KR20140038224A - 폴리아미도아민 덴드리머를 기반으로 하는 경피 전달 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부 효능 물질을 피부 내로 전달하는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머를 이용하여 효능 물질을 피부 내로 효과적으로 전달하여 효능 물질에 의한 효과를 보다 상승시킬 수 있는 경피 전달 시스템에 관한 것이다.
Description
본 발명은 피부 효능 물질을 피부 내로 전달하는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머를 이용하여 효능 물질을 피부 내로 효과적으로 전달할 수 있는 경피 전달 시스템에 관한 것이다.
덴드리머(dendrimer)는 중심의 핵에서부터 일정한 단위구조가 반복적으로 뻗어나가 특수한 구조를 가진 입체적인 구형의 거대분자로서, 1978년 독일의 V교수가 처음으로 보고하였다. 고분자가 자라는 모양이 나무의 가지가 뻗어가는 모습을 닮았다 하여, 그리스어로 ‘tree’라는 뜻의 “Dendron”에서 유래된 말이다.
이러한 덴드리머의 특성은 분자량이 좁은 분포를 가지는 단분산성(monodispersity)인 3차원의 거대분자로, 구조와 사슬 말단의 작용기가 덴드리머의 물리적, 화학적 성질을 결정한다.
1. 구조적 특성
나노 사이즈의 구형구조로, 핵(core)을 중심으로 층을 이루며 가지의 성장단계에 따라 1세대(G1), 2세대(G2), 3세대(G3) 등으로 구분한다. 세대가 증가하면서 점차 가지의 밀도가 증가하고, 일정 세대 이상이 되면 공간 부족으로 인해 더 이상 가지가 성장하지 못하게 된다. 세대에 따라 평면 타원형에서 조밀한 구형으로 모양이 변화된다. 덴드리머 분자 중심부에는 빈 공간(cavity)이 존재하는데(도 1), 이로 인해 다양한 물질의 운반체로 이용될 수 있다. 거대 분자의 바깥 부분에 위치하는 말단 관능기가 덴드리머 분자의 특성을 결정하고, 말단 부분과 용매의 상호작용에 의해 덴드리머의 형태가 결정된다.
2. 물리화학적 특성
기존의 선형고분자가 분자량이 증가함에 따라 점도가 증가하는 것에 반하여, 덴드리머는 분자량에 따라 점도가 증가하다가 한계 분자량 이상에서는 점도가 감소하는 현상을 나타낸다. 덴드리머의 유리전이온도는 세대에 따라 증가하다가 어느 정도 이상에서는 일정한 온도를 유지하며, 최외각 작용기의 극성이 클수록 더 높은 유리전이온도를 나타낸다. 덴드리머의 용해도는 용매의 극성과 pH, 염에 따라 최외각 작용기에 영향을 받는다.
3. 응용
대부분의 덴드리머의 중심부에는 빈 공간이 존재하기 때문에 다양한 물질의 담지가 가능하고 표면을 원하는 대로 변화시킬 수 있으며, 독성이 적고 생체 적합성을 지니기 때문에 재료공학이나 의학, 약물전달, 에너지 전달 등 여러 분야로 응용이 가능하며 점차 그 범위가 확장되는 추세이다.
특히, 덴드리머 고분자는 세포를 통과할 수 있는 크기이므로, 의학분야에서 활용될 수 있다. 약물은 세포를 가로질러 확산되어야 하는데 이는 매우 느린 공정이면서 높은 약물의 농도를 원하기 때문에 그만큼 정상 세포와 조직에 손상을 준다. 이 때, 약물을 탑재한 덴드리머는 주위의 건강한 조직을 상하지 않고 원하는 의약을 감염 부위나 종양 부위에 선택적으로 전달할 수 있다. 또 전하를 가지고 있어서 세포내 투과가 어려운 항바이러스제나 유전 물질들을 전달하는데도 사용될 수 있다.
이와 같이 덴드리머를 합성하고 이를 약물전달체로 사용하고자 하는 연구는 이미 상당부분 진행되었고, 이에 대한 기본 특허가 선점되었다. 하지만 화장품 분야에서의 용도로서의 개발은 거의 이루어지지 않았다.
덴드리머를 사용한 선행 기술로서는 US 2008/0014161 A1, US2008/0226578 A1 등이 존재한다. 그러나, 이들 발명은 케라틴 성분을 위한 새로운 코팅 물질에 초점을 맞추고 있는 것으로, 지속적으로 헤어 코팅이 가능한 물질이 되기 위한 안정적인 흡착성을 강조하는 것이다.
그러나, 화장품에 사용되는 효능 물질의 효과적인 경피 전달에 대해서는 전혀 개시하고 있지 않다.
이에 본 발명자들은 효능 물질을 피부에 보다 효과적으로 전달하여 피부 흡수율을 높임으로써 보다 높은 피부 개선 효과를 얻고자 경피 전달 시스템에 대하여 연구한 결과, 덴드리머를 효능 성분의 전달체로서 사용할 경우 피부에 안전하면서도 효능 성분의 전달 효율이 상당히 높아져 피부 흡수율이 증가함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 덴드리머를 기반으로 하는 경피 전달 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리아미도아민 덴드리머로 이루어진 경피 전달 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 효능 성분을 담지한 상기 폴리아미도아민 덴드리머를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 폴리아미도아민 덴드리머는 효능 성분을 피부 경피에 효과적으로 전달함으로써 피부 흡수를 증진시키고, 이에 따라 성분의 효능을 극대화시키는데 도움이 된다.
도 1은 덴드리머의 일반적인 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 덴드리머의 응용 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 덴드리머의 합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 덴드리머와 효능 물질의 컨쥬게이션을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 5는 효능 물질을 덴드리머의 내부로 캡슐화시키는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6은 2세대 PAMAM과 플루오레세인 이소티오시아네이트의 컨쥬게이션 형성을 나타낸 것이다.
도 7은 2세대 덴드리머와 4세대 덴드리머의 피부 투과능을 나타낸 것이다.
도 2는 덴드리머의 응용 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 덴드리머의 합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 덴드리머와 효능 물질의 컨쥬게이션을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 5는 효능 물질을 덴드리머의 내부로 캡슐화시키는 방법을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6은 2세대 PAMAM과 플루오레세인 이소티오시아네이트의 컨쥬게이션 형성을 나타낸 것이다.
도 7은 2세대 덴드리머와 4세대 덴드리머의 피부 투과능을 나타낸 것이다.
본 발명은 덴드리머를 이용한 경피 전달 시스템에 관한 것으로서, 구체적으로는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머를 이용하여 효능 물질을 피부 내로 효과적으로 전달할 수 있는 경피 전달 시스템에 관한 것이며, 이는 화장품적인 용도 뿐만 아니라, 덴드리머의 표면 작용기에 다양한 효능 성분을 컨쥬게이션시키거나, 또는 리포좀 타입(encapsulation)으로 이용하여 피부 흡수를 증진시키고 이에 따라 효능 효과를 극대화시킬 수 있다.
1. 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머의 합성법
본 발명에 따른 덴드리머는 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 다음과 같은 방법으로 합성할 수 있다. 또한, 반응 초기에 있어서 낮은 온도에서 실시하는 것이 반응을 천천히 진행시킬 수 있어서 바람직하다.
초기 합성물질인 에틸렌다이아민(Ethylene Diamine)을 MeOH에 녹인 후 20℃에서 과량의 아크릴산 메틸(Methyl Acrylate)을 첨가하고, 상온 질소 조건하에서 4일 동안 교반한 후 남은 아크릴산 메틸과 메탄올을 제거하면 덴드리머 -0.5세대(Generation)가 생성된다. 여기에 과량의 에틸렌다이아민 메탄올에 녹인 후 20℃에서 적가한 후 상온에서 교반시킨다. 이 때 초기 반응은 12시간 이내에 95% 이상 종결되지만, 합성된 물질의 안정화를 위하여 7일간 교반하며, 그 이후 미반응된 에틸렌다이아민을 제거한다. 이와 같이 반응을 하였을 때 덴드리머의 0세대가 만들어 진다.
그 다음 아크릴산 메틸과 에틸렌다이아민을 첨가하고 반응시키는 상기 공정을 반복함으로써 1세대, 2세대, 3세대, 4세대 등 다양한 덴드리머의 세대를 가진 물질을 확보할 수 있다(도 3 참조).
본 발명에서 사용가능한 덴드리머의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 0세대(분자량: 517), 1세대(분자량: 1430), 2세대(분자량: 3256), 3세대(분자량: 6909), 4세대(분자량: 14215), 5세대(분자량: 28826), 6세대(분자량: 58048)세대을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 0세대에서 4세대의 덴드리머가 본 발명의 경피 전달 시스템에 사용된다.
2. 덴드리머 효능물질 컨쥬게이션
본 발명의 덴드리머에 결합시키는 효능 물질은, 아미노산, 펩타이드 또는 단일 활성 화합물 등 화장품에 사용되는 모든 효능물질이 가능하며, 예를 들어 코직산, 미녹시딜, 카페인산, 알부틴, 아스코르브산, 레티놀, 에피갈로카테킨 갈레이트, 올레아놀산, 글라브리딘 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
덴드리머와 효능 물질의 결합은 두 분자간의 직접적인 결합방식과 매개체를 이용하여 덴드리머와 효능 물질의 컨쥬게이트를 형성시키는 방법과 효능물질을 덴드리머 내부로 포집하여 캡슐화(encapsulation)함으로써 리포좀을 형성하는 방법이 있다. 직접적인 컨쥬게이션 방법과 캡슐화시키는 방법에 있어서 사용되는 효능 물질의 종류가 구별되는 것은 아니지만, 바람직하게는 덴드리머의 아민과 아민 반응, 에스테르 반응, 에테르 반응 등을 통해 결합할 수 있는 -OH, -COOH, -CHO 등의 말단기가 효능 물질에 존재하는 경우에는 덴드리머와 직접 컨쥬게이션을 형성할 수 있으며, 이러한 말단기가 부족하거나 반응성이 부족한 경우에는 캡슐화를 통하여 덴드리머와 결합될 수 있다.
또한, 덴드리머와 효능 물질의 결합 비율은 효능 물질의 반응성에 따라서 상이하며, 그 비율이 특히 한정되는 것은 아니지만, 경피 흡수율을 높이기 위해서는 덴드리머의 아민기와 효능 물질의 결합 비율이 바람직하게는 1:2~15:1, 보다 바람직하게는 2:1~10:1, 보다 더 바람직하게는 1:1~4:1인 것이 좋다.
1) 직접 및 매개체를 이용한 컨쥬게이션 방법
덴드리머와 효능 물질의 결합 시 두 물질간의 용해도에 차이가 나기 때문에 화합물의 용해도 조건을 동일시하기 위하여 효능 물질에 매개체를 연결하여 용해도를 개선시키고, 컨쥬게이션을 용이하게 하기 위하여 아미노산 1개 혹은 2개 이상의 아미노산 결합물질(펩타이드 구조) 및 합성에서 좋은 이탈기(good leaving group)를 가지고 있는 화학물질, 예를 들어 p-니트로페닐 클로로포르메이트(p-nitrophenyl chloroformate) 등을 사용하여 직접 혹은 간접적으로 컨쥬게이션시킬 수 있다. 도 4에 대표적으로 합성한 예를 나타내었다.
도 4의 A와 같이 4세대 PAMAM 덴드리머에 인간 EGF를 모방(mimic)한 펩타이드 컨쥬게이션을 합성하였다. 그 다음, MALDI-TOF를 이용하여 분자량을 측정하고 구조 분석을 위하여 NMR로 측정한 결과 덴드리머와 인간 EGF가 컨쥬게이션되었으며 G4 덴드리머 한 분자당 펩타이드 8.139개가 결합되어 있음을 G4 덴드리머 분자량(12767.9 Da)과 덴드리머-펩타이드 분자량(19458.3 Da) 비교에서 확인할 수 있었다. 또한 2세대 덴드리머에 카페인산 합성결과 도 4의 B에서 보는 바와 같이 덴드리머 한 분자당 1.4개의 카페인산이 결합됨을 관찰할 수 있었다.
2) 효능물질을 덴드리머 내부로 캡슐화시키는 방법 및 덴드리머 리포좀(Dendrosome) 제조
이에 대한 예가 도 5에 제시되어 있다. 덴드리머의 친수성을 증가시키는 방법의 하나로 1.5 세대의 말단에 트리스(메틸 하이드록시) 아미노 메탄으로 사슬을 연장한 후 작은 활성 화합물을 덴드리머 구체의 안쪽으로 집어넣어 아미드의 O 또는 N과 수소결합을 이루도록 하여 캡슐화시킬 수 있다. 이에 대해서는 도 5에 간략히 나타내었다.
상기한 방법으로 제조한 폴리아미도아민 덴드리머는 피부 효능 성분과 결합하여 덴드리머 컨쥬게이트로서, 또는 내부에 효능 성분을 포집한 리포좀으로서 화장료 조성물 내에 함유될 수 있다. 이 때, 상기 덴드리머 컨쥬게이트 또는 리포좀은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~30중량%, 바람직하게는 0.001~1중량%의 양으로 함유될 수 있다. 상기 함량이 0.0001중량% 미만이면 피부 투과를 통한 효능 물질의 효능이 미미할 수 있으며, 30중량%를 초과하면 피부 자극 등에 대한 안전성 문제를 유발할 수 있다.
이하, 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[참고예 1] 덴드리머의 합성
에틸렌다이아민(Ethylene Diamine)을 MeOH에 녹인 후 20℃에서 과량의 아크릴산 메틸(Methyl Acrylate)을 첨가하고, 상온 질소 조건하에서 4일 동안 교반한 후 남은 아크릴산 메틸과 메탄올을 제거하여 덴드리머 -0.5세대를 생성하였다. 여기에 과량의 에틸렌다이아민 메탄올에 녹인 후 20℃에서 적가한 후 상온에서 7일간 교반하고 미반응된 에틸렌다이아민을 제거하여 0세대 덴드리머를 생성하였다.
그 다음 아크릴산 메틸과 에틸렌다이아민을 첨가하고 반응시키는 상기 공정을 2번 더 반복하여 2세대 덴드리머를, 4번 더 반복하여 4세대 덴드리머를 생성하였다.
[참고예 2] 덴드리머와 코직산의 컨쥬게이션
상기 참고예 1에서 제조한 2세대 또는 4세대의 덴드리머와 코직산의 컨쥬게이션은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
[반응식 1]
둥근 플라스크에 코직산(1당량)을 메틸렌클로라이드에 녹인 후 염화티오닐(1.2당량)을 상온에서 천천히 적가하면서 혼합 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 물을 적가하여 물과 메틸렌클로라이드를 층분리하고 유기용매층에 마그네슘설페이트(MgSO4)를 첨가하여 수분을 제거하고 유기용매를 농축한 후 헥산을 이용하여 재결정하여 코질클로라이드(Kojyl Chloride)를 얻었다. 상기 참고예 1의 2세대 또는 4세대의 PAMAM 덴드리머 20mg을 0.5mL의 물에 녹인 후 DMF 2mL에 5.02mg 코질클로라이드를 녹인 용액을 적가하고 24시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 Spectra/Por 500 MWCO 막을 사용하여 하루 동안 투석 반응을 통해 컨쥬게이션된 화합물의 순도를 높이고 이를 동결건조하여 최종 샘플을 얻었다.
[참고예 3] 덴드리머와 올레아놀릭산의 컨쥬게이션
상기 참고예 1에서 제조한 2세대 또는 4세대의 덴드리머와 올레아놀릭산(Oleanolic acid)의 컨쥬게이션은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
[반응식 2]
올레아놀릭산을 DMF/DMSO(3:1) 4mL에 녹인 후 1-에틸-3(3-디메틸 아미로프로필) 카보디이미드(EDC)와 N-하이드록시석신이미드(NHS) 각 1당량을 적가하여 올레아놀릭산을 활성화시켰다. 여기에 상기 참고예 1의 2세대 또는 4세대의 PAMAM 덴드리머 40mg을 1mL의 물에 녹인 후 적가하여 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 Spectra/Por 500 MWCO 막을 사용하여 하루 동안 희석 반응을 통해 컨쥬게이션된 화합물의 순도를 높이고 이를 동결건조하여 최종 샘플을 얻었다.
[참고예 4] 덴드리머와 펩타이드의 컨쥬게이션
상기 참고예 1에서 제조한 2세대 또는 4세대의 덴드리머와 펩타이드의 컨쥬게이션은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
[반응식 3]
상기 참고예 1의 2세대 또는 4세대의 PAMAM 덴드리머 15mg(0.004607mmol)을 2mL의 물에 녹이고, 여기에 8.04mg의 설포-SMCC(설포석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸] 사이클로헥산-1-카보실레이트)를 0.5mL 물에 용해시킨 것을 적가하여 상온에서 15분 동안 교반하였다. 여기에 13.6mg(0.01843mmol, 10당량)의 펩타이드를 천천히 적가한 후 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 이 때 사용한 펩타이드는 시스테인-리신-류신-티로신-글리신-아르기닌과 같이 6개의 아미노산으로 이루어진 것이다. 반응 종결 후에 Spectra/Por 3500 MWCO 막을 사용하여 하루 동안 희석 반응을 통해 컨쥬게이션된 화합물의 순도를 높이고 이를 동결건조하여 최종 샘플을 얻었다.
[참고예 5] 덴드리머와 플루오르세인 이소티오시아네이트(FITC)의 컨쥬게이션
플루오르세인 이소티오시아네이트을 DMSO 200μL에 녹인 후, 여기에 1mL의 DMSO에 상기 참고예 1의 2세대 또는 4세대의 PAMAM 덴드리머 10mg을 녹인 것을 천천히 적가한 후 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 Spectra/Por 500 MWCO 막을 사용하여 하루 동안 희석 반응을 통해 컨쥬게이션된 화합물의 순도를 높이고 이를 동결건조하여 최종 샘플을 얻었다.
[참고예 6] 덴드리머와 카페인산의 컨쥬게이션
카페인산을 DMF/DMSO(3:1) 5mL에 녹인 후 1-에틸-3(3-디메틸 아미로프로필) 카보디이미드(EDC)와 N-하이드록시석신이미드(NHS) 각 1당량을 적가하여 카페인산을 활성화시켰다. 여기에 1mL의 물에 상기 참고예 1의 2세대 또는 4세대의 PAMAM 덴드리머 30mg을 녹인 것을 적가한 후 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 Spectra/Por 500 MWCO 막을 사용하여 하루 동안 희석 반응을 통해 컨쥬게이션된 화합물의 순도를 높이고 이를 동결건조하여 최종 샘플을 얻었다.
[참고예 7] 덴드리머 리포좀의 합성
덴드리머 리포좀(즉, 덴드로좀)은 다음의 방법으로 제조하였다.
HBG(120mM HEPES-buffered glucose, 5%, pH 7.4) 완충액에 참고예 1의 2세대 덴드리머를 적절한 농도로 희석하고 여기에 일정양의 효능 물질을 첨가하여 덴드리플렉스(dendriplex)를 제조하였다.
그 후 EggPC(L-α-포스파티딜콜린, chicken, 95%) : DOPE(1,2-디-(9-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민) : 콜레스테롤이 4.75몰 : 4.75몰 : 1.5몰의 몰 비율로 섞여 있는 용액에서 클로로포름을 증발시켜 얇은 지질 층을 얻었다. 그리고 진공 건조 상태로 밤새 두고 잔류 클로로포름을 완전히 제거하였다. 획득한 지질을 제조된 HBG(120mM HEPES-buffered glucose, 5%, pH 7.4) 완충액에 수화시켜 잘 흔들어 주고(vortexing), 200nm 막 필터를 통해 여과하였다. 여기에 앞서 제조한 덴드리플렉스(덴드리머/효능물질 콤플렉스)를 첨가하여 잘 흔들어 준 후 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 덴드로좀을 제조하였다.
[시험예 1] 덴드리머의 피부투과 시험 결과
1) 2세대 덴드리머 또는 4세대 덴드리머와 이소티오시아네이트의 컨쥬게이션을 통한 피부 투과력
덴드리머의 피부투과 능력을 알아보기 위하여 2세대 덴드리머 또는 4세대 덴드리머에 녹색계의 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate)를 결합시켜 측정하였다. 결합 과정은 도 6에 나타내었다.
무모 마우스(Hairless mouse)의 피부에 2세대 덴드리머와 4세대 덴드리머 1mM을 처리하고 24시간 후에 피부 투과능을 관찰 한 결과를 도 7에 나타내었다. 2세대 덴드리머와 4세대 덴드리머는 모두 피부 각질층, 표피, 진피층까지 전달됨을 확인 하였으며, 특히 크기가 더 작은 2세대 덴드리머가 4세대 덴드리머보다 투과능이 우수함을 관찰할 수 있었다.
2) 효능 물질 및 펩타이드와 결합된 2세대 덴드리머의 피부 흡수량 측정
피부 흡수는 기네아피그 피부를 대상으로 프란츠 투과셀을 이용하여 측정하였으며, 효능 물질로는 6개의 아미노산(시스테인-리신-류신-티로신-글리신-아르기닌)으로 이루어진 펩타이드와 카페인산을 사용하였다. 시험 직전, 기네아피그의 복부 부분 피부를 채취하여 평방 1㎠의 면적으로 절단한 후, 이를 투과경의 직경이 0.9㎝인 투과셀에 장치하고 클램프로 고정하였다. 피부의 한쪽 면(공여체 용기)에 용매(물 또는 부틸렌글라이콜)에 활성 물질을 0.1중량% 용해시킨 샘플, 또는 2세대 덴드리머-효능 물질의 컨쥬게이션을 결합되어 있는 활성 물질이 동량이 되도록(즉, 활성 물질이 0.1중량%가 되도록) 용해시킨 샘플을 1ml 도포하고, 피부의 다른 쪽 면(수용체 용기)은 정제수와 에탄올이 4:1의 중량비로 혼합된 용매와 접촉하도록 하였으며, 시험 시 온도는 실제 피부 온도인 32℃를 유지하였다. 시험 시작 후, 일정 시간 간격으로 용매의 일부를 채취한 후, HPLC를 이용하여 피부에 흡수된 각 실험물질의 양을 측정하여 도포 농도당 피부 흡수량(㎍/㎠/중량%)으로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
<HPLC 분석조건>
- 컬럼 : C18(ODS)
- 용매 유량 : 1㎖/분
- 검출 UV : 280㎚
- 샘플 테스트 농도 : 5㎎/㎖
- 샘플 주입양 : 10㎍
- 용출 : 아세토니트릴/10mM H3PO4 = 30/70
| 시간 | 펩타이드 | G2 덴드리머-펩타이드 (참고예 4) |
카페인산 | G2 덴드리머-CA |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 | 0.75 | 1.68 | 1.08 | 1.89 |
| 8 | 1.29 | 2.07 | 1.78 | 2.97 |
| 12 | 1.43 | 3.24 | 2.09 | 3.53 |
상기 표 1의 결과로부터 덴드리머와 효능 물질을 결합시킬 경우 효능 물질만의 경피 흡수율보다 현저하게 높은 경피 흡수율을 보임을 알 수 있다.
[시험예 2] 덴드리머 효능 시험
1) B16/F10 흑색종 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제능 평가
제조된 물질을 시험물질로 하여 일정 농도로 B16/F10 흑색종 세포(한국세포주은행)의 배양액에 첨가하여 3일간 배양한 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 1N NaOH로 세포를 녹여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 시험물질로는 코직산(최종 농도 0.001중량%), 상기 참고예 2의 2세대 덴드리머-코직산 컨쥬게이트(결합된 코직산을 기준으로 최종 농도 0.01중량%, 0.001중량%) 및 참고예 7에서 효능 물질로서 코직산을 사용한여 제조한 2세대 덴드리머-코직산 리포좀(캡슐화된 코직산을 기준으로 최종 농도 0.001중량%)을 사용하였다. 시험물질을 첨가하지 않은 세포를 대조군으로 하여 대조군에서의 멜라닌 함량과 비교하여 시험물질의 멜라닌 생성 저해정도를 측정하여 미백효과를 측정하였다.
수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.
| 시료 | 멜라닌 생성 저해율(%) |
| 대조군(무첨가) | - |
| G2 덴드리머-코직산(최종 농도 0.001중량%) | 42.8 |
| G2 덴드리머-코직산(최종 농도 0.01중량%) | 47.9 |
| G2 덴드리머-코직산 리포좀(최종 농도 0.001중량%) | 38.4 |
| 코직산(최종 농도 0.001중량%) | 30.5 |
상기 표 2를 보면, 덴드리머-코직산 컨쥬게이션 또는 덴드리머-코직산 리포좀을 첨가한 경우에 멜라닌 생성 저해율이 코직산만을 첨가한 경우보다 훨씬 더 높게 나와, 덴드리머의 사용으로 코직산의 피부 전달율이 더 높아졌고, 따라서 피부에서 작용하는 코직산의 양이 증가하여 멜라닌 생성 저해율이 현저하게 높게 나온 것임을 알 수 있다.
2) 콜라게네이즈(MMP-1)를 저해능
시험은 2.5 %의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 함유된 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그리고 올레아놀릭산(Oleanolic acid)(최종 농도 0.001중량%), 참고예 3의 2세대 덴드리머-올레아놀릭산 컨쥬게이션(결합된 올레아놀릭산을 기준으로 최종 농도 0.01중량%, 0.001중량%) 또는 참고예 7에서 효능 물질로서 올레아놀릭산을 사용한여 제조한 2세대 덴드리머-올레아놀릭산 리포좀(캡슐화된 코직산을 기준으로 최종 농도 0.001중량%) 물질을 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 상업적으로 이용가능한 콜라게네이즈 측정기구(미국 아머샴파마샤 사, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 콜라게네이즈 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게네이즈 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판 (96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타난다. 노란색을 뛴 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 콜라게네이즈의 합성정도를 계산하였다. 이 때 조성물을 처리하지 않은 군의 채취된 세포배양액의 반응 흡광도를 음성대조군으로 하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈으며, 세포독성을 고려한 농도에서 시험을 진행하였다.
| 시료 | 콜라게네이즈 발현 억제(%) |
| 비처리군 | - |
| UV 처리 | 147.2 |
| G2 덴드리머-OA(최종 농도 0.001중량%) | 80.8 |
| G2 덴드리머-OA(최종 농도 0.01중량%) | 72.3 |
| G2 덴드리머-OA 리포좀(최종 농도 0.001중량%) | 81.4 |
| 레티노익산(최종 농도 0.001중량%) | 71.5 |
| 올레아놀릭산(최종 농도 0.001중량%) | 89.2 |
상기 표 3을 보면, 덴드리머-올레아놀릭산 컨쥬게이션 또는 덴드리머-올레아놀릭산 리포좀을 첨가한 경우에 콜라게네이즈 발현 억제율이 올레아놀릭산만을 첨가한 경우보다 훨씬 더 높게 나와, 덴드리머의 사용으로 올레아놀릭산의 피부 전달율이 더 높아졌고, 따라서 피부에서 작용하는 올레아놀릭산의 양이 증가하여 콜라게네이즈 발현을 보다 효과적으로 억제함을 알 수 있다.
Claims (6)
- 폴리아미도아민 덴드리머로 이루어진 경피 전달 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 덴드리머는 0세대 내지 6세대인 경피 전달 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 덴드리머는 피부 효능 성분과 컨쥬게이트를 형성하는 것을 특징으로 하는 경피 전달 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 덴드리머는 피부 효능 성분을 덴드리머 내부로 포집하여 리포좀을 형성하는 것을 특징으로 하는 경피 전달 시스템.
- 피부 효능 성분과 컨쥬게이트를 형성한 덴드리머 또는 피부 효능 성분을 내부로 포집한 덴드리머를 함유한 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 덴드리머는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~30중량%의 양으로 함유되는 화장료 조성물.
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