CN116670286A - 用于免疫相关疾病的人抗tigit单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了与人TIGIT和小鼠TIGIT两者结合的抗TIGIT抗体和其抗原结合片段。还提供了编码所述抗体或其片段的核苷酸、包含所述抗体或其片段的组合物或组合、以及所述抗体或其片段在治疗如癌症和病毒感染等免疫相关疾病中的用途。

Description

用于免疫相关疾病的人抗TIGIT单克隆抗体
技术领域
本文描述了与TIGIT结合并且阻断TIGIT的功能(具体地，阻断TI GIT与其配体CD155的相互作用)的分离的抗体或其抗原结合片段。本申请还提供了所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段在治疗如癌症和病毒感染等免疫相关疾病中的用途。
背景技术
免疫疗法已经成为治疗各种癌症的极其有效的方式。最有效的方法之一是基于对免疫检查点受体或配体的阻断。
TIGIT(脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/连接蛋白家族成员)是主要在激活的T细胞、记忆性T细胞、NK细胞和调节性T细胞(Treg)亚群上表达的免疫受体(Johnston,R.J.等人,2014.Cancer cell 26:923-937；Boles,K.S.等人,2009.European journal ofimmunology 39:695-703；Yu,X.,K.等人,2009.Nature immunology 10:48-57；以及Levin,S.D.等人,2011.European journal of immunology 41:902-915)。研究已经显示，TIGIT-/-小鼠更容易受到免疫诱导的自身免疫性的影响(Levin S.D.等人,2011,同上；Joller,N.等人,2011.J Immunol 186:1338-1342.)，从而支持TIGIT在维持免疫稳态方面发挥抑制性受体的作用。TIGIT结合其高亲和力同源配体CD155(也称为PVR)，后者在抗原呈递细胞(A PC)上表达，并且这种结合抑制了经由T细胞和APC以及通过NK细胞的免疫应答(Joller,N.等人,2011,同上；Stanietsky,N.等人,2009.Proc eedings of the National Academy ofSciences of the United States of A merica 106:17858-17863)。还已经显示，TIGIT与CD226竞争结合CD 155(Yu,X.等人,2009,同上)，从而抵消CD226介导的共刺激性T细胞信号传导(Johnston,R.J.等人,2014,同上)，这使人联想到CTLA-4对CD28共刺激功能的抵消功能(Egen,J.G.等人,2002.Nature immun ology 3:611-618.)。
在癌症背景下，已知肿瘤浸润T细胞会使TIGIT上调，并且已知人类和小鼠肿瘤以及肿瘤浸润髓样细胞都会高度表达CD155(Martinet,L.,和M.J.Smyth.)2015.Nat RevImmunol 15:243-254；Chan,C.J.等人,2014.Nature immunology 15:431-438；Blake,S.J.等人,2016.Clinica l cancer research 22:5183-5188；Li,X.Y.等人,2018.J ClinInvest 128:2613-2625；Kurtulus,S.等人,2015.J Clin Invest 125:4053-4062)。已经提出，TIGIT可以经由多个连续步骤抑制抗肿瘤免疫应答(Manieri,N.A.等人,2017.TrendsImmunol 38:20-28)：首先，抑制NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤以及肿瘤抗原释放；然后，诱导致耐受性树突细胞，并且经由TIGIT+Treg抑制CD8+T细胞功能；最后，直接抑制CD8+T细胞效应子功能，从而最终阻止癌细胞的消除。因此，TIGIT被认为是癌症免疫中的关键抑制剂(Manieri,N.A.等人,2017,同上；Dougall,W.C.等人,2017.Immunol Rev 276:112-120)，并且靶向TIGIT被认为是开发癌症免疫疗法的有前景的方法。
抗TIGIT抗体已经在若干鼠癌症模型中显示出治疗效果，并且正在人体临床试验中对若干抗体进行评估(Burugu,S.等人,2018.Semin Ca ncer Biol 52:39-52.)。尽管这些医疗结果具有前景，但对于抗TIGIT抗体赋予其抗肿瘤作用的一种或多种机制的科学认识尚不明确，从而限制了开发更有效的抗体或组合的工作以及辨别哪些患者群体可以受益于这种治疗的临床工作。
因此，仍然需要努力探索抗TIGIT抗体发挥功能的机制，以开发出适合于治疗用途的改进的抗TIGIT抗体。
发明内容
包括科学出版物、专利申请公开案和专利公开案在内的所有参考文献出于所有目的以其整体在此并入。
通过使用人TIGIT的细胞外结构域(ECD)(hTIGIT-ECD；Uniprot ID Q495A1)和小鼠TIGIT的细胞外结构域(mTIGIT-ECD；Uniprot ID P86176)作为靶标来对大型噬菌体展示抗体文库进行交叉选择和筛选，鉴定出一组对TIGIT和CD155的相互作用具有阻断活性的人单克隆抗体。其中，与其他Ab相比，T4 Ab和hm7 Ab对hTIGIT和mTIGIT两者均显示出更高的结合亲和力和更好的阻断活性。通过链改组法对T4 Ab和hm7Ab两者进行优化，得到了结合亲和力甚至更高的更具效力的Ab，从而完成了本发明。另外，发现本申请的抗TIGIT抗体除了对TIGIT与其配体的结合的阻断功能之外还具有Fc介导的效应子功能。此外，还发现，本申请的抗TIGIT抗体能够诱导交叉保护性且持久的免疫记忆效应，从而使所述抗体适合于治疗用途。
在第一方面，本公开文本提供了一种与人TIGIT(hTIGIT)和小鼠TIGIT(mTIGIT)两者结合的分离的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1(重链互补决定区1)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1(轻链互补决定区1)、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3；
(2)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR3；
(3)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR3；
(4)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的LCDR3；或
(5)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR3。
在更具体的实施方案中，与人TIGIT(hTIGIT)和小鼠TIGIT(mTIGIT)两者结合的所述分离的抗体或其抗原结合片段包含
(1)重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:8具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:12具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
(2)重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:27具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:26具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或
(3)重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:34具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:33具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，与人TIGIT(hTIGIT)和小鼠TIGIT(mTIGIT)两者结合的所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在更具体的实施方案中，与人TIGIT(hTIGIT)和小鼠TIGIT(mTIGIT)两者结合的所述分离的抗体或其抗原结合片段包含
(1)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(2)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
(3)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(4)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；或
(5)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在更具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含
(1)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及选自IGKV1-39、T4、1-44、1-48、1-60、1-66、1-93、3-5、3-12、3-17、3-96和T4M的抗体的如图6所示的轻链可变结构域；
(2)重链可变结构域，其选自如图10所示的IGHV3-23、IGHV3-30、hm7、hm7-3-23和hm7-3-30；以及选自IGLV2-11、IGLV2-14、hm7、Tm1、Tm3、Tm4、Tm5、Tm6、Tm7、Tm8、Tm9、Tm10、Tm11、Tm12、Tm13、Tm14、Tm15、Tm17、Tm18、Tm19、CS19、CS19ME和CS19ME-N的抗体的如图9所示的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，所述抗TIGIT抗体是人抗体。在一个实施方案中，所述抗TIGIT抗体是人单克隆抗体(mAb)。
在一个实施方案中，所述抗TIGIT抗体是Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv(ScFv)、或被包含作为双特异性或三特异性抗体中的结构域。
在一个实施方案中，所述抗TIGIT抗体包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的亚类的重链恒定区或其变体，以及κ或λ类型的轻链恒定区或其变体。在优选实施方案中，所述抗TIGIT抗体包含IgG1的重链恒定区。
在一个实施方案中，所述抗TIGIT抗体是分离的抗体。在一个实施方案中，所述抗TIGIT抗体是重组抗体。
在一个实施方案中，本申请的抗TIGIT抗体具有Fc介导的效应子功能。在一个优选实施方案中，本申请的抗TIGIT抗体具有增强的Fc介导的效应子功能。
在一个实施方案中，本申请的抗TIGIT抗体通过改变Fc区而进一步被修饰，以便与没有这种修饰的抗体相比(1)增强ADCC功能、(2)增强ADCP功能、和/或(3)减少或消除CDC功能。优选地，本申请的抗TIGIT抗体的Fc修饰的变体具有与本申请的未进行所述修饰的抗TIGIT抗体相比增强的ADCC功能、增强的ADCP功能、以及减少的CDC功能或无此CDC功能。
在一个实施方案中，本申请的抗TIGIT抗体是去岩藻糖基化抗体。在一个实施方案中，所述去岩藻糖基化抗体具有与其岩藻糖基化对应物相比增强的效应子功能。
在一个实施方案中，本申请的抗TIGIT抗体诱导免疫记忆效应。在更具体的实施方案中，由本申请的抗TIGIT抗体诱导的免疫记忆效应产生跨肿瘤免疫。
在第二方面，本公开文本提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包含本申请的第一方面的抗TIGIT抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂。在优选实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的所述抗TIGIT抗体或抗原结合片段。
在第三方面，本公开文本提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本申请的第一方面的抗TIGIT抗体或抗原结合片段或本申请的第二方面的组合物。在优选实施方案中，所述试剂盒包含治疗有效量的所述抗TIGIT抗体或抗原结合片段。
在第四方面，本公开文本提供了一种用于预防或治疗免疫相关病症或疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本申请的第一方面的抗TIGIT抗体或抗原结合片段或本申请的第二方面的药物组合物。在具体实施方案中，所述免疫相关病症或疾病是癌症或病毒感染(如慢性病毒感染)。
在第五方面，本公开文本提供了一种用于预防免疫相关病症或疾病(如癌症)复发的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本申请的第一方面的抗TIGIT抗体或抗原结合片段或本申请的第二方面的药物组合物。在具体实施方案中，所述疾病或障碍是癌症。
在第六方面，本公开文本提供了本申请的第一方面的抗体或抗原结合片段或本申请的第二方面的药物组合物用于治疗本文所描述的各种病症或疾病或用于预防本文所描述的各种病症或疾病复发的用途。
在第七方面，本公开文本提供了本申请的第一方面的抗TIGIT抗体或抗原结合片段或本申请的第二方面的药物组合物在制造用于治疗本文所描述的各种病症或疾病或用于预防本文所描述的各种病症或疾病复发的药物中的用途。
在第八方面，本公开文本提供了分离的核酸，所述分离的核酸编码第一方面的抗TIGIT抗体或片段。在此方面的更具体的实施方案中，编码所述抗TIGIT抗体或其片段的所述分离的核酸包含
(1)与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，和/或与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，和/或与SEQ ID NO:28的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；或
(3)与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，和/或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在第九方面，本公开文本提供了一种表达载体，所述表达载体包含第八方面的核酸。
在第十方面，本公开文本提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第八方面的核酸或第九方面的表达载体。
附图说明
图1示出了hTIGIT-ECD(人TIGIT细胞外结构域)和mTIGIT-ECD(小鼠TIGIT细胞外结构域)的氨基酸比对，其中，圆点表示具有相同的氨基酸残基的位置。
图2A至图2B示出了抗TIGIT Ab与hTIGIT和mTIGIT的结合。A)流式细胞术分析。B)使用Biacore T200进行单循环动力学分析。
图3A至图3B示出了通过ELISA分析的抗TIGIT Ab的结合活性和配体竞争活性。A)T4和hm7 Ab与经纯化的TIGIT-ECD蛋白质的结合。B)T4和hm7 Ab的配体竞争测定。
图4A至图4B示出了通过SPR得出的抗TIGIT Ab与hTIGIT或mTIGIT的结合动力学。A)使用Biacore T200进行的抗TIGIT Ab(T4和hm7)与hTIGIT或mTIGIT之间的相互作用的多循环动力学分析。B)列出ka、kd和KD的值的表格。
图5A至图5B示出了使用ELISA和SPR进行的T4和源自T4的抗TIGIT Ab与hTIGIT和mTIGIT的结合分析。A)抗TIGIT Ab与经纯化TIGIT-ECD蛋白质(生物素化hTIGIT-ECD或mTIGIT-ECD)的结合分析。B)使用Biacore T200进行的抗TIGIT Ab与hTIGIT或mTIGIT之间的相互作用的单循环动力学分析。
图6示出了源自T4的变体Ab的VL的氨基酸序列和种系序列的比对。圆点表示具有相同氨基酸的位置。氨基酸编号基于共有序列。CDR根据Kabat系统确定，并以灰色阴影表示。
图7A至图7B示出了使用SPR进行的T4和T4M Ab与hTIGIT或mTIGIT的结合动力学。A)使用Biacore T200进行的抗TIGIT Ab与hTIGIT或mTIGIT之间的相互作用的多循环动力学分析。B)列出ka、kd和KD的值的表格。
图8A至图8B示出了使用SPR进行的抗TIGIT Ab(源自hm7的Ab、hm7和T4)与hTIGIT(A)或mTIGIT(B)的结合动力学。
图9示出了源自hm7 Ab的变体的VL的氨基酸序列比对。圆点表示具有相同氨基酸的位置。氨基酸编号基于共有序列。CDR根据Kabat系统确定，并以灰色阴影表示。
图10示出了源自hm7 Ab的变体的VH的氨基酸序列比对。圆点表示具有相同氨基酸的位置。氨基酸编号基于共有序列。CDR根据Kabat系统确定，并以灰色阴影表示。
图11A至图11B示出了使用SPR得出的抗TIGIT Ab与hTIGIT或mTIGIT的结合动力学。A)使用T200进行的抗TIGIT Ab与hTIGIT或mTIGIT之间的相互作用的多循环动力学分析。B)列出ka、kd和KD的值的表格。
图12A至图12C示出了抗TIGIT Ab的表位作图。A)hTIGIT、mTIGIT、hCD155、三种hTIGIT/hCD155嵌合体和三种hTIGIT变体的N末端IgV结构域的氨基酸序列比对。圆点表示具有相同氨基酸的位置，并且破折号指示空位。替代区或突变区以灰色阴影表示。氨基酸编号基于hTIGIT。B)不同的Ab或hCD155-hFc配体与瞬时表达全长hTIGIT(野生型WT)或其嵌合体或变体的CHO细胞的结合的流式细胞术分析。仅二级Ab染色用作阴性对照(Neg.Ctrl.)。通过使用识别N末端标签的mAb(GC33)评估了WT hTIGIT、嵌合体和变体的细胞表面表达水平。C)不同的Ab或hCD155-hFc配体与瞬时表达全长hTIGIT(野生型WT)或其三种变体(S78A、S80A、K82A)的293T细胞的结合的流式细胞术分析。仅二级Ab染色用作阴性对照(Neg.Ctrl.)。通过使用hCD155-hFc评估了WT hTIGIT和变体的细胞表面表达水平。
图13A至图13C示出了通过ELISA分析的抗TIGIT Ab的配体竞争活性。测试了连续稀释浓度的hIgG1形式的CS19ME3-30-N Ab与hCD155-mFc(A)、mCD155-mFc(B)或hCD112(C)竞争结合由在ELISA板上固定化的链霉亲和素捕获的生物素化的hTIGIT、mTIGIT或hTIGIT。
图14A至图14C示出了抗TIGIT Ab有效地逆转了通过TIGIT-CD155相互作用抑制的NK细胞毒性。A-B)通过流式细胞术使用抗TIGIT Ab(10A7)或hTIGIT-Fc融合蛋白评估hTIGIT在YTS-hTIGIT稳定细胞系上或hCD155在721.221-hCD155稳定细胞系上的表达。C)TIGIT/CD155接合破坏了YTS细胞的细胞毒性(左图)，并且T4、CS19ME3-23和CS19ME3-30-NAb有效地逆转了通过TIGIT-CD155相互作用抑制的NK细胞毒性(中间图和右图)。对于NK效应子YTS细胞对721.221靶细胞以及YTS-hTIGIT细胞对721.221-hCD155细胞的杀伤测定，在x轴上指示了效应子与靶标(E:T)之比。对于在存在Ab的情况下的杀伤测定，E:T之比为2:1。抗体10A7作为抗TIGIT参考Ab对照包括在内。Ab是全长hIgG1 Ab。
图15A至图15E示出了本申请的抗TIGIT Ab诱导的ADCC效应子功能。A)产生Raji-hTIGIT细胞系以在体外进行Fc介导的效应子功能分析。通过FACS分析hTIGIT在Raji WT和Raji-hTIGIT细胞上的表达。B)T4 Ab诱导的ADCC效应子功能。使用报告物测定系统测量ADCC活性。分别地，将Jurkat-NFAT-Luc2p/mFcγRIV(Jurkat-mFcγRIV)或Jurkat-NFAT-Luc2p/hFcγRIII(Jurkat-hFcγRIII)用作效应细胞，并将Raji-hTIGIT细胞用作靶细胞。在指定浓度下一式三份地测试Ab。E:T之比为6:1。C-D)hIgG或mIgG型式的CS19ME3-23(C)或CS19ME3-30-N(D)诱导的ADCC效应子功能。在含有0.1μg/ml Ab的培养基中根据小图B中所描述的方法检测ADCC功能。E)hIgG和去岩藻糖基化hIgG1变体诱导的ADCC效应子功能。检测方法与小图B中所描述的方法相同。
图16A至图16C示出了抗TIGIT Ab经由巨噬细胞诱导的ADCP效应子功能。将Raji-hTIGIT靶细胞在与用F4/80-Alexa Fluor 633Ab染色的小鼠骨髓来源的巨噬细胞混合之前用CFSE荧光染料标记。E:T之比为1:2。经由荧光显微术监测ADCP活性。吞噬指数被确定为每100个巨噬细胞中CFSE阳性靶细胞的数量。对由T4 mIgG Ab(A)、CS19ME3-30-N mIgG Ab(B)或hIgG Ab(C)介导的ADCP应答进行检测。(“ns”：无显著性；****P<0.0001)。
图17A至图17D示出了抗TIGIT Ab诱导的CDC效应子功能。将Raji-hTIGIT靶细胞与抗TIGIT Ab在存在5％兔补体血清的情况下一起孵育。使用乳酸脱氢酶(LDH)释放一式三份地测量CDC活性。在15-20μg/ml下测试Ab。对由T4 mIgG Ab(A)、CS19ME3-23 mIgG Ab(B)或hIgG Ab(C和D)介导的CDC应答进行检测。(“ns”：无显著性；****P<0.0001)。
图18A至图18F示出了抗TIGIT Ab在小鼠模型中依赖于Fc介导的效应子功能发挥有效的抗肿瘤活性。A)mCD155在CT26、A20或4T1细胞系上的表达。B-C)CS19ME3-30-N-mIgG2a、T4-hIgG1或T4-mIgG2a在CT26肿瘤模型中的抗肿瘤活性。D)T4-mIgG2a在A20或4T1肿瘤模型中的抗肿瘤活性。E-F)T4或CS19ME3-23 Ab和其Fc变体在CT26和A20肿瘤模型中的抗肿瘤活性。抗体施用的时间点以箭头标记。肿瘤体积显示为平均值±SEM。
图19A至图19D示出了抗TIGIT Ab在小鼠中的药代动力学曲线的结果。A-B)示出了BALB/c小鼠中单次施用T4(A)或CS19ME3-23 Ab(B)(10mg/kg)的log血清Ab浓度随时间变化的曲线图。C-D)示出了C57 WT(C)或C57-hFcRn(D)小鼠中单次施用CS19ME3-30-N-hIgG1Ab(5mg/kg)的血清Ab浓度随时间变化的曲线图。数据表示为平均值±SEM。
图20A至图20K示出了实施例9的耗尽研究的结果。A)T细胞是T4 Ab的最佳治疗效果所需要的。在BALB/c(n＝5/组)和裸鼠(n＝6/组)中比较T4 Ab治疗CT26肿瘤的抗肿瘤效应。B-K)选择性免疫细胞耗尽对T4 Ab在治疗CT26或A20肿瘤时的治疗功效的作用。CD4耗尽抗体(克隆GK1.5)或CD8耗尽抗体(克隆2.43)用于耗尽CD4+或CD8+T细胞。抗Asialo-GM1多克隆抗体(Poly21460)、抗Ly6G抗体(1A8克隆)或氯膦酸盐脂质体(FormuMax)分别用于耗尽NK细胞、嗜中性粒细胞或巨噬细胞。黑色箭头指示耗尽抗体或氯膦酸盐脂质体的施用。T4Ab治疗(10mg/kg)由灰色箭头指示。示出了随时间变化的肿瘤体积(n＝4-6/组)。
图21A至图21B示出了用本申请的抗TIGIT抗体治疗所诱导的免疫记忆。A)将T4 Ab治疗所治愈的荷载CT26肿瘤的小鼠用CT26、A20或4T1再激发。箭头指示再激发的时间点。年龄匹配的初试小鼠作为对照包括在内。n＝3-5/组。B)将T4 Ab治疗所治愈的荷载A20肿瘤的小鼠用A20、CT26或4T1再激发。与小图A中类似地进行研究。
图22示出了抗TIGIT Ab(CS19ME3-30-N-hIgG1-afuco)在不同剂量下的抗肿瘤效应。给药的时间点以箭头标记。肿瘤体积显示为平均值±SEM。
图23A至图23C示出了抗TIGIT Ab和抗PD-1(或抗PD-L1)Ab的协同抗肿瘤效应。A)通过无治疗对照组、抗TIGIT Ab治疗组(CS19ME3-30-N-mIgG2a，10mg/kg)、抗mPD-1Ab治疗组(RMP1-14，3mg/kg)和组合治疗组获得的在荷载MC38的C57小鼠中的抗肿瘤效应的比较。B)和C)基于类似的平均CT26肿瘤体积(120-270mm3)随机分成以下组的荷载CT26的BALB/c小鼠中的抗肿瘤效应的比较：无治疗对照组、抗TIGIT Ab治疗组(CS19ME3-30-N-hIgG1-afuco，1mg/kg)、抗mPD-1Ab治疗组(RMP1-14，5mg/kg)或自制抗mPD-L1 Ab治疗组(mP4，10mg/kg)和组合治疗组。抗体治疗的时间点以箭头标记。肿瘤体积显示为平均值±SEM。
具体实施方式
定义
除非在本文件的其他地方明确定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文(包括所附权利要求)所使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式的词语例如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括它们对应的复数指示物。
除非上下文另外清楚地指示，否则术语“或”用于意指术语“和/或”，并且可与术语“和/或”互换使用。
在本公开文本的上下文中，除非另有指示，否则词语“包含”(“comprise”)以及其变型如“包含”(“comprises”和“comprising”)将被理解为暗示包括所陈述的要素(例如，氨基酸序列、核苷酸序列、特性、步骤或其组)，但不排除任何其他要素(例如，氨基酸序列、核苷酸序列、特性和步骤)。当在本文中使用时，术语“包含”或其任何变型可以用术语“含有”、“包括”代替或有时用“具有”或其等同变型代替。在某些实施方案中，词语“包含”还包括“由……组成”的情况。
抗体和其抗原结合片段
除非另有指示，否则如本文所用的术语“抗体”或“Ab”涵盖最广泛意义上的抗体以及抗体片段，只要其识别并结合人TIGIT和小鼠TIGIT即可。本申请的抗体通常是指单特异性抗体。但是，本申请还设想了具有异源性特异性的抗体(异源特异性抗体)或多特异性抗体。“抗体片段”和“抗原结合片段”是可互换的，意指全长抗体的一部分，所述部分通常包含抗原的结合区或可变区。抗体片段的例子可以包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
“特异性结合”或“特异性地结合”意指与其他蛋白质相比，抗体展现出优先与某个靶标结合，但这种特异性不需要绝对结合特异性。抗体被认为对其预期靶标是“特异性的”，如果其结合决定了样品中靶蛋白的存在而例如没有产生不期望的结果(如假阳性)的话。本发明的抗体或其抗原结合片段将以比与非靶蛋白的亲和力大至少2倍、优选大至少10倍、更优选大至少20倍、以及最优选大至少100倍的亲和力与靶蛋白结合。可替代地或另外地，本发明的抗体或其抗原结合片段将对其靶蛋白、特异性地对hTIGIT和mTIGIT两者具有结合亲和力，正如低于1×10-7M、低于1×10-8M、低于1×10-9M(1nM)、低于1×10-10M、低于1×10-11M、或甚至低于1×10-12M(1pM)的KD值所表示的。
如本文所用的术语“人抗体”意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、在小鼠细胞或在从小鼠细胞衍生的杂交瘤中产生，人抗体可能含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”意指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。
与人TIGIT特异性地结合的本发明的抗体还显示出与人TIGIT的小鼠直向同源物的交叉反应性。如本文所用，术语“交叉反应性”是指抗体与源自其他物种的同源或直向同源蛋白质反应的能力。抗体的交叉反应性可以使用如本领域已知的任何方法来确定。例如，可以经由表面等离子体共振(例如，BIACORE)或类似的技术(例如，KinExa或OCTET)对结合亲和力进行测量来确定所述交叉反应性。
可以对本申请的抗体进行纯化过程以除去不想要的材料，从而得到经纯化的抗体。用于纯化抗体的常规方法包括但不限于本领域中熟知的柱色谱法。
本发明的抗体或抗原结合片段可以是分离的抗体。术语“分离的”意指抗体或抗原结合片段至少部分地不含来自在其中产生所述抗体或抗原结合片段的细胞、细胞培养物、生长培养基、表达系统的其他生物材料或非生物材料。所述材料可以包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、缓冲液、盐或如细胞碎片和生长培养基等其他材料。
本申请还设想了包含一个或多个保守性取代的抗体或其抗原结合片段，只要所述抗体或抗原结合片段与hTIGIT和mTIGIT结合并且具有如本文所描述的抗体的特性中的至少一个特性即可。氨基酸的“保守性取代”是本领域中熟知的，并且通常是指将一个氨基酸残基改变成具有在结构或功能上类似的侧链的另一个氨基酸残基。
在本申请中，例如可变区或CDR的共有氨基酸序列是通过以下来确定的：对本申请的相关抗体的多个序列进行比对并且鉴定出每个位置处最经常显示的残基。因此，共有序列对本申请的用于进行比对的特异性抗体都具有高序列同源性。可以设想到的是，包含在仅几个氨基酸(整个序列的氨基酸的小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、或小于10％)处、尤其是在如比对中所显示的可变位置处与共有序列有所不同的可变区或CDR的抗体可以具有与比对中所涉及的特异性抗体类似的特性，并且也应当为本申请所覆盖。
本申请还提供了分离的核酸序列，所述分离的核酸序列包含编码本申请的抗体或其片段的核苷酸序列。“分离的核酸”或“分离的多核苷酸”意指从多核苷酸的全部或部分中除去的DNA或RNA(其中分离的多核苷酸在自然界中存在)或与在自然界中不与之连接的多核苷酸连接的DNA或RNA。“包含”特异性核苷酸序列的分离的核酸分子除指定的序列之外还可以包含可操作地连接的调节序列，所述调节序列控制所列举的核酸序列的编码区的表达。由于密码子简并性，本领域技术人员可以理解，特异性氨基酸序列可以由不同的核苷酸序列进行编码。
“效应子功能”、特别是“Fc介导的效应子功能”是指由抗体的Fc区与Fc受体的相互作用或结合产生的效应，并且包括例如与C1复合物上的Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、FcγR介导的效应子功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP))。本申请的抗体可以具有效应子功能或没有效应子功能。
如本领域中已知的，抗体的效应子功能可以通过改变所述抗体的Fc区和/或恒定区的氨基酸序列或翻译后修饰来调节。发现，与具有野生型mIgG2a的抗体相比，本申请的抗体的mIgG2a-DLE变体(T4或CS19ME3-23)显示出改进的抗肿瘤效应。mIgG2a-DLE变体显示出ADCC功能和ADCP功能，但没有显示出CDC功能。因此，在优选的实施方案中，本申请涉及：具有ADCC功能和/或ADCP功能、但没有CDC功能的第一方面的抗体；或第一方面的抗体的具有增强的ADCC功能和/或ADCP功能以及减少的CDC功能或无此CDC功能的Fc变体。
在本申请的上下文中，“免疫记忆”或“免疫学记忆”意指免疫系统已经建立了对某些激发的免疫，使得所述免疫系统可以在后续的激发出现时对所述后续的激发作出有效应答。在本申请的具体实施方案中，由本申请的抗TIGIT抗体创建的免疫记忆意指，施用所述抗体不仅减少肿瘤或癌症，而且保护受试者不会患上继发性或复发性肿瘤或癌症。更优选地，由本申请的抗TIGIT抗体诱导的免疫记忆提供了对不同类型癌症的交叉保护。也就是说，当使用所述抗体治疗一种肿瘤时，交叉保护性免疫记忆建立起来，并且会保护受试者不会患上对本申请的抗体也有反应的另一种肿瘤。
治疗用途
本公开文本提供了一种用于预防、治疗或预防免疫相关疾病(如癌症和病毒感染，例如慢性病毒感染)复发的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本申请的第一方面的抗TIGIT抗体或抗原结合片段或本申请的第二方面的药物组合物。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指当向受试者施用以用于治疗疾病、或疾病或障碍的临床症状中的至少一种临床症状时，足以实现对疾病、障碍或症状的这种治疗的抗体的量。“治疗有效量”可随以下项变化：抗体；疾病、障碍和/或疾病或障碍的症状；疾病、障碍和/或疾病或障碍的症状的严重程度；待治疗的受试者的年龄和/或待治疗的受试者的体重。在任何给定的例子中，适当的量对于本领域技术人员来说是清楚的，或者可以通过常规实验来确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合对象的总量。
在本申请的上下文中，“受试者”是指动物、优选哺乳动物，例如灵长类动物、优选高级灵长类动物(例如，人)。
本文中的术语“癌症”或“肿瘤”意指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理病症。可以通过本申请的抗体治疗的癌症包括实体瘤和血液恶性肿瘤(例如，乳腺癌、淋巴瘤和结直肠癌)。
本申请的抗TIGIT抗体可以与另外的治疗剂(包括但不限于抗PD-1抗体、抗PD-Ll抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗OX40抗体和抗CTLA-4抗体)组合地使用。
实施例
实施例1.抗TIGIT抗体的产生
此实施例描述了本申请的抗TIGIT抗体从文库筛选中的产生。
抗原靶标-TIGIT-ECD和mTIGIT-ECD
使用hTIGIT和mTIGIT的细胞外结构域(ECD)作为靶标进行文库筛选。两个ECD均表达为生物素化的重组融合蛋白。图1示出了hTIGIT-ECD和mTIGIT-ECD的序列比对。
噬菌体展示抗体文库
人非免疫性scFv(单链可变片段)抗体文库由93名健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)构建而成。文库的大小为总共1.1×1010个成员(Li D等人A potent humanneutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections.Elife2017；6)。
噬菌体抗体文库的选择和筛选
在其表面上表达scFv的噬菌体颗粒(噬菌体-scFv)从文库中制备而成并且用于选择针对经纯化抗原的噬菌体-scFv。对于第一轮选择，将生物素化的hTIGIT-ECD蛋白质捕获在链霉亲和素缀合的磁性M-280(Life Technologies)上，然后与从文库中制备的1×1013个噬菌体颗粒一起孵育。对于第二轮选择，将hTIGIT-ECD-生物素或mTIGIT-ECD-生物素蛋白捕获在M-280Dynabead上，并且与从第一轮选择中制备的噬菌体颗粒一起孵育。对于每轮选择，为了获得高亲和力Ab，对捕获到磁珠上的抗原量进行优化，并应用充分洗涤步骤。独立重复文库选择两次。
随后，挑选并取出单个克隆以在细菌培养物上清液中产生噬菌体-scFv，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选出对hTIGIT和mTIGIT两者都具有结合特异性的抗体。基于OD450(对于hTIGIT和mTIGIT两者都>0.6)选择出与hTIGIT和mTIGIT交叉反应的克隆。对克隆的重(VH)链和轻(VL)链的可变区的核苷酸序列进行测序。比对对应的氨基酸序列，以鉴定出具有不同序列的抗体以进行进一步表征。
在2轮选择后，使用ELISA对约3000种噬菌体-Ab克隆进行针对与hTIGIT-ECD和mTIGIT-ECD两者的交叉结合活性方面的筛选，因此获得了约100种具有交叉结合活性的克隆。随后，将这些克隆转化成hIgG1型式，并使用FACS对与hTIGIT和mTIGIT表达CHO细胞两者的结合进行分析。
对具有独特序列的Ab进行进一步表征以鉴定出最佳的抗体候选物
将具有独特序列的抗体克隆产生为经纯化的噬菌体-scFv颗粒或全长人IgG1，以通过ELISA、FACS或SPR(表面等离子体共振)测试所述抗体克隆与CD155的结合活性以及与CD155的竞争结合。基于这些测定的结果，将Ab根据其结合活性和竞争活性进行排序。选择排序靠前的抗体进行进一步开发。
制备经纯化的噬菌体-scFv以进行结合和竞争活性的分析
将10-30mL细菌培养物的上清液中的噬菌体-scFv通过PEG/NaCl沉淀，然后通过分光计进行定量。通过对噬菌体-Ab进行连续稀释并归一化到相同的浓度，对噬菌体-scFv的TIGIT结合活性以及阻断TIGIT与CD155之间的相互作用的活性进行评价。
全长IgG1抗体的制备
将scFv的VH编码序列和VL编码序列单独地克隆到抗体重链(HC)表达载体和轻链(LC)表达载体中。为了产生IgG Ab，将293F(Life Technologies)细胞用两种表达质粒(HC+LC质粒)以1:1的比率瞬时共转染。转染后3-5天，收获细胞培养物上清液，以通过蛋白A亲和色谱法(蛋白A琼脂糖凝胶CL-4B，GE Healthcare)对IgG Ab进行纯化。
基于ELISA的结合和竞争测定
对于基于ELISA的结合测定，用链霉亲和素(Sigma)包被的96孔板(Nunc，MaxiSorpTM)捕获生物素化的蛋白抗原。对于基于噬菌体-scFv的ELISA，添加连续稀释的噬菌体-scFv，然后通过添加小鼠抗M13-HRP抗体(GE Healthcare)进行检测。对于基于全长人IgG的ELISA测定，进行类似的过程。使用小鼠抗人IgG Fc-HRP抗体(Thermo FisherScientific)对结合的Ab进行检测。
以与基于ELISA的结合测定类似的方式进行基于ELISA的竞争测定，不同之处在于，将测试的Ab与捕获的抗原在存在竞争配体(人CD155和小鼠CD155)的情况下一起孵育。简而言之，将连续稀释浓度的不同的人IgG1抗体与2μg/mL的hCD155或mCD155的细胞外结构域和小鼠Fc标签的融合体(hCD155-mFc或mCD155-mFc)混合，并添加至ELISA板以与CD155竞争结合TIGIT。通过使用HRP抗小鼠IgG二级Ab(Thermo Fisher Scientific)进行配体检测来测量信号。
基于FACS的结合和竞争测定
在此测定中，使用稳定表达全长h/mTIGIT的CHO细胞系(CHO-hTIGIT和CHO-hTIGIT)。对于细胞系构建，通过将编码全长(Uniprot ID Q495A1)或mTIGIT(Uniprot IDP86176)的DNA片段插入载体中来构建表达质粒。然后将表达质粒转染到CHO细胞中，随后对这些稳定细胞系进行10A7(Genetech产生的抗TIGIT Ab)染色阳性群体的FACS分选。
对于基于FACS的结合测定，将CHO-h/mTIGIT细胞系与不同的hIgG1 Ab在1％ BSA/PBS中以5μg/mL在4℃下一起孵育1小时。然后将细胞用含有1％ BSA的PBS洗涤三次。通过添加山羊抗人IgG Fc-FITC Ab(Pierce-Thermo Fisher Scientific)来检测与细胞结合的Ab。
通过表面等离子体共振(SPR)技术进行结合动力学分析
在Biacore T200仪器(Biacore，GE Healthcare)上对T4和T4的Fc变体与hTIGIT或mTIGIT的细胞外结构域的结合进行动力学分析。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗hFc Ab(Thermo Fisher)共价附接到CM5传感器芯片的表面。将最佳浓度的Ab捕获在芯片上，然后将分析物(hTIGIT或mTIGIT)以确定的浓度或以2倍连续稀释浓度注入。使用1:1Langmuir结合模型对结合动力学进行评价。使用Biacore T200评价软件计算缔合速率(ka)、解离速率(kd)和亲和力常数(KD)。
根据基于FACS的结合分析，五种克隆(T4、#18、#43、#45和hm7)显示出与CHO-hTIGIT细胞和CHO-mTIGIT细胞两者的高交叉结合亲和力(图2A)。由于这五种克隆针对hTIGIT和mTIGIT两者的结合动力学，两种排序靠前的Ab(T4 Ab和hm7 Ab)被选择为主要候选物(图2B)。这两种Ab(T4和hm7)显示出与hTIGIT和mTIGIT两者的特异性结合，并且在ELISA、FACS或SPR测定中显示出与其配体CD155竞争的对于TIGIT的活性(图3-图4)。
实施例2.通过VL链改组提高T4的结合亲和力
为了进一步提高T4结合亲和力，诸位发明人制得VL链改组的噬菌体展示文库，其中，T4的VH是固定的，并与不同的Vk(κ可变轻链)链的文库配对。构建好的最终文库(T4VH/Vk文库)的大小为约2.8×108。
通过使用捕获在链霉亲和素缀合的磁性M-280(LifeTechnologies)上的hTIGIT作为靶标，对T4VH/Vk文库进行两轮筛选。使用ELISA筛选出196种克隆与hTIGIT结合。大多数克隆呈阳性，并且被挑选出进行测序。通过噬菌体-ELISA鉴定出九种具有不同Vk链序列的克隆(1-44、1-48、1-60、1-66、1-93、3-5、3-12、3-17和3-96)。将这些Ab转化成全长人IgG1，并使用Biacore对与hTIGIT或mTIGIT的结合进行测试。在这九种克隆中，克隆1-48显示出相较于其他Ab而言最强的与hTIGIT和mTIGIT两者的结合活性，如图5所示。这些克隆的VH序列是相同的(均为SEQ ID NO:8)，并且由SEQ ID NO:14的核苷酸序列编码。图6中示出了这些克隆的Vk序列，其中，根据Kabat系统，轻链CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)分别是相应Vk的氨基酸序列中的氨基酸24-34、氨基酸50-56和氨基酸89-97。
表1.T4M的序列信息
进一步的序列分析表明，1-48Ab的Vk的CDR2中的S50和Y52促成了1-48Ab的亲和力提高(图6)。
在这一结果的基础上，产生抗体T4M，以将这两个氨基酸(S50和Y52)掺入T4的种系Vk序列中。对结合动力学的分析证实，与亲本T4 Ab相比，变体T4M的(尤其是与hTIGIT的)结合亲和力提高(图7)。
实施例3.通过VL链改组提高hm7的结合亲和力
为了进一步提高hm7结合亲和力，诸位发明人制得VL链改组的噬菌体展示文库，其中，hm7的VH是固定的，并与不同的Vl(λ可变轻链)链的文库配对。构建好的最终文库(hm7VH/Vl文库)的大小为约1×108。
通过使用捕获在链霉亲和素缀合的M-280(Life Technologies)上的hTIGIT作为靶标，对hm7VH/Vl文库进行两轮筛选。通过ELISA筛选出576种克隆与hTIGIT结合。大多数克隆呈阳性，并且被挑选出进行测序。将47种Ab转化成全长hIgG1，并使用SPR对与hTIGIT或mTIGIT的结合进行测试。18种具有不同Vl链序列的克隆(Tm1、Tm3、Tm4、Tm5、Tm6、Tm7、Tm8、Tm9、Tm10、Tm11、Tm12、Tm13、Tm14、Tm15、Tm17、Tm18、Tm19和CS19)显示出相较于亲本Ab hm7而言更高的与hTIGIT结合的亲和力(图8)。其中，CS19显示出相较于其他Ab而言最强的与hTIGIT和mTIGIT两者的结合活性。
对CS19进行进一步工程化，以最小化潜在的、不期望的翻译后修饰和免疫原性。产生两种新的源自CS19 Ab的Vl，并分别命名为CS19ME-Vl(CS19-Vl-Q108K/M49L/N97E)和CS19ME-N-Vl(CS19-Vl-Q108K/M49L/N97E/K55N)(图9)。
对于hm7抗体的VH，基于种系分析，构建两种新的VH，并分别命名为hm7-3-23-VH(hm7-VH-V11L/R16G)和hm7-3-30-VH(hm7-VH-E1Q/L5V)(图10)。
将上文提到的VH和VL组合而产生两种新的抗体CS19ME3-23(重链：hm7-3-23-VH；轻链：CS19ME-Vl)和CS19ME3-30-N Ab(重链：hm7-3-30-VH；轻链：CS19ME-N-Vl)。这两种新的抗体均显示出与它们的亲本hm7 Ab相比而言提高的结合亲和力(图11)。
分别在图10和图9中列出了hm7和源自hm7的克隆的VH序列和VL序列。如图9所示，根据Kabat系统，轻链CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)分别是相应VL的氨基酸序列中的氨基酸23-34、氨基酸52-58和氨基酸91-102。如图10所示，根据Kabat系统，重链CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)分别是相应VL的氨基酸序列中的氨基酸31-35、氨基酸50-66和氨基酸99-113。
表2.CS19ME3-23和CS19ME3-30-N的序列信息
实施例4.抗TIGIT抗体的表位作图
对于表位作图，通过用来自hCD155 D1的对应残基替代hTIGIT的细胞外区中的残基来构建人TIGIT IgV结构域和hCD155的N末端IgV结构域D1的嵌合体。如图12A至图12C所示，产生了三种hTIGIT变体和三种嵌合体。这些嵌合体和变体通过CHO或293T细胞的瞬时转染来表达，通过使用识别与嵌合体和变体中的每一者融合的N末端标签的mAb GC33或使用hCD155-hFc来评估这些嵌合体和变体的细胞表面表达水平(4)。通过使用山羊抗人IgG-FITC抗体(Thermo Fisher Scientific)对人IgG1(hIgG1)型式的测试Ab或hCD155-hFc与这些转染子的结合进行检测。然后使用FACS机器(BD AccuriTMC6)对细胞进行分析。
通过用这些hTIGIT/hCD155嵌合体或hTIGIT变体转染CHO细胞，并且随后通过FACS对T4、CS19ME3-23和CS19ME3-30-N Ab与这些CHO转染子细胞的结合进行分析，鉴定出hTIGIT的细胞外IgV结构域中的FG环对这些Ab的结合是至关重要的(图12B)。发现，FG环对于与hCD155配体的结合而言也是重要的，这与先前的发现是一致的(5)。因此，通过与FG环结合，这三种Ab阻断TIGIT与其配体CD155的结合。由于hTIGIT与mTIGIT在此环中具有较高的氨基酸序列同源性，因此这三种Ab能够与这两者交叉反应。即，T4、CS19ME3-23和CS19ME3-30-N Ab与人TIGIT和小鼠TIGIT具有跨物种反应性。
另外，基于表位作图结果，C-C'环也参与CS19ME3-23和CS19ME3-30-N与TIGIT的结合。
US2018/0186875A1(Genentech)示出了，人TIGIT的氨基酸残基S78、S80和K82是针对其抗TIGIT抗体的关键表位残基。为了研究这些残基在本公开文本的抗TIGIT抗体与hTIGIT的结合中的作用，产生了各自具有选自S78A、S80A和K82A的单点突变的三种hTIGIT变体。通过用这些hTIGIT变体转染293T细胞，并且随后通过FACS对CS19ME3-30-N Ab与这些293T转染子细胞的结合进行分析，鉴定出hTIGIT的细胞外IgV结构域中的三个残基对这些Ab的结合都不是至关重要的(图12C)。
实施例5.抗TIGIT抗体在ELISA中发挥有效的配体阻断功能
以与基于ELISA的结合测定类似的方式进行基于ELISA的竞争测定，不同之处在于，将测试的Ab与捕获的抗原在存在竞争配体的情况下一起孵育。简而言之，将连续稀释浓度的不同的人IgG1抗体与0.05μg/mL的hCD155的细胞外结构域和小鼠Fc标签的融合体(hCD155-mFc)、0.8μg/mL的mCD155的细胞外结构域与小鼠Fc标签的融合体(mCD155-mFc)或5μg/mL的hCD112的细胞外结构域与小鼠Fc标签的融合体(hCD112-mFc)混合，并添加至ELISA板以竞争在TIGIT与CD155之间结合。通过使用HRP抗小鼠IgG二级Ab(Thermo FisherScientific)进行配体检测来测量信号。
CD155(也被称为PVR或Necl-5)和CD112(也被称为Pvrl2或连接蛋白-2)是在许多癌症细胞上大量表达的两种主要配体(6)。它们都与TIGIT相互作用以抑制T/NK细胞功能(6)。抗hTIGIT Ab对TIGIT结合的竞争活性已经得到证实。结果显示出，抗hTIGIT Ab在ELISA测定中显示出与其配体CD155或CD112竞争的对于TIGIT的活性(图13A-图13C)。
实施例6.抗TIGIT抗体在基于细胞的测定中发挥有效的配体阻断功能
在此实施例中，描述了由诸位发明人所进行的NK细胞毒性测定，以显示出本申请的抗TIGIT抗体的配体阻断功能。
1)稳定细胞系的建立
先前的研究显示出，YTS细胞(NK细胞系)实现了对721.221靶细胞(MHC I类阴性人B细胞系)的限制性杀伤(6-8)，并且显示出，这种杀伤可以通过在YTS细胞中表达hTIGIT以及通过在721.221细胞中表达hCD155而有效地得到抑制(6、7)。
诸位发明人建立了稳定表达hTIGIT的YTS细胞(YTS-hTIGIT)和稳定表达hCD155的721.221细胞(721.221-hCD155)(图14A-图14B)。为了产生稳定细胞系，将hTIGIT或hCD155的全长cDNA通过PCR扩增，并克隆到哺乳动物细胞表达质粒中。按照制造商的说明书，使用Neon转染系统(Thermo Fisher Scientific)或Nucleofector转染系统(Lonza，Nucleofector试剂盒V)，将YTS细胞或721.221细胞分别用对应的质粒转染。转染后48小时，将经转染细胞分别用hCD155-hFc或hTIGIT-hFc进行免疫染色，并对阳性细胞进行分选。将通过分选鉴定出的阳性细胞在G418的选择下培养。
2)细胞毒性测定
将721.221-hCD155细胞(5000个细胞/孔)与YTS-hTIGIT以各种E:T(效应子与靶标之比)在存在5μg/孔的Ab的情况下一起孵育6小时。然后，按照CytoTox非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega)的说明书对细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放进行检测。按照制造商的说明书计算出细胞毒性百分比。
结果，证实了，在YTS上表达的hTIGIT和在721.221上表达的hCD155的相互作用有效地抑制了其亲本细胞(YTS对721.221)的杀伤(图14C-左小图)。
3)配体阻断功能测定
为了测试本申请的抗TIGIT抗体的作用，在存在抗体T4、CS19ME3-23和CS19ME3-30-N的情况下进行上文提到的NK细胞毒性测定。发现，T4、CS19ME3-23和CS19ME3-30-N Ab恢复了YTS-hTIGIT细胞杀伤721.221-hCD155细胞的能力(图14C-中间图和右图)，因此证明了，这些Ab有效地阻断了TIGIT-CD155相互作用介导的抑制功能。
实施例7.本申请的抗TIGIT抗体在体外诱导Fc介导的效应子功能在不同Fc的背景 下的嵌合Ab的构建
在以下的背景下构建各种嵌合抗体：不同的人和鼠IgG同种型(hIgG1、mIgG1和mIgG2a)；以及hIgG1和mIgG2a同种型的三种Fc变体：FcγR介导的效应子功能消失的Fc-D265A/N297A(DANA)或D265A/N297G(DANG)变体(9-13)、Fc-S239D/I332E(DE)变体、Fc-S239D/A330L/I332E(DLE)变体；以及FcγR介导的效应子功能增强的去岩藻糖基化hIgG1(通过FUT8敲除293F细胞或CHO细胞来表达)(14-22)。
使用NK细胞系进行ADCC测定
对于ADCC测定，建立稳定表达全长hTIGIT(Raji-hTIGIT)的Raji细胞系，并在此测定中将其用作靶细胞。产生稳定表达FcγR(hFcγRIIIa(F158)或mFcγRIV受体)和由活化T细胞核因子(NFAT)应答元件驱动的萤火虫萤光素酶报告物的Jurkat细胞系(命名为Jurkat-NFAT-Luc2p/hFcγRIIIa(F158)或Jurkat-NFAT-Luc2p/mFcγRIV)，并将其用作效应细胞。
将靶细胞(15000个细胞/孔)接种到U形底96孔细胞培养板的孔中，并与各种浓度的不同Ab一起短暂孵育。然后，在补充有1％热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基中，将效应细胞添加(90000个细胞/孔)到含有靶细胞和各种浓度的Ab的孔中，并在37℃下孵育5小时。根据Bright-GloTM萤光素酶测定试剂(Promega)的说明书，通过萤光素酶表达确定ADCC活性。
使用小鼠巨噬细胞进行ADCP测定
对于ADCP测定，在此测定中将小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)用作效应细胞。为了制备BMDM，从C57小鼠的胫骨和股骨收集小鼠骨髓细胞，并在L929上清液中用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导3天。将Raji-hTIGIT稳定细胞系用CFSE标记，并用作靶细胞。将BMDM在与靶细胞一起孵育之前用抗小鼠F4/80-Alex Fluor647(Thermo FisherScientific)标记。将CFSE标记的靶细胞以2×105个细胞/孔的密度铺板，并在室温下与本申请的不同抗体(20μg/ml)一起孵育15分钟，并且然后在5％ CO2加湿培养箱中在37℃下添加至在DMEM+10％热灭活FBS培养基中的经标记BMDM(1×105个细胞/孔，因此E:T之比为1:2)，保持2小时。使用Nikon A1R共聚焦显微镜记录抗小鼠F4/80Ab标记的巨噬细胞对CFSE标记的靶细胞的吞噬。
补体介导的细胞毒性(CDC)测定
对于CDC测定，将Raji-hTIGIT稳定细胞用作靶细胞，并以4×105个细胞/孔接种在96孔U形底板中，在存在5％兔血清(Sigma)的情况下以指定浓度与100nM的本申请的抗TIGIT抗体一起孵育。在孵育2小时之后，使用CytoTox非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega)对每个孔中的上清液进行LDH释放分析。
为了寻求抗TIGIT Ab如何独立于TIGIT与CD155之间的相互作用对肿瘤发挥其抗肿瘤效应，诸位发明人首先使用体外测定(包括ADCC、ADCP和CDC)检查抗TIGIT Ab是否具有Fc介导的效应子功能。
先前的研究显示，小鼠FcγRIV是参与小鼠体内的ADCC的主要受体，并且其被认为是人FcγRIIIa的“功能性”同源物(23、24)。为了测试Ab的ADCC，诸位发明人建立了报告系统，在所述报告系统中，将表达hFcγRIIIa(F158等位基因)或mFcγRIV(23、24)和驱动萤火虫萤光素酶表达的NFAT应答元件的Jurkat T淋巴细胞用作效应细胞；并且在所述报告系统中，将稳定表达hTIGIT的Raji细胞(Raji-hTIGIT)用作靶细胞。为了测试小鼠IgG Ab的ADCC，诸位发明人使用经修饰系统(25)，在所述经修饰系统中，将表达小鼠FcγRIV和驱动萤火虫萤光素酶表达的NFAT应答元件的Jurkat T淋巴细胞(Jurkat-NFAT-Luc2p/mFcγRIV)用作效应细胞，并将Raji-hTIGIT用作靶细胞。同时，为了测试小鼠hIgG Ab的ADCC，诸位发明人使用一种系统(25)，在所述系统中，将表达小鼠FcγRIIIa(F158等位基因)和驱动萤火虫萤光素酶表达的NFAT应答元件的Jurkat T淋巴细胞(Jurkat-NFAT-Luc2p/hFcγRIIIa)用作效应细胞，并将Raji-hTIGIT用作靶细胞(图15A)。此ADCC测定揭示了，T4、CS19ME3-23和CS19ME3-30-N无论是hIgG1同种型还是mIgG2a同种型都诱导效应细胞对靶细胞产生细胞毒性作用。正如预期，hIgG1/mIgG2a-DE、hIgG1/mIgG2a-DLE和hIgG1-去岩藻糖基化变体展现出相较于野生型hIgG1和mIgG2a而言显著更高的ADCC活性；而hIgG1/mIgG2a-DANA/DANG和mIgG1没有诱导任何ADCC功能(图15B-图15E)。
为了测试Ab的ADCP活性，将BMDM和Raji-hTIGIT分别用作效应细胞和靶细胞。T4和CS19ME3-30-N Ab在mIgG2a同种型、mIgG2a-DE变体、mIgG2a-DLE变体和hIgG1同种型的背景下展现出类似水平的ADCP活性，而mIgG1和mIgG2a-DANA/DANG没有诱导ADCP(图16)。
为了测试Ab的CDC活性，将Raji-hTIGIT细胞系用作靶细胞，并将乳酸脱氢酶(LDH)释放用作通过补体造成的靶细胞裂解的读出。对于mIgG Ab，T4-mIgG2a、T4-mIgG2a-DE和T4-mIgG2a-DANA显示出类似的CDC活性，而T4-mIgG1和T4-mIgG2a-DLE根本没有引发CDC(图17A)。CS19ME3-23-mIgG2a显示出相较于CS19ME3-23-mIgG2a-DANG而言更强的CDC，并且CS19ME3-23-mIgG2a-DANG显示出相较于CS19ME3-23-mIgG2a-DE而言更强的CDC，而CS19ME3-23-mIgG1和CS19ME3-23-mIgG2a-DLE根本没有引发CDC(图17B)。对于CS19ME3-23和CS19ME3-30-N hIgG Ab，仅hIgG1显示出有效的CDC功能，但其他变体没有显示出(图17C)。另外，它们的hIgG1-去岩藻糖基化变体展现出与hIgG1类似的CDC活性(图17D)。
总的来说，这些研究证明了，本申请的抗TIGIT抗体除了其阻断TIGIT与CD155结合的活性之后还在体外具有Fc介导的效应子功能。这些Ab Fc变体为随后使用小鼠模型进行的体内研究提供了工具套件。
实施例8.本申请的抗TIGIT抗体在动物模型中依赖于Fc介导的效应子功能发挥有 效的抗肿瘤活性
在此实施例中，使用免疫感受态鼠同系肿瘤模型评价抗TIGIT Ab的抗肿瘤效应。还检查了抗TIGIT Ab的效应子功能对于抗肿瘤效应的促成。
使用FACS检测小鼠肿瘤细胞系上的mCD155表达
检查鼠肿瘤细胞系CT26(结肠癌)、A20(B细胞淋巴瘤)和4T1(乳腺癌)的小鼠CD155(mCD155)表达。使用大鼠抗mCD155Ab 4.24.1(Biolegend)来检查肿瘤细胞表面上的mCD155表达。将驴抗大鼠IgG-Alexa Fluor 488抗体用作二级Ab(Thermo Fisher Scientific)。为了染色A20细胞，在mCD155染色之前，使用2.4G2(一种阻断Fc与鼠FcγRII和FcγRIII结合的抗体)预阻断细胞表面Fc受体(图18A)。
动物研究
所有动物实验都是按照中国的《国家实验动物饲养护理指南》进行的，并在北京国家生物科学研究所批准的IACUC协议下进行。
为了建立小鼠肿瘤模型，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠右侧腹皮下接种1-3×105个CT26、A20或4T1细胞。基于类似的平均肿瘤体积(除非另有特别指示，否则为50-100mm3)，将小鼠随机分组(n＝3-6/组)，并接受抗TIGIT Ab(10mg/kg)、其变体或PBS缓冲液的腹膜内注射，每周两次，总共注射5次或6次。使用电子卡尺测量肿瘤体积，并使用修正椭球公式1/2×(长度×宽度2)计算。
对于CT26肿瘤模型和A20肿瘤模型两者，与对照组相比，用CS19ME3-30-N-mIgG2a、T4-hIgG1、T4-mIgG2a或CS19ME3-23-mIgG2a治疗显著抑制了肿瘤生长并且甚至诱导了肿瘤消退(图18B-图18E)。
为了测试这些抗TIGIT Ab的效应子功能是否在体内促成其抗肿瘤效应，诸位发明人将Ab的一组Fc变体的抗肿瘤活性与增强或消失的效应子功能比较。在荷载CT26或A20肿瘤模型的BALB/c小鼠中，与野生型mIgG2a相比，用抗TIGIT(T4或CS19ME3-23)Ab的mIgG2a-DLE或mIgG2a-DE变体治疗产生了改进的抗肿瘤效应，尤其是针对A20肿瘤有明显改进(图18E-图18F)，发现这与先前在实施例7和图15中所确定的其增强的ADCC效应子功能是一致的。在体外缺乏ADCC和ADCP功能的mIgG2a-DANA变体对CT26肿瘤和A20肿瘤两者展现出的抗肿瘤活性很小或没有抗肿瘤活性(图18E-图18F)。回顾mIgG2a-DLE在体外没有发挥CDC功能(如上文在实施例7中所描述的)这一发现，可以想到，观察到的这些变体的抗肿瘤效应不需要CDC功能。
药代动力学分析
诸位发明人检查了在BALB/c小鼠中T4 Ab的Fc变体的PK曲线。在此实验中使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠。在单次腹膜内注射测试Ab之后，在不同时间点收集血液。通过mTIGIT结合ELISA测量血清中的Ab浓度。
发现，T4 Ab的Fc变体T4-mIgG2a、T4-mIgG2a-DANA以及T4-hIgG1的PK曲线都具有可比的PK特征，而T4-mIgG2a-DE和T4-mIgG2a-DLE具有明显更快的清除率和更短的血清半衰期(图19)，推测是因为这些Ab在体内的稳定性较低。尽管这些PK特征明显较差，但回顾T4-mIgG2a-DE和T4-mIgG2a-DLE显示出更强的抗肿瘤活性(图18E-图18F)，得出结论，这两种Ab变体(T4-mIgG2a-DE和T4-mIgG2a-DLE)的改进的抗肿瘤活性可以归因于其更优的效应子功能。
综上所述，上述结果证明了，FcγR接合介导的效应子功能对于抗TIGIT Ab在体内的抗肿瘤活性而言是重要的，因为效应子功能增强的Fc变体在体内发挥了改进的抗肿瘤功效。因此，在本申请的一个实施方案中，抗TIGIT抗体是效应子功能增强的Fc变体。
实施例9.CD8+T和NK细胞参与抗TIGITAb介导的肿瘤消退
在此实施例中，诸位发明人寻求通过在体内进行免疫细胞耗尽研究来鉴定出促成本申请的抗TIGIT抗体的抗肿瘤效应的免疫细胞类型。
体内免疫细胞耗尽
对于CD4或CD8+T细胞的耗尽，在T4 Ab治疗前两天，对荷载肿瘤的BALB/c小鼠注射200μg的CD4耗尽Ab(克隆GK1.5，BioXCell)或CD8耗尽Ab(克隆2.43，BioXCell)，每周两次。
对于NK细胞的耗尽，在T4 Ab治疗前一天，对小鼠注射50μg的抗Asialo-GM1多克隆Ab(Poly21460，Biolegend)，每五天一次。
对于嗜中性粒细胞的耗尽，在T4 Ab治疗前两天，对小鼠注射400μg的抗Ly6G单克隆Ab(1A8克隆，BioXCell)，每周两次。
对于巨噬细胞的耗尽，在T4 Ab治疗前一天，对小鼠注射100μL的氯膦酸盐脂质体(FormuMax)，一周一次。
对于所有免疫细胞耗尽实验，均给予耗尽抗体或试剂，直到T4 Ab治疗结束为止。通过使用肿瘤未经处理的BALB/c小鼠证实上文所描述的免疫细胞耗尽方法的效率。
CD4+或CD8+T细胞的参与
首先，通过使用上文提到的CT26肿瘤模型来评价T细胞的贡献。观察到，T4 Ab治疗在WT BALB/c小鼠中诱导了有效的CT26肿瘤消退，但在T细胞缺乏的裸鼠中的抗肿瘤活性要小得多(图20A)，这明确表明，T细胞是实现T4 Ab的完全治疗效果所需要的。
为了鉴定出哪个(哪些)T细胞亚群参与了T4 Ab介导的肿瘤消退，通过在T4 Ab治疗前两天在荷载已建立的CT26肿瘤的BALB/c小鼠中分别用抗CD4抗体或抗CD8抗体治疗小鼠来耗尽CD4+或CD8+T细胞。无论T4 Ab治疗状态如何，单独的CD4+细胞耗尽就很大程度地抑制了肿瘤生长，这表明，抗CD4抗体治疗使得除去了免疫抑制性CD4+细胞，并且表明，CD4+细胞明显不是T4 Ab的抗肿瘤活性所需要的(图20B)。
相比之下，无论T4 Ab治疗状态如何，与未耗尽小鼠相比，在CD8+T细胞被耗尽的小鼠中，肿瘤生长更快，这表明，CD8+T细胞在天然抗CT26肿瘤免疫中起到重要效应子的作用。此外，CD8+T细胞的耗尽完全消除了T4 Ab的治疗效果(图20C)，这证明，CD8+T细胞对于观察到的T4 Ab的抗肿瘤效应而言是至关重要的。
NK细胞的参与
接下来，通过使用抗Asialo-GM1抗体，评价NK细胞通过NK细胞耗尽在T4 Ab的抗肿瘤活性中的潜在作用。在T4 Ab治疗前一天，在荷载已建立的CT26肿瘤的小鼠中开始进行NK细胞耗尽，一直进行到T4 Ab治疗结束为止。
与关于CD8+细胞的观察结果类似，发现NK在此起到重要天然抗肿瘤效应细胞的作用。具体地，与未耗尽小鼠相比，在NK耗尽小鼠中，肿瘤生长快得多。此外，NK细胞的耗尽很大程度地损害了T4 Ab治疗的治疗效果(图20D)，这表明，T4 Ab的抗肿瘤效应涉及NK细胞。
嗜中性粒细胞和巨噬细胞的参与
还通过使用抗Ly6G抗体(1A8克隆)耗尽嗜中性粒细胞并且使用氯膦酸盐脂质体耗尽巨噬细胞来耗尽这些细胞类型，评估了嗜中性粒细胞和巨噬细胞在T4 Ab的治疗效果中的作用。
发现，嗜中性粒细胞或巨噬细胞的耗尽对T4 Ab的抗肿瘤活性没有显著作用，这表明，嗜中性粒细胞或巨噬细胞不太可能参与了T4 Ab的抗肿瘤效应(图20E-图20F)。
同系A20肿瘤模型小鼠中的耗尽研究
在荷载A20肿瘤的同系BALB/c小鼠中进行了类似的免疫细胞耗尽研究。观察到与CT26肿瘤模型类似的结果。具体地，CD8+T或NK细胞的耗尽分别阻断了或基本上减少了T4Ab的抗肿瘤效应，而CD4+T、嗜中性粒细胞或巨噬细胞的耗尽对T4 Ab治疗后的肿瘤结局的作用很小或没有作用(图20G-图20K)。
合起来看，结果证明，CD8+T和NK免疫细胞在荷载CT26肿瘤的小鼠模型和荷载A20肿瘤的小鼠模型两者中都促成了T4 Ab的治疗效果。
实施例10.用抗TIGIT Ab治疗所诱导的交叉保护性且持久的抗肿瘤免疫记忆
此实施例描述了在用诸位发明人发现的本发明抗TIGIT抗体治疗之后的持久抗肿瘤免疫记忆和交叉保护效应。
肿瘤再激发研究
将抗TIGIT Ab治疗后CT26或A20肿瘤完全消退的小鼠在初次肿瘤接种后第80-100天时用CT26、A20或4T1肿瘤再激发，所述初始肿瘤接种是在左侧腹皮下(s.c.)接种肿瘤细胞(1-3×105个CT26、A20或4T1肿瘤细胞)。将年龄匹配的初试小鼠用作对照，并接受与再激发组相同的肿瘤移植。每周测量肿瘤体积两次，随时间监测肿瘤生长。在肿瘤细胞再激发之前收集小鼠血清，并且证实，在再激发之前没有可检测到的抗TIGIT Ab。
免疫记忆效应
与年龄匹配的初试小鼠相比之下，抗TIGIT Ab治愈的小鼠对相同肿瘤的再激发具有抗性。例如，CT26治愈小鼠对CT26的再激发具有抗性，并且对于A20肿瘤同样如此(图21A和图21B)。
此外，观察到，CT26或A20肿瘤完全消退的小鼠形成了排斥这两种肿瘤类型的跨肿瘤免疫，但不排斥另一种不同的4T1肿瘤(图21A和图21B)。
这些结果证明，用抗TIGIT抗体治疗可以产生保护性且持久的抗肿瘤免疫记忆，并且这种记忆能够针对对于抗TIGIT Ab治疗有反应的不同类型的肿瘤有交叉保护，但无法针对对于抗TIGIT Ab治疗具有抗性的肿瘤有交叉保护。
实施例11.抗TIGIT Ab即使在低剂量下也示出有效的抗肿瘤效应
此实施例描述了研究抗TIGIT Ab在不同剂量下的抗肿瘤效应的动物研究。
所有动物实验都是按照中国的《国家实验动物饲养护理指南》进行的，并在北京国家生物科学研究所批准的IACUC协议下进行。
对于小鼠肿瘤模型，将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠右侧腹皮下接种2×105个CT26细胞。基于类似的平均CT26肿瘤体积(20-80mm3)，将小鼠随机分成五组(0.3mg/kg组、1mg/kg组、3mg/kg组、10mg/kg组、以及作为对照的无治疗组；n＝5-6/组)，并接受抗TIGIT(CS19ME3-30-N-hIgG1-afuco)的腹膜内注射，一周一次，注射4次。使用电子卡尺测量肿瘤体积，并使用修正椭球公式1/2×(长度×宽度2)计算。
为了研究低剂量和高剂量的抗TIGIT Ab对荷载肿瘤的小鼠模型的抗肿瘤活性，在免疫感受态荷载肿瘤的小鼠模型中，对Ab在不同给药量下的抗肿瘤活性进行比较。在荷载CT26肿瘤模型的BALB/c小鼠中，用抗TIGIT Ab(CS19ME3-30-N-hIgG1-afuco)治疗即使在0.3mg/kg的最低剂量下也显示出有效的抗肿瘤活性(图22)。没有观察到抗体有明显的剂量依赖性。
实施例12.抗TIGIT Ab与抗PD-1Ab或抗PD-L1 Ab的组合使用
此实施例研究了本申请的抗TIGIT抗体与针对mPD-1或mPD-L1的抗体在两个不同的荷载肿瘤的小鼠模型中的组合使用。抗mPD-1Ab(RMP1-14)来自BioXCell，并且抗mPD-L1Ab是使用小鼠PD-L1的细胞外结构域(ECD)(mPD-L1-ECD；Uniprot ID Q9EP73)作为靶标而从噬菌体展示抗体文库选择的。这种Ab被表达为抗mPD-L1-mIgG2a(mP4)，并用于此测定中。
所有动物实验都是按照中国的《国家实验动物饲养护理指南》进行的，并在北京国家生物科学研究所批准的IACUC协议下进行。
对于小鼠肿瘤模型，将6-8周龄的雌性C57BL/6N或BALB/c小鼠右侧腹皮下接种1×105个MC38细胞或2×105个CT26细胞。
将荷载MC38肿瘤的小鼠随机分组(抗TIGIT Ab治疗组(CS19ME3-30-N-mIgG2a，10mg/kg)、抗mPD-1Ab治疗组(RMP1-14，3mg/kg)、组合治疗组、以及作为对照的无治疗组(PBS)；n＝3-6/组)，并接受抗TIGIT Ab和/或抗mPD-1(BioXCell，RMP1-14)或PBS的腹膜内注射。
基于类似的平均CT26肿瘤体积(120-270mm3)，将小鼠随机分组(n＝3-6/组)，并接受抗TIGIT Ab和/或抗mPD-1(BioXCell，RMP1-14)或抗TIGIT Ab和/或自制抗mPD-L1(mP4)的腹膜内注射，每周两次，注射4-6次。
使用电子卡尺测量肿瘤体积，并使用修正椭球公式1/2×(长度×宽度2)计算。
如图23所示，在荷载MC38肿瘤的小鼠模型和荷载CT26肿瘤的小鼠模型两者中，抗TIGIT Ab(CS19ME3-30-N-mIgG2a和CS19ME3-30-N hIgG1-afuco)在与抗mPD-1或PD-L1抗体组合时都展现出协同抗肿瘤功效。这些观察结果表明，本公开文本的抗TIGIT抗体可以单独地或与另一种治疗剂(如抗肿瘤剂，例如抗mPD-1剂或抗mPD-Ll剂)组合地用于许多治疗应用中，如用于治疗各种癌症。
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序列表
<110> 华辉安健（北京）生物科技有限公司
<120> 用于免疫相关疾病的人抗TIGIT单克隆抗体
<130> CT12807HHH33CN
<150> PCT/CN2020/098133
<151> 2020-06-24
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
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Arg Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Tyr Leu Asn
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
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Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
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<212> PRT
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(105)
<223> X为E,或D
<400> 7
Asp Ile Xaa Xaa Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Asp Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Lys Xaa Pro Xaa Leu Leu Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Xaa Gly
50 55 60
Ser Xaa Ser Xaa Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Xaa Ser Leu Xaa Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Xaa Thr Tyr Xaa Cys Gln Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile
85 90 95
Xaa Phe Gly Xaa Xaa Thr Xaa Leu Xaa Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 VH
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr His Ser Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Lys Leu Phe Arg Trp Lys Lys Thr Thr Val Thr Thr Phe
100 105 110
Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4M LCDR1
<400> 9
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4M LCDR2
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Ser Ala Tyr Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4M LCDR3
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Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile Thr
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T4M VL
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Tyr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 321
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (265)..(291)
<400> 13
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatacagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 14
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T4 VH核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(105)
<223> HCDR1编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (148)..(195)
<223> HCDR2编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (292)..(363)
<223> HCDR3编码序列
<400> 14
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtcattcaat gattactact ggacctggat ccgccaggcc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcactcaca gtggaagcgc cgactacaat 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agggctcaaa 300
ctttttcgtt ggaaaaagac tacggtgact acgttccccc cttactacta cggtatggac 360
gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca 396
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 LCDR1共有序列
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X为G, R, S,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X为Y,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X为N, P, D,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X为F,或Y
<400> 15
Thr Gly Xaa Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 cons LCDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X为E, D, Y, A,或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X为V, A,或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X为S, T, N, H, G, I,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X为K,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X为P,或A
<400> 16
Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser
1 5
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 cons LCDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X为S, R, A, T,或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X为S, G, R,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X为S, M, P,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X为G, S, P, T, N,或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X为S, H, G, T, N,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X为T, Q, A, P, G, V, K,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X为R, S, T, G, L, K, N, H, A,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X为L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X为V, L,或I
<400> 17
Ser Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 cons HCDR1
<400> 18
Ser Tyr Ala Met His
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 cons HCDR2
<400> 19
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 cons HCDR3
<400> 20
Leu Glu Gly Gly Gly Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 cons VL
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X为S, A或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X为A, G,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X为R, A,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X为V,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X为G, A,或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X为V,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X为I,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X为T,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X为S, I, G,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X为S,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X为G, R, S,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X为Y,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X为N, P, D,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X为F,或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X为Q,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X为H, D, Y,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X为G,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> X为A,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> X为K,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X为M, I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> X为I,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X为Y,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> X为E, D, Y, A,或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> X为V, A,或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> X为S, T, N, H, G, I,或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X为K,或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> X为P,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> X为P, S,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X为D, N, A,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> X为G,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> X为S,或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> X为G,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (71)..(71)
<223> X为N, S,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(74)
<223> X为S,或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> X为I,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (78)..(78)
<223> X为S,或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> X为Q,或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> X为A, T, S,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> X为E,或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> X为A,或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (87)..(87)
<223> X为D, H, Q,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (89)..(89)
<223> X为Y,或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(94)
<223> X为S, R, A, T,或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (95)..(95)
<223> X为S, G, R,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (96)..(96)
<223> X为S, M, P,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (97)..(97)
<223> X为G, S, P, T, N,或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (98)..(98)
<223> X为S, H, G, T, N,或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(99)
<223> X为T, Q, A, P, G, V, K,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> X为R, S, T, G, L, K, N, H, A,或缺失
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (101)..(101)
<223> X为L,或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (102)..(102)
<223> X为V, L,或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (108)..(108)
<223> X为K,或Q
<400> 21
Gln Xaa Xaa Leu Thr Gln Pro Xaa Ser Xaa Ser Xaa Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Xaa Thr Xaa Ser Cys Thr Gly Xaa Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Val Ser Trp Tyr Gln Xaa Xaa Pro Xaa Lys Xaa Pro Xaa Leu
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Ser Gly Val Xaa Xaa Arg Phe
50 55 60
Ser Xaa Xaa Lys Ser Xaa Xaa Thr Ala Xaa Leu Thr Xaa Xaa Gly Leu
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Asp Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Cys Ser Ser Tyr Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Xaa Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 22
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hm7 cons VH
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Leu Glu Gly Gly Gly Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME LCDR1 AA
<400> 23
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe Val Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME LCDR2
<400> 24
Ala Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME LCDR3
<400> 25
Ser Ser Tyr Ser Ser Glu Ser Thr Arg Val Val
1 5 10
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME VL
<400> 26
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Glu
85 90 95
Ser Thr Arg Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 27
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME3-23 VH
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Leu Glu Gly Gly Gly Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME VL NA
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(108)
<223> LCDR1编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (154)..(174)
<223> LCDR2编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (271)..(303)
<223> LCDR3编码序列
<400> 28
cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt ggttataact ttgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcctgatt tatgctgtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatatt caagcgagag cactagggtg 300
gttttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 29
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME3-23 VH NA
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(105)
<223> HCDR1编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (148)..(198)
<223> HCDR2编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (295)..(339)
<223> HCDR3编码序列
<400> 29
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gactctcgag 300
ggagggggac ggtattacga tttttggagc gctgactact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctctt ca 372
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME-N LCDR1
<400> 30
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe Val Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME-N LCDR2
<400> 31
Ala Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME-N LCDR3
<400> 32
Ser Ser Tyr Ser Ser Glu Ser Thr Arg Val Val
1 5 10
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME-N VL
<400> 33
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Glu
85 90 95
Ser Thr Arg Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 34
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME3-30-N VH
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Leu Glu Gly Gly Gly Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME-N VL NA
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(108)
<223> LCDR1编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (154)..(174)
<223> LCDR2编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (271)..(303)
<223> LCDR3编码序列
<400> 35
cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt ggttataact ttgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcctgatt tatgctgtca gtaaccggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatatt caagcgagag cactagggtg 300
gttttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 36
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CS19ME3-30-N VH NA
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(105)
<223> HCDR1编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (148)..(198)
<223> HCDR2编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (295)..(339)
<223> HCDR3编码序列
<400> 36
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtacagc ctgggcggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gactctcgag 300
ggagggggac ggtattacga tttttggagc gctgactact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctctt ca 372

Claims (16)

1.一种与人TIGIT(具有Ig和结构域的T细胞免疫受体)和小鼠TIGIT结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1(重链互补决定区1)、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR1(轻链互补决定区1)、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR3；
(2)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQID NO:19的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR3；
(3)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQID NO:19的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR3；
(4)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的LCDR3；或
(5)重链可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQID NO:19的氨基酸序列的HCDR2、以及具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR3；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:8具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:12具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；
(2)重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:27具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:26具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；或
(3)重链可变结构域(VH)，其包含与SEQ ID NO:34具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含与SEQ ID NO:33具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(2)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或
(3)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是具有增强的效应子功能或没有效应子功能的人IgGl抗体或其变体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段通过改变Fc区而进一步被修饰，以便与没有这种修饰的抗体相比(1)增强ADCC功能、(2)增强ADCP功能、和/或(3)减少或消除CDC功能。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是去岩藻糖基化抗体。
7.所述抗体或其抗原结合片段，其中所述去岩藻糖基化抗体具有与其岩藻糖基化对应物相比增强的效应子功能。
8.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的核酸，其包含
(1)与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，和/或与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，和/或与SEQ ID NO:28的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；或
(3)与SEQ ID NO:36的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，和/或与SEQ ID NO:35的核苷酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
10.一种载体，其包含根据权利要求8或9所述的核酸。
11.一种细胞，其包含根据权利要求8或9所述的核酸或根据权利要求10所述的载体。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在治疗癌症或病毒感染中的用途。
13.与另外的治疗剂组合的根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在治疗癌症或病毒感染中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述另外的治疗剂选自抗PD-1抗体、抗PD-Ll抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、或抗TIM3抗体。
15.一种治疗有需要的受试者的癌症或病毒感染的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断TIGIT与CD155的结合并且发挥效应子功能。
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