JP2023532248A - 免疫関連疾患のためのtigitに対するヒトモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトTIGITとマウスTIGITの両方に結合する抗TIGIT抗体およびその抗原結合断片に関する。本出願はまた、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド、抗体またはその断片を含む組成物または組み合わせ、ならびにがんおよびウイルス感染などの免疫関連疾患の治療における抗体またはその断片の使用を提供する。
Description
本明細書には、TIGITに結合し、TIGITの機能をブロックする、具体的にはTIGITとそのリガンドCD155との相互作用をブロックする、単離された抗体またはその抗原結合断片が記載される。本出願は、がんおよびウイルス感染などの免疫関連疾患の治療における上記抗TIGIT抗体またはその抗原結合断片の使用も提供する。
免疫療法は、種々のがんを治療するための極めて強力なモダリティとして台頭している。最も影響力のあるアプローチの1つは、免疫チェックポイント受容体またはリガンドの遮断に基づいている。
ポリオウイルス受容体(PVR)/ネクチンファミリーのメンバーであるTIGITは、活性化T細胞、記憶T細胞、NK細胞、および制御性T細胞(Treg)のサブセットに主に発現する免疫受容体である(Johnston, R. J. et al., 2014. Cancer cell 26:923-937; Boles, K. S. et al., 2009. European journal of immunology39:695-703; Yu, X., K. et al., 2009. Nature immunology 10:48-57; およびLevin, S. D. et al., 2011. European journal of immunology 41:902-915)。研究によって、TIGIT-/-マウスが、免疫誘発性自己免疫に対してより感受性が高かったことが示されており(Levin S. D. et al., 2011,上記を参照;Joller, N. et al., 2011. J Immunol 186:1338-1342.)、TIGITが免疫恒常性の維持において抑制性受容体として機能することを裏付けている。TIGITは、抗原提示細胞(APC)に発現される高親和性同族リガンドCD155(PVRとしても知られる)に結合し、この結合によって、T細胞およびAPCを介して、ならびにNK細胞により免疫応答を阻害する(Joller, N. et al., 2011, supra; Stanietsky, N. et al., 2009. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106:17858-17863)。TIGITは、CD155への結合のためにCD226と競争し(Yu, X. et al., 2009,上記を参照)、この結果、CD226介在共刺激T細胞シグナル伝達を相殺するが(Johnston, R. J. et al., 2014,上記を参照)、これは、CD28の共刺激機能に対抗するCTLA-4の機能によく似ている(Egen, J. G. et al., 2002. Nature immunology3:611-618.)ことも示されている。
がんに関連して、TIGITは、腫瘍浸潤T細胞によって、およびCD155がヒトとマウスの両方の腫瘍および腫瘍浸潤骨髄細胞によって高度に発現されることを考慮してアップレギュレートされることが知られている(Martinet, L., and M. J. Smyth. 2015. Nat Rev Immunol 15:243-254; Chan, C. J. et al., 2014. Nature immunology 15:431-438; Blake, S. J. et al., 2016. Clinical cancer research 22:5183-5188; Li, X. Y. et al., 2018. J Clin Invest 128:2613-2625; Kurtulus, S. et al., 2015. J Clin Invest 125:4053-4062)。TIGITは、複数の連続した工程を介して抗腫瘍免疫応答を阻害し得ることが提案されており(Manieri, N. A. et al., 2017. Trends Immunol38:20-28)、まず、NK細胞媒介性の腫瘍細胞の死滅の他に腫瘍抗原の放出も阻害し、その後、免疫寛容原性樹状細胞を誘導して、TIGIT+Tregを介してCD8+T細胞機能を抑制し、最後に、CD8+T細胞のエフェクター機能を直接阻害して、最終的にがん細胞の排除を妨げる。したがって、TIGITはがん免疫における重要な阻害剤であると考えられ(Manieri, N. A. et al., 2017,上記参照;Dougall, W. C. et al., 2017. Immunol Rev 276:112-120)、TIGITを標的とすることはがん免疫療法を開発するための有望なアプローチと見られている。
抗TIGIT抗体は、いくつかのマウスがんモデルで治療効果を示しており、いくつかの抗体がヒト臨床試験において現在評価されている(Burugu, S. et al., 2018. Semin Cancer Biol 52:39-52.)。これらの有望な医学的結果にもかかわらず、これらの抗TIGIT抗体が抗腫瘍作用を付与する(1つまたは複数の)機序の科学的理解は不明のままであり、このため、より有効な抗体または組み合わせを開発する試みのみならず、どの患者集団がそのような治療から恩恵を受ける可能性があるかを特定する臨床的試みも制限される。
したがって、治療用途に適した改良された抗TIGIT抗体を開発するように抗TIGIT抗体の機能の根底にある機序を探求する試みが依然として必要とされている。
科学出版物、特許出願公報、および特許公報を含むすべての参考文献は、あらゆる目的でそれらの実体が組み込まれている。
ヒトTIGIT(hTIGIT-ECD;Uniprot ID Q495A1)とマウスTIGIT(mTIGIT-ECD;Uniprot ID P86176)の両方の細胞外ドメイン(ECD)を標的として使用した大型ファージディスプレイ抗体ライブラリの交差選択(cross-selection)およびスクリーニングによって、TIGITとCD155の相互作用に対する阻害活性を有するヒトモノクローナル抗体のパネルが特定された。それらの中でも、T4 Abおよびhm7 Abは、hTIGITとmTIGITの両方に対してより高い結合親和性を示し、他のAbよりも良好な阻害活性を示した。チェーンシャッフリングのアプローチによるT4 Abとhm7 Abの両方の最適化によって、さらに高い結合親和性を備えたより強力なAbが得られ、したがって本発明が完成した。さらに、本出願の抗TIGIT抗体は、TIGITのそのリガンドへの結合をブロックする機能に加えて、Fc介在エフェクター機能を保有することが分かった。また、本出願の抗TIGIT抗体は、交差保護的な耐久性のある免疫記憶効果を誘発することができ、治療用途に適したものになることも分かった。
第1の態様では、本開示は、ヒトTIGIT(hTIGIT)とマウスTIGIT(mTIGIT)の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
(1)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1(重鎖相補性決定領域1)、配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号9のアミノ酸配列を有するLCDR1(軽鎖相補性決定領域1)、配列番号10のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号11のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号23のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号25のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(3)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号30のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号32のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(4)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号1のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号3のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(5)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号15のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号17のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む。
(1)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1(重鎖相補性決定領域1)、配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号9のアミノ酸配列を有するLCDR1(軽鎖相補性決定領域1)、配列番号10のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号11のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号23のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号25のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(3)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号30のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号32のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(4)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号1のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号3のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(5)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号15のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号17のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む。
より具体的な実施形態では、ヒトTIGIT(hTIGIT)とマウスTIGIT(mTIGIT)の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、
(1)配列番号8と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号27と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号26と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(3)配列番号34と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号33と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む。
(1)配列番号8と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号27と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号26と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(3)配列番号34と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号33と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む。
一実施形態では、ヒトTIGIT(hTIGIT)とマウスTIGIT(mTIGIT)の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
より具体的な実施形態では、ヒトTIGIT(hTIGIT)とマウスTIGIT(mTIGIT)の両方に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、
(1)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(3)配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号33のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(4)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(5)配列番号22のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む。
(1)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(3)配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号33のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(4)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(5)配列番号22のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む。
より具体的な実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、
(1)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびIGKV1-39、T4、1-44、1-48、1-60、1-66、1-93、3-5、3-12、3-17、3-96、およびT4Mからなる群から選択される抗体の図6に示されるような軽鎖可変ドメイン;
(2)図10に示されるようなIGHV3-23、IGHV3-30、hm7、hm7-3-23、およびhm7-3-30からなる群から選択される重鎖可変ドメイン、およびIGLV2-11、IGLV2-14、hm7、Tm1、Tm3、Tm4、Tm5、Tm6、Tm7、Tm8、Tm9、Tm10、Tm11、Tm12、Tm13、Tm14、Tm15、Tm17、Tm18、Tm19、CS19、CS19ME、およびCS19ME-Nからなる群から選択される抗体の図9に示されるような軽鎖可変ドメイン
を含む。
(1)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、およびIGKV1-39、T4、1-44、1-48、1-60、1-66、1-93、3-5、3-12、3-17、3-96、およびT4Mからなる群から選択される抗体の図6に示されるような軽鎖可変ドメイン;
(2)図10に示されるようなIGHV3-23、IGHV3-30、hm7、hm7-3-23、およびhm7-3-30からなる群から選択される重鎖可変ドメイン、およびIGLV2-11、IGLV2-14、hm7、Tm1、Tm3、Tm4、Tm5、Tm6、Tm7、Tm8、Tm9、Tm10、Tm11、Tm12、Tm13、Tm14、Tm15、Tm17、Tm18、Tm19、CS19、CS19ME、およびCS19ME-Nからなる群から選択される抗体の図9に示されるような軽鎖可変ドメイン
を含む。
一実施形態では、抗TIGIT抗体はヒト抗体である。一実施形態では、抗TIGIT抗体はヒトモノクローナル抗体(mAb)である。
一実施形態では、抗TIGIT抗体は、Fab、F(ab’)2、Fv、一本鎖Fv(ScFv)であるか、または二重特異性または三重特異性抗体におけるドメインとして含まれる。
一実施形態では、抗TIGIT抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはそれらの変異体のサブクラスの重鎖定常領域、およびカッパまたはラムダまたはそれらの変異体のタイプの軽鎖定常領域を含む。好ましい実施形態では、抗TIGIT抗体はIgG1の重鎖定常領域を含む。
一実施形態では、抗TIGIT抗体は単離された抗体である。一実施形態では、抗TIGIT抗体は組換え抗体である。
一実施形態では、本出願の抗TIGIT抗体は、Fc介在エフェクター機能を保有する。1つの好ましい実施形態では、本出願の抗TIGIT抗体は、増強したFc介在エフェクター機能を保有する。
一実施形態では、本出願の抗TIGIT抗体は、修飾のない抗体と比較して、(1)ADCC機能を増強する、(2)ADCP機能を増強する、および/または(3)CDC機能を低減または排除するように、Fc領域を変更することによってさらに修飾される。好ましくは、本出願の抗TIGIT抗体のFc修飾された変異体は、修飾前の本出願の抗TIGIT抗体と比較して、ADCC機能が増強される、ADCP機能が増強される、CDC機能が低減されるか、またはCDC機能がない。
一実施形態では、本出願の抗TIGIT抗体は脱フコシル化抗体である。一実施形態では、脱フコシル化抗体は、そのフコシル化対応物と比較してエフェクター機能が増強されている。
一実施形態では、本出願の抗TIGIT抗体は免疫記憶効果を誘発する。より具体的な実施形態では、本出願の抗TIGIT抗体によって誘発された免疫記憶効果は、交差腫瘍免疫を生み出す。
第2の態様では、本開示は、本出願の第1の態様の抗TIGIT抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物、たとえば、医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、治療上有効な量の抗TIGIT抗体または抗原結合断片を含む。
第3の態様では、本開示は、本出願の第1の態様の抗TIGIT抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第2の態様の組成物を含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは、治療上有効な量の抗TIGIT抗体または抗原結合断片を含む。
第4の態様では、本開示は、免疫関連の病状または疾患を予防または治療するための方法であって、本出願の第1の態様の治療上有効な量の抗TIGIT抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第2の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む方法を提供する。具体的な実施形態では、免疫関連の病状または疾患は、がんまたは慢性ウイルス感染症などのウイルス感染症である。
第5の態様では、本開示は、がんなどの免疫関連の病状または疾患の再発を予防するための方法であって、本出願の第1の態様の治療上有効な量の抗TIGIT抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第2の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む方法を提供する。具体的な実施形態では、疾患または障害はがんである。
第6の態様では、本開示は、本明細書に記載されるさまざまな病状もしくは疾患を治療するための、または本明細書に記載されるさまざまな病状または疾患の再発を予防するための、本出願の第1の態様の抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第2の態様の医薬組成物の使用を提供する。
第7の態様では、本開示は、本明細書に記載されるさまざまな病状もしくは疾患を治療するための、または本明細書に記載されるさまざまな病状または疾患の再発を予防するための、医薬品の製造における本出願の第1の態様の抗TIGIT抗体もしくは抗原結合断片、または本出願の第2の態様の医薬組成物の使用を提供する。
第8の態様では、本開示は、第1の態様の抗TIGIT抗体または結合断片をコードする単離された核酸を提供する。本態様のより具体的な実施形態では、抗TIGIT抗体またはその断片をコードする単離された核酸は、
(1)配列番号14と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列、および/または配列番号13と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(2)配列番号29と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列、および/または配列番号28と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;または
(3)配列番号36と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列、および/または配列番号35と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む。
(1)配列番号14と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列、および/または配列番号13と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(2)配列番号29と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列、および/または配列番号28と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;または
(3)配列番号36と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列、および/または配列番号35と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む。
第9の態様では、本開示は第8の態様の核酸を含む発現ベクターを提供する。
第10の態様では、本開示は第8の態様の核酸または第9の態様の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
定義
本文書の他の場所で特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本文書の他の場所で特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用される場合、「a」、「an」、および「the」などの単語の単数形は、文脈が明確に別段指示しない限り、それらの対応する複数参照を含む。
「または」という用語は、文脈が明確に別段指示しない限り、「および/または」という用語を意味し、それと交換可能に使用される。
本開示に関連して、別段に指示がない限り、「含む(comprise)」という文言、および「含む(comprises)」および「含むこと(comprising)」などのその変形は、明記された要素、たとえば、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、特性、工程、またはそれらの群を含蓄することを暗示すように理解されるが、任意の他の要素、たとえば、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、特性、および工程を除外するものではない。本明細書で使用される場合、「含む(comprise)」という用語またはその変形は、「含有する(contain)」、「含む(include)」、または場合によっては「有する(having)」という用語、またはそれらの同等の変形で置き換えることができる。特定の実施形態では、「含む(comprise)」という文言は、「からなる(consisting of)」のシナリオも含む。
抗体およびその抗原結合断片
別段の指示がない限り、本明細書で使用されるような用語「抗体」または「Ab」は、ヒトTIGITおよびマウスTIGITを認識してそれらに結合する限り、抗体の他に抗体断片も最も広い意味で包含する。本出願の抗体は、概して、単一特異性抗体を指す。しかし、本出願はまた、異種特異性(ヘテロ特異性)を有する抗体または多重特異性抗体も企図している。「抗体断片」および「抗原結合断片」は交換可能であり、通常、抗原のための結合領域または可変領域を含む全長抗体の一部を意味する。抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFv断片;二特異性抗体;線形抗体;一本鎖抗体分子;および抗体断片から形成された多重特異性抗体を挙げることができる。
別段の指示がない限り、本明細書で使用されるような用語「抗体」または「Ab」は、ヒトTIGITおよびマウスTIGITを認識してそれらに結合する限り、抗体の他に抗体断片も最も広い意味で包含する。本出願の抗体は、概して、単一特異性抗体を指す。しかし、本出願はまた、異種特異性(ヘテロ特異性)を有する抗体または多重特異性抗体も企図している。「抗体断片」および「抗原結合断片」は交換可能であり、通常、抗原のための結合領域または可変領域を含む全長抗体の一部を意味する。抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFv断片;二特異性抗体;線形抗体;一本鎖抗体分子;および抗体断片から形成された多重特異性抗体を挙げることができる。
「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、抗体が他のタンパク質と比較して特定の標的に優先的に結合することを意味するが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要としない。抗体は、その結合がサンプルにおける標的タンパク質の存在を決定する場合に、その意図した標的に対して「特異的」であると見なされ、たとえば、偽陽性などの望ましくない結果を生み出すことはない。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、非標的タンパク質との親和性よりも少なくとも2倍を超える、好ましくは少なくとも10倍を超える、より好ましくは少なくとも20倍を超える、最も好ましくは少なくとも100倍を超える親和性で標的タンパク質に結合する。代替的にまたは付加的に、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、その標的タンパク質に対する、具体的には、1×10-7M未満、1×10-8M未満、1×10-9M(1nM)未満、1×10-10M未満、1×10-11M未満、またはさらには1×10-12M(1pM)未満のKD値によって表されるようなhTIGITとmTIGITの両方に対する結合親和性を有する。
本明細書で使用されるような「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマで産生される場合、マウスの糖鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」は、それぞれ、マウスまたはラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。
ヒトTIGITに特異的に結合する本発明の抗体は、ヒトTIGITのマウスオルソログとも交差反応性を示す。本明細書で使用されるような「交差反応性」という用語は、他の種に由来する同種またはオルソロガスのタンパク質と反応する抗体の能力を指す。抗体の交差反応性は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して判定することができる。たとえば、これは、表面プラズモン共鳴(たとえば、BIACORE)または同様の技術(たとえば、KinExaまたはOCTET)を介する結合親和性の測定によって判定することができる。
本出願の抗体は、不要な物質を取り除くための精製プロセスに付され、結果として精製された抗体を得ることができる。抗体を精製するための従来の方法には、限定されないが、当該技術分野で周知のカラムクロマトグラフィー法が含まれる。
本発明の抗体または抗原結合断片は単離された抗体であり得る。「単離された」という用語とは、抗体または抗原結合断片が、それらが産生される細胞、細胞培養物、増殖培地、発現系からの他の生物学的物質または非生物学的物質を少なくとも部分的に含まないことを意味する。上記物質には、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、緩衝液、塩、または細胞破片および増殖培地などの他の材料が含まれ得る。
本出願は、1つまたは複数の保存的置換を含む抗体またはその抗原結合断片も企図するが、これは、抗体または抗原結合断片が、hTIGITおよびmTIGITに結合し、本明細書に記載されるような抗体の特性の少なくとも1つを保有することを前提とする。アミノ酸の「保存的置換」は、当該技術分野で周知であり、概して、1つのアミノ酸残基を構造または機能において類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基に変更することを指す。
本出願では、たとえば可変領域またはCDRのコンセンサスアミノ酸配列は、本出願の関連抗体の複数の配列を整列させ、各位置で最も頻繁に示される残基を特定することによって決定される。結果として、コンセンサス配列は、アラインメントを行うために使用される本出願の特異抗体に対する高い配列相同性を共有する。(配列全体のアミノ酸配列の30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、または10%未満)の少数のアミノ酸にのみコンセンサス配列とは異なる可変領域またはCDRを含む抗体が、特にアラインメントに示されるような可変位置で、アラインメントに関与する特異抗体に類似した特性を有し得、本出願によって包含されるべきであることが企図され得る。
本出願はまた、本出願の抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列を提供する。「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド」とは、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見られるポリヌクレオチドの全部または一部から除去された、または自然界では結合されていないポリヌクレオチドに結合されたDNAまたはRNAを意味する。特異的なヌクレオチド配列を「含む」単離された核酸分子は、特異的な配列に加えて、列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に結合された制御配列を含み得る。コドン縮重が要因で、当業者は、特定のアミノ酸配列が異なるヌクレオチド配列によってコードされ得ることを理解することができる。
「エフェクター機能」、具体的には「Fc介在エフェクター機能」とは、Fc受容体と抗体のFc領域との相互作用または結合から結果として生じた効果を指し、たとえば、C1複合体上のClqへの結合、補体依存性細胞毒性(CDC)、抗体依存性細胞毒性(ADCC)および抗体依存性細胞媒介食作用(ADCP)などのFcγR介在エフェクター機能を含む。本出願の抗体は、エフェクター機能を有していても有していなくてもよい。
当該技術分野で既知であるように、抗体のエフェクター機能は、抗体のFcおよび/または定常領域のアミノ酸配列または翻訳後修飾を変更することによって調節することができる。本出願の抗体のmIgG2a-DLE変異体(T4またはCS19ME3-23)は、野生型mIgG2aを有する抗体と比較して、抗腫瘍効果が向上していることが分かった。mIgG2a-DLE変異体は、ADCCおよびADCP機能を示したが、CDC機能は示さなかった。したがって、好ましい実施形態では、本出願は、ADCCおよび/またはADCP機能を有するがCDC機能を有さない第1の態様の抗体に関するか;またはADCCおよび/またはADCP機能が増強され、CDC機能が低減されたかまたは存在しない第1の態様の抗体のFc変異体に関する。
本出願に関連して、「免疫記憶」または「免疫学的記憶」とは、免疫系が、特定のチャレンジに対する免疫を確立し、それにより、その後のチャレンジが発生したときに効率的に応答することができることを意味する。本出願の具体的な実施形態では、本出願の抗TIGIT抗体によって作り出された免疫記憶は、抗体の投与が、腫瘍またはがんを減少させるだけでなく、被験体を二次または再発の腫瘍またはがんからも保護することを意味する。より好ましくは、本出願の抗TIGIT抗体によって誘発された免疫記憶は、種々のタイプのがんに対する交差保護を提供する。すなわち、抗体が1つの腫瘍を治療するために使用される場合、交差保護免疫記憶が確立され、本出願の抗体に応答する別の腫瘍を発症することからも被験体を保護する。
治療用途
本開示は、がんおよびウイルス感染、たとえば慢性ウイルス感染などの免疫関連疾患を予防する、治療する、または免疫関連疾患の再発を予防するための方法であって、本出願の第1の態様の治療上有効な量の抗TIGIT抗体または抗原結合断片、または本出願の第2の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
本開示は、がんおよびウイルス感染、たとえば慢性ウイルス感染などの免疫関連疾患を予防する、治療する、または免疫関連疾患の再発を予防するための方法であって、本出願の第1の態様の治療上有効な量の抗TIGIT抗体または抗原結合断片、または本出願の第2の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
本明細書で使用されるような「治療上有効な量」という用語は、疾患、または疾患もしくは障害の臨床症状の少なくとも1つを治療するために被験体に投与されるときに、疾患、障害、または症状のためのそのような治療を有効にするのに十分な抗体の量を指す。「治療上有効な量」は、抗体、疾患、障害、および/または疾患もしくは障害の症状、疾患、障害、および/または疾患もしくは障害の症状の重症度、治療される被験体の年齢、および/または治療される被験体の体重によって変化し得る。任意の所与の例における適切な量は、当業者に明らかであり得るか、または定期的な実験によって判定され得る。併用療法の場合、「治療上有効な量」は、疾患、障害、または病状の有効な治療のための組み合わせ対象の総量を指す。
本出願に関連して、「被験体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、たとえば霊長類、好ましくは高等霊長類、たとえばヒトを指す。
本明細書における「がん」または「腫瘍」という用語は、典型的に調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を意味するか、または説明する。本出願の抗体によって治療することができるがんには、固形腫瘍および血液悪性腫瘍の両方、たとえば、乳がん、リンパ腫、および結腸直腸がんが含まれる。
本出願の抗TIGIT抗体は、限定されないが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗OX40抗体、および抗CTLA4抗体を含む、追加の治療薬と組み合わせて使用することができる。
実施例1.抗TIGIT抗体の産生
本実施例は、ライブラリスクリーニングからの本出願の抗TIGIT抗体の産生を説明する。
本実施例は、ライブラリスクリーニングからの本出願の抗TIGIT抗体の産生を説明する。
抗原標的-TIGIT-ECDおよびmTIGIT-ECD
hTIGITおよびmTIGITの細胞外ドメイン(ECD)を、ライブラリスクリーニングの標的として使用した。両方のECDを、ビオチン化組換え融合タンパク質として発現した。hTIGIT-ECDおよびmTIGIT-ECDの配列アラインメントを図1に示す。
hTIGITおよびmTIGITの細胞外ドメイン(ECD)を、ライブラリスクリーニングの標的として使用した。両方のECDを、ビオチン化組換え融合タンパク質として発現した。hTIGIT-ECDおよびmTIGIT-ECDの配列アラインメントを図1に示す。
ファージディスプレイ抗体ライブラリ
ヒト非免疫scFv(一本鎖可変断片)抗体ライブラリを、93人の健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)から構築した。ライブラリのサイズは合計1.1×1010のメンバーであった(Li D, et al. A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections. Elife 2017;6)。
ヒト非免疫scFv(一本鎖可変断片)抗体ライブラリを、93人の健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)から構築した。ライブラリのサイズは合計1.1×1010のメンバーであった(Li D, et al. A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections. Elife 2017;6)。
ファージ抗体ライブラリの選択およびスクリーニング
表面にscFvを発現するファージ粒子(ファージ-scFv)をライブラリから調製し、精製抗原に対するファージ-scFvの選択に使用した。第1ラウンドの選択は、ビオチン化hTIGIT-ECDタンパク質を、ストレプトアビジン結合磁気M-280 Dynabeads(登録商標)(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies))上に捕捉し、その後、ライブラリから調製した1×1013のファージ粒子とインキュベートした。第2ラウンドの選択は、hTIGIT-ECD-ビオチンまたはmTIGIT-ECD-ビオチンタンパク質を、M-280 Dynabeads上に捕捉し、第1ラウンドの選択から調製したファージ粒子とインキュベートした。各ラウンドの選択は、高親和性Abを得るために、磁気ビーズ上に捕捉された抗原の量を最適化し、広範な洗浄工程を適用した。ライブラリの選択は独立して2回繰り返した。
表面にscFvを発現するファージ粒子(ファージ-scFv)をライブラリから調製し、精製抗原に対するファージ-scFvの選択に使用した。第1ラウンドの選択は、ビオチン化hTIGIT-ECDタンパク質を、ストレプトアビジン結合磁気M-280 Dynabeads(登録商標)(ライフテクノロジーズ社(Life Technologies))上に捕捉し、その後、ライブラリから調製した1×1013のファージ粒子とインキュベートした。第2ラウンドの選択は、hTIGIT-ECD-ビオチンまたはmTIGIT-ECD-ビオチンタンパク質を、M-280 Dynabeads上に捕捉し、第1ラウンドの選択から調製したファージ粒子とインキュベートした。各ラウンドの選択は、高親和性Abを得るために、磁気ビーズ上に捕捉された抗原の量を最適化し、広範な洗浄工程を適用した。ライブラリの選択は独立して2回繰り返した。
続いて、単一のクローンを選択し、レスキューして、細菌培養上清中にファージscFvを生成し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってhTIGITとmTIGITの両方に結合特異性を有する抗体をスクリーニングした。hTIGITおよびmTIGITと交差反応したクローンを、OD450(hTIGITおよびmTIGITの両方に対して>0.6)に基づいて選択した。クローンの重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域のヌクレオチド配列を配列決定した。それらの対応するアミノ酸配列を整列させて、さらなる特徴付けのために種々の配列を有する抗体を特定した。
2ラウンドの選択後、約3000個のファージ-Abクローンを、ELISAを使用してhTIGIT-ECDとmTIGIT-ECDの両方に対する交差結合活性についてスクリーニングし、それにより、交差結合活性を有する約100個のクローンを得た。続いて、これらをhIgG1形式に変換し、FACSを使用してhTIGITとmTIGITの両方を発現するCHO細胞への結合を解析した。
最適な抗体候補を特定するための固有配列を有するAbのさらなる特徴付け
固有配列を有する抗体クローンを、精製ファージ-scFv粒子または全長ヒトIgG1のいずれかとして生成し、ELISA、FACS、またはSPR(表面プラズモン共鳴)によってCD155へのそれらの結合活性およびCD155への競争的結合を試験した。これらのアッセイの結果に基づいて、Abを、それらの結合活性および競争活性に従ってランク付けした。さらなる開発のために上位ランクの抗体を選択した。
固有配列を有する抗体クローンを、精製ファージ-scFv粒子または全長ヒトIgG1のいずれかとして生成し、ELISA、FACS、またはSPR(表面プラズモン共鳴)によってCD155へのそれらの結合活性およびCD155への競争的結合を試験した。これらのアッセイの結果に基づいて、Abを、それらの結合活性および競争活性に従ってランク付けした。さらなる開発のために上位ランクの抗体を選択した。
結合および競争活性の解析のための精製ファージ-scFvの調製
10~30mLの細菌培養の上清中のファージ-scFvをPEG/NaClによって沈殿させ、その後、分光計で定量化した。ファージ-scFvを、ファージ-Abの段階希釈を行い、同じ濃度に正規化することによって、TIGIT結合活性およびTIGITとCD155との間の相互作用をブロックする活性について評価した。
10~30mLの細菌培養の上清中のファージ-scFvをPEG/NaClによって沈殿させ、その後、分光計で定量化した。ファージ-scFvを、ファージ-Abの段階希釈を行い、同じ濃度に正規化することによって、TIGIT結合活性およびTIGITとCD155との間の相互作用をブロックする活性について評価した。
全長IgG1抗体の調製
scFvのVHおよびVLのコード配列を、抗体重鎖(HC)発現ベクターおよび軽鎖(LC)発現ベクターに別々にクローニングした。IgG Abを産生するために、293F(ライフテクノロジー社)細胞を、1:1の比率で2つの発現プラスミド(HC+LCプラスミド)で共トランスフェクションした。トランスフェクションの3~5日後、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(プロテインAセファロース CL-4B、GEヘルスケア社(GE Healthcare)によるIgG Abの精製のために細胞培養上清を回収した。
scFvのVHおよびVLのコード配列を、抗体重鎖(HC)発現ベクターおよび軽鎖(LC)発現ベクターに別々にクローニングした。IgG Abを産生するために、293F(ライフテクノロジー社)細胞を、1:1の比率で2つの発現プラスミド(HC+LCプラスミド)で共トランスフェクションした。トランスフェクションの3~5日後、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(プロテインAセファロース CL-4B、GEヘルスケア社(GE Healthcare)によるIgG Abの精製のために細胞培養上清を回収した。
ELISAに基づく結合および競争アッセイ
ELISAに基づく結合アッセイは、ビオチン化タンパク質抗原を、ストレプトアビジン(シグマ社(Sigma))で被覆した96ウェルプレート(ヌンク社(Nunc)、MaxiSorp(商標))で捕捉した。ファージ-scFvベースのELISAについては、段階希釈したファージ-scFvを加え、その後、マウス抗M13-HRP抗体(GEヘルスケア)を加えることによって検出した。全長ヒトIgGベースのELISAアッセイについて同様のプロセスを実施した。結合したAbを、マウス抗ヒトIgG Fc-HRP抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific))を使用して検出した。
ELISAに基づく結合アッセイは、ビオチン化タンパク質抗原を、ストレプトアビジン(シグマ社(Sigma))で被覆した96ウェルプレート(ヌンク社(Nunc)、MaxiSorp(商標))で捕捉した。ファージ-scFvベースのELISAについては、段階希釈したファージ-scFvを加え、その後、マウス抗M13-HRP抗体(GEヘルスケア)を加えることによって検出した。全長ヒトIgGベースのELISAアッセイについて同様のプロセスを実施した。結合したAbを、マウス抗ヒトIgG Fc-HRP抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific))を使用して検出した。
ELISAに基づく競争アッセイは、試験したAbを、競争リガンド、ヒトCD155、およびマウスCD155の存在下で捕捉された抗原とインキュベートしたことを除いて、ELISAに基づく結合アッセイと類似した方法で実施した。簡単に説明すると、段階希釈した濃度の種々のヒトIgG1抗体を、マウスFcタグと融合したhCD155またはmCD155(hCD155-mFcまたはmCD155-mFc)の細胞外ドメイン2μg/mLと混合し、ELISAプレートに加えて、TIGITへの結合をCD155と競争させた。シグナルを、HRP-抗マウスIgG二次抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用したリガンド検出を介して測定した。
FACSに基づく結合および競争アッセイ
h/mTIGITの全長を安定して発現するCHO細胞株(CHO-hTIGITおよびCHO-hTIGIT)をこのアッセイで使用した。細胞株の構築のために、全長(Uniprot ID Q495A1)またはmTIGIT(Uniprot ID P86176)をコードするDNA断片をベクターに挿入することによって、発現プラスミドを構築した。その後、発現プラスミドをCHO細胞にトランスフェクトし、続いて、これらの安定細胞株のために、10A7(Genetechによって産生された抗TIGIT Ab)染色陽性集団のFACSソーティングを行った。
h/mTIGITの全長を安定して発現するCHO細胞株(CHO-hTIGITおよびCHO-hTIGIT)をこのアッセイで使用した。細胞株の構築のために、全長(Uniprot ID Q495A1)またはmTIGIT(Uniprot ID P86176)をコードするDNA断片をベクターに挿入することによって、発現プラスミドを構築した。その後、発現プラスミドをCHO細胞にトランスフェクトし、続いて、これらの安定細胞株のために、10A7(Genetechによって産生された抗TIGIT Ab)染色陽性集団のFACSソーティングを行った。
FACSに基づく結合アッセイは、CHO-h/mTIGIT細胞株を、1時間4℃で1%BSA/PBS中において5μg/mLの種々のhIgG1 Abとインキュベートした。その後、細胞を1%のBSAを含むPBSで3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG Fc-FITC Ab(Pierce-サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を加えることによって、細胞に結合するAbを検出した。
表面プラズモン共鳴(SPR)技術による結合動態解析
hTIGITまたはmTIGITの細胞外ドメインへのT4およびT4のFc変異体の結合の動態解析を、Biacore T200機器(Biacore、GEヘルスケア社)で実施した。アミンカップリングキット(GEヘルスケア社)を使用して、抗hFc Ab(サーモフィッシャー社)をCM5センサチップの表面に共有結合させた。最適濃度のAbをチップ上に捕捉し、その後、分析物(hTIGITまたはmTIGIT)を、判定された濃度または2倍連続希釈濃度で注入した。結合動態を、1:1のラングミュア結合モデルを使用して評価した。会合速度(ka)、解離速度(kd)、および親和定数(KD)を、Biacore T200評価ソフトウェアを使用して計算した。
hTIGITまたはmTIGITの細胞外ドメインへのT4およびT4のFc変異体の結合の動態解析を、Biacore T200機器(Biacore、GEヘルスケア社)で実施した。アミンカップリングキット(GEヘルスケア社)を使用して、抗hFc Ab(サーモフィッシャー社)をCM5センサチップの表面に共有結合させた。最適濃度のAbをチップ上に捕捉し、その後、分析物(hTIGITまたはmTIGIT)を、判定された濃度または2倍連続希釈濃度で注入した。結合動態を、1:1のラングミュア結合モデルを使用して評価した。会合速度(ka)、解離速度(kd)、および親和定数(KD)を、Biacore T200評価ソフトウェアを使用して計算した。
FACSに基づく結合解析に従って、5つのクローン(T4、#18、#43、#45、およびhm7)が、CHO-hTIGITおよびCHO-mTIGIT細胞の両方に対して高い交差結合親和性を示した(図2A)。それらのhTIGITとmTIGITの両方に対する結合動態により、2つの上位ランクのAb、T4およびhm7 Abを主要な候補として選択した(図2B)。これらの2つのAb、T4およびhm7は、hTIGITとmTIGITの両方との特異的結合を示し、ELISA、FACS、またはSPRアッセイにおいてTIGITに対してそのリガンドCD155との競争活性を示した(図3~4)。
実施例2.VL鎖シャッフリングによるT4の結合親和性の向上
T4結合親和性をさらに向上させるために、本発明者らは、T4のVHが固定され、異なるVk(カッパ可変軽鎖)鎖のライブラリと対になった、VL鎖をシャッフルしたファージディスプレイライブラリを作製した。構築した最終ライブラリ(T4VH/Vk lib)のサイズは約2.8×108であった。
T4結合親和性をさらに向上させるために、本発明者らは、T4のVHが固定され、異なるVk(カッパ可変軽鎖)鎖のライブラリと対になった、VL鎖をシャッフルしたファージディスプレイライブラリを作製した。構築した最終ライブラリ(T4VH/Vk lib)のサイズは約2.8×108であった。
ストレプトアビジン結合磁気M-280 Dynabeads(登録商標)(ライフテクノロジーズ社)上に捕捉されたhTIGITを標的として使用することによって、T4VH/Vk libを2ラウンドの間スクリーニングした。hTIGITとの結合に関してELISAを使用して196個のクローンをスクリーニングした。ほとんどのクローンが陽性であり、それらを配列決定のために選択した。異なるVk鎖配列を有する9個のクローン、1-44、1-48、1-60、1-66、1-93、3-5、3-12、3-17、および3-96を、ファージELISAによって同定した。これらのAbを、全長ヒトIgG1に変換し、Biacoreを使用してhTIGITまたはmTIGITへの結合を試験した。図5に示すように、9個のクローンの中で、クローン1-48は、他のAbよりもhTIGITとmTIGITの両方に対して最も強い結合活性を示した。これらのクローンのVH配列は、配列番号8で同一であり、配列番号14のヌクレオチド配列によってコードされる。これらのクローンのVk配列は図6に示され、ここで、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)は、KabatシステムによるそれぞれのVkのアミノ酸配列において、それぞれ、アミノ酸24~34、アミノ酸50~56およびアミノ酸89~97である。
さらなる配列解析では、1-48 AbのVkのCDR2におけるS50およびY52が、1-48 Abの親和性の向上に寄与したことを示唆した(図6)。
この結果に基づいて、抗体T4Mを産生して、これらの2つのアミノ酸(S50およびY52)をT4の生殖系列Vk配列に組み込んだ。結合動態の解析では、変異体T4Mが、親T4 Abと比較して、特にhTIGITに対する結合親和性を向上させたことを確認した(図7)。
実施例3.VL鎖シャッフリングによるhm7の結合親和性の向上
hm7結合親和性をさらに向上させるために、本発明者らは、hm7のVHが固定され、異なるVl(ラムダ可変軽鎖)鎖のライブラリと対になった、VL鎖をシャッフルしたファージディスプレイライブラリを作製した。構築されている最終ライブラリ(hm7VH/Vl lib)のサイズは約1×108であった。
hm7結合親和性をさらに向上させるために、本発明者らは、hm7のVHが固定され、異なるVl(ラムダ可変軽鎖)鎖のライブラリと対になった、VL鎖をシャッフルしたファージディスプレイライブラリを作製した。構築されている最終ライブラリ(hm7VH/Vl lib)のサイズは約1×108であった。
ストレプトアビジン結合磁気M-280 Dynabeads(登録商標)(ライフテクノロジーズ社)上に捕捉されたhTIGITを標的として使用することによって、hm7VH/Vl libを2ラウンドの間スクリーニングした。hTIGITとの結合に関してELISAによって576個のクローンをスクリーニングした。ほとんどのクローンが陽性であり、それらを配列決定のために選択した。47のAbを、全長hIgG1に変換し、SPRを使用してhTIGITまたはmTIGITへの結合を試験した。異なるVl鎖配列を有する18個のクローン、Tm1、Tm3、Tm4、Tm5、Tm6、Tm7、Tm8、Tm9、Tm10、Tm11、Tm12、Tm13、Tm14、Tm15、Tm17、Tm18、Tm19およびCS19は、hTIGITへの結合に関して親Ab hm7よりも高い親和性を示した(図8)。中でも、CS19は、他のAbよりもhTIGITとmTIGITの両方に対して最も強い結合活性を示した。
潜在的な望ましくない翻訳後修飾および免疫原性を最小限に抑えるため、CS19をさらに変更した。CS19 Abに由来する2つの新しいVlを生成し、それぞれ、CS19ME-Vl(CS19-Vl-Q108K/M49L/N97E)およびCS19ME-N-Vl(CS19-Vl-Q108K/M49L/N97E/K55N)と命名した(図9)。
hm7抗体のVHについては、2つの新しいVHを、生殖細胞系解析に基づいて構築し、それぞれ、hm7-3-23-VH(hm7-VH-V11L/R16G)およびhm7-3-30-VH(hm7-VH-E1Q/L5V)と命名した(図10)。
上述のVHとVLを組み合わせて、2つの新しい抗体、CS19ME3-23 Ab(重鎖:hm7-3-23-VH;軽鎖:CS19ME-Vl)およびCS19ME3-30-N Ab(重鎖:hm7-3-30-VH;軽鎖:CS19ME-N-Vl)を産生した。それらは両方とも、それらの親hm7 Abと比較して、増強された結合親和性を示した(図11)。
hm7およびhm7由来のクローンのVHおよびVL配列を、それぞれ、図10および図9に列挙する。図9に示されるように、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)は、KabatシステムによるそれぞれのVLのアミノ酸配列において、それぞれ、アミノ酸23~34、アミノ酸52~58およびアミノ酸91~102である。図10に示されるように、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)は、KabatシステムによるそれぞれのVLのアミノ酸配列において、それぞれ、アミノ酸31~35、アミノ酸50~66およびアミノ酸99~113である。
実施例4.抗TIGIT抗体のエピトープマッピング
エピトープマッピングのために、hTIGITの細胞外領域の残基をhCD155 D1の対応する残基と置き換えることによって、ヒトTIGIT IgVドメインおよびhCD155のN末端IgVドメインD1のキメラを構築した。3つのhTIGIT変異体および3つのキメラを、図12A~Cに示されるように作製した。これらのキメラおよび変異体を、CHOまたは293T細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、それらの細胞表面発現レベルを、キメラおよび変異体またはhCD155-hFcの各々に融合されたN末端タグを認識するmAb GC33を使用することによって評価した(4)。ヤギ抗ヒトIgG-FITC抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用することによって、これらのトランスフェクタントへのヒトIgG1(hIgG1)フォーマットまたはhCD155-hFcの試験Abの結合を検出した。その後、細胞をFACS装置(BD Accuri(商標)C6)で解析した。
エピトープマッピングのために、hTIGITの細胞外領域の残基をhCD155 D1の対応する残基と置き換えることによって、ヒトTIGIT IgVドメインおよびhCD155のN末端IgVドメインD1のキメラを構築した。3つのhTIGIT変異体および3つのキメラを、図12A~Cに示されるように作製した。これらのキメラおよび変異体を、CHOまたは293T細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、それらの細胞表面発現レベルを、キメラおよび変異体またはhCD155-hFcの各々に融合されたN末端タグを認識するmAb GC33を使用することによって評価した(4)。ヤギ抗ヒトIgG-FITC抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用することによって、これらのトランスフェクタントへのヒトIgG1(hIgG1)フォーマットまたはhCD155-hFcの試験Abの結合を検出した。その後、細胞をFACS装置(BD Accuri(商標)C6)で解析した。
これらのhTIGIT/hCD155キメラまたはhTIGIT変異体でCHO細胞をトランスフェクトし、続いて、FACSによりこれらのCHOトランスフェクタント細胞に結合するT4 Ab、CS19ME3-23 Ab、およびCS19ME3-30-N Abを解析することによって、hTIGITの細胞外IgVドメインのFGループが、これらのAbの結合に重要であることを特定した(図12B)。FGループがhCD155リガンドへの結合にも重要であり、これが以前の発見と一致していることが分かった(5)。したがって、FGループに結合することによって、これらの3つのAbは、TIGITのそのリガンドCD155への結合をブロックする。hTIGITとmTIGITとの間のこのループにおけるアミノ酸配列相同性が高いため、これらの3つのAbは、それらの両方と交差反応することができる。すなわち、T4 Ab、CS19ME3-23 Ab、およびCS19ME3-30-N Abは、ヒトおよびマウスのTIGITに対して異種間反応性を保有している。
さらに、エピトープマッピングの結果に基づいて、C-C’ループは、TIGITへのCS19ME3-23およびCS19ME3-30-Nの結合にも関与している。
米国特許出願公開第2018/0186875号明細書(ジェネンテック)は、ヒトTIGITのアミノ酸残基S78、S80、およびK82が抗TIGIT抗体の重要なエピトープ残基であることを示した。hTIGITへの本開示の抗TIGIT抗体の結合におけるこれらの残基の役割を調査するために、S78A、S80A、およびK82Aから選択される単一の点突然変異を各々が有する3つのhTIGIT変異体を作製した。これらのhTIGIT変異体で293T細胞をトランスフェクトし、続いて、FACSによりこれらの293Tトランスフェクタント細胞に結合するCS19ME3-30-N Abを解析することによって、hTIGITの細胞外IgVドメインにおける3つの残基がいずれも、これらのAbの結合に重要ではないことを特定した(図12C)。
実施例5.抗TIGIT抗体はELISAにおいて有効なリガンドブロック機能を発揮する
ELISAに基づく競争アッセイは、試験したAbを、競争リガンドの存在下で捕捉された抗原とインキュベートしたことを除いて、ELISAに基づく結合アッセイと類似した方法で実施した。簡単に説明すると、段階希釈した濃度の種々のヒトIgG1抗体を、マウスFcタグと融合したhCD155(hCD155-mFc)の細胞外ドメイン0.05μg/mL、マウスFcタグと融合したmCD155(mCD155-mFc)のの細胞外ドメイン0.8μg/mL、またはマウスFcタグと融合したhCD112(hCD112-mFc)のの細胞外ドメイン5μg/mLと混合し、ELISAプレートに加えて、TIGITとCD155との間の結合について競争させた。シグナルを、HRP-抗マウスIgG二次抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用したリガンド検出を介して測定した。
ELISAに基づく競争アッセイは、試験したAbを、競争リガンドの存在下で捕捉された抗原とインキュベートしたことを除いて、ELISAに基づく結合アッセイと類似した方法で実施した。簡単に説明すると、段階希釈した濃度の種々のヒトIgG1抗体を、マウスFcタグと融合したhCD155(hCD155-mFc)の細胞外ドメイン0.05μg/mL、マウスFcタグと融合したmCD155(mCD155-mFc)のの細胞外ドメイン0.8μg/mL、またはマウスFcタグと融合したhCD112(hCD112-mFc)のの細胞外ドメイン5μg/mLと混合し、ELISAプレートに加えて、TIGITとCD155との間の結合について競争させた。シグナルを、HRP-抗マウスIgG二次抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用したリガンド検出を介して測定した。
CD155(PVRまたはNecl-5としても知られる)およびCD112(Pvrl2またはNectin-2としても知られる)は、多くのがん細胞上で高発現される2つの主要なリガンドである(6)。それらは両方ともTIGITと相互作用して、T/NK細胞機能を阻害する(6)。TIGIT結合に対する抗hTIGIT Abの競争活性が確認された。結果は、抗hTIGIT Abが、ELISAアッセイにおいてTIGITに対するそのリガンドCD155またはCD112との競争活性を示したことを示した(図13A~C)。
実施例6.抗TIGIT抗体は細胞に基づくアッセイにおいて有効なリガンドブロック機能を発揮する
本実施例では、本出願の抗TIGIT抗体のリガンドブロック機能を示すために、本発明者らによって実施されたNK細胞の細胞毒性アッセイが説明される。
本実施例では、本出願の抗TIGIT抗体のリガンドブロック機能を示すために、本発明者らによって実施されたNK細胞の細胞毒性アッセイが説明される。
1)安定細胞株の確立
以前の研究では、YTS細胞(NK細胞株)が、721.221標的細胞(MHCクラスI陰性のヒトB細胞株)の限定的な死滅を達成することが示され(6-8)、かつYTS細胞においてhTIGITを発現させ、そして721.221細胞においてhCD155を発現させることによって、この死滅を効果的に阻害することができることが示された(6、7)。
以前の研究では、YTS細胞(NK細胞株)が、721.221標的細胞(MHCクラスI陰性のヒトB細胞株)の限定的な死滅を達成することが示され(6-8)、かつYTS細胞においてhTIGITを発現させ、そして721.221細胞においてhCD155を発現させることによって、この死滅を効果的に阻害することができることが示された(6、7)。
本発明者らは、hTIGITを安定して発現するYTS細胞(YTS-hTIGIT)およびhCD155を安定して発現する721.221細胞(721.221-hCD155)を確立した(図14A~B)。安定細胞株の作製については、hTIGITまたはhCD155の全長cDNAを、PCRによって増幅し、哺乳動物細胞発現プラスミドへとクローニングした。YTS細胞または721.221細胞を、それぞれ、製造元の指示に従って、Neonトランスフェクションシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)またはNucleofectorトランスフェクションシステム(ロンザ社(Lonza)、Nucleofector kit V)を使用して、対応するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、トランスフェクトした細胞を、それぞれ、hCD155-hFcまたはhTIGIT-hFcで免疫染色し、陽性細胞を選別した。選別によって同定された陽性細胞をG418の選択下で培養した。
2)細胞毒性アッセイ
721.221-hCD155細胞(5000細胞/ウェル)を、6時間、5μg/ウェルのAbの存在下で、種々のE:T(エフェクター対標的)でYTS-hTIGITとインキュベートした。その後、細胞による乳酸脱水素酵素(LDH)の放出を、CytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイキット(プロメガ社(Promega))の指示に従って検出した。細胞毒性のパーセンテージを製造元の指示に従って計算した。
721.221-hCD155細胞(5000細胞/ウェル)を、6時間、5μg/ウェルのAbの存在下で、種々のE:T(エフェクター対標的)でYTS-hTIGITとインキュベートした。その後、細胞による乳酸脱水素酵素(LDH)の放出を、CytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイキット(プロメガ社(Promega))の指示に従って検出した。細胞毒性のパーセンテージを製造元の指示に従って計算した。
結果として、YTS上に発現したhTIGITと721.221上に発現したhCD155との相互作用が、それらの親細胞(YTSから721.221へ)の死滅を効果的に阻害したことを確認した(図14Cの左パネル)。
3)リガンドブロック機能アッセイ
本出願の抗TIGIT抗体の効果を試験するために、上述のNK細胞の細胞毒性アッセイを、抗体T4、CS19ME3-23、およびCS19ME3-30-Nの存在下で実施した。T4、CS19ME3-23、およびCS19ME3-30-N Abが、721.221-hCD155細胞を死滅するYTS-hTIGIT細胞の能力を回復させたことが分かり(図14Cの中央および右)、したがって、これらのAbが、TIGIT-CD155相互作用媒介性の阻害機能を効率的にブロックすることが実証された。
本出願の抗TIGIT抗体の効果を試験するために、上述のNK細胞の細胞毒性アッセイを、抗体T4、CS19ME3-23、およびCS19ME3-30-Nの存在下で実施した。T4、CS19ME3-23、およびCS19ME3-30-N Abが、721.221-hCD155細胞を死滅するYTS-hTIGIT細胞の能力を回復させたことが分かり(図14Cの中央および右)、したがって、これらのAbが、TIGIT-CD155相互作用媒介性の阻害機能を効率的にブロックすることが実証された。
実施例7.本出願の抗TIGIT抗体は、インビトロでFc介在エフェクター機能を誘発した
異なるFcに関連したキメラAbの構築
多様なキメラ抗体が、種々のヒトおよびマウスIgGアイソタイプ(hIgG1、mIgG1、およびmIgG2a)、およびhIgG1とmIgG2aアイソタイプの3つのFc変異体:消失したFcγR介在エフェクター機能を有するFc-D265A/N297A(DANA)またはD265A/N297G(DANG)の変異体(9~13);増強されたFcγR介在エフェクター機能を有するFc-S239D/I332E(DE)変異体、Fc-S239D/A330L/I332E(DLE)変異体、および脱フコシル化hIgG1(FUT8ノックアウト293F細胞またはCHO細胞によって発現された)(14~22)に関連して構築された。
異なるFcに関連したキメラAbの構築
多様なキメラ抗体が、種々のヒトおよびマウスIgGアイソタイプ(hIgG1、mIgG1、およびmIgG2a)、およびhIgG1とmIgG2aアイソタイプの3つのFc変異体:消失したFcγR介在エフェクター機能を有するFc-D265A/N297A(DANA)またはD265A/N297G(DANG)の変異体(9~13);増強されたFcγR介在エフェクター機能を有するFc-S239D/I332E(DE)変異体、Fc-S239D/A330L/I332E(DLE)変異体、および脱フコシル化hIgG1(FUT8ノックアウト293F細胞またはCHO細胞によって発現された)(14~22)に関連して構築された。
NK細胞株を使用したADCCアッセイ
ADCC アッセイに関して、全長hTIGITを安定して発現するRaji細胞株(Raji-hTIGIT)を確立し、本アッセイの標的細胞として使用した。FcγR(hFcγRIIIa(F158)またはmFcγRIV受容体)および活性化T細胞の核因子(NFAT)応答エレメント駆動ホタルルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するJurkat細胞株(Jurkat-NFAT-Luc2p/hFcγRIIIa(F158)またはJurkat-NFAT-Luc2p/mFcγRIVと命名された)を産生し、エフェクター細胞として使用した。
ADCC アッセイに関して、全長hTIGITを安定して発現するRaji細胞株(Raji-hTIGIT)を確立し、本アッセイの標的細胞として使用した。FcγR(hFcγRIIIa(F158)またはmFcγRIV受容体)および活性化T細胞の核因子(NFAT)応答エレメント駆動ホタルルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するJurkat細胞株(Jurkat-NFAT-Luc2p/hFcγRIIIa(F158)またはJurkat-NFAT-Luc2p/mFcγRIVと命名された)を産生し、エフェクター細胞として使用した。
標的細胞(15000細胞/ウェル)を、U字形底の96ウェル細胞培養プレートのウェルへと播種し、様々な濃度の異なるAbと短時間インキュベートした。その後、エフェクター細胞を、1%の熱不活性化ウシ胎児血清を補足したRPMI1640培地中の様々な濃度の標的細胞およびAbを含有するウェルに加え(90000細胞/ウェル)、37℃で5時間インキュベートした。ADCC活性を、Bright-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ試薬(プロメガ社)の説明書に従って、ルシフェラーゼ発現によって判定した。
マウスマクロファージを使用したADCPアッセイ
ADCPアッセイに関して、マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、本アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。BMDMを調製するために、マウス骨髄細胞を、C57マウスの脛骨および大腿骨から収集し、3日間、L929上清中で顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)によって誘発した。Raji-hTIGIT安定細胞株を、CFSEで標識し、標的細胞として使用した。BMDMを、標的細胞とのインキュベーション前に抗マウスF4/80-Alex Fluor647(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で標識した。CFSE標識した標的細胞を、2×105細胞/ウェルの密度で蒔き、15分間室温で本出願のさまざまな抗体(20μg/ml)とインキュベートし、その後、DMEM+10%熱不活性化FBS培地中で5%CO2加湿インキュベーターにおいて2時間、37℃で標識したBMDM(1×105細胞/ウェル、結果として1:2のE:T比をもたらす)に加えた。Nikon A1R共焦点顕微鏡を使用して、抗マウスF4/80 Ab標識マクロファージによるCFSE標識した標的細胞の食作用を記録した。
ADCPアッセイに関して、マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、本アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。BMDMを調製するために、マウス骨髄細胞を、C57マウスの脛骨および大腿骨から収集し、3日間、L929上清中で顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)によって誘発した。Raji-hTIGIT安定細胞株を、CFSEで標識し、標的細胞として使用した。BMDMを、標的細胞とのインキュベーション前に抗マウスF4/80-Alex Fluor647(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で標識した。CFSE標識した標的細胞を、2×105細胞/ウェルの密度で蒔き、15分間室温で本出願のさまざまな抗体(20μg/ml)とインキュベートし、その後、DMEM+10%熱不活性化FBS培地中で5%CO2加湿インキュベーターにおいて2時間、37℃で標識したBMDM(1×105細胞/ウェル、結果として1:2のE:T比をもたらす)に加えた。Nikon A1R共焦点顕微鏡を使用して、抗マウスF4/80 Ab標識マクロファージによるCFSE標識した標的細胞の食作用を記録した。
補体媒介性細胞毒性(CDC)アッセイ
CDCアッセイに関して、Raji-hTIGIT安定細胞を、標的細胞として使用し、4×105細胞/ウェルで96ウェルのU字形底プレートに播種し、5%のウサギ血清(シグマ社)の存在下において示した濃度で本出願の100nMの抗TIGIT抗体とインキュベートした。2時間のインキュベーション後、各ウェルにおける上清を、CytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイキット(プロメガ社)を使用して、LDH放出に関して解析した。
CDCアッセイに関して、Raji-hTIGIT安定細胞を、標的細胞として使用し、4×105細胞/ウェルで96ウェルのU字形底プレートに播種し、5%のウサギ血清(シグマ社)の存在下において示した濃度で本出願の100nMの抗TIGIT抗体とインキュベートした。2時間のインキュベーション後、各ウェルにおける上清を、CytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイキット(プロメガ社)を使用して、LDH放出に関して解析した。
抗TIGIT Abが、腫瘍上のTIGITとCD155との間の相互作用とは無関係にそれらの抗腫瘍効果をどのように発揮するかを求めて、本発明者らはまず、抗TIGIT Abが、ADCC、ADCP、およびCDCを含む、インビトロアッセイを使用してFc介在エフェクター機能を保有するかどうかを調べた。
以前の研究では、マウスFcγRIVが、マウスのADCCに関与する主要な受容体であることが示され、ヒトFcγRIIIaの「機能的」相同体となることを提案した(23、24)。AbのADCCを試験するために、本発明者らは、hFcγRIIIa(F158対立遺伝子)またはmFcγRIVを発現するJurkat Tリンパ球細胞(23、24)およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動させるNFAT応答エレメントを、エフェクター細胞として使用し;hTIGITを安定して発現するRaji細胞(Raji-hTIGIT)を標的細胞として使用したレポーター系を確立した。マウスIgG AbのADCCを試験するために、本発明者らは、マウスFcγRIVおよびホタルルシフェラーゼの発現を駆動させるNFAT応答エレメントを発現するJurkat Tリンパ球細胞(Jurkat-NFAT-Luc2p/mFcγRIV)を、エフェクター細胞として使用し、Raji-hTIGITを標的細胞として使用した改変したシステム(25)を使用した。一方、hIgG AbのADCCを試験するために、本発明者らは、FcγRIIIa(F158対立遺伝子)およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動させるNFAT応答エレメントを発現するヒトJurkat Tリンパ球細胞(Jurkat-NFAT-Luc2p/hFcγRIIIa)を、エフェクター細胞として使用し、Raji-hTIGITを標的細胞として使用した系(25)を使用した(図15A)。このADCCアッセイは、hIgG1またはmIgG2aアイソフォームのいずれかでのT4、CS19ME3-23、およびCS19ME3-30-Nが、標的細胞に対してエフェクター細胞によって実行される細胞毒性効果を誘発したことを明らかにした。予想した通りに、hIgG1/mIgG2a-DE、hIgG1/mIgG2a-DLE、およびhIgG1脱フコシル化変異体が、野生型hIgG1およびmIgG2aよりも著しく高いADCC活性を示した;一方で、hIgG1/mIgG2a-DANA/DANGおよびmIgG1は、ADCC機能を誘発しなかった(図15B~E)。
AbのADCP活性を試験するために、BMDMおよびRaji-hTIGITを、それぞれ、エフェクター細胞および標的細胞として使用した。mIgG2aアイソタイプ、mIgG2a-DE変異体、mIgG2a-DLE変異体、およびhIgG1アイソタイプに関連したT4およびCS19ME3-30-N Abが、類似したレベルのADCP活性を示した一方で、mIgG1およびmIgG2a-DANA/DANGはADCPを誘発しなかった(図16)。
AbのCDC活性を試験するために、Raji-hTIGIT細胞株を標的細胞として使用し、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出を、補体を介する標的細胞溶解の読み出しとして使用した。mIgG Abに関して、T4-mIgG2a、T4-mIgG2a-DE、およびT4-mIgG2a-DANAが類似したCDC活性を示した一方で、T4-mIgG1およびT4-mIgG2a-DLEはCDCをまったく誘発しなかった(図17A)。CS19ME3-23-mIgG2aがCS19ME3-23-mIgG2a-DANGよりも強いCDCを示し、CS19ME3-23-mIgG2a-DANGがCS19ME3-23-mIgG2a-DEよりも強いCDCを示した一方で、CS19ME-23-mIgG1およびCS19ME3-23-mIgG2a-DLEは、CDCをまったく誘発しなかった(図17B)。CS19ME3-23およびCS19ME3-30-N hIgG Abに関して、hIgG1のみが有効なCDC機能を示し、他の変異体は示さなかった(図17C)。さらに、それらのhIgG1脱フコシル化変異体は、hIgG1に類似したCDC活性を示した(図17D)。
まとめると、これらの研究は、本出願の抗TIGIT抗体が、CD155へのTIGITの結合をブロックするその活性に加えて、インビトロでのFc介在エフェクター機能を保有することを実証した。これらのAb Fc変異体は、マウスモデルを使用した続くインビボ研究のためのツールセットを提供した。
実施例8.本出願の抗TIGIT抗体は、動物モデルにおいてFc介在エフェクター機能に応じて強力な抗腫瘍活性を発揮した
本実施例では、抗TIGIT Abの抗腫瘍効果を、免疫適格性マウス同系腫瘍モデルを使用して評価した。抗TIGIT Abのエフェクター機能も、抗腫瘍効果へのそれらの寄与に関して調べた。
本実施例では、抗TIGIT Abの抗腫瘍効果を、免疫適格性マウス同系腫瘍モデルを使用して評価した。抗TIGIT Abのエフェクター機能も、抗腫瘍効果へのそれらの寄与に関して調べた。
FACSを用いるマウス腫瘍細胞株上のmCD155発現の検出
マウス腫瘍細胞株、CT26(結腸癌腫)、A20(B細胞リンパ腫)、および4T1(乳がん)を、マウスCD155(mCD155)の発現について調べた。腫瘍細胞表面上のmCD155発現を調べるために、ラット抗mCD155 Ab 4.24.1(バイオレジェンド社(Biolegend))を使用した。ロバ抗ラットIgG-Alexa Fluor 488抗体を二次抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)として使用した。A20細胞を染色するために、mCD155染色の前に、細胞表面Fc受容体を、2.4G2(マウスFcγRIIおよびFcγRIIIへのFc結合をブロックする抗体)を使用して予めブロックした(図18A)。
マウス腫瘍細胞株、CT26(結腸癌腫)、A20(B細胞リンパ腫)、および4T1(乳がん)を、マウスCD155(mCD155)の発現について調べた。腫瘍細胞表面上のmCD155発現を調べるために、ラット抗mCD155 Ab 4.24.1(バイオレジェンド社(Biolegend))を使用した。ロバ抗ラットIgG-Alexa Fluor 488抗体を二次抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)として使用した。A20細胞を染色するために、mCD155染色の前に、細胞表面Fc受容体を、2.4G2(マウスFcγRIIおよびFcγRIIIへのFc結合をブロックする抗体)を使用して予めブロックした(図18A)。
動物試験
すべての動物実験を、中国のNational Guidelines for Housing and Care of Laboratory Animalsに従って行い、北京生命科学研究所(National Institute of Biological Sciences, Beijing)で承認されたIACUCプロトコルの下で実施した。
すべての動物実験を、中国のNational Guidelines for Housing and Care of Laboratory Animalsに従って行い、北京生命科学研究所(National Institute of Biological Sciences, Beijing)で承認されたIACUCプロトコルの下で実施した。
マウス腫瘍モデルを確立するために、6~8週齢の雌BALB/cマウスの右側腹部に1~3×105のCT26、A20、または4T1細胞を皮下接種した。類似した平均腫瘍体積(特に別段明記されている場合を除き、50~100mm3)に基づいて、マウスを無作為に群(n=3~6/群)に分け、週に2回、合計5回または6回、抗TIGIT Ab(10mg/kg)、その変異体、またはPBS緩衝液を腹腔内注射した。腫瘍体積を、電子キャリパーで測定し、修正楕円体式を使用して1/2×(長さ×幅2)として計算した。
CT26およびA20の腫瘍モデルの両方に関して、CS19ME3-30-N-mIgG2a、T4-hIgG1、T4-mIgG2a、またはCS19ME3-23-mIgG2aによる治療によって、対照群と比較して、腫瘍増殖を著しく阻害し、腫瘍退縮を誘発さえした(図18B~E)。
これらの抗TIGIT Abのエフェクター機能がインビボでのそれらの抗腫瘍効果に寄与するかどうかを試験するために、本発明者らは、AbのFc変異体のセットの抗腫瘍活性を、増強または消失したエフェクター機能と比較した。CT26またはA20の腫瘍担持モデルのBALB/cマウスでは、抗TIGIT(T4またはCS19ME3-23)AbのmIgG2a-DLEまたはmIgG2a-DE変異体による治療によって、野生型mIgG2aと比較して抗腫瘍効果が改善され、特にA20腫瘍に対する顕著な改善があり(図18E~F)、これらは実施例7および図15で事前に判定されたADCCエフェクター機能の増強と一致することが分かった。インビトロでのADCCおよびADCP機能を欠くmIgG2a-DANA変異体は、CT26およびA20の腫瘍の両方に対して最小の抗腫瘍活性を示したか、または抗腫瘍活性を示さなかった(図18E~F)。(上記の実施例7に記載されるように)mIgG2a-DLEがインビトロでCDC機能を発揮しなかったという発見を想起すると、これらの変異体の観察された抗腫瘍効果はCDC機能を必要としないと考えられる。
薬物動態解析
本発明者らは、BALB/cマウスにおけるT4 AbのFc変異体のPKプロファイルを検査した。本実験では、6~8週齢の雌BALB/cマウスを使用した。試験Abの単回腹腔内注射後、異なる時点で血液を採取した。血清中のAb濃度をmTIGIT結合ELISAによって測定した。
本発明者らは、BALB/cマウスにおけるT4 AbのFc変異体のPKプロファイルを検査した。本実験では、6~8週齢の雌BALB/cマウスを使用した。試験Abの単回腹腔内注射後、異なる時点で血液を採取した。血清中のAb濃度をmTIGIT結合ELISAによって測定した。
T4 Ab、T4-mIgG2a、T4-mIgG2a-DANAの他に、T4-hIgG1のFc変異体のPKプロファイルがすべて、同等のPKプロファイルを有していた一方で、T4-mIgG2a-DEおよびT4-mIgG2a-DLEは、おそらくインビボでのこれらのAbの安定性がより低いことが原因で、著明にクリアランスがより速く、血清半減期がより短かった(図19)。これらの明らかに劣ったPKプロファイルにもかかわらず、T4-mIgG2a-DEおよびT4-mIgG2a-DLEがより強い抗腫瘍活性を示したことを想起すると(図18E~F)、これらの2つのAb変異体(T4-mIgG2a-DEおよびT4-mIgG2a-DLE)の改善された抗腫瘍活性が、それらの優れたエフェクター機能に起因し得ると結論付けられる。
まとめると、上記結果は、増強されたエフェクター機能を有するFc変異体がインビボで改善された抗腫瘍効果を発揮したため、FcγR関与介在エフェクター機能がインビボでの抗TIGIT Abの抗腫瘍活性にとって重要であることを実証した。したがって、本出願の一実施形態では、抗TIGIT抗体は、増強されたエフェクター機能を有するFc変異体である。
実施例9.抗TIGIT Ab介在腫瘍退縮におけるCD8+TおよびNK細胞の関与
本実施例では、本発明者らは、インビボ免疫細胞枯渇試験を行うことによって、本出願の抗TIGIT抗体の抗腫瘍効果に寄与する免疫細胞型を特定しようとした。
本実施例では、本発明者らは、インビボ免疫細胞枯渇試験を行うことによって、本出願の抗TIGIT抗体の抗腫瘍効果に寄与する免疫細胞型を特定しようとした。
インビボ免疫細胞枯渇
CD4またはCD8+T細胞の枯渇については、T4 Ab治療の2日前に、および週2回、腫瘍担持BALB/cマウスに、200μgのCD4枯渇Ab(クローンGK1.5、BioXCell社)またはCD8枯渇Ab(クローン2.43、BioXCell社)を注射した。
CD4またはCD8+T細胞の枯渇については、T4 Ab治療の2日前に、および週2回、腫瘍担持BALB/cマウスに、200μgのCD4枯渇Ab(クローンGK1.5、BioXCell社)またはCD8枯渇Ab(クローン2.43、BioXCell社)を注射した。
NK細胞の枯渇については、T4 Ab治療の1日前に、および5日に1回、マウスに50μgの抗アシアロ-GM1ポリクローナルAb(Poly21460、バイオレジェンド社)を注射した。
好中球の枯渇については、T4 Ab治療の2日前に、および週2回、マウスに400μgの抗Ly6GモノクローナルAb(1A8クローン、BioXCell社)を注射した。
マクロファージの枯渇については、T4 Ab処理の1日前に、およびその後週1回、マウスに100μLのクロドロネートリポソーム(FormuMax社)を注射した。
免疫細胞枯渇実験のすべてについて、T4 Ab治療が終了するまで枯渇抗体または試薬を与えた。上記の免疫細胞枯渇法の効率を、腫瘍ナイーブBALB/cマウスを使用して確認した。
CD4+またはCD8+T細胞の関与
まず、前述のCT26腫瘍モデルを使用することによって、T細胞の寄与を評価した。T4 Ab治療が、WT BALB/cマウスにおいて効果的なCT26腫瘍退縮を誘発したが、T細胞欠損ヌードマウスにおいて誘発された抗腫瘍活性ははるかに少ないことが観察され(図20A)、これは、T4 Abの十分な治療効果にはT細胞が必要とされることを明確に示唆している。
まず、前述のCT26腫瘍モデルを使用することによって、T細胞の寄与を評価した。T4 Ab治療が、WT BALB/cマウスにおいて効果的なCT26腫瘍退縮を誘発したが、T細胞欠損ヌードマウスにおいて誘発された抗腫瘍活性ははるかに少ないことが観察され(図20A)、これは、T4 Abの十分な治療効果にはT細胞が必要とされることを明確に示唆している。
どの(1つまたは複数の)T細胞サブセットがT4 Ab介在腫瘍退縮に関与しているかを特定するために、T4 Ab治療の2日前に、確立されたCT26腫瘍担持BALB/cマウスにおいて、抗CD4または抗CD8抗体でマウスを処理することによって、それぞれ、CD4+またはCD8+T細胞を枯渇させた。CD4+細胞単独の枯渇は、T4 Ab治療の状況に関係なく腫瘍増殖を大幅に抑制し、これは、抗CD4抗体による治療の結果、免疫抑制性CD4+細胞が除去され、CD4+細胞がT4 Abの抗腫瘍活性に明らかに必要ではないことを示唆している(図20B)。
対照的に、CD8+T細胞が、T4 Ab治療の状況に関係なく、非枯渇マウスと比較して枯渇マウスでは腫瘍増殖がより速く、これは、CD8+T細胞が天然の抗CT26腫瘍免疫において重要なエフェクターとして機能することを示唆している。また、CD8+T細胞の枯渇は、T4 Abの治療効果を完全に無効にし(図20C)、これは、CD8+T細胞がT4 Abの観察された抗腫瘍効果に必須であることを裏付けている。
NK細胞の関与
次に、NK細胞枯渇によるT4 Abの抗腫瘍活性におけるNK細胞の潜在的な役割を、抗アシアロ-GM1抗体を使用することによって評価した。NK細胞枯渇は、確立されたCT26腫瘍担持マウスでT4 Ab治療の1日前に始まり、T4 Ab治療の終了まで続いた。
次に、NK細胞枯渇によるT4 Abの抗腫瘍活性におけるNK細胞の潜在的な役割を、抗アシアロ-GM1抗体を使用することによって評価した。NK細胞枯渇は、確立されたCT26腫瘍担持マウスでT4 Ab治療の1日前に始まり、T4 Ab治療の終了まで続いた。
CD8+細胞での観察と同様に、ここでNKが重要な天然の抗腫瘍エフェクター細胞として機能することが分かった。具体的には、NK枯渇マウスは、非枯渇マウスよりも腫瘍増殖がはるかに速かった。さらに、NK細胞の枯渇によってT4 Ab治療の治療効果は大きく損なわれ(図20D)、これは、T4 Abの抗腫瘍効果がNK細胞を必要とすることを示唆している。
好中球およびマクロファージの関与
抗Ly6G抗体(1A8クローン)を使用して好中球を枯渇させ、クロドロネートリポソームを使用してマクロファージを枯渇させることによる、これらの細胞種の枯渇により、T4 Abの治療効果における好中球およびマクロファージの役割も評価した。
抗Ly6G抗体(1A8クローン)を使用して好中球を枯渇させ、クロドロネートリポソームを使用してマクロファージを枯渇させることによる、これらの細胞種の枯渇により、T4 Abの治療効果における好中球およびマクロファージの役割も評価した。
好中球またはマクロファージの枯渇が、T4 Abの抗腫瘍活性に有意な効果がなかったことが見出され、これは、それらがT4 Abの抗腫瘍効果に関与する可能性が低いことを示唆している(図20E~F)。
同系A20腫瘍モデルマウスにおける枯渇研究
A20腫瘍担持同系BALB/cマウスにおいて、同様の免疫細胞枯渇試験を実施した。CT26腫瘍モデルと同様の結果が観察された。具体的には、CD8+TまたはNK細胞の枯渇は、それぞれ、T4 Abの抗腫瘍効果をブロックまたは大幅に低下させたが、CD4+T、好中球、またはマクロファージの枯渇は、T4 Ab治療後の腫瘍転帰にほとんどまたはまったく効果がなかった(図20G~K)。
A20腫瘍担持同系BALB/cマウスにおいて、同様の免疫細胞枯渇試験を実施した。CT26腫瘍モデルと同様の結果が観察された。具体的には、CD8+TまたはNK細胞の枯渇は、それぞれ、T4 Abの抗腫瘍効果をブロックまたは大幅に低下させたが、CD4+T、好中球、またはマクロファージの枯渇は、T4 Ab治療後の腫瘍転帰にほとんどまたはまったく効果がなかった(図20G~K)。
まとめると、我々の結果は、CD8+TおよびNK免疫細胞が、CT26およびA20の腫瘍担持マウスモデルの両方でT4 Abの治療効果に寄与することを実証している。
実施例10.抗TIGIT Abによる治療によって誘発された交差保護的かつ持続的な抗腫瘍免疫記憶
本実施例では、本発明者らによって発見された本発明の抗TIGIT抗体での治療後の持続的な抗腫瘍免疫記憶および交差保護効果について説明する。
本実施例では、本発明者らによって発見された本発明の抗TIGIT抗体での治療後の持続的な抗腫瘍免疫記憶および交差保護効果について説明する。
腫瘍リチャレンジ研究
抗TIGIT Abの治療後のCT26またはA20の腫瘍が完全に退縮したマウスを、最初の腫瘍接種から80~100日後にCT26、A20、または4T1腫瘍でリチャレンジし、左側腹部に腫瘍細胞(1~3×105のCT26、A20、または4T1)を皮下(s.c.)に接種した。同齢のナイーブマウスを対照として使用し、リチャレンジ群と同じ腫瘍移植を受けさせた。毎週2回、腫瘍体積を測定することによって、腫瘍増殖を経時的にモニターした。マウス血清を、腫瘍細胞のリチャレンジの前に収集し、リチャレンジの前に検出可能な抗TIGIT Abがないことを確認した。
抗TIGIT Abの治療後のCT26またはA20の腫瘍が完全に退縮したマウスを、最初の腫瘍接種から80~100日後にCT26、A20、または4T1腫瘍でリチャレンジし、左側腹部に腫瘍細胞(1~3×105のCT26、A20、または4T1)を皮下(s.c.)に接種した。同齢のナイーブマウスを対照として使用し、リチャレンジ群と同じ腫瘍移植を受けさせた。毎週2回、腫瘍体積を測定することによって、腫瘍増殖を経時的にモニターした。マウス血清を、腫瘍細胞のリチャレンジの前に収集し、リチャレンジの前に検出可能な抗TIGIT Abがないことを確認した。
免疫記憶効果
同年齢のナイーブマウスとは対照的に、抗TIGIT Abで治癒したマウスは、同じ腫瘍によるリチャレンジに対して耐性があった。たとえば、CT26の治癒したマウスはCT26によるリチャレンジに対して耐性があり、同じことがA20腫瘍にも当てはまった(図21AおよびB)。
同年齢のナイーブマウスとは対照的に、抗TIGIT Abで治癒したマウスは、同じ腫瘍によるリチャレンジに対して耐性があった。たとえば、CT26の治癒したマウスはCT26によるリチャレンジに対して耐性があり、同じことがA20腫瘍にも当てはまった(図21AおよびB)。
また、CT26またはA20の腫瘍が完全に退縮したマウスは、両方の腫瘍タイプを拒絶する交差腫瘍免疫が発達したが、別の異なる4T1腫瘍に対しては発達しなかったことが観察された(図21AおよびB)。
これらの結果は、抗TIGIT抗体による治療の結果、保護的で持続的な抗腫瘍免疫記憶がもたらされ得、この記憶は、抗TIGIT Ab治療に応答性である異なるタイプの腫瘍を交差保護することができるが、抗TIGIT Ab治療に抵抗性である腫瘍を交差保護することはできないことを実証している。
実施例11.抗TIGIT Abは低用量でも強力な抗腫瘍効果を示す
本実施例では、種々の用量での抗TIGIT Abの抗腫瘍効果を調べる動物試験について説明する。
本実施例では、種々の用量での抗TIGIT Abの抗腫瘍効果を調べる動物試験について説明する。
すべての動物実験を、中国のNational Guidelines for Housing and Care of Laboratory Animalsに従って行い、北京生命科学研究所で承認されたIACUCプロトコルの下で実施した。
マウス腫瘍モデルに関して、6~8週齢の雌BALB/cマウスの右側腹部に2×105のCT26細胞を皮下接種した。類似した平均CT26腫瘍体積(20~80mm3)に基づいて、マウスを無作為に5つの群(0.3mg/kg群、1mg/kg群、3mg/kg群、10mg/kg群および対照として無治療群;n=5~6/群)に分け、それらに、週1回で4回、抗TIGIT(CS19ME3-30-N-hIgG1-afuco)を腹腔内注射した。腫瘍体積を、電子キャリパーで測定し、修正楕円体式1/2×(長さ×幅2)を使用して計算した。
腫瘍担持マウスモデルにおける低用量および高用量の抗TIGIT Abの抗腫瘍活性を調べるために、異なる投与量でのAbの抗腫瘍活性を、免疫適格性腫瘍担持マウスモデルにおいて比較した。CT26腫瘍モデルを有するBALB/cマウスにおいて、抗TIGIT Ab(CS19ME3-30-N-hIgG1-afuco)による治療は、0.3mg/kgの最低用量でも強力な抗腫瘍活性を示した(図22)。抗体の明らかな用量依存性は観察されなかった。
実施例12.抗PD-1 Abまたは抗PD-L1 Abと組み合わせた抗TIGIT Abの使用
本実施例では、2つの異なる腫瘍を有するマウスモデルにおいて本出願の抗TIGIT抗体とmPD-1またはmPD-L1に対する抗体との併用について調べる。抗mPD-1 Ab(RMP1-14)はBioXCell社から入手し、抗mPD-L1 Abは、マウスPD-L1の細胞外ドメイン(ECD)(mPD-L1-ECD;Uniprot ID Q9EP73)を標的として使用してファージディスプレイ抗体ライブラリから選択した。この抗体を、抗mPD-L1-mIgG2a(mP4)として発現し、本アッセイで使用した。
本実施例では、2つの異なる腫瘍を有するマウスモデルにおいて本出願の抗TIGIT抗体とmPD-1またはmPD-L1に対する抗体との併用について調べる。抗mPD-1 Ab(RMP1-14)はBioXCell社から入手し、抗mPD-L1 Abは、マウスPD-L1の細胞外ドメイン(ECD)(mPD-L1-ECD;Uniprot ID Q9EP73)を標的として使用してファージディスプレイ抗体ライブラリから選択した。この抗体を、抗mPD-L1-mIgG2a(mP4)として発現し、本アッセイで使用した。
すべての動物実験を、中国のNational Guidelines for Housing and Care of Laboratory Animalsに従って行い、北京生命科学研究所で承認されたIACUCプロトコルの下で実施した。
マウス腫瘍モデルに関して、6~8週齢の雌C57BL/6NまたはBALB/cマウスの右側腹部に1×105のMC38または2×105のCT26細胞を皮下接種した。
MC38腫瘍担持マウスを、無作為に群(抗TIGIT Ab治療群(CS19ME3-30-N-mIgG2a、10mg/kg)、抗mPD-1 Ab治療群(RMP1-14、3mg/kg)、併用治療群、および対照として無治療群(PBS);n=3~6/群)に分け、それらに、抗TIGIT Abおよび/または抗mPD-1(BioXCell社、RMP1-14)またはPBSを腹腔内注射した。
類似した平均CT26腫瘍体積(120~270mm3)に基づいて、マウスを無作為に群(n=3~6/群)に分け、それらに、週2回で4~6回、抗TIGIT Abおよび/または抗mPD-1(BioXCell社、RMP1-14)、または抗TIGIT Abおよび/または自作の抗mPD-L1(mP4)を腹腔内注射した。
腫瘍体積を、電子キャリパーで測定し、修正楕円体式1/2×(長さ×幅2)を使用して計算した。
図23に示されるように、抗TIGIT Ab(CS19ME3-30-N-mIgG2aおよびCS19ME3-30-N hIgG1-afuco)は、MC38およびCT26の腫瘍を有するマウスモデルの両方で抗mPD-1またはPD-L1抗体と組み合わせると相乗的な抗腫瘍効果を示した。これらの観察は、本開示の抗TIGIT抗体が、単独で、または、例えば抗mPD-1剤または抗mPD-L1剤などの抗腫瘍剤などの別の治療剤と組み合わせて、さまざまながんの治療などの多数の治療用途に使用され得ることを示唆している。
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Claims (16)
- ヒトTIGIT(IgおよびΠΙΜドメインを有するT細胞免疫受容体)およびマウスTIGITに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
(1)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1(重鎖相補性決定領域1)、配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号9のアミノ酸配列を有するLCDR1(軽鎖相補性決定領域1)、配列番号10のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号11のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号23のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号24のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号25のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(3)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号30のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号31のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号32のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(4)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号1のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号3のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(5)配列番号18のアミノ酸配列を有するHCDR1、配列番号19のアミノ酸配列を有するHCDR2、および配列番号20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号15のアミノ酸配列を有するLCDR1、配列番号16のアミノ酸配列を有するLCDR2、および配列番号17のアミノ酸配列を有するLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む単離された抗体またはその抗原結合断片。 - (1)配列番号8と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号27と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号26と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(3)配列番号34と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号33と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。 - (1)配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);
(2)配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号26のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL);または
(3)配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH);および/または配列番号33のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
を含む請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体が、増強されたエフェクター機能を有するまたはエフェクター機能を有さないヒトIgG1抗体またはその変異体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 修飾のない抗体と比較して、(1)ADCC機能を増強する、(2)ADCP機能を増強する、および/または(3)CDC機能を低減または排除するように、Fc領域を変更することによってさらに修飾される請求項1~3のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体が脱フコシル化抗体である請求項1~3のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 脱フコシル化抗体が、そのフコシル化対応物と比較してエフェクター機能が増加されている抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸。
- (1)配列番号14と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;および/または配列番号13と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;
(2)配列番号29と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;および/または配列番号28と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;または
(3)配列番号36と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列;および/または配列番号35と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するヌクレオチド配列
を含む請求項8記載の核酸。 - 請求項8または9に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項8または9に記載の核酸または請求項10記載のベクターを含む細胞。
- がんまたはウイルス感染の治療における請求項1~7のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
- がんまたはウイルス感染の治療における追加の治療剤と組み合わせた請求項1~7のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
- 前記追加の治療剤が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、または抗TIM3抗体の群から選択される請求項13記載の使用。
- 治療上有効な量の請求項1~7のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、それを必要とする被験体においてがんまたはウイルス感染を治療する方法。
- 抗体またはその抗原結合断片が、CD155へのTIGITの結合をブロックし、エフェクター機能を発揮する請求項15記載の方法。
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