70을 발현하는 세포로의 인간 용해성 CD27 결합의 억제;

0.5 ug/ml 미만의 IC50에서의 NF-kB 리포터 유전자 검정에 의해 측정되는 인간 CD70 매개의 CD27 신호전달의 억제;

나이브 T-세포의 CD70-매개의 증식의 억제;

일차 인간 B-세포로부터의 CD70 매개의 형질모세포 형성의 억제;

T 및 B 일차 세포 또는 세포주로부터의 인간 CD70-매개의 용해성 매개체 분비의 억제;

100 nM (10 ^-7 M) 미만의 K_d로 인간 CD27에 결합;

CD70 자극제의 부재 하의 CD27 신호전달의 최소의 활성화; 및

서열 번호 76 내지 144의 가변 영역 서열 중 하나 이상을 갖는 Mab가 결합하고, 서열 번호 76 내지 144의 가변 영역 서열 중 하나 이상을 갖는 확인된 Mab와 결합을 위해 경쟁하는 인간 CD27 세포외 도메인 상의 에피토프로의 결합을 갖는다.

항체 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인이 특히 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화성에서 중요한 역할을 수행하는 것이 당업계에 널리 공지되어 있기 때문에, 본 명세서에 개시된 본 발명의 재조합 항체는 바람직하게는 서열 번호 1 내지 75의 중쇄 및 경쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 그러한 항체는 통상적인 기술을 사용하여 항체의 다양한 부분 (예를 들어, CDR, 프레임워크)을 함께 화학적으로 연결하거나, 통상의 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 항체를 암호화하는 (즉, 하나 이상의) 핵산 분자를 제조하고 발현시키거나 임의의 다른 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 인간 항체는 서열 번호 1 내지 75의 중쇄 및 경쇄 CDR 중 하나 이상의 서열을 갖는다. 이들 CDR 서열에 더하여, 당업자는 정확한 CDR 서열로부터의 일부 일탈이 가능하거나 바람직할 수 있으며, 여전히 CD27에 결합하는 항체의 능력을 유지함을 인식할 것이다 (예를 들어, 보존적 치환). 따라서, 다른 실시형태에서, 인간 항체는 서열 번호 1 내지 75에 열거된 CDR과 예를 들어, 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 이루어질 수 있다.

다른 실시형태에서, CD27 단백질의 잔기 21 내지 191 중 5개 내지 전부, 또는 그에 대한 핵산 암호화 서열을 포함하는 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프를 사용하여, 대상체를 면역화시켜, CD27의 생성과 관련된 질환 또는 질환의 증후를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키는 목적을 위해 숙주에서 직접 본 발명의 항체를 생성할 수 있다.

2. CD27-중화 항체의 생성

개시되고 기재된 항체에 의해 본 명세서에 예시된 바와 같은 요망되는 생물활성 스펙트럼을 나타내는 CD27-중화 항체는 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술 (하이브리도마 방법)을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 마카크 원숭이 (macaque monkey)는 본 명세서에 설명된 바와 같이 면역화되어, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 그를 생성할 수 있는 림프구가 유도된다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).

또한, CD27-중화 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 및/또는 당업계에 공지된 바와 같이, 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 비-인간 영장류 등)의 면역화에 의해 임의로 생성될 수 있다. 인간 항-CD27 항체를 생성하는 세포는 상기 동물로부터 분리되고, 본 명세서에 기재된 방법과 같은 적절한 방법을 사용하여 무한증식될 수 있다. 대안적으로, 항체 암호화 서열은 적절한 벡터 내로 클로닝시키고, 도입하고, 본 명세서에 교시된 방법 및 당업계에 공지된 방법에 의해 항체의 발현 및 분리를 위하여 숙주 세포를 트랜스펙션시키기 위해 사용될 수 있다.

인간 면역글로불린 (Ig) 유전자좌를 그의 생식계열 구조 내에 지니는 트랜스제닉 마우스의 사용은 정상적인 인간 면역계가 용인하는 인간 자가 항원을 비롯한 다양한 표적에 대하여 유도된 고 친화성 완전 인간 모노클로널 항체의 분리를 제공한다 (예를 들어, 론버그, 엔. (Lonberg, N.) 등의 미국 특허 제5569825호, 미국 특허 제6300129호 및 문헌 [1994, Nature 368:856-9]; 문헌 [Green, L. et al., 1994, Nature Genet. 7:13-21]; 문헌 [Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med. 188:483-95]; 문헌 [Lonberg, N and Huszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93]; 쿠체르라파티 (Kucherlapati) 등의 미국 특허 제6713610호; 문헌 [Bruggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326]; 문헌 [Fishwild, D. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851]; 문헌 [Mendez, M. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-156]; 문헌 [Green, L., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23]; 문헌 [Yang, X. et al., 1999, Cancer Res. 59:1236-1243]; 문헌 [

, M. and Taussig, M J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997]; 토미주카 (Tomizuka) 등의 WO02043478호). 상기 생쥐에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실되어, 내인성 유전자에 의해 암호화되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거할 수 있다. 게다가, 아브제닉스, 인코포레이티드 (Abgenix, Inc.) (미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 메다렉스 (Medarex) (미국 캘리포니아주 새너제이 소재)와 같은 회사를 고용하여, 상기에 기재된 기술을 사용하여 선택 항원에 대하여 유도된 인간 항체를 제공할 수 있다.

다른 실시형태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고, 라이브러리는 예를 들어 단쇄 항체 (scFv)로서, Fab로서 또는 쌍을 형성하거나 쌍을 형성하지 않는 항체 가변 영역을 나타내는 일부 다른 구축물로서 인간 항체 결합 도메인을 발현한다 (문헌 [Vaughan et lo al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]; 문헌 [Sheets et al. PITAS (USA) 95:6157-6162 (1998)]; 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; 문헌 [Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). 또한, 본 발명의 인간 모노클로널 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체를 분리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호 (Ladner et al.); 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호 (Dower et al.); 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호 (Griffiths et al.)를 참조한다.

면역원성 항원의 제조 및 모노클로널 항체 생성은 임의의 적절한 기술, 예를 들어, 재조합 단백질 생성을 사용하여 수행될 수 있다. 면역원성 항원은 정제된 단백질, 또는 전 세포 또는 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태로 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 항원은 상기 항원 또는 그의 부분을 암호화하는 핵산으로부터 동물의 체 내에서 드 노보 형성될 수 있다.

본 발명의 분리된 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로널 항체를 암호화하는 DNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 쥣과 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용에 의해) 쉽게 분리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마가 생성될 경우, 그러한 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 암호화 서열 및 번역 생성물이 연결된 디스플레이 기술, 예를 들어 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 사용하면, 결합제 및 핵산의 선택은 단순화된다. 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 암호화 영역을 분리하고 이를 사용하여 인간 항체 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함하는 전 항체를 생성하고, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다.

인간화 항체

본 발명은 추가로 인간 CD27에 결합하는 인간화된 (조작된 또는 인간 조정된) 면역글로불린 (또는 항체)을 제공한다. 면역글로불린의 인간화 형태는 실질적으로 인간 면역글로불린 (수용자 면역글로불린으로 표기) 유래의 가변 프레임워크 영역 (들) 및 실질적으로 CD27에 특이적으로 결합하는 비인간 Mab 유래의 CDR을 갖는다. 불변 영역 (들)은 또한, 존재하는 경우 실질적으로 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 인간화 항체는 적어도 약 10^-6 M (1 μM), 약 10^-7 M (100 nM) 또는 그 미만의 CD27에 대한 K_D를 나타낸다. 인간화 항체의 결합 친화성은 그들이 유래되는 마우스 항체의 결합 친화성보다 더 크거나 더 낮을 수 있다. CD27에 대한 인간화 항체의 친화성의 변화에 영향을 주기 위하여, 예를 들어, 그의 친화성을 향상시키기 위하여, CDR 잔기 또는 인간 잔기 중 어느 하나에서의 치환이 이루어질 수 있다.

마우스 CDR의 인간 가변 도메인 프레임워크로의 치환은 인간 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 비롯된 마우스 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 입체형태를 채용한다면, 그들의 올바른 공간 배향의 유지를 야기할 가능성이 크다. 이는 프레임워크 서열이 CDR이 유래되는 쥣과 가변 프레임워크 도메인과 높은 서열 동일성 정도를 나타내는 인간 항체로부터 인간 가변 도메인을 수득함으로써 달성된다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 서열은 천연 발생 인간 항체의 서열이거나, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 몇몇 인간 항체의 공통 서열 및/또는 생식계열 서열일 수 있다.

적절한 인간 항체 서열은 마우스 가변 영역의 아미노산 서열과, 공지되어 있는 인간 항체의 서열의 컴퓨터 비교에 의해 확인한다. 비교는 중쇄 및 경쇄에 대하여 따로 수행하나, 원리는 각각에 대하여 유사하다.

일 예에서, CD27-중화 mAb의 아미노산 서열을 사용하여 공공의 항체 서열 데이터베이스로부터 작성된 인간 항체 데이터베이스를 질의한다. 본 명세서에 개시되거나 기재된 중쇄 가변 영역은 서열 동일성이 가장 높은 인간 가변 영역을 찾는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 개시되거나 기재된 경쇄의 가변 영역은 서열 동일성이 가장 높은 인간 가변 영역을 찾는데 사용될 수 있다. 쥣과 Mab 공여자 유래의 중쇄 가변 영역 중 하나의 CDR을 암호화하는 영역이 선택된 인간 중쇄 가변 서열로 전달되어, 인간 가변 영역의 CDR을 대체하는 DNA 구축물이 각각의 쥣과 가변 영역에 대해 바람직하다.

쥣과 CDR 영역과 인간 가변 프레임워크 영역의 부자연스러운 병치는 부자연스러운 입체형태적 제약을 야기할 수 있으며, 이는 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 교정되지 않는 한, 결합 친화성의 소실을 야기한다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 인간화 항체는 실질적으로 인간 면역글로불린으로부터 유래된 가변 프레임워크 영역 (들) 및 실질적으로 마우스 면역글로불린으로부터 유래된 CDR (예를 들어, C2177, C2186, C2191 또는 C2192 마우스 항체)을 포함한다. 마우스 항체의 CDR 및 적절한 인간 수용자 면역글로불린 서열을 확인하면, 다음 단계는 생성되는 인간화 항체의 특성을 최적화하기 위해 존재한다면, 이들 성분으로부터의 어느 잔기가 치환되어야 할 지를 결정하는 것이다. 일반적으로, 인간 아미노산 잔기를 쥣과 아미노산 잔기로 치환하는 것은 최소화되어야 하는데, 이는 쥣과의 잔기의 도입이 인간에서 항체가 HAMA 반응을 유발할 위험을 증가시키기 때문이다. 아미노산은 CDR 입체형태 및/또는 항원으로의 결합에 대한 그들의 가능한 영향에 기초하여 치환을 위해 선택된다. 이러한 가능한 영향의 조사는 모델링, 특정 위치에서 아미노산의 특징 검사, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과의 실험 관찰에 의해 행해질 수 있다. 실험 방법에 관해서는, 원하는 활성, 결합 친화성 또는 특이성에 대하여 스크리닝될 수 있는 변이체 서열의 라이브러리를 생성하는 것이 특히 편리한 것으로 관찰되었다. 이러한 변이체의 라이브러리의 생성을 위한 하나의 형식은 파지 디스플레이 벡터이다. 대안적으로, 변이체는 가변 도메인 내의 표적화된 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 다양하게 하기 위한 다른 방법을 사용하여 생성될 수 있다.

추가의 치환이 필요한지 여부를 결정하고, 치환을 위한 아미노산 잔기를 선택하는 다른 방법은 컴퓨터 모델링을 사용하여 달성될 수 있다. 면역글로불린 분자의 3차원 이미지를 생성하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어는 광범위하게 이용할 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린 사슬 또는 그의 도메인에 대하여 밝혀져 있는 구조로부터 시작하여 분자 모델을 생성한다. 모델링될 사슬을 아미노산 서열 유사성에 대하여 밝혀져 있는 3차원 구조의 사슬 또는 도메인과 비교하며, 가장 큰 서열 유사성을 보이는 사슬 또는 도메인을 분자 모델의 구축을 위한 출발점으로 선택한다. 밝혀져 있는 출발 구조를 변형시켜, 모델링될 면역글로불린 사슬 또는 도메인에서의 실제 아미노산과 출발 구조에서의 아미노산 간의 차이를 가능하게 한다. 이어서, 변형된 구조를 복합 면역글로불린으로 조립한다. 마지막으로, 모델은 에너지 최소화에 의해, 그리고 모든 원자가 서로 적절한 거리 내에 존재하며, 결합 길이 및 결합 각이 화학적으로 허용되는 한계 내에 있는 것을 입증함으로써 개선시킨다.

통상, 인간화 항체 내의 CDR 영역은 그들이 유래되는 마우스 항체 내의 상응하는 CDR 영역과 실질적으로 동일하며, 보다 통상적으로, 그와 동일하다. 통상적으로는 바람직하지 않지만, 얻어진 인간화 면역글로불린의 결합 친화성에 눈에 띄게 영향을 미치지 않고, 때때로 CDR 잔기의 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 만들 수 있다. 때때로, CDR 영역의 치환은 결합 친화성을 향상시킬 수 있다.

상기 논의된 특정 아미노산 치환 이외에, 인간화 면역글로불린의 프레임워크 영역은 통상적으로 그들이 유래한 인간 항체의 프레임워크 영역과 실질적으로 동일하고, 더욱 통상적으로는 동일하다. 물론, 프레임워크 영역 내의 아미노산 중 다수는 항체의 특이성 또는 친화성에 대하여 직접적 기여를 거의 하지 않거나 전혀 하지 않는다. 따라서, 프레임워크 잔기의 많은 개별적인 보존적 치환은 생성된 인간화 면역글로불린의 특이성 또는 친화성의 상당한 변화 없이 허용될 수 있다.

코드의 축퇴성 (degeneracy) 때문에, 다양한 핵산 서열이 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화할 것이다. 원하는 핵산 서열은 드 노보 고체상 DNA 합성에 의해 또는 원하는 폴리뉴클레오티드의 조기 제조된 변이체의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 본 출원에 기재된 항체를 암호화하는 모든 핵산은 명시적으로 본 발명에 포함된다.

상기에 설명된 바와 같이 생성된 인간화 항체의 가변 세그먼트는 전형적으로 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분에 연결된다. 본 항체는 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역 둘 모두를 포함할 것이다. 중쇄 불변 영역은 통상적으로 CH1, 힌지, CH2, CH3을 포함하며, 때때로 CH4 도메인을 포함한다.

인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE와, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 하위분류 (subclass) (아이소타입)를 포함하는 임의의 분류의 항체 유래의 임의의 유형의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 인간화 항체가 세포독성 활성을 나타내기를 원하는 경우, 불변 도메인은 통상적으로 보체-고정 (complement-fixing) 불변 도메인이며 그 분류는 전형적으로 IgG₁이다. 그러한 세포독성 활성이 바람직하지 않은 경우에는, 불변 도메인은 IgG₂ 분류의 것일 수 있다. 인간화 항체는 1종 초과의 분류 또는 아이소타입 유래의 서열을 포함할 수 있다.

선택적으로 불변 영역에 결합되는, 인간화 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산을 발현 벡터 내로 삽입한다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 암호화하는 DNA 세그먼트는 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터 (들) 내의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러한 조절 서열은 신호 서열, 프로모터, 인핸서, 및 전사 종결 서열을 포함한다 (모든 목적을 위해 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)]; WO 90/07861호; 문헌 [Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992)] 참조).

치료 단백질의 효능은 원하지 않는 면역 반응에 의해 제한될 수 있다. 비-인간 모노클로널 항체는 실질적인 선형 아미노산 서열의 스트레치 및 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있는 국소 구조 입체형태를 가질 수 있다. 비-인간 항체의 면역원성을 감소시키려는 첫번째 시도는 인간-쥣과 항체 키메라의 구축이었으며, 그 후, 1980년대 후기에 그들 키메라의 인간화 방법이 행해졌다 (문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13: 1619-1633, 2008]에서 검토).

가장 흔하게 사용되는 인간화 방법 중 하나는 소위 "상보성 결정 영역 (CDR) 그래프팅"이며, 여기서, 쥣과 CDR이 인간 항체 프레임워크 영역 (FR)으로 그래프팅된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법의 적용은 종종 실질적인 항원으로의 결합의 소실과 이에 따른 항체-기반의 약물의 효능의 감소를 야기한다. 따라서, 인간으로 주입될 때 비-인간 모 분자의 결합 프로파일 및 생물물리학적 프로파일을 유지하면서, 최소 면역 반응을 유도하는 항체 분자를 생성하기 위한 타당한 설계 원리를 사용하는 것은 매우 가치가 있다.

2177 및 2191, 즉, CD27에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 마우스 모노클로널 항체 (mAb)의 인간화가 기재된다. 이들 항체의 프레임워크 (FR)를 미국 특허 출원 공개 제20090118127 A1호 (Raghunathan, G.)에 개시되고, 문헌 [Fransson et al (J Mol Biol 398:214-231, 2010)]에 추가로 예시된 인간 프레임워크 조정 (Human Framework Adaption; HFA)으로 지칭되는 얀센 (Janssen)이 소유권을 주장할 수 있는 인간화 기술의 제1 단계를 사용하여 인간 생식계 유전자 FR로 대체하였다. 이러한 기술은 CD27에 특이적인 일련의 mAb가 모 마우스 항체 2177 및 2191에 대하여 측정된 것들에 비해 뛰어난 결합 및 억제 특성을 갖게 한다.

3. 항-CD27 항체의 사용 방법

하기에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 4개의 분리된 모노클로널 항체 (C2177, C2186, C2191 및 C2192)가 CD27 상의 3개의 비중첩 에피토프에 결합하고, 시험관내 및/또는 생체내 CD27 억제 활성을 나타냄을 보여준다. 유의미하게, MAb의 반응성은 용량 의존적으로 CD70과의 CD27 상호작용을 차단하고, CD70의 존재 하에 CD27 신호전달을 감소시키고, T-세포에 의한 IL-4 및 IFNg 생성을 감소시키고, CD70-의존성 인간 나이브 CD4+ T-세포 증식, CD70-의존성 B-세포 증식 및 형질 세포 생성을 억제하는 능력을 포함한다. 더욱이, 분리된 항체는 CD70 자극제의 부재 하에 CD27 활성화를 유의미하게 유도하지 않는다.

본 발명에 기재된 바와 같은 모노클로널 항체의 특성을 고려해 볼 때, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 및 동물에서 CD27-관련 증상을 치료하거나 예방하기 위한 치료제 및 예방제 둘 모두로서 적절하다.

일반적으로, 용도는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 모노클로널 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 유사한 스펙트럼의 결합 활성 및 생물학적 활성을 갖도록 선택된 항체 또는 분자를 감수성 대상체 또는 CD27 활성이 병적 후유증, 예컨대 면역 장애 또는 종양 성장 및 전이를 갖는 것으로 알려져 있는 증상을 나타내는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 것이다. Fab 및 F (ab')2 단편을 비롯한 항체의 임의의 활성 형태가 투여될 수 있다.

바람직하게는, 사용된 항체는 수용자 종과 상용성이어서, MAb에 대한 면역 반응이 대상체에서 허용할 수 없는 짧은 순환 반감기를 야기하거나 MAb에 대한 면역 반응을 유도하지 않게 한다. 투여된 MAb는 몇몇 부차적인 기능, 예컨대 대상체의 Fc 수용체로의 결합 및 ADCC 메커니즘의 활성화를 나타내어, 세포용해 또는 세포독성 메커니즘을 사용하여 표적 세포 개체군을 고갈시킬 수 있거나, 그들을 표적 세포 개체군을 보존하기 위하여 이들 부차적인 이펙터 기능이 제한되거나 이것이 없게 조작할 수 있다.

개체의 치료는 치료적 유효량의 본 발명의 항체의 투여를 포함할 수 있다. 항체는 후술하는 바와 같이 키트로 제공될 수 있다. 항체는 혼합물로서, 예를 들어, 동량으로 또는 개별적으로, 순차적으로 제공되거나 한꺼번에 사용되거나 투여될 수 있다. 환자에게 CD27에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편, 또는 수여 환자에서 CD27에 대해 보호할 수 있는 항체를 제공함에 있어서, 투여되는 제제의 용량은 환자의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 이전의 병력 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이다.

유사한 접근법에서, 본 발명의 모노클로널 항체의 다른 치료적 용도는 본 발명의 모노클로널 항체 중 하나에 대해 야기된 항-이디오타입 (anti-idiotypic) 항체를 이용한 환자의 능동 면역화이다. 에피토프의 구조를 모방하는 항-이디오타입을 사용한 면역화에 의해 활성 항-CD27 반응이 유도될 수 있었다 (문헌 [Linthicum, D. S. and Farid, N. R., Anti-idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988), pp 1-5 and 285-300]).

이와 유사하게, 능동 면역화는 백신의 성분으로서 하나 이상의 항원성 및/또는 면역원성 에피토프를 투여함으로써 유도될 수 있다. 백신접종은 수여자가 이러한 생물학적으로 기능성인 영역에 대한 보호적 항체를 생성하도록 하기에 충분한 양으로 경구로 또는 비경구로, 예방적으로 또는 치료적으로 수행될 수 있다. 숙주는 순수한 형태의 항원성/면역원성 펩티드, 펩티드의 단편, 또는 펩티드의 변형된 형태로 능동 면역화될 수 있다. 원래의 단백질 서열에 상응하지 않는 하나 이상의 아미노산이 원래의 펩티드, 또는 절단된 펩티드 형태의 아미노 또는 카르복실 말단에 부가될 수 있다. 그러한 가외의 아미노산은 펩티드를 다른 펩티드, 더 큰 캐리어 단백질, 또는 지지체에 커플링시키는 데 유용하다. 이들 목적에 유용한 아미노산에는 티로신, 라이신, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인 및 그의 유도체가 포함된다. 펩티드를 다른 단백질 또는 펩티드 분자에 또는, 지지체에 커플링시키거나 융합시키기 위한 추가 수단을 제공하기 위하여, 대안적 단백질 변형 기술, 예를 들어, NH2-아세틸화 또는 COOH-말단 아미드화를 이용할 수 있다.

원치않는 CD27 생물활성에 대하여 보호할 수 있는 항체는 수여 대상체에게 CD27-관련 증후 또는 병증의 감소, 해결 또는 개선을 달성하기에 충분한 양으로 제공되는 것으로 의도된다. 만일 제제의 용량, 투여 경로 등이 그러한 반응에 영향을 주기에 충분하면, 양은 증후의 감소를 "달성하기 위한" 충분한 양 또는 "치료적 유효량"이라고 말한다. 항체 투여에 대한 반응은 영상화 기술에 의해 또는 조직 시료의 생체외 (ex vivo) 분석에 의해서와 같이 대상체의 이환 조직, 기관 또는 세포의 분석에 의해 측정될 수 있다. 제제는 그 존재가 수여 환자의 생리학에서 검출가능한 변화를 야기한다면 생리학적으로 유의미하다.

치료적 응용

본 발명의 CD27-중화 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 특정 변이체를 사용하여, CD27 또는 CD27을 발현하는 세포에 의하여 매개되거나 영향을 받거나 조절되는 증상을 진단하거나, 모니터링하거나, 조절하거나, 치료하거나, 경감시키거나, 그의 발병의 예방에 도움이 되거나, 그의 증후를 감소시키는 세포, 조직, 기관 또는 동물 (포유류 및 인간 포함)에서의 효과를 측정하거나 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명은 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 적어도 하나의 CD27 항체를 사용하여 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 CD27 관련 질환을 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 특정 지시사항이 하기에 논의된다.

면역 관련 질환

본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 전신성 소아 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 위궤양, 혈청 반응 음성 관절증, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 낭창, 항인지질 증후군, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신성 혈관염/베게너 육아종증, 유육종증, 고환염/정관절제술 역전 처치 (reversal procedure), 알러지성/아토피성 질환, 천식, 알러지성 비염, 습진, 알러지성 접촉 피부염, 알러지성 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관 이식 거부, 이식편대숙주병, 전신성 염증 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그람 양성균 패혈증, 그람 음성균 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구 감소성 발열, 요로성 패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 피폭, 급성 췌장염, 성인 호흡곤란 증후군, 류마티스성 관절염, 알코올성 간염, 만성 염증성 병증, 유육종증, 크론병, 겸상적혈구 빈혈, 당뇨병, 신장증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알러지성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 두드러기, 전신성 아나팔락시스, 피부염, 악성 빈혈, 용혈성 질환, 혈소판 감소증, 임의의 기관 또는 조직의 이식 거부, 신장 이식 거부, 심장 이식 거부, 간 이식 거부, 췌장 이식 거부, 폐 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 피부 동종이식 거부, 연골 이식 거부, 뼈 이식 거부, 소장 이식 거부, 태아 흉선 이식 거부, 부갑상선 이식 거부, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부, 동종이식 거부, 항수용체 과민 반응, 그레이브스 (Graves) 병, 레이노병, B형 인슐린 저항성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체 매개성 세포독성, III형 과민 반응, 전신 홍반성 낭창, POEMS 증후군 (다발성 신경병증, 기관비대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부 변화 증후군), 항인지질 증후군, 천포창, 피부경화증, 혼합성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활동성 간염, 원발성 답즙성 간경변증, 백반, 혈관염, 심근 경색후 (post-MI) 심장절개술 증후군, IV형 과민증, 접촉성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식 거부, 세포내 생물에 의한 육아종, 대사성 또는 특발성 약물 과민증, 윌슨병, 혈색소증, 알파-1 항트립신 결핍증, 당뇨병성 망막증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부-뇌하수체-부신축 평가, 원발성 담즙성 간경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성 섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 피부 증상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액 투석, 요독증, 독성, 자간전증, OKT3 요법, 항-CD3 요법, 사이토카인 요법, 화학 요법, 방사선 요법 (예를 들어, 무력증, 빈혈, 악액질 등을 포함하나 이에 한정되지 않음), 만성 살리실산염 중독 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 면역 관련 염증 질환의 조절 또는 치료 방법을 제공한다.

폐 질환

본 발명은 또한 예를 들어, 폐렴; 폐 농양; 먼지, 기체 또는 미스트 형태의 물질로 인한 직업성 폐질환; 천식, 폐색성섬유성세기관지염, 호흡부전, 과민성 폐렴 (외인성 알러지성 폐포염), 알러지성 기관지 폐 아스페르길루스증, 및 약물 반응을 포함한 폐의 과민성 질환; 성인 호흡곤란 증후군 (ARDS), 구드패스츄어 증후군, 만성 폐쇄성 기도 장애 (COPD), 특발성 간질성 폐질환, 예컨대 특발성 폐섬유증, 유육종증, 박리성 간질성 폐렴, 급성 간질성 폐렴, 호흡 세기관지염 관련 간질성 폐질환, 기질화 폐렴을 동반한 특발성 폐쇄성 세기관지염, 림프구성 간질성 폐렴, 랑게르한스 세포 육아종증, 특발성 폐혈철증; 급성 기관지염, 폐포단백증, 기관지확장증, 흉막 장애, 폐확장부전, 낭성 섬유증 및 폐 종양, 및 폐색전증에서 CD27을 수반하는 관련 또는 부수 세포 또는 세포 과정에 대한 면역 반응을 조절하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 폐 또는 흉막 질환의 조절 또는 치료 방법을 제공한다.

악성 질환

본 발명은 또한 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병, 골수 이형성 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷 (Burkitt) 림프종, 다발성 골수종, 원발성 질환으로서의 또는 전이성 질환으로서의 고형 종양, 카포시 육종, 결장직장 암종, 췌장 암종, 신장 세포 암종, 중피종을 포함한 폐암, 유방암, 비인두암종, 악성 조직구 증식증, 부종양 증후군/악성 질환에 의한 고칼슘혈증, 선암종, 편평상피세포암종, 육종, 악성 흑색종, 특히 전이성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골흡수, 암 관련 뼈통증 등 중 적어도 하나에서 CD27을 수반하는 관련 또는 부수 세포 또는 세포 과정에 대한 면역 반응을 조절하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 악성 질환의 조절 또는 치료 방법을 제공한다.

심혈관 질환

본 발명은 또한 심근경색증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재협착, 당뇨병성 동맥경화성 질환, 고혈압, 동맥성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전, 폐심장증, 원발성 폐고혈압, 심부정맥, 이소성 심방 박동, 심방 조동, 심방 세동 (지속성 또는 일과성), 관류후 증후군, 심폐 바이패스 염증 반응, 혼돈성 또는 다소성 심방 빈맥, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 특정 부정맥, 심실세동, 히스 다발 (His bundle) 부정맥, 방실 차단, 다발 갈래 차단, 심근 허혈 장애, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근경색증, 심근병증, 확장형 울혈성 심근병증, 제한성 심근병증, 심장 판막 질환, 심내막염, 심낭 질환, 심종양, 대동맥류 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 이의 분지의 폐쇄, 말초 혈관 장애, 동맥 폐쇄성 장애, 말초 아테롬성 동맥경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 장애, 레이노 현상 및 레이노병, 말단청색증, 피부홍통증, 정맥 질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥루, 림프부종, 지방부종, 불안정성 협심증, 재관류 손상, 펌프 후 (post pump) 증후군, 허혈-재관류 손상 등 중 적어도 하나에서 CD27을 수반하는 관련 또는 부수 세포 또는 세포 과정에 대한 면역 반응을 조절하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 심혈관 질환의 조절 또는 치료 방법을 제공한다.

신경 질환

본 발명은 또한, 신경변성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 복합증, 탈수초성 질환, 예를 들어, 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌 질환, 예컨대 피질 척수계 병변; 기저핵 장애 또는 소뇌 장애; 과다운동성 운동 장애, 예컨대 헌팅턴 무도병 및 노인무도병; 약물 유도성 운동 장애, 예컨대 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 장애; 과소운동성 운동 장애, 예컨대 파킨슨병; 진행성 핵상마비; 소뇌 구조 병변; 척수소뇌 변성증, 예컨대 척수성 운동실조증, 프리이드라이히 운동실조증, 소뇌 피질 변성증, 다발계통 변성증 (멘셀 (Mencel), 데제린-토마스 (Dejerine-Thomas), 샤이-드래거 (Shi-Drager), 및 마카도-조셉 (Machado-Joseph)); 전신성 장애 (레프섬 병, 무베타리포단백혈증, 운동실조, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다발계통 장애); 탈수초성 코어 (core) 장애, 예컨대 다발성 경화증, 급성 횡단성 척수염; 및 운동단위 질환, 예컨대 신경성 근위축증 (전각 세포 변성, 예컨대 근위축성 측삭경화증, 유아 척수성 근위축증 및 소아 척수성 근위축증); 알츠하이머병; 다운 증후군; 확장형 루이소체병; 루이소체형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프 증후군; 만성 알콜 중독; 크로이츠펠트-야콥병; 아급성 경화성 범뇌염, 할레로르덴-스파츠 병 (Hallerrorden-Spatz disease); 및 권투선수 치매 등에서 CD27을 수반하는 관련 또는 부수 세포 또는 세포 과정에 대한 면역 반응을 조절하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자의 신경 질환의 조절 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 선택적으로 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 TNF 항체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

CD27-중화 항체의 다른 치료적 용도

상기 기재된 증상 및 질환에 더하여, 본 발명은 또한, 예를 들어, 간 섬유증 (알콜 유도성 경화증, 바이러스 유도성 경화증, 자가면역 유도성 간염을 포함하나 이들에 한정되지 않음); 폐 섬유증 (피부경화증, 특발성 폐 섬유증을 포함하나 이들에 한정되지 않음); 신장 섬유증 (피부경화증, 당뇨병성 신장염, 사구체신염, 낭성 신장염을 포함하나 이들에 한정되지 않음); 피부 섬유증 (피부경화증, 비후성 및 켈로이드 흉터 형성, 화상을 포함하나 이들에 한정되지 않음); 골수 섬유증; 신경 섬유종증; 섬유종; 장 섬유증; 및 외과적 처치로부터 야기된 섬유성 유착에서, CD27을 수반하는 관련 또는 부수 세포 또는 세포 과정에 대한 면역 반응을 조절함으로써 다양한 병인의 섬유성 증상의 조절 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 예를 들어, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염을 포함한 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 및 만성 기생충성 과정 또는 감염성 과정, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염 (A형, B형 또는 C형 등), 패혈성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 대장균 (E. coli), 용혈성 요독증후군, 말라리아, 뎅기 출혈열, 리슈만편모충증, 나병, 독성 쇼크 증후군, 연쇄상구균 근염, 가스괴저, 결핵균, 조류형 결핵균, 폐포자충 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염 또는 부고환염, 레지오넬라, 라임병, A형 인플루엔자, 엡스타인-바 바이러스, 바이러스 관련 혈구탐식 증후군, 바이러스성 뇌염/무균성 수막염 등에서, CD27을 수반하는 관련 또는 부수 세포 또는 세포 과정에 대한 면역 반응을 조절함으로써 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 감염성 질환의 증후의 조절 또는 치료 또는 개선 방법을 제공한다.

본 출원 전체에 걸쳐 모든 인용된 참고문헌의 내용 (문헌 참고문헌, 등록 특허, 공개 특허 출원, 및 공계류 중인 특허 출원 포함)은 본 명세서에 명시적으로 참고로 포함된다.

본 발명의 다른 특징은 본 발명의 예시를 위해 주어지며 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는 예시적 실시형태의 하기 설명 과정에서 명백해질 것이다.

4. 약제학적 제형

본 발명은 약제학적으로 허용되는 제형 중의 적어도 하나의 CD27-중화 항체를 포함하는 바람직하게는 인산염 완충 염수 용액 또는 혼합된 염 용액 및 보존 용액 및 제형 및 약제학적 또는 수의학적 용도에 적절한 다용도 보존 제형인 CD27-중화 항체의 안정한 제형을 제공한다. 기타 인간 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민을 포함하는 적절한 비히클 및 그들의 제형은 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5]에 기재되어 있다.

효과적인 투여에 적절한 약제학적으로 허용되는 조성물을 형성하기 위하여, 이러한 조성물은 적절한 양의 담체 비히클과 함께 유효량의 상기 기술된 화합물을 함유할 것이다. 추가의 약제학적 방법이 작용의 지속을 조절하기 위해 이용될 수 있다. 조절 방출 제제는 화합물과 복합체를 형성하거나 화합물을 흡수하기 위해 중합체를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 조절 방출 제제에 의해 작용의 지속을 조절하는 다른 가능한 방법은 본 발명의 화합물을 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체와 같은 중합체성 물질의 입자내로 혼입시키는 것이다. 대안적으로, 중합체성 입자 내로 이들 제제를 혼입하는 대신, 예를 들어, 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 각각, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트)-미세캡슐에, 또는 콜로이드성 약물 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자, 및 나노캡슐에 또는 마이크로에멀젼에 이들 물질을 포획하는 것이 가능하다. 이러한 기술은 상기 문헌 [Remington (2006)]에 개시되어 있다.

5. CD27-중화 항체의 투여

본 명세서에 기재된 안정한 또는 보존된 제형 또는 용액 중의 적어도 하나의 CD27-중화 항체는 정맥내 (I.V.), 근육내 (I.M.); 피하 (S.C.); 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 또는 당업계에 공지된 것으로서 당업자에 인식되는 다른 수단에서 제형을 사용하는 것을 포함하는 다양한 전달 방법을 통해 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.

CD27-중화 항체를 투여하는 하나의 방법에서, 약물 물질은 이전에 설치된 수액 백을 갖춘 카테터로부터 정맥내로 제공된다. CD27-중화 항체는 20 ml 일회용 바이알, 예를 들어, 이뮤노젠, 인코포레이티드 (ImmunoGen, Inc.) (미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)에 의해 공급되는 것에서 공급된다. 각 바이알은 본질적으로 정제수, USP 중에 제1인산칼륨 (0.57 mg/ml), 제1인산나트륨 일수화물 (0.20 mg/ml), 제2인산나트륨 (0.555 mg/ml) 및 염화나트륨 (8.16 mg/ml)을 포함하는 완충 용액 (pH 6.5 ± 0.5)에 0.05 내지 약 2.0 mg/ml의 농도로 단백질을 포함한다. 약물 제품은 저 단백질 결합 5 μ 필터를 통과시킴으로써 용량을 수액 백에 주입하면서 2회 미리 여과되어, 조제한 후 8 시간 이내에 인라인 0.22 μm 필터를 통해 환자에게 투여된다. 주입 후, 정맥내 라인은 전체 약물 용량의 전달을 보장하도록 유체로 플러시되어여 한다.

일반적으로, 항체의 전신성 용량을 투여한다면, 약 1 ng/㎏ 내지 100 ng/㎏, 100 ng/㎏ 내지 500 ng/㎏, 500 ng/㎏ 내지 1 ug/㎏, 1 ug/㎏ 내지 100 ug/㎏, 100 ug/㎏ 내지 500 ug/㎏, 500 ug/㎏ 내지 1 mg/㎏, 1 mg/㎏ 내지 50 mg/㎏, 50 mg/㎏ 내지 100 mg/㎏, 100 mg/㎏ 내지 500 mg/㎏ (수여자의 체중)의 범위인 항체 용량을 수여자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 더 낮거나 더 높은 용량이 투여될 수 있다. 약 1.0 mg/㎏ 만큼 낮은 용량이 약간의 효능을 나타낼 것으로 예상될 수 있다. 바람직하게는, 약 5 mg/㎏이 허용가능한 용량이지만, 최대 약 50 mg/㎏의 용량 수준 또한 치료적 용도를 위해 특히 바람직하다. 대안적으로, 1 ug 내지 100 ug, 1 mg 내지 100 mg, 또는 1 gm 내지 100 gm의 범위 내의 양과 같은 환자의 체중을 기초로 하지 않는 특정 양의 항체의 투여가 주어질 수 있다. 예를 들어, 부위 특이적 투여는 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내 (intraosteal), 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 수단과 같은 신체 구획 또는 체강에 이루어질 수 있다.

치료는 단일 투여 스케쥴로, 또는 바람직하게는 다중 투여 스케쥴로 주어질 수 있으며, 다중 용량 스케쥴에서는 치료의 일차 코스는 1 내지 10회의 개별 투여로 이루어질 수 있으며, 이어서 반응을 유지하고/하거나 강화하는 데 필요한 후속 시간 간격에, 예를 들어, 제2 용량을 위해 1 내지 4개월에 다른 용량이 주어지며, 그리고 필요에 따라, 수개월 후 후속 용량 (들)이 주어진다. 적절한 치료 스케쥴의 예는 (i) 0, 1개월 및 6개월, (ii) 0, 7일 및 1개월, (iii) 0 및 1개월, (iv) 0 및 6개월, 또는 질환 증후를 감소시키거나 질환의 중증도를 감소시킬 것으로 예상되는 원하는 반응을 유도하는데 충분한 다른 스케쥴을 포함한다.

6. CD27-중화 항체를 포함하는 제조 용품

본 발명은 CD27-중화 항체를 포함하는 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 물질, 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 인서트를 포함하는 제조 용품을 포함한다. 제조 용품은 바람직하게는 임의로 수성 희석액 중의 처방된 완충제 및/또는 보존제를 갖는 적어도 하나의 CD27-중화 항체의 용액을 포함하는 적어도 하나의 바이알을 포함하며, 상기 패키지 재료는 이러한 용액이 소정의 기간에 걸쳐서 유지될 수 있는 지를 나타내는 라벨을 포함한다. 본 발명은 패키징 재료 및 동결건조된 CD27-중화 항체를 포함하는 제1 바이알, 및 처방된 완충제 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 제조 용품을 포함할 수 있고, 상기 패키징 재료는 CD27-중화 항체를 수성 희석제 중에 재구성하여 용액을 형성하는 방법을 의사 또는 환자에게 지시하는 라벨을 포함한다.

적절한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 멸균 액세스 포트 (예를 들면, 용기는 정맥 주사용 용액 백 또는 피하주사용 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다.

조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 CD27-중화 항체이다. 라벨 또는 패키지 인서트는 조성물이 선택된 징후, 예를 들어, SLE를 치료하는데 사용되는 것을 나타낸다. 본 명세서에서 패키지 인서트는 항체 또는 조성물이 특정 질환 및 진단에 대한 본 명세서에 개요된 주의 기준을 이용한 치료에 대하여 반응하지 않거나, 불충분하게 반응하는 증상을 치료하는데 사용되는 것을 나타낼 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 패키지 인서트는 또한 항체, 항체-컨쥬게이트 또는 조성물을 사용하여, CD27을 수반한 세포 과정의 면역 반응을 조절할 필요성을 특징으로 하는 질환을 치료할 수 있음을 나타낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 생물학적 시료 중의 CD27을 검출하기 위한 키트이다. 키트는 CD27의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체를 보유하는 용기 및 면역학적 복합체를 형성하기 위하여 CD27에 결합시키고 면역학적 복합체의 형성을 검출하여 면역학적 복합체의 존재 또는 부재가 시료 내의 CD27의 존재 또는 부재와 상관되도록 하는 목적을 위하여 항체를 이용하기 위한 설명서를 포함한다. 용기의 예는 다수 시료 중의 CD27의 동시 검출을 허용하는 다중웰 플레이트를 포함한다.

본 발명을 일반적으로 설명하였지만, 본 발명의 실시형태가 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.

실시예 1: CD27 시약 및 방법

CD27-결합 모노클로널 항체를 생성하고 시험하기 위하여, 인간 CD70 및 인간 CD27의 전장 및 인간 CD27의 세포외 도메인 (ECD)을 나타내는 단백질 구축물을 생성하였다.

인간 CD27 (서열 번호 149)은 신호 펩티드 (잔기 1 내지 20), 세포외 (ECD, 잔기 21 내지 191), 막횡단 (TM, 잔기 191 내지 212) 및 세포내 (ICD, 잔기 213 내지 260) 도메인으로 이루어진 1형 막횡단 단백질이다. 인간 CD70 (서열 번호 2)은 N-말단으로부터 세포내 도메인 (ICD, 잔기 1 내지 17), 막횡단 (TM, 잔기 18 내지 38) 및 세포외 도메인 (ECD, 잔기 39 내지 193)으로 이루어진 193개 아미노산 길이의 2형 막횡단 폴리펩티드이다. 완전한 CD70 암호화 서열은 HEK 293 세포의 표면 상에 클론에 의해 발현된다.

mAb ELISA 및 단백질 기반의 직접 결합 검정을 위하여, CD27 ECD의 아미노산 1 내지 121을 C-말단 His6-태그 펩티드와 함께 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰으며, 금속 이온 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 파지 패닝 (panning) 및 ELISA 검정을 위하여, C-말단 His6-태그가 있는 ECD의 아미노산 1 내지 173을 HEK 발현시키고, 금속 이온 크로마토그래피에 이어서, 슈퍼덱스 (Superdex) 75에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이들 CD27 단백질 둘 모두를 단백질 상의 NHS-에스테르 화학물질 표적화 아민 잔기를 사용하여 비오티닐화시켰다. 결정화를 위하여, C-말단 His6-태그가 있는 아미노산 1 내지 101을 배큘로바이러스 시스템에서 발현시키고, 프로테오스, 인코포레이티드 (Proteose, Inc.)에 의한 금속 이온 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 마우스 면역화를 위하여, CD27-Fc 단백질을 알앤디 시스템즈 (R&D systems)로부터 구입하였다. 일부 연구를 위하여, 완전한 CD27 암호화 서열을 HEK 293 세포의 표면 상에 클론에 의해 발현시켰다.

인간 CD27 및 인간 CD70 cDNA 클론을 오픈 바이오시스템즈 (Open Biosystems)로부터 구입하였다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 발현 구축물을 생성하였다. 약술하면, CD27 및 CD70 유전자의 오픈 리딩 프레임을 PCR 증폭시키고, 제한 엔도뉴클레아제 분해 및 라이게이션을 통하여, 또는 리가제 독립적 클로닝 (LIC)을 통하여 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다. 전장 CD27 및 CD70 유전자를 발현 벡터로 클로닝하고, 포유류 세포의 표면 상에 클론에 의해 발현시켰다. CD27의 세포외 도메인을 포유류 발현 벡터로 클로닝하고, 헥사-his 테일과 함께, HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰다.

실시예 2: CD27-중화 항체의 생성

쥣과 항-인간 CD27 항체를 문헌 [Kohler and Milstein (1975)]의 하이브리도마 방법에 의해 생성하였다. 10마리의 12 내지 14주령 C3H/HeJ 마우스를 찰스 리버 래보러터리즈 (Charles River Laboratories)로부터 수득하였다. 마우스를 1일에 100 μL의 최종 부피 중의 각각의 쥣과 인터페론-알파 및 -베타 (바이오소스 (Biosource)) 0.33×10⁵ 유닛과 병용하여 50 ㎍의 Hu CD27 Fc (알앤디 시스템즈)로 꼬리의 기저부 (BOT)에서 피하 (SQ) 면역화시켰다. 2일 및 3일에, 마우스에 인터페론을 기저부에 피하 (SQ BOT) 주사하였다 (1일과 같은 용량). 마우스를 융합을 위한 비장 수집 4일 전, 14일에 PBS 중에 기저부에 피하 (SQ BOT)로 제공되는 50 ㎍의 항-쥣과 CD40 효능제 Mab (알앤디 시스템즈)와 병용하여 50 ㎍의 Hu CD27-Fc로 부스팅시켰다.

역가 평가를 위하여, 포획 상 (capture phase) EIA를 수행하였다. 약술하면, 플레이트 (넌크-맥시소르프 (Nunc-Maxisorp))를 4℃에서 하룻밤 중탄산염 완충제 중의 0.1 ㎍의 염소 항-ms Fc (잭슨 이뮤노테크 (Jackson Immunotech))로 코팅하였다. 블로킹 및 세척 단계 후에, 혈청 희석액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 단계 후에, 플레이트를 실온에서 30분 동안 0.25 ㎍/mL의 블로킹 완충제 중의 비오티닐화 Hu CD27-ECD와 함께 인큐베이션시키고, 실온에서 30분 동안 0.4% BSA/PBS 중에 1:40,000 희석된 HRP 표지 스트렙트아비딘 (잭슨 이뮤노테크)으로 프로빙하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척한 다음; OPD (시그마 패스트 탭스 (Sigma fast tabs)) 기질 용액을 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션시키고, 25 μl/웰로의 4N 황산의 첨가에 의해 기질 발색을 중단시키고, 흡광도를 490nm에서 측정하였다.

미분비 BALB/c 마우스 골수종 융합 파트너인 FO의 세포 은행을 ATCC로부터 구입하였다 (#CRL-1646). 동결된 FO 세포의 바이얼 하나를 해동시키고, 10% (v/v) FBS (하이클론 (Hyclone))가 보충된 글루타맥스 (Glutamax)™ (변형) 배지 (인비트로겐 (Invitrogen))가 있는 DMEM 중에 재현탁화시켰다. 세포를 증식시키고, 동결보존하고, 찰스 리버 래보러터리즈에 의해 무균이며, 마이코플라스마가 없는 것으로 여겼다. C1833A (센토코 (Centocor)) 세포주도 또한 이러한 융합에 사용하였다. FO 세포주에서 CHOP 유전자의 발현을 낙다운시킴으로써 이러한 세포주를 사내에서 유도하여, 그것이 제네티신을 사용한 선택 하의 성장을 필요로 한다. 세포를 10% (v/v) FBS (하이클론) 및 500 ug/mL의 제네티신 (집코 (Gibco))이 보충된 글루타맥스™ (변형) 배지가 있는 DMEM 중에 성장시킨 것을 제외하고 상기 FO와 같이 처리하였다. FO 및 C1833A 세포주 둘 모두를 융합 전에 세포 주기 동시화 (cell synchronization)로 처리하였다. 약술하면, 1.5-2 x108개 세포를 0.25% (v/v) FBS (하이클론)가 보충된 글루타맥스™ (변형) 배지가 있는 DMEM 180 mL로 씨딩하고, 37℃에서 13시간 동안 인큐베이션시켰다. 추가의 20 mL의 FBS를 10%의 최종 FBS 농도로 첨가하고, 사용 전에 37℃에서 추가 13시간 동안 인큐베이션시켰다. C1833A 세포는 지속적으로 세포 주기 동기화 과정 동안에 제네티신 선택 하에 존재하였다. 골수종 세포를 PBS에서 세척하고, 계수하고, 융합 전에 구아바 비아카운트 소프트웨어 (Guava Viacount software)를 통해 생존력을 결정하였다 (>78%).

융합하는 날에, 동물을 CO₂ 질식에 의해 안락사시켰다. 비장을 무균적으로 제거하고, 항생제 (PSA) (시그마 (Sigma))를 함유하는 10 mL의 냉 인산염-완충 염수 (PBS) 중에 침지시켰다.

비장세포의 단일 세포 현탁액을 준비하고, RBC 용해 완충제 (시그마)를 사용한 RBC 용해로 처리하였다. 세척된 세포를 항-쥣과 Thy1.2, 항-쥣과/인간 CD11b 및 항-쥣과 IgM 자기 비드 (각각 밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotec) # 130-049-101, 130-149-601 및 130-047-301)를 사용하여 제조처의 지시에 따라 자기 분류 (magnetic sorting)를 위해 표지한 다음, 디플리트 (Deplete) 프로그램을 작동시킴으로써 오토맥스 프로 (AutoMacs Pro) 기기를 사용하여 분류하였다. 미표지 (농축된 형질모세포 B 세포) 및 표지 세포 분획 둘 모두를 수집한 다음, 구아바 PCA를 통해 계수하였다. 양성 표지 세포를 폐기하였다. 미표지 세포를 FO 및 C1833A 융합 파트너 둘 모두에 대한 융합을 위하여 절반으로 나누었다. 융합을 문헌 [De St. Groth (J Immunological Methods. 35:1-21. 1980)]의 방법에 따라 1:1 비의 쥣과 골수종 세포 대 생존가능한 비장 세포에서 수행하였다. 약술하면, 비장 및 골수종 세포를 함께 혼합하고, 펠렛화시키고, 50 mL의 PBS 중에 1회 세척하였다. 펠렛을 37℃에서 30초에 걸쳐, 1 mL의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 (2 g PEG 분자량 4000, 2 mL DMEM 및 0.4 mL DMSO)을 사용하여 재현탁화시켰다. 그 다음, 세포/융합 혼합물을 온건하게 교반하면서 대략 60초 동안 37℃ 수조에서 침지시켰다. 1분에 걸쳐 37℃ DMEM을 천천히 첨가함으로써 융합 반응을 중단시켰다. 융합된 세포가 실온에서 5분 동안 정치되게 한 다음, 150 x g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 이어서, 세포를 HAT 배지 [20% FBS, 5% 오리젠 (Origen), 25 ㎍/mL 젠타마이신 (시그마) 및 HAT (100 μM 하이포크산틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘 (시그마)이 보충된 글루타맥스™ (변형)가 있는 DMEM] 중에 재현탁화시키고, 약 2.25 ㎍/mL의 AF488 인간 CD27 (얀센 리서치 앤드 디벨롭먼트, 엘엘씨 (Janssen Research & Development, LLC))을 함유하는 메틸셀룰로스 배지 (스템셀 테크놀로지즈 (StemCell Technologies), 미디움디 (MediumD) 카탈로그 번호 03804) 또는 96-웰 평면 바닥 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 (코닝 # 3997)에 씨딩하였다. 플레이트를 7 내지 10일 동안 7% CO₂가 있는 가습 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 단일의 콜로니를 ClonepixFL을 사용한 또는 백색광 현미경 하의 스크리닝을 위하여 메틸셀룰로스 플레이트로부터 선택하였다.

실시예 3: 재조합 Mab의 생물활성

쥣과 항체 유래의 결합 도메인이 CD27에 결합하고, CD27의 특정 생물활성을 차단하는 능력을 하기에 기재된 바와 같은 다양한 시험관 내 검정을 사용하여 분석하였다.

고체상 EIA를 사용하여, 인간 CD27에 결합할 수 있는 항체에 대하여 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다. 플레이트 (넌크-맥시소르프 #446612)를 4℃에서 하룻밤 중탄산염 완충제 중의 4 ㎍/mL Fab 염소 항-huFc (잭슨 #109-006-098)로 코팅하였다. 세척 없이, 웰을 실온에서 1시간 동안 PBS 중 0.4% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) 200 μL로 블로킹하였다. 0.02% (w/v) 트윈 (Tween) 20을 함유하는 0.15 M 염수를 사용한 세척 후에, 0.4% BSA/PBS 중 50 μl의 huCD27-Fc를 실온에서 1시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 다시 세척한 후에, 50 μl의 희석되지 않은 하이브리도마 상청액을 실온에서 30분 동안 코팅된 플레이트 상에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3회 세척한 다음, 실온에서 30분 동안 1:10,000으로 희석된 염소 항-쥣과 Fc HRP (잭슨 # 115-036-071) 50 μL와 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 역가 평가를 위하여 상기 기재된 바와 같이 발색시켰다. 하이브리도마 Mab의 상대 결합능의 평가를 위하여, 단계 희석된 하이브리도마 상청액 (5 ㎍/mL의 출발 농도로 정규화)을 사용해, 맥시소르프 384 웰 플레이트 (넌크 464718)를 사용하여 유사한 검정을 수행하였다. 이러한 검정에 의해, 386개의 양성 하이브리도마가 확인되었다.

모든 386개의 CD27 특이적 하이브리도마를 IM-9 세포, 인간 CD70을 내인적으로 발현하는 것으로 관찰된 B-림프모구성 (lymphoblastoid) 세포주를 사용한 생화학 결합 검정을 사용하여 huCD70에 대한 huCD27의 결합을 억제하는 능력에 대하여 스크리닝하였다. 맥시소르프 플레이트 (VWR # 62409-314)를 250 나노그램 (ng)/mL의 재조합 인간 CD27/Fc (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 382-CD)로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 블로킹 완충제 (피어스 (Pierce), 카탈로그 번호 37543)로 블로킹한 다음, Ca++ 또는 Mg++ 부재 PBS, 0.01% 트윈-20을 함유하는 세척 완충제 I으로 세척하였다. 대조군 (hCD27에 대한 마우스 MAB, 알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 MAB382; 마우스 IgG1 아이소타입 대조군, 알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 MAB002; 마우스 IgG2a 아이소타입 대조군, 알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 MAB003)을 각 플레이트 상에서 포함시켰다. 50 uL/웰의 하이브리도마 시료 또는 대조군을 50 μL/웰의 수집된 IM-9 세포, 인간 B-림프모구성 세포주 (ATCC, CCL-159)와 혼합하고, 진탕시키지 않고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션의 마지막에, 플레이트를 세척 완충제 II로 세척하여, 모든 미결합 세포를 제거한 다음, 50 uL/웰의 셀 타이터 글로 (Cell Titer Glo) 시약 (프로메가 (Promega), 카탈로그 번호 G7571)으로 용해시켰다. 진탕시키면서 10분 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 엔비젼 (Envision) (퍼킨엘머 (PerkinElmer), 2102 멀티라벨 (Multilabel) 판독기)에서 판독하였다. 생성된 발광 신호는 존재하는 ATP의 양에 비례하며, CD27 결합에 의해 포획되는 웰에 존재하는 생 세포의 개수와 직접적으로 상관된다. 생화학 결합 검정의 결과에 기초하여, CD27 특이적 클론의 약 50%는 중화성이었다.

중화 클론 간의 중복을 없애기 위하여, 경쟁 결합 검정을 수행하여 항체를 경쟁 그룹으로 비닝 (bin)시켰다. 이러한 검정에서, 하이브리도마 상청액을 패널에서 각각의 양성 하이브리도마를 사용하여 포획 및 검출 시약 둘 모두로서 개별적으로 평가하였다. 서로 효과적인 포획/검출 시약을 형성하는 항체는 아마도 CD27 단백질 상의 공간 분리된 에피토프를 인식하여, 둘 모두의 항체가 동시에 표적 단백질에 결합하게 한다. 전체 패널에 걸쳐 유사한 활성 패턴을 나타내는 클론의 그룹은 아마도 유사한 에피토프에 결합할 것이다. 따라서, 상이한 그룹으로부터 클론을 선택하여, 상이한 에피토프를 인식하는 항체를 제공한다. 약술하면, 384 웰 넌크 맥시소르프 플레이트 (464718)를 4℃에서 하룻밤 코팅 완충제 중 염소 항-마우스 Fc (JIR115-005-071)로 코팅하였다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 30분 동안 PBS 중 0.4% BSA로 블로킹하였다. 이러한 단계 및 모든 이후의 단계에서, 플레이트를 PBS, 0.02% 트윈-20으로 세척하였다. 그 다음, 20 uL의 상청액 (순수 상청액을 초기 스크리닝을 위해 사용하였으나, 서브클론을 다시 스크리닝을 위해서는, 상청액을 2 ug/ml의 mAb로 정규화시킴)을 제공한 한 열의 각 웰 (상청액당 하나의 열)을 대조군 (마우스 항-huCD27, 알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 MAB382; 마우스 아이소타입 대조군 카탈로그 번호 555439, 벡톤-딕킨슨 (Becton-Dickenson))과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후에, 25 uL의 미표지 Hu CD27-ECD-His-태그를 0.3 (또는 정규화된 농도에 대하여 0.8) ㎍/ml로 PBS + 10% 마우스 혈청 (바이오레클라메이션 (Bioreclamation) 마우스 혈청 CD-1 lot#MSEBREC.18565) 중에 제조하고, 모든 웰에 첨가한 다음, 실온에서 30분 인큐베이션시킨 다음, 세척하였다. 각 상청액을 단일의 컬럼에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 하기와 같이 제조된 혼합물 25 uL와 함께 인큐베이션시켰다: (150 uL의 1:1000 염소 항-마우스 Fc HRP를 각각 1000 uL의 상청액 (일차 스크리닝용)와, 또는 2 ug/mL로 조정된 상청액 (서브클론의 재스크리닝용) 600 uL당 1:2000의 90 uL과 혼합함으로써 상청액을 염소 항-마우스 Fc HRP (잭슨 115-036-008)와 사전 인큐베이션시킴). 실온에서 30분 인큐베이션시킨 후에, mL당 200 μL의 100% 정상 마우스 혈청을 첨가하고, 실온에서 추가 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 다음, 실온에서 15분 동안 100 uL/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액 (0.1 M 시트르산 및 0.2 M 인산나트륨, 0.01% H2O2 및 1 mg/mL OPD)과 함께 인큐베이션시켰다. 기질 발색을 25 uL의 4N 황산의 첨가에 의해 중단시키고, 자동화 플레이트 판독기를 사용하여 흡광도를 490nm에서 측정하였다. 이러한 비닝 검정에 의해, huCD27 항원 상의 비중첩 결합 부위를 인식하는 3개의 그룹을 확인하였다. 모든 3개의 그룹으로부터 선택된 항체를 항체 생성, 정제 및 기능 검정에서의 추가의 시험을 위해 증량시켰다.

세포 신호전달의 억제

CD27로의 CD70의 결합에 의해, 전사 인자, NF-kβ의 다운스트림 활성화를 야기하는 신호전달이 유도된다. NF-kβ 리포터 검정을 추가의 항체 특성화를 위해 확립하였다. 검정을 2가지 방식으로 시행하였다: (1) CD70 유도된 CD27 활성화의 중화에 의하여 항체 길항작용 (antagonism)을 평가하는 방식, 및 (2) CD70 라이게이션의 부재 하의 CD27의 활성화에 의하여 항체 효능 (agonism)을 평가하는 방식. HEK-293F 세포를 NF-kβ 프로모터의 제어 하에 인간 CD27 및 루시퍼라제 구축물 둘 모두를 포함하는 DNA 총 36 ng으로 트랜스펙션시켰다. HEK-293F 트랜스펙턴트 (transfectant)를 96-웰 플레이트에서 40 uL 프리스타일 (Freestyle) 배지 (집코) 중에 웰당 5×10⁴개 세포를 플레이팅하였다. CD27-중화 하이브리도마 mAb의 희석물을 1:3 희석을 사용하여 50 ug/mL의 최종 농도로 검정 플레이트에 프리스타일 배지 (집코) 중에 첨가하고, 플레이트를 37℃ (95% O₂/5% CO₂)에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. CD70:CD27 신호전달을 중화시키는 하이브리도마 mAb의 능력을 시험하기 위하여, 정기적으로 조사된 (4000 rad) HEK-293E CD70 에피솜 세포를 CD27 트랜스펙턴트 세포의 개수의 20%로 검정 플레이트에 첨가하였다. 하이브리도마 mAb의 효능제 활성을 시험하기 위하여, CD70 에피솜 세포의 첨가를 생략하였다. 검정 플레이트를 37℃ (95% O₂/5% CO₂)에서 하룻밤 인큐베이션시키고, 제조처의 지침에 따라 스테디-글로 (Steady-Glo)® 루시퍼라제 어세이 시스템 (Luciferase Assay System) (프로메가)을 사용하여 발색시켰다. CD70 자극제의 부재 하에 CD27 수용체의 유의미한 용량 의존적 효능 활성화를 야기하지 않고, CD70-매개의 CD27 신호전달을 용량 의존적으로 차단하는 4개의 CD27-중화 하이브리도마 mAb, C2177, C2186, C2191 및 C2192를 추가의 특성화를 위해 선택하였다. NF-kβ 리포터 유전자 검정에서 CD27로의 IM-9 세포 결합 및 CD70-매개의 신호전달의 차단에 대한 IC₅₀은 표 1에 이들 4개의 항체에 대하여 요약되어 있다. NF-kβ 리포터 유전자 검정에서 효능제 활성은 시험한 최대 농도의 항체에서, CD70 자극제의 부재 하에, 관계없는 아이소타입 대조군 항체 (랫트 EMP 단백질에 대한 마우스 IgG)에 비한 CD27 신호전달의 배수 증가로서 나타난다.

CD27에 대한 친화성

25℃에서 용해성 단량체 CD27에 대한 항체 C2177, C2186, C2191 및 C2192의 K_D를 비아코어로 측정하였으며, 표 1에 기록되어 있다. 검정을 비아코어 3000 (비아코어, 인코포레이티드) 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기기에서 수행하였다. 시료를 0.005% 계면활성제 (폴리소르베이트 20)를 포함하는 둘베코 (Dulbecco)의 인산염 완충 염수 pH 7.4 중에 제조하였다. 염소 항-마우스 Fc 특이적 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러터리즈 제품 번호 115-005-071)를 카르복시메틸 덱스트란 코팅 금 표면 (CM-5 칩, 비아코어)에 공유 부착시켰다. 고정화 전에, 칩을 전처리 사이에 탈이온수를 주입하면서 50 mM NaOH, 100 mM HCl 및 0.1% 나트륨 도데실 설페이트로 전처리하였다. 항체를 10 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 4.5로 희석시키고, 아민-커플링 화학물질에 대한 제조처의 지침을 이용하여 칩의 카르복시메틸화 덱스트란 표면에 커플링시켰다. 표면 상의 남아있는 반응기를 에탄올아민-HCl을 이용하여 불활성화시켰다. mAb를 Fc 도메인을 통해 센서 표면 상에 포획하였다. 농도를 증가시키면서 (0.6-150 nM, 4-배 단계 희석), 주입한 인간 CD27 ECD의 회합을 3분 동안 모니터링하고, 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 기준선으로의 포획 표면의 재생을 2회의 100 mM 인산의 3초 펄스를 사용하여 최적화시켰다. 데이터를 스크러버 소프트웨어 (Scrubber software), 버전 1.1g (바이오로직 소프트웨어 (BioLogic Software))를 사용하여 처리하였다. 데이터의 이중 참조 감산을 수행하여, 신호에 대한 완충제 기여 및 기기 노이즈에 대하여 보정하였다. 처리된 데이터의 역학 분석을 비아이밸류에이션 (Biaevaluation) 4.0.1 소프트웨어 (스웨덴 웁살라 소재의 지이 헬쓰케어 바이오-사이언스즈 (GE Healthcare Bio-Sciences))를 사용하여 수행하였다. 결합 프로파일을 CD27의 1가 결합을 나타내는 1:1 결합 모델에 의해 설명하였다.

세포 증식의 억제

항-CD3 + 항-CD28 항체가 있는 배양물에서 준최적으로 활성화된 T-세포의 증식은 T-세포 상에서 발현된 CD27의 CD70 라이게이션에 의해 향상된다. 4가지 쥣과 중화 항체를 CD70의 존재 하에 T-세포 증식을 억제하고, CD70의 부재 하에 증식을 유도하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. 동결 CD4+ T 세포를 올셀즈, 엘엘씨 (AllCells, LLC)로부터 구입하였다. 세포를 해동시키고, 10% FBS, 1% l-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 IMDM 배지에 두었다. 세포를 플레이팅하기 전에, 항-CD3 (OKT3) 항체를 4℃에서 하룻밤 PBS 중 1 ug/mL로 U-바닥 플레이트에 코팅시켰다. 세포를 계수하고, 1×10⁶개 세포/mL의 농도가 되게 하고, 1×10⁵개 세포/웰로 플레이팅하였다. 용해성 항-CD28을 웰당 1 ug/mL로 이차 활성화 신호로서 첨가하였다. 인간 CD70 또는 단독의 벡터 (모의)를 트랜스펙션시킨, 조사된 (6000 rad) HEK 세포를 적절한 웰에 2×10⁴개 세포/웰 (20%)로 첨가하였다. 세포를 3일 동안 자극시키고, 0.9 uCi 티미딘 [메틸-3H]을 모든 시료 웰에 첨가하고, 세포를 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 자극 4일째에, 세포를 PE 필터메이트 하비스터 (Filtermate Harvester)를 사용하여 필터 플레이트 상으로 수집하였다. 플레이트가 건조되게 하고, 30 uL의 마이크로신트 (MicroScint)TM-20을 모든 시료 웰에 첨가하였다. 플레이트를 PE 탑카운트 (TopCount) NXT 상에서 판독하고, 수집된 데이터는 CPM으로 존재하였다. 항체 C2177은 CD70 매개의 T-세포 증식의 용량 의존적 억제 및 CD70의 부재 하의 매우 약한 고유 효능제 활성을 보여준다 (도 1). 유사한 결과가 C2186, C2191 및 C2192 항체에 대하여 관찰되었다. 이들 항체에 대한 IC₅₀ 및 최대 억제%는 표 2에 기록되어 있다. 항체 중 어느 것도 CD70 라이게이션의 부재 하에 지속적인 증식 자극을 보이지 않았으며, 이는 고유 효능제 활성의 부재를 나타낸다.

또한, C2177, C2186, C2191 및 C2192 항체는 CSFE 검정에서 측정시 CD70-매개의 T-세포 증식의 용량 의존적 억제를 보였으며, CD70 자극제의 부재 하에 증식에 대한 효과가 없었다. 동결 CD3+ T 세포를 올셀즈, 엘엘씨로부터 구입하였다. 세포를 해동시키고, 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 IMDM 배지에 두었다. 세포를 2.5 mM CFSE (인비트로겐)로 사전-표지하고, FBS로 켄칭하고, T 세포 배지로 세척하였다. CFSE는 세포로 수동 확산되고, 세포내 아민과의 결합시에 고도로 형광성이 되는 염료이다. 세포 분열 시에, 각각의 딸 세포는 모 세포의 CFSE 표지의 절반을 함유할 것이며, 이에 따라, 상이한 CFSE 세기를 갖는 세포의 수를 추적함으로써 세포 증식을 모니터링할 수 있다. 세포를 1 × 10⁶개 세포/mL의 농도가 되게 하고, 1×10⁵개 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 플레이팅하기 전에, 항-CD3 (OKT3) 항체를 4℃에서 하룻밤 PBS 중 0.5 ug/mL로 U-바닥 플레이트로 코팅시켰다. 용해성 항-CD28을 이차 활성화 신호로서 웰마다 0.1 ug/mL로 첨가하였다. 인간 CD70 또는 단독의 벡터 (모의) 중 어느 하나를 트랜스펙션시킨, 조사된 (6000 rad) HEK 세포를 적절한 웰에 2×10⁴개 세포/웰 (20%)로 첨가하였다. 세포를 4일 동안 자극시키고, FACS 분석에 의해 분석하여, 상이한 CFSE 표지 세기 수준을 함유하는 분열된 세포를 계수하였다.

형질모세포 분화의 억제

또한, CD27-중화 하이브리도마 mAb를 일차 인간 B-세포를 사용하여 형질모세포 분화 검정에서 시험하였다. 정상의 공여자의 말초 혈액 (올셀즈로부터 수득)으로부터 음성 선택된 CD19+ 인간 B 림프구를 웰당 10⁵개 B 세포로 96-웰 플레이트에서, 1 ug/mL 항-CD40 항체 (클론 MAB89, 아브캄 (Abcam)) 및 100 ng/mL 인터류킨 21 (인비트로겐) 또는 1 ug/mL의 용해성 인간 재조합 CD40 리간드 및 2 ug/mL의 '리간드에 대한 인핸서' (둘 모두 알렉시스 바이오케미칼즈 (Alexis Biochemicals)) 및 100 ng/ml 인터류킨 21의 존재 하에 6일 동안 배양하였다. CD27-중화 하이브리도마 또는 아이소타입 대조군 항체를 2×10⁴개의 조사된 (6000 rad) CD70-발현 HEK 293 세포 또는 모의-트랜스펙션된 HEK 293 세포의 존재 또는 부재 하에 첨가하였다. CD27-중화 하이브리도마 mAb 및 매칭 아이소타입 대조군을 25, 2.5 및 0.25 ug/mL로 사용하였다. 6일에, 세포 시료를 유세포분석법에 의해 분석하고, 형질모세포의 분획을 전방 산란/high, IgDminus, CD38bright, CD20low로 확인하였다. 모의-트랜스펙션된 세포를 함유하는 상응하는 B-세포 배양물 중의 형질모세포 빈도로 정규화된 하이브리도마 mab 및 CD70 발현 세포를 함유하는 B-세포 배양물 중의 형질모세포 빈도로서 CD27-중화 mab의 효과를 계산하였다. 2.5 ug/mL의 C2177, C2186, C2191 또는 C2192 mAb에 의한 억제 백분율은 표 2에 나타나 있다. CD70 자극제의 부재 하에서 이들 mAb 중 어느 것에 대해서도 효능제 활성이 관찰되지 않았다.

실시예 4: 에피토프 맵핑 및 그룹화

초기 비닝을 더욱 신중하게 평가하기 위하여, 정제된 중화 mAb의 일부 및 CD27-중화 항체, MAB 382 (알앤디 시스템즈)를 사용하여 경쟁 검정을 수행하였다. 약술하면, 웰마다 5 μl (10 ㎍/mL)의 CD27-Fc 키메라 단백질 (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 382-CD)을 실온에서 2시간 동안 MSD 하이바인드 (HighBind) 플레이트 (미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메소 스케일 디스커버리 (Meso Scale Discovery)) 상에 코팅하였다. 5% MSD 블로커 A 완충제 (미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메소 스케일 디스커버리)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.1 M HEPES 완충제, pH 7.4를 사용하여 3회 세척한 다음, 상이한 농도의 경쟁자 항체 (1 nM 내지 2 uM)와 10 nM의 표지된 CD27 항체의 혼합물을 첨가하였다. 항체를 MSD 설포-태그 (Sulfo-Tag)™ NHS-에스테르, 단백질의 일차 아민기에 커플링되어 안정한 아미드 결합을 형성하는 아민-반응성 N-하이드록시석신이미드 에스테르로 표지하였다. 온건하게 진탕시키면서 실온에서 2시간 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 0.1M HEPES 완충제 (pH 7.4)를 사용하여 3회 세척하였다. MSD 판독 (Read) 완충제 T를 증류수 (4배)로 희석하고, 150 μL/웰의 부피로 제공하였다. 플레이트를 MSD 마이크로플레이트의 전극 표면에서 개시되는 전기화학적 자극 시에 발광하는 설포-태그 표지를 통하여 전기화학발광을 검출하는 섹터 이미저 (SECTOR Imager) 6000을 사용하여 분석하였다.

경쟁 연구에 의해, 표 3에 약술된 항체에 대한 3개의 경쟁 그룹을 정의하여, 초기 비닝 검정을 확인하였다. C2179, C2192 및 MAB382는 하나의 그룹을 구성하며; C2177, C2182, C2186 및 C2193은 제2 그룹이고; C2191은 개별 그룹을 구성한다.

실시예 5: X-선 결정학에 의한 에피토프 및 파라토프 확인

항체 C2177 및 C2191의 세부 에피토프 및 파라토프를 트라이머 복합체로서 그들의 상응하는 Fab와 CD27 ECD 단편 (잔기 1 내지 101)의 공결정화 및 X-선 결정학에 의한 구조 결정에 의해 결정하였다. C2177 Fab 및 C2191 Fab의 His-태그된 키메라 버전 (마우스 가변 도메인, 인간 불변 도메인)을 HEK293 세포에서 발현시키고, 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 인간 CD27의 His-태그된 ECD 단편 (잔기 1 내지 101)을 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. CD27을 1:1.25:1.25의 몰비로 과잉의 Fab와 혼합함으로써 삼원 복합체 CD27:C2177 Fab:C2191 Fab를 제조하였다. 복합체를 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 복합체화되지 않은 종으로부터 분리하고, 20 mM Tris pH 8.5, 250 mM NaCl 중에 12 mg/mL로 농축시켰다. 복합체의 결정화를 20℃에서 시팅 드롭 (sitting drop)에서의 증기 확산 방법에 의해 수행하였다. 복합체의 결정을 24% PEG 3350, 0.2 M 염화암모늄, 0.1 M 트리스 완충제, pH 8.5로부터 수득하였다. X-선 데이터 수집을 위하여, 20% 글리세롤이 보충된 결정화 용액을 함유하는 동결보호 용액에 결정 1개를 수 초 동안 침지시키고, 100 K에서 질소의 스트림에서 급속 동결시켰다. 0.25°-이미지마다 2분 노출과 함께 240° 결정 회전에 걸쳐 X-스트림 (X-Stream) 2000 크라이오쿨링 (cryocooling) 시스템 (리가쿠 (Rigaku)) 및 새턴 (Saturn) 944 CCD 검출기가 장착된 리가쿠 마이크로맥스 (Rigaku MicroMax)TM-007HF X-선 발생기에서 회절 데이터를 수집하고, 프로그램 XDS (문헌 [Kabsch W. 2010. Acta Crystallogr. D66:125-132])로 처리하였다. 결정은 하기의 단위 셀 파라미터가 있는 단사 정계 공간군 P21에 속한다: a = 141.1 Å, b = 53.0 Å, c = 143.4 Å, α = 90°, β = 112.2°, γ = 90°.

삼원 복합체의 결정 구조를 3.5 Å 해상도에서 결정하고, 26%의 결정학적 R-지수로 개선시켰다. C2177 및 C2191의 Fab는 공간적으로 구별되는 비중첩 에피토프에서 CD27에 결합한다 (도 2). C2177 Fab는 CD27의 N-말단 (세포 표면에서 원위) 부분에 결합한다. 에피토프는 700 Å2를 커버하며, 9개의 잔기를 포함한다: K5, S6, P8, H11, W13, G16, K17, H36, R37 (도 3). 파라토프는 항원과 접촉하는 (4 Å 이내) 항체 잔기로서 정의된다. C2177 파라토프는 VL 유래의 5개 잔기 (Y31, Y36, Y53, N57, N96) 및 VH 유래의 9개 잔기 (S31, W33, Y52, D55, D57, Y101, Y102, D104, Y105)를 포함한다 (도 3). 모든 6개의 CDR은 항원 인식에 수반된다. H36 및 R37은 에피토프의 중심 잔기이다. 그들은 VL의 Y31 및 VH의 Y102에 대해 포개지며; H36은 또한 VH의 D104에 염 가교를 형성한다.

C2191 Fab는 '측' 표면에서 CD27에 결합하며 (도 2), 표면의 800 Å2를 커버한다. 에피토프는 10개 잔기를 포함한다: F28, D43, P44, I46, P47, G48, V49, H60, S63, H66. C2191 파라토프는 VL 유래의 7개 잔기 (Y34, F36, Y53, L54, R96, L98, W100) 및 VH 유래의 8개 잔기 (S31, Y32, Y50, N57, Y59, R100, G101, N102)를 포함한다 (도 4). 항체-항원 상호작용은 CD27의 잔기 44 내지 49와, VL CDR에서의 소수성 패치 간의 소수성 상호작용이 우세하다.

C2177 및 C2191 에피토프의 상이한 위치는 이들 항체의 상이한 메커니즘 작용을 시사한다. C2191은 CD27의 '측' 표면 상의 중첩 에피토프를 위해 아마도 CD70 ECD와 직접적으로 경쟁할 것이다. 대조적으로, C2177 항체는 동일한 에피토프를 위해 경쟁하지 않고, 오히려 CD27 및 CD70을 갖는 세포의 접근을 방지한다. 이러한 관찰은 C2191이 CD27로의 용해성 CD70 ECD의 결합을 방지하는 한편, C2177은 그렇지 않다는 사실에 의해 뒷받침된다.

실시예 6: 인간 림프구 반응의 항체 조절

면역 결함 마우스 모델, NOD/SCID-IL2Rγ^null (NSG) 마우스를 개발하여, T-세포 반응에 의한 인간 면역계 대조군의 양상을 연구하였다 (문헌 [Markus G Manz & James P Di Santo Renaissance for mouse models of human hematopoiesis and immunobiology Nature Immunology 10, 1039 - 1042 (2009)]). 인간 PBMC의 면역-약화 (NSG) 마우스로의 입양 전달을 사용하여, 인간 세포 생착 및/또는 증식에서의 항-CD27 항체의 효과를 평가하였다. 모델은 항체 생성 및 T-세포 매개의 반응에 대한 인간 CD27의 표적화의 효과의 평가를 가능하게 한다.

항체 C2177 및 C2191을 세포 전달 시에 투여한 다음, 3주 동안 1주에 2회 투여하였다. 21일에, 마우스를 희생시키고, 세포를 혈액 및 비장으로부터 정제하고, 이후에 유세포분석법으로 특성화시켰다. CTLA4-Ig (오렌시아 (Orencia), BMS)를 면역 억제를 위한 양성 대조군으로서 포함시켰다. 혈액 및 비장 시료 중의 인간 CD45⁺ 세포의 존재를 평가함으로써, 인간 세포 생착/증식을 측정하였다.

마우스를 면밀히 모니터링하고, 동물 복지 지침에 따라 XGVH 증후에 기초하여 희생 시간을 결정하였다. 항-CD27 치료의 효과를 평가하기 위해 사용되는 실험 판독치에는 다음의 것이 포함된다: 체중 (주 2회), 관찰된 XGVH의 징후 (주 2회), 예를 들어, 1 내지 5 점수 시스템을 사용한 자세, 활동 수준, 그루밍 (grooming), 피부 병변 (특히, 눈과 귀 주위), 인간 세포 서브셋의 절대 계수 및 (1) 주입된 인간 PBMC, (2) 마우스 PB (1회/주) 및 (3) 비장 및 골수의 유세포 분석을 사용한 활성화 상태; ELISA를 사용한 혈청, 비장 및 BM 중의 총 인간 Ig, IgM 및 IgG의 결정, 및 표적 기관, 예를 들어, 간, 신장, 폐 및 비장에서의 인간 침윤 수준을 결정하기 위한 희생 시의 조직학 또는 면역조직화학.

처리군은 하기와 같았다:

1. PBMC (마우스당 2000만 내지 4000만개 세포, 복강내)

2. PBMC + CTLA4-Ig (10 mg/㎏)

3. PBMC + 아이소타입 대조군 항체, 3주 동안 2회/주

4. PBMC + 항-CD27 항체, 3주 동안 2회/주

10 mg/㎏ 항-CD27 mAb, C2177 및 C2191 (인간 IgG₄ (ala/ala, ser->pro) 스캐폴드에서 키메라화된 하이브리도마 항체)을 투여한 마우스는 혈액 또는 비장 시료로부터 분리된 PMBC 중의 아이소타입 대조군 또는 단독의 PMBC와 비교시 통계적으로 유의미하게 더 적은 인간 CD45⁺ 세포를 가졌다.

실시예 7: C2177 및 C2191 MAB의 인간 프레임워크 조정

항체 C2177 및 C2191로부터의 항원 특이성을 인간 FR로 전달하는데 사용되는 항원-결합 부위 및 영역을 문헌 [Raghunathan G. US20090118127 A1, 2009]에 약술된 바와 같이 다시 분류하였다. 약술하면, 항원-결합 영역을 다양한 용어를 사용하여 정의하였다 (문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13: 1619-1633, 2008]에서 검토). 용어 "상보성 결정 영역 (CDR)"은 서열 가변성을 기반으로 한다 (문헌 [Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970]). V_H에 대하여 3개 (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3) 및 V_L에 대하여 3개 (L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991])의 6개의 CDR이 존재한다. "초가변 영역", "HVR" 또는 "HVL"은 문헌 [Chothia and Lesk (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987)]에 의해 정의된 바와 같이 구조가 가변적인 항체 가변 도메인의 영역을 말한다. VH에 대하여 3개 (H1, H2 및 H3), 그리고 VL에 대하여 3개 (L1, L2 및 L3)의 6개의 HVR이 존재한다.

HFA 방법에서, 비인간 항체의 특이성을 인간 FR (HFR)로 전달하기 위해 표적화된 영역은 V_H의 CDR-1에 상응하는 영역을 제외하고 문헌 [Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)]에 의해 정의된 바와 같은 CDR이다. 이러한 이유로, CDR 및 HVL의 조합 (연장된 V_H의 CDR-1)을 비인간 항체로부터 인간 FR로 전달한다 (표 30, 31, 34, 35에 제공된 바와 같음). 또한, 전달되는 CDR-H2가 보다 짧은 변이체 (Kabat-7로 표기, 문헌 [Raghunathan G. US20090118127 A1, 2009])를 생성하고 시험한다.

인간 FR 선택.

항원 결합 부위 내에 포함되지 않는 V 영역 내의 영역으로서 정의되는 인간 FR을 기능성 인간 생식계열 IGHV, IGKV, IGKJ 및 IGHJ 유전자의 레퍼토리로부터 선택하였다. 인간 생식계열 유전자 서열의 레퍼토리를 IMGT 데이터베이스를 검색하고 (문헌 [Kaas, et al., Nucl. Acids. Res. 32, D208-D210, 2004]; 문헌 [Lefranc M.-P et al., Nucl. Acids Res., 33, D593-D597, 2005]), 2007년 10월 1일자의 모든 "01" 대립유전자를 편집함으로써 수득하였다. 이 편집물로부터, 중복 유전자 (아미노산 수준에서 100% 동일함) 및 쌍을 형성하지 않은 시스테인 잔기를 갖는 유전자를 편집물에서 제거하였다.

HFR에 대한 인간 서열의 초기의 선택은 FR-1 내지 3, 및 H-CDR-1 및 H-CDR-2를 포함하는 전장의 마우스 V_H 영역에 대한 인간 IGHV 생식계열 유전자의 서열 유사성을 기초로 하였다. 다음 단계에서, 선택된 인간 서열을 CDR의 길이, 및 마우스와 인간 서열의 CDR 간의 서열 유사성 둘 모두를 고려한 점수를 사용하여 순위를 정하였다. 표준 돌연변이 매트릭스, 예를 들어, BLOSUM 62 치환 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 10915-9, 1992])를 마우스 및 인간 서열의 CDR의 정렬의 점수화를 위해 사용하고, CDR 루프 내에 삽입 및/또는 결실이 존재한다면 큰 페널티를 적용하였다. FR-4를 IGHJ 생식계열 유전자 (문헌 [Kaas, et al., Nucl. Acids. Res. 32, D208-D210, 2004]; 문헌 [Lefranc M.-P et al., Nucl. Acids Res., 33, D593-D597, 2005])와 마우스 항체 C2177 및 C2191 서열의 서열 유사성에 기초하여 선택하였다. 유사한 절차를 사용하여 V_L을 위한 인간 FR을 선택하였다. IGVK, 생식계열 유전자를 FR 1-3 및 L-CDR 1-3을 선택하는데 사용하였다. IGJK 생식계열 유전자를 FR-4를 선택하는데 사용하였다.

서열 기준에 더하여, Fv 단편에 대한 3D 상동성 모델을 아셀리스, 인코포레이티드 (Accelrys, Inc.)로부터의 프로그램 모음에서 모델러 (Modeler) (문헌 [Sali and Blundell. J. Mol. Biol. 234: 779,1993])를 사용하여 구축하였다. CDR 특성화 및 개발성 책임의 평가를 포함하는 HFR 변이체의 분석을 위하여 모델을 사용하였다. HFR 변이체의 선택을 위한 추가의 고려사항은 노출된 메티오닌 및 트립토판 잔기의 개수를 최소화하고, 잠재적 N-글리코실화 부위를 제거하고, 가상에서 가장 높은 발현 프로파일을 갖는 인간 생식계열에 유리하게 하는 것이었다 (문헌 [de Wildt, J. Mol. Biol. 185: 895, 1999]).

C2177의 패쓰 (path) 1 프레임워크 조정 및 최적화를 위하여, 6개의 V_H 및 4개의 V_L HFR 변이체를 라이브러리에 포함시켰다. V_H 및 V_L HFR 변이체를 조합 방식으로 쌍을 형성하여, 24개의 HFR 변이체 쌍 + 모든 HFR 변이체를 C2177의 대응 V 영역과 쌍을 형성시킨 10개의 대조군 + 모 C2177 그 자체를 제공하여, 총 35개의 조합물을 제공하였다. 유사하게, C2191에 대하여, 5개의 V_H 및 4개의 V_L HFR 변이체를 조합 방식으로 쌍을 형성시켜, 총 30개의 변이체에 있어서, 20개의 HFR + C2191의 대응 V 영역과 쌍을 형성시켜 모든 HFR V 변이체를 조합한 9개의 대조군 + 모 C2191 그 자체를 제공하였다. 선택된 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 표준 방법을 사용하여 재조합하여, 완전한 MAb와 인간 IgG1 및 카파 불변 영역을 조립하였다. M40으로 표기되는, 얻어진 C2177의 참조 키메라 항체는 가변 영역 H7 및 L18로 이루어진다. M41로 표기되는, C2191의 상응하는 키메라 항체는 가변 영역 H10 및 L20으로 이루어진다. mAb를 48-웰 플레이트에서, HEK 293E 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 트랜스펙션 96시간 후에, 배양물로부터의 상청액을 발현 및 결합 활성에 대하여 시험하였다. 분비된 mAb의 발현 수준을 옥텟 (Octet) 기술을 사용하여 평가하여, 프로테인 에이 바이오센서 (Protein A biosensor)에 결합하는 항체의 비율을 측정하였다. 발현 수준을 항체 농도가 알려진 표준 시료와의 비교에 의해 정량화하였다. 100 ug/ml에서 시작하여, 동일한 아이소타입의 항체의 1:2 단계 희석으로 이루어진 8-점 표준 곡선을 만들었다. 바이오센서를 폐배지에서 10분 동안 수화시키고, 표준물질 및 미지의 시료의 결합률을 2분 동안 측정하였다. 데이터를 5가지 파라미터 가중 용량-반응 식 및 초기 기울기 결합률 알고리즘을 사용하여 분석하였다. 발현이 1 ug/ml 초과인 시료를 폐 배지를 사용하여 1 ug/ml로 희석하고, 단일점 ELISA를 사용하여 스크리닝하였다. 이러한 ELISA를 위하여, 96 웰 블랙 맥시소르프 (black maxisorp) 플레이트를 탄산염-중탄산염 완충제, pH 9.4 중 희석된 3ug/ml 염소 항 인간 IgG FC 50uL로 4℃에서 하룻밤 코팅한 다음, 세척 완충제 (0.05% 트윈-20이 있는 PBS)로 3회 세척하고, 300 μl의 스타팅블록 (StartingBlock) (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific)) 용액으로 1시간 동안 블로킹한 다음, 이전과 같이 세척하였다. 시료 또는 표준물질을 폐배지에서 100 ng/ml로 희석하고, 50 ul를 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 검정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 검정 완충제 (1% FBS 및 0.05% 트윈-20이 있는 PBS) 중에 희석시킨 60 ng/ml의, His 태그가 있는 인간 CD27 ECD를 웰당 50 ul로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 분석 완충제 중에 1:2000으로 희석시킨, 퀴아젠 (Qiagen) 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 펜타-his를 웰당 50 ul로 첨가하고, 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비엠 케미룸 서브스트레이트 (BM ChemiLum Substrate) (비엠 케미룸 (BM Chemilum), POD, 로슈 (Roche))를 제조처의 지침에 따라 혼합하고, 50 ul를 최종 세척 후에 플레이트에 첨가하였다. 10분 후, 플레이트를 퍼킨 엘머 엔비전 판독기에서 판독한다.

C2177 조합 라이브러리의 스크리닝의 결과에 의해, 모든 V-영역이 다양한 세기로 CD27에 결합하는 것으로 나타났다. 몇몇 HFR 변이체는 모 C2177보다 더 높은 결합 신호를 제공하는 한편, 다른 것들은 모체와 유사하거나 그보다 더 낮은 결합을 보였다. 모든 VL은 검출가능한 수준으로 항원에 결합하였으며, 허용가능하지만 모체보다 더 낮은 수준으로 발현되는 HFR 변이체의 결합에 영향을 미치지 않았다. C2177 HFR 항체 (VH, VL 조합) 중 24개는 1 ug/ml 초과의 CD27 결합 및 발현을 보였다.

C2191 조합 라이브러리의 스크리닝의 결과에 의해, 하나의 VH를 제외하고 모두가 다양한 신호로 CD27에 결합하는 것이 나타났다. 이러한 VH와의 쌍의 형성을 제외하고, 모든 VL은 CD27로의 결합을 보였다. 몇몇 HFR 변이체는 모 C2177보다 더 높은 결합 신호를 제공하는 한편, 다른 것들은 모체와 유사하거나 그보다 더 낮은 결합을 보였다. 17개 C2191 HFR 항체 (VH, VL 조합)에 의해, 1 ug/ml 초과의 CD27 결합 및 발현이 입증되었다.

ELISA에 의해 측정된 CD27에 대한 상대 결합 친화성에 기초하여, 15개의 C2177 및 11개의 C2191 변이체를 파일럿 규모 (pilot-scale)의 발현 및 정제를 위해 선택하였다. 750 ml의 부피에서, CHO-S 세포에서의 파일럿 규모의 발현을 일시적으로 행하였다. 수집한 상청액을 단백질 A 크로마토그래피를 통하여 정제하고, 정제된 단백질들을 그의 친화성 및 기능적 활성에 대하여 평가하였다.

HFR C2177 인간 MAb 변이체의 친화성을 프로테온 (ProteOn) XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템 (바이오라드)을 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. CD27 회합 및 해리율을 각각의 변이체에 대하여 측정하였다. 아민-커플링 화학물질에 대한 제조처의 지침을 사용하여, 염소 항-인간 IgG (Fc) 항체를 GLC 칩 (바이오라드)의 표면에 공유적으로 커플링시킴으로써 바이오센서 표면을 제작하였다. 대략 5,000 RU (반응 유닛)의 항체를 고정화시켰다. 역학 실험을 런닝 (running) 완충제 (PBS, 0.01% P20, 0.01% BSA)에서 25℃에서 수행하였다. 300 nM에서 시작하여 인간 CD27 ECD의 1:3 단계 희석물을 런닝 완충제에서 제조하였다. 약 350 RU의 mAb를 센서 칩의 각각의 채널 상에 포획하였다. 아이소타입-매치된 항체 대조군을 채널 6에 고정화시키고, 참조 표면으로 사용하였다. mAb를 포획한 다음, 30 uL/분에서 항원을 3분 주입한 다음 (회합 단계), 10분간 완충액을 유동시켰다 (해리 단계). 100 uL/분으로 0.85% 인산을 주입함으로써 칩 표면을 재생시켰다. 데이터를 기기 소프트웨어에서 처리하였다. 피분석물 주입에 대한 참조물질-감산된 곡선으로부터 완충제 주입에 의해 생성된 곡선을 감산함으로써, 데이터의 이중 참조 감산을 수행하였다. 전반적인 핏팅 (fit)을 사용한 1:1 랑무이르 (Langmuir) 결합 모델을 사용하여 데이터의 역학 분석을 수행하였다. 각각의 mAb에 대한 결과는 K_a (결합-속도), K_d (분리-속도), K_D (평형 해리 상수) 및 활성 백분율의 형식으로 보고되었다. C2177 HFR 변이체의 친화성은 모 M40 mAb와 유사하였으며, 모든 변이체에 대하여 K_D의 3배 미만의 변화를 보였다. 유사하게, HFR C2191 인간 mAb 변이체의 친화성은, 모 M41 mAb와 2배 미만의 차이를 보였다.

HFR 변이체의 생물활성을 루시퍼라제 리포터 검정에서 NFkB의 CD70-매개의 유도의 그들의 억제에 의해 측정하였다. HEK 세포를 NFkB 유도성 루시퍼라제 발현 벡터 pGL4-32-NFkB-Luc2 (프로메가) 및 CD27 발현 플라스미드 또는 빈 벡터로 트랜스펙션시키고, 프리스타일 발현 배지 (집코, #12338)에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 다음날, 세포를 웰당 50,000개 세포로, 40 uL 중에 96-웰 배양 플레이트에서 플레이팅하였다. 이어서, 40 uL 항체 또는 대조군을 30 ug/ml의 최종 웰 내의 농도에서 시작하여 1:3의 단계 희석을 사용하여 세포에 첨가하고, 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이러한 인큐베이션 동안, CD70 에피솜 세포를 자극을 위해 제조하였다. 약술하면, 부착 세포를 표준 세포 배양 기술을 사용하여 재현탁화시키고, 25 ug/mL의 마이토마이신 C와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켜, 세포 증식을 중단시켰다. 인큐베이션 후에, CD70+ 세포를 배지에서 세척하고, 희석하고, 40 uL를 웰당 10,000개 세포로 첨가하였다. 플레이트를 하룻밤 인큐베이션시켰다. 다음날, 스테디 글로 시약 (프로메가)을 제조처의 지침에 따라 제조하고, 웰마다 120 uL를 첨가하였다. 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 발광을 퍼킨 엘머 엔비젼 판독기에서 측정하였다. C2177 HFR 변이체의 IC₅₀은 서로, 그리고 M40 모 MAb와 유사하였으며, 이는 0.11 nM 내지 0.21 nM 범위이다. C2191 HFR 변이체의 IC₅₀은 또한 서로, 그리고 M41 모체와 유사하였으며, 이는 0.13 nM 내지 1.39 nM이었다.

친화성, 생물활성 및 생물물리학 특성을 고려하여, 친화성 성숙을 위하여, 가변 영역 H28 (서열 번호 111) 및 L35 (서열 번호 82)로 이루어진 C2177 변이체 M69, 및 가변 영역 H31 (서열 번호 131) 및 L42 (서열 번호 140)로 이루어진 C2191 변이체 M91을 선택하였다. M40 모체 및 그의 M69 HFR 변이체, 및 M41 모체 및 그의 M91 변이체에 대한, K_D, 정제 수율, 세포 배양 상청액에 대한 CD27 ECD로의 결합 ("ELISA"), 및 CD70에 의한 CD27 매개의 NFκβ 반응의 억제 (IC₅₀)의 요약은 표 4에 나타나 있다.

실시예 8: C2177 HFR MAB M69의 최적화

M69는 인간 CD27 ECD에 대하여 대략 1 nM의 친화성을 가지며, C2177, HFA 모 CD27M40과 동일한 CDR을 포함한다. M69의 최적화에는 친화성을 증가시키고, 과정 중에 도입되거나 확인된 PTM 부분을 제거하기 위하여 다수의 라이브러리가 수반된다.

실시예 9에 기재된 바와 같이, HFR에 대한 병행의 파지 디스플레이 라이브러리 방법 및 C2177의 최적화에 의해 CDR-H2의 위치 52a에서 프롤린에서의 변화가 확인되었다. 이러한 위치는 라이브러리 설계에서 무작위화되지 않았다. C2177 및 C2191 Fab와 CD27의 공결정 (실시예 5)에 의해, P52a가 항원 결합에 직접 수반되지 않음을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 이러한 위치에서의 돌연변이는 CDR-H2 루프 입체형태를 변경시킬 수 있으며, 주변의 잔기 D27에 의해 CD27과의 더욱 최적의 상호작용을 가능하게 한다. 따라서, 라이브러리를 NNK 돌연변이유발을 사용하여 P52a 및 그의 주변 잔기 Y52, G53 및 D54를 무작위적으로 달라지게 하도록 설계하였다 (라이브러리 C27H28L2). 또한, 패쓰 2 최적화에서, CDR-L1 내의 Y32에서 F로의 돌연변이에 의해 개선된 결합이 나타났다. 따라서, Y32와 동일한 구조면에 놓여 있는 잔기 Y30a, D30d, A50의 변화와 함께, Y32의 무작위적 변화가 있는 제2 라이브러리를 설계하였다 (라이브러리 C27L35L2).

또한, 완전한 CDR-H3 및 CDR-L1 루프를 변화가 제한된 라이브러리를 사용하여 평가하였다. 표 5 및 6은 이들 라이브러리의 설계를 보여준다.

Fab 라이브러리를 WO2009/085462호, 문헌 [Shi et al, J Mol Biol 397: 385-396 (2010)] 및 문헌 [Tornetta et al. J Immunol Methods 360: 39-46 (2010)]에 기재된 바와 같이 pIX 파지 Fab 디스플레이 시스템에서 구축하였으며, 제한 효소 부위에 대해서는 변형을 최소로 하였다. 이들 라이브러리를, 보다 느린 분리-속도 또는 보다 빠른 결합-속도에 대하여 선택함으로써 친화성을 증가시키는 것에 관한 WO2009/085462호 및 문헌 [Shi et al, J Mol Biol 397: 385-396 (2010)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있는 패닝 계획에 따라, 비오티닐화 CD27-ECD에 대하여 패닝시켰다. 파지를 헬퍼 파지 감염에 의해 생성하였다. 결합제를 비드의 첨가에 의해 회수하여 비드/항원/파지 복합체를 형성하였다. 최종 세척 후, 파지를 기하급수적으로 성장 중인 TG-1 에스케리키아 콜라이 세포의 감염에 의해 구제하였다. 파지를 다시 생성하고, 추가의 라운드의 패닝으로 처리하였다.

후속 스크리닝을 위하여, DNA를 파지 패닝 라운드의 글리세롤 스톡으로부터 제조하고, pIX 유전자를 NheI/SpeI 분해에 의해 잘라냈다. 라이게이션 후에, DNA를 TG-1 세포로 형질전환시키고, LB/아가 (Agar) 플레이트에서 하룻밤 성장시켰다. 다음 날, 콜로니를 골라내고, 하룻밤 성장시키고, 배양물을 (i) 콜로니 PCR 및 V-영역의 시퀀싱, 및 (ii) Fab 생성의 유도에 사용하였다. Fab 생성에 있어서, 하룻밤 배양물을 새로운 배지에서 10 내지 100배 희석시키고, 37℃에서 5 내지 6시간 동안 성장시켰다. Fab 생성은 IPTG를 함유하는 신선한 배지의 첨가에 의해 유도하였으며, 배양물을 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 다음 날, 배양물을 스핀다운시키고 (spun down), 용해성 Fab 단백질을 함유하는 상청액을 Fab ELISA에 사용하였다. ELISA를 위하여, 용해성 Fab 단백질을 폴리클로널 항-Fd (CH1) 항체에 의해 플레이트로 포획하였다. 세척 및 블로킹 후에, 비오티닐화 인간 CD27 ECD를 0.2 nM 농도로 첨가하였다. 이 농도는 모 Fab의 결합 백분율로서 정의되는 Fab 변이체의 순위가 정해지게 하며, 여기서, 모든 플레이트에서 대조군으로서 존재하는 모 Fab는 100% 결합으로서 정의된다. 바이오티닐화 CD27 ECD를 HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘에 의해 검출하고, 플레이트 판독기에서 화학발광을 판독하였다. 이러한 CD27의 농도에서, 모 Fab에 대해 정규화된 Fab 변이체의 순위를 정하는 것이 가능하다. 이러한 기준에 의해, M69 Fab에 비하여 100% 이상으로, 인간 CD27에 결합하는 10개의 중쇄 및 6개의 경쇄를 선택하였다.

CDR-H2 라이브러리 (C27H28L2)로부터, 위치 52에서 모체의 Y가 대개 선택되었으며, 이는 이러한 잔기에 대한 선호를 나타낸다. 위치 52a에서, P는, 최고의 결합 활성을 갖는 Fab 중에서 A, S, V 및 G 잔기로 대체되었다. 위치 53에서, 모체의 G가 R 및 N과 함께 선택되었다. 위치 54에서, 오직 모체의 D만이 회수되었다. 이러한 라이브러리로부터 9개 클론 (표 7)을 발현 및 mAb로서의 특성화를 위해 IgG 벡터로 서브클로닝하였다.

CDR-H3 라이브러리 (C27H28L3)에 대하여, 회수된 유일한 변화는 S95A 및 A101G였다. 둘 모두의 돌연변이를 함유하는 이러한 라이브러리로부터의 하나의 클론 (표 8)을 발현 및 mAb로서의 특성화를 위해 IgG 벡터로 서브클로닝하였다.

4개 위치 L-CDR1 라이브러리 (C27L35L2)에 있어서, 위치 30a에서는 모체의 Y 및 W가 풍부한 것으로 보였다. 위치 30d에서, 잔기 S, H 및 E가 모체의 D와 함께 풍부하였다. 위치 32에서, 모체의 Y가 F 및 W로 대체되었다. 위치 50에서, T는 모체의 A보다 바람직하였다. 일반적으로, 최적의 클론은 모체에 비하여 더욱 소수성의 측쇄를 가졌다. 이러한 라이브러리로부터의 5개의 클론 (표 9)을 발현 및 mAb로서의 특성화를 위해 IgG 벡터로 서브클로닝하였다.

변화가 제한된 전체 CDR-L1 라이브러리 (C27L35L3)에 있어서, 상기 4개 위치 VL 라이브러리와 유사하게, 오직 Y32만이 F로 변경된 모체와의 차이를 갖는 오직 하나의 서열만을 회수하였다. 이러한 전체 CDR-L1 라이브러리는 위치 32에서 F를 포함하지 않았으며, 이에 따라, 회수된 클론은 4개 위치 VL 라이브러리로부터의 오염물이었을 것이다. 이러한 클론 (L255)을 발현 및 mAb로서의 특성화를 위해 IgG 벡터로 서브클로닝하였다 (표 9).

6개의 변이체 경쇄를 10개의 변이체 중쇄와 쌍을 형성시켜, 60개의 조합을 제공하고, 이를 HEK293E 세포에서 발현시켰다. 상청액을 발현 수준, ELISA에 의해 측정시 인간 CD27 ECD로의 결합 및 프로테온 기기에서 측정시 친화성에 대하여 스크리닝하였다. 모든 변이체의 발현 수준은 스크리닝 목적을 위해 충분하였다. 몇몇 변이체를 위하여 친화성을 40배까지 증가시켰다. 2개의 mAb, M596 및 M600을 추가의 돌연변이유발을 위해 선택하여, 잠재적인 번역후 변형 위치를 제거하였다. 이들 mAb를 위한 VH 및 VL 사슬 조합은 표 10에 제공되어 있다. 항체는 그들의 경쇄의 2개 잔기만이 상이하다.

M596은 3개의 위치에 있어서 모 분자, M69와 상이하다: CDR-H2에서의 P52aA, CDR-L1에서의 Y32W, 및 CDR-L2에서의 A50T. M600은 2개의 위치에서 M69와 상이하다: CDR-H2에서의 P52aA 돌연변이 및 CDR-L1에서의 Y32F.

3개의 공유된 잠재적인 번역후 변형 부위가 M596 및 M600에서 확인되었다. CDR-H2 내의 위치 N58에 잠재적 N-연결 글리코실화 부위가 존재하고, 각각 "DG" 및 "DS"에 의해 암호화되는 CDR-H2 및 CDR-L1 내의 2개의 잠재적인 이성질화 부위가 존재한다. 또한, M596은 산화되기 쉬울 수 있는 CDR-L1 내의 비-생식계열 트립토판 잔기를 함유한다.

글리코실화 위험을 없애기 위하여, 3개의 개별 단일 치환을 N58에서 생성하고, 하나를 S60에서 생성하였다 (표 11). 구축물을 HEK293E 세포에서 발현시키고, 상청액을 프로테온 기기를 사용하여 CD27에 대한 친화성에 대하여 평가하였다. 모든 변이체는 각각 M596 및 M600에 대하여 25 pM 및 49 pM이었던 모체의 친화성과 유사한 친화성을 가졌다. M600으로부터 유래된 변이체 M680 및 M678 둘 모두를 이성질화 부위를 제거하기 위한 추가의 치환의 평가를 위해 선택하였다. 변이체 M680 및 M678은 각각 위치 60 및 58에서 A를 가지며, M596 모체에 존재하는 CDR-L1 내의 트립토판이 없는 추가의 이점을 갖는다.

M678 및 M680 내의 잠재적인 이성질화 부위의 돌연변이의 영향을 평가하기 위하여, 병행하여 둘 모두의 부위를 제거하기 위하여 작은 라이브러리를 설계하였다. 각각의 돌연변이를 중쇄의 CDR-H2 또는 공통 경쇄의 CDR-L1로 개별적으로 치환시킨 다음, 조합 라이브러리에서 쌍을 형성시켰다. 이러한 라이브러리의 변화는 표 12에 나타나 있다.

이들 mAb를 발현시키고, 글리코실화 부위 변이체에 대해서와 같이 친화성을 평가하였다. CDR-L1 잠재적 이성질화 부위 내의 D34E 돌연변이에 의해 일관된 친화성의 2배 증가가 야기되었으며, 이에 따라, 이러한 부위는 성공적으로 제거되었다. CDR-H2 잠재적 이성질화 부위 내의 D54E 돌연변이는 친화성을 10배 넘게 감소시켰다. 그러나, G55A 돌연변이는 친화성에 유의미하게 영향을 미치지 않았다. 변이체 M703 및 M706은 M600 모체의 친화성을 유지하며, PTM으로부터의 기능에 대한 영향의 위험이 감소된다. 표 13은 각 단계의 PTM-위험 평가로부터의 선택된 변이체, 그들의 중쇄 및 경쇄 쌍 형성, 친화성 및 CDR 내의 서열 변형을 보여준다. 잠재적인 글리코실화 부위를 제거하기 위해 선택된 돌연변이에는 밑줄이 있다. 2개의 잠재적인 이성질화 부위를 제거하기 위한 돌연변이는 볼드체로 되어 있으며, 밑줄이 2줄 있다.

실시예 9: 조합된 HFR 및 C2177 MAB의 최적화

이러한 방법에서, 제한된 세트의 HFR 변이체를 발현, pIX 디스플레이 및 결합에 대하여 Fab 형식에서 평가한 다음, 최적의 후보물질을 최적화 진행시켰다. C2177 유래의 CDR은 2개의 중쇄 VH5-51 (서열 번호 102 H24) 및 VH1-46 (서열 번호 106 H25), 및 2개의 경쇄 Vk4-1 및 Vk012 (서열 번호 90 L36)로 조정된 인간 프레임워크였다. 이들 HFA 가변 도메인을 Fab pIX 파지 디스플레이 벡터에서 인간 CH1 및 Ck 불변 영역이 있는 Fab로서 2×2 매트릭스로 함께 쌍을 형성시켰다. VH1-46/Vk012 변이체 (M55, H25/L36)는 CD27로의 결합 및 우수한 디스플레이 특징을 나타내었으며, 친화성 성숙 라이브러리의 구축을 위해 선택하였다.

pIX 파지 디스플레이에 대한 Fab 라이브러리를 실시예 8에 대해 상기 기재된 바와 같이 구축하였다. CD27과 C2191 및 C2177의 실험적 공동-구조 (실시예 5)에 기초하여, 변화 라이브러리를 항체 파라토프 내의 그리고 그 근처의 CDR 잔기에 설계하였다. CDR L1, L3 및 H2에서의 변이에 역점을 두었다. 개별 CDR 내의 총 4 내지 6개의 잔기를, 모든 20개의 아미노산을 암호화하는 NNK 코돈을 사용하여 달라지게 하였다. 각각의 라이브러리의 크기는 6 × 10⁷개 이하의 변이체인 것으로 추정되었으며, 이는 표준 라이브러리 제한 엔도뉴클레아제 클로닝 기술을 사용하여 커버할 수 있다. 표 14는 상이한 CDR 라이브러리에서 완전한 변화를 겪은 잔기를 보여준다.

파지 코트 단백질 IX에 디스플레이된 Fab 라이브러리를 비오티닐화 hCD27ECD/Fc에 대하여 패닝하였다. 파지를 변이체의 플라스미드 라이브러리의 헬퍼 파지 감염에 의해 생성하였다. 결합제를 스트렙트아비딘-코팅 자성 비드의 첨가에 의해 회수하여, 비드/항원/파지 복합체를 형성하였다. 최종 세척 후에, 파지를 기하급수적으로 성장하는 MC1061F의 에스케리키아 콜라이 세포의 감염에 의해 구제하였다. 파지를 다시 생성하고, 추가의 라운드의 패닝으로 처리하였다. 선택된 클론으로부터의 용해성 Fab를 생성하고, 패쓰 1에 대하여 기재된 바와 같이 결합 활성에 대하여 평가하였다. 오직 CDR-L1 및 CDR-L2 라이브러리로부터 히트 (hit)를 얻었다. 이들 2개의 라이브러리로부터의 21개 클론에 의해 모 HFR Fab의 결합보다 더 큰 결합이 입증되었다. 변화된 서열에서 C 또는 M을 함유하는 클론을 폐기하였다. 10개의 Fab를 추가의 특성화를 위하여 IgG4SPAAa/카파 백그라운드에서의 발현을 위해 전환시켰다. IgG4PAA 중쇄는 힌지 영역 내의 세린에서 프롤린으로의 치환 (문헌 [Angal et al., Mol Immunol 30: 105 (1993)]) 및 CH2 내의 2개의 위치에서 알라닌 치환 (문헌 [ML Alegre et al, Transplantation; 57: 1537-43 (1994)])을 포함하는 인간 IgG4이다. mAb를 Fab의 복제물로서, 그리고 중쇄 및 경쇄 조합의 매트릭스로서 HEK293E 세포에서 생성하였다. 친화성을 배양 상청액을 사용하여 프로테온 기기에서 측정하였다 (표 15). CDR-H2 내의 P52a에서 Q (M158) 또는 S (M157)로의 돌연변이에 의해 모 mAb (M159)에 비하여 K_D가 6배 감소되었다. CDR-L1 내의 Y36F 돌연변이 (M149)에 의해 K_D가 4배 감소되었으며, G33H 및 D34E 돌연변이의 부가 (M155)에 의해, K_D의 6배 감소가 야기되었다. P52S 돌연변이와, Y36F (M160) 또는 Y36F + G33H 및 D34E의 조합에 의해 K_D가 100 pM으로 20배 감소하였다. M158, M160 및 M166 내의 치환의 조합을 추가의 특성화를 위해 선택하였다.

M158, M160 및 M166 단백질을 750mL의 HEK293 세포 배양물에서 생성하고, 정제하고, 비아코어 상의 CD27-His로의 결합 역학에 대하여 분석하였다. K_D 값은 미정제 상청액을 사용하여 프로테온에 의해 측정된 것보다 약 1 log 더 컸으나, 서로에 대해서는 동일한 값을 보였다 (표 16).

원래의 HFA 조합을 재평가하는 경우, VH5-51 조정 VH는 VH1-46 스캐폴드보다 2배 더 낮은 K_D를 보였다. H-CDR2 내의 P52aS 돌연변이를 VH5-51 VH 내로 도입하여, H221을 생성하였다. H221을 각각 HFA 모 mAb (M159) 및 친화성 향상 변이체 M160 및 M166 유래의 L220, L219 및 L217 경쇄와 함께 발현시켜, mAb M171, M169 및 M170을 생성하였다. 정제된 mAb에 대한 비아코어 역학적 측정은 상응하는 VH1-46 변이체에 비하여 K_D의 2배 향상을 보였다 (표 16 및 17 비교).

M160, M169 및 M170의 서열 분석에 의해, H196 및 H221의 CDR-H2 내의 D54-G55에서 잠재적인 이성질화 부위가 확인되고, N61-G62에서 잠재적인 탈아미드화 부위가 확인되었다. 추가로, 잠재적인 이성질화 부위가 L219의 CDR-L1 내의 D34에서 확인되었다. 돌연변이를 도입하여, 이들 부위를 제거하고, 활성에 대한 그들의 영향에 대하여 평가하였다 (표 18). 정제된 mAb를 프로테온 상의 CD27-His에 대한 친화성에 대하여 분석하였다. 돌연변이는 K_D에 대한 효과를 갖지 않거나 긍정적인 효과를 가졌다. 예를 들어, M668 및 M671 둘 모두는 각각 그들의 모 mAb, M160 및 CM169보다 거의 2배 더 낮은 K_D를 가졌다.

실시예 10: C2191 HFR MAB M91의 최적화

M91의 최적화 (H31/L42)를 위해 적용된 방법은 기재된 것을 제외하고 실시예 8에 기재된 바와 같았다. 인간 Ch1 및 Ck 불변 영역이 있는 Fab 형식의 C2191 모 VH 및 VL 영역을 사용하여, C2191의 CDR의 알라닌/생식계열 스캔을 Fab 형식에서 수행하여, CD27과의 상호작용에 중요한 위치를 평가하였다. 라이브러리에서는 CDR 내의 잔기를 알라닌 또는 상응하는 생식계열 서열에 존재하는 잔기로 대체하였다. CDR 내의 몇몇 위치는 그들이 모델링과, 이후의 결정된 구조에 기초하여 용매 노출이 낮거나 용매 노출이 없기 때문에, 배제하였다 (실시예 5). 추정의 체세포 돌연변이를 마우스 생식계열 아미노산으로 역 돌연변이시켜, 항체 친화성에 대한 그들의 기여를 평가하였다. 약술하면, 마우스 V 영역을 Fab pIX 디스플레이 벡터로 클로닝하고, 비오티닐화 인간 CD27-ECD 단백질로의 모체의 결합을 ELISA에 의해 입증하였다. 단일의 돌연변이 (라이브러리 설계에 따름)를 본질적으로 스트라타진에 의해 기술된 바와 같이 수행되는 위치 지정 돌연변이유발에 의해 도입하였다 (문헌 [La Jolla, CA, USA]). 서열 확인된 돌연변이체를 새로운 플레이트로 선별하고, 모 Fab 및 음성 대조군 Fab와 함께 성장시켰다. 최종 단일 아미노산 치환 변이체는 에스케리키아 콜라이에서 생성한 다음, ELISA에 의해 발현 및 CD27 결합에 대하여 스크리닝하였다. 모 클론에 대한 발현 및 결합 신호를 평균을 내고, 1.0으로 설정하고, 돌연변이체의 신호를 모체와 비교하여 정규화시켰다. 2가지 형태의 항원을 ELISA에서 사용하였다: CD27 ECD (1-173 잔기) 및 CD27 ECD-Fc 키메라 (알앤디 시스템즈).

공동-결정 구조와 커플링된 이러한 스캔의 결과는 친화성 성숙 라이브러리의 설계를 위한 기반을 제공하였다. 중쇄에 대하여; 변이를 위해 선택된 위치는 H-CDR1 내의 T33, 및 CDR-H2 내의 Y50, S52, S52a, N56 및 Y58이었다 (표 23). T33은 접촉 잔기가 아니나, T33A 돌연변이는 결합을 향상시켰다. 위치 S52 및 S52a는 접촉 잔기가 아니나, 상기 스캔 내의 치환은 다소 증가된 결합을 보였다. 위치 50 및 58에서의 티로신은 둘 모두 접촉 위치이며, 이들 위치에서의 치환은 실시예 11에 기재된 병행 최적화 패쓰에서 선택되었다. 위치 N56을 알라닌/생식계열 스캔에서 평가하지 않았으나, 그것은 접촉 위치이며, 결정 구조에서 T33, S52 및 S52a와 인접한다. 경쇄에 있어서, 변이를 위해 선택된 위치는 CDR-L1 내의 T30a, S30b, G30c 및 Y30d, 및 CDR-L2 내의 L50 및 N53이었다 (표 23). 이들 잔기 중 어느 것도 항원과 직접 접촉하지 않지만, 접촉하고 있는 잔기에 인접해 있으며, 스캔에 의해 결합에 실질적으로 부정적인 영향을 갖는 것으로 나타났다. L50A 돌연변이는 결합에 대하여 중등의 영향을 가졌으며, 결정 구조에서 아마도 항원과 접촉할 CDR-L2 내의 유일한 잔기일 것이다. 또한, 제한된 변화를 위해 N53을 선택하였다. 2가지 병행 라이브러리를 구축하였으며, 하나는 Y30d를 W로 돌연변이시키고, 다른 하나는 Y30d를 Y로 유지시켰는데, 이는 W가 파라토프를 더욱 소수성이 되게 하고, 이에 따라 개발가능성이 더 낮아지게 할 수 있기 때문이다. 하기 표 19 및 20은 M91에 대한 VH 및 VL 친화성 성숙 라이브러리 설계를 보여준다.

파지 코트 단백질 IX에서 디스플레이된 Fab 라이브러리를 비오티닐화 CD27-ECD에 대하여 패닝하였다. C2191의 모 키메카 Fab와 동일하게 또는 그보다 더 잘 CD27에 결합되는 총 12개 중쇄 및 12개 경쇄 변이체를 선택하였다. 변이체를 IgG1/카파 항체로 전환시키고, 144개 조합으로서 HEK293E 세포에서 생성하고, 배양 상청액을 프로테온에 의해 결합에 대하여 평가하였다. 친화성의 상당한 증가 (100배 초과)가 일부 변이체에 대하여 관찰되었다. 144개의 VH 및 VL 쌍 중에, 8개를 추가의 특성화를 위해 선택하였다 (표 21). 이들 mAb를 3개의 하위 그룹으로 분류하였다: 그룹 1 변이체는 4가지 상이한 경쇄와 쌍을 형성하는 동일한 중쇄 (H227, 서열 번호 133)를 갖는 한편, 그룹 2 및 그룹 3은 각각 2가지 상이한 중쇄와 쌍을 형성하는 하나의 경쇄를 갖는다. 4개의 선택된 경쇄는 CDR-L1 내의 변화된 모든 4개의 위치에서 상이하였다 (RASKSVSX₁X₂X₃X₄SFMH) (서열 번호 158); (여기서, X₁은 A, E, H 또는 L이며; X₂는 D, G, V 또는 W이고; X₃은 G 또는 R이며; X₄는 W 또는 Y임). 그들은 또한 CDR-L2 내의 변화된 둘 모두의 위치에서 상이하였다 (X₁ASX₂LES) (서열 번호 171); (여기서, X₁은 L 또는 V이며; X₂는 K, N 또는 R임). CDR-L3은 L42 서열 (서열 번호 140)로부터 변경되지 않았으며, QHSRELPWT이다.

이들 8개의 변이체를 750 ml의 부피에서 HEK293E 세포에서의 일시적인 발현에 의해 생성하였다. 수집된 상청액을 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, 각각의 변이체를 SDS-PAGE 및 SE-HPLC에 의해 분석하여, 정제된 시료 중의 시료의 순도 및 단량체의 백분율을 결정하였다. 모든 변이체는 순도가 90% 초과이며, 단량체가 90% 초과였다. 항체의 회합 특성을 평가하기 위하여, 각 정제된 변이체에 대하여 교차-상호작용 크로마토그래피를 수행함으로써 체류 인자 (k')를 결정하였다 (문헌 [Jacobs SA, Wu SJ, Feng Y, Bethea D & O'Neil KT (2010) Cross-interaction chromatography: a rapid method to identify highly soluble monoclonal antibody candidates. Pharm Res 27, 65-71]). 이러한 방법에서, 시료 항체를 인간 IgG와 커플링된 컬럼을 통해 통과시키고, 대조군 항체와 비교하여 체류에 대하여 평가하였다. 약술하면, 50 mg의 인간 IgG (시그마 알드리치)를 제조처의 지침에 따라 1mL NHS-세파로스 컬럼 (지이 헬쓰케어)에 커플링시켰다. 커플링되지 않은 IgG를 0.1M Tris, pH 8, 0.5M NaCl을 사용한 세척에 의해 제거하고, 미반응 NHS 기를 동일한 완충제로 블로킹하였다. 피어스 (Pierce)의 쿠마시 플러스 분석 키트 (Coomassie Plus Assay Kit; 써모 피어스 (Thermo Pierce))를 사용하여 미반응 커플링 완충제 및 세척물 중에 남아 있는 단백질의 농도를 측정하고, 이를 고정화 전의 단백질의 양으로부터 차감함으로써 커플링의 효율을 결정하였다. 또한, 대조군 컬럼을 동일한 프로토콜을 사용하지만, 수지로의 IgG의 컨쥬게이션 없이 제조하였다. 먼저 대조군 컬럼을, 0.1 mL/분의 유량으로, PBS, pH 7로 평형화한 후 다이오넥스 얼티메이트 (Dionex UltiMate) 3000 HPLC에서 작동시켰다. 먼저 20μL의 스톡 단백질 용액을 주입하여 비특이적 결합 부위가 블로킹되었음을 보장한 다음, 20 μL의 10% 아세톤을 주입하여 컬럼의 무결성을 점검하였다. 분석할 시료를 PBS, pH 7 중에 0.1 mg/mL로 희석시켰다. 20 uL의 각각의 시료를 각각의 컬럼에 주입하고, 0.1 mL/분에서 30분 동안 작동되게 하였다. 각각의 변이체에 대하여 체류 시간을 기록하고, 체류 인자 (k')를 계산하였다. k' 값을 IgG 및 블랭크 (blank) 컬럼에서의 체류 시간의 차이로서 계산하였다. 모든 변이체를 SDS-PAGE 및 SE-HPLC에 기초하여 90% 초과의 순도로 정제하였다. 모든 k' 값은 0.3 미만인 것으로 계산되었으며, 이는 우수한 용액 특성을 나타낸다 (표 22).

8개의 변이체 mAb 및 HFR 모체를 비아코어에 의해 CD27 ECD에 대한 그들의 친화성에 대하여, 그리고, κβ-리포터 검정에서 그들의 IC₅₀에 대하여 평가하였다. 역학 상수 및 친화성을 비아코어에 의해 측정하였다. 표 23은 이들 변이체에 대하여 수집된 데이터를 요약한 것이다. 초기 소규모 배양 상청액으로부터 측정시, 발현 및 CD27으로의 결합에 대한 ELISA 신호도 또한 이러한 표에 포함시켰다.

실시예 11: 조합된 HFR 및 C2191 MAB의 최적화

이러한 방법에서, 제한된 세트의 HFR 변이체를 발현, pIX 디스플레이 및 결합에 대하여 Fab 형식에서 평가한 다음, 최적의 후보물질을 최적화 진행시켰다. C2191 유래의 CDR은 2개의 중쇄 (VH3-23 및 VH3-11) 및 2개의 경쇄 (Vk4-1 및 Vk012)로 조정된 인간 프레임워크였다. 이들 HFA 가변 도메인을 Fab pIX 파지 디스플레이 벡터에서 인간 CH1 및 Ck 불변 영역이 있는 Fab로서 2×2 매트릭스로 함께 쌍을 형성하였다. VH3-23/Vk012 변이체 (H39 (서열 번호 145)) 및 L40 (서열 번호 137)은 CD27로의 결합 및 우수한 디스플레이 특징을 보였으며, 친화성 성숙 라이브러리의 구축을 위해 선택하였다. 이러한 Fab는 "모체"로 지칭된다.

친화성이 향상된 항체의 선택을 위하여, H39의 CDR-H3을 제외한 모든 CDR 내의 다수의 잔기를 NNK 축퇴 코돈을 사용하여 완전히 변화시켰다 (표 24). 각각의 CDR 라이브러리를 따로 구축하고, 친화성 성숙 변이체의 선택을 위해 파지 패닝으로 처리하였다.

CDR-H2, CDR-L1 또는 CDR-L2 내에 변화가 있는 C2191 라이브러리에 의해, 단일점 ELISA에서 측정시, 모 HFR Fab에 비하여 인간 CD27로의 결합이 향상된 50개의 독특한 Fab를 제공하였다. 이들 클론을 다중점 ELISA에서 추가로 순위를 정하고, 17개의 클론을 추가의 특성화를 위한 인간 IgG4alaala/카파로의 전환을 위해 선택하였다 (표 25).

IgG1/k mAb를 Fab의 복제물로서, 그리고 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 매트릭스로서 구축하고 (표 26), 친화성 및 용액 특성에 대하여 시험하였다. 모 Fab의 mAb 형태는 M131로 표기한다. M141 및 M408을 추가의 특성화를 위해 선택하였다.

실시예 12: 친화성 성숙 MAB의 특성화

모 C2177 및 C2191 하이브리도마 항체로부터 유래된 선택된 친화성 성숙 mAb를 코돈 최적화시키고, 중쇄 및 경쇄의 이중 발현을 위해 상이한 벡터로 도입하고, CHO-GS 세포 배양물에서 발현시키고, 추가의 특성화를 위해 정제하였다. 상기 실시예에 기재된 성숙 변이체에 관하여 이들 항체의 식별 번호는 표 27에 나타나 있다.

이들 mAb에 대한 요약 데이터는 비아코어에 의한 K_D 분석 및 NF-κβ 리포터 유전자 검정에서 측정된 IC₅₀에 대하여 하기에 나타나 있다 (표 28 및 29). 이러한 NF- κβ 리포터 검정을 위하여, HEK-293F 세포를 NF-κβ 프로모터의 제어 하에 인간 CD27 및 루스퍼라제 구축물 둘 모두를 함유하는 총 36 ng의 DNA로 트랜스펙션시켰다. HEK-293F 트랜스펙턴트를 96-웰 플레이트 내의 40 μL 프리스타일 배지 (집코) 내에 웰당 5×10⁴개 세포로 플레이팅하였다. 항-CD27 하이브리도마 mAb의 희석물을 1:3 희석을 사용하여 검정 플레이트에 프리스타일 배지 중에 50 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 37℃ (5% CO₂)에서 인큐베이션시켰다. CD70:CD27 신호전달을 중화시키는 mAb의 능력을 시험하기 위하여, 정기적으로 조사된 (4000 rad) HEK-293E CD70 에피솜 세포를 CD27 트랜스펙턴트 세포의 개수의 20%로 검정 플레이트에 첨가하였다. 하이브리도마 mAb의 효능제 활성을 시험하기 위하여, CD70 에피솜 세포의 첨가를 생략하였다. 검정 플레이트를 37℃ (5% CO₂)에서 하룻밤 인큐베이션시키고, 제조처의 지침에 따라 스테디-글로

루시퍼라제 어세이 시스템 (프로메가)을 사용하여 발색시켰다.

CDR 및 V 영역 서열

단백질 및 항체 가변 영역 서열

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. <120> Human Anti-CD27 Antibodies, Methods, and Uses <130> JBI5001USNP <140> To Be Assigned <141> 2013-03-14 <150> 61611332 <151> 2012-03-15 <160> 176 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 1 Ser Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 2 Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 3 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Variable Sequence <400> 4 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 5 Arg Ile Phe Val Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 6 Arg Ile Tyr Val Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 7 Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 8 Arg Ile Tyr Ala Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 9 Arg Ile Tyr Gly Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 10 Arg Ile Tyr Ala Asn Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 11 Arg Ile Tyr Gly Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 12 Arg Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 13 Arg Ile Tyr Ser Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 14 Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Ala Tyr Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 15 Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 16 Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 17 Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Thr Asn Tyr Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> 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Variable Sequence <400> 23 Ser Asp Tyr Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 24 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 25 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly Asp Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 26 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly Asp Ser Trp Met Asn 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 27 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly Ser Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 28 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Trp Ala Gly His Ser Trp Met Asn 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT 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Asp Tyr Val Gly Thr Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 35 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Trp Ser Asp Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 36 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Tyr Asn Ser Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 37 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD27 Sequence <400> 38 Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 39 Thr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 40 Glu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Asp Glu Gly Gly Gly Gln Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 48 Tyr Ile Asp Ala Gly Gly Gly Phe Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 49 His Ile Asp Ala Gly Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 50 Tyr Ile Asp Arg Gly Gly Gly Val Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 51 Ala Ile Asp His Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Heavy Chain Variable Sequence <400> 52 Ala Ile Asp His Gly Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 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<400> 58 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 59 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Trp Gly Tyr Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 60 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Trp Gly Tyr Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 61 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Glu Gly Arg Trp Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 62 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Leu Asp Arg Trp Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 63 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Leu Asp Arg Trp Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> 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Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Val Leu Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Pro Cys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 77 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Variable Sequence <400> 77 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu 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Gln Arg Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 80 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable Sequence <400> 80 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 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Xaa can be any naturally occurring amino acid <222> (10)..(10) <400> 157 Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 158 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <220> <221> Xaa can be any naturally occurring amino acid <222> (8)..(8) <220> <221> Xaa can be any naturally occurring amino acid <222> (9)..(9) <220> <221> Xaa can be any naturally occurring amino acid <222> (10)..(10) <220> <221> Xaa can be any naturally occurring amino acid <222> (11)..(11) <400> 158 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 159 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Constant Region <400> 159 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 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naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 171 Xaa Ala Ser Xaa Leu Glu Ser 1 5 <210> 172 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 172 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Leu Ile Arg Trp Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 173 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Light Chain Variable Sequence <400> 173 Val Ala Asp Arg Val Glu Val 1 5 <210> 174 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly 1 5 10 15 Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys Asp 20 25 30 Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro Gly 35 40 45 Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys 50 55 60 Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr Ala 65 70 75 80 Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys Glu 85 90 95 Cys Thr Glu 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Glu Val Leu Phe Gln Gly 115 120 125 Pro His His His His His His 130 135 <210> 176 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly 1 5 10 15 Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys Asp 20 25 30 Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro Gly 35 40 45 Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys 50 55 60 Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr Ala 65 70 75 80 Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys Glu 85 90 95 Cys Thr Glu Cys Asp Gly Gly His His His His 100 105

Claims

경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 경쇄 가변 영역이
서열 번호 59 내지 66 및 158로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역 경쇄 1(CDRL1) 아미노산 서열;
서열 번호 67 내지 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRL2 아미노산 서열; 및
서열 번호 75의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제1항에 있어서,
서열 번호 42 내지 45 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH1 아미노산 서열;
서열 번호 46 내지 57, 156 및 157로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH2 아미노산 서열; 및
서열 번호 58의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 중쇄 가변 영역이
서열 번호 42 내지 45 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역 중쇄 1(CDRH1) 아미노산 서열;
서열 번호 46 내지 57, 156 및 157로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH2 아미노산 서열; 및
서열 번호 58의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 경쇄 가변 영역이
서열 번호 59 내지 66 및 158로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRL1 아미노산 서열;
서열 번호 67 내지 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRL2 아미노산 서열; 및
서열 번호 75의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이
서열 번호 42 내지 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH1 아미노산 서열;
서열 번호 46 내지 57, 156 및 157로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH2 아미노산 서열; 및
서열 번호 58의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 경쇄 가변 영역이
서열 번호 62의 CDRL1 아미노산 서열;
서열 번호 68의 CDRL2 아미노산 서열; 및
서열 번호 75의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이
서열 번호 44 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH1 아미노산 서열;
서열 번호 47의 CDRH2 아미노산 서열; 및
서열 번호 58의 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
경쇄 가변 아미노산 서열 및 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 경쇄 가변 아미노산 서열이 서열 번호 143을 포함하고, 중쇄 가변 아미노산 서열이 서열 번호 133을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제6항에 있어서, IgG4 중쇄 불변 영역 및 IgG4 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 분리된 항체.
제7항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 서열 번호 159의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 불변 영역이 서열 번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 항체.
분리된 인간 CD27-중화 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 고정화 CD27 세포외 도메인으로의 결합에 의해 결정시 제6항의 항체에 의해 결합되는 에피토프에 결합하는 분리된 인간 CD27-중화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제6항에 있어서, 상기 항체가 표면 플라스몬 공명에 의해 결정시, 1×10^-7 M 이하의 K_D로 인간 CD27에 결합하는 분리된 항체.
(i) 제6항의 항체 또는 항원 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (ii) 서열 번호 163의 경쇄 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호 164의 중쇄 뉴클레오티드 서열, 또는 (iii) 서열 번호 143의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호 133의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 핵산 분자.
제11항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 분리된 핵산 벡터 또는 벡터들.
제12항의 분리된 핵산 벡터 또는 벡터들을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
제13항에 있어서, 상기 숙주 세포가 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포, 또는 그들의 임의의 유도체, 불멸화(immortalized) 또는 형질전환 세포로부터 선택되는 적어도 하나인 숙주 세포.
제11항의 핵산 분자를 벡터에 혼입시키는 단계, 숙주 세포, 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 트랜스제닉 식물을 형질전환시켜, 항체를 발현하는 단계 및 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 CD27 항체의 생성 방법.
대상체의 T-세포의 일부를 유효량의 제6항의 항체 또는 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하는 T-세포 매개의 B-세포 항체 생성의 억제 방법으로서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 인간 CD70 단백질 또는 인간 CD70 단백질의 일부의 존재 하에 상기 인간 T-세포 상의 CD27의 활성화를 억제하는 T-세포 매개의 B-세포 항체 생성의 억제 방법.
제16항에 있어서, 대상체가 염증성 장애를 앓고 있는 방법.
제17항에 있어서, 염증성 장애가 전신 홍반성 낭창인 방법.
제16항에 있어서, 대상체가 폐 또는 늑막계의 질환, 중추 또는 말초 신경계의 질환, 눈 또는 시각계의 질환, 위장 및 소화계의 질환, 심혈관계의 질환, 감염성 질환 및 기생충 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애와 관련된 항원-특이적 체액성 면역 반응을 나타내는 방법.
제16항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 대상체에게 전신으로 투여되는 방법.
조직을 유효량의 제6항의 항체 또는 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하는 나이브(
) T-세포 증식의 억제 방법으로서, 항체 또는 항원 결합 부분이 인간 CD70 단백질 또는 인간 CD70 단백질의 일부의 존재 하에 상기 인간 T-세포 상의 CD27의 활성화를 억제하는 나이브 T-세포 증식의 억제 방법.
제6항의 항체를 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형을 포함하는 제조 용품.
항체 C2177, CD2186, CD2191 및 CD2192로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체에 의해 결합되는 인간 CD27 단백질 상의 에피토프에 결합하는 항체 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
인간 CD27 단백질로의 결합을 위해 항체 C2177, CD2186, CD2191 및 CD2192로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 경쟁하는 항체 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 경쇄 가변 영역이
서열 번호 24 내지 36, 153 및 155로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역 경쇄 1(CDRL1) 아미노산 서열;
서열 번호 37 내지 40 및 154로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRL2 아미노산 서열; 및
서열 번호 41의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 중쇄 가변 영역이
서열 번호 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역 중쇄 1(CDRH1) 아미노산 서열;
서열 번호 3 내지 22, 151 및 152로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH2 아미노산 서열; 및
서열 번호 23 및 162로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 경쇄 가변 영역이
서열 번호 24 내지 36, 153 및 155로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역 경쇄 1(CDRL1) 아미노산 서열;
서열 번호 37 내지 40 및 154로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRL2 아미노산 서열; 및
서열 번호 41의 CDRL3 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역이
서열 번호 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH1 아미노산 서열;
서열 번호 3 내지 22, 151 및 152로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH2 아미노산 서열; 및
서열 번호 23 및 162로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
서열 번호 137 내지 144 및 148로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제28항에 있어서, 서열 번호 128 내지 136 및 145 내지 147로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열을 추가로 포함하는 분리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
서열 번호 128 내지 136 및 145 내지 147로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
서열 번호 82 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제31항에 있어서, 서열 번호 102 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열을 추가로 포함하는 분리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
서열 번호 102 내지 125로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 분리된 인간 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
서열 번호 77, 79, 81 및 127로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 분리된 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
제34항에 있어서, 서열 번호 76, 78, 80 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열을 추가로 포함하는 분리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
서열 번호 76, 78, 80 및 126으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 아미노산 서열을 포함하는 분리된 CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
본 명세서에 기재된 임의의 발명.