BR112013029206B1 - composto, e, uso de um composto - Google Patents

Abstract

COMPOSTO, E, USO DE UM COMPOSTO. A invenção refere-se a inibidores potentes inéditos do complexo de proteína ternária do receptor de nNOS, PSD-95 e NMDA e composições farmacêuticas compreendendo os inibidores para profilaxia e/ou tratamento com doença excitotóxica relacionada e condições de dor crônica em um indivíduo. Os inibidores são inibidores de PSD-95 diméricos compreendendo um primeiro peptídeo ou análogo de peptídeo ligado a um segundo peptídeo ou análogo de peptídeo por um ligante, em que o primeiro e o segundo peptídeos ou análogos de peptídeo compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com uma sequência YTXV ou YSXV, em que a) Y é selecionado entre E, Q e A, ou um análogo desses, e b) X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D e N-Me-N ou um análogo desses, e em que um Peptídeo de Penetração Celular (CPP) é ligado ao ligante ou a uma cadeia lateral de aminoácido do primeiro e segundo peptídeos ou análogos de peptídeo. O ligante pode ser um ligante PEG ou NPEG.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A proteína andaime PSD-95 é um alvo potencial para tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico e lesão cerebral traumática, bem como para condições de dor crônica, tal como dor neuropática e inflamatória. A presente invenção refere-se a provisão de análogos de peptídeo dimérico que agem como inibidores de interações proteína-proteína relacionadas a PSD-95.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Interações proteína-proteína (PPIs) são essenciais para processos celulares vitais, e estão envolvidas em inúmeros estados patofisiológicos, onde elas servem como alvos potenciais para intervenção terapêutica. PPIs têm geralmente sido consideradas difíceis de alvejar com moléculas terapêuticas, uma vez que elas são frequentemente caracterizadas por interfaces grandes, planas e hidrofóbicas.

[003] Uma classe de PPIs é a que envolve domínios de PDZ [PDZ é uma abreviação para proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95), supressor de tumor homólogos de grandes discos de Drosophila (DlgA) e proteína de zona de oclusão 1 (ZO-1)]. Domínios de PDZ frequentemente funcionam como módulos em proteínas andaimes que são envolvidas na montagem de complexos de proteínas grandes na célula, e são altamente abundantes em organismos eucarióticos. Domínios de PDZ compreendem cerca de 90 aminoácidos e geralmente interagem com a terminação C da proteína de interação. PSD-95 contém três domínios de PDZ, PDZ1-3, que ligam ligantes de peptídeo com a sequência consenso Glu/Gln-Ser/Thr-X-Val- COOH.

[004] A base estrutural para a interação de domínios de PDZ com peptídeos da terminação C foi primeiro elucidada por uma estrutura cristalográfica de raios-X de PDZ3 de PSD-95 complexada com um ligante de peptídeo nativo, CRIPT (Sequência: YKQTSV). PDZ3 contém seis fitas β antiparalelas (βA-βF) e duas hélices α (αA e αB), e o ligante de peptídeo da terminação C liga como uma fita β antiparalela adicional em um entalhe entre a fita βB e hélice αB. Dois resíduos no ligante de peptídeo são considerados particularmente importantes quanto a afinidade e especificidade, os primeiros (P0) e os terceiros (P-2) aminoácidos (contando a partir da terminação C). A cadeia lateral do aminoácido na posição P0 projeta em uma bolsa hidrofóbica e é necessário um aminoácido com cadeias laterais alifáticas (Val, Ile e Leu). Na estrutura PDZ3-CRIPT, o oxigênio de hidroxila de Thr (P-2) forma uma ligação de hidrogênio com o nitrogênio de uma cadeia lateral de imidazol de His372. Um motivo Gly-Leu-Gly-Phe conservado (posição 322-325 em PDZ3) e um resíduo positivamente carregado (Arg318 em PDZ3) dos domínios de PDZ mediam ligação no grupo carboxilato da terminação C.

[005] Os domínios de PDZ1 e PDZ2 de PSD-95 interagem com diversas proteínas incluindo a ligação simultânea do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) de receptores de glutamato ionotrópico e a enzima produtora de óxido nítrico, sintase do óxido nítrico neuronal (nNOS) (Figura 1). Receptores de NMDA são os principais mediadores de excitotoxicidade, que é implicada em doenças neurodegenerativas e lesões cerebrais agudas e, embora antagonistas do receptor de NMDA reduzam eficientemente a excitotoxicidade, impedindo fluxo iônico mediado por glutamato, eles também impedem importantes processos fisiológicos. Assim, antagonistas do receptor de NMDA falharam em experiências clínicas para acidente vascular cerebral devido a baixa tolerância e falta de eficácia. Em vez disto, inibição específica de excitotoxicidade pode ser obtida perturbando o complexo do receptor de nNOS/PSD-95/NMDA intracelular com inibidores de PSD-95 (Figura 1). PSD-95 simultaneamente liga o receptor de NMDA, basicamente subunidades de GluN2A e GluN2B, e nNOS por meio de PDZ1 e PDZ2. A ativação do receptor de NMDA causa influxos iônicos de cálcio, que ativam nNOS, levando por meio disso à geração de óxido nítrico (NO). Assim, PSD- 95 media uma associação específica entre ativação do receptor de NMDA e produção de NO, que pode ser detrimental para as células, se sustentada por um período mais longo, e é um facilitador chave de neurotoxicidade mediada por glutamato (Figura 1). Inibição do complexo ternário de interação do receptor de nNOS/PSD-95/NMDA alvejando PSD-95 é conhecida por impedir dano cerebral isquêmico em camundongos, prejudicando a ligação funcional entre a entrada de íons de cálcio e produção de NO, enquanto a função fisiológica, tais como fluxo iônico e caminhos de sinalização de pró- sobrevivência, do receptor de NMDA permanece intacta.

[006] Inibição do complexo do receptor de nNOS/PSD-95/NMDA foi previamente obtida com um nonapeptídeo, correspondente à terminação C de GluN2B, fundido no peptídeo da HIV-1 Tat, conhecido por sua capacidade de facilitar a permeabilidade de barreira de membrana e sangue-cérebro. Este peptídeo 20-mero (Tat-NR2B9c; Sequência: YGRKKRRQRRRKLSSIESDV) mostrou propriedades neuroprotetoras promissoras em modelos de rato de dano cerebral isquêmico (Aarts et al., Science 298, 2002, p.846-850, 2002; Sun et al., Stroke 39, 2008, p.2544-2553) e está atualmente em experiências clínicas como um medicamento potencial para o tratamento de isquemia cerebrovascular, visto em acidente vascular cerebral. Entretanto, este composto apresenta baixa afinidade (Ki = 4,6 μM; vide posteriormente) para PDZ1-2 de PSD-95, que potencialmente torna-o um composto ineficiente e não seletivo.

[007] WO2010/004003 descreve ligantes de peptídeo dimérico ligados por um ligante de polietileno glicol (PEG) que simultaneamente liga nos domínios de PDZ1 e PDZ2 de PSD-95 e seu uso para tratamento de isquemia cerebrovascular. Continua haver uma necessidade de inibidores de PSD-95 com uma maior afinidade com domínios de PDZ1 e PDZ2, e que têm um melhor efeito terapêutico in vivo para o tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico e lesão cerebral traumática.

[008] Dor neuropática é causada por dano no sistema nervoso periférico ou central devido a lesão traumática, cirurgia, ou doenças tais como diabetes ou distúrbios autoimunes. Tal dano leva a uma resposta de fase aguda caracterizada por ‘dor nociceptiva’ e inflamação. Em uma grande proporção de pacientes, a dor persiste, a despeito de cura da lesão, resultando em um estado de dor neuropática crônica. Além do envolvimento de inflamação depois de lesão nervosa, dor crônica pode também ser iniciada por inflamação induzida por mediadores liberados por células imunes, que causam uma sensibilização de caminhos da dor. Sensibilização dos neurônios sensoriais espinais (‘aumento crescente da frequência de disparo dos neurônios nociceptivos’’) é um recurso compartilhado de dor neuropática e dor inflamatória crônica, e é evocado por uma ativação prolongada de nociceptores. Os sintomas apresentam como dor ardente espontânea, uma resposta exagerada a estímulos dolorosos (hiperalgesia), e dor em resposta a estímulos normalmente não dolorosos (alodinia). Dor crônica, particularmente em decorrência de lesão nervosa, é insuficientemente administrada por medicamentos atuais tais como opióides e medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs). Antagonistas do receptor de NMDA bloqueiam a sensibilização de respostas a dor e exibem boas propriedades analgésicas em modelos de animal e ambientes clínicos, mas eles são associados com efeitos colaterais inaceitáveis e, portanto, não podem ser usados clinicamente. Dessa maneira, existe uma necessidade de medicamentos alternativos capazes de fornecer melhores tratamentos de dor, particularmente sintomas de dor relacionados a receptor de NMDA, evitando ao mesmo tempo os efeitos colaterais inaceitáveis de medicamentos atuais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Uma primeira modalidade da presente invenção refere-se a um composto compreendendo um primeiro peptídeo ou análogo de peptídeo ligado a um segundo peptídeo ou análogo de peptídeo por um ligante, em que o primeiro e o segundo peptídeos ou análogos de peptídeo compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com uma sequência YTXV ou YSXV, em que: a. Y é selecionado entre E, Q e A, ou um análogo desses, e b. X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me- D e N-Me-N ou um análogo desses, e em que um terceiro peptídeo com a função de um peptídeo de penetração celular (CPP) é ligado ao ligante, em que o terceiro peptídeo compreende pelo menos 4 resíduos de aminoácidos selecionados de arginina e/ou lisina. Preferivelmente, o ligante compreende PEG, em que pelo menos um átomo de oxigênio do PEG é substituído com um átomo de nitrogênio para dar NPEG, e preferivelmente o terceiro peptídeo é ligado ao átomo de nitrogênio do ligante NPEG, preferivelmente por uma ligação de amida.

[010] Uma segunda modalidade da invenção refere-se a um composto compreendendo um primeiro peptídeo ou análogo de peptídeo ligado a um segundo peptídeo ou análogo de peptídeo por um ligante, em que o ligante compreende PEG e em que o primeiro e o segundo peptídeos ou análogos de peptídeo compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com uma sequência YTXV ou YSXV, em que: a. Y é selecionado entre E, Q e A, ou um análogo desses, e b. X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me- D e N-Me-N ou um análogo desses, caracterizado em que um terceiro peptídeo é ligado a uma cadeia lateral de um dos resíduos do primeiro e segundo peptídeos ou análogos de peptídeo, em que o terceiro peptídeo compreende pelo menos 4 resíduos de aminoácidos selecionados de arginina e/ou lisina e tem o função de um peptídeo de penetração celular (CPP).

[011] Em uma modalidade adicional dos compostos anteriores da invenção, o ligante é um ligante PEG compreendendo 1-28 frações de etileno glicol (N=1-28), preferivelmente 4 a 12 frações de etileno glicol (N=4-12), mais preferivelmente 4 a 6 frações de etileno glicol (N=4-6). Em uma modalidade adicional do composto da invenção, o ligante é um PEG-diácido ou um diácido-NPEG, e em que cada grupo carboxila do ligante é ligado ao grupo amino terminal de um resíduo terminal do primeiro ou do segundo peptídeo ou análogo de peptídeo por meio de uma ligação de amida.

[012] Em uma modalidade adicional dos compostos anteriores da invenção, o terceiro peptídeo (CPP) compreende um peptídeo retroinverso. Em uma modalidade adicional dos compostos anteriores da invenção, o terceiro peptídeo (CPP) é peptídeo Tat (YGRKKRRQRRR) ou peptídeo retroinverso-D-Tat (rrrqrrkkr).

[013] Em uma modalidade adicional dos compostos anteriores da invenção, o peptídeo ou análogo de peptídeo tem de 5 a 10 resíduos ligados a amida de comprimento. Em uma modalidade adicional dos compostos anteriores da invenção, o peptídeo é compreendido de pelo menos 4 resíduos de L-aminoácido. Em uma modalidade adicional dos compostos anteriores da invenção, X é selecionado entre A, Q, e D. Em uma modalidade adicional dos compostos anteriores da invenção, o peptídeo ou análogo de peptídeo é N- alquilado.

[014] A presente invenção adicionalmente refere-se a um composto ligante compreendendo um PEG-diácido, em que um átomo de oxigênio do PEG é substituído com um átomo de nitrogênio para dar diácido-NPEG. Em uma modalidade adicional do composto ligante da invenção, o átomo de nitrogênio é ligado a um grupo de proteção.

[015] A presente invenção adicionalmente refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores da invenção para uso como um medicamento. Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores da invenção é para uso na profilaxia e/ou tratamento com uma doença excitotóxica relacionada em um indivíduo.

[016] A presente invenção adicionalmente refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores da invenção para uso na profilaxia e/ou tratamento de dor em um indivíduo.

[017] A presente invenção adicionalmente refere-se a um método de fornecer profilaxia e/ou tratamento com uma doença ou dor relacionada excitotóxica em um indivíduo, compreendendo administrar a composição farmacêutica anterior ao indivíduo, em que a dita doença pode ser lesão isquêmica ou traumática do CNS.

[018] Em uma modalidade adicional, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a profilaxia e/ou tratamento de dor em um indivíduo, a dita composição compreendendo um composto ativo, o dito composto ativo compreende um primeiro peptídeo ou análogo de peptídeo ligado a um segundo peptídeo ou análogo de peptídeo por um ligante, em que o primeiro e o segundo peptídeos ou análogos de peptídeo compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com uma sequência YTXV ou YSXV, em que (a) Y é selecionado entre E, Q e A, ou um análogo desses, e (b) X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D e N-Me-N ou um análogo desses. Em uma modalidade adicional, o ligante no dito composto ativo é um ligante PEG ou um ligante NPEG e compreende 4 a 28 frações de etileno glicol (N=4-28). Em uma modalidade adicional, o grupo carboxila do ligante no dito composto ativo é ligado a um resíduo terminal do primeiro ou do segundo peptídeo ou análogo de peptídeo. Em uma modalidade adicional, o dito composto ativo é selecionado entre PEG4(IETAV)2, NPEG4(IETAV)2, PEG6(IESDV)2, e PEG4(IESDV)2.

[019] O dito composto ativo pode adicionalmente ter um terceiro peptídeo compreendendo pelo menos 4 resíduos de aminoácidos selecionados de arginina e/ou lisina e com a função de um CPP, em que o terceiro peptídeo é ligado ao ligante ou é ligado a uma cadeia lateral de um aminoácido do primeiro e segundo peptídeos ou análogos de peptídeo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[020] Figura 1. PSD-95 liga simultaneamente o receptor de NMDA e nNOS por meio de seus domínios de PDZ1 e PDZ2. Por meio disso, PSD- 95 facilita a ligação funcional entre ativação do receptor de NMDA e produção de NO, uma vez que a entrada de cálcio (Ca2+) do receptor de NMDA ativa nNOS. Inibidores de PSD-95, tal como o ligante dimérico ilustrado que alveja PDZ1-2 de PSD-95, inibem a formação do complexo ternário do receptor de nNOS/PSD-95/NMDA e não acopla a ligação entre atividade do receptor de NMDA e produção de NO, por meio do que neuroproteção contra excitotoxicidade é obtida.

[021] Figura 2. Estruturas químicas de ligantes de PEG4-diácido e 4-diácido-NPEG, e compostos AB125 e AB141 diméricos.

[022] Figura 3. Estruturas químicas de ligantes diméricos AB144 e AB147, fornecendo tanto sua estrutura completa quanto uma apresentação alternativa onde as frações de pentapeptídeo, sequência Tat e sequência retroinversa-D-Tat são escritas em código de aminoácido de 1 letra.

[023] Figura 4. Estrutura química do ligante dimérico fluorescente, AB143 e AB145, que é usado como sondas no ensaio de polarização de fluorescência e/ou usado para estudar permeabilidade de CNS.

[024] Figura 5. Afinidade com relação a PDZ1-2 de PSD-95 medida por polarização de fluorescência (esquerda) e estabilidade em plasma sanguíneo de humano in vitro a 37°C (direita). Constantes de afinidade Ki e meias vidas da estabilidade (T1/2) são listadas na tabela. Dados em tabela e gráfico de polarização de fluorescência (esquerda) representam >3 medições individuais, embora dados representativos de um experimento sejas mostrados no gráfico de plasma sanguíneo (gráfico da direita).

[025] Figura 6. Espectros de correlação 1H-15N (RNM) de AB140 e AB140 livres (contornos: I1, E2, T3, A4, V5) em complexo com PDZ1-2 de PSD-95 (contornos restantes a/b). As designações são mostradas nos espectros. Para a forma ligada do dipeptídeo não foi feita nenhuma tentativa de determinar a qual domínio PDZ os picos ‘a’ e picos ‘b’ ligam, respectivamente.

[026] Figura 7. Propensões de estrutura secundária da forma ligada de AB140 calculadas usando o programa SSP. Um valor de que um indica uma a-hélice completamente formada e um valor de menos que um indica uma estrutura completamente prolongada, enquanto que um valor próximo a zero é indicativo de uma espiral randomizada. Barras pretas correspondem a resíduos etiquetados ‘a’ e barras cinzas correspondem a resíduos etiquetados ‘b’ na figura 6.

[027] Figura 8. Permeabilidade da barreira sangue-cérebro de análogos fluorescentes em camundongos não manipulados. (A) Gráfico de barra da intensidade de fluorescência média de compostos 5-FAM (F) etiquetados, 2 horas depois de injeção intravenosa (i.v.), comparado com camundongos tratados com salina. (B) Detecção de F-Tat-NPEG4(IETDV)2 (AB145) (n=2), F-Retroinverso-D-Tat-NPEG4(IETDV)2 (AB148) (n=2), e F- Tat-NR2B9c (MS23) (n=2) mas não F-NPEG4(IETAV)2 (AB143) (n=2), comparada com camundongos tratados com salina (n=2). F = 5-FAM; Re = Retroinverso. Os dados são apresentados como média ± SEM; */**/***: p<0,05/0,01/0,001 (Mann-Whitney não paramétrico). Barra de escala: 100 μm.

[028] Figura 9. Linha de tempo de experimentos pMCAO. Todos os compostos foram administrados i.v. (3 nmol/g) 30 minutos pós-cirurgia, seguido por um período de sobrevivência tanto de 5,5 quanto de 47,5 horas.

[029] Figura 10. Efeito neuroprotetor de compostos depois de um período de sobrevivência pós-cirúrgico de 6 horas. Gráfico de barra mostrando volumes de infarto médio 6 horas depois de pMCAO. Tratamento de AB144 reduziu significativamente dano cerebral isquêmico comparado com camundongos controles tratados com salina, um efeito que não foi obtido por tratamento com Tat-NR2B9c monomérico (n = 16-19). Os dados são mostrados como média ± SEM; */**/***: p<0,05/0,01/0,001; teste Mann- Whitney não paramétrico.

[030] Figura 11. Efeito neuroprotetor de compostos depois um período de sobrevivência pós-cirúrgico de 48 horas. Manchamento azul de toluidina mostrando o dano cerebral isquêmico 48 horas depois de pMCAO. Barra de escala: 1 mm.

[031] Figura 12. Efeito neuroprotetor de compostos depois um período de sobrevivência pós-cirúrgico de 48 horas. Gráfico de barra mostrando um efeito redutor de infarto mais duradouro de AB144 comparado com camundongos controles tratados com salina, e significativamente infartos menores comparado com camundongos tratados com o Tat-NR2B9c monomérico (n = 16-19). Também, AB147 produziu uma redução de infarto mais duradoura similar a AB144. Os dados são mostrados como média ± SEM; */**/***: p<0,05/0,01/0,001; teste Mann-Whitney não paramétrico.

[032] Figura 13. Parâmetros fisiológicos tais como temperatura (esquerda) e peso corpóreo (direita) foram registrados antes e depois de pMCAO (experimento de 48 horas). Pontos de tempo (eixo x) indicam tempo relativo a cirurgia (0 hora). Gráfico (esquerda) mostrando uma queda induzida por anestesia na temperatura do corpo, 30 minutos depois de pMCAO, que, entretanto, foi registrada antes das injeções i.v.. Não foi registrada nenhuma diferença induzida por medicamento entre grupos 1 e 3 horas depois da cirurgia. Gráfico (direita) mostrando nenhuma diferença em peso corpóreo entre grupos, 3 dias antes e 24 horas e 48 horas depois de pMCAO (0 hora). Dados mostrados como média ± SEM. Anova a dois fatores.

[033] Figura 14. Avaliação função motora de camundongos com sobrevivência pós-cirúrgica de 48 horas. (A) Gráfico de barra mostrando a força de pega média de ambas as patas dianteiras antes (linha de base) e depois de pMCAO. Camundongos tratados com saline e Tat-NR2B9c mostraram baixa força de pega significante quando comparados com linha de base, 48 horas depois de pMCAO. Não foi observada nenhuma diferença comparada com a linha de base em camundongos tratados com AB144 e AB147. (B) Gráfico de barra mostrando a assimetria induzida por isquemia nas patas dianteiras, observada aqui em camundongos tratados tanto com salina quanto com Tat-NR2B9c monomérico, entretanto, não em camundongos tratados com AB144 e AB147. (C) Teste de desempenho Rotarod de quatro experiências (T1-T4), mostrando as habilidades de aprendizado motoras em curto prazo de camundongos 48 horas depois de pMCAO. Dados revelam um componente de aprendizado ao longo das experiências em todos os grupos de camundongos, entretanto, tratamento com AB144 e AB147 dá uma melhoria mais pronunciada (cf. T2) comparada com salina, e maior tolerância comparada com Tat-NR2B9c (Vide texto). (A-C) Todos os dados são mostrados como média ± SEM; */**/***: p<0,05/0,01/0,001; (A-B) teste t de Student pareado; (C) teste de pares casados de Wilcoxon.

[034] Figura 15. Estruturas químicas de análogos de AB144: AB144_B, AB144_C, AB144_D, AB144_E, AB144_H, AB144_I; Mesmo estilo de representação estrutural conforme na figura 3 a seguir.

[035] Figura 16. Esquema 1. Síntese do ligante NPEG A-C em uma forma N protegida (Ns) (ligantes de PEG-diácido Ns-N4), que é usada no processo de dimerização de fabricação de compostos diméricos a base de NPEG. Ligante Ns-N4-PEG-diácido A é usado para AB141, AB144, AB147, AB144_D, AB144_E, AB143, AB145, e AB148. Ligante Ns-N4-PEG- diácido B é usado para AB144_B. Ligante Ns-N4-PEG-diácido C é usado para AB144_C.

[036] Figura 17. Efeito de AB125 no modelo adjuvante de Freund completo de dor inflamatória. Animais foram tratados com CFA intraplantar e AB125 intraperitonealmente (0, 3, 10, ou 30 mg/kg), 24 horas antes do teste. Hiperalgesia/alodinia mecânica foi medida com o método von Frey. Dados são expressos como média ± SEM, mostrando o patamar de remoção da pata relativo aos valores da linha de base (isto é, < 1,0 corresponde a hiperalgesia/alodinia). Camundongos tratados com salina mostraram uma resposta acentuada a CFA, com patamar mecânico reduzido para 36 % da linha de base (###; p < 0,001). Esta redução não foi observada em camundongos tratados com 3, 10, ou 30 mg/kg de AB125. Patamar em camundongos tratados com 3, 10 ou 30 mg/kg de AB125 diferiu significativamente dos camundongos tratados com salina (***: p<0,001).

[037] Figura 18. O efeito de AB125 (a) e MK-801 (b) em hiperalgesia induzida por CFA quando dados simultaneamente com CFA. Para AB125, a ANCOVA revelou um efeito principal significante da linha de base (F1,47=4,61; p=0,037), um efeito principal significante do tratamento (F3,47=5,00; p=0,004), um efeito principal significante do tempo (F1,48=42,02; p<0,001), e nenhum tratamento significante por interação de tempo (F3,48=0,71; p=0,552). Comparações planejadas revelaram que AB125 reverteu significativamente a hiperalgesia induzida por CFA a 3 mg/kg (p=0,012) e 10 mg/kg (p=0,03) depois de 1 hora. Uma reversão significante foi ainda observada depois de 24 horas nos grupos tratados com 3 mg/kg (p=0,008) e 10 mg/kg (p=0,003). Para MK-801, a ANCOVA não revelou nenhum efeito principal significante da linha de base (F1,27=0,03; p=0,86), um efeito principal significante do tratamento (F3,27=9,60; p<0,001), um efeito principal significante do tempo (F1,28=31,14; p<0,001), e nenhum tratamento significante por interação de tempo (F3,28=0,90; p=0,452). Comparações planejadas revelaram que MK-801 reverteu significativamente a hiperalgesia induzida por CFA a 0,1 mg/kg (p=0,004) depois de 1 hora. Uma reversão significante foi ainda observada depois de 24 horas no grupo tratado com 0,1 mg/kg (p<0,001).

[038] Figura 19. O efeito de AB125 quando dado 24 horas depois injeção de CFA. A ANCOVA revelou um efeito principal significante da linha de base (F1,34=15,67; p<0,001), um efeito principal significante do tratamento (F4,34=7,98; p<0,001), um efeito principal significante do tempo (F2,70=24,41; p<0,001), mas nenhum tratamento significante por interação de tempo (F1,70=1,31; p=0,253). Comparações planejadas revelaram uma reversão da hiperalgesia induzida por CFA por 3 mg/kg (p=0,002) e 10 mg/kg (p=0,001) depois de 1 hora. Uma reversão significante foi ainda observada depois de 24 horas nos grupos tratados com 3 mg/kg (p=0,015) e 10 mg/kg (p<0,001). Em 72 horas, a hiperalgesia foi revertida significativamente por todas as doses (1, 3, e 10 mg/kg) (p<0,001).

[039] Figura 20. O efeito de AB125 e MK-801 na ingestão de alimento (A-b) e índice de discriminação (c-D) na transmissão social de teste de preferência de alimento para memória de referência a longo prazo. Para AB125, a ANOVA a 1 fator no índice de discriminação não revelou nenhum efeito principal significante do tratamento (F2,22=0,108; p=0,898). Comparações planejadas não mostraram nenhum efeito significante das doses de AB125 testadas (30 e 60 mg/kg mostrados). Para MK-801, a ANOVA a 1 fator revelou um efeito principal significante do tratamento (F2,21=5,28; p=0,014). Comparações planejadas na média prevista revelaram que 0,1 mg/kg MK-801 reduziu significativamente o índice de discriminação (p=0,005).

[040] Figura 21. O efeito de AB125 e MK-801 no tempo gasto no braço familiar e inédito no labirinto Y modificado (A-b), e no índice de discriminação, DI=(inédito-familiar)/(inédito+familiar) (c-D). Para AB125, a ANOVA a 1 fator não revelou nenhum efeito principal significante de AB125 no índice de discriminação (F3,29=0,85; p=0,478). Comparações planejadas não mostraram nenhum efeito significante das doses de AB125 testadas (30 e 60 mg/kg mostrados). Para MK-801, a ANOVA a 1 fator revelou um efeito significante do tratamento (F3,23=15,43; p<0,001). Comparações planejadas revelaram que o índice de discriminação foi reduzido tanto por 0,05 (p=0,019) quanto por 0,1 mg/kg MK-801 (p<0,001).

[041] Figura 22. Efeito de AB125 e MK-801 no desempenho motor no teste Rotarod. Para AB125 (30 e 60 mg/kg mostrados), a ANOVA RM a dois fatores não mostrou nenhum efeito principal significante do tratamento (F2,48=1,18; p=0,333), nenhum efeito principal significante do tempo (F3,48=0,84; p=479), e nenhum tratamento significante por interação de tempo (F6,48=1,26; p=0,293). Para MK-801, a ANOVA a dois fatores mostrou um efeito principal significante do tratamento (F2,66=55,72; p<0,001), um efeito principal significante do tempo (F3,66=3,69; p=0,016), e um tratamento significante por interação de tempo (F6,66=2,25; p=0,049). Comparação planejada revelou que 0,1 mg/kg MK-801 diminui significativamente o tempo no Rotarod a 15 minutos (p<0,001), 30 minutos (p<0,001), 45 minutos (p<0,001), e 60 minutos (p=0,006).

[042] Figura 23. Efeito de AB144 no modelo adjuvante de Freund completo de dor inflamatória. Animais foram simultaneamente tratados com CFA intraplantar e AB144 intraperitonealmente (0, 3, 10, ou 30 mg/kg), e hiperalgesia/alodinia mecânica foi medida com o método von Frey 1 e 24 horas depois. Os dados são expressos como média ± SEM, mostrando o patamar de remoção da pata relativo aos valores da linha de base (isto é, < 1,0 corresponde a hiperalgesia/alodinia). Camundongos tratados com salina mostraram uma resposta acentuada a CFA, com patamar mecânico reduzido para 25 % da linha de base (###; p < 0,001). Esta redução não foi observada 1 hora depois de administração de AB144/CFA em camundongos tratados com 30 mg/kg de AB144, e a 24 horas depois da administração de AB144/CFA em camundongos tratados com 10 e 30 mg/kg de AB144 (*: p<0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definição de abreviações e termos:

[043] “Um” ou “uma” da maneira aqui usada pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado.

[044] Ligação de amida é formada por uma reação entre um ácido carboxílico e um amina (e eliminação concomitante de água). Onde a reação é entre dois resíduos de aminoácidos, a ligação formada em decorrência da reação é conhecida como um acoplamento de peptídeo (ligação de peptídeo).

[045] Aminoácidos que são proteogênicos são denominados aqui usando tanto seu código de 1 letra quanto de 3 letras de acordo com o recomendações da IUPAC vide, por exemplo, http://www. chem.qmw.ac.uk/iupac. Se nada mais for especificado, um aminoácido pode ser de forma D ou L. Na descrição (mas não na listagem de sequência) um código de 3 letras iniciando com um letra maiúscula indica um aminoácido em forma de L, enquanto que um código de 3 letras em letras minúsculas indica um aminoácido em forma de D.

[046] “Compreendendo” deve ser entendido de uma maneira inclusiva. Consequentemente, a título de exemplo, uma composição compreendendo composto X pode compreender o composto X e opcionalmente compostos adicionais.

[047] CFA, adjuvante de Freund completo.

[048] CNS, sistema nervoso central.

[049] CPP, peptídeo de penetração celular; caracterizado pela capacidade de cruzar a membrana plasmática de células de mamífero e, por meio disso, pode dar origem à distribuição intracelular de moléculas com carga, tais como peptídeos, proteínas, oligonucleotídeos nos quais é ligado;

[050] DCM, Diclorometano;

[051] Inibidor de PSD-95 dimérico, é um inibidor de PSD-95 compreendendo dois peptídeo ou análogos de peptídeo, que são covalentemente ligados por meio de um ligante, capaz de ligar a PDZ1 e PDZ2 de PSD-95 simultaneamente, e interagir com eles consequentemente.

[052] P0, definido como o primeiro resíduo de aminoácido ou análogo correspondente ao aminoácido da terminação C do peptídeo/análogo de peptídeo;

[053] P-1, definido como o segundo resíduo de aminoácido ou análogo deste contando a partir do aminoácido da terminação C do peptídeo/análogo de peptídeo.

[054] P-2, definido como o terceiro resíduo de aminoácido ou análogo deste contando a partir do aminoácido da terminação C do peptídeo/análogo de peptídeo.

[055] P-3, definido como o quarto resíduo de aminoácido ou análogo deste contando a partir do aminoácido da terminação C do peptídeo/análogo de peptídeo.

[056] P-4, definido como o quinto resíduo de aminoácido ou análogo deste contando a partir do aminoácido da terminação C do peptídeo/análogo de peptídeo.

[057] P-5, definido como o sexto resíduo de aminoácido ou análogo deste contando a partir do aminoácido da terminação C do peptídeo/análogo de peptídeo.

[058] DIPEA, di-isopropiletilamina.

[059] DMF, N,N-dimetilformamida.

[060] Fração de etileno glicol, aqui refere-se à unidade estrutural que constitui um ligante PEG ou NPEG. Um nome mais técnico de uma ‘fração de etileno glicol’ é ‘oxietileno’, e a fórmula química da unidade é aqui mostrada:

[061] FP, polarização de fluorescência.

[062] HATU, hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametilurônio.

[063] HBTU, hexafluorfosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio.

[064] Célula de mamífero visa indicar qualquer célula de origem mamífera. A célula pode ter uma linhagem celular estabelecida, muitas das quais são da The American Type Culture Collection (ATCC, Virgínia, USA) ou uma célula primária com um período de vida prolongado derivada de um tecido de mamífero, incluindo tecidos derivados de um animal transgênico, ou uma linhagem celular imortal estabelecida recém-derivada de um tecido de mamífero incluindo tecidos transgênicos, ou uma célula híbrida ou linhagem celular derivada fundindo diferentes tipos de célula de origem mamífera, por exemplo, linhagens celulares de hibridoma. As células podem opcionalmente expressar um ou mais produtos genéticos não ativos, por exemplo, receptores.

[065] MCAO, oclusão de artéria cerebral média.

[066] nNOS, sintase do óxido nítrico neuronal.

[067] NO, óxido nítrico

[068] NMDA, N-metil-D-aspartato.

[069] RNM, ressonância magnética nuclear.

[070] NPEG, é o tipo de ligante inédito descrito aqui, que é derivado do ligante PEG clássico, mas onde um ou mais dos átomos de oxigênio da espinha dorsal são substituídos com um átomo de nitrogênio.

[071] Ns, orto-nitrobenzenossulfonila (algumas vezes abreviada oNBS).

[072] PDZ, Proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95), supressores de tumor de discos grandes homólogos de Drosophila (DlgA), proteína da zônula de oclusão 1 (zo-1).

[073] PEG, polietileno glicol; PEG é um polímero de etileno glicol com a fórmula química C2n+2H4n+6On+2, e a estrutura de repetição: onde, por exemplo, 12 frações de PEG, ou PEG12, corresponde a um polímero de 12 frações de etileno glicol (n=12).

[074] PPIs, interações proteína-proteína.

[075] PSD-95, proteína de densidade pós-sináptica 95.

[076] Inibidor de PSD-95 é um composto que liga a PDZ1, PDZ2, ou tanto a PDZ1 quanto PDZ2 de PSD-95 e inibe o sPPIs que são facilitados por esses domínios de PDZ na célula. Um exemplo de uma interação que é inibida por um inibidor de PSD-95 é o complexo ternário de nNOS, PSD-95 e receptor de NMDA.

[077] Retroinverso, peptídeos retroinversos são compostos de aminoácido D montados na ordem inversa daquela da sequência de aminoácido L pai.

[078] Sequência retroinverso-D-Tat, uma sequência CPP de 9- mero produzida revertendo a sequência Tat e usando aminoácido D (rrrqrrkkr), que facilita permeabilidade através de membranas biológicas, incluindo a barreira sangue-cérebro, e cuja estrutura a torna estável para enzimas de protease.

[079] SEM, erro padrão da média.

[080] Sequência Tat, uma sequência CPP de 11-mero (YGRKKRRQRRR) derivada da proteína Tat do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), que facilita permeabilidade através de membranas biológicas, incluindo a barreira sangue-cérebro.

[081] TFA, ácido trifluoracético.

[082] THF, tetraidrofurano.

[083] TIPS, tri-isopropilsilano.

I. Estrutura química de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP

[084] A invenção refere-se a um inibidor de PSD-95 dimérico compreendendo um primeiro peptídeo ou análogo de peptídeo ligado a um segundo peptídeo ou análogo de peptídeo por um ligante, em que o primeiro e o segundo peptídeos ou análogos de peptídeo compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com a sequência YTXV ou YSXV, em que Y é selecionado entre E, Q e A, ou um análogo do resíduo selecionado, e X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D e N-Me-N ou um análogo do resíduo selecionado. O inibidor de PSD-95 dimérico é adicionalmente caracterizado em que um terceiro peptídeo é ligado ao inibidor, o dito terceiro peptídeo sendo um CPP com propriedades de penetração celular.

I.i O ligante do Inibidor de PSD-95 dimérico

[085] O primeiro e segundo peptídeos ou análogos de peptídeo do inibidor de PSD-95 dimérico são ligados entre si por meio de um ligante. Ligantes adequados incluem um ligante compreendendo NPEG, polietileno glicol (PEG); poliamina (Hervé F et al, AAPS J, 2008, p.455); ácido nucleico do peptídeo (PNA) (Egholm et al., 2005 Nature 365, p.566); ácido nucleico bloqueado (LNA) (Singh et al., 1998, Chem. Commun., p.455); triazóis, piperazinas, oximas, tiazolidinas, sistemas de anel aromático, alcanos, alcenos, alcinos, alcanos cíclicos, alcenos cíclicos, amidas, tioamidas, éteres, e hidrazonas. Quando o ligante é um Ligante de PEG (ou NPEG) ele pode também compreender um grupo funcional ativo, tal como um grupo funcional eletrofílico ou nucleofílico (WO/2007/140282), que pode ser usado para anexar o ligante PEG em cada inibidor de peptídeo (ou análogo de peptídeo). Grupos funcionais adequados para anexação incluem grupos eletrofílicos amino reativos, selecionados entre éster N-hidroxissucinimida (NHS), éster p- nitrofenílico, carbonato de sucinimidila, carbonato de p-nitrofenila, uretano de sucinimidila, isocianato, isotiocianato, acil azida, cloreto de sulfonila, aldeído, carbonato, imidioéster ou anidreto; e grupos tio reativo selecionados entre maleimida, haloacetila, derivados de haleto de alquila, aziridina, agentes arilantes derivados de acriloíla ou reagentes de troca tio-dissulfeto. Os grupos funcionais nucleofílicos adequados incluem amina, hidrazida, carbazato, acil hidrazida, semicarbamato ou hidrazina, que podem passar por reações com grupo aldeído ou carboxila no inibidor de peptídeo ou análogo de peptídeo.

[086] O comprimento ideal de ligante no inibidor de PSD-95 dimérico dependerá do ligante selecionado. Quando o ligante é PEG, o número de frações de etileno glicol (n) de PEG pode ficar entre n=1-28 ou n=4-28, ou o ligante pode ter um comprimento de n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Diácidos PEG podem ser usados para ligar ligantes (peptídeos ou análogos de peptídeo), onde, por exemplo, o ligante PEG4 é modificado de forma que dois grupos de ácido carboxílico estão presentes em cada extremidade do ligante. Assim, um ligante PEG4-diácido antes do processo de dimerização é chamado ácido 4,7,10,13,16-pentaoxanonadecano-1,19-dióico. Durante a dimerização do primeiro e segundo peptídeos ou análogos de peptídeo do inibidor com o ligante, os dois grupos de ácido carboxílico reagem com os grupos amino da terminação N dos peptídeos (ou análogos de peptídeo) para criar ligações de amida. Os ligantes PEG 0, 1, 2, 4, 6, 8 e 12 são de acordo com esta descrição.

[087] De acordo com uma primeira modalidade do inibidor de PSD- 95 dimérico, o ligante compreende um derivado de um ligante PEG-diácido, denominado NPEG, em que um átomo de oxigênio na espinha dorsal do ligante PEG-diácido é substituído com um átomo de nitrogênio. O átomo de nitrogênio pode ser substituído por qualquer um dos átomos de oxigênio na espinha dorsal do ligante PEG. Os grupos carbonila do ligante NPEG-diácido são ligados ao primeiro e segundo peptídeos ou análogos de peptídeo respectivamente, preferivelmente onde a ligação é uma ligação de amida em um resíduo terminal do peptídeo ou análogo de peptídeo.

[088] A figura 2 exemplifica um ligante NPEG da invenção, isto é, o ligante NPEG4-diácido, onde o átomo de oxigênio central é substituído com nitrogênio para gerar um ligante NPEG simétrico, para uso no inibidor dimérico (por exemplo, AB141). A figura 15 exemplifica um ligante NPEG em um inibidor dimérico da invenção onde o átomo de oxigênio localizado na espinha dorsal do ligante PEG, que é substituído com nitrogênio, é tanto uma quanto duas “frações de etileno glicol” fora do centro do ligante, dando um ligante NPEG assimétrico (por exemplo, como em AB144_B e AB144_C).

[089] O ligante tem funções. Ele serve para ligar o primeiro e segundo peptídeos ou análogos de peptídeo do inibidor, cuja função é agir como ligação dos ligantes ao PDZ1-2 de PSD-95. A afinidade dos peptídeos/análogos de peptídeo do inibidor com o PDZ1-2 de PSD-95 é bastante aumentada por dimerização. Adicionalmente, o átomo de nitrogênio no ligante NPEG serve como um ‘separador’ químico para derivação adicional (Figura 2 e 3).

[090] De acordo com uma segunda modalidade do inibidor de PSD- 95 dimérico, o ligante compreende PEG-diácido, com um comprimento de 1 a 28 frações de etileno glicol (n=1-28), preferivelmente de 1 a 12 frações de etileno glicol (n=1-12), mais preferivelmente de 4 a 6 frações de etileno glicol (n=4-6). A figura 2 exemplifica o ligante PEG, isto é, o ligante PEG4-diácido. I.ii O peptídeo ou análogo de peptídeo do inibidor de PSD-95 dimérico

[091] De acordo com a primeira ou segunda modalidade do inibidor de PSD-95 dimérico, o peptídeo ou análogo de peptídeo é 10, 9, 8, 7 ou 6 resíduos ligados a amida de comprimento, mais preferivelmente 5 ou 4 resíduos de comprimento ligados a amida. O peptídeo ou análogo de peptídeo pode compreender pelo menos 4 resíduos de aminoácidos L. Preferivelmente o resíduo X no inibidor é selecionado entre A, Q, e D. Análogos adequados de resíduo Y ou X, ou análogos de qualquer um dos 4 resíduos ligados a amida (YTXV ou YSXV), ou análogos de suas ligações de amida conectando-os, incluem: aminoácido D, aminoácidos peptóide, e-aminoácidos, ligações duplas olefínicas (E-vinil), retroamidas, a-azapeptídeos, tioésteres, ésteres (depsipeptídeos), substituição carba de carbonila (metilaminas), grupos metiltio, alcanos, cetometilenos, hidroxietilenos, hidroxietilaminas, hidroxietiluréias, fluoretos de vinila (Chemistry & Biochemistry of amino acid, peptides, and proteins”, vol 7, 1983, Boris Weinstein, Ch.5 by Arno F. Spatola); tioamidas (Bach et al., J. Med. Chem., 2011, p. 1333); o aza-@- unidade (fração de 5-di-idro-2(3H)-pirazona), particularmente posição P-1 ou P-3 correspondente ao resíduo X ou Y (Hammond et al, Chem. Biol., 2006, p.1247); onde a escolha do análogo pode ser auxiliada por uso de o ferramentas e ensaios para uma abordagem peptidomimética conforme descrito aqui. Adicionalmente, um resíduo do primeiro e/ou segundo peptídeo ou análogo de peptídeo do inibidor de PSD-95 dimérico pode ser N-alquilado, em que o resíduo N-alquilado é na posição P-3 correspondente ao resíduo Y (WO2010/004003). O grupo N-alquila pode ser selecionado entre N-metila, N-etila, N-propila, N-butila, e N-benzila. Um grupo N-alquila particularmente adequado pode ser selecionado entre N-cicloexilmetila, N-cicloexiletila, N- feniletila, N-fenilpropila, N-(3,4-diclorofenil)propila, N-(3,4- difluorfenil)propila, N-(naftaleno-2-il)etila.

[092] A figura 2 exemplifica um inibidor de PSD-95 dimérico com um ligante de acordo com a primeira ou segunda modalidade da invenção, compreendendo um pentapeptídeo dimerizado IETAV e tanto um ligante PEG, como em PEG4(IETAV)2 (AB125) quanto um ligante NPEG, como em NPEG4(IETAV)2 (AB141).

I.iii O peptídeo CPP do inibidor de PSD-95 dimérico

[093] O Inibidor de PSD-95 dimérico de acordo com a primeira ou segunda modalidade, compreende adicionalmente um terceiro peptídeo que tem as propriedades de um CPP. Este terceiro peptídeo CPP compreende pelo menos 4 resíduos de aminoácidos D ou L, mas pode ser 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de comprimento de aminoácidos D ou L. Um CPP preferido tem uma estrutura policatiônica e compreende pelo menos 4 resíduos de lisina, ou pelo menos 4 resíduos de arginina, ou pelo menos 4 resíduos compreendendo tanto resíduos de lisina quanto de arginina (por exemplo, peptídeo Tat; poliarginina peptídeos, tais como 8 argininas; SynB1: RGGRLSYSRRRFSTSTGRA), ou pelo menos 4 aminoácidos com cadeias laterais catiônica ou básicas que são análogos da arginina ou lisina, tais como, por exemplo, ácido 5-hidroxilisina, ornitina, 2-amino-3 (ou-4)- guanidinopropiônico, e homoarginina. Um CPP alternativo tem um estrutura anfipática e compreende um padrão alternado de aminoácidos polares/carregados e não polares, aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, penetratina: RQIKIWFQNRRMKWFF; retroinverso-penetratina: kkwkmrrnqfwvrvqr; peptídeo modelo anfipático: KLALKLALKLAKAALKA).

[094] A figura 3 exemplifica um inibidor dimérico com um ligante de acordo com a segunda modalidade da invenção, compreendendo um pentapeptídeo dimerizado IETDV, um ligante NPEG, e um peptídeo CPP. O CPP é tanto Tat (Sequência: YGRKKRRQRRR; código de aminoácido de 1 letra), como em Tat-NPEG4(IETDV)2 (AB144), quanto Retroinverso-D-Tat (Sequência: rrrqrrkkr; código de aminoácido D de 1 letra), como em Retroinverso-D-Tat-NPEG4(IETDV)2 (AB147).

I.iv Ligação do peptídeo CPP ao Inibidor de PSD-95 dimérico

[095] O inibidor de PSD-95 dimérico de acordo com a primeira modalidade, compreende um CPP que é ligado ao inibidor por meio de uma ligação química, tanto direta quanto indiretamente, ao átomo de nitrogênio na espinha dorsal do ligante NPEG, onde o átomo de nitrogênio pode ser posicionado simétrica ou assimetricamente no ligante. Ligação do CPP ao nitrogênio do ligante NPEG pode ser mediada por meio de uma ligação de amida, um acoplamento de maleimida, uma ligação de dissulfeto, ou grupos eletrofílicos amino reativos, selecionados entre N-hidroxisuccinimida (NHS) éster, éster p-nitrofenílico, carbonato de sucinimidila, carbonato de p- nitrofenila, uretano de sucinimidila, isocianato, isotiocianato, acil azida, cloreto de sulfonila, aldeído, carbonato, imidioéster ou anidreto; e grupos tio reativos selecionados entre haloacetila, derivados de haleto de alquila, aziridina, agentes arilantes derivados de acriloíla.

[096] Alternativamente, ligação do CPP ao nitrogênio do ligante pode ser mediada por meio de um grupo espaçador, onde um grupo espaçador adequado pode, por exemplo, ser qualquer aminoácido tais como cisteína, glicina, alanina; cadeias de alcano pequenas ou cadeias de PEG/NPEG pequenas.

[097] As figuras 3 e 15 exemplificam inibidores diméricos compreendendo um pentapeptídeo dimerizado IETDV, um ligante NPEG, e um CPP. O CPP pode ser ligado por uma ligação de amida a um ligante NPEG simétrico, como em AB144 e AB147; ou ele pode ser ligado por uma ligação de amida a um ligante NPEG simétrico, como em AB144_B e AB144_C. Alternativamente, um CPP compreendendo um Cys da terminação C pode ser ligado por meio de um acoplamento de maleimida a um grupo maleimida estendendo-se do átomo de nitrogênio de NPEG, como em AB144_D. Alternativamente, um CPP compreendendo um Cys da terminação C pode ser ligado por meio de uma ligação de dissulfeto (S-S) a um grupo sulfidrila estendendo-se d o átomo de nitrogênio de NPEG, como em AB144_E.

[098] O inibidor de PSD-95 dimérico de acordo com a segunda modalidade, compreende um ligante PEG, e o CPP que é ligado a uma cadeia lateral tanto do primeiro de segundo peptídeo quanto do análogo de peptídeo. O CPP pode ser ligado a uma cadeia lateral de um resíduo (por exemplo, um aminoácido) na posição P-1 tanto do primeiro do segundo peptídeo quanto do análogo de peptídeo. Preferivelmente, o CPP é anexado na cadeia lateral de um resíduo > P-4, ou mais preferivelmente um P-5 ou P-6 (por exemplo, aminoácido) de um primeiro ou segundo peptídeo ou análogo de peptídeo. Ligação do CPP na cadeia lateral do resíduo pode ser mediada por meio de uma ligação de amida, um acoplamento de maleimida, uma ligação de dissulfeto, ou grupos eletrofílicos amino reativos, selecionados entre N- hidroxisuccinimida (NHS) éster, éster p-nitrofenílico, carbonato de sucinimidila, carbonato de p-nitrofenila, uretano de sucinimidila, isocianato, isotiocianato, acil azida, cloreto de sulfonila, aldeído, carbonato, imidioéster ou anidreto; e grupos tio reativos selecionados entre haloacetila, derivados de haleto de alquila, aziridina, agentes arilantes derivados de acriloíla.

[099] A figura 15 exemplifica inibidores diméricos compreendendo um pentapeptídeo dimerizado KETDV, um ligante PEG, e um CPP ligado a um aminoácido P-4 (lisina) de um primeiro peptídeo (pentapeptídeo), como em AB144_H. Em AB144_I o CPP é anexado na cadeia lateral do aminoácido P-5 de um primeiro peptídeo (KIETDV, hexapeptídeo).

II. Afinidade do ligante de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP

[0100] Todos os inibidores de PSD-95 diméricos da presente invenção têm uma afinidade com o PDZ1-2 de PSD-95 na faixa nanomolar (Exemplo 5), tornando-os inibidores altamente potentes (Figura 5 e Tabela 2). Um CPP, ligado aos inibidores de PSD-95 diméricos da invenção, é introduzido a fim de melhorar o transporte do inibidor através da barreira sangue-cérebro. Surpreendentemente, a ligação de um CPP no inibidor de PSD-95 dimérico também melhora sua afinidade com o PDZ1-2 de PSD-95. Isto é exemplificado por AB144 e AB147 (Ki = 4,6 ± 0,3 e 5,1 ± 0,4 nM, respectivamente), que mostraram uma afinidade 2 vezes maior com relação a AB141 (Ki = 9,3 ± 1 nM), e uma afinidade 1.000 vezes maior relativo ao peptídeo monomérico Tat-NR2B9c (Ki = 4600 ± 300 nM). A afinidade do inibidor de PSD-95 dimérico com o PDZ1-2 de PSD-95 é um fator crítico na redução da concentração do patamar de medicamento necessário para obter um efeito terapêutico, que é particularmente importante quando o medicamento deve cruzar a barreira sangue-cérebro (BBB) para alcançar seu alvo, uma vez que a BBB tenderá limitar o acúmulo de concentração do medicamento no alvo. Surpreendentemente, uma comparação dos inibidores de PSD-95 diméricos revela que a posição e tipo de acoplamento do CPP no inibidor de PSD-95 dimérico é um determinante chave na obtenção do grau mais alto de afinidade com PDZ1-2 de PSD-95. Assim, o acoplamento do CPP por meio de uma ligação de amida a um átomo de nitrogênio de um substituinte de NPEG do ligante PEG aumenta a afinidade com PDZ1-2 de PSD-95 duas vezes com relação a outras formas de acoplamento no substituinte de NPEG do ligante PEG, tal como acoplamento de ligação de dissulfeto ou acoplamento de maleimida. Além disso, acoplamento da ligação de amida do CPP a um átomo de nitrogênio de um substituinte de NPEG do ligante PEG também aumenta a afinidade com PDZ1-2 de PSD-95 mais que duas vezes com relação ao acoplamento da ligação de amida do CPP no primeiro ou segundo peptídeo.

[0101] Os inibidores de PSD-95 diméricos da presente invenção ligam PDZ1 e PDZ2 simultaneamente, que pode ser responsável por sua alta afinidade com esses domínios. Estudos RNM (Exemplo 7) confirmam uma estequiometria de ligação 1:1 e demonstram inequivocadamente que tanto o primeiro quanto segundo peptídeo do inibidor de PSD-95 dimérico ligam igualmente PDZ1 ou PDZ2 em PDZ1-2 de um modo de ligação verdadeiramente bivalente.

[0102] N-alquilação na posição P-3 do primeiro ou segundo peptídeo ou análogo de peptídeo do inibidor de PSD-95 dimérico pode ser usada para aumentar adicionalmente a afinidade de um peptídeo ou análogo de peptídeo com um ou mais domínios de PDZ alvos, por meio disso, aumentando sua capacidade de impedir interações PPI que ocorrem com o dito alvo.

III. Estabilidade do plasma sanguíneo de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP

[0103] Os inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP da presente invenção mostram uma suscetibilidade bastante reduzida a degradação em plasma sanguíneo de humano. Esta maior estabilidade notável é observada para inibidores compreendendo o CPP Tat nativo, e o Retroinverso-D-CPP Tat, que foi efetivamente não degradável, ilustrando o efeito de introduzir um CPP com protease estável no inibidor de PSD-95 dimérico (Exemplo 6).

IV. Permeabilidade da barreira sangue-cérebro de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP

[0104] Os inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP da presente invenção, a despeito do tamanho molecular relativamente grande desses inibidores de peptídeo, têm a capacidade de cruzar a barreira sangue-cérebro, que é importante para sua função terapêutica como um neuroprotetor no cérebro de um mamífero. Esta propriedade é exemplificada para os inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP, AB144 e AB147 que contêm Tat ou retroinverso-D-CPP Tat (Exemplo 8).

V. Propriedades neuroprotetoras IN VIVO de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP V.i Inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP reduz volumes de infarto em indivíduos com isquemia cerebral focal.

[0105] Os inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP da presente invenção, quando administrados a um indivíduo que sofre de isquemia cerebral focal, podem reduzir significativamente dano no tecido isquêmico. O efeito terapêutico desses inibidores de PSD-95 diméricos foi demonstrado em um modelo de isquemia cerebral focal pMCAO em camundongos adultos, onde os inibidores foram injetados intravenosamente depois do insulto, seguido por um período de sobrevivência pós-cirúrgico de 6 horas ou 48 horas, depois do que o volume do infarto foi medido (Exemplo 9). A eficácia demonstrada dos inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP como um neuroprotetor in vivoé devido ao efeito sinergístico de sua alta afinidade com seu alvo (afinidade nanomolar com domínio PDZ1-2 de PSD-95), sua permeabilidade da barreira sangue-cérebro, e sua alta estabilidade in vivo.

[0106] Estudos controles confirmaram que o efeito terapêutico observado na administração de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP em camundongos com isquemia cerebral focal não é devido aos efeitos secundários devido à manipulação dos camundongos e seu tratamento (Exemplo 9).

V. ii inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP melhoram a função motora em indivíduos com isquemia cerebral focal.

[0107] Isquemia cerebral focal induzida por pMCAO em camundongos afeta áreas cerebrais corticais que controlam o membro dianteiro e traseiro contralateral incluindo as patas. A administração de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP da invenção a camundongos são submetidos a pMCAO preserva sua função motora. Observou-se que os camundongos tratados mantiveram sua força de pega total (ambas as patas) e sua análise de força de pega não mostrou nenhuma assimetria entre as patas dianteiras direita e esquerda, consistente com um efeito neuroprotetor. Além disso, testes de desempenho Rotarod mostraram que os camundongos tratados mostraram maior habilidade de aprendizado a curto prazo e o tempo total gasto na haste foi significativamente maior (Exemplo 10). Essa função motora e habilidades de aprendizado melhoradas conferidas por tratamento com inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP da invenção fornece evidência adicional do valor terapêutico desses medicamentos.

VI. Ferramentas para monitorar e avaliar as propriedades inibidoras dos inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP da invenção

[0108] VI.i. Ensaio de Polarização de Fluorescência (FP): conforme descrito a seguir, o exemplo 1 fornece um modo conveniente e confiável de monitorar e avaliar as propriedades inibidoras de um inibidor de PSD-95 da invenção. O ensaio de FP permite que uma ampla faixa de análogos de peptídeo seja testada e comparada com relação a sua interação com domínios de PDZ, e sua especificidade com relação ao tandem PDZ1-2 de PSD-95. PDZ1-2 é expressa usando tecnologia de DNA recombinante padrão conhecida pelos versados na técnica. Purificação do domínio PDZ1-2 expresso pode ser facilitada pela inclusão de uma etiqueta de afinidade (por exemplo, etiqueta de poli-histidina, etiqueta de glutationa-S-transferase, ou etiqueta de anticorpo tal como etiqueta FLAG) na proteína expressa compreendendo o domínio PDZ (por exemplo, proteína de fusão), e o uso de uma resina de afinidade para purificar proteínas do domínio PDZ etiquetadas seletivas.

[0109] Mais especificamente, o ensaio baseado em um ensaio de ligação de competição heteróloga, onde a afinidade medida como IC50 de um dado análogo de peptídeo (não fluorescente) para um domínio PDZ é medida na presença de uma concentração fixada de um ligante dimérico etiquetado fluorescente (AB143; Figura 4). Os valores IC50 determinados são convertidos em valores Ki (Nikolovska-Coleska et al, Anal. Biochem. 2004, 332, p. 261273). O fluoróforo 5-FAM pode ser anexado no ligante dimérico por acoplamento com HATU ou HBTU. AB143 é uma sonda de alta afinidade (Kd = 7,8 nM), por meio disso permitindo medições de Ki precisas de ligantes não etiquetados com afinidades na mesma faixa (baixas afinidades nanomolares).

[0110] VI.ii. Permeabilidade da barreira sangue-cérebro. Etiquetados fluorescentes para permear a barreira sangue-cérebro e por meio disso entrar no cérebro. Depois da injeção dos compostos, os camundongos são perfundidos com paraformaldeído e os cérebros são cuidadosamente removidos, pós-fixados em paraformaldeído, processados nas seções coronais, e quantificados para fluorescência (Exemplo 8).

[0111] VI.iii. pMCAO. Acidente vascular cerebral experimental, isto é, oclusão MCA permanente (pMCAO), visa provocar um condição patológica similar àquela vista em humanos, com o objetivo primário de estudar processos celulares básicos ou de desenvolver novas terapias para tratamento de acidente vascular cerebral. Estudos mostraram que oclusão direta da parte distal de MCA em camundongos é uma técnica altamente reprodutível e associada com baixa mortalidade. O MCA é eletrocoagulado através de uma pequena craniotomia, resultando em um infarto cortical unilateral na lâmina I-VI das córtices frontais e parietais. Os volumes de infarto obtidos após pMCAO são altamente reprodutíveis, que torna este modelo bem adequado para investigar o efeito terapêutico de novas estratégias de tratamento.

[0112] VI.iv. Testes Comportamentais. Um teste comportamental tem que ser sensível o bastante para detectar as incapacidades dos animais, e dar resultados que possam ser reproduzidos e explicados a partir do que é conhecido a respeito da condição. A lesão de acidente vascular cerebral induzida por pMCAO em camundongos afeta as áreas cerebrais corticais que controlam os membros dianteiro e traseiro contralaterais, incluindo as patas, assim, testes de comportamento (por exemplo, Rotarod e teste de pega) podem ser usados para determinar a função motora dos camundongos.

VII. Métodos para sintetizar e caracterizar inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP da invenção

[0113] VII.i Síntese de peptídeo: Síntese de peptídeo de fase sólida baseado em Fmoc (SPPS) fornece um procedimento adequado para a síntese das frações de peptídeo de ligação de PDZ e CPPs, por meio do que um inibidor de PSD-95 dimérico da invenção pode ser preparado, e para produção dos compostos de controle monomérico. Peptídeos com um resíduo de aminoácido da terminação C natural, tal como Val, podem ser sintetizados iniciando com resinas Wang pré-carregadas. No caso de peptídeos com uma cisteína da terminação C, então uma resina do cloreto de 2-clorotritila pode ser usada, onde o resíduo é carregado na resina usando di-isopropiletilamina (DIPEA) (resina/aminoácido/DIPEA em 1:3:10) em DCM por 2 horas, então capeado com metanol, antes de desproteção e acoplamento de Fmoc do resíduo de aminoácido consecutivo. Uma descrição detalhada de um protocolo adequado de SPPS a base de Fmoc é dada a seguir no exemplo 1. Métodos para N-alquilação de peptídeos são descritos em WO2010/004003.

[0114] VII.ii Síntese de ligante NPEG: Ligantes de Ns-NPEG4- diácido são sintetizados por química de fase sólida, conforme descrito no exemplo 1. A presente invenção refere-se a um ligante compreendendo um PEG-diácido, em que um átomo de oxigênio na espinha dorsal do ligante PEG-diácido é substituído com um átomo de nitrogênio para dar diácido- NPEG. Em uma modalidade adicional, o átomo de nitrogênio do diácido- NPEG é ligado a um grupo de proteção. Grupos de proteção adequados incluem o-nitrobenzenossulfonila (abreviado: oNBS ou Ns), p- nitrobenzenossulfonila (pNBS), 2,4-dinitrobenzenossulfonila (dNBS). Também outros grupos de N-proteção podem ser usados tais como α,α- dimetil-3,5-dimetoxibenzilixicarbonila (Ddz), 2-nitrofenilsulfenila (Nps), 2- (4-bifenil)isopropoxicarbonila (Bpoc), trifenilmetila (tritila, Trt), benzilixicarbonila (Z), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), 1-(4,4-dimetil-2,6- dioxocicloex-1-ilideno)-3-etil (Dde), 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxocicloex-1- ilideno)-3-metilbutila (ivDde), 2,2,2-tricloroetiloxicarbonila (Troc), alilixicarbonila (Alloc), p-nitrobenzilixicarbonila (pNZ), o- nitrobenzilixicarbonila (oNZ) e 6-nitroveratrilixicarbonila (NVOC), azidometoxicarbonila (Azoc), terc-butilixicarbonila (Boc), carbamato de 2- trimetilsililetil (Teoc) e 2-clorobenzilixicarbonila (Cl-Z)

[0115] O número de frações de etileno glicol (n) no PEG e diácido- NPEG pode ficar entre n1-28, ou o ligante pode ter um comprimento de n= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 frações de etileno glicol.

[0116] VII.iii Síntese de Ligantes Diméricos: Ligantes diméricos podem ser produzidos ativando os ligantes de Ns-NPEG4-diácido ou ligante PEG4-diácido in situ com reagentes de acoplamento tais como HBTU e HATU, seguido por incubação com o grupo amino terminal N do ligante de peptídeo ligado a resina. Usando este procedimento, o procedimento de dimerização é limitado a uma reação da etapa A.

[0117] VII.iv Análise química: Os compostos são analisados por ESI- LC/MS, HPLC analítico, e espectrometria de massa de alta resolução, empregando técnicas bem conhecidas pelos versados, e exemplificados no exemplo 1.

VIII. Inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP de acordo com a primeira ou segunda modalidade da invenção para tratamento terapêutico de distúrbios excitotóxicos relacionados tal como acidente vascular cerebral isquêmico ou lesão traumática

[0118] Em sinapse neuronal, a terminação C das subunidades do receptor de NMDA interagem com domínios de PDZ de PSD-95 ligando-os nas moléculas de sinalização neurotóxicas à jusante (por exemplo, nNOS) levando a produção de NO e excitotoxicidade. A presente invenção refere-se a inibidores que podem bloquear receptores de NMDA e nNOS interagindo em uma célula, sem prejudicar as correntes iônicas do receptor de NMDA e funções de sinalização de cálcio do receptor de NMDA. Assim, um inibidor de PSD-95 dimérico contendo CPP da invenção age como um neuroprotetor de uma ou mais células ou tecidos fornecendo uma estratégia específica para tratar distúrbios excitotóxicos, incluindo lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, lesão cerebral traumática, lesão isquêmica do sistema nervoso central (CNS), epilepsia, doenças neurodegenerativas do CNS.

[0119] Tratamento terapêutico com indivíduos em risco ou que sofrem atualmente dos distúrbios e doenças citados pode ser feito tanto pelo tratamento profilático para reduzir o risco do início de ação do distúrbio ou doença quanto tratamento terapêutico após o início de ação do distúrbio ou doença. O indivíduo pode ser um paciente mamífero ou humano.

IX. Inibidores de PSD-95 diméricos para tratamento terapêutico de tratamento de dor

[0120] É surpreendentemente mostrado que inibidores de PSD-95 diméricos da presente invenção são efetivos na redução de dor em um indivíduo (paciente mamífero ou humano) e, além disso, que esses inibidores podem ser usados em tratamento terapêutico uma vez que eles não causam nenhum efeito colateral deletério simultâneo na função cognitiva e motora do indivíduo. A dor a ser tratada pode ser dor crônica, que pode ser dor neuropática crônica ou dor inflamatória crônica. A dor neuropática pode ser induzida por dano no sistema nervoso periférico ou central em decorrência de lesão traumática, cirurgia, ou doenças tais como diabetes ou distúrbios autoimunes. Onde a dor persiste a condição é dor neuropática crônica. Dor inflamatória crônica pode ser induzida por inflamação depois de lesão nervosa, bem como ser iniciada por inflamação induzida por matéria estranha, onde mediadores liberados por células imunes causam uma sensibilização de caminhos da dor, isto é, um "aumento crescente da frequência de disparo dos neurônios nociceptivos" de neurônios sensoriais localizados na medula espinhal. Assim, um medicamento analgésico efetivo deve ser capaz de alcançar o tecido da medula espinhal e encontrar seu alvo, neste caso PSD-95, a fim de ter um efeito de alívio da dor. Por meio disso, os compostos devem ser capazes de passar a barreira sangue-cérebro e/ou barreira sangue-medula espinhal para poder alcançar o tecido da medula espinhal. Um inibidor de PSD-95 dimérico adequado para tratar dor crônica compreende um primeiro peptídeo ou análogo de peptídeo ligado a um segundo peptídeo ou análogo de peptídeo por um ligante, em que o primeiro e o segundo peptídeos ou análogos de peptídeo compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com a sequência YTXV ou YSXV, em que Y é selecionado entre E, Q e A, ou um análogo do resíduo selecionado, e X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D e N-Me-N ou um análogo do resíduo selecionado. Exemplos de inibidores de PSD-95 diméricos adequados incluem AB125, e AB122 com a estrutura PEG6(IESDV)2 [correspondente ao composto 77 em WO2010/004003] e AB123 com a estrutura PEG4(IESDV)2 [correspondente ao composto 78 em WO2010/004003] e AB141 [com um ligante NPEG]. Esses compostos são surpreendentemente capazes de alcançar seu alvo, PSD-95, na medula espinhal (Exemplo 12), a despeito de ter estruturas químicas hidrofílicas e grandes, e a despeito de não ser anexados a um CPP - já que essas são propriedades que normalmente impedem os compostos de passar a barreira sangue-cérebro e/ou barreira sangue-medula espinhal e assim impedem os compostos de entrar no CNS. Adicionalmente, o inibidor pode compreender ainda um terceiro peptídeo, em que o dito terceiro peptídeo é um CPP com propriedades de penetração celular ligado ao inibidor, dando um inibidor da presente invenção.

X. Efeitos analgésicos in vivo de inibidores de PSD-95 diméricos para tratamento terapêutico de dor crônica

[0121] Antagonismo do receptor de NMDA mostra ação antinociceptiva em modelos humanos e animais de dor crônica, mas é associado com perturbações graves da função cognitiva e motora.

[0122] A ausência de efeitos colaterais deletérios de AB125 e AB144 em comparação com o antagonista do receptor de NMDA seletivo, MK-801, em hiperalgesia mecânica é demonstrada no modelo Adjuvante de Freund Completo (CFA) de dor inflamatória crônica. Uma redução em efeito colateral de inibidores de PSD-95 diméricos é demonstrada comparando os efeitos de AB125 e MK-801 no teste de transmissão social de preferência de alimento (STFP) de memória a longo prazo e o teste de labirinto Y de atenção modificado, bem como no teste Rotarod de desempenho motor.

[0123] Quando administrados simultaneamente com CFA, tanto MK- 801, AB125, quanto AB144 impediu o desenvolvimento de hiperalgesia mecânica induzida por CFA 1 hora e 24 horas depois do tratamento (Figuras 17, 18, 23; Exemplo 11). Além do mais, observou-se que AB125 reverte hiperalgesia induzida por CFA quando administrado 24 horas depois de tratamento com CFA, um efeito duradouro por pelo menos 3 dias (Figura 19; Exemplo 11). Na dose que reduz a hiperalgesia, MK-801 induziu déficits cognitivos no teste de labirinto Y e STFP modificados bem como déficits motores no teste Rotarod. Surpreendentemente, mesmo altas doses de AB125 foram isentas de efeitos colaterais nesses testes (Figura 20-22; Exemplo 11). Os dados mostram que inibidores de PSD-95 diméricos, sem (AB125) e com (AB144) um CPP, são eficientes na prevenção e inibição do desenvolvimento de dor inflamatória crônica, evitando ao mesmo tempo efeitos colaterais relacionados ao antagonismo do receptor de NMDA na função cognitiva e motora.

XI. Fabricação de uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de PSD-95

[0124] Formulações de um inibidor de PSD-95 dimérico ou um inibidor de PSD-95 dimérico contendo CPP da presente invenção nas composições farmacêuticas são bem conhecidas na técnica, e são adicionalmente descritas em Gennaro (ed.), 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000); and Ansel et al., 1999, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Dilivery Systems, 7th ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers.

[0125] Uma composição como essa contém tipicamente cerca de 0,1 a 90 % em peso (tal como cerca de 1 a 20 % ou cerca de 1 a 10 %) do inibidor de PSD-95 da invenção em um carreador farmaceuticamente aceito.

[0126] Várias formulações líquidas e em pó podem ser preparadas por métodos convencionais para inalação nos pulmões do mamífero a ser tratado.

[0127] Composições adequadas para administração oral podem ser formuladas combinando um inibidor de PSD-95 dimérico ou um inibidor de PSD-95 dimérico contendo CPP da invenção com um carreador adequado na forma de um comprimido, pílula, drágea, cápsula, líquido, gel, xarope, lama, suspensão para ingestões orais pelo indivíduo a ser tratado. Para formulações sólidas orais/retais, excipientes adequados incluem cargas tais como açúcares (por exemplo, lactose, sacarose, manitol e sorbitol); preparações de celulose (por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose sódica, e/ou polivinilpirrolidina; agentes de granulação; e agentes de ligação. Opcionalmente, agentes de desintegração podem ser incluídos, tais como polivinilpirrolidina reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um alginato sódico de sal. A formulação sólida pode adicionalmente incluir um revestimento entérico.

[0128] Para formulações orais líquidas, excipientes adequados ou diluentes incluem água, glicóis, óleos e álcoois.

[0129] Formulações injetáveis das composições podem conter vários carreadores tais como óleos vegetais, dimetilacetamida, dimetilformamida, lactato de etila, carbonato de etila, miristato de isopropila, etanol, polióis (glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, e similares). Para injeções intravenosas, versões solúveis em água dos compostos podem ser administradas pelo método de gotejamento, por meio do qual uma formulação farmacêutica contendo o agente ativo (um inibidor de PSD-95 dimérico contendo CPP) e um excipiente fisiologicamente aceitável é infundido. Excipientes fisiologicamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, 5 % de dextrose, 0,9 % de salina, solução de Ringer ou outros excipientes adequados. Preparações intramusculares, por exemplo, uma formulação estéril de uma forma de sal solúvel adequada dos compostos, pode ser dissolvida e administrada em um excipiente farmacêutico tais como água para injeção, 0,9 % de salina, ou 5 % de solução de glicose. Uma forma insolúvel adequada do composto pode ser preparada e administrada como uma suspensão em uma base aquosa ou uma base de óleo aceitável farmaceuticamente, tal como um éster de um ácido graxo de cadeia longa (por exemplo, oleato de etila).

[0130] Um inibidor de PSD-95 dimérico ou um inibidor de PSD-95 dimérico contendo CPP da invenção pode também ser formulado como uma preparação de depósito de longa ação. Por exemplo, o inibidor pode ser formulado com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, uma emulsão de um óleo aceitável) ou resina de troca iônica, ou como um derivado solúvel fracamente, tal como um sal fracamente solúvel.

[0131] Lipossomos e emulsões podem também ser usados para distribuir o inibidor de PSD-95 dimérico ou um inibidor de PSD-95 dimérico contendo CPP. Adicionalmente, o inibidor pode ser distribuído por meio de um sistema de liberação sustentada, tais como matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos compreendendo o inibidor.

[0132] A porcentagem ideal do agente terapêutico em cada formulação farmacêutica varia de acordo com a formulação em si e o efeito terapêutico desejado nas patologias específicas e regimes terapêuticos correlacionados.

XII. Modo de administração de uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de PSD-95

[0133] Métodos convencionais, conhecidos pelos versados na técnica de medicina, podem ser usados para administrar composições ao indivíduo ou paciente, e podem ser supridas para uso na forma de um kit. Esses incluem, mas sem limitações, vias subcutâneas, intrapulmonares, transmucosais, intravenosas, intraperitoneais, intrauterinas, sublinguais, intratecais, ou intramusculares, usando métodos/dispositivos padrões para distribuição [incluindo por injeção, cateter, onde o kit pode incluir um dispositivo de injeção, um dispositivo para distribuir um depósito injetável, ou um cateter]. Além disso, as formulações farmacêuticas podem ser administradas no paciente por meio de vias de depósito injetável de administração tal como usando depósito injetáveis ou materiais e métodos biodegradáveis 1, 3 ou 6 meses.

[0134] Independente da via de administração, um inibidor de PSD-95 dimérico ou um inibidor de PSD-95 dimérico contendo CPP da presente invenção é tipicamente administrado a uma dosagem diária de cerca de 0,01 mg a cerca de 120 mg/kg em peso corpóreo do paciente (por exemplo, 1 mg/kg a 20 mg/kg). A formulação farmacêutica pode ser administrada em múltiplas doses por dia, se desejado, para obter a dose diária total desejada.

[0135] Métodos convencionais, conhecidos pelos versados na técnica de medicina, podem ser usados para administrar a(s) formulação(s) farmacêutica(s) da presente invenção no paciente. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas sozinhas, ou em combinação com outros agentes ou intervenções terapêuticas. Especificamente, as composições da presente invenção podem compreender adicionalmente uma pluralidade de agentes da presente invenção.

Exemplos Exemplo 1. Síntese de inibidores diméricos de PSD-95 1.1 Síntese do ligante Ns-N4-PEG-diácido A-C (Esquema 1 - Figura 16)

[0136] Para a síntese do ligante Ns-N4-PEG-diácido A (3; Esquema 1) resina do cloreto de 2-clorotritila (3 mmol, 1,90 g) foi lavado e intumescido (20 minutos) em DMF. Fmoc-NH-PEG2-CH2CH2COOH (1, Esquema 1; Biomatrik Inc., Jiaxing, China) foi carregado na resina adicionando 1 (2 mmol, 800 mg) em DMF (8 mL) na resina drenada seguido por DIPEA (10 mmol, 1,75 mL). Depois de agitação por 60 minutos, metanol (1 mL, 25 mmol) foi adicionado, e a agitação continuou por mais 5 minutos. A resina carregada foi drenada e lavada completamente com DMF (lavagens de 10-15 fluxos, cada qual de 10 mL), e o grupo Fmoc foi desprotegido com 20 % de piperidina em DMF por 5 minutos e 15 minutos com um lavagem com DMF entre eles, seguido por um lavagem com DMF e THF. A resina foi intumescida em DIPEA (12 mmol, 2,1 mL) e THF (8 mL) por 15 minutos, e cloreto de orto-nitrobenzenossulfonila (NsCl, 8 mmol, 1,78 g) em DCM (5 mL) foi adicionado lentamente embora agitando suavemente a resina. Depois de 4 horas, a resina foi drenada e lavada consecutivamente com THF, MeOH, DCM, e THF. O grupo amino livre anexado na resina foi alquilado com o álcool HO-PEG2-CH2CH2COOtBu (2, Esquema 1; Biomatrik Inc., Jiaxing, China) iniciando por evacuação do vaso de reação e adicionando um balão de nitrogênio. A resina (1 eq., 2 mmol) foi tratada com trifenilfosfina (PPh3, 10 mmol, 2.625 mg) em THF (5 mL) e 2 (10 mmol, 2.32,34 g) em THF (5 mL). Azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD) (10 mmol, 2,02 g, 1,97 mL) foi adicionado gota a gota, e o balão foi removido antes de agitação por 1 hora. A resina foi completamente lavada com THF e DCM, seca in vacuo e tratada com TFA/tri-isopropilsilano/H2O (90/5/5, 20 mL) por 2,5 horas. A mistura de TFA foi coletada e a resina foi lavada com TFA e DCM antes de as frações de TFA/DCM combinadas serem evaporadas e coevaporadas com éter (2x30 mL). O material resultante foi dissolvido em água/MeCN (75/25, 100 mL) e liofilizado para obter ligante Ns-N4-PEG-diácido A (3, Esquema 1) na forma de um óleo laranja, que foi usado diretamente na síntese de ligantes NPEG4 diméricos. Rendimento: 80 %. m/z (ESI) 540,1 (22 %), 523,1 (M++H, 100), 505,1 (11), 433,0 (7,3), 365,2 (7,4).

[0137] O procedimento usado para a síntese do ligante Ns-N4-PEG- diácido A foi também usado para sintetizar o ligante Ns-N4-PEG-diácido B e ligante Ns-N4-PEG-diácido C (6 e 9, respectivamente; Esquema 1). Para produzir ligante Ns-N4-PEG-diácido B (6), blocos de construção Fmoc-NH- PEG3-CH2CH2COOH (4; Biomatrik Inc., Jiaxing, China) e HO-PEG1- CH2CH2COOtBu (5; Biomatrik Inc., Jiaxing, China) foram usados (Esquema 1). Rendimento: 54 %. m/z (ESI) 596,2 (22 %), 523,2 (M++H, 100), 505,1 (15), 433,1 (8).

[0138] Para produzir ligante Ns-N4-PEG-diácido C (9), blocos de construção Fmoc-beta-alanina (7; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)e HO- PEG4-CH2CH2COOtBu (8; IRIS Biotech, Marktredwitz, Alemanha) foram usados (Esquema 1). Rendimento: 45 %. m/z (ESI) 596,2 (51 %), 523,1 (M++H, 100), 506,1 (14), 433,1 (55).

1.2 Síntese de frações de peptídeo de inibidores diméricos de PSD-95

[0139] Peptídeos (por exemplo, IETDV ou IETAV) foram sintetizados por química de peptídeo de fase sólida baseada em Fmoc usando resina Fmoc-Val-Wang pré-carregada (0,6-0-7 mmol/g, malha 100-200), HBTU/DIPEA para acoplamentos, e DMF seco como solvente. Cada acoplamento foi realizado por 40 minutos com um estequiometria de resina/Fmoc-aminoácido/HBTU/DIPEA 1/4/3,9/8, e foi qualitativamente avaliado quanto ao teste ninidrina. Desproteção Fmoc foi realizada em 20 % de piperidina em DMF por 5 minutos, seguido por lavagem com DMF e um segundo tratamento com piperidina/DMF por 15 minutos.

1.3 Síntese de ligantes diméricos AB141, AB144 e AB147 a base de NPEG4 (Figura 2 e 3)

[0140] Ligante Ns-N4-PEG-diácido A (3, Esquema 1; 0,1 eq., 0,025 mmol) foi pré-ativado com HBTU (0,2 eq, 0,05 mmol) e DIPEA (0,4 eq, 0,1 mmol) e adicionado a IETDV ligado a resina-Wang Fmoc-desprotegida (1 eq, 0,25 mmol) em um volume total de 4 mL de DMF. A reação foi agitada por 45 minutos e repetida 5 vezes. O grupo Ns foi removido adicionando DBU (0,5 mmol) em DMF (2 mL) seguido por mercaptoetanol (0,5 mmol) em DMF (2 mL). A reação foi agitada por 30 minutos e lavada em DMF. Tratamento com mercaptoetanol/DBU foi repetido uma vez, e a resina lavada consecutivamente com DMF, DCM, MeOH e DCM para fornecer AB141 ligado a resina. Para AB144 e AB147 o primeiro aminoácido do CPP (L- ou D-Arg, respectivamente) foi acoplado no nitrogênio por seis acoplamentos consecutivos de Fmoc-Arg(Pbf)-OH. Para cada acoplamento, Fmoc-Arg(Pbf)- OH (0,5 mmol) foi ativado por HATU em DMF (2 mL, 0,244 M) e colidina (132 μL), antes de adicioná-lo na resina drenada. Depois de 40 minutos de agitação e uma lavagem com DMF, o acoplamento e lavagem com DMF foram repetidos 5 vezes seguido por uma lavagem completa com DMF. Fmoc foi removido com 20 % de piperidina em DMF, a sequência Tat- ou D-Tat- Retroinverso restante foi sintetizada conforme descrito para síntese de peptídeo, e o grupo Fmoc final removido.

1.4 Síntese de ligantes diméricos AB144-B e AB144-C a base de NPEG4 (Figura 15)

[0141] AB144_B e AB144_C foram sintetizados conforme descrito para AB144, exceto que o ligante Ns-N4-PEG-diácido B e ligante Ns-N4- PEG-diácido C foram usados, respectivamente, em vez do ligante Ns-N4- PEG-diácido A.

1.5 Síntese de ligantes diméricos AB144-D e AB144-E a base de NPEG4 (Figura 15)

[0142] A síntese de AB144_D e AB144_E foi conforme descrito para AB144 até no ponto onde AB141 ligado a resina é provido. Fmoc-Gly-OH foi acoplado no átomo de nitrogênio no ligante NPEG4 por seis acoplamentos consecutivos com HBTU/DIPEA conforme supradescrito na seção de síntese de peptídeo, 1,2. Depois da remoção de Fmoc com piperidina/DMF, N- Maleoil-β-alanina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)foi acoplado a (HBTU/DIPEA) na metade da resina, que foi subsequentemente seca in vacuo e tratada com mistura de clivagem TFA/tioanisol/H2O/anisol 90/5/3/2 (v/v/v/v) para fornecer intermediário de dímero de maleimida bruto. Em paralelo, o peptídeo 12-mero Tat-Cys (Sequência: YGRKKRRQRRRC) foi preparado por padrão síntese de peptídeo com base em Fmoc iniciando de uma resina do cloreto de 2-clorotritila carregado com Fmoc-Cys(Trt)-OH seguido por clivagem da resina. AB144_D foi sintetizado em seguida misturando 0,05 mmol de intermediário de dímero de maleimida bruto com Tat-Cys bruto 0,06 mmol em 10 mL de acetonitrila e 50 mL de tampão TBS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, desgaseificado) à temperatura ambiente, o pH foi ajustado a 7 com NaOH (0,2 M), e a mistura da reação foi incubada por 90 minutos. A mistura foi então liofilizada e AB144_D puro foi fornecido por purificação de HPLC.

[0143] Para AB144_E, Boc-Cys(Npys)-OH foi acoplado com HBTU/DIPEA no resíduo de glicina do ligante dimérico ligado a resina, ao contrário de N-maleoil-β-alanina como para AB144_D (vide anteriormente). A resina foi seca in vacuo e tratada com mistura de clivagem TFA/tioanisol/H2O/anisol 90/5/3/2 (v/v/v/v) para fornecer intermediário de dímero de Cys(Npys) bruto. Este intermediário (0,026 mmol) foi reagido com Tat-Cys (0,030 mmol) em tampão Tris-HCl 50 mL/EDTA (Tris-HCl 0,5 M, EDTA 5 mM, pH 7,5, desgaseificado) à temperatura ambiente por 60 minutos. A mistura foi liofilizada e AB144_E puro foi fornecido por purificação de HPLC.

1.6 Síntese de ligantes diméricos AB144-H e AB144-I a base de PEG4

[0144] Compostos AB144_H e AB144_I foram sintetizados a partir de uma resina Val-wang pré-carregada iniciando pela produção das sequências de peptídeo ligadas a resina, K(Dde)ETDV e K(Dde)IETDV, respectivamente [cadeias laterais de E, T, D são protegidas com grupos terc- butila embora o composto seja ligado a resina; K é protegido com Dde: 1- (4,4-dimetil-2,6-dioxocicloex-1-ilideno)etila], conforme descrito na seção de Síntese de peptídeo (Geral)'. O processo de dimerização em resina foi realizado com o ligante PEG4-diácido (IRIS Biotech, Marktredwitz, Alemanha) conforme descrito previamente (WO2010/004003). Em seguida, Dde foi removido tratando a resina com monoidrato de hidrazina recém- preparado (2 % em DMF) por 5 minutos, seguido por uma lavagem com DMF e um outro tratamento com hidrazina por 10 minutos. A resina foi completamente lavada com DMF, 10 % de DIPEA em DMF (5x2 minutos), DCM, e DMF consecutivamente. A sequência Tat foi sintetizada a partir do grupo amino liberado na cadeia lateral de lisina usando HATU/Colidina e remoção padrão de Fmoc com piperidina/DMF.

Exemplo 2. Síntese de análogos etiquetados de inibidores diméricos de PSD-95 2.1 Síntese de análogos etiquetados com fluoróforo (AB143, AB145, AB148, MS23)

[0145] Ligantes fluorescentes foram preparados acoplando 5-FAM (5- carboxifluoresceína; Anaspec, San Jose, CA, USA) no grupo amino terminal N do final e AB144, AB147, ou Tat-NR2B9c Fmoc-desprotegidos, embora ligados na resina, para produzir AB145, AB148, e MS23, respectivamente. Igualmente, 5-FAM foi acoplado em Ns-desprotegido, ligado a resina AB141 para produzir AB143. 5-FAM foi acoplado em um razão 1/2/2/3 de N-sítios- resina/5-FAM/HATU/colidina em um total de 2 mL de DMF em uma escala de 0,07 mmol (molar de ligante NPEG). Para AB145, AB148, ou MS23, o tempo de acoplamento foi de 6 horas. Para AB143, 5-FAM foi acoplado por dois acoplamentos consecutivos de 6 e 16 horas, respectivamente.

2.2 Síntese de ligante dimérico15N, 13C-etiquetado de PSD-95

[0146] [15N, 13C]-PEG4(IETAV)2 (AB140) foi sintetizado usando aminoácidos protegido com Fmoc contendo completamente átomos de aminoácido 15N, 13C-etiquetados (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Andover, MA, USA). Blocos de construção de aminoácido para Thr e Glu tiveram cadeia lateral protegida com grupos terc-butila. Fmoc-Val-OH etiquetado (0,125 mmol, 43 mg) foi dissolvido em DMF (1,5 mL) e carregado na resina do cloreto de 2-clorotritila (0,1875 mmol, 119 mg) que foi intumescido em DMF (2 mL) por 20 minutos e drenado. DIPEA (0,625 mmol, 109 μL) foi adicionada e a agitação continuou por 60 minutos. MeOH (100 μL) foi adicionado, e a agitação continuou por 15 minutos, e a resina lavada com DMF. Fmoc foi removido com piperidina/DMF e IETAV etiquetado foi adicionalmente sintetizado usando condições de acoplamento e estequiometrias de 1/2/2/3 de resina/Fmoc-aminoácido/HATU/colidina em DMF (1 mL) por 40 minutos. Depois da remoção final de Fmoc, a resina foi lavada com DMF e DCM, seca in vacuo e usada adicionalmente para preparar AB140 por o processo de dimerização em resina com o ligante PEG4-diácido (não etiquetado) (IRIS Biotech, Marktredwitz, Alemanha) descrito previamente (WO2010/004003).

Exemplo 3. Purificação e caracterização de inibidores de PSD-95 diméricos de PSD-95 e seus derivados etiquetados

[0147] Compostos sintetizados, incluindo inibidores de PSD-95 diméricos e seus derivados, foram obtidos como sais de TFA tratando os produtos ligados a resina com ácido trifluoracético (TFA)/tri- isopropilsilano/H2O (90/5/5) por 2 horas (a menos que outra especificação seja declarada), evaporação in vacuo, precipitação com éter frio, liofilização, e purificação com cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa preparativa (RP-HPLC). Os compostos foram caracterizados por HPLC analítico e espectrometria de massa (Tabela 1). Tabela 1. Caracterização de compostos. 1Íon mais abundante é listado (ESI- LC/MS).

[0148] 2HPLC analítico (UV218) e ESI-LC/MS (ELSD) foram conduzidos para todos os compostos para determinar pureza. 3Parte do peptídeo, IETAV, é [15N, 13C]-etiquetado.

[0149] Para experimentos in vivo, compostos foram preparados como sais de HCl incubando os sais de TFA dos compostos com HCl aquoso resfriado no gelo (50 mM; excesso molar 3 vezes de HCl relativo aos TFA) por 20 minutos seguido por liofilização.

3.1 RP-HPLC preparativo:

[0150] Compostos foram purificados em um sistema Agilent 1200 com uma coluna de fase reversa C18 (Zorbax 300 SB-C18, 21,2x250 mm) usando um gradiente linear de H2O/MeCN/TFA (a: 95/5/0,1 e B: 5/95/0,1) e uma vazão de 20 mL/minutos. 3.2 ESI-LC/MS:

[0151] Espectros de massa foram obtidos com um instrumento Agilent 6410 Triple Quadrupole Mass Spectrometer usando ionização por aspersão eletrônica (ESI), acoplado a um sistema Agilent 1200 HPLC (ESI- HPLC-MS) com uma coluna de fase reversa C18 (Zorbax Eclipse XBD-C18, 4,6x50 mm), detector de dispersão de luz evaporativo (ELSD, Sedere Sedex 85) e um detector de arranjo de diodo (UV) usando um gradiente linear de H2O/MeCN/ácido fórmico (A: 95/5/0,1 e B: 5/95/0,086) com uma vazão de 1 mL/minutos.

3.3 RP-HPLC Analítico:

[0152] As purezas do composto foram determinadas por um sistema Agilent 1100 com uma coluna de fase reversa C18 (Zorbax 300 SB-C18 coluna, 4,6x150 mm) usando um gradiente linear de H2O/MeCN/TFA (A: 95/5/0,1 e B: 5/95/0,1) e uma vazão de 1 mL/minutos.

3.4 Espectros de massa de alta resolução (HRMS):

[0153] HRMS foram obtidos para AB144 e AB147 usando ionização por aspersão eletrônica (ESI) e um instrumento Micromass Q-Tof 2.

Exemplo 4. Expressão e Purificação de PDZ1-2 de PSD-95

[0154] O cDNA que codifica para PSD-95 PDZ1-2 em tandem (correspondente aos resíduos 61-249 em o PSD95α de comprimento total de humano sem exon 4b) foi amplificado por PCR invertido e clonado em um vetor pRSET His-etiquetado modificado (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O peptídeo PDZ1-2 codificado compreendeu adicionalmente a sequência MHHHHHPRGS, que foi usada como uma etiqueta para purificação (His- etiquetado), e o DNA que codifica sequências e proteínas codificadas são designadas da maneira a seguir: HIS-PDZ1-2 DNA [SEQ ID NO: 1] que codifica proteína HIS-PDZ1-2 [SEQ ID NO: 2]. Bactérias E. coli competentes (BL21 - DE3, pLysS) foram transformadas com PDZ1-2 expressando construto e crescimento por toda a noite nas placas de ágar contendo ampicilina (100 μg/mL) e clorafenicol (35 μg/mL) a 37°C. Colônias foram picadas e usadas para culturas bacterianas inoculares (meio LB com 50 μg/mL de ampicilina). Essas foram agitadas embora sendo incubadas a 37°C até A600 da cultura obtida 0,45, em cujo ponto 1 mM de isopropil β-D-1- tiogalactopiranosído foi adicionado. Culturas induzidas foram incubadas por toda a noite a 30°C (PDZ1-2). Células foram colhidas centrifugando a 10.000 g por 10 minutos a 4°C e recolocadas em suspensão em tampão de lise (50 Tris mM/HCL pH 7,5, PMSF 1 mM, DNAse 25 μg/mL, Mg2SO4 40 mM). As células foram destruídas usando um aparelho interruptor celular a 26 KPsi. O Lisado celular foi centrifugado a 35.000 g por 1 hora e o sobrenadante filtrado com um filtro de 0,45 de μm e um de 0,22 μm. Purificação de peptídeo PDZ1-2 expresso foi realizada primeiro com uma coluna carregado de níquel (II) (HisTrapTM HP, GE Healthcare, UK) equilibrada com Tris-tampão (tampão Tris/HCl 50 mM, pH 7,5) seguido por filtração de gel. Para filtração de gel a amostra de PDZ1-2 foi carregada em uma coluna SuperdexTM 75 HR 10/30 (GE Healthcare, UK) equilibrada com Tris tampão (Tris/HCL 20 mM, pH 7,5) com uma vazão constante a 0,5 mL/minutos. As frações relevantes foram analisadas em um gel SDS-PAGE manchado por um protocolo de manchamento de prata Padrão. A purificação final foi analisada por espectrometria de massa de cromatografia líquida de ionização por eletroaspersão (ESI-LC/MS) para obter o peso molecular exato e por meio disso verificar a identidade do domínio PDZ1-2. Coeficientes de extinção molares foram observados por análise de aminoácidos (Alphalyse, odense, Dinamarca) e em seguida usados para medir concentrações de proteína. Para Estudos RNM, [15N] PDZ1-2 uniformemente etiquetado foi expresso crescendo a cultura bacteriana em meios M-9 seguido por purificação conforme supradescrito.

Exemplo 5. Melhores inibidores de PSD-95 diméricos de afinidade com o domínio PDZ de PSD-95 5.1 Ensaio de polarização de fluorescência (FP) para determinar a afinidade de ligantes (inibidores de PSD-95 diméricos) com o domínio PDZ de PSD-95

[0155] Um ensaio de medição de afinidade in vitro foi desenvolvido com base no princípio de polarização de fluorescência a fim de fornecer constantes de afinidade (valores Ki) entre ligantes sintetizados (por exemplo, inibidores diméricos) e PDZ1-2 de PSD-95. Primeiro, a afinidade entre a sonda NPEG4(IETAV)2 etiquetada com 5-FAM, designada AB143 (Figura 4), e PDZ1-2 foi estabelecido por um experimento de ligação de saturação, onde maiores concentrações de PDZ1-2 foram adicionadas a uma concentração fixada (0,5 nM) da sonda. O ensaio foi realizado em tampão TBS (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,4) em preto, placas de 384 poços de base plana (Corning Life Sciences, NY, USA). Depois da incubação por 10 minutos à temperatura ambiente, polarização de fluorescência das amostras foi medida em uma leitora de placa Safire2 (Tecan, Mannedorf, Suíça) a valores de excitação/emissão de 470/525 nm. Os valores de polarização de fluorescência foram ajustados na equação Y = Bmax x X/(Kd + X), com Bmax sendo o valor de polarização de fluorescência máximo, X sendo a concentração de PDZ1-2, e Y sendo o valor de polarização de fluorescência. Kd foi diretamente derivado da curva de saturação como sendo igual na concentração de PDZ1-2 a meia saturação, e determinado como 7,8 ± 0,11 nM, que é boa concordância com o valor Ki encontrado para seu ligante não fluorescente correspondente (‘frio’), AB141 (Ki = 9,3 ± 1 nM). As afinidades entre compostos não fluorescentes e PDZ1-2 foram determinadas por competição heteróloga, onde maiores concentrações de composto foram adicionadas a uma concentração fixada de sonda (0,5 nM) e PDZ1-2 (7,8 nM) no mesmo tampão TBS e condições conforme supradescrito. Valores FP foram ajustados na equação geral: Y = Base + (Topo - Base)/[1 + (10(X-LogIC50*HillSlope))], onde X é o valor logarítmico de concentração de peptídeo, e os valores IC50 resultantes foram convertidos em constantes de inibição competitiva, valores Ki. Todos os valores reportados são a média de pelo menos três experimentos individuais. Estoques ligante foram preparados em água e concentrações foram verificadas por análise de aminoácido.

5.2 Inibidores de PSD-95 diméricos da invenção têm maior afinidade com o domínio PDZ1-2

[0156] O ensaio de FP (vide 5,1) foi empregado para determinar a afinidade de vários inibidores de PSD-95 diméricos com o domínio PDZ1-2 de PSD-95. O inibidor dimérico AB141 difere de AB125 em que o ligante PEG4 é substituído por um ligante NPEG4. Esta diferença não tem nenhum efeito significante na afinidade do inibidor dimérico com PDZ1-2, uma vez que ambos exibiram valores Ki em torno de 9,5 nM (Figura 5). A adição de um CPP no inibidor dimérico AB141, onde o CPP é anexado no ligante NPEG4, resulta em um surpreendente aumento na afinidade com PDZ1-2. AB144 (CPP é Tat) e AB147 (CPP é Retroinverso-D-Tat) mostraram um aumento 2 vezes com relação a AB141 no valor Ki = 4,6 ± 0,3 e 5,1 ± 0,4 nM, respectivamente (Figura 5), e uma afinidade 1.000 vezes maior relativa ao peptídeo monomérico Tat-NR2B9c (Ki = 4600 ± 300 nM contra PDZ1-2 de PSD-95; Figura 5).

5.3 Inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP têm maior afinidade com odomínio PDZ1-2

[0157] Os análogos de AB144 (vide Exemplo 1 e Figura 15) AB144_B e AB144_C, nos quais o ponto de anexação de Tat no átomo de nitrogênio do ligante NPEG é assimétrico (tanto uma quanto duas frações de etileno glicol fora do centro do ligante), mostraram afinidades com relação a PDZ1-2 de PSD-95 na mesma faixa de AB144, isto é, na baixa faixa nanomolar (Tabela 2). Embora AB144_C demonstre uma afinidade 2 vezes maior comparado com AB144 ambos os compostos são ligantes altamente potentes para o domínio PDZ1-2.

[0158] Os Análogos de AB144 (vide Exemplo 1 e Figura 15) AB144_D e AB144_E, Tat é anexada simetricamente no ligante NPEG, mas em AB144_D, Tat é anexada por um acoplamento de maleimida, embora em AB144_E, Tat seja anexado por meio de uma ligação de dissulfeto (S-S). Embora AB144_D e AB144_E tenham exibido afinidade ~2-3 vezes menor que AB144 (Tabela 2), seus valores Ki foram ainda na faixa nanomolar mais baixa e, consequentemente, compostos são ligantes ainda muito fortes para PDZ1-2 de PSD-95.

[0159] No composto AB144_H e AB144_I (vide Exemplo 1 e Figura 15), a sequência Tat é anexada a uma cadeia lateral de aminoácido de um dos peptídeos diméricos ligados a PEG, em vez de usar um ligante NPEG. Em AB144_H, a Tat estende-se do aminoácido P-4, que neste caso é uma lisina. Normalmente, isoleucina (I) é observada nesta posição (AB144), mas aqui lisina é usada, uma vez que ela fornece um funcional grupo (grupo amino) de onde a Tat pode ser sintetizada, e ainda funciona como um análogo estrutural para isoleucina (a base de alcano não carregada depois da formação de ligação de amida no primeiro aminoácido de Tat, similar em tamanho). AB144_H retém uma afinidade nanomolar com PDZ1-2, embora ligeiramente menos ideal sendo ~ 5 vezes mais baixa que aquela de AB144 (Tabela 2). Em AB144_I a Tat é anexada na cadeia lateral do aminoácido P-5 em um hexapeptídeo, e mostra maior afinidade com o domínio PDZ1-2 do que AB144_H, embora ca 2 vezes mais fraco que AB144 (Tabela 2). Tabela 2. Constantes de afinidade Ki de análogos de AB144 com relação a PDZ1-2 de PSD-95 conforme medido por polarização de fluorescência. Dados representam >4 medições individuais.

Exemplo 6. Inibidores de PSD-95 diméricos modificados têm maior estabilidade em plasma sanguíneo de humano 6.1 Ensaio de estabilidade do plasma sanguíneo de humano

[0160] Ligantes (inibidores de PSD-95 diméricos) para o domínio PDZ de PSD-95 foram dissolvidos em plasma sanguíneo de humano (270 μL; 3H Biomedical, Suécia, cat no 1300-1-P50) para uma concentração de 0,25 mM (30 μL de 2,5 mM) e incubados a 37°C. Alíquotas (30 μL) foram removidas em vários intervalos de tempo (por exemplo, 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 960, 1.280, 2.550, 4.560 e 7.240 minutos) e finalizadas com 60 μL ácido tricloroacético (aquoso, 5 %). As alíquotas foram submetidas em vórtex, e incubadas 15 minutos, a 4°C antes de centrifugação a 18.000 g por 2 minutos. Os sobrenadantes foram analisados por RP-HPLC analítico (UV218) para quantificar composto relativo ao tempo zero, e também avaliados qualitativamente por ESI-LC/MS a fim de identificar o composto (m/z) na amostra. Procaína (controle positivo) e procainamida (controle negativo) foram investigadas a 50 μM para validar o procedimento. Recuperações do ligante após o procedimento de precipitação foram entre 85-95 %.

6.2 Maior estabilidade de plasma sanguíneo de inibidores diméricos com um peptídeo Tat

[0161] Os inibidores diméricos AB144 (CPP é Tat) e AB147 (CPP é Retroinverso-D-Tat) foram incubados em plasma sanguíneode humano e sua degradação in vitro foi monitorada. Quando comparado com suscetibilidade a degradação do pentapeptídeo IETDV e Tat-NR2B9c monomérico, que mostraram meia vidas (T1/2) de 37 ± 6 e 1.100 ± 300 minutos, respectivamente, AB144 exibiu um T1/2 = 4.900 ± 100, que corresponde a uma melhoria mais que 100 vezes na estabilidade comparado com pentapeptídeo IETDV monomérico (Figura 5). Não foi observada nenhuma degradação detectável de AB147 no período de medições (130 horas) (Figura 5), ilustrando o efeito de introduzir um CPP de protease estável no inibidor dimérico.

Exemplo 7. Inibidores de PSD-95 diméricos ligam aos domínios tanto PDZ1 quanto PDZ2 de PSD-95 7.1 Análise RNM de ligação do ligante aos domínios tanto PDZ1 quanto PDZ2 de PSD-95

[0162] Uma amostra RNM compreendendo [15N,13C]-PEG4(IETAV)2 (AB140) 3,5 mM livre e 2,2 mM do mesmo composto saturado com PDZ1-2 não etiquetado em KPi 50 mM, pH 7,5 em 90 % de H2O/10 % de D2O foi preparada para estudos de ligação. Todos os experimentos foram registrados a 25°C a um campo magnético estático correspondente a um próton de frequência de Larmor de 600 MHz. Experimentos HNCA, HN(CA)CO e HSQC foram registrados para designar a espinha dorsal das frações de peptídeo do composto livre. Para o composto de ligação experimentos HNCACB, HN(CA)CO e HSQC foram registrados com propósitos de designação.

[0163] As taxas de relaxamento 15N R1 e R1pbem como o NOE 15N- [1H] foram medidas por [15N]-PDZ1-2 2,83 mM saturado com AB125 não etiquetado usando sequências de pulso previamente descritas. Condições da amostra foram conforme anteriormente. Para o experimento R1 os seguintes atrasos de relaxamento foram usados: 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 s. Incertezas em intensidades de pico foram estimadas de cinco pontos dados em duplicata. O experimento R1p foi registrado com um campo trava de spin de 1661 Hz e o carreador de radiofrequência posicionado a 119 ppm e atrasos de relaxamento de 0,004, 0,008, 0,012, 0,016, 0,0,02, 0,024, 0,03, 0,036, 0,04, 0,05, 0,055, 0,06 s. Cinco pontos de dados em duplicata foram registrados para estimativa de incertezas em volumes de pico. NOE 15N-[1H] foi registrado tomando a razão dos experimentos registrados com e sem saturação dos prótons. O atraso de reciclagem total para ambos os experimentos foi 12 s e o experimento sem os pulsos de saturação foi duplicado para estimativa de incertezas.

[0164] Todos os dados RNM foram processados com NMRpipe e visualizados usando Sparky (Goddard and Kneller, University of Califórnia em São Francisco). Designações para a forma ligada de PDZ1-2 foram obtidas transferindo as designações de PDZ1-2/cipina (Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 131, 787, 2009). Uma vez que um diferente composto foi usado neste estudo e uma vez que as condições da amostra foram diferentes, apenas ligeiramente mais que metade das designações pôde ser transferida com confidência. Os picos restantes nos espectros não foram analisados. Picos foram integrados e volumes convertidos nas taxas de relaxamento usando o programa doméstico PINT. O mesmo programa foi usado para converter as taxas de relaxamento R1p em taxas de relaxamento R2.

7.2 Inibidores de PSD-95 diméricosligam tanto a PDZ1 quanto a PDZ2

[0165] Ligação do ligante dimérico 15N, 13C-etiquetado (AB140) em PDZ1 e PDZ2 foi analisada determinando sua estrutura RNM na presença/ausência de PDZ1-2 não etiquetado, conforme descrito em 7.1. Cinco picos foram detectados em um espectro HSQC para o ligante simétrico [15N, 13C]-PEG4(IETAV)2 (AB140). Entretanto, quando o ligante foi combinado com PDZ1-2, dez diferentes picos correspondentes a cada um dos dez aminoácidos foram observados (Figura 6). Isto demonstra claramente que ambas as frações ligantes interagem com PDZ1-2 e que elas ficam voltadas para diferentes ambientes de proteína, a saber, PDZ1 e PDZ2, respectivamente. A partir dos cálculos estruturais secundários com base nos deslocamentos químicos para o ligante dimérico ligado e não ligado pode-se deduzir que o ligante não ligado apresenta caráter espiral randomizado, embora o ligante ligado adote uma estrutura de fita β (Figura 7). Finalmente, medições de taxa de relaxamento R1 e R2 confirmaram que PDZ1-2 em complexo com ligante dimérico cai como uma unidade, e assim estabelece outros modelos potenciais tais como uma estequiometria de ligação 2:2 (Tabela 3). Dessa maneira, os estudos RNM confirmam uma estequiometria de ligação 1:1 e de modo não definido demonstra que cada fração de ligante do ligante dimérico liga igualmente PDZ1 ou PDZ2 em PDZ1-2 em um modo de ligação verdadeiramente bivalente. 15 1 15 15 Tabela 3. Taxas de relaxamento N R1 e R2 e NOE H- N medidas para [ N]- PSD95 PDZ1-2 em complexo com AB125. São mostrados somente resultados para resíduos onde as designações poderiam ser transferidas com confidência pela Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 131, 787, 200.

Exemplo 8. Inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP cruzam a barreira sangue-cérebro 8.1 análise de permeabilidade da barreira sangue-cérebro (BBB)

[0166] Esses ligantes etiquetados fluorescentes foram usados como medições substitutas da capacidade de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP cruzar a barreira sangue-cérebro e entrar no cérebro de camundongos. Os ligantes fluorescentes foram injetados intravenosamente (3 nmol/g) e o local dos ligantes foi detectado por microscopia de fluorescência de fatias de cérebro coronal de camundongos (n=8), foi avaliado 2 horas depois da injeção. Duas seções do cérebro, antes e dois depois de comissura anterior (n=5), foram selecionadas para análise de permeabilidade de BBB. A comissura anterior (Bregma: -0,3) foi usada como um ponto fixo no cérebro a fim de analisar seções do cérebro anatomicamente idênticas. A intensidade do fluoróforo 5-FAM foi medida semiquantitativamente usando um sistema de microscopia de fluorescência (Olympus System Microescopo modelo BX-51, Dinamarca) com um objetivo 10 x (Olympus 10x/0,15 UPlanApo) conectado a uma câmera digital de microscópio de alta resolução (modelo Olympus DP70), que transferiu imagens para um software de captura de imagem (Image Pro Plus software). Todas as imagens foram tomadas usando os mesmos ajustes de microscópio e com tempo de exposição de câmera constante. Intensidades foram quantificadas usando o ImageJ software.

8.2 Permeabilidade da barreira sangue-cérebro (BBB) de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP

[0167] Os inibidores de PSD-95 diméricos AB143, AB145, AB148 são os derivados etiquetados com 5-FAM de AB141, AB144, AB147, respectivamente (Figura 4: AB143 e AB145 são mostrados como exemplos). Derivado de Tat-NR2B9c etiquetado com 5-FAM é designado MS23. Depois da injeção dos compostos, os camundongos são perfundidos com paraformaldeído e os cérebros são cuidadosamente removidos, pós-fixados em paraformaldeído, processados nas seções coronais, e quantificados para fluorescência. Microscopia de fluorescência de fatias de cérebro coronal mostrou que AB145, AB148, e Tat-NR2B9c entram no cérebro, embora AB143 não entre (Figura 8). Com base nesses resultados concluiu-se que compostos contendo Tat ou Retroinverso-D-Tat (AB144, AB147, Tat- NR2B9c) são capazes de entrar no cérebro, embora AB125/AB141, que não contém um CPP, não possa entrar.

Exemplo 9. Propriedades neuroprotetoras de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP reduz volumes de infarto em camundongos com isquemia cerebral focal

[0168] As propriedades neuroprotetoras in vivo de inibidores de PSD- 95 diméricos contendo CPP foram examinadas no modelo de oclusão de artéria cerebral média permanente (pMCAO) de acidente vascular cerebral isquêmico em camundongos.

9.1 Camundongos para estudos in vivo

[0169] O estudo pMCAO foi realizado usando 164 camundongos C57BL/6 machos adultos jovens de idade casada, (7-8 semanas), (Taconic, Dinamarca). Os camundongos foram alojados em gaiolas separadas sob iluminação diurna e tiveram livre acesso a alimento (1314 Altromin, Brogârden, Dinamarca) e água. Camundongos aclimatados por 7 dias antes de cirurgia de acordo com diretrizes aprovadas pelo Danish Animal Ethical Committee (J. no. 2005/561-1068). A extensão do infarto isquêmico foi medida em dois estudos controlados de placebo duplo cego randomizado.

9.2 Oclusão da artéria cerebral média permanente

[0170] Procedimento cirúrgico: Camundongos foram submetidos a isquêmica cerebral focal por oclusão permanente da artéria cerebral média (pMCAO). Camundongos foram anestesiados por injeções subcutâneas de 0,18 mL por 10 gramas em peso corpóreo, de uma mistura 1:1:2 de HypnormTM (citrato de fentanila 0,315 mg/mL e fluanisona 10 mg/mL, VectaPharma Ltd), Midazolam (5 mg/mL, Hameln), e H2O destilada. O camundongo foi colocado em uma almofada de aquecimento 37±0,5°C e os olhos cobertos com unguento (Viscotears; Novartis, Basel, Suíça). Uma incisão na pele foi produzida entre a parte lateral da órbita e o canal auditivo externo. O polo superior da glândula parótida e a parte superior do músculo temporal foram empurrados de lado depois da ressecção parcial e uma pequena craniotomia, usando uma broca de 0,8 mm, foi produzida diretamente acima de parte distal do MCA. A dura-máter foi removida e o MCA eletrocoagulado usando fórceps bipolares (Gimmi, Alemanha) acoplados a uma unidade eletrocirúrgica (ICC50 from ERBE, Alemanha). Após a oclusão, o músculo e tecido macio foram organizados e a pele suturada usando uma sutura de náilon 4-0. Para tratamento de dor pós- cirúrgico os camundongos foram supridos com Temgesic (0,001 mg/20 g de buprenorfina, Reckitt & Coleman, UK), três vezes com um intervalo de 8 horas iniciando imediatamente depois da cirurgia. Além disso, os camundongos foram injetados s.c. com 1 mL de salina isotônica antes da transferência para um ambiente de recuperação controlado a 28°C.

9.3 Administração do composto

[0171] Compostos foram dissolvidos em salina isotônica (0,9 %) (NaCl) a uma concentração de 300 μM, e 10 μL por grama em peso corpóreo foram administrados intravenosamente (i.v.) (Dose: 3 nmol/g) como um bolo, na cauda, 30 minutos depois da cirurgia. Camundongos controles receberam uma injeção i.v. de 0,9 % de NaCl.

9.4 Terminação do processamento do tecido cerebral do camundongo

[0172] Camundongos C57BL/6 com tempo de sobrevivência pós- cirúrgica de 6 horas foram eutanizados por desarticulação cervical. Camundongos C57BL/6 com sobrevivência pós-cirúrgica de 48 horas foram anestesiados com um\ overdose de pentobarbital (the pharmacy of Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Dinamarca) a fim de coletar amostras de sangue e tecido. Todos os cérebros foram cuidadosamente removidos, congelados em CO2 gasoso e cortados em 6 séries de seções de criostato coronais de 30 μm e armazenados a -80 oC até uso adicional. Camundongos C57BL/6J usados para investigar a permeabilidade da barreira sangue-cérebro (BBB) de AB143, AB145, AB148, e MS23 foram profundamente anestesiados e perfundidos através do ventrículo esquerdo, usando 10 mL de tampão fosfato cheio Soerensens (SB) (KH2PO4 25 nM, Na2HPO4 125 mM, pH 7,4) seguido por 20 mL de SB contendo 4 % de paraformaldeído (PFA). Os cérebros foram cuidadosamente removidos e pós- fixados em 4 % de PFA por 1 hora seguido por imersão em SB contendo 20 % de sacarose por toda a noite. Os cérebros foram congelados em CO2 gasoso e processados em seções de criostato coronais de 16 μm.

9.5 Determinação de volume do infarto

[0173] Uma série de seções cérebro congelado fresco de cada camundongo foi fixada em 70 % de etanol por toda a noite a 4°C. Seções foram reidratadas e imersas em uma solução azul de toluidina (0,01 %, Merck, Alemanha) diluídas em 80 mmol/L de Na2HPO4x2H2O e 70 mmol/L ácido cítrico), seguido por rinsagem três vezes em H2O e desidratadas em série graduada de álcool (96-99 % de etanol). As seções foram limpas em xileno e colocadas em lamínula de microscópio em Depex (BDH Gurr, UK). Seções foram usadas para análise volumétrica de infarto usando um sistema de microscópio Computer Assisted Sterological Test (CAST) GRID (Olympus, Dinamarca) e o princípio Cavalieri para estimativa de volume. O volume total do infarto (Vtotal) foi calculado usando a fórmula: Vtotal = ∑P * t * aponto, onde ∑Pé o número total de pontos que atinge o infarto, t é a distância média entre as seções, e aponto representa a área por ponto.

9.6 Análise estatística

[0174] A análise estatística foi feita usando o programa Graphpad Instat 5,0 para Windows (GraphPad software, San Diego, CA, USA). Comparação de valores médios de tamanhos de infarto entre dois grupos de camundongos foi feita usando o teste Mann-Whitney não paramétrico. Teste t de Student pareado a 2 fatores foi usado para comparar valores de força de pega obtidos do mesmo camundongo antes e depois da cirurgia. Teste de classificação sinalizada de Wilcoxon foi usado em medições repetidas do mesmo camundongo (Teste de Desempenho Rotarod). Análise a dois fatores de variância foi usada para investigar variáveis independentes (tempo e peso ou temperatura). Todos os dados são apresentados como média ± SEM. Significância estatística foi aceita para P<0,05.

9.7 Os efeitos neuroprotetores de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP a curto prazo

[0175] O efeito protetor de AB144 e Tat-NR2B9c foi comparado com salina no modelo de isquemia cerebral focal pMCAO em camundongos adultos (n=60). Os inibidores foram injetados intravenosamente (3 nmol/g) 30 minutos depois do insulto, seguido por um período de 5,5 horas de sobrevivência pós-cirúrgica (Figura 9). AB144 mostrou uma redução significante de 40 % do dano no tecido isquêmico comparado com camundongos tratados com salina, enquanto que Tat-NR2B9c não forneceu uma redução estatisticamente significante em volumes de infarto (Figura 10). Assim, a combinação de uma alta afinidade notável, devido à estrutura dimérica, e permeabilidade a barreira sangue-cérebro, facilitadas pelo peptídeo Tat, leva ao composto neuroprotetor in vivo, AB144, com atividade superior comparada com Tat-NR2B9c.

9.8 Os efeitos neuroprotetores de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP a longo prazo

[0176] Os efeitos neuroprotetores de longa duração de AB144, AB147, e Tat-NR2B9c, comparados com salina, foram avaliados 48 horas depois de pMCAO (n=80) (Figura 9). AB144 e AB147 forneceram respectivamente uma redução de 37 % e 34 % de tamanho de infarto comparado com camundongos tratados com salina, embora não tenha sido detectada nenhuma redução de infarto estatisticamente significante no tratamento com Tat-NR2B9c (Figura 11 e 12).

9.9 O estado fisiológico de camundongos com pMCAO

[0177] O estado fisiológico dos camundongos foi cuidadosamente monitorado antes e durante a cirurgia de pMCAO a fim de excluir o efeitos observados de tratamento com inibidores de PSD-95 diméricos devido a condições secundárias (por exemplo, relacionadas a doença) resultantes do procedimento experimental.

9.10 Monitoramento de peso corpóreo

[0178] O peso corpóreo de cada camundongo foi registrado durante o pré-treinamento, antes da cirurgia, e a 24 e 48 horas depois da cirurgia e não foi observada nenhuma diferença entre os grupos de tratamento (Figura 13).

9.11 Monitoramento da temperatura:

[0179] A temperatura retal do camundongo foi continuamente medida usando uma sonda termoacoplada conectada a uma unidade Modelo Ba 12 (Physitemp). A temperatura foi medida antes de 30 minutos e depois de pMCAO além de 30 minutos e 2,5 horas depois da injeção i.v., isto é, 1 e 3 horas depois de pMCAO. Não foi observada nenhuma diferença nas taxas de peso corpóreo (Figura 13) ou sobrevivência (>96 %), depois da injeção do medicamento comparado com camundongos tratados com salina.

9.12 Análisede gás no sangue

[0180] Uma amostra de sangue venoso foi tirada para análise de gás no sangue de eletrólitos PO2/PCO2, glicose, lactato, e hematócrito, 30 minutos depois da administração do composto (1 hora depois de pMCAO). Um tubo revestido com heparina capilar foi inserido ao longo do canto interno do olho e virado até que ele penetrou na conjuntiva. Uma amostra de sangue (150 μL) foi coletada e armazenada em gelo até a análise de gás usando o instrumento de gás do sangue GEM Premier 300 (Instrumentation Laboratory) Controles de qualidade (QC ContrlIL9) foram adquiridos pela IL Sensor Systems. Também, não foi detectada nenhuma diferença nos parâmetros de gás do sangue (PO2/PCO2, pH, eletrólitos, glu/lac), que foram similares entre os grupos e na faixa normal, quando comparados com camundongos controles não manipulados (Tabela 4). Tabela 4. Sangue valores foram monitorados durante o experimento pMCAO (período de sobrevivência de 48 horas) a 1 hora depois da cirurgia. Valores são mostrados como média ± SEM. ‘Controle’ indica animais não manipulados.

Exemplo 10. Propriedades neuroprotetoras de inibidores de PSD-95 diméricos CPP conserva função motora em camundongos com isquemia cerebral focal

[0181] Os camundongos com sobrevivência pós-cirúrgica de 48 horas no modelo de acidente vascular cerebral isquêmico (pMCAO) (Exemplo 9) foram examinados usando os três testes comportamentais seguintes a fim de detectar déficits motores que não podem necessariamente manifestar no tamanho do infarto, por meio disso, dando uma impressão mais geral da condição do animal.

10.1 Força de pega

[0182] O medidor de força de pega (BIO-GT-3, BIOSEB) permite o estudo de funções neuromusculares em camundongos determinando a força máxima que é exigida para fazer o camundongo soltar sua pega. A força de pega em patas individuais foi usada para medir a gravidade da assimetria induzida por pMCAO. Foi deixado o camundongo pegar uma pega metálica e então ele foi puxado para trás no plano horizontal. A força aplicada na pega é registrada como a tensão do pico. A força das patas dianteiras individuais e a força de pega total (ambas as patas simultaneamente) foram medidas antes (linha de base) e depois de pMCAO. Cada camundongo é testado em 5 experiências sequenciais e a maior força de pega é registrada como a melhor pontuação.

10.2 Teste de desempenho Rotarod

[0183] O Rotarod (LE 8200, Panlab) é bem adequado para avaliar atividade motora em roedores, efeitos do composto experimental no dano do sistema nervoso central, ou efeitos de doença na coordenação motora, avaliado pelo tempo durante o qual o animal permanece andando em um tambor rotativo. A rotação do Rotarod é acionada por motor e acelera de 0 a 40 rotações por minutos (rpm) por um período de tempo de 5 minutos, em cujo tempo todos os camundongos caíram da haste. Todos os camundongos foram testados em 4 experiências repetidas com um intervalo de 20 minutos (tempo de descanso). Antes da cirurgia os camundongos foram pré-treinados para permanecer na haste por 30 segundos, a 4 rpm.

10.3 O efeito neuroprotetor de inibidores de PSD-95 diméricos contendo CPP preserva a força de pega e coordenação motora

[0184] Camundongos pMCAO tratados tanto com AB144 quanto com AB147 não mostraram nenhuma mudança significante na força total de pega (ambas as patas), embora camundongos tratados com salina ou Tat-NR2B9c tenham perdido uma quantidade significante de força de pega (Figura 14A). Similarmente, análise de força de pega não mostrou nenhuma assimetria entre a pata dianteira direita e esquerda para camundongos tratados com AB144 e AB147 comparado com camundongos tratados com salina e Tat-NR2B9c (Figura 14B), que demonstra claramente o efeito neuroprotetor de AB144 e AB147. No teste de desempenho Rotarod, camundongos tratados com AB144 e AB147 mostraram tanto uma melhoria na habilidade mais pronunciada de aprendizado a curto prazo do que os camundongos tratados com salina (Figura 14C), quanto o tempo total dos camundongos gasto na haste foi significativamente maior (AB144: 83,5 ± 4,1 segundos; AB147: 92,6 ± 4,5 segundos) do que para camundongos tratados com Tat-NR2B9c (65,7 ± 3,6 segundos) (P<0,001).

Exemplo 11. Inibidores de PSD-95 diméricos aliviam condições de dor inflamatória 11.1 Animais

[0185] Camundongos NMRI fêmeas (22-26 gramas) obtidos pela Taconic M&B (Ry, Dinamarca) foram usados para todos os experimentos e tinham 8-9 semanas de idade no momento do teste. Depois da chegada, camundongos tiveram uma aclimatização mínima de 7 dias em gaiolas Macrolon III (20 x 40 x 18 cm) com 7 camundongos por gaiola. Alimento e água foram disponíveis ad libitum em um ciclo de 12/12 horas luz/escuro com luzes a partir das 6 am. Experimentos foram realizados entre 9:00 am e 16:00 pm em temperatura e ambientes umidade regulada (22-24°C, umidade relativa: 60-70 %). Todos os procedimentos de teste foram de acordo com “Principles of Laboratory Animal Care” (NIH publication No. 85-23, revised 1985) e o Danish Animal Experimentation Act, e todos os foram feitos esforços para minimizar o sofrimento do animal.

11.2 Indução de dor inflamatória por Adjuvante de Freund completo e administração do composto

[0186] Dor inflamatória persistente foi induzida por injeção subcutâneas (s.c.) de 20 μL de suspensão de adjuvante de Freund completo (CFA; 1 mg/mL Mycobacterium tuberculosis; Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) na superfície plantar d pata traseira esquerda, usando uma microsseringa GASTIGHT® de 50 μL (Hamilton Company) com uma agulha de bitola 301/2. Medições da linha de base de patamar de retirada dos estímulos mecânicos foram realizadas uma vez diariamente, três vezes antes da injeção de CFA. Veículo (0,9 % de salina) ou AB125 (3, 10, ou 30 mg/kg) foram dados intraperitonealmente em um volume de injeção de 10 mL/kg (AB125 dissolvido em 0,9 % de salina). CFA e veículo/AB125 foram administrados pelo menos 24 horas antes de teste de sensibilidade mecânica.

11.3 Teste de Dor- O teste Von Frey para alodinia/hiperalgesia mecânica induzida por CFA

[0187] Para avaliar o grau de hiperalgesia/alodinia induzida por tratamento com CFA os 50 % do patamar de remoção da pata (PWT) para estímulos mecânicos foram medidos usando o método para cima e para baixo (Chaplan et al., J Neuroscience Methods, 1994, 53, 55-63). Resumidamente, camundongos foram colocados individualmente em caixa de plástico vermelho escuro transparente no piso de malha de arame metálico por pelo menos 30 minutos para adaptar no ambiente. Uma série de filamentos von Frey (Stoelting, Wood Dale, IL) com forças de dobradura equivalentes a 0,008, 0,02, 0,04, 0,07, 0,16, 0,40, 0,60, 1,00, e 1,4 grama foi usada para distribuir os estímulos. Começando com filamento 0,6, os filamentos von Frey foram aplicados perpendicularmente na superfície plantar das patas traseiras por 4-5 s. Quando ocorreu uma resposta positiva a um estímulo, o seguinte filamento von Frey menor foi aplicado. Quando ocorreu uma resposta negativa, o seguinte filamento maior foi usado. O padrão de respostas positivas e negativas foi convertido em 50 % de patamar (Chaplan et al., J Neuroscience Methods, 1994, 53, 55-63), que foi expresso como valores em grama (g) de acordo com a fórmula seguinte: 50 % PWT= 10A(G+0.2237*K), onde G é a força de dobradura do último filamento von Frey e K é o valor obtido da tabela padronizada com base no padrão para cima e para baixo. Levantamento da pata devido a comportamento motor normal foi ignorado, e teste durante sono profundo, autolimpeza e exploração foi evitado. Tratamento foi cego para a pessoa de teste.

11.4 Transmissão social de teste de preferência de alimento

[0188] STFP foi conduzido em duas fases. Primeira fase: um camundongo ‘demonstrador' de cada gaiola de 4 camundongos privados de alimento foi transferido para uma gaiola separada e pôde comer por 30 minutos de alimento moído misturado tanto com 1 % de canela quanto com 2 % de cacau em pó. Então os camundongos ‘demonstradores’ foram levados de volta para suas respectivas gaiolas de residência por 30 minutos. Durante esta ‘fase de apresentação’ o número de interações entre os três camundongos ‘observadores’ e os camundongos demonstradores foi pontuado. Um mínimo de 2 e um máximo de 5 interações de lambida/farejamento foram estabelecidas como critério para aquisição apropriada de aviso de odor. Depois desta primeira fase, o camundongo ‘demonstrador’ foi removido e os três camundongos ‘observadores’ foram transferidos para uma gaiola limpa com livre acesso a alimento e água por 4 horas antes da privação de alimento preparando-os para a segunda fase. Segunda fase: após um intervalo de 24 horas de retenção, os camundongos observadores foram colocados individualmente em gaiolas contendo duas bandejas de alimento moído com cheiro de canela ou cacau, respectivamente. A quantidade comida do alimento sugerido com relação ao alimento inédito é tomada como um índice de memória para o alimento previamente sugerido. Estudos pilotos mostraram que os camundongos não mostram nenhuma preferência inerente quando tiveram uma escolha entre alimento com cheiro de canela e cacau. Ainda, experimentos foram planejados de um modo balanceado para garantir que um número igual de camundongos em cada grupo de tratamento fosse sugestionado com canela e cacau, respectivamente.

11.5 Labirinto Y modificado

[0189] Teste foi realizado em um labirinto Plexiglass claro composto de 2 braços perpendiculares conectados a uma saída. Os 2 braços (disponíveis para exploração) e saída tiveram 50 cm de comprimento e 8 cm de largura, envoltos por paredes claras de Plexiglass de 30 cm de altura. Cada braço atendeu a uma plataforma central equipada com partições removíveis pretas, permitindo que os braços fossem abertos e fechados como desejado. Todo o labirinto foi fechado em uma caixa triangular preta Plexiglass (1x1x1 m). As paredes desta caixa externa envolvendo cada braço de exploração foram cobertas com avisos óticos distintos, por exemplo, linhas horizontais ou verticais brancas. A área vizinha da saída não conteve avisos óticos e teve a cor preta. Cada braço do labirinto foi separado um do outro por uma partição opaca, assim, um camundongo na entrada de um braço somente poderia ver os avisos óticos distintos deste braço particular. O teste consistiu em duas fases: Na fase 1 (habituação), o camundongo (n=8-10) foi colocado na extremidade da saída e teve acesso a um dos braços de exploração por escolha forçada (isto é, o outro braço foi fechado). Depois que o camundongo introduziu o braço, acesso na saída foi bloqueado, e foi permitido que camundongo explorasse o braço (denominado familiar) por um período de 5 minutos. O braço familiar foi alternado sistematicamente para eliminar qualquer preferência de lugar pra confundir o ensaio. Imediatamente em seguida, na fase 2 (teste), foi permitido que camundongo explorasse tanto os braços de exploração familiares quanto os não familiares, mas não o saída, por um período de 2 minutos. O tempo cumulativo gasto em cada braço foi registrado durante esta sessão de teste por um sistema de rastreamento por vídeo automatizado (Ethovision, Noldus). Um índice de discriminação (DI) foi calculado para cada camundongo, definido como a diferença no tempo gasto no braço inédito e no familiar dividida pelo tempo total gasto no braço inédito e no familiar durante o teste da fase 2, isto é, DI = (inédito-familiar)/(inédito+familiar).

[0190] Função motora foi avaliada usando um Rotarod de aceleração (MedAssociates, Inc., VT, USA). A velocidade do Rotarod (3,2 cm de diâmetro) foi aumentada de 4 a 40 rpm por um período de 300 s com o tempo mínimo possível para gastar na haste designada como 0 s e o tempo máximo de corte ajustado a 310 s. Cada camundongo foi testado imediatamente antes de tratamento com medicamento (t=0), e novamente 15, 30, 45 e 60 minutos depois do tratamento com medicamento. Quando um animal caiu do tambor rotativo, um fotofeixe foi automaticamente quebrado para registrar a quantidade de tempo gasto na haste rotativa.

11.7 Análise de Dados

[0191] Dados da dor: o patamar mecânico da linha de base foi definido como a média de medições von Frey tomadas três dias consecutivos antes do tratamento com CFA, com o última medição da linha de base tomado no mesmo dia do tratamento com CFA. Análise estatística foi realizada usando análise de covariância de medida repetida a 2 fatores (RM- ANCOVA), com tratamento como o fator independente, tempo como o fator repetido, e patamar mecânico da linha de base como a covariada. A RM- ANCOVA foi seguida por comparações planejadas na média prevista para avaliar o efeito dos tratamentos com relação ao tempo na sensibilidade do patamar. A análise foi realizada nos dados brutos, embora os resultados sejam descritos como valores relativos (por exemplo, linha de base definido como 1).

[0192] Dados cognitivos: Na transmissão social de teste de preferência de alimento, a preferência para o alimento sugerido foi expressa como um índice de discriminação, DI = (sugerido-novo)/(sugerido+novo). No labirinto Y modificado, a preferência para o braço novo foi expressa como um índice de discriminação, DI = (tempo em novo - tempo em familiar)/(tempo em novo + tempo em familiar). Dados de STFP e labirinto Y foram analisados por ANOVA a 1 fator seguidos por comparações planejadas que foram realizadas para avaliar efeitos de tratamento no índice de discriminação.

[0193] Desempenho motor: No teste Rotarod, efeito de tratamento na coordenação motora foi analisado usando uma ANOVA RM a 2 fatores, com tratamento como o fator independente e tempo como medida repetida. Procedimento de comparações planejadas foi usado para avaliar efeitos de tratamento com o tempo.

11.8 AB125 reduz alodinia/hiperalgesia mecânica induzida por CFA

[0194] AB125 reduz resposta a dor induzida por CFA quando injetado intraperitonealmente tanto a 3, 10 quanto a 30 mg/kg (Figura 17). Isto é mostrado injetando CFA e AB125 simultaneamente nos camundongos, e medindo alodinia/hiperalgesia mecânica 24 horas mais tarde. Este resultado ilustra que inibidores de PSD-95, sem um CPP anexado, são analgésicos eficientes contra dor mecânica inflamatória (induzida por CFA) e, portanto, agentes prometedores em tratamento de condições de dor crônica.

11.9 Efeitos analgésicos de AB125 comparados com MK-801 no modelo de dor de CFA

[0195] Quando administrado simultaneamente com CFA, tanto o antagonista do receptor de NMDA MK-801 clássico quanto AB125 impediu o desenvolvimento de hiperalgesia mecânica induzida por CFA 1 hora e 24 horas depois do tratamento (Figura 18).

11.10 Efeitos analgésicos prolongados de AB125 quando dado 24 horas depois de injeção de CFA

[0196] Quando AB125 foi dado 24 horas depois de injeção de CFA, o teste ANCOVA revelou uma reversão significante da hiperalgesia induzida por CFA a 3 e 10 mg/kg depois de 1 hora. Além do mais, esta reversão foi ainda observada depois de 24 horas nos grupos tratados tanto com 3 mg/kg quanto com 10 mg/kg; e a 72 horas, a hiperalgesia foi revertida significativamente por todas as doses (1, 3, e 10 mg/kg) (Figura 19). Uma medição adicional foi feita 8 dias depois do tratamento com AB125, mas neste ponto de tempo os animais tratados com salina tiveram recuperação espontânea no nível da linha de base, impedindo a detecção de um efeito potencialmente analgésico de AB125.

11.11 Test de AB125 e MK-801 em testes comportamentais de cognição e função motora.

[0197] Para examinar os perfis de efeito colateral comparamos os efeitos de AB125 e MK-801 no teste de transmissão social de preferência de alimento (STFP) de memória a longo prazo, e no teste labirinto Y modificado de atenção bem como no teste Rotarod de desempenho motor. A dose que reduz a hiperalgesia, MK-801 induziu déficits cognitivos nos testes STFP (Figura 20) e labirinto Y modificado (Figura 21) bem como déficits motores no teste Rotarod (Figura 22). Ao contrário, AB125 não induziu nenhum déficit da função cognitiva ou motora nesses testes em doses analgésicas, ou mesmo em doses mais altas (até 60 mg/kg) (Figura 20-22). Assim, inibidores de PSD-95 na forma de AB125 fornecem um eficiente efeito analgésico contra dor mecânica inflamatória (induzida por CFA) e, além disso, isto é sem induzir efeitos colaterais função cognitiva ou motora, como é observado para o antagonista do receptor de NMDA MK-801 clássico. Consequentemente, inibidores de PSD-95 diméricos são agentes prometedores em tratamento de dor crônica.

11.12 AB144 reduz alodinia/hiperalgesia mecânica induzida por CFA

[0198] AB144 também reduz resposta a dor induzida por CFA, conforme mostrado injetando AB144 intraperitoneal e simultaneamente com a injeção de CFA e medindo alodinia/hiperalgesia mecânica 1 e 24 horas mais tarde. O teste ANCOVA estatístico revelou uma reversão significante da hiperalgesia induzida por CFA na dose de 30 mg/kg depois de 1 hora e nas doses de 10 e 30 mg/kg depois de 24 horas (Figura 23). Este resultado ilustra que os inibidores de PSD-95, com um CPP anexado, são analgésicos eficientes contra dor mecânica inflamatória (induzida por CFA) e, portanto agentes prometedores em tratamento com condições de dor crônica.

Exemplo 12. Inibidores de PSD-95 diméricos entram no tecido da medula espinhal 12,1. Método de detecção da medula espinhal de inibidores de PSD-95.

[0199] Os inibidores de PSD-95 diméricos AB143 e AB145 são os derivados de AB141 e AB144 etiquetados com 5-FAM, respectivamente (Figura 4). Consequentemente, AB143 serve como um composto substituto para investigar as propriedades farmacocinéticas de AB125/141, embora AB145 sirva como um composto substituto para AB144. Para investigar se AB143 e AB145 são capazes de entrar no tecido da medula espinhal, eles foram administrados nos camundongos por injeção intraperitoneal (30 mg/kg). Os camundongos tratados com medicamento foram decapitados 30 minutos depois da injeção, e a medula espinhal foi cuidadosamente dessecada, na qual 5 % de ácido tricloroacético (TCA) (300 μL por 0,1 g de tecido) foram adicionados e o tecido homogeneizado com um homogeneizador ultrassônico (em gelo). O tecido homogeneizado foi vortexado e centrifugado por 10 minutos (20.000 g a 4°C). O sobrenadante foi transferido para um tubo de teste e evaporado, e o resíduo foi reconstituído em água e sua intensidade de fluorescência foi determinada usando uma fluorescência leitora de placa (excitação/emissão: 470/525 nm). Para quantificação dos compostos, uma curva padrão foi preparada colocando uma quantidade conhecida de AB143 e AB145 no tecido da medula espinhal dos camundongos controles antes da homogeneização, seguido por desenvolvimento e análise similar nos camundongos tratados com medicamento.

12.2. Inibidores de PSD-95 são encontrados na medula espinhal.

[0200] Um aumento na fluorescência claro e distinto foi medido em tecido da medula espinhal dos camundongos tratados com AB143 e AB145 comparados com camundongos tratados com salina. Com base na curva padrão, as concentrações foram determinadas 0,061 nmol/g e 0,074 nmol/g de AB143 e AB145, respectivamente. Essas concentrações são acima de valores Kd dos compostos com relação a PSD-95 (5-10 nM), por meio disso, suportando que tanto AB143 (e assim AB125) quanto AB145 (e assim AB144) são capazes de entrar no tecido da medula espinhal de CNS as concentrações relevantes a fim de inibir PSD-95 e, por meio disso, aliviar dor. Tabela 5. Concentrações de AB143 e AB145 em medula espinhal depois de injeção intraperitoneal (30 mg/kg) em camundongos.

Claims (17)

1. Composto, caracterizadopelo fato de compreender um primeiro peptídeo ligado a um segundo peptídeo por um ligante, em que o primeiro e o segundo peptídeos compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com uma sequência YTXV ou YSXV, em que: a. Y é selecionado entre E, Q e A, e b. X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me- D E N-Me-N, e em que o ligante compreende PEG e, em que pelo menos um átomo de oxigênio do PEG é substituído por um átomo de nitrogênio para dar NPEG, em que um peptídeo de penetração celular (CPP) é ligado ao átomo de nitrogênio do ligante por uma ligação de amida, e em que o CPP compreende pelo menos 4 resíduos de aminoácidos selecionados de arginina e/ou lisina.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende 4 a 28 frações de etileno glicol (N=4- 28).

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o ligante é um ligante NPEG-diácido, e em que cada grupo carboxila do ligante é ligado a um resíduo terminal do primeiro ou do segundo peptídeo.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que CPP compreende um peptídeo retroinverso.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelo fato de que o CPP é um peptídeo Tat com sequência de aminoácido YGRKKRRQRRR ou um peptídeo retroinverso-D-Tat com sequência de aminoácido de rrrqrrkkr.

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro peptídeo e/ou o segundo peptídeo tem de 5 a 10 resíduos ligados a amida de comprimento.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou segundo peptídeo é compreendido de pelo menos 4 resíduos de aminoácidos L.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro peptídeo e/ou o segundo peptídeo é N-alquilado.

9. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em:

10. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é como um medicamento.

11. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para a profilaxia e/ou tratamento de uma doença excitotóxica, selecionada do grupo consistindo de lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, lesão cerebral traumática, lesão isquêmica do sistema nervoso central (SNC), epilepsia e doenças neurodegenerativas do SNC.

12. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para profilaxia e/ou tratamento de dor em um indivíduo.

13. Uso de um composto compreendendo um primeiro peptídeo ligado a um segundo peptídeo por um ligante, em que o primeiro e o segundo peptídeos compreendem pelo menos quatro resíduos ligados a amida com uma sequência YTXV ou YSXV, em que a. Y é selecionado entre E, Q e A, e b. X é selecionado entre A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me- D e N-Me-N; caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para a profilaxia e/ou tratamento de dor.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante PEG e compreende 4 a 28 frações de etileno glicol (N=4-28).

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante PEG-diácido e cada grupo carboxila do ligante é ligado a um resíduo terminal do primeiro ou do segundo peptídeo.

16. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito composto é selecionado do grupo consistindo em PEG4(IETAV)2, NPEG4(IETAV)2, PEG6(IESDV)2, e PEG4(IESDV)2.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 16,caracterizado pelo fato de que a dor é dor inflamatória ou dor neuropática.

Images