KR20140127437A - 락토바실러스 파라카제이 ｍｋ１을 이용한 주름개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 두유에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시킨 두유 발효물, 또는 그로부터 제조된 두유 펩타이드 분획물을 유효성분으로 하는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 피부 세포에 독성을 나타내지 않으면서 주름개선 활성을 나타내는 천연 기능성 소재로서 주름개선용 화장료 조성물의 소재로 활용할 수 있다.

Description

락토바실러스 파라카제이 ＭＫ１을 이용한 주름개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법{Anti-wrinkle cosmetic composition using Lactobacillus paracasei MK1 and preparation method thereof}

본 발명은 주름개선용 화장료 조성물, 그 제조방법 및 그 제조방법에 이용되는 유산균에 관한 것이다.

세포 외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포 외 간질에 존재한다. 또한, 생체 단백질 총 중량의 약 30 %를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3 중 나선구조를 가지고 있다. 콜라겐은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부(지피)에 그 포함량이 높다. 대부분의 다른 체 구조물에서는 섬유상 봉입체로서 존재한다.

콜라겐은 비교적 약한 면역원인데, 콜라겐의 나선구조에 의한 잠재성 항원 결정인자의 차폐가 그 일부 원인이고, 이 나선구조는 또한 콜라겐이 단백질 분해에 대한 내성을 갖도록 한다. 콜라겐의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저향력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유시)의 유도 등이 알려져 있다(Van der Rest 등, Ann NY Acad Sci, 1990).

이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다(Arthur K. Balin et al., Aging and the skin, 1989). 또한 콜라겐은 상처치유에 있어서 중요한 역할을 담당하며, 손상된 상피에서 콜라겐의 합성을 촉진시켜서 상처를 신속하고 흉터 없이 회복시킬 수 있다.

종래에는 콜라겐의 피부 보습 효과 및 상처 치유 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되어 있으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로서 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 보습작용 또는 상처치유 효과를 기대할 수 없으므로 본질적인 피부기능 개선 및 상처치유의 기능을 나타낸다고 말할 수 없었다.

한국등록특허 제0987518호는 대두추출물 및 엽산을 포함하는 배지에 바실러스 서브틸리스를 접종하여 통성혐기적 조건에서 발효시키고, 발효 후 분자량 500 kDa 이하의 물질을 제거하여 제조된 고분자물질을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 생합성 촉진 효과를 갖는 화장료 조성물을 개시하고 있고, 한국 공개특허 제2010-0020124호는 단일 균주에 의한 콩 발효물에 비해 비타민과 영양성분이 뛰어난 복합 김치유산균에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 하는 주름개선에 효과적인 화장료 조성물을 개시하고 있으며, 한국 공개특허 제2011-0041178호는 발아콩과 깨의 혼합물을 백국균, 황국균, 고초균 등으로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 하는 주름개선에 효과적인 화장료 조성물을 개시하고 있다.

그러나 저분자량의 대두 펩타이드 또는 그를 함유하는 분획물의 주름개선 효과에 대해서는 보고된 바 없다.

본 발명은 주름개선용 화장료 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있는 I형 프로콜라겐 생성 활성 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 억제 활성을 동시에 갖는 두유발효물 또는 그로부터 제조된 두유 펩타이드 분획물, 그 두유 펩타이드 분획물의 제조방법, 및 그 제조방법에 이용되는 신규 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 과제해결을 위하여, 두유에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시킨 두유 발효물을 유효성분으로 하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물은, 상기 두유를 단백분해효소로 가수분해한 두유 가수분해물에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시킨 두유 가수분해물의 발효물; 또는 상기 두유에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시킨 두유 발효물을 단백분해효소로 가수분해한 두유 발효물의 가수분해물;을 유효성분으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물에서, 상기 단백분해효소는 후라보자임(flavourzyme)인 것이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물에서, 상기 두유 발효물은 두유 원액의 고형분 량이 25 내지 50 중량%가 되도록 희석한 두유 희석액을 발효시킨 두유 발효물이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물은, 상기 두유 발효물, 두유 가수분해물의 발효물 또는 두유 발효물의 가수분해물에서, 분자량 30 kDa 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거한 두유 펩타이드 분획물을 유효성분으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물은, 상기 두유 발효물, 두유 가수분해물의 발효물 또는 두유 발효물의 가수분해물에서 분자량 5 kDa 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거한 두유 펩타이드 분획물을 유효성분으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물에서, 상기 분획물은 I형 프로콜라겐 생성 활성 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 억제 활성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물에서, 상기 분획물은 인간 진피 섬유아세포 및 인간 각질세포에 독성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물에서, 상기 분획물은 전체 분획물에서 유리아미노산 함량이 60 mg% 이상이고, 상기 유리아미노산 중에서 필수아미노산 함량이 50 중량% 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물에서, 상기 분획물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 두유를 단백분해효소인 후라보자임(flavourzyme)으로 가수분해하는 두유 가수분해물 제조단계; 상기 두유 가수분해물에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시키는 두유 가수분해물의 발효물 제조단계; 및 상기 두유 가수분해물의 발효물에서 분자량 5 kDa 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거하여 두유 펩타이드 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 주름개선용 두유 펩타이드 분획물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 두유에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시키는 두유 발효물 제조단계; 상기 두유 발효물을 단백분해효소인 후라보자임(flavourzyme)으로 가수분해하는 두유 발효물의 가수분해물 제조단계; 및 상기 두유 발효물의 가수분해물에서 분자량 5 kDa 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거하여 두유 펩타이드 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 주름개선용 두유 펩타이드 분획물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 두유를 발효시켜 I형 프로콜라겐 생성 활성 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 억제 활성을 갖는 두유 펩타이드를 생성하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 제공한다.

본 발명의 주름개선용 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 두유 발효물을 0.00001 내지 50% 중량%, 바람직하게는, 0.0001 내지 20% 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10% 중량%으로 포함한다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 두유 발효물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부외용 연고, 로션, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 신규 유산균은 두유를 발효시켜 I형 프로콜라겐 생성 활성 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 억제 활성을 동시에 가지는 두유 펩타이드를 생성하고, 그 유산균을 이용해 제조된 두유 발효물 또는 두유 펩타이드 분획물은 피부 세포에 독성을 나타내지 않으면서 주름개선 활성을 나타내는 천연 기능성 소재로서 주름개선용 화장료 조성물의 소재로 활용할 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 실험예 3에서 SDS-PAGE에 따른 단백질 밴드 패턴을 나타낸 것으로, 도 1a 내지 도 1d에서 공통적으로 M은 분자량 마커를, C는 두유를 나타내고, 도 1a에서 1. GK1; 2. GK2; 3. GK3; 4. GK4; 5. GK5; 6. OJ1; 7. OJ2를 나타내며, 도 1b에서 1. CRJ; 2. JJ; 3. CMK2; 4. K1; 5. CCK; 6. MK1을 나타내며, 도 1c에서 1. SULK 2. radish 3. K2; 4. kimchis; 5. GOM를 나타내고, 도 1d에서 1. NJ3; 2. NJ1; 3. SJ; 4. CMK1를 나타낸다.
도 2는 MK1 균주의 형태를 전자주사현미경으로 30,000배 확대한 사진이다.
도 3은 MK1 균주의 필로제닉 트리를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 실험예 5의 1)에서 배양온도 및 시간에 따른 적정산도, pH 및 균수를 각각 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 실험예 5의 1)에서 배양온도에 따른 배양 상등액의 SDS-PAGE 단백질 밴드 패턴을 나타낸 것으로, 공통적으로 M은 분자량 마커를, 도 5a에서 1. 25℃, 0 hr; 2. 25℃, 16 hr; 3. 25℃, 24 hr; 4. 30℃, 0 time; 5. 30℃, 16 hr; 6. 30℃, 24 hr을 나타내고, 도 5b에서 1. 37℃, 0 hr; 2. 37℃, 16 hr; 3. 37℃, 24 hr; 4. 40℃, 0 hr; 5. 40℃, 16 hr; 6. 40℃, 24 hr를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 실험예 5의 2)에서 희석농도 및 시간에 따른 적정산도, pH 및 균수를 각각 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 도 7d는 실험예 5의 2)에서 희석농도에 따라 각각 100%, 75%, 50% 및 25% 두유의 배양 상등액의 SDS-PAGE 단백질 밴드 패턴을 나타낸 것으로, 공통적으로 M은 분자량 마커를, 1. 0 hr; 2. 6 hr; 3. 12 hr; 4. 18 hr; 5. 24 hr의 배양시간을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8j는 시료의 종류 및 농도에 따른 HaCaT 세포에 대한 세포독성을 확인할 수 있는 MTT분석 그래프이다.
도 9a 내지 도 9e는 I형 프로콜라겐 생성량을 측정한 그래프로서, 도 9a는 양성대조군으로 아스코르빈산 50 μM 처리한 것이고, 도 9b는 MK1 균주로 발효시키지 않은 50% 두유인 50S, 도 9c 내지 도 9e는 농도별로 50SFMKUF5, 50SMKP, 50SFMKUF30, 50SPMK 및 50SFMK를 양성 대조군인 아스코르빈산과 비교한 것이다.
도 10a 내지 도 10e는 TNF-α의 생성량을 측정한 그래프로서, 도 10a는 양성대조군으로 덱사메타손(DXMS) 1μM 처리한 것이고, 도 10b는 MK1 균주로 발효시키지 않은 50% 두유인 50S, 도 10c 내지 도 10e는 농도별로 50SFMKUF5, 50SMKP, 50SFMKUF30, 50SPMK 및 50SFMK를 양성 대조군인 덱사메타손과 비교한 것이다.
도 11a 및 도 11b는 실험예 9에서 50SFMKUF5 분획물을 LC/MS-MS를 사용하여 peptide mapping을 진행한 결과로서, 도 11a는 LC chromatogram, 도 11b는 MS chromatogram이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험재료

두유는 (학)연세대학교우유의 것을 사용하였고, BCP plate count agar는 교쿠토제약공업회사(Japan)에서 구입하였으며, skim milk와 MRS broth 및 agar는 Difco Co.(USA)에서 구입하였다. Azo-casein과 bovine serum albumin은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 사용하였으며, protein assay reagent는 Bio-rad사(USA)의 것을 사용하였다. API kit는 bioMerieux Ltd.(France) 제품을 이용하였다. Protamex와 flavourzyme은 Novozymes사(Denmark) 제품을 이용하였다. Procollagen type-Ⅰ C-Peptide(PIP) EIA kit는 Takara Bio사(MK101, Japan)의 제품과 TNF-α의 측정은 Invitrogen사(#KHC3012, USA)의 kit를 사용하였다.

실험예 1: 프로테아제 활성이 높은 유산균의 1차 선별

두유로부터 주름개선용 저분자 펩타이드 또는 펩타이드 이외의 활성물질을 얻기 위하여 프로테아제 활성이 높은 미생물을 안전하고 생리활성면에서 뛰어난 유산균 중에서 탐색하였다.

김치, 젓갈 등의 다양한 발효식품을 구입하여 멸균생리식염수(0.88%(w/v) NaCl)에 희석한 후 그 희석액을 skim milk가 첨가된 BCP plate count agar에 도말하여 37℃에서 2일간 배양하고, colony 주변에 투명한 clear zone을 형성하는 유산균을 분리하였다. 총 180주의 유산균 중 22주의 균주에서 일정 수준 이상의 clear zone을 형성함을 확인하였다. 이들 균주들을 BCP plate count agar에 계대 배양하여 순수 분리하였다.

실험예 2: 프로테아제 활성, 산도 및 pH에 따른 2차 선별

상기 1차 선발된 유산균의 2차 선별을 위하여 azo-casein법을 응용하여 protease 활성을 측정하여 표 1에 나타내었다. 1차 선발된 균주들을 MRS broth에 접종하고 37℃, 48시간 배양한 후 균배양액을 16,100×g에서 5분간 원심분리하여 세포를 제거한 후 상등액을 취하여 조효소로 사용하였다. Protease 활성 측정에 사용한 기질로는 azo-casein을 사용하였고, 2 g의 azo-casein을 100 mL의 100 mM 인산완충용액(pH 7.0)에 용해한 후, azo-casein 기질용액 500 μL를 40℃, 5분간 예열하였다. 예열한 azo-casein 기질용액에 조효소 50 μL를 혼합하여 40℃에서 10분간 반응시켜 azo기를 유리시켰다. 여기에 12%(w/v) trichloroacetic acid 1 mL을 가하여 잔존활성을 실활시키고, 반응하지 않은 azo-casein은 4℃에서 30분간 침전시킨 후 16,100×g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액 500 μL를 취한 후 동량의 0.5 M NaOH 용액을 가하여 440 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 효소 활성 1 unit은 주어진 조건에서 분당 440 nm에서의 흡광도를 0.001 증가시키는 양으로 정하였다.

구분	프로테아제 활성 ( mU / mL · min )
GK1 GK2 GK3 GK4 GK5 GOM K1 K2 NJ1 NJ2 NJ3 MK1 SJ BK SULK OJ1 OJ2 JJ CRJ CCK CMK1 CMK2	140 71 164 98 77 114 2 73 134 96 118 126 128 138 112 120 168 130 116 116 102 152

Min 등(Min SG, Kim JH, Kim TW, Kim KN. Isolation and identification of protease producing bacteria in kimchi. Korean J. Food Sci. Technol. 35: 660-670 (2003))의 연구에서 김치에서 분리한 protease를 생성하는 균주를 분리 및 동정하였는데, Lactobacillus delbruekii로 동정된 균주는 58 mU/mg, 다른 유산균주인 Leuconostoc citreum의 protease 활성은 5 mU/mg으로 확인되었다.

그러나 표 1에 나타낸 바와 같이 실험예 1에서 선별된 22주의 균주는 높은 프로테아제 활성을 나타내었다. 가장 높은 protease 활성을 나타낸 균주는 OJ1이 168 mU/mL·min으로 protease 활성이 높게 측정되었고, 그 다음으로 GK3, CMK2, GK1(각 164, 152, 140 mU/mL·min)의 순서로 측정되었다. 또한 가장 낮은 활성을 나타낸 K1는 2 mU/mL·min으로 같은 분리원(영문약어를 동일하게 표시)에서 분리된 균주라도 protease의 활성이 각기 다른 것을 확인할 수 있었다.

또한 상기 실험예 1에서 선별된 22주의 균주를 121℃에서 15분간 멸균한 두유를 배지로 사용하여 37℃에서 48시간 배양한 후, 적정 산도와 pH를 측정하여 각각 표 2에 나타내고, 두유에서의 유산균의 성장 및 발효 특성을 확인하였다. 적정산도는 증류수 10 mL에 배양액을 9 mL 취하여 희석한 후, 0.1 % phenolphthalein 용액 500 μL를 첨가하고, 30초 동안 미홍색이 없어지지 않을 때까지 0.1 N NaOH로 적정하여 그 소비량을 % 적정 산도로 나타내었다. 산도는 유산(0.1N NaOH 1 mL = 유산 0.009 g)으로 나타내었고, 남은 배양액을 pH meter(FE-20K, METTLER TOREDO, USA)를 이용하여 pH를 측정하였다.

구분	pH	적정산도 (%)
GK1 GK2 GK3 GK4 GK5 GOM K1 K2 NJ1 NJ2 NJ3 MK1 SJ BK SULK OJ1 OJ2 JJ CRJ CCK CMK1 CMK2	5.10 4.84 4.95 4.78 4.71 6.44 4.76 5.24 4.59 ND 4.60 4.10 4.58 6.55 4.90 4.61 4.65 5.05 4.64 4.38 4.82 4.67	0.11 0.17 0.14 0.17 0.17 0.00 0.16 ND1) 0.01 ND 0.19 0.28 0.18 0.03 0.13 0.18 0.18 0.11 0.17 0.19 0.16 0.18

¹⁾ND는 Not detemided의 약어임

상기 표 2에 나타낸 바와 같이 MK1의 pH는 4.10으로 가장 낮은 pH를 보였고, 0.28%의 적정 산도로 다른 균주들보다 높은 산도를 나타냈다. 반면에 BK 균주를 접종하여 발효한 두유는 pH가 6.55로 유산균의 산생성이 전혀 이루어지지 않았고, 적정산도 또한 0.03% 밖에 측정되지 않았다. 이는 BK 균주가 두유에서는 거의 생장이 불가하다고 추정할 수 있었다.

실험예 3: 단백질 정량 및 SDS-PAGE 패턴을 이용한 3차 선별

상기 1차 선발된 유산균의 3차 선별을 위하여 실험예 2에서 121℃에서 15분간 멸균한 두유를 배지로 사용하여 37℃에서 48시간 배양한 배양액을 16,100×g에서 5분간 원심분리하여 세포를 제거한 후 상등액을 취하여 Bio-rad사의 protein assay reagent를 사용하하여 단백질을 정량하여 표 3에 나타내었다(Bradford, 1976).

구분	단백질 농도 (μg/μL)
GK1 GK2 GK3 GK4 GK5 GOM K1 K2 NJ1 NJ2 NJ3 MK1 SJ BK SULK OJ1 OJ2 JJ CRJ CCK CMK1 CMK2	1.10 1.08 1.04 0.99 1.08 16.90 1.10 1.24 1.10 ND1) 1.20 0.74 1.10 ND 1.10 1.11 1.17 1.18 0.90 1.15 1.40 1.12

¹⁾ND는 Not detemided의 약어임

MK1은 pH와 적정산도의 결과에서 가장 좋은 결과를 나타내었고, bradford assay를 이용한 단백질의 측정결과, 0.74 μg/μL로 낮은 수치의 단백질 양을 측정할 수 있었다. MK1과 반대로 GOM 균주의 경우 pH와 적정 산도의 결과에서도 볼 수 있듯이 단백질 양이 16.90 μg/μL으로 측정되어 가장 높은 단백질 양을 관찰할 수 있었다. 이는 두유 내에 존재하던 단백질이 균주들에 의하여 분해되었거나 혹은 그렇지 않은 것을 단적으로 보여주는 결과라고 판단할 수 있다.

또한 상기 원심분리하여 세포를 제거한 후 상등액을 SDS-PAGE에 시료의 농도가 10 μg/μL가 되게 loading하여 전기영동을 실시한 후 SDS-PAGE상의 단백질 밴드 패턴을 확인하여 그 결과를 도 1a 내지 도 1d에 나타내었다.

두유를 MK1으로 발효시켰을 경우 수많은 major band가 14.3 kDa 부근에 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 두유 내에 존재하는 단백질이 가수분해되어 주요 밴드들이 사라지는 패턴으로 단백질 가수분해활성의 정도를 알 수 있었다.

이상의 실험예 1 내지 3의 protease 활성, pH와 적정산도 및 SDS-PAGE의 pattern을 결과를 종합하여 두유를 발효하여 protease 활성으로 두유 내 단백질을 가수분해하여 주름개선 활성을 가지는 저분자 펩타이드 생성 균주 후보로 MK1 균주를 선정하였다.

실험예 4: MK1 균주의 동정

1) 형태학적 관찰

상기 MK1 균주를 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 형태를 관찰한 결과, 간균으로 균체의 길이는 약 0.5×1-1.5 μm로 측정되었다.

2) 유산균의 당대사능 확인

상기 MK1 균주의 당대사능을 API 50 CHL system(BioMerieux, Marcy, IEtoile, France)을 이용하여 조사하여 표 4에 나타내었다.

Characteristics	MK1	Characteristics	MK1
Glycerol Erythritol D-Arabinose L-Arabinose D-Ribose D-Xylose L-Xylose D-Adonitol Methyl-β-D-xylopyranoside D-Galactose D-Glucose D-Fructose D-Mannose L-Sorbose L-Rhamnose Dulcitol Inositol D-Mannitol D-Sorbitol Methyl-α-D-mannopyranoside Methyl-α-D-glucopyranoside N-Acetyl glucosamine Amygdalin Arbutin Esculin ferric citrate	- - - - + - - - - + + + + - - - - + - - - + + + +	Salicin D-Cellobiose D-Maltose D-Lactose (bovine origin) D-Melibiose D-Saccharose (sucrose) D-Trehalose Inulin D-Melezitose D-Raffinose Amidon (starch) Glycogen Xylitol Gentiobiose D-Turanose D-Lyxose D-Tagatose D-Fucose L-Fucose D-Arabitol L-Arabitol Potassium Gluconate Potassium 2-ketogluconate Potassium 5-ketogluconate	- - - - - + + + + - - - - - + - + - - - - - - -

표 4에 나타낸 것과 같이, 단당류인 glucose, galactose, fructose, ribose, maanose, tagatose와 이당류인 saccharose, trehalose, turanose를 이용하고, 다당류인 inulin과 melezitose, 당알코올인 mannitol, cyan 배당체인 amygdalin, arbutin과 raffinose 배당체인 N-acetyl glucosamin, esculin ferric citrate를 이용하는 것을 확인할 수 있었다.

3) 분자생물학적 동정

최종적인 동정을 위하여 MK1 균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 blastn program을 이용하여 분석한 후 GenBank에 등록된 표준군주(type strain)와의 상동성을 비교하였다.

MK1 균주의 16S rRNA 염기서열은 서열번호 1에 나타내었고, 이 염기서열을 NCBI에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 16S rRNA 염기서열과 비교한 결과 Lactobacillus 속과 높은 상동성을 나타내었고, Clustal X와 Mega 5 프로그램을 이용하여 각 Lacobacillus 유전자에 속하는 다양한 종들과 염기서열의 상동성을 비교분석하여 phylogenetic tree를 작성하여 도 3에 나타내었다.

MK1은 김치에서 분리된 것으로 Latobacillus paracasei, L. casei와 높은 유사성을 갖고, 이 중 Latobacillus paracasei JCM813과 가장 높은 상동성을 나타내어 최종 선발된 균주는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1으로 명명하여 한국미생물보존센터에 2013년 4월 4일 기탁하고, 기탁번호 KFCC11552P를 부여받았다.

또한 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1의 일반특성을 조사한 결과 그람 양성의 무포자형성균이고, 운동성은 없으며, catalase 활성과 gas 생성은 하지 않았다.

실험예 5: MK1 균주의 생장 조건

1) 배양온도에 따른 생장율

MK1 균체를 두유에 접종하여 37℃에서 배양하여 균체액을 100% 두유에 2%(v/v)으로 접종하여 25, 30, 37, 및 40℃에서 24시간 배양하였으며 배양액의 생균수, 산도, pH 및 SDS-PAGE를 이용하여 배양온도에 따른 생육정도를 측정하였다.

L. paracasei MK1의 최적 배양온도를 적정 산도 및 pH로 관찰한 결과 30℃에서 24시간 발효하였을 때 0.98%로 가장 높은 산도를 보였고, pH의 경우 25℃에서 나머지 온도의 실험구보다 높은 pH 5.64로 측정되었다. 30, 37, 40℃의 24시간 발효 후 pH는 각각 4.56, 4.56, 4.54로 각 실험구마다 pH는 유사한 것으로 확인되었다(도 4a 및 도 4b).

두유에 L. paracasei MK1을 접종한 후 측정한 생균수는 30℃에서 발효한 실험구가 대수증식기에 가장 먼저 진입하여 24시간 발효 시, 사멸기에 진입한 것으로 나타났다. 사멸기에 진입하였음에도 불구하고 다른 온도의 실험구보다 높은 생균수를 확인할 수 있었는데, 40℃에서 발효 시 생균수는 8.37 log CFU/mL, 37℃는 8.74 log CFU/mL, 25℃는 30℃와 유사한 8.98 log CFU/mL로 측정되었고, 30℃의 생균수는 9.03 log CFU/mL로 측정되었다(도 4c).

두유의 단백질 분해능은 SDS-PAGE로 확인할 수 있었는데, 0시간과 비교하면 25℃의 sample을 제외하고, 나머지 30, 37 및 40℃의 24시간 배양액의 SDS-PAGE pattern은 Fig. 13, 14에서 볼 수 있듯이 분해정도가 유사한 것으로 관찰하였다(도 5a 및 도 5b).

또한 L. paracasei MK1의 유산 생성으로 인하여 두유의 물리적 성상은 접종 12시간 이후부터 커드(curd)를 형성하였으며, 발효시간이 지날수록 커드의 경도가 높아졌다. 최종적으로 분석한 결과 두유 발효에 가장 최적의 발효온도는 30℃로 확정하였다.

2) 두유 희석 농도에 따른 생장율

MK1 균체를 두유에 접종하여 37℃에서 배양하여 균체액을 25, 50, 75, 및 100% 두유에 2%(v/v)으로 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였으며 배양액의 생균수, 산도, pH 및 SDS-PAGE를 이용하여 두유 희석에 따른 생육정도를 측정하였다.

100% 두유(고형분 함량 10.8%)에서 적정 산도는 발효 18시간에서 0.90%의 높은 산도를 나타냈으며, 나머지 75% 이하의 그룹은 24시간 이후에도 적정산도가 계속적으로 증가하는 것으로 관찰되었다(도 6a).

적정 산도와는 달리 실험구간의 차이가 크지 않았던 pH와 생균수는 각각 24시간 발효 후 최종 pH는 약 4.6, 생균수는 8.86(100% 두유) 내지 9.12(75% 두유) log CFU/mL로 측정되어 두유의 희석이 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보였으나(도 6b 및 도 6c), 단백질의 분해능을 SDS-PAGE로 확인한 결과 100% 및 75% 두유의 경우에는 24 시간 발효 후에도 44.3 kDa 이상의 밴드가 남아있었고, 50% 두유의 24시간 발효했을 때, 44.3 kDa 이상의 부분에서 희미한 band는 나타나지 않았다(도 7a 내지 도 7c). 25% 두유도 분해능이 좋은 것으로 나타났으나 생산성 면에서 50% 두유에 비해 불리할 것으로 판단되었다(도 7d).

제조예:

1) 두유 발효물의 제조

멸균한 두유 또는 두유 가수분해물에 L. paracasei MK1의 colony를 접종하여 두유 발효액을 제조한 뒤, 두유 혹은 50% 두유에 2%(v/v)의 두유 발효액을 접종하여, 30℃에서 30시간 발효하였다. 발효산물은 원심분리를 통하여 그 상등액을 시료로 사용하였다.

2) 두유 가수분해물의 제조

멸균한 두유 또는 두유 발효물을 효소 처리 전 50℃로 예열하였고, protamex와 flavourzyme을 단백질 kg당 효소 2 g을 첨가한 후 50℃에서 4시간 동안 격렬하게 진탕하여 반응한 후, 80℃에서 10분간 가열하여 실활시켰다.

3) 한외여과 분획물의 제조

멸균한 두유, 두유 발효물 또는 두유 가수분해물을, pore size가 0.22 μm, nitrocellulose filter membrane(Sigma, USA)을 이용하여 membrane filteration으로 여과된 여액을 한외여과에 사용하였다. 한외여과기기는 Millipore사(USA)의 Lascale^™ TFF system을 사용하였고, cartridge는 Millipore사의 Pellicon XL filter 중 BIOMAX, 30 K 및 5 K polyethersul- fone(50 cm²)을 사용하여 실시하였다.

상기 1) 내지 3)의 방법을 하나 또는 2 이상 조합하여 표 5의 시료를 제조하였다.

시료명

처리방법

50S 50SMK 50SMKUF30 50SMKUF5 SF SP 50SMKF 50SMKFUF30 50SMKFUF5 50SMKP 50SMKPUF30 50SMKPUF5 50SFMK 50SFMKUF30 50SFMKUF5 50SPMK 50SPMKUF30 50SPMKUF5 100S 100SMK 100SMKUF30 100SMKUF5 100SMKF 100SMKFUF30 100SMKFUF5 100SMKP 100SMKPUF30 100SMKPUF5 100SFMK 100SFMKUF30 100SFMKUF5 100SPMK 100SPMKUF30 100SPMKUF5

50% Soymilk 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa → UF 5 kDa 100% Soymilk → Flavourzyme 100% Soymilk → Protamex 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Flavourzyme 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Flavourzyme → UF 30 kDa 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Flavourzyme → UF 30 kDa → UF 5 kDa 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Protamex 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Protamex → UF 30 kDa 50% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Protamex → UF 30 kDa → UF 5 kDa 50% Soymilk → Flavorzyme → Fermented with L. paracasei MK1 50% Soymilk → Flavorzyme → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa 50% Soymilk → Flavorzyme → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa → UF 5 kDa 50% Soymilk → Protamex → Fermented with L. paracasei MK1 50% Soymilk → Protamex → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa 50% Soymilk → Protamex → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa → UF 5 kDa 100% Soymilk 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa → UF 5 kDa 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Flavourzyme 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Flavourzyme → UF 30 kDa 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Flavourzyme → UF 30 kDa → UF 5 kDa 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Protamex 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Protamex → UF 30 kDa 100% Soymilk → Fermented with L. paracasei MK1 → Protamex → UF 30 kDa → UF 5 kDa 100% Soymilk → Flavorzyme → Fermented with L. paracasei MK1 100% Soymilk → Flavorzyme → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa 100% Soymilk → Flavorzyme → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa → UF 5 kDa 100% Soymilk → Protamex → Fermented with L. paracasei MK1 100% Soymilk → Protamex → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa 100% Soymilk → Protamex → Fermented with L. paracasei MK1 → UF 30 kDa → UF 5 kDa

실험예 6: 고형분 함량

상기 제조예의 시료들의 항산화, 피부세포에 대한 세포성장 및 독성, procollagen 생성량, TNF-α의 생성량을 측정하기에 앞서, 각각 시료들의 고형분 함량을 측정하여 표 6에 나타내었다.

시료명	고형분(%)	시료	고형분(%)	시료	고형분(%)
50S 50SMK 50SMKUF30 50SMKUF5 SF SP 50SMKF 50SMKFUF30 50SMKFUF5 50SMKP 50SMKPUF30	3.51 1.42 1.30 1.13 ND1) ND 1.65 1.38 1.30 1.45 1.34	50SMKPUF5 50SFMK 50SFMKUF30 50SFMKUF5 50SPMK 50SPMKUF30 50SPMKUF5 100S 100SMK 100SMKUF30 100SMKUF5	1.18 1.97 1.65 1.37 2.70 2.34 1.85 ND 2.58 2.05 1.70	100SMKF 100SMKFUF30 100SMKFUF5 100SMKP 100SMKPUF30 100SMKPUF5 100SFMK 100SFMKUF30 100SFMKUF5 100SPMK 100SPMKUF30 100SPMKUF5	3.30 2.96 2.45 3.10 1.66 1.36 3.31 2.88 2.58 4.10 3.22 2.45

¹⁾ND는 Not detemided의 약어임

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 100SF, 100SP, 및 100S(100% 두유)는 filtration이 불가능하여 제외하였다.

고형분 함량이 가장 높은 100SPMK는 100% 두유를 protamex 처리 후 L. paracasei MK1으로 발효시킨 시료로서 4.10%의 높은 고형분 함량을 나타냈고, 1.13%의 가장 낮은 고형분 함량을 나타낸 50SMKUF5은 50% 두유를 L. paracasei MK1로 발효하여 한외여과를 이용하여 5 kDa 미만의 분획을 얻은 것으로 큰 분자량의 단백질은 제거된 상태였다.

전반적인 경향은 100% 두유를 이용하여 제조한 시료들은 50% 두유보다 고형분 함량에 있어 1.5-1.7배의 차이를 나타냈고, 발효와 한외여과를 진행할수록 고형분의 함량은 감소하는 경향을 보였다. 이는 초기의 희석배수가 고형분 함량에도 영향을 미치며, 한외여과를 진행함으로써 고형분 함량에 근소한 영향을 주는 것이라고 사료된다.

실험예 7: 세포독성

1) 세포 배양

Collagen 생성에 관여하는 진피 세포주인 Normal Human dermal fibroblast(ATCC, VA)와 주름의 주요한 원인 중 하나인 염증 반응을 완화시키는 효과가 있는지 평가하기 위하여 표피세포주인 Immotalized human keratinocyte(HaCaT)을 1% antibiotic-antimycotic(AA, Welgene, Korea)와 10% fetal bovine serum(FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium(DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

2) MTT 분석

MTT assay는 세포의 미토콘드리아에 있는 mitochondrial succinate dehydrogenase가 MTT(yellow)를 환원시켜 생성된 formazan(purple)의 흡광도를 측정하여 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하는 방법으로, 본 연구에서는 시료를 고형분 함량 0.02%에서 1/2씩 희석하여 다양한 농도로 세포에 처리하고 24시간 동안 배양한 후 Fibroblast와 HaCaT 세포를 사용하였고, 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 세포를 사용하였다.

3) 분석 결과

Fibroblast 세포의 생존율은 시료의 농도에 의존적이지 않았고, fibroblast의 경우 농도가 높아지며 생존율이 증가함을 보였으며, 특히 100% 두유를 protamex 효소 처리 후, L. paracasei MK1으로 발효하고 한외여과를 통하여 5 kDa 미만으로 여과한 여액인 100SPMKUF5는 2.50×10^-2의 농도에서 다른 시료들 중에서 가장 높은 129.67%의 생장률을 나타냈다. 또한 50SMKF는 3.13×10^-3의 농도부터 122.85% 이상의 cell 생존율을 보였다. 100% 두유로 처리한 시료들과 50% 두유로 처리한 시료들은 서로의 차이는 발견할 수 없었지만, 1.25×10^-2 이상의 농도에서는 거의 모든 시료가, 시료를 처리하지 않은 세포들보다 높은 생존율을 보였다(데이터 미첨부).

항염증 반응을 확인할 수 있는 HaCaT 세포의 경우 최종 농도인 0.1%에서 생존율이 높았던 시료와 생존율은 50SFMKUF5 103.71%, 50SMKP 102.02%, 50SFMKUF30 101.83%, 50SPMK 101.45%, 100SMK 101.41%, 50SFMK 100.7%, 100SPMK는 100.23%로 나타났고, 이들 시료를 제외하고는 100SMKFUF5로 59.63%로 가장 낮은 생존율을 나나내었고, 대부분 세포독성을 나타낸 것으로 나타났다(도 8a 내지 도 8j).

또한 전반적으로 HaCaT 세포에 있어서 50% 두유로 진행한 시료보다 100% 두유로 진행한 시료가 cell 생존율이 낮은 것으로 나타났고, 이를 통해서 50%의 두유로 진행한 시료를 2차 시료로 선정하였다.

실험예 8: I형 프로콜라겐 생성량 분석

1) 세포배양

Collagen 생성에 관여하는 진피 세포주인 Normal Human dermal fibroblast(ATCC, VA)를 1% antibiotic-antimycotic(AA, Welgene, Korea)와 10% fetal bovine serum(FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium(DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

2) I형 프로콜라겐 생성량 분석

Fibroblast를 6 well plate에 2×10⁵ cell을 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거한 뒤 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation하였다. Starvation 후, 배지를 제거한 뒤 PBS(phosphate buffered saline, Amresco, USA)로 세척하였다. PBS 존재 하에 312 nm에서 25 mJ로 조사하고, 시료를 FBS가 함유되어 있지 않은 DMEM 배지를 넣고 시료를 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후, 수거한 배지를 procollagen type-I C-Peptide(PIP) EIA kit(Takara Bio, Inc., MK101, Japan)를 이용하여 생성되는 콜라겐을 측정하였다. 양성 대조군(positive control)으로 50 μM ascorbic acid로 사용하였고, 음성 대조군(negative control)으로 UV를 처리하지 않은 시험구로 이용하며, 배지만 처리한 시료를 대조군(control)으로 사용하였다.

3) 분석 결과

실험예 7의 HaCat 세포에 세포독성을 나타내지 않은 50% 두유를 처리한 시료 50SFMKUF5, 50SMKP, 50SFMKUF30, 50SPMK 및 50SFMK를 양성 대조군인 ascorbic acid와 비교하였고, 고형분 함량 대비 0.1, 0.01, 0.001%의 농도로 시료를 처리하였으며, MK1으로 발효시키지 않은 50S를 대조군으로 함께 비교하여 도 9a 내지 도 9e에 나타내었다.

50 μM ascorbic acid를 처리하였을 때의 양성 대조군은 50 μM에서 197.76%로 측정되었으며, 대조군보다 높은 시료는 고형분 함량이 0.1%일 때, 246.94%로 측정된 50SPMK이다. 50SPMK를 제외하고 대조군과 유사한 범위내의 시료는 50SFMKUF5로 확인되었는데, 50SFMKUF5는 50% 두유를 flavourzyme으로 처리한 후, L. paracasei MK1으로 발효한 뒤, 한외여과를 통하여 5 kDa 미만의 분획의 시료이다. 50SFMKUF5는 대조군보다 약간 적은 164.23%의 procollagen 양을 나타내었지만, 모든 농도에 있어 160% 이상으로 적지 않은 procollagen을 확인할 수 있었다.

실험예 9: TNF -α의 생성량 분석

1) TNF-α의 생성량 분석

HaCaT 세포를 12 well plate에 1×10⁵ cell을 접종하여 24시간 동안 배양한 후, TNF-α를 유도시키기 위하여 UV 조사와 함께 시료를 농도별로 처리하여 24시간 추가 배양하였다. UV 조사하지 않은 그룹과 UV 조사 후 dexamethasone을 1 μM/mL 처리한 그룹을 대조군으로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 312 nm에서 12.5 mJ로 조사하고, 시료를 24시간 동안 배양 후 배지로 분비되어지는 TNF-α는 kit(Invitrogen, #KHC3012, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) 분석 결과

대조군은 UV를 조사한 HaCaT을 100%로 하고, 양성 대조군은 강력한 항염증제로 사용되는 덱사메타손을 사용하였다. 실험예 7의 HaCat 세포에 세포독성을 나타내지 않은 50% 두유를 처리한 시료 50SFMKUF5, 50SMKP, 50SFMKUF30, 50SPMK 및 50SFMK를 양성 대조군인 덱사메타손과 비교하여 도 10a 내지 도 10e에 나타내었다.

Dexamethasone을 처리한 양성 대조군의 TNF-α의 생성량은 65.58%로 모든 농도(0.1, 0.02, 0.004, 0.0008%)에서 양성 대조군보다 낮은 값을 보인 시료는 50SFMKUF30 및 50SFMKUF5로서 이 중 50SFMKUF5도 0.02%의 농도에서 23.44%의 TNF-α가 검출되어 50SFMKUF5는 TNF-α 생성을 억제하는 것으로 확인되었다.

실험예 10: 50 SFMKUF5 및 5 kDa 이하 분획의 성분 분석

1) 유리아미노산 분석

상기 선정한 50% 두유 희석액을 한외여과를 통해 5 kDa 미만의 분획물인 50SMKUF5, 50SMKFUF5, 50SMKPUF5, 50SFMKUF5, 50SPMKUF5의 5가지 시료에 대한 유리 아미노산 분석을 실시하여 표 7에 나타내었다.

Amino acid	Concentration of free amino acid(mg/100 g (%))
	50SMKUF5	50SMKFUF5	50SMKPUF5	50SFMKUF5	50SPMKUF5
Aspartic acid	1.8 (4.5)	1.9 (4.1)	1.9 (4.5)	2.6 (3.9)	1.2 (2.8)
Glutamic acid	12.5 (31.0)	13.3 (28.4)	11.2 (27.0)	7.2 (10.7)	4.6 (10.5)
Asparagine	0.4 (1.0)	0.6 (1.2)	0.4 (0.9)	1.0 (1.5)	0.2 (0.4)
Serine	0.2 (0.6)	0.5 (1.1)	0.3 (0.6)	0.2 (0.3)	0.1 (0.2)
Glutamine	0.0 (0.0)	0.5 (1.1)	0.0 (0.0)	0.0 (0.0)	0.0 (0.0)
Glycine	0.8 (2.0)	0.7 (1.5)	0.7 (1.7)	0.6 (0.8)	1.2 (2.7)
Histidine	1.6 (3.9)	1.6 (3.4)	1.7 (4.2)	1.3 (2.0)	1.2 (2.8)
Arginine	10.9 (27.0)	10.2 (21.8)	10.7 (25.8)	11.9 (17.7)	9.6 (22.1)
Threonine	0.3 (0.6)	0.7 (1.6)	0.4 (1.0)	0.5 (0.8)	0.5 (1.1)
Alanine	2.4 (6.0)	2.5 (5.3)	2.5 (6.1)	2.9 (4.3)	3.1 (7.1)
Proline	2.9 (7.2)	2.7 (5.9)	3.8 (9.1)	1.5 (2.2)	1.0 (2.3)
Tyrosine	1.5 (3.7)	0.7 (1.6)	1.5 (3.6)	3.1 (4.5)	1.4 (3.2)
Valine	0.3 (0.7)	0.7 (1.4)	0.3 (0.7)	2.2 (3.3)	1.7 (4.0)
Methionine	0.0 (0.0)	0.7 (1.6)	0.0 (0.0)	0.3 (0.5)	0.5 (1.2)
Cysteine	0.0 (0.0)	0.1 (0.3)	0.1 (0.2)	0.1 (0.2)	0.0 (0.0)
Isoleucine	0.0 (0.0)	0.6 (1.2)	0.2 (0.4)	2.4 (3.6)	2.1 (4.8)
Leucine	0.4 (0.9)	2.1 (4.5)	0.6 (1.4)	11.2 (16.6)	4.7 (10.8)
Phenylalanine	0.6 (1.5)	2.4 (5.1)	1.0 (2.4)	15.0 (22.3)	6.4 (14.6)
Tryptophan	2.7 (6.7)	2.6 (5.6)	3.0 (7.3)	2.7 (4.0)	3.9 (8.9)
Lysine	1.0 (2.5)	1.7 (3.6)	1.2 (3.0)	0.6 (0.8)	0.2 (0.4)
TA1 )	40.2 (100)	46.8 (100)	41.4 (100)	67.3 (100)	43.6 (100)
EA2 )	6.9 (16.8)	13.1 (28.0)	8.4 (20.4)	36.2 (53.9)	21.2 (43.6)

¹⁾TA : Total free amino acid

²⁾EA : Essential amino acid (Thr+Val+Met+Ile+Leu+Phe+Lys+Trp+His)

효소처리를 하지 않은 50SMKUF5이 가장 낮은 40.2 mg/100 g의 값을 나타냈고, 발효 후 효소처리한 50SMKFUF5, 50SMKPUF5보다 효소처리 후 발효한 50SFMKUF5, 50SPMKUF5의 유리아미노산 함량이 더 높았다. 50SFMKUF5의 유리 아미노산 함량은 67.3 mg/100 g으로 가장 높았고, 50SMKFUF5는 46.8 mg/100 g으로 측정되었다. 이는 효소처리를 먼저 함으로서 두유의 단백질을 L. paracasei MK1이 더욱 효과적으로 절단할 수 있었기 때문에 효소 처리를 먼저 진행한 시료들이 그렇지 않은 시료들보다 유리 아미노산 함량이 높았던 것으로 사료된다.

유리 아미노산 중 필수 아미노산의 함량은 50SFMKUF5가 36.2 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타냈고, 전체 아미노산의 53.9%를 차지하였다. 반면 50SMKUF5는 6.9 mg/ 100 g으로 가장 높은 50SFMKUF5의 약 6배 차이가 있는 것으로 나타났다. 또한 효소 처리를 하지 않은 50SMKUF5는 flavourzyme이나 protamex를 처리한 시료의 필수 아미노산의 함량이 낮은 것으로 확인되었다. Flavourzyme을 처리한 시료인 50SMKFUF5, 50SFMKUF5의 필수 아미노산 함량은 각각 13.1, 36.2 mg/100 g이었고, protamex를 처리한 시료인 50SMKPUF5, 50SPMKUF5의 필수 아미노산 함량은 8.4, 21.2 mg/100 g으로 flavourzyme을 처리한 시료가 더 높은 필수 아미노산 함량을 나타내었다. 이는 효소가 기질에 작용하는 범위가 차이가 있는 것으로 판단되며, 두유 발효에 있어서 L. paracasei MK1이 이용하는데 효소처리를 하지 않은 것보다 효소처리를 하는 것이 두유 단백질의 분해가 더욱 잘 일어난 것으로 판단되며, protamex보다 flavouzyme이 더 효과적임을 시사하는 바이다.

2) 총질소 및 TCA 용해 질소 함량 분석

시료의 총 질소함량과 TCA 용해 질소함량을 통하여 발효 및 효소처리에 의한 질소 함량 변화를 측정하였다. 총 질소 함량은 시료에 존재하는 모든 peptide나 단백질의 양을 추정할 수 있으며, TCA 용해 질소의 함량은 protease에 의하여 단백질이 가수분해 되어 나타난 질소 화합물의 함량을 가늠할 수 있는 의미가 있다.

구분	Total nitrogen (mg N/100 mL)	TCA soluble nitrogen (mg N/100 mL)	TN / SN(%)
50S 50SMKUF5 50SMKFUF5 50SMKPUF5 50SFMKUF5 50SPMKUF5	2.82±0.17 0.34±0.07 0.60±0.14 0.40±0.09 1.22±0.23 1.60±0.22	0.12±0.03 0.12±0.05 0.36±0.03 0.23±0.01 0.45±0.02 0.82±0.06	4.39 36.17 59.59 58.02 36.93 51.16

표 8에 나타난 바와 같이 어떠한 처리도 하지 않은 50S는 총 질소함량이 2.82 mg N/100 mL로 나타났고, 50SPMKUF5가 1.60 mg N/100 mL로 측정되었다. 총 질소함량에 있어 가장 낮은 값을 나타낸 50SMKUF5는 0.34 mg N/100 mL로 확인하였다. 이는 최대 총 질소함량이 최대 50% 미만까지 감소함을 보였다. 또한 최종선발균주인 L. paracasei MK1으로 발효한 50SMKUF5와 발효 후 효소 처리한 50SMKFUF5, 50SMKPUF5는 총 질소함량의 큰 차이가 없었고, flavourzyme과 protamex로 처리한 후 발효를 거쳐 한외여과를 한 시료인 50SFMKUF5, 50SPMKUF5는 총 질소함량이 50SMKUF5, 50SMKFUF5, 50SMKPUF5의 2배 이상으로 측정되었다.

TCA 용해 질소함량을 통해 효소처리에 의한 비단백태 질소의 함량을 볼 수 있었는데, 이 결과 역시 50SFMKUF5와 50SPMKUF5가 각각 0.45, 0.82 mg N/100 mL로 총 질소함량과 유사한 경향임을 관찰하였다. 효소처리를 먼저 한 것이 비단백태 질소함량이 높은 것으로 측정되었다. 두유에 먼저 효소제로 인하여 가수분해가 일어났기 때문에 TCA 용해 질소함량이 높은 것으로 사료되고, 발효 후 효소처리한 것은 이미 최종선발균주로 인하여 가수분해가 일어났기 때문에 효소제의 영향이 적은 것으로 판단되는데, TCA 용해 질소의 함량이 시료 50S와 50SMKUF5가 큰 차이가 없는 것으로 알 수 있었다.

3) 일반성분 분석

상기 실험예 7 및 8을 통해 선정한 50SFMKUF5 분획물과 100% 두유의 일반성분의 차이점을 분석하기 위하여 100% 두유의 일반성분은 표 9에 나타내었다.

구분	함량
	100% 두유	50SFMKUF5
Saccharide (g/100 g) Carbohydrate (g/100 g) Crude protein (g/100 g) Crude lipid (g/100 g) Solid (%)	0.71 3.40 4.30 2.40 10.8	ND1) ND 0.30 0.00 1.37

¹⁾ND는 Not detemided의 약어임

100 g당 당류는 0.71 g, 탄수화물 3.40 g, 조단백질 4.30 g, 조지방 2.40 g의 함량을 나타내었으며, 고형분 함량은 10.8%로 측정되었다. 50SFMKUF5의 조단백질은 0.30 g으로 나타났으며, 조지방의 함량은 0.00 g, 고형분은 1.37%로 확인되었다. 모든 일반성분은 100% 두유보다 낮은 값을 나타냈고, 이는 발효와 ultrafilt- ration으로 인한 감소로 판단할 수 있었다.

4) 펩타이드 분석

상기 실험예 7 및 8을 통해 선정한 50SFMKUF5 분획물을 LC/MS-MS를 사용하여 peptide mapping을 진행하였다. LC chromatogram은 도 11a에 나타내었고, retention time이 19.03-46.54분에 대부분의 peak가 존재하였다. Retention time 19.25-48.28분의 구간을 선정한 MS chromatogram을 도 11 b에 나타내었다. 분자량 953.48-4770.20 kDa의 peptide peak 사이에 major peak는 m/z값이 726.87이고, 이 peak의 분자량 1453.74 kDa의 peptide로 확인되었다. 이 peptide는 콩 유래의 data base상에서 검색한 결과(NCBI, USA) Glycinin G2로 나타났고, 그 아미노산서열은 APEFLKEAFGVN으로 확인하였다.

이하, 하기 조성에 따라서, 각각 비누형, 로션형, 크림형, 팩형, 미용액형의 제제들을 제조하였다.

제조예 1. 비누형

50SFMKUF5 분획물 5

유지 75

수산화나트륨 5

향료 10

정제수 잔량

(단위: 중량%)

제조예 2. 로션형

50SFMKUF5 분획물 3.00

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00

수용성 콜라겐 (1% 수용액) 1.00

시트르산나트륨 0.10

시트르산 0.05

감초 엑기스 0.20

1,3-부틸렌글리콜 3.00

정제수 잔량

(단위: 중량%)

제조예 3. 크림형

50SFMKUF5 분획물 1.00

폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트 2.00

자기유화형 모노스테아르산글리세린 5.00

세틸알코올 4.00

스쿠알렌 6.00

트리2-에틸헥산글리세릴 6.00

스핑고당지질 1.00

1.3-부틸렌글리콜 7.00

정제수 잔량

(단위: 중량%)

제조예 4. 팩형

50SFMKUF5 분획물 5.00

폴리비닐알코올 13.00

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00

라우로일히드록시프롤린 1.00

수용성 콜라겐 (1% 수용액) 2.00

1,3-부틸렌글리콜 3.00

에탄올 5.00

정제수 잔량

(단위: 중량%)

제조예 5. 미용액형

50SFMKUF5 분획물 2.00

히드록시에틸렌셀룰로오스 (2% 수용액) 12.00

크산탄검 (2% 수용액) 2.00

1,3-부틸렌글리콜 6.00

진한 글리세린 4.00

히알루론산나트륨 (1% 수용액) 5.00

정제수 잔량

상기 제제들은 본 발명에 따른 두유 발효액 또는 두유 펩타이드 분획물을 이용하는 일 형태를 나타내는 것이며, 본 발명에 따른 두유 발효액 또는 두유 펩타이드 분획물은 당 업계에서 사용되는 다양한 제형으로 사용될 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11552P 20130404

<110> YONSEI UNIVERSITY BKBIO.CO.,Ltd. Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation LCS Biotech Co., Ltd. <120> Anti-wrinkle cosmetic composition using Lactobacillus paracasei MK1 and preparation method thereof <130> HPC3939 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1284 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 1 tttggaaaca gatgctaata ccgcatagat ccaacaaccg catggttctt ggctgaaaga 60 tggcgtaagc tatcgctttt ggatggaccc gcggcgtatt agctagttgg tgaggtaatg 120 gctcaccaag gcgatgatac gtagccgaac tgagaggttg atcggccaca ttgggactga 180 gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt 240 ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttgg 300 agaagaatgg tcggcagagt aactgttgcc ggcgtgacgg tatccaacca gaaagccacg 360 gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggatttatt 420 gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccctc ggcttaaccg 480 aggaagcgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg 540 tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct 600 gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc 660 catgccgtaa acgatgaatg ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt gccgcagcta 720 acgcattaag cattccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac 780 gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 840 caggtcttga catcttttga tcacctgaga gatcaggttt ccccttcggg ggcaaaatga 900 caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 960 agcgcaaccc ttatgactag ttgccagcat ttagttgggc actctagtaa gactgccggt 1020 gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1080 cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgagacc gcgaggtcaa gctaatctct 1140 taaagccatt ctcagttcgg actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagt cggaatcgct 1200 agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1260 tcacaccatg agagttgtaa cacc 1284

Claims (12)

1. 두유에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시킨 두유 발효물을 유효성분으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 두유를 단백분해효소로 가수분해한 두유 가수분해물에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시킨 두유 가수분해물의 발효물; 또는 상기 두유에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시킨 두유 발효물을 단백분해효소로 가수분해한 두유 발효물의 가수분해물;을 유효성분으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 단백분해효소는 후라보자임(flavourzyme)인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두유 발효물, 두유 가수분해물의 발효물 또는 두유 발효물의 가수분해물에서, 분자량 30 kDa을 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거한 두유 펩타이드 분획물을 유효성분으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 두유 발효물, 두유 가수분해물의 발효물 또는 두유 발효물의 가수분해물에서 분자량 5 kDa 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거한 두유 펩타이드 분획물을 유효성분으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 분획물은 I형 프로콜라겐 생성 활성 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 분획물은 인간 진피 섬유아세포 및 인간 각질세포에 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
8. 제 5 항에 있어서, 상기 분획물은 전체 분획물에서 유리아미노산 함량이 60 mg% 이상이고, 상기 유리아미노산 중에서 필수아미노산 함량이 50 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
9. 제 5 항에 있어서, 상기 분획물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
   
10. 두유를 단백분해효소인 후라보자임(flavourzyme)으로 가수분해하는 두유 가수분해물 제조단계;
    상기 두유 가수분해물에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시키는 두유 가수분해물의 발효물 제조단계; 및
    상기 두유 가수분해물의 발효물에서 분자량 5 kDa 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거하여 두유 펩타이드 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 주름개선용 두유 펩타이드 분획물의 제조방법.
    
11. 두유에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P]를 접종하여 발효시키는 두유 발효물 제조단계;
    상기 두유 발효물을 단백분해효소인 후라보자임(flavourzyme)으로 가수분해하는 두유 발효물의 가수분해물 제조단계; 및
    상기 두유 발효물의 가수분해물에서 분자량 5 kDa 초과하는 단백질 또는 펩타이드를 제거하여 두유 펩타이드 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 주름개선용 두유 펩타이드 분획물의 제조방법.
    
12. 두유를 발효시켜 I형 프로콜라겐 생성 활성 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 억제 활성을 갖는 두유 펩타이드를 생성하는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) MK1 [기탁번호: KFCC11552P].

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