KR20140038435A - 허혈성 뇌 손상에 대한 효과적인 신경보호제이며 통증의 치료를 위한 ｐｓｄ-95의 고-친화성, 이량체 저해제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 nNOS, PSD-95 및 NMDA 수용체의 3원 단백질 복합체의 신규한 효능 있는 저해제, 및 대상에서 흥분독성-관련된 질환 및 만성 통증 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 상기 저해제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 저해제는 링커에 의해서 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체에 연결된 제1 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하는 이량체 PSD-95 저해제이며, 상기 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하고, a. Y는 E, Q 및 A, 또는 이들의 유사체 중에서 선택되고, b. X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N, 또는 이들의 유사체 중에서 선택되며, 세포 투과성 펩티드(CPP)가 링커 또는 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 아미노산 측쇄에 연결된다. 링커는 PEG 또는 NPEG 링커일 수 있다.

Description

허혈성 뇌 손상에 대한 효과적인 신경보호제이며 통증의 치료를 위한 ＰＳＤ-95의 고-친화성, 이량체 저해제{HIGH-AFFINITY, DIMERIC INHIBITORS OF PSD-95 AS EFFICIENT NEUROPROTECTANTS AGAINST ISCHEMIC BRAIN DAMAGE AND FOR TREATMENT OF PAIN}

구조 단백질(scaffolding protein) PSD-95는 허혈성 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상의 치료는 물론 신경병증 통증과 염증성 통증 등 만성 통증 상태에 대한 잠재적 표적이다. 본 발명은 PSD-95-관련 단백질-단백질 상호작용의 저해제로서 작용하는 이량체 펩티드 유사체의 제공에 관한 것이다.

단백질-단백질 상호작용(PPI)은 생명 유지에 관련된 세포성 과정에 필수적이며, 많은 병리생리학적 상태에 수반되어 치료적 중재를 위한 잠재적 표적으로 사용된다. PPI는 주로 크고 평평하며 소수성인 계면을 특징으로 하기 때문에 일반적으로 치료 분자와 함께 표적화하는 것은 어렵다고 알려져 있다.

PPI의 한 부류로 PDZ 도메인을 수반하는 것이 있다(PDZ는 시냅스후 밀도 단백질-95(PSD-95), 초파리 상동성 원판상 대형 종양 억제제(DlgA) 및 폐쇄소대-1 단백질(ZO-1)의 약칭이다). PDZ 도메인은 주로 세포에서 큰 단백질 복합체를 조립할 때 수반되는 구조 단백질에서 모듈로서 기능하며 진핵생물에 매우 풍부하다. PDZ 도메인은 약 90개의 아미노산을 포함하고, 일반적으로 상호작용 단백질의 C-말단과 상호작용한다. PSD-95는 3개의 PDZ 도메인 PDZ 1-3을 함유하며, 이들은 공통 서열Glu/Gln-Ser/Thr-X-Val-COOH을 가진 펩티드 리간드와 결합한다. PDZ 도메인과 C-말단 펩티드의 상호작용에 대한 구조적 기초는 자생 펩티드 리간드인 CRIPT(서열: YKQTSV)와 복합체화된 PSD-95의 PDZ3의 엑스선 결정학적 구조에 의해서 처음에 해명되었다. PDZ3은 6개의 역평행 β-가닥(βA-βF)과 2개의 α-나선(αA 및 αB)을 지니고, C-말단 펩티드 리간드는 βB 가닥과 αB 나선 사이의 홈에 추가의 역평행 β-가닥으로서 결합한다. 이 펩티드 리간드에서 2개의 잔기가 친화성 및 특이성에 특히 중요하다고 생각되는데, 이들은 첫 번째(P0)와 세 번째(P-2) 아미노산이다(C-말단에서부터 세었을 때). P0 위치에 있는 아미노산의 측쇄는 소수성 포켓으로 돌출하며, 지방족 측쇄를 가진 아미노산(Val, Ile 및 Leu)이 필요하다. PDZ3-CRIPT 구조에서 Thr(P-2)의 히드록실 산소는 His372의 이미다졸 측쇄의 질소와 수소 결합을 형성한다. 보존된 Gly-Leu-Gly-Phe(PDZ3에서 위치 322-325) 모티프와 PDZ 도메인의 양으로 하전된 잔기(PDZ3에서 Arg318)는 C-말단 카복실레이트 기와의 결합을 매개한다.

PSD-95의 PDZ1 및 PDZ2 도메인은 통로형(ionotropic) 글루타메이트 수용체와 일산화질소 생산 효소인 뉴런성 일산화질소 신타아제(nNOS)의 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA)-타입의 동시 결합을 포함하는 몇 개의 단백질과 상호작용한다(도 1). NMDA 수용체는 신경변성 질환 및 급성 뇌 손상에 연루되는 흥분세포독성의 주요 매개제인데, NMDA 수용체의 길항제가 글루타메이트-매개 이온 플럭스를 방지함으로써 흥분세포독성을 효과적으로 감소시키지만 이들은 또한 생리학적으로 중요한 과정들도 방지한다. 따라서, NMDA 수용체 길항제는 낮은 관용성과 효능의 부족으로 인하여 뇌졸중에 대한 임상 시험에서 실패했다. 대신에, PSD-95 저해제와의 세포내 nNOS/PSD-95/NMDA 수용체 복합체를 교란시킴으로써 흥분세포독성의 특이적 저해가 얻어질 수 있다(도 1). PSD-95는 PDZ1과 PDZ2를 통해서 NMDA 수용체, 주로 GluN2A와 GluN2B 서브유닛 및 nNOS와 동시에 결합한다. NMDA 수용체의 활성화는 칼슘 이온의 유입을 야기하며, 칼슘 이온은 nNOS를 활성화시켜 일산화질소(NO) 생성을 초래한다. 이와 같이, PSD-95는 NMDA 수용체 활성화와 NO 생산 사이의 특이적 관계를 매개하며, 이것은 장기간 지속될 경우 세포에 해로울 수 있고, 글루타메이트-매개 신경독성의 핵심적인 촉진제이다(도 1). PSD-95를 표적화함에 의한 nNOS/PSD-95/NMDA 수용체 상호작용의 3원 복합체의 저해는 NMDA 수용체의 이온 플럭스 및 전-생존 신호화 경로와 같은 생리학적 기능은 그대로 유지하면서 칼슘 이온 진입과 NO 생산 사이의 기능적 고리를 손상시킴으로써 마우스에서 허혈성 뇌 손상을 방지한다고 알려져 있다. nNOS/PSD-95/NMDA 수용체 복합체의 저해는 막 및 혈관-뇌 장벽 투과성을 촉진하는 능력에 대해 알려진, HIV-1 Tat 펩티드와 융합된, GluN2B의 C-말단에 상응하는 나노펩티드에 의해서 이미 달성되었다. 이 20-mer 펩티드(Tat-NR2B9c; 서열: YGRKKRRQRRRKLSSIESDV)는 허혈성 뇌 손상의 래트 모델에서 유망한 신경보호 특성을 나타냈으며(Aarts et al., Science 298, 2002, p.846-850, 2002; Sun et al., Stroke 39, 2008, p.2544-2553), 현재 뇌졸중에서 보이는 뇌혈관성 허혈의 치료를 위한 잠재적 약물로서 임상 시험 중이다. 그러나, 이 화합물은 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 낮은 친화성(Ki = 4.6μM; 이후 참조)이 문제인데, 이것은 잠재적으로 화합물을 비효과적이며 비-선택성으로 만든다.

WO 2010/004003은 PSD-95의 PDZ1 및 PDZ2 도메인과 동시에 결합하는 폴리에틸렌 글리콜 링커(PEG)에 의해서 연결된 이량체 펩티드 리간드, 및 뇌혈관성 허혈의 치료를 위한 이들의 사용을 설명한다. PDZ1과 PDZ2 도메인에 대한 친화성이 더 높고, 허혈성 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상의 치료를 위한 개선된 생체내 치료 효과를 갖는 PSD-95 저해제에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.

신경병증 통증은 외상성 손상, 수술 또는 당뇨병이나 자가면역 장애와 같은 질환으로 인한 말초신경계 또는 중추신경계의 손상에 의해서 야기된다. 이러한 손상은 통각적 통증 및 염증을 특징으로 하는 급성기 반응을 초래한다. 대부분의 환자에서는 손상이 치유되어도 통증이 지속되며, 이것은 만성 신경병증 통증 상태를 가져온다. 신경 손상 후 염증의 연루에 더하여, 만성 통증이 또한 통증 경로의 민감화를 야기하는 면역 세포에 의해서 방출된 매개제에 의해 유도된 염증에 의해서 개시될 수 있다. 척추 감각 뉴런의 민감화('와인드업')는 신경병증 통증과 만성 염증성 통증의 공유된 특징이며, 통각수용기의 연장된 활성화에 의해서 촉발된다. 증상들은 자발적 작열통, 고통 자극에 대한 과장된 반응(통각과민증), 및 정상적으로는 고통이 없는 자극에 대해 반응하는 통증(무해자극통증)으로 나타난다. 만성 통증, 특히 신경 손상의 결과인 만성 통증은 오피오이드류 및 비-스테로이드계 항염제(NSAID)와 같은 현행 약물에 의해서 잘 관리되지 않는다. NMDA 수용체 길항제는 통증 반응의 민감화를 차단하고, 동물 모델 및 임상 환경에서 우수한 진통 특성을 나타내지만, 이들은 허용될 수 없는 부작용과 관련되므로 임상에서는 사용될 수 없다. 따라서, 현행 약물의 허용될 수 없는 부작용을 피하면서 개선된 통증 치료, 특히 NMDA 수용체 관련된 통증 증상의 개선된 치료를 제공할 수 있는 대체 약물에 대한 필요성이 있다.

본 발명의 제1 구체예는 링커에 의해서 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체에 연결된 제1 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하고,

a. Y는 E, Q 및 A, 또는 이들의 유사체 중에서 선택되고,

b. X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N, 또는 이들의 유사체 중에서 선택되며,

세포 투과성 펩티드(CPP)의 기능을 갖는 제3 펩티드가 링커에 연결되고, 상기 제3 펩티드는 아르기닌 및/또는 리신으로부터 선택된 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게, 링커는 PEG를 포함하며, PEG의 적어도 하나의 산소 원자가 질소 원자로 치환되어 NPEG를 제공하고, 바람직하게 제3 펩티드는 NPEG 링커의 질소 원자에, 바람직하게 아미드 결합에 의해서 연결된다.

본 발명의 제2 구체예는 링커에 의해서 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체에 연결된 제1 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하는 화합물을 제공하며, 상기 링커는 PEG를 포함하고, 상기 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하며,

a. Y는 E, Q 및 A, 또는 이들의 유사체 중에서 선택되고,

b. X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N, 또는 이들의 유사체 중에서 선택되며,

제3 펩티드가 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 잔기 중 하나의 측쇄에 연결되고, 상기 제3 펩티드는 아르기닌 및/또는 리신으로부터 선택된 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하며, 세포 투과성 펩티드(CPP)의 기능을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 화합물의 추가의 구체예에서, 링커는 1-28개의 에틸렌 글리콜 부분(N = 1-28), 바람직하게 4 내지 12개의 에틸렌 글리콜 부분(N = 4-12), 더 바람직하게 4 내지 6개의 에틸렌 글리콜 부분(N = 4-6)을 포함하는 PEG 링커이다. 본 발명의 화합물의 추가의 구체예에서, 링커는 PEG-2산 또는 NPEG-2산이며, 링커의 각 카복실 기가 아미드 결합을 통해서 제1 또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 말단 잔기의 말단 아미노 기에 연결된다.

본 발명의 상기 화합물의 추가의 구체예에서, 제3 펩티드(CPP)는 레트로인버소(retro-inverso) 펩티드를 포함한다. 본 발명의 상기 화합물의 추가의 구체예에서, 제3 펩티드(CPP)는 Tat 펩티드(YGRKKRRQRRR) 또는 레트로인버소-D-Tat 펩티드(rrrqrrkkr)이다.

본 발명의 상기 화합물의 추가의 구체예에서, 펩티드 또는 펩티드 유사체는 5 내지 10개의 아미드-결합된 잔기 길이이다. 본 발명의 상기 화합물의 추가의 구체예에서, 펩티드는 적어도 4개의 L-아미노산 잔기로 이루어진다. 본 발명의 상기 화합물의 추가의 구체예에서, X는 A, Q 및 D 중에서 선택된다. 본 발명의 상기 화합물의 추가의 구체예에서, 펩티드 또는 펩티드 유사체는 N-알킬화된다.

본 발명은 PEG-2산을 포함하는 링커 화합물을 더 제공하며, PEG의 하나의 산소 원자가 질소 원자로 치환되어 NPEG-2산을 제공한다. 본 발명의 링커 화합물의 추가의 구체예에서, 질소 원자는 보호기에 연결된다.

본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 상기 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물을 더 제공한다.

추가의 구체예에서, 본 발명의 상기 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물은 대상에서 흥분독성-관련 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것이다.

본 발명은 대상에서 통증의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 상기 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물을 더 제공한다.

본 발명은 상기 제약 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 흥분독성-관련 질환 또는 통증의 예방 및/또는 치료를 제공하는 방법을 더 포함하며, 상기 질환은 CNS의 허헐성 또는 외상성 손상일 수 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 대상에서 통증의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 활성 화합물을 포함하고, 상기 활성 화합물은 링커에 의해서 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체에 연결된 제1 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하고, 여기서 (a) Y는 E, Q 및 A, 또는 이들의 유사체 중에서 선택되고, (b) X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N, 또는 이들의 유사체 중에서 선택된다. 추가의 구체예에서, 상기 활성 화합물 중의 링커는 PEG 링커 또는 NPEG 링커이고, 4 내지 28개의 에틸렌 글리콜 부분을 포함한다(N = 4-28). 추가의 구체예에서, 상기 활성 화합물에서 링커의 카복실 기는 제1 또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 말단 잔기에 연결된다. 추가의 구체예에서, 상기 활성 화합물은 PEG4(IETAV)2, NPEG4(IETAV)2, PEG6(IESDV)2 및 PEG4(IESDV)2중에서 선택된다.

상기 활성 화합물은 아르기닌 및/또는 리신으로부터 선택된 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하고, CPP의 기능을 갖는 제3 펩티드를 더 가질 수 있으며, 상기 제3 펩티드는 링커에 연결되거나, 또는 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 아미노산의 측쇄에 연결된다.

도 1은 PSD-95가 그것의 PDZ1 및 PDZ2 도메인을 통해서 NMDA 수용체와 nNOS에 동시에 결합하는 것을 도시한다. 이로써, NMDA 수용체로부터의 칼슘(Ca2+) 진입이 nNOS를 활성화함으로 PSD-95는 NMDA 수용체 활성화와 NO 생산 사이의 기능적 연결을 촉진한다. PSD-95의 PDZ1-2를 표적으로 하는 예시된 이량체 리간드와 같은 PSD-95 저해제는 3원 nNOS/PSD-95/NMDA 수용체 복합체의 형성을 저해하고, NMDA 수용체 활성과 NO 생산 사이의 연결을 끊으며, 이로써 흥분독성에 대한 신경보호가 달성된다.
도 2는 PEG4-2산 및 NPEG4-2산 링커, 그리고 이량체 화합물 AB125 및 AB141의 화학적 구조이다.
도 3은 이량체 리간드 AB144 및 AB147의 화학적 구조로서, 모두 이들의 전체 구조를 제공하며, 펜타펩티드 부분, Tat-서열 및 레트로인버소-D-Tat 서열은 1-문자 아미노산 코드로 기재된다.
도 4는 형광 이량체 리간드 AB143 및 AB145의 화학적 구조이며, 이들은 형광 분극 분석에서 프로브로서 사용되고, CNS 투과성을 연구하기 위해서 사용된다.
도 5는 형광 분극에 의해서 측정된 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성(왼쪽)과 37℃에서 시험관내 사람 혈액 혈장에서의 안정성(오른쪽)이다. Ki 친화성 상수와 안정성 반감기(T1/2)가 표에 기재된다. 표 및 형광 분극 그래프(왼쪽)의 데이터는 3회 이하의 개별적 측정을 나타내며, 1회 실험으로부터의 대표 데이터가 혈액 혈장 그래프(오른쪽 그래프)에 도시된다.
도 6은 자유 AB140(등고선: I1, E2, T3, A4, V5) 및 PSD-95의 PDZ1-2와 복합체화된 AB140(나머지 a/b 등고선)의 1H-15N 상호관련 스펙트럼(NMR)이다. 배치가 스펙트럼에 표시된다. 디펩티드의 결합된 형태인 경우, 'a' 피크와 'b' 피크가 각각 결합한 PDZ 도메인을 결정하려는 시도는 하지 않았다.
도 7은 프로그램 SSP를 사용하여 계산된 AB140의 결합된 형태의 2차 구조 경향이다. 하나의 값은 완전히 형성된 α-나선을 나타내고, 마이너스가 붙은 하나의 값은 완전히 연장된 구조를 나타내며, 0에 가까운 값은 랜덤 코일을 나타낸다. 검은색 막대는 도 6에서 'a'로 표지된 잔기에 해당하고, 회색 막대는 'b'로 표지된 잔기에 해당한다.
도 8은 조작되지 않은 마우스에서 형광 유사체의 혈액-뇌 장벽 투과성이다. (A) 식염수 처리 마우스와 비교하여 정맥내(i.v.) 주사 2시간 후 5-FAM(F)-표지된 화합물의 평균 형광 강도의 막대 그래프이다. (B) 식염수 마우스(n=2)와 비교하여 F-Tat-NPEG4(IETDV)2(AB145)(n=2), F-레트로인버소-D-Tat-NPEG4(IETDV)2(AB148)(n= 2) 및 F-Tat-NR2B9c(MS23)(n=2)은 검출되지만, F-NPEG4(IETAV)2(AB143)(n=2)는 검출되지 않는다. F = 5-FAM; Re = 레트로인버소. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다; */**/***: p<0.05/0.01/0.001(비-모수 만-휘트니. 스케일 바: 100μm.
도 9는 pMCAO 실험의 타임 라인이다. 모든 화합물은 수술 30분 후에 정맥내 투여되었고(3nmol/g), 이후 5.5시간 또는 47.5시간 생존 기간이 이어졌다.
도 10은 6시간 후-수술 생존 기간 후 화합물의 신경보호 효과이다. 막대 그래프는 pMCAO 6시간 후 평균 경색 부피를 나타낸다. AB144 치료는 식염수 처리 대조군 마우스와 비교하여 허혈성 뇌 손상을 유의하게 감소시켰으며, 이 효과는 단량체 Tat-NR2B9c 치료에 의해서는 달성되지 않았다(n = 16-19). 데이터는 평균±SEM으로 표시된다; */**/***: p<0.05/0.01/0.001; 비-모수 만-휘트니 테스트.
도 11은 48시간 후-수술 생존 기간 후 화합물의 신경보호 효과이다. 톨루이딘 블루 염색은 pMCAO 48시간 후 허혈성 뇌 손상을 나타낸다. 스케일 바: 1mm.
도 12는 48시간 후-수술 생존 기간 후 화합물의 신경보호 효과이다. 막대 그래프는 식염수 처리 대조군 마우스와 비교하여 AB144의 장기간 지속되는 경색 감소 효과를 나타내며, 단량체 Tat-NR2B9c로 치료된 마우스와 비교하여 경색이 유의하게 작아졌다(n = 16-19). 또한, AB147은 AB144와 유사하게 장기간 지속되는 경색 감소를 야기했다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다; */**/***: p<0.05/0.01/ 0.001; 비-모수 만-휘트니 테스트.
도 13에서는 온도(왼쪽) 및 체중(오른쪽)과 같은 생리학적 변수를 pMCAO 전과 후에 등록되었다(48시간 실험). 시간 지점(x-축)은 수술(0h)에 대한 시간을 나타낸다. (왼쪽) pMCAO 30분 후 체온의 마취-유도 저하를 나타내는 그래프이며, 정맥내 주사 전에 등록되었다. 수술 1시간 후와 3시간 후 그룹들 사이에 약물-유도 차이는 등록되지 않았다. (오른쪽) pMCAO(0h) 3일 전과 24시간 후와 48시간 후에 그룹들 사이에 체중의 차이가 없음을 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. 양-방향 Anova.
도 14는 48시간 후-수술 생존을 가진 마우스의 운동 기능 평가이다. (A) pMCAO 전(베이스라인)과 후에 두 앞발의 평균 움켜쥠 강도를 나타내는 막대 그래프이다. 식염수 및 Tat-NR2B9c 치료 마우스는 pMCAO 48시간 후에 베이스라인과 비교하여 유의하게 감소된 움켜쥠 강도를 나타냈다. AB144 및 AB147로 치료된 마우스에서는 베이스라인과 비교하여 차이가 관찰되지 않았다. (B) 앞발에서 허헐-유도된 비대칭성을 나타내는 막대 그래프로서, 식염수 및 단량체 Tat-NR2B9c 치료된 마우스에서 모두 비대칭성이 관찰되지만, AB144 및 AB147 치료된 마우스에서는 관찰되지 않는다. (C) 4번 시도의 로타로드 성능 테스트(T1-T4)로서, pMCAO 48시간 후 마우스의 단기 운동 학습 능력을 나타낸다. 데이터는 모든 그룹의 마우스에서 시험에 따른 학습 성분을 드러내며, AB144 및 AB147 치료는 식염수와 비교하여 더욱 확연한 개선(T2 참조)과 Tat-NR2B9c와 비교하여 증가된 인내심(설명 참조)을 제공했다. (A-C) 모든 데이터는 평균±SEM로 표시된다; */**/***: p<0.05/0.01/0.001; (A-B) 페어드 스튜던트 티 테스트; (C) 윌콕슨 매칭 페어 테스트.
도 15는 AB144 유사체들인 AB144_B, AB144_C, AB144_D, AB144_E, AB144_H, AB144_I의 화학적 구조이다. 도 3에서와 같은 동일한 스타일로 구조적으로 표시된다.
도 16은 N-보호된(Ns) 형태의 NPEG-링커A-C(Ns-NPEG4-2산-링커)의 합성을 예시하는 반응도 1이며, 이것은 NPEG-기반 이량체 화합물을 제조하는 이량체화 과정에서 사용된다. Ns-NPEG4-2산-링커 A는 AB141, AB144, AB147, AB144_D, AB144_E, AB143, AB145 및 AB148에서 사용된다. Ns-NPEG4-2산-링커 B는 AB144_B에서 사용된다. Ns-NPEG4-2산-링커 C는 AB144_C에서 사용된다.
도 17은 염증성 통증의 완전 프레운드 애쥬번트 모델에서 AB125의 효과이다. 동물은 발바닥내 CFA와 복강내 AB125(0, 3, 10 또는 30mg/kg)로 동시에 치료되었고, 24시간 후 시험되었다. 기계적 통각과민증/무해자극통증이 본 프레이 방법으로 측정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표시되며, 베이스라인 값에 대한 발 움츠림 역치를 나타낸다(즉, <1.0은 통각과민증/무해자극통증에 해당한다). 식염수 처리 마우스는 CFA에 대해 현저한 반응을 보였으며, 기계적 역치는 베이스라인의 36%까지 감소되었다(###; p<0.001). 이 감소는 3, 10 또는 30mg/kg AB125 치료 마우스에서는 관찰되지 않았다. 3, 10 또는 30mg/kg AB125로 치료된 마우스의 역치는 식염수 처리 마우스와 유의하게 상이했다(***: p<0.001).
도 18은 CFA와 동시에 주어졌을 때 CFA-유도된 통각과민증에 대한 AB125(A)와 MK-801(B)의 효과이다. AB125의 경우, ANCOVA는 베이스라인의 유의한 주 효과 (F1,47=4.61; p=0.037), 치료의 유의한 주 효과(F3,47=5.00; p=0.004), 시간의 유의한 주 효과(F1,48=42.02; p<0.001)를 드러냈고, 시간 상호작용에 의한 유의한 치료는 없었다(F3,48=0.71; p=0.552). 계획된 비교는 AB125가 1시간 후 3mg/kg(p= 0.012) 및 10mg/kg(p=0.03)에서 CFA-유도된 통각과민증을 유의하게 반전시켰음을 드러냈다. 유의한 반전은 3mg/kg(p=0.008) 및 10mg/kg(p=0.003) 치료 그룹에서 24시간 후에도 관찰되었다. MK-801의 경우, ANCOVA는 베이스라인의 유의한 주 효과 없음(F1,27=0.03; p=0.86), 치료의 유의한 주 효과(F3,27=9.60; p<0.001), 시간의 유의한 주 효과(F1,28=31.14; p<0.001), 및 시간 상호작용에 의한 유의한 치료 없음(F3,28=0.90; p=0.452)을 드러냈다. 계획된 비교는 MK-805가 1시간 후 0.1mg/kg (p=0.004)에서 CFA-유도된 통각과민증을 유의하게 반전시켰음을 드러냈다. 유의한 반전은 0.1mg/kg(p<0.001) 치료 그룹에서 24시간 후에도 관찰되었다.
도 19는 CFA 주사 24시간 후에 주어졌을 때 AB125의 효과이다. ANCOVA는 베이스라인의 유의한 주 효과(F1,34=15,67; p<0.001), 치료의 유의한 주 효과(F4,34= 7.98; p<0.001), 시간의 유의한 주 효과(F2,70=24.41; p<0.001)는 드러냈지만, 시간 상호작용에 의한 유의한 치료는 없었다(F1,70=1.31; p=0.253). 계획된 비교는 1시간 후 3mg/kg(p=0.002) 및 10mg/kg(p=0.001)에 의한 CFA-유도된 통각과민증의 반전을 드러냈다. 유의한 반전은 3mg/kg(p=0.015) 및 10mg/kg(p<0.001) 치료 그룹에서 24시간 후에도 관찰되었다. 72시간째에 통각과민증은 모든 용량에 의해서 유의하게 반전되었다(1, 3 및 10mg/kg)(p<0.001).
도 20은 장기 참조 기억에 대한 식품 선호도의 사회적 전달 시험에서 식품 섭취에 대한 AB125와 MK-801의 효과(A-B), 및 구별 지수에 대한 효과(C-D)이다. AB125의 경우, 구별 지수에 대한 단-방향 ANOVA는 치료의 유의한 주 효과가 없음을 드러냈다(F2,22=0.108; p=0.898). 계획된 비교는 시험된 AB125 용량(도시된 30 및 60mg/kg)의 유의한 효과가 없음을 나타냈다. MK-801의 경우, 단-방향 ANOVA는 치료의 유의한 주 효과를 드러냈다(F2,21=5.28; p=0.014). 예측된 평균에 대한 계획된 비교는 0.1mg/kg MK-801이 구별 지수를 유의하게 감소시켰음을 드러냈다(p=0.005).
도 21은 변형된 Y-미로에서 익숙한 팔과 새로운 팔에서 소비한 시간에 대한 AB125와 MK-801의 효과(A-B)와 구별 지수 DI = (새로운 팔 - 익숙한 팔)/(새로운 팔 + 익숙한 팔)에 대한 효과(C-D)이다. AB125의 경우, 단-방향 ANOVA는 구별 지수에 대한 AB125의 유의한 주 효과가 없음을 드러냈다(F3,29=0.85; p=0.478). 계획된 비교는 시험된 AB125 용량(도시된 30 및 60mg/kg)의 유의한 효과가 없음을 나타냈다. MK-801의 경우, 단-방향 ANOVA는 치료의 유의한 효과를 드러냈다(F3,23= 15.43; p<0.001). 계획된 비교는 구별 지수가 0.05(p=0.019) 및 0.1mg/kg MK-801 (p<0.001)까지 감소되었음을 드러냈다.
도 22는 로타로드 테스트에서 운동 성능에 대한 AB125 및 MK-801의 효과이다. AB125(도시된 30 및 60mg/kg)의 경우, 양-방향 RM ANOVA는 치료의 유의한 주 효과(F2,48=1.18; p=0.333), 시간의 유의한 주 효과(F3,48=0.84; p=479), 및 시간 상호작용에 의한 유의한 치료(F6,48=1.26; p=0.293)를 나타내지 않았다. MK-801의 경우, 양-방향 ANOVA는 치료의 유의한 주 효과(F2,66=55.72; p<0.001), 시간의 유의한 주 효과(F3,66=3.69; p=0.016) 및 시간 상호작용에 의한 유의한 치료(F6,66= 2.25; p=0.049)를 나타냈다. 계획된 비교는 0.1mg/kg MK-801이 15분(p<0.001), 30분(p<0.001), 45분(p<0.001), 및 60분(p=0.006)에서 로타로드 위의 시간을 유의하게 감소시켰음을 드러냈다.
도 23은 염증성 통증의 완전 프레운드 애쥬번트 모델에서 AB144의 효과이다. 동물은 발바닥내 CFA와 복강내 AB144(0, 3, 10 또는 30mg/kg)로 동시에 치료되었고, 1시간 및 24시간 후 본 프레이 방법으로 기계적 통각과민증/무해자극통증이 측정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표시되며, 베이스라인 값에 대한 발 움츠림 역치를 나타낸다(즉, <1.0은 통각과민증/무해자극통증에 해당한다). 식염수 처리 마우스는 CFA에 대해 현저한 반응을 보였으며, 기계적 역치는 베이스라인의 25%까지 감소되었다(###; p<0.001). 이 감소는 30mg/kg AB144 치료 마우스에서 AB144/CFA 투여 1시간 후에, 그리고 10 및 30mg/kg AB144 치료 마우스에서 AB144/CFA 투여 24시간 후에 관찰되지 않았다(*: p<0.05).

I. 약칭 및 용어의 정의

본원에서 사용된 "한"은 그것이 사용된 문맥에 따라서 하나 이상을 의미할 수 있다.

아미드 결합은 카복실산과 아민 사이의 반응에 의해서 형성된다(동시에 물이 제거된다). 반응이 두 아미노산 잔기 사이에서 일어난 경우, 반응의 결과로서 형성된 결합은 펩티드 연결(펩티드 결합)로 알려져 있다.

단백질형성 아미노산은 IUPAC의 지침에 따라서 본원에서 1-문자 또는 3-문자 코드를 사용하여 명명되며, 예를 들어 http://www.chem.qmw.ac.uk/iupac를 참조한다. 어떻게도 특정되지 않는다면 아미노산은 D- 또는 L-형태를 가질 수 있다. 본 설명에서(서열목록에서는 아니지만) 대문자로 시작하는 3-문자 코드는 L-형태의 아미노산을 나타내고, 소문자로 시작하는 3-문자 코드는 D-형태의 아미노산을 나타낸다. "포함하는"은 포괄적 방식으로 이해되어야 한다. 따라서, 예로서 화합물 X를 포함하는 조성물은 화합물 X와 선택적으로 추가의 화합물을 포함할 수 있다.

CFA, 완전 프레운드 애쥬번트;

CNS, 중추신경계;

CPP, 세포 투과성 펩티드; 포유류 세포의 원형질 막을 가로질러 그것이 연결되어 있는 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드와 같은 적재 분자의 세포내 송달을 일어나게 할 수 있는 능력을 특징으로 한다.

DCM, 디클로로메탄;

이량체 PSD-95 저해제는 PSD-95의 PDZ1 및 PDZ2와 동시에 결합하거나 상호작용할 수 있는, 링커에 의해서 공유 연결된 두 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하는 PSD-95 저해제이다;

P0, 펩티드/펩티드 유사체의 C-말단 아미노산에 상응하는 첫 번째 아미노산 잔기 또는 유사체로 정의된다;

P-1, 펩티드/펩티드 유사체의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 두 번째 아미노산 잔기 또는 그것의 유사체로 정의된다;

P-2, 펩티드/펩티드 유사체의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 세 번째 아미노산 잔기 또는 그것의 유사체로 정의된다;

P-3, 펩티드/펩티드 유사체의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 네 번째 아미노산 잔기 또는 그것의 유사체로 정의된다;

P-4, 펩티드/펩티드 유사체의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 다섯 번째 아미노산 잔기 또는 그것의 유사체로 정의된다;

P-5, 펩티드/펩티드 유사체의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 여섯 번째 아미노산 잔기 또는 그것의 유사체로 정의된다;

DIPEA, 디이소프로필에틸아민;

DMF, N,N-디메틸포름아미드;

에틸렌 글리콜 부분은 여기서 PEG 또는 NPEG 링커를 구성하는 구조 단위를 말한다. '에틸렌 글리콜 부분'의 더욱 기술적인 명칭은 '옥시에틸렌'이며, 이 단위의 화학 식이 아래 도시된다:

FP, 형광 분극;

HATU, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로포스페이트;

HBTU, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로포스페이트;

포유류 세포는 포유류 기원의 어느 세포를 나타내도록 의도된다. 세포는 확립된 셀라인일 수 있고, 이들 중 대부분은 The American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, USA)로부터 입수 가능하거나, 또는 트랜스제닉 동물로부터 유래된 조직을 포함하는 포유류 조직으로부터 유래된 제한된 수명 범위를 가진 일차 세포, 또는 트랜스제닉 조직을 포함하는 포유류 조직으로부터 유래된 새로 확립된 불멸 셀라인, 또는 포유류 기원의 상이한 세포 타입들을 융합함으로써 유래된 하이브리드 세포 또는 셀라인, 예를 들어 하이브리도마 셀라인일 수 있다. 세포는 선택적으로 하나 이상의 비-자생 유전자 산물, 예를 들어 수용체를 발현할 수 있다;

MCAO, 중뇌 동맥 폐쇄;

nNOS, 뉴론성 일산화질소 신타아제;

NO, 일산화질소;

NMDA, N-메틸-D-아스파르테이트;

NMR, 핵자기공명;

NPEG는 본원에 설명된 새로운 링커 종류로서, 고전적인 PEG 링커로부터 유래되고, 백본 산소 원자 중 하나 이상이 질소 원자로 치환된 것이다;

Ns, 오르토-니트로벤젠술포닐(때로는 oNBS로 약칭된다);

PDZ, 시냅스후 밀도 단백질-95(PSD-95), 초파리 상동성 원판상 대형 종양 억제제(DlgA), 및 폐쇄소대-1 단백질(ZO-1)의 약칭이다);

PEG, 폴리에틸렌 글리콜; PEG는 화학식 C2n+2H4n+6On+2를 갖는 에틸렌 글리콜의 중합체이며, 반복 구조는 아래와 같다:

여기서 예를 들어 12 PEG 부분, 또는 PEG12는 12개 에틸렌 글리콜 부분의 중합체에 해당한다(n = 12);

PPIs, 단백질-단백질 상호작용;

PSD-95, 시냅스후 밀도 단백질-95;

PSD-95 저해제는 PSD-95의 PDZ1에, PDZ2에 또는 PDZ1과 PDZ2 모두에 결합하여 세포에서 이들 PDZ 도메인에 의해 촉진되는 PPI를 저해하는 화합물이다. PSD-95 저해제에 의해서 저해되는 상호작용의 예는 nNOS, PSD-95 및 NMDA 수용체의 3원 복합체이다;

레트로인버소, 레트로인버소 펩티드는 모 L-아미노산 서열의 순서와 역순으로 조립된 D-아미노산으로 이루어진다;

레트로인버소-D-Tat 서열, Tat 서열을 반전시키고 D-아미노산을 사용하여 제조된 9-mer CPP 서열(rrrqrrkkr)로서, 혈액-뇌 장벽을 포함하는 생물학적 막을 가로지르는 투과성을 촉진하며, 이것의 구조는 프로테아제 효소에 대해 안정하다;

SEM, 평균의 표준 오차;

Tat 서열, 사람 면역결핍 바이러스-타입 1(HIV-1) Tat 단백질로부터 유래된 11-mer CPP 서열(YGRKKRRQRRR)로서, 혈액-뇌 장벽을 포함하는 생물학적 막을 가로지르는 투과성을 촉진한다;

TFA, 트리플루오로아세트산;

THF, 테트라히드로푸란;

TIPS, 트리이소프로필실란;

I. CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 화학 구조

본 발명은 링커에 의해서 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체에 연결된 제1 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하는 이량체 PSD-95 저해제를 제공하며, 상기 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하고, 여기서

Y는 E, Q 및 A 중에서 선택되거나, 또는 선택된 잔기의 유사체이고,

X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 중에서 선택되거나, 또는 선택된 잔기의 유사체이다. 이량체 PSD-95 저해제는 제3 펩티드가 상기 저해제에 연결된 것을 더 특징으로 하며, 상기 제3 펩티드는 세포 투과 특성을 갖는 CPP이다.

I.i 이량체 PSD-95 저해제의 링커

이량체 PSD-95 저해제의 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체는 링커에 의해 함께 연결된다. 적합한 링커는 NPEG, 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리아민(Herve F et al, AAPS J, 2008, p.455); 펩티드 핵산(PNA)(Egholm et al., 2005 Nature 365, p.566); 잠긴 핵산(LNA)(Singh et al., 1998, Chem. Commun., p.455); 트리아졸, 피페라진, 옥심, 티아졸리딘, 방향족 고리 시스템, 알칸, 알켄, 알킨, 고리형 알칸, 고리형 알켄, 아미드, 티오아미드, 에테르, 및 히드라존을 포함하는 링커를 포함한다. 링커가 PEG(또는 NPEG) 링커일 때, 그것은 또한 활성 작용기, 예를 들어 친전자성 또는 친핵성 작용기를 포함할 수 있으며(WO 2007/140282), 이들을 사용하여 PEG 링커를 각 펩티드(또는 펩티드 유사체) 저해제에 부착할 수 있다. 부착을 위한 적합한 작용기는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐 카보네이트, 숙신이미딜 우레탄, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실 아지드, 술포닐 클로라이드, 알데히드, 카보네이트, 이미디오에스테르 또는 무수물 중에서 선택된 아미노-반응성 친전자성 기; 및 말레이미드, 할로아세틸, 알킬 할로겐화 유도체, 아지리딘, 아크릴로일 유도체 아릴화제 또는 티오-이황화물 교환 시약 중에서 선택된 티오-반응성 기를 포함한다. 적합한 친핵성 작용기는 아민, 히드라진, 카바자이트, 아실 히드라지드, 세미카바메이트 또는 히드라진을 포함하며, 이들은 펩티드 또는 펩티드 유사체 저해제 상에서 알데히드 또는 카복실 기와의 반응을 거칠 수 있다.

이량체 PSD-95 저해제에서 링커의 최적 길이는 선택된 링커에 따를 것이다. 링커가 PEG일 때, PEG의 에틸렌 글리콜 부분의 수(n)는 n = 1-28 또는 n = 4-28일 수 있으며, 또는 링커는 n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 길이를 가질 수 있다. 리간드(펩티드 또는 펩티드 유사체)를 연결하기 위해서 PEG-2산이 사용될 수 있고, 이 경우 예를 들어 PEG4-링커는 두 카복실산 기가 링커의 각 단부에 존재하도록 변형된다. 따라서, 이량체화 과정 전에 PEG4-2산 링커는 4,7,10, 13,16-펜타옥사노나데칸-1,19-디오익산으로 명명된다. 저해제의 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체와 링커의 이량체화 동안, 두 카복실산 기는 펩티드(또는 펩티드 유사체)의 N-말단 아미노 기와 반응하여 아미드 결합을 생성한다. PEG 0, 1, 2, 4, 6, 8 및 12 링커도 본 설명에 따른다.

이량체 PSD-95 저해제의 제1 구체예에 따라서, 링커는 PEG-2산 링커의 백본에서 하나의 산소 원자가 질소 원자로 치환된 NPEG로 명명된 PEG-2산 링커의 유도체를 포함한다. 질소 원자는 PEG 링커의 백본에 있는 산소 원자 중 어느 하나를 대신해 치환될 수 있다. NPEG-2산 링커의 카보닐 기는 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체에 각각 연결되며, 바람직하게 이 경우 링커는 펩티드 또는 펩티드 유사체의 말단 잔기에 아미드 결합된다.

도 2는 본 발명의 NPEG 링커, 즉 NPEG4-2산 링커를 예시하는데, 여기서 중심 산소 원자가 질소로 치환되어 대칭 NPEG 링커가 생성되며, 이것은 이량체 저해제에 사용된다(예를 들어, AB141). 도 15는 본 발명의 이량체 저해제에서 NPEG 링커를 예시하며, 여기서 질소로 치환된 PEG 링커의 백본에 위치된 산소 원자는 링커의 중심에서 떨어져 있는 하나 또는 두 '에틸렌 글리콜 부분'이며, 비대칭 NPEG 링커가 제공된다(예를 들어, AB144_B 및 AB144_C에서와 같은).

링커는 두 가지 기능을 제공한다. 그것은 저해제의 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체를 연결하기 위해 사용되며, 그 기능은 PSD-95의 PDZ1-2에 결합하는 리간드로서 작용하는 것이다. PSD-95의 PDZ1-2에 대한 저해제의 펩티드/펩티드 유사체의 친화성은 이량체화에 의해서 크게 증가된다. 추가로, NPEG 링커의 질소 원자는 추가의 유도체화를 위한 화학적 '핸들'로서 작용한다(도 2 및 3).

이량체 PSD-95 저해제의 제2 구체예에 따라서, 링커는 1 내지 28개 에틸렌 글리콜 부분(n = 1-28), 바람직하게 1 내지 12개 에틸렌 글리콜 부분(n = 1-12), 더 바람직하게 4 내지 6개 에틸렌 글리콜 부분(n = 4-6)의 길이를 가진 PEG-2산을 포함한다. 도 2는 PEG 링커, 즉 PEG4-2산 링커를 예시한다.

I.ii 이량체 PSD-95 저해제의 펩티드 또는 펩티드 유사체

이량체 PSD-95 저해제의 제1 또는 제2 구체예에 따라서, 펩티드 또는 펩티드 유사체는 10, 9, 8, 7 또는 6개 아미드-결합된 잔기 길이, 더 바람직하게 5 또는 4개 아미드-결합된 잔기 길이이다. 펩티드 또는 펩티드 유사체는 적어도 4개의 L-아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 저해제에서 잔기 X는 A, Q 및 D 중에서 선택된다. 잔기 Y 또는 X의 적합한 유사체, 또는 4개의 아미드-연결된 잔기(YTXV 또는 YSXV) 중 어느 것의 유사체, 또는 이들을 연결하는 아미드 결합의 유사체는 D-아미노산, 펩토이드 아미노산, β-아미노산, 올레핀계 이중결합(E-비닐), 레트로아미드, α-아자펩티드, 티오에스테르, 에스테르(뎁시펩티드), 카보닐의 카바 치환(메틸아민), 메틸티오기, 알칸, 케토메틸렌, 히드록시에틸렌, 히드록시에틸아민, 히드록시에틸유레아, 비닐 플루오라이드(Chemistry & Biochemistry of amino acids, peptides, and proteins, vol 7, 1983, Boris Weinstein, Ch.5 by Arno F. Spatola); 티오아미드(Bach et al., J. Med. Chem., 2011, p. 1333); 아자-@-단위(5-디히드로-2(3H)-피라존 부분), 특히 잔기 X 또는 Y에 상응하는 위치 P-1 또는 P-3(Hammond et al, Chem. Biol., 2006, p.1247)를 포함하며, 유사체의 선택은 본원에 설명된 펩티드의태체 접근법을 위한 도구 및 분석의 사용에 의해서 보조될 수 있다. 추가로, 이량체 PSD-95 저해제의 제1 및/또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 잔기는 N-알킬화될 수 있고, 이때 N-알킬화된 잔기는 잔기 Y에 상응하는 위치 P-3에 있다(WO 2010/004003). N-알킬 기는 N-메틸, N-에틸, N-프로필, N-부틸 및 N-벤질 중에서 선택될 수 있다. 특히 적합한 N-알킬 기는 N-시클로헥실메틸, N-시클로헥실에틸, N-페닐에틸, N-페닐프로필, N-(3,4-디클로로페닐)프로필, N-(3,4-디플루오로페닐)프로필, N-(나프탈렌-2-일)에틸 중에서 선택될 수 있다.

도 2는 이량체화된 펜타펩티드 IETAV와 PEG4(IETAV)2(AB125)에서와 같은 PEG 링커 또는 NPEG4(IETAV)2(AB141)에서와 같은 NPEG 링커를 포함하는, 본 발명의 제1 또는 제2 구체예에 따른 링커를 갖는 이량체 PSD-95 저해제를 예시한다.

I.iii 이량체 PSD-95 저해제의 CPP 펩티드

제1 또는 제2 구체예에 따라서, 이량체 PSD-95 저해제는 CPP의 특성을 가진 제3 펩티드를 더 포함한다. 이 제3 CPP 펩티드는 적어도 4개의 D- 또는 L-아미노산 잔기를 포함하지만, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 D- 또는 L-아미노산 잔기 길이일 수도 있다. 바람직한 CPP는 폴리양이온성 구조를 가지며, 적어도 4개의 리신 잔기, 또는 적어도 4개의 아르기닌 잔기, 또는 리신과 아르기닌 잔기를 모두 포함하는 적어도 4개의 잔기(예를 들어, Tat 펩티드; 폴리아르기닌 펩티드, 예를 들어 8개 아르기닌; SynB1: RGGRLSYSRRRFSTSTGRA), 또는 예를 들어 5-히드록시리신, 오르니틴, 2-아미노-3(또는 -4)-구아니디노프로피온산, 및 호모아르기닌과 같은 아르기닌 또는 리신과 유사한 양이온성 또는 염기성 측쇄를 갖는 적어도 4개의 아미노산을 포함한다. 대안의 CPP는 양친매성 구조를 가지며, 극성/하전된 아미노산과 비-극성, 소수성 아미노산의 교대하는 패턴을 포함한다(예를 들어, 페네트라틴: RQIKIWFQNRRMKWFF; 레트로인버소-페네트라틴: kkwkmrrnqfwvrvqr; 양친매성 모델 펩티드: KLALKLALKLAKAALKA).

도 3은 이량체화된 펜타펩티드 IETDV, NPEG 링커 및 CPP 펩티드를 포함하는, 본 발명의 제2 구체예에 따른 링커를 갖는 이량체 저해제를 예시한다. CPP는 Tat-NPEG4(IETDV)2에서와 같은 Tat(서열: YGRKKRRQRRR; 1-문자 아미노산 코드)(AB144)이거나, 또는 레트로인버소-D-Tat-NPEG4(IETDV)2에서와 같은 레트로인버소-D-Tat (서열: rrrqrrkkr; 1-문자 D-아미노산 코드)이다(AB147).

I.iv CPP 펩티드와 이량체 PSD-95 저해제의 연결

제1 구체예에 따라서, 이량체 PSD-95 저해제는 NPEG 링커의 백본에 있는 질소 원자에 대한 직접적인 또는 간접적인 화학 결합을 통해서 저해제에 연결된 CPP를 포함하며, 여기서 질소 원자는 링커에 대칭 또는 비대칭 위치될 수 있다. CPP와 NPEG 링커의 질소의 연결은 아미드 결합, 말레이미드 커플링, 이황화 결합, 또는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐 카보네이트, 숙신이미딜 우레탄, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실 아지드, 술포닐 클로라이드, 알데히드, 카보네이트, 이미디오에스테르 또는 무수물 중에서 선택된 아미노-반응성 친전자성 기, 및 할로아세틸, 알킬 할로겐화 유도체, 아지리딘, 아크릴로일 유도체 아릴화제 중에서 선택된 티오-반응성 기를 통해서 매개될 수 있다.

또는 달리, CPP와 링커의 질소의 연결은 스페이서 기를 통해서 매개될 수 있으며, 이 경우 적합한 스페이서 기는, 예를 들어 시스테인, 글리신, 알라닌과 같은 어떤 아미노산; 짧은 알칸 사슬 또는 짧은 PEG/NPEG 사슬일 수 있다.

도 3 및 15는 이량체화된 펜타펩티드 IETDV, NPEG 링커 및 CPP를 포함하는 이량체 저해제를 예시한다. CPP는 AB144 및 AB147에서와 같이 아미드 결합에 의해서 대칭 NPEG 링커에 연결될 수 있거나, 또는 AB144_B 및 AB144_C에서와 같이 아미드 결합에 의해서 비대칭 NPEG 링커에 연결될 수 있다. 또는 달리, C-말단 Cys를 포함하는 CPP는 AB144_D에서와 같이 NPEG 질소 원자로부터 연장된 말레이미드 기와의 말레이미드 커플링을 통해서 연결될 수 있다. 또는 달리, C-말단 Cys를 포함하는 CPP는 AB144_E에서와 같이 이황화(S-S) 결합을 통해서 NPEG 질소 원자로부터 연장된 술프히드릴 기에 연결될 수 있다.

제2 구체예에 따라서, 이량체 PSD-95 저해제는 PEG 링커, 및 제1 또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 측쇄에 연결된 CPP를 포함한다. CPP는 제1 또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 P-1 위치에 있는 잔기의 측쇄(예를 들어, 아미노산)에 연결될 수 있다. 바람직하게, CPP는 제1 또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 >P-4, 또는 더 바람직하게는 P-5 또는 P-6 잔기의 측쇄(예를 들어, 아미노산)에 부착된다. CPP와 잔기의 측쇄의 연결은 아미드 결합, 말레이미드 커플링, 이황화 결합, 또는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐 카보네이트, 숙신이미딜 우레탄, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실 아지드, 술포닐 클로라이드, 알데히드, 카보네이트, 이미디오에스테르 또는 무수물 중에서 선택된 아미노-반응성 친전자성 기, 및 할로아세틸, 알킬 할로겐화 유도체, 아지리딘, 아크릴로일 유도체 아릴화제 중에서 선택된 티오-반응성 기를 통해서 매개될 수 있다.

도 15는 AB144_H에서와 같은, 이량체화된 펜타펩티드 KETDV, PEG 링커 및 제1 펩티드(펜타펩티드)의 P-4 아미노산(리신)에 연결된 CPP를 포함하는 이량체 저해제를 예시한다. AB144_I에서 CPP는 제1 펩티드(KIETDV, 헥사펩티드)의 P-5 아미노산의 측쇄에 부착된다.

II. CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 리간드 친화성

본 발명의 이량체 PSD-95 저해제는 모두 나노몰 범위에서 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성을 가지며(실시예 5), 이것은 이들을 매우 효능 있는 저해제로 만든다(도 5 및 표 2). 본 발명의 이량체 PSD-95 저해제에 연결된 CPP는 혈액-뇌 장벽을 가로지른 저해제의 수송을 개선하기 위해 도입된다. 놀랍게도 CPP와 이량체 PSD-95 저해제의 연결은 또한 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성을 증진시킨다. 이것은 AB144 및 AB147(Ki = 4.6±0.3 및 5.1±0.4nM, 각각)에 의해서 예시되는데, 이들은 AB141(Ki = 9.3±1nM)에 비해 2배 증가된 친화성, 및 단량체 Tat-NR2B9c 펩티드(Ki = 4600±300nM)에 비해 1000배 증가된 친화성을 나타냈다. PSD-95의 PDZ1-2에 대한 이량체 PSD-95 저해제의 친화성은 치료 효과를 얻기 위해서 필요한 약물의 역치 농도를 감소시키는데 있어서 중요한 인자이며, 이것은 약물이 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그것의 표적에 도달해야 할 때 특히 중요한데, BBB는 표적에 약물 농도의 축적을 제한하는 경향이 있을 것이기 때문이다. 놀랍게도 이량체 PSD-95 저해제들의 비교는 CPP와 이량체 PSD-95 저해제의 결합의 위치 및 종류가 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 최고의 친화성을 얻는데 핵심적인 결정소임을 드러낸다. 따라서, PEG 링커의 NPEG 치환체의 질소 원자에 아미드 결합을 통한 CPP의 연결은 이황화 결합 연결 또는 말레이미드 결합과 같은 PEG 링커의 NPEG 치환체에 대한 다른 형태의 연결에 비해 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성을 2배 증진시킨다. 더욱이, PEG 링커의 NPEG 치환체의 질소 원자에 CPP의 아미드 결합 연결도 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성을 제1 또는 제2 펩티드에 대한 CPP의 아미드 결합 연결에 비해 2배를 초과하여 증진시킨다.

본 발명의 이량체 PSD-95 저해제는 PDZ1 및 PDZ2와 동시에 결합하며, 이것이 이들 도메인에 대한 높은 친화성을 설명할 수 있다. NMR 연구(실시예 7)는 1:1 결합 화학량론을 확인하며, 이량체 PSD-95 저해제의 제1 및 제2 펩티드가 모두 진짜 2가 결합 방식으로 PDZ1-2의 PDZ1 또는 PDZ2 중 어느 하나와 결합하는 것을 분명히 증명한다.

하나 이상의 표적 PDZ 도메인에 대한 펩티드 또는 펩티드 유사체의 친화성을 더 증가시키기 위해서 이량체 PSD-95 저해제의 제1 또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 위치 P-3에서 N-알킬화가 사용될 수 있으며, 이로써 상기 표적과 함께 발생하는 PPI 상호작용을 방지하는 능력이 증진된다.

III. CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 혈액 혈장 안정성

본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 사람 혈액 혈장 중에서 분해에 대해 상당히 감소된 감수성을 나타낸다. 이 현저히 개선된 안정성은 자생 Tat CPP 및 레트로인버소-D-Tat CPP를 포함하는 저해제들에 대해 관찰되며, 이것은 효과적으로 분해되지 않을 수 있었으며, 이량체 PSD-95 저해제에 프로테아제-안정한 CPP를 도입하는 효과를 예시한다(실시예 6).

IV. CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 혈액-뇌 장벽 투과성

본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 이들 펩티드 저해제의 상대적으로 큰 분자 크기에도 불구하고 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 능력을 가지는데, 이것은 포유류의 뇌에서 신경보호제로서의 이들의 치료적 기능에 중요하다. 이 특성은 Tat 또는 레트로인버소-D-Tat CPP를 함유하는 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제인 AB144 및 AB147에서 예시된다(실시예 8).

V. CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 생체내 신경보호 특성

V.i CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 뇌 국소 허혈을 지닌 대상에서 경색 부피를 감소시킨다

본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 뇌 국소 허혈을 앓는 대상에 투여되었을 때 허혈성 조직 손상을 유의하게 감소시킬 수 있다. 이들 이량체 PSD-95 저해제의 치료 효과는 성체 마우스의 뇌 국소 허혈 pMCAO 모델에서 증명되었으며, 이 경우 저해제는 손상 후 정맥내 주사되었고, 이어서 6시간 또는 48시간 후-수술 생존 기간이 이어졌으며, 이후 경색 부피가 측정되었다(실시예 9). 생체내 신경보호제로서 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 증명된 효능은 표적에 대한 높은 친화성(PSD-95의 PDZ1-2 도메인에 대한 나노몰 친화성), 혈액-뇌 장벽 투과성 및 높은 생체내 안정성의 상승작용적 효과로 인한 것이다.

대조군 연구는 뇌 국소 허혈을 가진 마우스에 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 투여에서 관찰된 치료 효과가 마우스의 조작 및 이들의 치료로 인한 이차적인 효과로 인한 것이 아님을 확인했다(실시예 9).

V.ii CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 뇌 국소 허혈을 가진 대상에서 운동 기능을 개선한다

마우스에서 pMCAO에 의해 유도된 국소 뇌 허혈은 발을 포함하는 반측성 앞다리 및 뒷다리를 제어하는 피질 뇌 영역에 영향을 미친다. pMCAO를 겪은 마우스에 본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 투여는 이들의 운동 기능을 보존한다. 치료된 마우스는 총 움켜쥠 강도를 유지하는 것으로 나타났으며(양 발), 이들의 움켜쥠 강도 분석은 오른쪽 앞발과 왼쪽 앞발 사이에 비대칭성을 보이지 않았고, 신경보호 효과와 일치하였다. 더욱이, 로타로드 성능 테스트는 치료된 마우스가 개선된 단기 학습 기술을 보였으며, 로드에서 소비한 전체 시간도 유의하게 더 길었던 것으로 나타났다(실시예 10). 본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제 치료에 의해서 부여된 이들 개선된 운동 기능 및 학습 기술은 이들 약물의 치료적 가치에 대한 추가의 증거를 제공한다.

VI. 본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 저해제 특성을 모니터링하고 평가하는 도구

VI.i. 형광 분극(FP) 분석:

아래 설명된 대로, 실시예 1은 본 발명의 PSD-95 저해제의 저해제 특성을 모니터하고 평가하기 위한 편리하며 신뢰성 있는 방식을 제공한다. FP 분석은 광범위한 펩티드 유사체들이 PDZ 도메인과의 상호작용 및 PSD-95의 텐덤 PDZ1-2에 관한 특이성과 관련하여 시험되고 비교되는 것을 허용한다. PDZ1-2는 당업자에게 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 발현된다. 발현된 PDZ1-2의 정제는 PDZ 도메인을 포함하는 발현 단백질에 친화성 태그(예를 들어, 폴리-히스티딘-태그, 글루타티온-S-트랜스페라아제-태그 또는 FLAG-태그와 같은 항체-태그)의 포함(예를 들어, 융합 단백질), 및 태그가 붙은 PDZ 도메인 단백질을 선택적 정제하는 친화성 수지의 사용에 의해서 촉진될 수 있다.

더 구체적으로, 이 분석은 이종성 경쟁 결합 분석에 기초하여, 이 경우 PDZ 도메인에 대한 주어진 (비-형광) 펩티드 유사체의 IC50으로 측정된 친화성이 형광 표지된 이량체 리간드(AB143; 도 4)의 고정된 농도의 존재하에 측정된다. 결정된 IC50 값이 Ki 값으로 전환된다(Nikolovska-Coleska et al, Anal. Biochem. 2004, 332, p. 261-273). HATU 또는 HBTU와 결합시킴으로써 5-FAM 형광단이 이량체 리간드에 부착될 수 있다. AB143은 고-친화성 프로브이며(Kd = 7.8nM), 이로써 동일한 범위의(낮은 나노몰 친화성) 친화성을 지닌 표지되지 않은 리간드의 정확한 Ki 측정을 허용한다.

VI.ii. 혈액-뇌 장벽 투과성: 혈액-뇌 장벽을 투과할 수 있고, 이로써 뇌로 진입할 수 있는 형광 표지된 상태. 화합물의 주사 후, 마우스에 파라포름알데히드를 관류시키고, 뇌를 조심해서 제거하고, 파라포름알데히드에 고정 후, 관상 절편으로 가공하여, 형광에 대해 정량한다(실시예 8).

VI.iii. pMCAO: 사람에서 보이는 것과 유사한 병리학적 상태를 유발하기 위해 의도된 실험적 뇌졸중, 즉 영구적 MCA 폐쇄(pMCAO), 일차적 목표는 기본적 세포 과정을 연구하거나, 뇌졸중 치료를 위한 새로운 치료법을 개발하는 것이다. 연구들은 마우스에서 MCA의 원위부의 직접 폐쇄가 매우 재현성 있는 기술이며 낮은 사망률과 관련된다는 것을 나타냈다. MCA는 소 개두를 통해서 전기 응고되며, 그 결과 전두 피질과 두정 피질의 라미나 I-VI 내에 단측성 피질 경색이 생긴다. pMCAO 후 얻어진 경색 부피는 매우 재현 가능하며, 이것은 이 모델을 새로운 치료 전략의 치료 효과를 조사하는데 아주 적합하게 한다.

VI.iv. 행동 테스트: 행동 테스트는 동물의 장애를 검출할 수 있을 만큼 충분히 민감해야 하며, 그 상태에 대해 알려진 것으로부터 재현될 수 있고 설명될 수 있는 결과를 제공해야 한다. 마우스에서 pMCAO에 의해 유도된 뇌졸중 병소는 발을 포함하는 반측성 앞다리 및 뒷다리를 제어하는 피질 뇌 영역에 영향을 미치며, 이로써 행동 테스트(예를 들어, 로타로드 및 움켜쥠 테스트)를 이용하여 마우스의 운동 기능을 결정할 수 있다.

VII. 본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제를 합성하고 특성화하는 방법

VII.i 펩티드 합성:

Fmoc-기반 고체상 펩티드 합성(SPPS)은 PDZ 결합 펩티드 부분과 CPP의 합성을 위한 적합한 과정을 제공하며, 이로써 본 발명의 이량체 PSD-95 저해제가 제조될 수 있고, 단량체 대조군 화합물을 제조하는데도 적합하다. Val과 같은 천연 C-말단 아미노산 잔기를 가진 펩티드는 전-로딩된 왕(Wang) 수지에서 출발하여 합성될 수 있다. C-말단 시스테인을 가진 펩티드의 경우, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지가 사용될 수 있으며, 이 경우 수지는 2시간 동안 DCM 중에서 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 사용하여 수지에 로딩되고(수지/아미노산/DIPEA 1:3:10), 메탄올로 캡핑된 후에 Fmoc 탈보호 및 연속 아미노산 잔기의 결합이 이어진다. 적합한 Fmoc-기반 SPPS 프로토콜에 대한 상세한 설명은 아래 실시예 1에 주어진다. 펩티드의 N-알킬화를 위한 방법은 WO 2010/004003에 설명된다.

VII.ii NPEG 링커의 합성:

Ns-NPEG4-2산-링커가 실시예 1에 설명된 대로 고체상 화학에 의해서 합성된다. 본 발명은 PEG-2산을 포함하는 링커를 제공하며, 상기 PEG-2산 링커의 백본에서 하나의 산소 원자가 질소 원자로 치환되어 NPEG-2산을 제공한다. 추가의 구체예에서, NPEG-2산의 질소 원자는 보호기에 연결된다. 적합한 보호기는 o-니트로벤젠술포닐(약칭: oNBS 또는 Ns), p-니트로벤젠술포닐(pNBS), 2,4-디니트로벤젠술포닐(dNBS)을 포함한다. 또한, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐(Ddz), 2-니트로페닐술페닐(Nps), 2-(4-비페닐)이소프로폭시카보닐(Bpoc), 트리페닐메틸(트리틸, Trt), 벤질옥시카보닐(Z), 9-플루오렌일메톡시카보닐(Fmoc), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)-3-에틸(Dde), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸(ivDde), 2,2,2-트리클로로에틸옥시카보닐(Troc), 알릴옥시카보닐(Alloc), p-니트로벤질옥시카보닐(pNZ), o-니트로벤질옥시카보닐(oNZ) 및 6-니트로베라트릴옥시카보닐(NVOC), 아지도메톡시카보닐(Azoc), tert-부틸옥시카보닐(Boc), 2-트리메틸실릴에틸 카바메이트(Teoc) 및 2-클로로벤질옥시카보닐(Cl-Z)과 같은 다른 N-보호기들도 사용될 수 있다.

PEG 및 NPEG-2산 중에 에틸렌 글리콜 부분의 수(n)는 n1-28 사이일 수 있거나, 또는 링커는 n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 에틸렌 글리콜 부분의 길이를 가질 수 있다.

VII.iii 이량체 리간드의 합성: 이량체 리간드는 HBTU 및 HATU와 같은 커플링 시약으로 Ns-NPEG4-2산-링커 또는 PEG4-2산-링커를 인시튜 활성화하고, 이어서 수지-결합된 펩티드 리간드의 N-말단 아미노 기와 함께 인큐베이션함으로써 생산될 수 있다. 이 과정을 사용하여 이량체화 과정은 1-단계 반응으로 제한된다.

VII.iv 화학적 분석: 화합물은 ESI-LC/MS, 분석적 HPLC, 및 고 분해능 질량분광기에 의해서 분석되며, 이들은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하고, 실시예 1에 예시된다.

VIII. 허혈성 뇌졸중 또는 외상성 손상과 같은 흥분독성-관련 장애의 치료적 치료를 위한 본 발명의 제1 또는 제2 구체예에 따른 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제

뉴론성 시냅스에서 NMDA 수용체 서브유닛의 C-말단은 이들을 하류 신경독성 신호화 분자(예를 들어, nNOS)에 연결하는 PSD-95의 PDZ 도메인과 상호작용하여 NO 생산 및 흥분독성을 초래한다. 본 발명은 NMDA 수용체 이온 전류 및 NMDA 수용체의 칼슘 신호화 기능을 손상시키지 않고 세포에서 NMDA 수용체와 nNOS 상호작용을 차단할 수 있는 저해제를 제공한다. 따라서, 본 발명의 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 하나 이상의 세포 또는 조직의 신경보호제로서 작용하여 척수 손상, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상, 중추신경계(CNS)의 허혈성 손상, 뇌전증, CNS의 신경변성 질환을 포함하는 흥분독성 장애를 치료하기 위한 특정한 전략을 제공한다.

상기 장애 및 질환의 위험이 있거나 현재 앓고 있는 대상의 치료적 치료는 장애 또는 질환 개시의 위험을 감소시키기 위한 예방적 치료 또는 장애 또는 질환 개시 후의 치료적 치료 중 어느 하나로 제공될 수 있다. 대상은 포유류 또는 사람 환자일 수 있다.

IX. 통증 치료의 치료적 치료를 위한 이량체 PSD-95 저해제

놀랍게도 본 발명의 이량체 PSD-95 저해제는 대상(포유류 또는 사람 환자)에서 통증의 감소에 효과적이며, 또한 이들 저해제는 대상의 인지 및 운동 기능에 어떤 자발적인 해로운 부작용을 야기하지 않기 때문에 치료적 치료에 사용될 수 있는 것으로 나타난다. 치료될 통증은 만성 통증일 수 있고, 이것은 만성 신경병증 통증 또는 만성 염증성 통증일 수 있다. 신경병증 통증은 외상성 손상, 수술 또는 당뇨병이나 자가면역 장애와 같은 질환의 결과로서 말초신경계 또는 중추신경계의 손상에 의해서 유도될 수 있다. 통증이 지속될 경우 이 상태가 만성 신경병증 통증이다. 만성 염증성 통증은 신경 손상 후의 염증에 의해서 유도될 수 있으며, 물론 이물질에 의해 유도된 염증에 의해서 개시되기도 하며, 이 경우 면역 세포에 의해서 방출된 매개제가 통증 경로의 민감화, 즉 척수에 위치된 감각 뉴런의 '와인드업'을 야기한다. 따라서, 통증-완화 효과를 갖기 위해서 효과적인 진통제는 척수 조직에 도달하여 그것의 표적을 찾을 수 있어야 하는데, 이 경우에는 PSD-95이다. 이로써, 화합물은 혈액-뇌 장벽 및/또는 혈액-척수 장벽을 통과하여 척수 조직에 도달할 수 있어야 한다. 만성 통증을 치료하기 위한 적합한 이량체 PSD-95 저해제는 링커에 의해서 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체에 연결된 제1 펩티드 또는 펩티드 유사체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하고, Y는 E, Q 및 A 중에서 선택되거나, 또는 선택된 잔기의 유사체이며, X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 중에서 선택되거나, 또는 선택된 잔기의 유사체이다. 적합한 이량체 PSD-95의 예들은 AB125, 및 구조 PEG6(IESDV)2(WO 2010/004003의 화합물 77에 해당)를 갖는 AB122와 구조 PEG4(IESDV)2(WO 2010/004003의 화합물 78에 해당)를 갖는 AB123과 AB141[NPEG 링커를 구비]을 포함한다. 놀랍게도 이들 화합물은 친수성이며 커다란 화학 구조와 CPP에 부착되지 않은 상태임에도 불구하고 척수에 있는 이들의 표적인 PSD-95에 도달할 수 있다(실시예 12) - 이들은 정상적으로는 화합물이 혈액-뇌 장벽 및/또는 혈액-척수 장벽을 통과하는 것을 방지하며, 따라서 화합물이 CNS로 진입하는 것을 방지하는 특성이기 때문이다. 추가로, 이 저해제는 제3 펩티드를 더 포함할 수 있으며, 상기 제3 펩티드는 저해제에 연결된 세포 투과 특성을 갖는 CPP로서, 본 발명의 저해제를 제공한다.

X. 만성 통증의 치료적 치료를 위한 이량체 PSD-95 저해제의 생체내 진통 효과

NMDA 수용체 길항작용은 만성 통증의 사람 및 동물 모델에서 항-통각 작용을 나타내지만, 인지 및 운동 기능의 중대한 교란과 관련된다.

선택적 NMDA 수용체 길항제인 MK-801과 비교하여 기계적 통각과민증에 대한 AB125 및 AB144의 유해한 부작용의 부재가 만성 염증성 통증의 완전 프레운드 애쥬번트(CFA) 모델에서 증명된다. 이량체 PSD-95 저해제의 부작용의 감소가 장기 기억의 식품 선호도의 사회적 전달(STFP) 테스트와 변형된 Y-미로 주의력 테스트 및 운동 성능의 로타로드 테스트에서 AB125와 MK-801의 효과를 비교함으로써 증명된다.

CFA와 동시에 투여했을 때, MK-801, AB125 및 AB144는 모두 치료 1시간 및 24시간 후에 CFA-유도된 기계적 통각과민증의 발생을 방지했다(도 17, 18, 23; 실시예 11). 또한, AB125는 CFA 처치 24시간 후에 투여되었을 때 CFA-유도된 통각과민증을 역전시키는 것으로 판명되었으며, 이 효과는 적어도 3일 동안 지속되었다(도 19; 실시예 11). 통각과민증을 감소시키는 용량에서 MK-801은 변형된 Y-미로 및 STFP 테스트에서 인지 결손을 유도했고, 로타로드 테스트에서 운동 결손을 유도했다. 놀랍게도 더욱 고 용량의 AB125는 이들 테스트에서 부작용이 전혀 없었다(도 20-22; 실시예 11). 이 데이터는 CPP가 함께이든(AB125) 아니든(AB144) 이량체 PSD-95 저해제는 인지 및 운동 기능에 대한 NMDA 수용체 길항작용-관련 부작용을 피하면서 만성 염증성 통증의 발생을 방지하고 저해하는데 효과적임을 나타낸다.

XI. PSD-95 저해제를 포함하는 제약 조성물의 제조

본 발명의 이량체 PSD-95 저해제 또는 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 제약 조성물로의 조제는 본 분야에 주지되어 있고, Gennaro (ed.), 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott, Williams & Wilkins (2000); 및 Ansel et al, 1999, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed, Lippincott Williams & Wilkins Publishers에 더 설명된다.

이러한 조성물은 전형적으로 제약학적으로 승인된 담체 중에 본 발명의 PSD-95 저해제를 약 0.1 내지 90중량%(예를 들어, 약 1 내지 20% 또는 약 1 내지 10%)를 함유한다.

다양한 액체 및 분말 조제물이 치료될 포유류의 폐로의 흡입을 위해 종래의 방법에 의해서 제조될 수 있다.

경구 투여에 적합한 조성물은 본 발명의 이량체 PSD-95 저해제 또는 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제를 적합한 담체와 조합함으로써 치료될 대상에 의한 경구 섭추를 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액으로서 조제될 수 있다. 고체 경구/직장 조제물의 경우, 적합한 부형제는 필러, 예를 들어 당류(예를 들어, 락토오스, 수크로오스, 만니톨 및 소르비톨); 셀룰로오스 제조물(예를 들어, 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 젤라틴, 검 트래거캔스, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈); 과립화제; 및 결합제를 포함한다. 선택적으로, 가교 폴리비닐피롤리딘, 아가, 또는 알긴산 또는 나트륨 알기네이트의 염과 같은 붕해제가 포함될 수 있다. 고체 조제물은 장용 코팅을 더 포함할 수 있다.

액체 경구 조제물의 경우, 적합한 부형제 또는 희석제는 물, 글리콜, 오일 및 알코올을 포함한다.

조성물의 주사형 조제물은 식물성 오일, 디메틸아세타미드, 디메틸포름아미드, 에틸락테이트, 에틸카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 함유할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 화합물의 수용성 형태가 드립법에 의해서 투여될 수 있으며, 이로써 활성제(CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제)와 생리학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 제약 조제물이 주입된다. 생리학적으로 허용되는 부형제는, 예를 들어 5% 덱스트로오스, 0.9% 식염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제조물, 예를 들어 화합물의 적합한 수용성 염 형태의 멸균 조제물이 주사용수, 0.9% 식염수 또는 5% 글루코오스 용액과 같은 제약 부형제에 용해되어 투여될 수 있다. 화합물의 적합한 불용성 형태가 제조될 수 있고, 수성 베이스 또는 제약학적으로 허용되는 오일 베이스, 예를 들어 장쇄 지방산의 에스테르(예를 들어, 에틸올레에이트) 중의 현탁액으로서 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 이량체 PSD-95 저해제 또는 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 장기 작용 데포 제조물로서 조제될 수 있다. 예를 들어, 저해제는 적합한 중합체 또는 소수성 재료(예를 들어, 용인된 오일의 에멀젼) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 염과 같은 난용성 유도체로서 조제될 수 있다.

또한, 이량체 PSD-95 저해제 또는 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제를 송달하기 위하여 리포솜 및 에멀젼이 사용될 수 있다. 추가로, 저해제는 저해제를 포함하는 고체 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출 시스템을 통해서 송달될 수 있다.

각 제약 조제물에서 치료제의 최적 퍼센트는 조제물 자체 및 특정 병증에서 바람직한 치료 효과 및 관련된 치료 섭생에 따라서 변한다.

XII. PSD-95 저해제를 포함하는 제약 조성물의 투여 방식

대상 또는 환자에게 조성물을 투여하기 위하여 의약 분야의 종사자들에게 알려진 종래의 방법이 사용될 수 있으며, 키트의 형태로 사용하도록 공급될 수 있다. 이들은, 제한은 아니지만 송달을 위한 표준 방법/수단을 사용함에 의한, 피하, 폐내, 점막내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 설하, 척추관내, 또는 근육내 경로를 포함한다(주사, 카테테르, 키트가 주사 장치, 주사용 데포를 송달하기 위한 장치 또는 카테테르를 포함할 수 있는 경우에 의한 것을 포함한다). 또한, 제약 조제물은 1-, 3- 또는 6-개월 데포 주사형 또는 생분해성 재료 및 방법을 사용하는 것과 같이, 주사형 데포 투여 경로를 통해서 환자에게 투여될 수 있다.

투여 경로와 무관하게, 본 발명의 이량체 PSD-95 저해제 또는 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 전형적으로 약 0.01mg/환자 체중 kg 내지 약 120mg/환자 체중 kg의 일일 투약량으로 투여된다(예를 들어, 1mg/kg 내지 20mg/kg). 제약 조제물은 원한다면 원하는 총 일일 용량을 달성하기 위해 일당 다수 용량으로 투여될 수 있다.

환자에게 본 발명의 제약 조제물(들)을 투여하기 위하여 의약 분야의 종사자들에게 알려진 종래의 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제 또는 치료적 개입과 조합되어 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 본 발명의 복수의 제제를 더 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1 - PSD -95의 이량체 저해제의 합성

1.1 Ns-NPEG4-2산-링커 A-C의 합성(반응도 1 - 도 16)

Ns-NPEG4-2산-링커 A(3; 반응도 1)의 합성을 위해, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(3mmol, 1.90g)를 DMF로 세척, 팽윤시켰다(20분). DMF(8mL) 중의 1(2mmol, 800mg)을 배액된 수지와 DIPEA(10mmol, 1.75mL)에 차례로 첨가함으로써 Fmoc-NH-PEG2-CH2CH2COOH(1, 반응도 1; Biomatrik Inc., Jiaxing, China)를 수지에 로딩했다. 60분 쉐이킹 후, 메탄올(1mL, 25mmol)을 첨가하고, 5분 더 쉐이킹했다. 로딩된 수지를 배액하여 DMF로 충분히 세척하고(10-15회 흘려 씻음, 각각 10mL), Fmoc 기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 5분간 탈보호하고, DMF로 세척하고, 다시 15분간 탈보호한 후, DMF와 THF로 세척했다. 수지를 DIPEA(12mmol, 2.1mL)와 THF(8mL)로 15분간 팽윤시키고, 수지를 부드럽게 교반하면서 DCM(5mL) 중의 오르토-니트로벤젠술포닐 클로라이드(NsCl, 8mmol, 1.78g)를 서서히 첨가했다. 4시간 후, 수지를 배액하고 THF, MeOH, DCM 및 THF로 연속해서 세척했다. 수지-부착된 자유 아미노 기를 알코올 HO-PEG2-CH2CH2COOtBu(2, Scheme 1; Biomatrik Inc., Jiaxing, China)로 알킬화했는데, 반응 용기를 소기하고 질소 벌룬을 첨가하는 것에서 시작한다. 수지(1eq., 2mmol)를 THF 중의 트리페닐포스핀(PPh3, 10mmol, 2625mg)과 THF(5mL) 중의 2(10mmol, 2.34g)로 처리했다. 디이소프로필아조디카복실레이트(DIAD)(10mmol, 2.02g, 1.97mL)를 적가하고, 벌룬을 제거한 후 1시간 쉐이킹했다. 이 수지를 THF와 DCM으로 충분히 세척하고, 진공에서 건조시키고, TFA/트리이소프로필실란/H2O (90/5/5, 20mL)으로 2.5시간 동안 처리했다. TFA-혼합물을 수집하고 수지를 TFA와 DCM으로 세척한 후, 조합된 TFA/DCM 분획을 증발시키고, 에테르와 함께 공-증발시켰다(2×30mL). 결과의 물질을 물/MeCN(75/25, 100mL)에 용해하고 동결건조시켜 오랜지색 오일로서 Ns-NPEG4-2산-링커 A(3, 반응도 1)를 얻었으며, 이것을 이량체 NPEG4 리간드의 합성에 직접 사용했다. 수율: 80%. m/z (ESI) 540.1(22%), 523.1 (M++H, 100), 505.1(11), 433.0(7.3), 365.2(7.4).

또한, Ns-NPEG4-2산-링커 A의 합성에 사용된 과정을 사용하여 Ns-NPEG4-2산-링커 B와 Ns-NPEG4-2산-링커 C(6 및 9, 각각; 반응도 1)를 합성했다. Ns-NPEG4-2산-링커 B(6)의 제조에는 빌딩 블록 Fmoc-NH-PEG3-CH2CH2COOH(4; Biomatrik Inc., Jiaxing, China) 및 HO-PEG1-CH2CH2COOtBu(5; Biomatrik Inc., Jiaxing, China)를 사용했다(반응도 1). 수율: 54%. m/z(ESI) 596.2(22%), 523.2(M++H, 100), 505.1 (15), 433.1(8).

Ns-NPEG4-2산-링커 C(9)를 제조하기 위해서 빌딩 블록 Fmoc-beta-알라닌(7; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) 및 HO-PEG4-CH2CH2COOtBu(8; IRIS Biotech, Marktredwitz, Germany)를 사용했다(반응도 1). 수율: 45%. m/z(ESI) 596.2(51%), 523.1(M++H, 100), 506.1(14), 433.1(55).

1.2 PSD-95의 이량체 저해제의 펩티드 부분의 합성

전-로딩된 Fmoc-Val-왕-수지(0.6-0-7mmol/g, 100-200 메쉬), 커플링을 위한 HBTU/DIPEA, 및 용매로서 무수 DMF를 사용하여 Fmoc-기반 고체상 펩티드 화학에 의해서 펩티드(예를 들어, IETDV 또는 IETAV)를 합성했다. 각 커플링은 수지/Fmoc-아미노산/HBTU/DIPEA의 1/4/3.9/8 화학량론으로 40분간 수행했으며, 닌히드린 테스트에 의해서 정성 평가되었다. Fmoc-탈보호를 DMF 중의 20% 피페리딘 중에서 5분간 수행한 후, DMF 세척하고, 두 번째 피페리딘/DMF 처리를 15분간 수행했다.

1.3 NPEG4-기반 이량체 리간드 AB141, AB144 및 AB147의 합성(도 2 및 3)

Ns-NPEG4-2산-링커 A(3, 반응도 1; 0.1eq., 0.025mmol)를 HBTU(0.2eq, 0.05 mmol)와 DIPEA (0.4eq, 0.1mmol)로 전-활성화해서 총 부피 4mL DMF 중에서 Fmoc-탈보호된 왕-수지-결합된 IETDV(1eq, 0.25mmol)에 첨가했다. 반응물을 45분 쉐이킹하고 5회 반복했다. DMF(2mL) 중의 DBU(0.5mmol)를 첨가하고, 이어서 DMF(2mL) 중의 메르캅토에탄올(0.5mmol)을 첨가해서 Ns 기를 제거했다. 반응물을 30분 쉐이킹하고 DNF로 세척했다. 메르캅토에탄올/DBU 처리를 1회 반복하고 수지를 DMF, DCM, MeOH 및 DCM로 연속해서 세척하여 수지-결합된 AB141을 제공했다. AB144 및 AB147의 경우, CPP의 제1 아미노산(L- 또는 D-Arg, 각각)을 Fmoc-Arg(Pbf)-OH의 6회 연속 커플링에 의해서 질소에 결합시켰다. 각 커플링의 경우, Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.5 mmol)를 DMF 중의 HATU(2mL, 0.244M)와 콜리딘(132μL)에 의해서 활성화한 후, 그것을 배액된 수지에 첨가했다. 40분 쉐이킹하고 DMF로 세척한 후, 커플링 및 DMF 세척을 5회 반복하고, 이어서 DMF로 충분히 세척했다. Fmoc를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 제거하고, 나머지 Tat- 또는 레트로인버소-D-Tat 서열을 펩티드 합성에 대해 설명된 대로 합성하고, 최종적으로 Fmoc 기를 제거했다.

1.4 NPEG4-기반 이량체 리간드 AB144-B 및 AB144-C의 합성(도 15)

AB144_B 및 AB144_C를 Ns-NPEG4-2산-링커 A 대신 Ns-NPEG4-2산-링커 B와 Ns-NPEG4-2산-링커 C를 각각 사용한 것을 제외하고 AB144에 대해 설명된 대로 합성했다.

1.5 NPEG4-기반 이량체 리간드 AB144-D 및 AB144-E의 합성(도 15)

AB144_D 및 AB144_E의 합성을 AB144에 대해 설명된 대로 수지-결합된 AB141이 제공되는 지점까지 수행했다. Fmoc-Gly-OH를 펩티드 합성 절 1.2에서 상기 설명된 대로 HBTU/DIPEA와의 6회 연속 커플링에 의해서 NPEG4-링커 상의 질소 원자에 결합시켰다. 피페리딘/DMF에 의한 Fmoc 제거 후, N-말레오일-β-알라닌(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)을 수지의 반에 결합시켰고(HBTU/DIPEA), 이어서 진공에서 건조시키고, 절단-믹스 TFA/티오아니솔/H2O/아니솔 90/5/3/2(v/v/v/v)로 처리하여 조 말레이미드-이량체 중간체를 제공했다. 병행하여, 12-mer 펩티드 Tat-Cys(서열: YGRKKRRQRRRC)를 Fmoc-Cys(Trt)-OH로 로딩된 2-클로로트리틸 클로라이드 수지에서 시작하여 표준 Fmoc-기반 펩티드 합성에 의해 제조했고, Fmoc-Cys(Trt)-OH는 나중에 수지로부터 절단된다. 다음에, 실온에서 10mL 아세토니트릴과 50mL TBS 버퍼(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.4, 탈기된) 중에서 0.05mmol 조 말레이미드-이량체 중간체를 0.06mmol 조 Tat-Cys와 혼합함으로써 AB144_D를 합성했으며, pH를 NaOH(0.2M)로 7로 조정해서 반응 혼합물을 90분간 인큐베이션했다. 다음에, 혼합물을 동결 건조시키고, HPLC 정제에 의해서 순수한 AB144_D를 제공했다.

AB144_E의 경우, AB144_D에 대한 N-말레오일-β-알라닌 대신에(상기 참조), Boc-Cys(Npys)-OH를 수지-결합된 이량체 리간드의 글리신 잔기에 HBTU/DIPEA를 가지고 결합시켰다. 수지를 진공에서 건조시키고, 절단 믹스 TFA/티오아니솔/H2O/아니솔 90/5/3/2(v/v/v/v)로 처리하여 조 Cys(Npys)-이량체 중간체를 제공했다. 이 중간체(0.026mmol)를 50mL Tris-HCl/EDTA 버퍼(0.5M Tris-HCl, 5mM EDTA, pH 7.5, 탈기된) 중에서 Tat-Cys(0.030mmol)와 실온에서 60분간 반응시켰다. 혼합물을 동결 건조시키고, HPLC 정제에 의해서 순수한 AB144_E를 제공했다.

1.6 PEG4-기반 이량체 리간드 AB144-H and AB144-I의 합성

'펩티드 합성(일반)'절에 설명된 대로, 수지-결합된 펩티드 서열 K(Dde)ETDV 및 K(Dde)IETDV를 만드는 것에서 시작하여 화합물 AB144_H 및 AB144_I를 전-로딩된 Val-왕-수지로부터 합성했다(E, T, D의 측쇄가 tert-부틸 기로 보호되고 화합물은 수지-결합된다; K는 Dde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸로 보호된다). 이미 설명된 대로(WO 2010/004003), 수지-상 이량체화 과정을 PEG4-2산 링커(IRIS Biotech, Marktredwitz, Germany)를 가지고 수행했다. 다음에, 신선하게 제조된 히드라진 일수화물(DMF 중 2%)로 수지를 5분간 처리하고, 이어서 DMF로 세척하고, 다시 10분간 히드라진 처리를 함으로써 Dde를 제거했다. 수지를 DMF, DMF 중의 10% DIPEA(5×2분), DCM 및 DMF로 연속해서 충분히 세척했다. HATU/콜리딘과 피페리딘/DMF에 의한 Fmoc의 표준 제거를 사용하여 리신 측쇄의 유리된 아미노 기로부터 Tat 서열을 합성했다.

실시예 2 - PSD -95의 이량체 저해제의 표지된 유사체의 합성

2.1 형광단-표지된 유사체의 합성(AB143, AB145, AB148, MS23)

수지에 결합된 상태에서 5-FAM(5-카복시플루오레세인; Anaspec, San Jose, CA, USA)을 최종의 Fmoc-탈보호된 AB144, AB147 또는 Tat-NR2B9c의 N-말단 아미노 기에 결합시켜서 형광 리간드를 제조했으며, 이로써 각각 AB145, AB148 및 MS23을 생성했다. 마찬가지로, 5-FAM을 Ns-탈보호된 수지-결합된 AB141에 결합시켜 AB143을 생산했다. 5-FAM은 0.07mmol 규모(NPEG-링커의 몰)로 총 2mL DMF 중에서 N-부위-수지/5-FAM/HATU/콜리딘의 1/2/2/3 비율로 결합되었다. AB145, AB148 또는MS23의 경우, 커플링 시간은 6시간이었다. AB143의 경우, 5-FAM은 각각 6시간 및 16시간의 2회 연속 커플링에 의해 결합되었다.

2.2 PSD-95의 15N, 13C-표지된 이량체 리간드의 합성

[15N, 13C]-PEG4(IETAV)2(AB140)를 충분히 15N, 13C-표지된 아미노산 원자를 함유한 Fmoc-보호 아미노산을 사용하여 합성했다(Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, MA, USA). Thr 및 Glu를 위한 아미노산 빌딩 블록은 tert-부틸 기로 보호된 측쇄였다. 표지된 Fmoc-Val-OH(0.125mmol, 43mg)를 DMF(1.5mL)에 용해하고, 이것을 DMF(2mL)에서 20분간 팽윤되어 배액된 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(0.1875mmol, 119mg)에 로딩했다. DIPEA(0.625mmol, 109μL)를 첨가하고, 60분간 쉐이킹을 계속했다. MeOH(100μL)를 첨가하고, 15분간 쉐이킹을 계속하고, 수지를 DMF로 세척했다. Fmoc를 피페리딘/DMF로 제거하고, 표지된 IETAV를 DMF(1mL) 중에서 40분간 커플링 조건 및 수지/Fmoc-아미노산/HATU/콜리딘의 1/2/2/3의 화학량론을 사용하여 더 합성했다. 최종 Fmoc-제거 후, 수지를 DMF와 DCM으로 세척하고, 진공에서 건조시키고, 이것을 사용하여 수지-상 이량체화 과정에 의해서 (표지되지 않은) 이미 설명된 PEG4-2산 링커(IRIS Biotech, Marktredwitz, Germany)를 가지고 AB140을 제조했다(WO 2010/004003).

실시예 3 - PSD -95의 이량체 PSD -95 저해제 및 이들의 표지된 유도체의 정제 및 특성화

수지-결합된 생성물을 2시간 동안(다른 특이사항이 언급되지 않는다면) 트리플루오로아세트산(TFA)/트리이소프로필실란/H2O(90/5/5)로 처리하고, 진공에서 증발시고, 냉 에테르로 침전시키고, 동결건조하고, 예비 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 정제함으로써 이량체 PSD-95 저해제와 이들의 유도체를 포함하는 합성된 화합물들을 TFA 염으로서 얻었다. 화합물을 분석용 HPLC와 질량분광기에 의해서 특성화했다(표 1).

생체내 실험의 경우, 화합물의 TFA 염을 얼음 냉각된 수성 HCl(50mM; TFA에 비해 3배 몰 과량의 HCl)과 함께 20분 인큐베이션하고, 이어서 동결건조시켜서 화합물을 HCl 염으로 준비했다.

3.1 예비 RP-HPLC:

C18 역상 칼럼(Zorbax 300 SB-C18, 21.2×250mm)을 구비한 Agilent 1200 시스템에서 선형 구배의 H2O/MeCN/TFA(A: 95/5/0.1 및 B: 5/95/0.1)와 20mL/min의 유속을 사용하여 화합물을 정제했다.

3.2 ESI-LC/MS:

C18 역상 칼럼(Zorbax Eclipse XBD-C18, 4.6×50mm), 증발식 광 산란 검출기(ELSD, Sedere Sedex 85) 및 다이오드-어레이 검출기(UV)를 구비한 Agilent 1200 HPLC 시스템(ESI-HPLC-MS)에 연결된 전자분무이온화(ESI)를 사용하는 Agilent 6410 트리플 쿼드러폴 질량분광계 기기에서, 선형 구배의 H2O/MeCN/포름산(A: 95/5/0.1 및 B: 5/95/0.086) 및 1mL/min의 유속을 사용하여 질량 스펙트럼을 얻었다.

3.3 분석용 RP-HPLC:

선형 구배의 H2O/MeCN/TFA(A: 95/5/0.1 및 B: 5/95/0.1)와 1mL/min의 유속을 사용하여 C18 역상 칼럼(Zorbax 300 SB-C18 칼럼, 4.6×150mm)을 구비한 Agilent 1100 시스템에 의해서 화합물 순도를 결정했다.

3.4 고 분해능 질량 스펙트럼(HRMS):

전자분무이온화(ESI) 및 Micromass Q-Tof 2 기기를 이용하여 AB144 및 AB147에 대해서 HRMS를 얻었다.

실시예 4 - PSD -95의 PDZ1 -2의 발현 및 정제

PSD-95 PDZ1-2 텐덤(엑손 4b가 없는 사람 전장 PSD95a에서 잔기 61-249에 해당하는)을 코딩하는 cDNA를 반전 PCR에 의해서 증폭하고 변형된 His-태그 pRSET 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝했다. 암호화된 PDZ1-2 펩티드는 서열 MHHHHHPRGS을 더 포함했으며, 이것은 정제를 위한 태그로서 사용되었고(His-태그), DNA 코딩 서열 및 암호화된 단백질은 다음과 같이 지정된다: HIS-PDZ1-2 단백질[SEQ ID NO: 2]을 암호화하는 HIS-PDZ1-2 DNA[SEQ ID NO: 1]. 컴페턴트 E. coli 박테리아(BL21 - DE3, pLysS)를 PDZ1-2 발현 구성물로 형질변환하여 37℃에서 암피실린(100mg/mL)과 클로람페니콜(35mg/mL)을 함유하는 아가 플레이트에서 하룻밤 성장시켰다. 콜로니를 선별하고, 이것을 사용하여 박테리아 배양물(50mg/mL 암피실린이 첨가된 LB 배지)을 접종했다. 배양물의 A600이 0.45에 도달할 때까지 이들을 쉐이킹하면서 37℃에서 인큐베이션했고, 이 지점에서 1mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드를 첨가했다. 유도된 배양물을 30℃에서 하룻밤 인큐베이션했다(PDZ1-2). 4℃에서 10분간 10,000g에서 스피닝하여 세포를 수거하고, 세포용해 버퍼(50mM Tris/HCL pH 7.5, 1mM PMSF, 25μg/ml DNAse, 40mM Mg2SO4)에 재현탁시켰다. 26KPsi에서 세포 파괴 장치를 사용하여 세포를 파괴했다. 세포 용해물을 1시간 동안 35,000g에서 스핀 침전시키고, 상청액을 0.45μm 및 0.22μm 필터로 여과했다. 발현된 PDZ1-2 펩티드의 정제를 먼저 Tris-버퍼(Tris/HCl 버퍼 50mM, pH 7.5)로 평형화된 니켈(II)-충전된 칼럼(HisTrapTM HP, GE Healthcare, UK)으로, 이어서 겔 여과에 의해서 수행했다. 겔 여과의 경우, PDZ1-2 샘플을 Tris-버퍼(20mM Tris/HCl, pH 7.5)로 평형화된 SuperdexTM 75 HR 10/30 칼럼(GE Healthcare, UK)에 0.5mL/min의 일정한 유속으로 로딩했다. 적절한 분획을 표준 은 염색 프로토콜에 의해서 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 분석했다. 최종 정제분을 전기분무이온화 액체 크로마토그래피-질량분광기(ESI-LC/MS)에 의해서 분석하여 정확한 분자량을 획득했고, 이로써 PDZ1-2 도메인의 존재를 검증했다. 아미노산 분석(Alphalyse, Odense, Denmark)에 의해 몰 소광 계수를 찾아서 단백질 농도를 측정하는데 사용했다. NMR 연구에서는 M-9 배지에서 박테리아 배양물을 성장시키고, 이어서 상기 설명된 대로 정제하여 균일하게 표지된 [15N] PDZ1-2를 발현시켰다.

실시예 5 - PSD -95의 PDZ 도메인에 대한 증진된 친화성의 이량체 PSD -95 저해제

5.1 PSD-95의 PDZ 도메인에 대한 리간드(이량체 PSD-95 저해제)의 친화성을 결정하기 위한 형광 분극(FP) 분석

합성된 리간드(예를 들어, 이량체 저해제)와 PSD-95의 PDZ1-2 사이의 친화성 상수(Ki 값)를 제공하기 위해서 형광 분극 원리에 기초하여 시험관내 친화성 측정 분석을 개발했다. 먼저, 5-FAM-표지된 NPEG4(IETAV)2 프로브, 지정된 AB143(도 4) 및 PDZ1-2 사이의 친화성을 포화 결합 실험에 의해서 확립했는데, 이 경우 PDZ1-2의 농도를 증가시키면서 고정된 농도(0.5nM)의 프로브에 첨가했다. 검은색의 평평한 바닥의 384-웰 플레이트(Corning Life Sciences, NY, USA)에서 TBS 버퍼(150mM NaCl, 10mM Tris, pH 7.4) 중에서 분석을 수행했다. 실온에서 10분 인큐베이션 후, Safire2 플레이트 리더(Tecan, Mannedorf, Switzerland)에서 470/525nm의 여기/방출 값에서 샘플의 형광 분극을 측정했다. 식 Y = Bmax×X/(Kd+X)에 따라 형광 분극 값을 피팅했으며, 이때 Bmax는 최대 형광 분극 값이고, X는 PDZ1-2 농도이고, Y는 형광 분극 값이다. Kd는 반 포화된 PDZ1-2 농도와 동일한 것으로서 포화 곡선으로부터 직접 유도되었으며, 7.8±0.11nM인 것으로 판명되었는데, 이것은 그것의 상응하는 비-형광('콜드') 리간드인 AB141(Ki = 9.3±1nM)에 대해 판명된 Ki 값과 잘 일치한다. 비-형광 화합물과 PDZ1-2 사이의 친화성을 이종성 경쟁에 의해서 결정했으며, 이 경우 상기 설명된 것과 동일한 TBS 버퍼 및 조건에서 화합물의 농도를 증가시키면서 고정된 농도의 프로브(0.5nM)과 PDZ1-2(7.8nM)에 첨가했다. 식 Y = 하단 + (상단 - 하단)/[1 + (10(X - LogIC50 * 사면))]에 따라 FP 값을 피팅했으며, 이때 X는 펩티드 농도의 로그값이고, 결과의 IC50 값을 경쟁적 저해 상수, Ki 값으로 전환했다. 기록된 모든 값은 적어도 3회의 개별 실험의 평균이다. 리간드 스톡은 물에서 제조했고, 농도는 아미노산 분석에 의해서 검증했다.

5.2 본 발명의 이량체 PSD-95 저해제는 PDZ1-2 도메인에 대해 증진된 친화성을 가진다

FP 분석(5.1 참조)을 사용하여 PSD-95의 PDZ1-2 도메인에 대한 다양한 이량체 PSD-95 저해제의 친화성을 결정했다. PEG4 링커가 NPEG4 링커로 치환된다는 점에서 이량체 저해제 AB141은 AB125와 상이하다. 이 차이는 PDZ1-2에 대한 이량체 저해제의 친화성에 대해 유의한 효과를 갖지 않는데, 둘 다 9.5nM 근처의 Ki 값을 나타냈기 때문이다(도 5). 이량체 저해제 AB141에 CPP 첨가는 CPP가 NPEG4 링커에 부착된 경우 PDZ1-2에 대한 친화성에 놀라운 증가를 가져온다. AB144(CPP가 Tat이다)와 AB147(CPP가 레트로인버소-D-Tat이다)은 각각 Ki 값이 4.6±0.3nM 및 5.1±0.4nM로서 AB141에 비해 2배 증가를 보였고(도 5), 단량체 Tat-NR2B9c 펩티드(Ki = 4600±300nM, PSD-95의 PDZ1-2에 대해; 도 5)에 비해서는 1000배 증가된 친화성을 나타냈다.

5.3 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 PDZ1-2 도메인에 대해 증진된 친화성을 가진다

NPEG 링커 질소 원자에 대한 Tat-부착 지점이 비대칭인 AB144 유사체(실시예 1 및 도 15 참조) AB144_B 및 AB144_C('에틸렌 글리콜 부분' 중 어느 하나 또는 둘이 링커의 중심으로부터 떨어져 있다)는 AB144와 동일한 범위에서, 즉 낮은 나노몰 범위에서 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 친화성을 보였다(표 2). AB144_C는 AB144와 비교하여 2배 높은 친화성을 나타내지만, 두 화합물 모두 PDZ1-2 도메인에 대해 매우 효능 있는 리간드이다.

AB144 유사체(실시예 1 및 도 15 참조) AB144_D 및 AB144_E는 Tat가 NPEG 링커에 대칭 부착되지만, AB144_D의 경우에 Tat는 말레이미드 결합에 의해서 부착되고, AB144_E는 Tat가 이황화(S-S) 결합을 통해서 부착된다. AB144_D와 AB144_E는 AB144보다 약 2-3배 낮은 친화성을 나타냈지만(표 2), 이들의 Ki 값은 여전히 낮은 나노몰 범위였으며, 따라서 화합물들은 여전히 PSD-95의 PDZ1-2에 대한 매우 강한 결합제이다.

화합물 AB144_H 및 AB144_I(실시예 1 및 도 15 참조)에서는 Tat 서열이 NPEG 링커를 사용하는 대신 PEG-연결된 이량체 펩티드 중 하나의 아미노산 측쇄에 부착된다. AB144_H에서 Tat는 P-4 아미노산으로부터 연장되며, 이 경우 P-4 아미노산은 리신이다. 정상적으로는 이소류신(I)이 이 위치에서 발견되지만(AB144), 여기에 리신이 사용됨으로써 기능적 기(아미노 기)를 제공하며, 이로부터 Tat가 합성될 수 있고, 여전히 이소류신에 대한 구조적 유사체로서 기능한다(알칸 기반, 제1 Tat 아미노산에 아미드 결합 형성 후 비-하전됨, 크기 유사). AB144_H는 PDZ1-2에 대한 나노몰의 친화성을 보유하지만, AB144보다는 약 5배 낮아서 최적성이 약간 떨어진다(표 2). AB144_I에서 Tat는 헥사펩티드에서 P-5 아미노산의 측쇄에 부착되며, AB144_H보다 PDZ1-2 도메인에 대한 친화성이 더 크지만, AB144보다는 약 2배 약하다(표 2).

실시예 6 - 변형된 이량체 PSD -95 저해제는 사람 혈액 혈장에서 증진된 안정성을 가진다

6.1 사람 혈액 혈장 안정성 분석

PSD-95의 PDZ 도메인에 대한 리간드(이량체 PSD-95 저해제)를 사람 혈액 혈장(270μL; 3H Biomedical, Sweden, cat no 1300-1-P50)에 0.25mM의 농도로 용해하고(2.5mM의 30μL) 37℃에서 인큐베이션했다. 알리쿼트(30μL)를 다양한 시간 간격(예를 들어, 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 960, 1280, 2550, 4560 및 7240분)에서 제거하여 60μL 트리클로로아세트산(수성 5%)으로 퀀칭했다. 알리쿼트를 휘젓고 4℃에서 15분 인큐베이션한 후, 2분간 18,000g에서 원심분리했다. 상청액을 분석용 RP-HPLC(UV218)에 의해서 분석하여 시간 0에 대해서 화합물을 정량하고, 또한 ESI-LC/MS에 의해서 정성 평가하여 샘플에서 화합물을 확인했다(m/z). 프로카인(양성 대조군)과 프로카인아미드(음성 대조군)를 50μM에서 조사하여 상기 과정을 검증했다. 침전 과정 후 리간드 회수율은 85-95%였다.

6.2 Tat 펩티드를 가진 이량체 저해제의 증진된 혈액 혈장 안정성

이량체 저해제 AB144(CPP는 Tat이다)와 AB147(CPP는 레트로인버소-D-Tat이다)을 사람 혈액 혈장 중에서 인큐베이션하고 이들의 시험관내 분해를 모니터했다. 각각 37±6 및 1100±300분의 반감기(T1/2)를 나타냈던 단량체 펜타펩티드 IETDV와 Tat-NR2B9c의 분해에 대한 감수성과 비교했을 때 AB144는 T1/2 = 4900±100를 나타냈으며, 이것은 단량체 펜타펩티드 IETDV와 비교하여 안정성에서 100배를 넘는 개선에 상응한다(도 5). AB147은 측정 기간 내에(130시간) 검출가능한 분해가 관찰되지 않았으며(도 5), 이는 이량체 저해제에 프로테아제-안정한 CPP를 도입한 것의 효과를 예시한다.

실시예 7 - 이량체 PSD -95 저해제는 PSD -95의 PDZ1 및 PDZ2 도메인과 모두 결합한다

7.1 PSD-95의 PDZ1 및 PDZ2 도메인 모두에 대한 리간드 결합의 NMR 분석

결합 연구를 위하여 90% H2O/10% D2O 중 50mM KPi, pH 7.5 중에 3.5mM 자유 [15N,13C]-PEG4(IETAV)2(AB140)와 표지되지 않은 PDZ1-2로 포화된 2.2mM의 동일한 화합물을 포함하는 NMR 샘플을 제조했다. 모든 실험은 600MHz의 프로톤 Larmor 주파수에 상응하는 정류 자기장에서 25℃에서 기록되었다. HNCA, HN(CA)CO 및 HSQC 실험을 기록하여 자유 화합물의 펩티드 부분의 백본을 정했다. 결합 화합물에 대하여, 배치 목적으로 HNCACB, HN(CA)CO 및 HSQC 실험을 기록했다.

15N R1 및 R1ρ 이완율과 15N-[1H] NOE를 이미 설명된 펄스 순서를 사용하여 표지되지 않은 AB125로 포화된 2.83mM[15N]-PDZ1-2에 대해 측정했다. 샘플 조건은 상기와 같았다. R1 실험의 경우, 다음의 이완 지연이 사용되었다: 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0초. 5번의 중복 데이터 포인트로부터 피크 강도의 불확실성을 추정했다. R1ρ 실험을 1661Hz의 스핀락 필드에서 119ppm에 위치된 라디오 주파수 캐리어와 0.004, 0.008, 0.012, 0.016, 0.0,02, 0.024, 0.03, 0.036, 0.04, 0.05, 0.055, 0.06초의 이완 지연 하에 기록했다. 5번의 중복 데이터 포인트를 기록하여 피크 부피의 불확실성을 추정했다. 프로톤 포화 하에 기록된 실험과 프로톤 포화 없이 기록된 실험의 비율을 고려함으로써 15N-[1H]NOE를 기록했다. 두 실험에서 전체 리사이클 지연은 12초였으며, 포화 펄스가 없는 실험을 중복하여 불확실성을 추정했다.

NMR 데이터를 NMRpipe로 가공하고, Sparky(Goddard and Kneller, University of California at San Francisco)를 사용하여 시각화했다. PDZ1-2/cypin으로부터 배치를 옮겨서 PDZ1-2의 결합된 형태에 대한 배치를 얻었다(Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 131, 787, 2009). 이 연구에는 상이한 화합물이 사용되었고 샘플 조건도 상이했으므로 배치의 절반을 약간 초과하는 정도만 신뢰를 가지고 옮겨질 수 있었다. 스펙트럼의 나머지 피크는 분석되지 않았다. 피크를 적분하고, 인 하우스 프로그램 PINT를 사용하여 부피를 이완율로 전환했다. 동일한 프로그램을 사용하여 R1ρ 이완율을 R2 이완율로 전환했다.

7.2 이량체 PSD-95 저해제는 PDZ1 및 PDZ2와 모두 결합한다

7.1에 설명된 대로 표지되지 않은 PDZ1-2의 존재/부재하에 NMR 구조를 결정함으로써 15N, 13C-표지된 이량체 리간드(AB140)와 PDZ1 및 PDZ2의 결합을 분석했다. 대칭 리간드[15N,13C]-PEG4(IETAV)2(AB140)에 대한 HSQC 스펙트럼에서 5개의 피크가 검출되었다. 그러나, 이 리간드가 PDZ1-2와 조합되었을 때는 10개의 아미노산 각각에 상응하는 10개의 상이한 피크가 관찰되었다(도 6). 이것은 두 리간드 부분이 모두 PDZ1-2와 상호작용하며, 이들이 상이한 단백질 환경, 즉 PDZ1 및 PDZ2와 각각 직면한다는 것을 분명히 증명한다. 결합 및 미결합 이량체 리간드에 대한 화학적 이동에 기초한 2차 구조 계산으로부터 미결합 리간드는 랜덤 코일 특성을 나타내고, 결합 리간드는 β-가닥 구조를 채택한다는 것이 추론될 수 있다(도 7). 마지막으로, R1 및 R2 이완율 측정은 이량체 리간드와의 복합체에서 PDZ1-2가 하나의 단위에 이르며, 따라서 2:2 결합 화학량론과 같은 다른 가능한 모델은 배제된다는 것을 확인했다(표 3). 따라서, NMR 연구는 1:1 결합 화학량론을 확인하며, 이량체 리간드의 각 리간드 부분이 진짜 2가 결합 방식으로 PDZ1-2의 PDZ1 또는 PDZ2 중 어느 하나와 결합한다는 것을 분명히 증명한다.

실시예 8 - CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제는 혈액-뇌 장벽을 가로지른다

8.1 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성 분석

이들 형광 표지된 리간드를 마우스에서 혈액-뇌 장벽을 가로지르고 뇌로 진입하는 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 능력에 대한 대용 척도로 사용했다. 형광 리간드를 정맥내 주사하고(3nmol/g), 주사 2시간 후 형광현미경으로 마우스의 관상 뇌 절편(n = 8)에서 리간드의 위치를 검출하여 평가했다. 뇌의 두 부분, 전교련 앞, 전교련 뒤 두 부분(n = 5)을 BBB 투과성 분석을 위해 선택했다. 전교련(브레그마: -0.3)을 뇌의 고정점으로 하여 해부학적으로 동일한 뇌 부분을 분석했다. 이미지를 이미지-캡쳐 소프트웨어(Image Pro Plus 소프트웨어)로 전달하는 고-해상도 현미경 디지털 카메라(Olympus 모델 DP70)에 연결된 10×대물렌즈(Olympus 10x/0,15 UPlanApo)를 구비한 형광 현미경 시스템(Olympus System Microscope 모델 BX-51, Denmark)을 사용하여 5-FAM 형광단의 강도를 반정량적으로 측정했다. 모든 이미지는 동일한 현미경 설정을 사용하고 일정한 카메라 노출 시간 하에 취득했다. 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량했다.

8.2 CPP-이량체 PSD-95 저해제의 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성

이량체 PSD-95 저해제인 AB143, AB145, AB148은 각각 AB141, AB144, AB147의 5-FAM-표지된 유도체이다(도 4: AB143과 AB145가 예로서 도시된다). Tat-NR2B9c의 5-FAM-표지된 유도체는 MS23으로 지정된다. 화합물의 주사 후, 마우스에 파라포름알데히드를 관류시키고 뇌를 조심해서 제거하여 파라포름알데히드에 후-고정하고, 관상 절편으로 가공하여 형광을 정량했다. 관상 뇌 절편의 형광현미경은 AB145, AB148 및 Tat-NR2B9c는 뇌로 진입하지만 AB143은 진입하지 않는다는 것을 보여주었다(도 8). 이들 결과에 기초하여, Tat 또는 레트로인버소-D-Tat를 함유하는 화합물(AB144, AB147 및 Tat-NR2B9c)은 뇌로 진입할 수 있지만 CPP를 함유하지 않는 AB125/AB141은 그럴 수 없다는 결론이 내려진다.

실시예 9 - CPP - 이량체 PSD -95 저해제의 신경보호 특성은 국소 뇌 허혈을 가진 마우스에서 경색 부피를 감소시킨다

CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 생체내 신경보호 특성을 마우스의 허혈성 뇌졸중의 영구적 중뇌 동맥 폐쇄(pMCAO)에서 시험했다.

9.1 생체내 연구를 위한 마우스

pMCAO 연구를 164마리의 연령 일치된 젊은 성체(7-8주) 수컷 C57BL/6 마우스(Taconic, Denmark)를 사용하여 수행했다. 마우스를 별도의 케이지에 수용하고 주행성 조명을 제공했으며, 음식(1314 Altromin, Brogarden, Denmark)과 물에 자유롭게 접근하도록 했다. Danish Animal Ethical Committee(J. no. 2005/561-1068)에서 승인된 가이드라인에 따라서 마우스를 수술 전에 7일간 적응시켰다. 두 무작위 이중 블라인드 위약 대조군 연구에서 허혈성 경색의 범위를 측정했다.

9.2 영구적 중뇌 동맥 폐쇄

수술 과정: 중뇌 동맥의 영구적 폐쇄(pMCAO)에 의해서 마우스에 국소 뇌 허혈을 일으켰다. 마우스를 HypnormTM(펜타닐 시트레이트 0.315mg/mL 및 플루아니손 10mg/mL, VectaPharma Ltd), 미다졸람(5mg/mL, Hameln) 및 증류수의 1:1:2 혼합물을 10g 체중당 0.18mL를 피하 주사하여 마취시켰다. 마우스를 37±0.5℃에 두고, 눈을 연고(Viscotears; Novartis, Basel, Switzerland)로 코팅했다. 안와의 외측 부분과 외이도 사이에서 피부를 절개했다. 이하선 상부 극과 저작근 상부를 0.8mm 버를 사용한 부분 절제 및 소 개두술 후 옆으로 밀어서 MCA의 원위 분지를 위에 직접 만들었다. 경막을 제거하고, 전기수술 유닛(ERBE의 ICC50, Germany)에 연결된 양극성 겸자(Gimmi, Germany)를 사용하여 MCA를 전기 응고시켰다. 폐쇄 후 근육과 연조직을 정리하고 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 피부를 봉합했다. 후-수술 통증 치료를 위해 마우스에 Temgesic(0.001mg/20g 부프레노르피늄, Reckitt & Coleman, UK)를 수술 직후 시작하여 8시간 간격으로 3회 제공했다. 추가로, 28℃로 제어된 회복실로 옮기기 전에 마우스에 등장성 식염수 1mL를 피하 주사했다.

9.3 화합물 투여

화합물을 등장성(0.9%) 식염수(NaCl)에 300μM의 농도로 용해하고, 수술 30분 후에 체중 g당 10mL를 꼬리에 정맥내(i.v.) 볼루스로 투여했다(용량: 3nmol/g). 대조군 마우스는 0.9% NaCl의 정맥내 주사를 받았다.

9.4 마우스 및 뇌 조직 가공의 종료

6시간 후-수술 생존 시간을 가진 C57BL/6 마우스를 경추파열법으로 안락사시켰다. 48시간 후-수술 생존을 가진 C57BL/6 마우스는 펜토바르비탈(the pharmacy of the Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Denmark)을 과다투여하여 마취시켜 혈액과 조직 샘플을 수집했다. 모든 뇌를 조심해서 제거하고 기체상 CO2에서 냉동시켜 6개의 일련의 30μm 관상 극저온기 절편으로 잘라서 추후의 사용시까지 -80℃에 보관했다. AB143, AB145, AB148 및 MS23의 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 조사하는데 사용된 C57BL/6J 마우스는 깊이 마취시키고, 왼쪽 뇌실을 통해서 10mL 냉동 Soerensens 포스페이트 버퍼(SB)(25nM KH2PO4, 125mM Na2HPO4, pH 7.4)와 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유하는 20mL SB를 관류시켰다. 뇌를 조심해서 제거하여 1시간 동안 4% PFA에 후-고정시키고, 이어서 20% 수크로오스를 함유하는 SB 중에 하룻밤 침지시켰다. 뇌를 기체상 CO2에 냉동시키고 16mm 관상 극저온기 절편으로 가공했다.

9.5 경색 부피의 결정

각 마우스로부터의 일련의 신선한 냉동 뇌 절편을 4℃에서 하룻밤 70% 에탄올에 고정시켰다. 절편을 재수화시키고, 80mmol/L Na2HPO4×2H2O 및 70mmol/L 시트르산으로 희석된 톨루이딘 블루 용액(0.01%, Merck, Germany)에 침지시킨 다음, H2O로 3번 헹구고, 일련의 알코올(96-99% 에탄올)로 단계적으로 재수화시켰다. 자일렌 중에서 절편을 깨끗이 하고, Depex(BDH Gurr, UK)로 커버 슬립으로 만들었다. 절편들을 컴퓨터 보조 입체 테스트(CAST) GRID 현미경-시스템(Olympus, Denmark)을 사용하는 경색 부피 분석에 사용했으며, 부피 추정에는 카발리에리 원리가 적용되었다. 총 경색 부피(Vtotal)는 식 Vtotal = ∑P * t * apoint을 사용하여 계산되었고, 여기서 ∑P는 경색이 있는 지점의 총 수, t는 절편들 간 평균 거리, apoint는 지점당 면적을 나타낸다.

9.6 통계 분석

윈도우용 Graphpad Instat 5.0 프로그램(GraphPad software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 마우스의 두 그룹 사이에서 경색 크기의 평균값들의 비교를 비-모수 만-휘트니 테스트를 사용하여 수행했다. 투 테어드 페어드 스튜던트 티 테스트를 사용하여 수술 전후에 동일한 마우스로부터 얻은 움켜쥠 강도 값을 비교했다. 윌콕슨 부호 위수 테스트는 동일한 마우스로부터의 반복된 척도에 대해 사용되었다(로타로드 성능 테스트). 양-방향 변량 분석을 사용하여 독립 변수들을 조사했다(시간 및 체중 또는 온도). 모든 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. 통계적 유의성은 P<0.05에서 용인된다.

9.7 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 신경보호 효과 - 단기

AB144와 Tat-NR2B9c의 보호 효과를 성체 마우스 뇌 국소 허혈 pMCAO 모델에서 식염수와 비교했다(n = 60). 저해제(3nmol/g)를 손상 30분 후에 정맥내 주사하고, 5.5시간 후-수술 생존 기간이 이어졌다(도 9). AB144는 식염수 처리 마우스와 비교하여 허혈성 조직 손상의 유의한 40% 감소를 보였지만, Tat-NR2B9c는 경색 부피에서 통계적으로 유의한 감소를 제공하지 않았다(도 10). 따라서, 이량체 구조로 인한 현저히 높은 친화성과 Tat-펩티드에 의해서 촉진된 혈액-뇌 장벽 투과성의 조합은 Tat-NR2B9c와 비교하여 뛰어난 활성을 가진 생체내 신경보호 화합물 AB144을 가져온다.

9.8 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 신경보호 효과 - 장기

식염수와 비교하여 AB144, AB147 및 Tat-NR2B9c의 장기간 지속되는 신경보호 효과를 pMCAO 48시간 후에 평가했다(n = 80)(도 9). AB144와 AB147은 각각 식염수 처리 마우스와 비교하여 경색 크기의 37% 및 34% 감소를 제공했지만, Tat-NR2B9c에 의한 치료에서는 통계적으로 유의한 경색 감소가 검출되지 않았다(도 11 및 12).

9.9 pMCAO 마우스의 생리학적 상태

pMCAO 수술 전과 수술 도중에 마우스의 생리학적 상태를 주의 깊게 모니터하여, 실험 과정으로 인해 생긴 이차적인 상태(예를 들어, 질환-관련된)로 인한 이량체 PSD-95 저해제 치료에서 관찰된 효과를 배제했다.

9.10 체중 모니터링

전-훈련, 수술 전 및 수술 24시간 및 48시간 후에 각 마우스의 체중을 등록했는데 치료 그룹들 간에는 차이가 보이지 않았다(도 13).

9.11 체온 모니터링

마우스의 직장 온도를 Model Bat 12 유닛(Physitemp)에 연결된 열전쌍 프로브를 사용하여 계속 측정했다. 체온은 pMCAO 전과 30분 후에 그리고 추가로 i.v. 주사 30분 및 2.5시간 후, 즉 pMCAO 1시간 및 3시간 후에 측정되었다. 식염수 처리 마우스와 비교하여 약물 주사 후, 체중(도 13)이나 생존율(>96%)에 차이는 보이지 않았다.

9.12 혈액 가스 분석:

PO2/PCO2 전해질, 글루코오스, 락테이트, 및 헤마토크릿의 혈액 가스 분석을 위해서 화합물 투여 30분 후에 정맥혈 샘플을 하나 채취했다(pMCAO 1시간 후). 모세관 헤파린 코팅된 튜브를 눈의 안쪽 코너를 따라 삽입해서 결막을 뚫고 돌려 내보냈다. 혈액 샘플(150μL)을 수집해서 얼음에 보관하고, 이후 IL Sensor Systems에서 구입한 GEM Premier 300 혈액 가스 기기(Instrumentation Laboratory) 퀄리티 컨트롤(QC ContrlIL9)를 사용하여 가스 분석을 행했다. 혈액 가스 변수(PO2/PCO2, pH, 전해질, glu/lac)에는 역시 차이가 검출되지 않았으며, 이들은 조작되지 않은 대조군 마우스와 비교하여 정상 범위 내에서 그룹 간에 유사했다(표 4).

실시예 10 - CPP - 이량체 PSD -95 저해제의 신경보호 특성은 국소 뇌 허혈을 가진 마우스에서 운동 기능을 보존한다

허혈성 뇌졸중의 (pMCAO) 모델에서 48시간 후-수술 생존 마우스(실시예 9)를 3회의 추적 행동 테스트를 사용하여 시험해서 운동 결손을 검출했는데, 이것은 반드시 경색 크기를 나타내는 것은 아닐 수 있고, 동물 상태의 더욱 일반적인 인상을 제공한다.

10.1 움켜쥠 강도

움켜쥠 강도계(BIO-GT-3, BIOSEB)를 사용하여 마우스가 움켜쥔 것을 푸는데 필요한 최대 힘을 결정함으로써 마우스에서 신경근육 기능을 연구했다. 각 발에서 움켜쥠 강도를 사용하여 pMCAO-유도된 비대칭성의 중증도를 측정했다. 마우스에게 금속 손잡이를 움켜쥐도록 한 후 수평 판을 뒤로 잡아당겼다. 격자판에 적용된 힘을 최고 장력으로 기록한다. pMCAO 전(베이스라인)과 후에 각 앞발의 강도와 전체 움켜쥠 강도(양 발 동시)를 측정했다. 각 마우스를 5회 연속 시험으로 시험하고, 최고 움켜쥠 강도를 최상의 점수로 기록한다.

10.2 로타로드 성능 테스트

로타로드(LE 8200, Panlab)는 설치류의 운동 활성, 중추신경계 손상에 대한 실험 화합물 효과, 또는 운동 조정력에 대한 질환 효과를 평가하는데 아주 적합하며, 동물이 회전 드럼에서 보행을 유지하는 동안의 시간으로서 평가된다. 로타로드의 회전은 운동 유도되며, 모든 마우스가 로드에서 떨어지는 5분의 시간 기간에 걸쳐서 분당 0에서 40 라운드까지 가속된다(rpm). 모든 마우스는 20분 간격(휴식 시간)으로 4회 반복 시험으로 시험했다. 수술 전에 마우스를 4rpm에서 30초간 로드에 머물도록 미리 훈련시켰다.

10.3 CPP-함유 이량체 PSD-95 저해제의 신경보호 효과는 움켜쥠 강도 및 운동 조정력을 보존한다

AB144 및 AB147로 치료된 pMCAO 마우스는 전체 움켜쥠 강도(양 발)에서 유의한 차이를 보이지 않았지만, 식염수 또는 Tat-NR2B9c 처리 마우스는 움켜쥠 강도에서 유의한 양을 상실했다(도 14A). 유사하게, 움켜쥠 강도 분석은 식염수 및 Tat-NR2B9c 처리 마우스와 비교하여 AB144 및 AB147 치료된 마우스에서 오른쪽 및 왼쪽 앞발 사이에 비대칭성을 보이지 않았으며(도 14B), 이것은 AB144 및 AB137의 신경보호 효과를 분명히 증명한다. 로타로드 성능 테스트에서 AB144 및 AB147 치료된 마우스는 식염수 처리 마우스보다 더욱 확연한 단기 학습 능력 개선을 보였으며(도 14C), 마우스가 로드에서 소비한 총 시간도 Tat-NR2B9c 처리 마우스(65.7±3.6초)보다 유의하게 길어졌다(AB144: 83.5±4.1초; AB147: 92.6±4.5초)(P<0.001).

실시예 11 - 이량체 PSD -95 저해제는 염증성 통증 상태를 완화한다

11.1 동물

모든 실험에는 Taconic M&B(Ry, Denmark)로부터 얻은 암컷 NMRI 마우스(22-26g)가 사용되었고, 이들은 시험 당시 8-9주령이었다. 도착 후 마우스를 최소 7일 Macrolon III 케이지(20×40×18cm)에 적응하도록 했으며, 케이지당 7마리의 마우스를 배정했다. 음식과 물은 마음대로 이용할 수 있었고, 오전 6시에 불을 켜서 12/12h 명/암 사이클을 적용했다. 실험은 온도와 습도가 조절되는 방에서 오전 9시에서 오후 4시 사이에 수행했다(22-24℃, 상대 습도: 60-70%). 모든 시험 과정은 "실험실 동물 관리 원칙"(NIH 공개 No. 85-23, 1985년 개정)과 Danish Animal Experimentation Act에 따랐으며, 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다.

11.2 완전 프레운드 애쥬번트에 의한 염증성 통증의 유도 및 화합물 투여

301/2-게이지 바늘이 딸린 GASTIGHT® 50μL 마이크로 주사기를 사용하여 왼쪽 뒷발 발바닥 표면에 20μL의 완전 프레운드 애쥬번트 현탁액(CFA; 1mg/ml 결핵균; Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)을 피하(s.c.) 주사하여 영구적 염증성 통증을 유도했다. 기계적 자극에 대한 움츠림 역치의 베이스라인 측정을 매일 한 번씩 CFA 주사 전 3회 수행했다. 비히클(0.9% 식염수) 또는 AB125(3, 10 또는 30mg/kg)를 10mL/kg의 주사 부피로 복강내 제공했다(AB125를 0.9% 식염수에 용해). CFA 및 비히클/AB125는 기계적 민감성 시험 적어도 24시간 전에 투여했다.

11.3 통증 시험: CFA에 의해서 유도된 기계적 무해자극통증/통각과민증에 대한 본 프레이 테스트

CFA 처리에 의해서 유도된 통각과민증/무해자극통증의 정도를 평가하기 위해서 기계적 자극에 대한 50% 발 움츠림 역치(PWT)를 업 앤 다운 방법을 사용하여 측정했다(Chaplan et al., J Neuroscience Methods, 1994, 53, 55-63). 간단히 말해서, 마우스를 각각 금속 와이어 메쉬 바닥의 투명한 암적색 플라스틱 상자에 넣고 적어도 30분간 환경에 적응시켰다. 0.008, 0.02, 0.04, 0.07, 0.16, 0.40, 0.60, 1.00 및 1.4g과 동등한 굽힘력을 가진 일련의 본 프레이 필라멘트(Stoelting, Wood Dale, IL)를 사용하여 자극을 전달했다. 필라멘트 0.6에서 시작하여 본 프레이 필라멘트를 4-5초간 뒷발 발바닥 표면에 수직으로 적용했다. 자극에 대해 양성 반응이 발생하면 다음 낮은 수치의 본 프레이 필라멘트를 적용했다. 음성 반응이 발생하면 다음 높은 수치의 필라멘트를 사용했다. 양성 및 음성 반응의 패턴을 50% 역치로 전환했으며(Chaplan et al., J Neuroscience Methods, 1994, 53, 55-63), 이것은 다음 식에 따라서 그램(g) 값으로 표시되었다: 50% PWT = 10^(G+0.2237*K), 여기서 G는 마지막 본 프레이 필라멘트의 굽힘력이고, K는 업 앤 다운 패턴에 기초한 표준화된 표로부터 얻어진 값이다. 정상적인 운동 행동으로 인해 발을 드는 것은 무시했고, 깊은 수면, 털 손질 및 탐색 동안에는 시험을 피했다. 치료는 시험 요원에 대해 블라인드 방식이었다.

11.4 식품 선호도의 사회적 전달 시험

STFP는 두 단계로 수행되었다. 제1 단계: 4마리의 음식을 주지 않은 마우스들로 구성된 각 케이지에서 '시범' 마우스를 별도의 케이지로 옮겨서 1% 시나몬 또는 2% 코코아 분말과 혼합된 분쇄된 음식을 30분간 먹도록 했다. 다음에, '시범' 마우스를 다시 이들의 원래 케이지로 30분간 돌려보냈다. 이 '제시' 단계 동안 3마리의 '관찰자' 마우스와 시범 마우스 사이의 상호작용 횟수를 기록했다. 최소 2회에서 최대 5회의 핥기/킁킁대기 상호작용이 냄새 단서의 적절한 습득을 위한 기준으로 제시되었다. 이 제1 단계 후, '시범' 마우스를 꺼내고, 3마리의 '관찰자' 마우스를 깨끗한 케이지로 옮겨서 음식과 물에 4시간 동안 자유롭게 접근하도록 한 후, 음식을 빼앗아 제2 단계를 준비했다. 제2 단계: 24시간 보류 기간 후, 관찰자 마우스를 각각 시나몬 또는 코코아 향기를 첨가한 분쇄된 음식 트레이 둘을 함유한 케이지에 넣었다. 새로운 음식에 비해 단서가 주어진 음식이 섭취된 양을 미리 단서가 주어진 음식에 대한 기억 지수로서 고려한다. 파일럿 연구는 시나몬향 및 코코아향 음식 사이에서 선택하게 되었을 때 마우스들이 어떤 고유한 선호도를 나타내지 않는다는 것을 보였다. 또한, 실험들은 각 처리군 내에서 동일한 수의 마우스가 시나몬과 코코아의 단서를 제공받는 것을 보장하기 위해서 균형 잡힌 방식으로 설계되었다.

11.5 변형된 Y-미로

주행로에 연결된 2개의 수직 팔로 이루어진 투명 플렉시 글래스 미로에서 시험이 수행되었다. 2개의 팔(탐색에 이용가능)과 주행로는 50cm 길이 및 8cm 너비였고, 30cm 높이의 투명 플렉시 글래스 벽으로 둘러싸여 있다. 각 팔은 검은색의 제거가능한 파티션이 장착된 중앙 플랫폼에서 만나며, 팔들은 원하는 대로 열고 닫는 것이 가능하다. 전체 미로는 삼각형의 검은색 플렉시 글래스 상자(1×1×1m)에 봉입되었다. 각 탐색 팔을 둘러싼 이 외부 상자의 벽은 뚜렷한 광학적 단서, 예를 들어 흰색 수평선이나 수직선으로 덮였다. 주행로를 둘러싼 영역은 광학적 단서를 함유하지 않았고 색은 검은색이었다. 미로의 각 팔은 불투명 파티션에 의해서 서로 분리되었고, 이로써 팔에 들어간 마우스는 해당 특정 팔의 뚜렷한 광학적 단서만 볼 수 있었다. 시험은 두 단계로 구성되었다. 단계 1(습관화)에서 마우스(n = 8-10)를 주행로의 끝에 두고 강제로 선택시켜 탐색 팔 중 하나에 접근하도록 했다(나머지 팔은 닫혀 있었다). 마우스가 팔로 들어간 후, 주행로로의 접근을 차단하고, 마우스가 5분간 팔(익숙한 팔이라고 칭함)을 탐색하도록 했다. 체계적으로 익숙한 팔을 번갈아 교체하여 어떤 장소 선호도를 제거해서 이 분석에 혼동을 부여했다. 직후 단계 2(시험)에서 마우스를 주행로를 제외한 익숙한 탐색 팔과 익숙하지 않은 탐색 팔 양쪽을 2분간 탐색하도록 했다. 이 시험 단계 동안 자동 비디오 추적 시스템(Ethovision, Noldus)으로 각 팔에서 소비한 누적 시간을 기록했다. 각 마우스에 대해 구별 지수(DI)를 계산했으며, 이것은 단계 2 시험 동안 새로운 팔과 익숙한 팔에서 소비한 시간의 차이를 새로운 팔과 익숙한 팔에서 소비한 총 시간으로 나눈 것으로서 정의되는데, 즉 DI = (새로운 팔 - 익숙한 팔)/(새로운 팔 + 익숙한 팔)이다.

11.6 로타로드 테스트

가속 로타로드(MedAssociates, Inc., VT, USA)를 사용하여 운동 기능을 평가했다. 로타로드(3.2cm 직경) 속도를 300초 기간에 걸쳐서 4에서 40rpm까지 증가시켰고, 로드에서 소비할 수 있는 가능한 최소 시간은 0초, 최대 컷 오프 시간은 310초로 정했다. 각 마우스를 약물 치료 직전(t=0)에 시험했고, 약물 치료 후에 15, 30, 45 및 60분에 다시 시험했다. 동물이 회전 드럼에서 떨어졌을 때 포토빔이 자동으로 깨져서 회전 로드에서 소비한 시간의 양을 기록했다.

11.7 데이터 분석

통증 데이터: 베이스라인 기계적 역치는 CFA 치료 전 연속 3일에 취득한 본 프레이 측정치의 평균으로서 정의했으며, 마지막 베이스라인 측정치는 CFA 치료와 같은 날에 취득했다. 양-방향 반복 공분산 측정 분석(RM-ANCOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행했으며, 치료는 독립 인수, 시간은 반복 인수, 베이스라인 기계적 역치는 공변인으로 사용된다. RM-ANCOVA에 이어서 예측된 평균에 대한 계획된 비교를 수행하여 역치 민감성에 대한 시간에 따른 치료 효과를 평가했다. 분석은 원 데이터를 가지고 수행했으며, 결과는 상대 값으로 표시된다(예를 들어, 베이스라인이 1로서 정의된다).

인지 데이터: 식품 선호도의 사회적 전달 시험에서 단서가 주어진 음식에 대한 선호도는 구별 지수, DI = (단서가 주어진 음식 - 새로운 음식)/(단서가 주어진 음식 + 새로운 음식)으로 표시되었다. 변형된 Y-미로에서 새로운 팔에 대한 선호도는 구별 지수, DI = (새로운 팔에서의 시간 - 익숙한 팔에서의 시간)/(새로운 팔에서의 시간 + 익숙한 팔에서의 시간)으로 표시되었다. STFP 및 Y-미로 데이터를 단-방향 ANOVA에 의해서 분석하고, 이어서 계획된 비교를 수행하여 구별 지수에 대한 치료 효과를 평가했다.

운동 성능: 로타로드 테스트에서 운동 조정력에 대한 치료 효과를 양-방향 RM-ANOVA를 사용하여 분석했으며, 치료는 독립 인수, 시간은 반복 척도이다. 계획된 비교 과정을 사용하여 시간에 따른 치료 효과를 평가했다.

11.8 AB125는 CFA에 의해서 유도된 기계적 무해자극통증/통각과민증을 감소시킨다

AB125는 3, 10 및 30mg/kg로 복강내 주사되었을 때 모두 CFA-유도된 통증 반응을 감소시킨다(도 17). 이것은 마우스에 CFA와 AB125를 동시 주사하고, 24시간 후에 기계적 무해자극통증/통각과민증을 측정함으로써 보여진다. 이 결과는 PSD-95 저해제는 CPP가 부착되지 않아도 염증성(CFA-유도된) 기계적 통증에 대해 효과적인 진통제이며, 따라서 만성 통증 상태의 치료에서 유망한 제제임을 예시한다.

11.9 CFA 통증 모델에서 MK-801과 비교된 AB125의 진통 효과

CFA와 동시에 투여되었을 때 고전적인 NMDA 수용체 길항제인 MK-801과 AB125는 모두 치료 1시간 및 24시간 후에 CFA-유도된 기계적 통각과민증의 발생을 방지했다(도 18).

11.10 CFA-주사 24시간 후에 제공되었을 때 AB125의 연장된 진통 효과

AB125를 CFA-주사 24시간 후에 제공했을 때 ANCOVA-테스트는 1시간 후 3 및 10mg/kg에서 CFA-유도된 통각과민증의 유의한 역전을 드러냈다. 더욱이, 이 역전은 3mg/kg 및 10mg/kg 치료된 그룹 양쪽에서 24시간 후에도 여전히 관찰되었으며, 72시간째에는 모든 용량(1, 3 및 10mg/kg)에서 통각과민증이 유의하게 역전되었다(도 19). 추가의 측정이 AB125 치료 8일 후에 있었지만, 이 시점에서 식염수 처리 동물은 베이스라인 수준으로 자발적으로 회복되었고, AB125의 잠재적 진통 효과의 검출은 불가능했다.

11.11 인지 및 운동 기능 행동 테스트에서 AB125 및 MK-801의 시험

부작용 프로파일을 시험하기 위해서 우리는 장기 기억의 식품 선호도의 사회적 전달(STFP) 시험, 및 주의력의 변형된 Y-미로 테스트, 그리고 운동 성능의 로타로드 테스트에서 AB125와 MK-801의 효과를 비교했다. 통각과민증을 감소시키는 용량에서 MK-801은 STFP(도 20)와 변형된 Y-미로(도 21) 테스트에서 인지 결손을, 로타로드 테스트(도 22)에서 운동 결손을 유도했다. 반면에, AB125는 진통 용량에서 또는 심지어 더 높은 용량에서도(최대 60mg/kg) 이들 시험에서 인지 또는 운동 기능 결손을 유도하지 않았다(도 20-22). 따라서, AB125의 형태의 PSD-95 저해제는 염증성(CFA-유도된) 기계적 통증에 대해 효과적인 진통 효과를 제공하며, 또한 이것은 고전적인 NMDA 수용체 길항제인 MK-801에서 보이는 것과 같은 인지 또는 운동 기능 부작용을 유도하지 않는다. 따라서, 이량체 PSD-95 저해제는 만성 통증의 치료에서 유망한 제제이다.

11.12 AB144는 CFA에 의해서 유도된 기계적 무해자극통증/통각과민증을 감소시킨다

AB144는 또한 AB144를 CFA-주사와 동시에 복강내 주사하고, 1시간 및 24시간 후에 기계적 무해자극통증/통각과민증을 측정함으로써 밝혀진 대로 CFA-유도된 통증 반응을 감소시킨다. 통계 ANCOVA-테스트는 30mg/kg 용량에서 1시간 후 그리고 10 및 30mg/kg 용량에서 24시간 후 CFA-유도된 통각과민증의 유의한 역전을 드러냈다(도 23). 이 결과는 PSD-95 저해제가 CPP가 부착된 상태에서 염증성(CFA-유도된) 기계적 통증에 대해 효과적인 진통제이며, 따라서 만성 통증 상태의 치료에서 유망한 제제임을 예시한다.

실시예 12 - 이량체 PSD -95 저해제는 척수 조직으로 진입한다

12.1. PSD-95 저해제의 척수 검출 방법

이량체 PSD-95 저해제인 AB143과 AB145는 각각 AB141 및 AB144의 5-FAM-표지된 유도체이다(도 4). 따라서, AB143은 AB125/141의 약동학적 특성을 조사하기 위한 대용 화합물로 작용하고, AB145는 AB144의 대용 화합물로서 작용한다. AB143과 AB145가 척수 조직으로 진입할 수 있는지 조사하기 위해서 이들을 마우스에 복강내 주사(30mg/kg)에 의해서 투여했다. 약물 치료된 마우스를 주사 30분 후에 죽여 척수를 조심해서 절제하고, 거기에 5% 트리클로로아세트산(TCA)(0.1g 조직당 300μL)을 가해서 조직을 초음파 균질화기로 균질화했다(얼음에서). 균질화된 조직을 휘젓고 10분간 원심분리했다(4℃에서 20000g). 상청액을 시험관으로 옮겨서 증발시키고, 잔류물을 물에서 복원해서 형광 플레이트 리더(여기/방출: 470/525nm)를 사용하여 그것의 형광 강도를 결정했다. 화합물의 정량을 위해서 균질화 전에 대조군 마우스의 척수 조직에 기지량의 AB143과 AB145를 스파이크하고, 이어서 약물 치료된 마우스와 유사하게 워크업과 분석을 수행하여 표준 곡선을 작성했다.

12.2. PSD-95 저해제는 척수에서 발견된다

식염수 처리 마우스와 비교하여 분명하고 뚜렷한 형광 증가가 AB143과 AB145로 치료된 마우스의 척수 조직에서 측정되었다. 표준 곡선에 기초하여, AB143 및 AB145의 농도는 각각 0.061nmol/g 및 0.074nmol/g인 것으로 결정되었다. 이들 농도는 PSD-95에 대한 해당 화합물의 Kd 값(5-10nM) 이상이며, 이로써 AB143(따라서 AB125도)과 AB145(따라서 AB144도)가 모두 적당한 농도에서 CNS 척수 조직으로 진입하여 PSD-95를 저해하고 통증을 완화할 수 있다는 것을 뒷받침한다.

SEQUENCE LISTING <110> Copenhagen University <120> High-Affinity, Dimeric Inhibitors of PSD-95 as Efficient Neuroprotectants against Ischemic Brain Damage and for treatment of pain <130> P81101657EP00 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 605 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(600) <223> HIS-PDZ1-2 DNA <400> 1 atg cac cac cac cac cac ccg cgc gga tcc atg gaa tac gag gaa atc 48 Met His His His His His Pro Arg Gly Ser Met Glu Tyr Glu Glu Ile 1 5 10 15 aca ttg gaa agg ggt aac tca ggt ctg ggc ttc agc atc gca ggt ggc 96 Thr Leu Glu Arg Gly Asn Ser Gly Leu Gly Phe Ser Ile Ala Gly Gly 20 25 30 act gac aac cca cac atc ggt gac gac cca tcc att ttc atc acc aag 144 Thr Asp Asn Pro His Ile Gly Asp Asp Pro Ser Ile Phe Ile Thr Lys 35 40 45 atc att cct ggt ggg gct gcg gcc cag gat ggc cgc ctc agg gtc aac 192 Ile Ile Pro Gly Gly Ala Ala Ala Gln Asp Gly Arg Leu Arg Val Asn 50 55 60 gac agc atc ctg ttt gta aat gaa gtg gac gtg cgc gag gtg acc cac 240 Asp Ser Ile Leu Phe Val Asn Glu Val Asp Val Arg Glu Val Thr His 65 70 75 80 tca gcg gcg gtg gaa gcc ctc aaa gag gca ggc tcc atc gtt cgc ctc 288 Ser Ala Ala Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser Ile Val Arg Leu 85 90 95 tat gtc atg cgc cgg aag ccc ccg gct gag aag gtc atg gag atc aag 336 Tyr Val Met Arg Arg Lys Pro Pro Ala Glu Lys Val Met Glu Ile Lys 100 105 110 ctc atc aag ggg cct aaa ggt ctt ggc ttc agc atc gca ggg ggc gta 384 Leu Ile Lys Gly Pro Lys Gly Leu Gly Phe Ser Ile Ala Gly Gly Val 115 120 125 ggg aac cag cac atc cca gga gat aat agc atc tat gta aca aag atc 432 Gly Asn Gln His Ile Pro Gly Asp Asn Ser Ile Tyr Val Thr Lys Ile 130 135 140 atc gaa ggg ggt gct gcc cac aag gat ggg agg ttg cag att gga gac 480 Ile Glu Gly Gly Ala Ala His Lys Asp Gly Arg Leu Gln Ile Gly Asp 145 150 155 160 aag atc ctg gcg gtc aac agt gtg ggg cta gag gac gtc atg cat gaa 528 Lys Ile Leu Ala Val Asn Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Met His Glu 165 170 175 gat gct gtg gca gcc ctg aag aac acg tat gat gtt gtc tac cta aag 576 Asp Ala Val Ala Ala Leu Lys Asn Thr Tyr Asp Val Val Tyr Leu Lys 180 185 190 gtg gcc aag ccc agc aat gcc tga attcg 605 Val Ala Lys Pro Ser Asn Ala 195 <210> 2 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met His His His His His Pro Arg Gly Ser Met Glu Tyr Glu Glu Ile 1 5 10 15 Thr Leu Glu Arg Gly Asn Ser Gly Leu Gly Phe Ser Ile Ala Gly Gly 20 25 30 Thr Asp Asn Pro His Ile Gly Asp Asp Pro Ser Ile Phe Ile Thr Lys 35 40 45 Ile Ile Pro Gly Gly Ala Ala Ala Gln Asp Gly Arg Leu Arg Val Asn 50 55 60 Asp Ser Ile Leu Phe Val Asn Glu Val Asp Val Arg Glu Val Thr His 65 70 75 80 Ser Ala Ala Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser Ile Val Arg Leu 85 90 95 Tyr Val Met Arg Arg Lys Pro Pro Ala Glu Lys Val Met Glu Ile Lys 100 105 110 Leu Ile Lys Gly Pro Lys Gly Leu Gly Phe Ser Ile Ala Gly Gly Val 115 120 125 Gly Asn Gln His Ile Pro Gly Asp Asn Ser Ile Tyr Val Thr Lys Ile 130 135 140 Ile Glu Gly Gly Ala Ala His Lys Asp Gly Arg Leu Gln Ile Gly Asp 145 150 155 160 Lys Ile Leu Ala Val Asn Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Met His Glu 165 170 175 Asp Ala Val Ala Ala Leu Lys Asn Thr Tyr Asp Val Val Tyr Leu Lys 180 185 190 Val Ala Lys Pro Ser Asn Ala 195

Claims (18)

1. 링커에 의해서 제2 펩티드에 연결된 제1 펩티드를 포함하는 화합물로서, 상기 제1 및 제2 펩티드는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하고, 여기서
   a. Y는 E, Q 및 A 중에서 선택되고,
   b. X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 중에서 선택되며,
   상기 링커는 PEG를 포함하고, NPEG를 제공하기 위해서 PEG의 적어도 하나의 산소 원자는 질소 원자로 치환되며, 세포 투과성 펩티드(CPP)가 아미드 결합에 의해서 상기 링커의 질소 원자에 결합되고, 상기 CPP는 아르기닌 및/또는 리신으로부터 선택된 적어도 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 화합물.
2. 제 1 항에 있어서, 링커는 4 내지 28개 에틸렌 글리콜 부분(N = 4-28)을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 링커는 NPEG-2산 링커이며, 상기 링커의 각 카복실 기가 제1 또는 제2 펩티드 또는 펩티드 유사체의 말단 잔기에 연결된 것을 특징으로 하는 화합물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, CPP는 레트로인버소 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, CPP는 YGRKKRRQRRR의 아미노산 서열을 갖는 Tat 펩티드 또는 rrrqrrkkr의 아미노산 서열을 갖는 레트로인버소-d-Tat 펩티드인 것을 특징으로 하는 화합물.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드 및/또는 제2 펩티드는 5 내지 10개 아미드-결합된 잔기 길이인 것을 특징으로 하는 화합물.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 펩티드는 적어도 4개의 L-아미노산 잔기로 이루어진 것을 특징으로 하는 화합물.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, X는 A, Q 및 D 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 화합물.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드 및/또는 제2 펩티드는 N-알킬화된 것을 특징으로 하는 화합물.
10. 의약으로서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물.
11. 대상에서 흥분독성-관련 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물.
12. 제 11 항에 있어서, 질환이 CNS의 허혈성 또는 외상성 손상인 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
13. 대상에서 통증의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물.
14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 포함하며, 상기 조성물을 대상에게 송달하기 위한 수단을 더 포함하는 키트.
15. 화합물을 포함하는, 대상에서 통증의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물로서, 상기 화합물은 링커에 의해서 제2 펩티드에 연결된 제1 펩티드를 포함하고, 상기 제1 및 제2 펩티드는 서열 YTXV 또는 YSXV를 갖는 적어도 4개의 아미드-결합된 잔기를 포함하며, 여기서
    a. Y는 E, Q 및 A 중에서 선택되고,
    b. X는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 중에서 선택되는 제약 조성물.
16. 제 15 항에 있어서, 링커는 PEG 링커이고, 4 내지 28개 에틸렌 글리콜 부분(N = 4-28)을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
17. 제 16 항에 있어서, 링커는 PEG-2산 링커이며, 상기 링커의 각 카복실 기가 제1 또는 제2 펩티드의 말단 잔기에 연결된 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
18. 제 16 항에 있어서, 상기 화합물은 PEG4(IETAV)2, NPEG4(IETAV)2, PEG6(IESDV)2 및 PEG4(IESDV)2 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
    
    

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