KR20140037513A - 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분을 함유하는 고지혈증 및 비만증 예방 또는 치료를 위한 약학조성물에 대한 것이다. 본 발명의 생약 추출물은 마우스 유래 지방세포인 3T3-L1 세포의 지방분화를 억제 시켜주는 효과와 고지방 식이를 이용해 비만을 유도한 흰쥐에서 체중감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도 감소효과 및 조직병리학적 영향에 효과가 있으므로 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 치료용 약제 또는 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 치료용 조성물{A composition comprising a crude extract or purified fraction extract of Plantago asiatica for treating or preventing hyperlipidemia and obesity}

본 발명은 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 치료용 약학조성 및 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Kim DM, et al., Prevalence of obesity in Korea. Obes Rev. 6, pp.117-121, 2005

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오늘날 현대인들은 과거에 비해 양적으로 풍성해지고 맛있는 식단을 즐기게 된 반면 고칼로리, 고지방 섭취에 따른 과체중과 각종 만성 질환으로 인한 어려움을 겪고 있다. 성인병 유발의 가장 기본적인 원인은 비만인데 2007년 의료 정책연구소 발표에 의하면 우리나라 당뇨사망자는 OECD 회원국의 평균인 13.5명보다 2.5배 높은 35.3명으로 회원국 중 가장 높은 수치를 기록하였고 우리나라에서 최근 10년 동안 제 2형 당뇨병 환자이고, 특히 40대와 50대에서 그 유병율이 급격히 상승하고 있으며, 앞으로도 계속 증가할 것으로 예상된다 (Kim DM, et al., Prevalence of obesity in Korea. Obes Rev. 6, pp.117-121, 2005).

비만은 신체 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 과잉의 체지방 축적으로 생기는 질환으로, 심혈관계 질환, 당뇨, 고혈압, 고지혈증, 담석증 등의 신체질환뿐만 아니라 정신 건강까지 영향으로 미치므로 이에 대한 대책 마련이 시급한 실정이다 (Kopelman PG. Obesity as medical problem. Nature 404: 635-643, 2000). 특히 동양인의 경우, 서양인에 비해 체질량 지수가 적어도 복부 비만이 심하여 고혈압, 당뇨병, 고지혈증과 같은 동맥관련 질환으로 인한 합병증의 감수성이 높기 때문에 비만관리가 더욱 중요시 된다. 비만인에 있어 질병발생의 위험도는 정상인에 비해 고혈압의 경우에는 4배, 당뇨병의 경우 무려 10배나 높아지며, 사망률은 체중이 25% 과다일 때 39% 증가하는 것으로 보고 있다. 그러므로 비만의 예방 또는 치료를 위한 방법들의 개발이 시급히 요구되어 지고 있다. 비만은 관련된 유전자의 발현, 인슐린 등의 대사관련 호르몬의 작용, 흡연, 식습관, 활동량과 운동량 등의 개인 환경 및 기타 조절 작용에 의해 지방세포 내에 과도한 지방이 축적된 병태를 의미 하므로 체지방 감량에 대한 근본적인 대책이 필요하다 (Kissebah AH, Vydelingum N, Murry R, et al. Relation of body fat distribution to metabolic complications of obesity. 54(2):254-60, 1982).

한의학에서는 비만의 원인을 膏粱珍味와 氣虛, 濕滯 등으로 보고 있으며, 치료법으로는 利水化濕, 化痰, 熱通腑, 活血祛瘀의 약물요법을 쓰고 있다(張介賓. 張氏類經. 서울, 성보사. p.586, 1982). 비만치료법으로는 식욕억제제, 지방흡수억제제, 에너지대사촉진제, 호르몬제제 등의 약물요법과 위절제술, 지방흡입술 등의 외과적 수술법이 사용되고 있으나, 치료효과의 지속적 유지 여부 및 약물 중단 시 체중이 증가하는 현상 등이 문제되고 있다(Van der Ploeg LH. Related Obesity: an epidemic in need of therapeutics. Curr Opin Chem Biol. 4(4), pp.452-460, 2004; 김은선 외 2, 비만치료제, 심층정보분석 보고서, 한국과학기술정보연구원, pp.1-111, 2002). 현재 의료계에서는 식욕억제제인 시부트라민과 지방흡수억제제인 올리스태트 등을 장기간 사용 가능한 비만약물로 인정하고 있지만 아직도 부작용에 대한 의문이 제기되고 있다. 체중을 감소시키기 위해 약물투여와 수술뿐만 아니라 식이요법, 운동, 행동수정 요법들을 병행할 경우 좋은 효과를 나타내며, 이중 식이요법은 비만의 예방과 치료에 있어서 가장 중요하고 근본적인 방법이다(Mason EE. Methods for voluntary weight loss and control. Obes Surg 2: 275-276, 1992).

차전초(車前草, Plantago asiatica)는 질경이과(Plantaginaceae)에 속하는 다년생 草本으로 전 세계에 3속 300종이 분포하고 있으며 질경이라고도 불린다. 각 지역의 들판이나 길가에서 자라는 차전초는 예로부터 거담, 항균, 진해 작용 등의 약리작용 때문에 민간요법의 약제로 많이 사용되어 왔으며, 면역조절, 항산화 활성, 항염증 등 다양한 생리활성을 가지고 있음이 알려져 있다. 또한 랫드에서 차전초 추출물 단회와 14일, 90일 반복투여 시험을 한 결과, 일반독성 및 유전독성에 대한 안전성이 확보되어 있다(Park, B.G., Lee, H.S., et al., : Single & 14-day repeated oral toxicity study and genotoxicological safety estimate of plantamajoside isolated from Plantago asiatica. J Toxicol Pub Health. 23(1), 79-86, 2007).

위와 같이 차전초는 안전하며 한방 및 민간요법에서 꾸준히 이용되어 왔으나 아직까지 그 기능성에 대한 연구는 미흡한 실정이다.

따라서 본 발명자들은 차천초 추출물 및 분획물들을 지방세포인 3T3-L1에 처리한 결과, 세포 분화를 억제하였음을 확인하였고, 고지방 식이를 이용한 비만 유도 동물에서 체중 및 체지방 감소, 혈중 지질농도의 감소뿐만 아니라 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin)의 혈중 농도가 감소함을 확인하였다. 또한 간, 부고환, 지방 및 췌장의 조직 병리학적 영향을 관찰함으로써 비만에 효과적인 치료제로 활용할 수 있음을 입증하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 비만증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30 내지 100%(v/v) 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 분획물은 n-헥산, 헵탄, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매, 바람직하게는 헥산 또는 에틸아세테이트 용매, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트에 가용한 분획물 및 상기 비극성용매 가용분획물을 제거한 극성용매, 바람직하게는 부탄올 용매에 가용한 분획물을 포함한다.

본 발명의 조추출물 및 분획물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 차전초를 건조하여 마쇄한 후 시료 중량의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 2 내지 20배에 달하는 부피의 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30 내지 100%(v/v) 물 및 에탄올 혼합용매로 20 내지 120℃, 바람직하게는 실온 내지 80℃에서 약 1 내지 72시간, 바람직하게는 2 내지 12시간 동안에서 냉침추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출한 후 감압여과 및 농축하여 본 발명의 차전초 조추출물들을 수득가능하고; 상기 단계에서 얻은 조추출물을 상기 조추출물 중량의 약 0.05 내지 50배, 바람직하게는 0.5 내지 5배 부피 (v/w%)의 물을 가하여 현탁물을 제조하는 제 3단계; 상기 현탁물에 상기 현탁물 부피의 약 0.5 내지 20배 부피, 바람직하게는 1 내지 5배 부피 (v/w%)의 n-헥산, 헵탄, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매, 바람직하게는 헥산 또는 에틸아세테이트 용매, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트를 가하여 순차적으로 분획과정을 반복수행하여 본 발명의 비극성 용매 가용분획물 및 극성용매 가용 분획물을 각각 수득가능하다.

본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 비만증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

상기에서 수득된 차전초 추출물 및 분획물들은 지방세포의 지방 분화를 감소시켜 주며, 고지방 식이를 이용해 비만을 유도한 흰쥐에서 체중감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도 감소효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 고지혈증 및 비만증 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 80 중량%, 바람직하게는 10 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무,알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 봉해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 및 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 차전초 에탄올 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 비만에 대하여 탁월한 억제효과를 갖는 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 고지혈증 및 비만증 억제활성을 나타내는 차전초 조추출물 또는 분획물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 고지혈증 및 비만증 억제활성을 나타내는 차전초 조추출물 또는 분획물을 주성분으로 함유하는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 추출물은 고지혈증 및 비만증의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 차전초 에탄올 추출물은 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryo fibroblast) 유래 지방세포인 3T3-L1에서 지방분화를 억제시켜주는 효과와 고지방 식이로 비만을 유도한 흰쥐에서 체중감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도 감소뿐만 아니라 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin)의 혈중 농도 감소효과를 발휘하여 조직 병리학적인 영향에도 효과가 있으므로 비만 예방 또는 치료를 위한 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 지방세포의 cell line인 3T3-L1의 MTT assay에 대한 CCE 및 CCE분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 2는 지방세포의 cell line인 3T3-L1의 Tunnel staining에 대한 CCE의효과를 나타낸 도이며,
도 3(a-b)은 지방세포의 cell line인 3T3-L1의 Oil Red-O staining에 대한 CCE 및 CCE 분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 4는 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 몸무게 및 식이량에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 5는 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 간무게에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 6 (a-b)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 체지방 무게에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 7(a-d)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 혈중 지질농도에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 8은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 간 조직 직경에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 9은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 부고환 조직 직경에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 10는 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 췌장조직 직경에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 11은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 췌장조직 직경에서 인슐린 생산세포에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 12은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 췌장조직 직경에서 글루카곤 생산세포에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이며,
도 13은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 근육조직에서 AMPK와 ACC 단백 발현에 대한 CCE의 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 차전초 에탄올 추출물 제조

실험에 사용된 차전초는 믿음당 건재상(서울)으로부터 구입하여 대구한의대 본초학교실에서 감별, 엄선하였으며 증류수로 깨끗하게 세척한 후 이물질을 제거한 다음 실험에 사용하였다. 차전초의 건조 약재 600g에 10배의 95% 에탄올을 가하고 상온에서 2시간 인큐베이션(incubation)을 시킨 후에, 2겹 거어즈와 와트만 3M paper(1440-320)로 여과하였다. 수거한 여과액을 rotary evaporator (N-1110V, EYELA, Japan)로 감압 농축한 후 동결 건조하였으며 건조물 51.6g(8.6%)를 수득하여 (이하, CCE라 함) 하기 실험에 사용하였다.

실시예 2. 차전초 에탄올 추출물의 분획물 제조

실험에 사용된 차전초는 믿음당 건재상(서울)으로부터 구입하여 대구한의대 본초학교실에서 감별, 엄선하였으며 증류수로 깨끗하게 세척한 후 이물질을 제거한 다음 실험에 사용하였다. 차전초 건조 약재 600g에 95% 에탄올(6L X 3회)로 추출한 후 rotary evaporator (N-1110V, EYELA, Japan)로 감압 농축한 후 에탄올 농축액 53.0g을 얻었다. 이를 증류수 1000ml에 분산시켜 메칠렌클로라이드(CH₂Cl_2, 1L X 3회)로 추출한 후 농축하여 메칠렌클로라이드 분획 9.5g을 얻었다(이하 CH₂Cl₂라 함). 남은 수층을 에칠아세테이트 (EtOAc, 1L X 3회)로 추출하고 추출액을 농축하여 에칠아세테이트 분획 3.3g을 얻었다(이하 EtOAc라 함). 이어서 수층을 다시 부탄올 (n-BuOH, 1L X 3회)로 추출, 농축하여 부탄올 분획 8.3g을 얻었으며(이하 n-BuOH라 함), 다시 수층을 농축하여 물 분획 30.4g을 얻었다(이하 WA라 함).

참고예 1. 실험재료의 준비

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포는 미국세포주은행(American Type Culture Collection; ATCC, CL-173TM)에서 구입하였으며, Dulbeccos modified Eagles media (DMEM, SH30243.01), Bovine calf serum (BCS, SH30401.01), Fetal bovine serum (FBS, SH30396.03) 및 페니실린과 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; PS)은 하이클론(SV30010, Hyclone, USA)에서 구입하였다. 인슐린(Insulin, 090-03446)과 디메칠술폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO, D2650), 오일레드오(Oil Red-O, O0625-25), 덱사메타손(dexamethasone (DEX, D4902-100MG)과 이소부칠메틸잔틴(isobutylmethylxanthine (IBMX, I5879-250MG)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich company, St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

참고예 2. 실험동물의 준비

실험동물은 오리엔트 바이오(성남, 경기도)에서 분양 받은 체중 180 g내외의 5주령 수컷 흰쥐(Sprague Dawley)를 각각 한 cage당 한 마리씩 넣고 온도 22 ± 2℃, 습도 53.3%, 12:12 light-dark cycle로 일반사료(효창사이언스 (주))와 물을 충분히 공급하여 사육하였다. 모든 실험동물은 구입 후 1주간 순화시킨 후 비슷한 체중의 개체만 선별하여 3그룹으로 나누었다.

참고예 3. 3 T3 - L1 세포배양

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포(mouse embryo fibroblast)를 하기와 같은 실험방법으로 배양하였다(Lin. J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research, 13(6), pp.982-990, 2005).

먼저, 10% 우태아 혈청(bovine calf serum)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(SH30243.01)로 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다(Day 0). 8일 동안 배양한 다음에 전지방세포(preadipocyte)를 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 DMEM 배지(167 nM insulin, 0.5μΜ isobutylmethylxanthine, 1μΜ dexamethasone 첨가)로 옮겨 2일간 배양하였다(Day 2). 167 nM 인슐린이 있는 배지에서 2일간 더 배양한 다음에 10% FBS/DMEM 배지에서 4일 동안 배양하여 성숙한 지방세포(adipocytes)로 만들었다.

참고예 4. 차전초 에탄올 추출물의 투여 및 비만 유도

비만을 유발하기 위하여 문헌에 기재된 식이조성을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Lee J. S. et al., Supplementation of whole persimmon leaf improves lipid profiles and suppresses body weight gain in rat fed high-fat diet, Food and Chemical Toxicology, 44(11), pp.1875-1883, 2006).

탄수화물이 주식인 한국인의 식습관에 따라 15% (lard-10% w/w, con oli-5% w/w)함유의 고지방 식이로(#102038, AIN-76A Based High Fat/High Carb Purified Rodent Diet with Cholesterol & Cholic Acid, Dyet, USA), 기존 고지방식에서 지방의 열량을 약 30% 줄이고, 탄수화물의 열량을 50% 높여 조제하였다(표 1). 실험군은 그룹 당 15마리씩 4그룹으로 나누었고, 정상식이군(NOR군)에게는 일반식이(AIN-76), 고지방식이군(HF)은 고지방 식이와 생리식염수를 먹였다. 실험군에는 고지방식이와 차전초 에탄올 추출물(CCE)을 300 mg/kg씩 경구 투여하여 8주간 사육하였다.

Ingredient	Normal	HF
Casein	200	200
DL - Methionine	3	3
Com starch	150	150
Sucrose	500	397.5
Cellulose	50	50
Corn oil	50	50
Mineral-mix	35	35
Vitamin-mix	10	10
Choline bitartrate	2	2
Lard	-	100
Cholesterol	-	2
Cholic acid	-	0.5
total(g)	1000	1000
Kcal/100g diet	3850	4340
Calorie from fat(%)	11.7	31.1
Calorie from carbohydrate(%)	67.5	50.5
Calorie from protein(%)	20.8	18.4

참고예 5. 통계처리

실험성적의 통계적 유의성은 SPSS 프로그램(Version 14.01)의 투웨이(Two-way) ANOVA와 LSD 사후검정을 이용하여, P<0. 05 인 경우에 유의한 것으로 인정하였으며, 정상군과의 통계학적 유의성(#) 및 고지방식이투여군(HF)과의 통계학적 유의성(*)을 도면 및 표에 각각 표기하였다.

실험예 1. 세포독성(MTT assay)

차전초 에탄올 추출물(CCE)이 3T3-L1 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT검정법(methylthiazol tetrazolium bromide)을 이용하여 측정하였다(Lin J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

MTT 검정법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 생성된 blue formazan 결정을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여서 발색시켜 그 흡광도를 측정하는 방법이다. 참고예 1에서 배양한 3T3-L1 cell line을 사용하였으며, 실험에는 지수적 성장기에 있는 세포를 사용하셨다. 즉, 5 X 10⁴ cells/ml을 일정기간 아무처치 없이 동량의 5% tryphan으로 잘 섞어 살아있는 세포수를 측정하였고, 생존능 실험은 모두 3개 well의 평균가를 이용하여 평가하였다. Well당 MTT 용액(2 mg/ml)을 50 ㎕씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO를 well당 100 ㎕씩 넣어 5분간 plate shaker에서 blue formazan 결정을 용해시킨 다음 ELISA reader (Tekan, Austria, Switzerland) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1-A에 나타난 바와 같이 DMSO만으로 처리된 대조군에 비해 CCE 시료 농도에 의존적으로 지방세포의 생존율이 감소하는 것으로 관찰되었으나, 시료처리농도인 0.2mg/ml 범위에서 세포에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보였다. 도 1-B에서 CCE 추출물의 분획물에서도 농도 의존적으로 지방세포 생존율이 감소하나, 시료처리 농도에서 큰 영향을 주지 않음을 확인 하였다.

실험예 2. 세포를 이용한 Tunnel 염색

Apoptosis 양성세포를 관찰하기 위해 TUNEL assay kit (11684795910, Roche, Manheim, Germany)을 이용하여 TUNEL 염색을 실시하였다.

세포를 4 chamber slide에 배양하여 분화시키고 분화 마지막에 시료 50ug/ml, 200ug/ml CCE를 각각 24시간 처리하였으며 양성대조약물로 0.5mM Rosiglitazone(R2408, Sigma-Aldrich, USA)을 처리하였다(이하 Rosi라 함). 분화가 끝난 세포를 D-PBS(SH30028.03, Thermo, USA)로 세척한 후 4% paraformaldehyde로 실온에서 1시간 고정한 후 재차 D-PBS로 세척한 다음에 3% H₂O₂로 봉쇄(blocking)를 실시한 후 permeabilization 용액을 첨가하여 permeabilization 시키고 TUNEL assay kit(11684795910, Roche, Manheim, Germany)을 50 ㎕ 첨가하여 37℃ 암실에서 1시간 반응시키고 DAB solution을 이용하여 염색하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 DMSO만으로 처리된 대조군에서는 apoptotic cell이 관찰되지 않았으나, 양성대조약물인 0.5mM Rosiglitazone 처리군과 CCE군에서 지방세포 사멸이 유도되는 것을 관찰하였다.

실험예 2. 세포를 이용한 oil red-O 염색

3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 및 지방 생성에 차전초 에탄올 추출물(CCE)이 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil Red-O 염색 실험을 수행하였다(Lin J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

Oil Red-O 염색법은 분화된 3T3-L1 세포에 Oil Red-O 시약으로 염색하여 세포내 생성된 지방을 측정하는 방법이다. 분화된 세포의 배지를 제거하고 D-PBS(DPBS, SH30028.03)로 세포를 세척하고 pH 7.2 Cacodylate buffer로 2시간 고정하고 Oil-red O Solution으로 염색하였다. 세포 염색이 끝난 후 40% Isopropyl alcohol(2-Propanol,67-63-0)로 3번 세척 후 건조하여 세포 내 지방의 크기를 광학현미경(AE 31, Motic, USA)으로 관찰하였다.

실험결과, 도 3-A에 나타나는 바와 같이, 3T3-L1 세포의 분화과정 중에 CCE추출물을 각각 100 ㎍/㎖ (B), 150 ㎍/㎖ (C), 200 ㎍/㎖ (D)의 농도로 시료를 처리한 결과, 대조군(control)에 비해서 농도 의존적으로 세포분화 및 지방생성을 억제하였으며, 각 용량의 한약재 추출물을 현미경 및 육안으로 관찰한 결과, CCE 추출물이 용량 의존적으로 지방축적 저해효과가 뛰어났으므로 지방세포의 분화 및 지방축적을 저해하였다. 도 3-B에 나타나는 바와 같이, CCE추출물의 분획물인 메칠렌클로라이드(CH₂Cl₂), 에칠아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH), 물(H₂O) 분획물을 각각 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포내 지방구의 염색 정도를 관찰한 결과, 대조군(100%)에 비해서 41.30%, 29.46%, 108.58%, 133.41%로 측정되어 에칠아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH) 분획물은 세포내 지방축적을 억제, 메칠렌클로라이드(CH₂Cl₂), 물(H₂O) 분획물은 지방축적을 증가시켰음을 알 수 있었다.

실험예 3. 고지방 식이를 이용한 비만 유도 쥐의 식이효율, 체중측정 및 조직의 채취

식이 섭취량은 매일 오전에 측정하여, 일일 먹이 섭취량을 계산하였으며, 체중은 일주일에 한 번씩 측정하였다. 식이효율(FER; Food efficiency ratio)은 실험기간 동안의 체중 증가량을 구하고 그 값을 식이섭취량으로 나눈 값이다(FER=body weight gain/food intake).

상기 실험 결과, 도 4 및 표 2에 나타나는 바와 같이 식이시작 2 주 후부터 HF군은 NOR군과 CCE군에 비해 유의적인 체중 증가를 나타내었다. 반면 NOR군과 CCE군은 HF군에 비해 유의적(p<0.05)인 체중 감소를 나타내기 시작하였으며, 실험종료 8주까지 같은 경향을 나타내었고, 실험종료 후 CCE군에서 HF군에 비해 유의적(p<0.05)인 체중 감소를 나타내었다. 따라서 CCE 투여는 고지방식이로 유발된 비만 흰쥐의 체중증가를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 NOR군보다도 더 감소하는 것으로 나타났다. 식이섭취량은 HF군에 비해 NOR군은 낮았으나 CCE군에서 높았으며, 식이효율면에서는 HF군이 높았다. 체중증가량의 변화는 NOR군에 비해 HF군에서 유의적인(p<0.05)증가를 나타내었으며, CCE군에서는 HF군에 비해 감소하였음을 확인할 수 있었다.

한편, 실험동물을 12시간 동안 절식시키고 에테르를 흡입시켜 마취시킨 다음, 복부 하대정맥으로부터 EDTA가 처리된 튜브를 이용하여 혈액을 채취한 후 3000 rpm (4℃)에서 15분간 원심 분리하여 혈장을 분리하였다. 실험동물로부터 혈액을 수집하고, 간과 및 지방 조직(부고환지방, 신장주위지방, 복막 후 복부 피하지방)을 즉시 적출하여 1X PBS 완충액으로 수차례 세척하여 표면의 수분을 제거한 후 칭량하였다. 일부 간과 뇌 조직은 10% formaldehyde 용액에 고정시켜 냉장 보관하였으며, 단백질 발현분석을 위한 나머지 장기와 지방 조직은 즉시 액체질소로 급냉시켜 실험분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 조직은 액체 질소로 급속 냉동시켜 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

상기 실험 결과 도 5 및 도 6(A-B) 에 의하면 NOR 에 비해 HF 군에서 간 무게, 부고환 지방 무게, 신장주위 지방 무게, 내장 무게, 갈색지방(BAT)가 모두 유의하게 증가하였으며, CCE군에서는 HF군에 비해 유의하게 억제되었음을 확인할 수 있었다. 이 결과는 비만에 있어서 단순한 체중감소 보다는 심혈관계 질환과 같은 합병증을 야기시키는 것으로 알려진 체지방 감소에 대한 강력한 CCE의 효과를 보여주는 것으로서 비만 치료제로서의 더 큰 의미가 있다고 할 수 있다.

	NOR	HF	CCE
Food intake (g/day)	21.29±0.44*	23.59±0.44#	24.02±0.28#
Weight gain (g/day)	4.80±0.06*	6.14±0.13#	5.40±0.19
FER	0.23±0.00	0.26±0.00	0.23±0.00

실험예 4. 비만을 유발시킨 쥐에서 차전초 에탄올 추출물이 혈청 지질 농도의 변화에 미치는 영향

각 군의 실험동물을 희생 전 12시간 절식시킨 후 CO₂로 가볍게 마취한 다음, 복부 대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 test tube에 넣고 상온에서 1시간 방치한 다음 4℃, 3,500 rpm에서 15분간 원심분리 하여 혈청을 분리하고, 혈청 중 총콜레스테롤(total cholesterol; TC)은 C. Allain 1의 효소법 (Allain C. et al., Enzymatic determination of total serum cholesterol, Clin. Chem. 20(4), pp.470-475, 1974)에 따라 분석시약(L-type GHO M, Wako, 일본)을 사용하였고 중성지방(triglyceride) 함량은 Van Handel등의 효소법 (Van Handel E. et al, Micromethod for the direct determination of serum triglycerides, J. Lab. Clin. Med. 50(1), pp.152-157, 1957)에 의하여 검사시약(L-type TG M, Wako, 일본)을 사용하였다. 고밀도지단백(HDL-cholesterol)과 저밀도지단백(LDL-cholesterol) 농도는 Warnick의 효소법(Warnick G. R. et al., Dextran sulfate-Mg²⁺ precipitation procedure for quantitationof high density lipoprotein cholesterol, Clin. Chem. 20(6), pp.1397-1388, 1982)에 의하여 검사시약 (Choesterol N HDL, Choesterol N LDL, SEKISUI, 일본)으로 측정하였다. 간 기능과 관련된 트랜스아미나아제(transaminase)인 혈청 중 에이엘티(ALT; Alanine aminotransferase)와 혈청 에이에스티(AST; Aspartate aminotransferase) 함량은 분광광도법 (Giusti G. et al., A comparative study of some spectrophotometric and colorimetric procedures for the determination of serum glutamic-oxaloacetic and glutamic-pyruvic transaminase in hepatic diseases. Enzymol. Biol. Clin(Basel), 10(1), pp.17-38, 1969)을 이용한 검사시약(L-type ALT J2, L-type AST J2, Wako, 일본)을 사용하여 자동화된 생화학 분석기(Hitachi 7080, Japan)로 분석하였다. 혈청 중 렙틴(leptin)의 농도는 Leptin ELISA kit(900-015, Assay Designs, U.S.A.), 혈청 중 아디포넥틴(adiponectin)의 농도는 Adiponectin ELISA kit(44-ADPR-0434, ALPCO Diagnostics, U.S.A.)를 사용하여 ELISA reader(Tecan, Germany)로 분석하였다.

실험결과, 도 7-A-C에 나타나는 바와 같이, 혈장 ALT 수치에서 NOR과 비교 하였을때, HF군보다 CCE군에서 유의성 있는 증가를 보였으며, AST 수치에서는 NOR보다 HF군이 증가하였고, CCE군은 HF군보단 감소하였으나 유의적인 변화는 없었다. LDL-C수치에서 NOR이 HF보다 월등히 감소하였지만 CCE군에서도 유의적으로 감소한 결과를 얻었으며, HDL-C 경우 HF군보다 CCE가 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었다. Total cholesterol은 NOR 과 CCE군에서 HF군보다 유의성 있게 감소하였다. Glucose와 TG 수치에서도 NOR군과 CCE군이 HF에 비해 유의성 있게 감소한 경향을 알 수 있었다. 따라서 8주간의 고지방식이 섭취로 증가된 지질(총콜레스테롤, 중성지방)의 증가와 비례하여 LDL-C의 증가를 나타냄으로써 동맥경화성 관상동맥 질환이나 뇌혈관성 질환 또는 동맥경화 및 합병증의 유발율을 증가시킬 수 있다. 이는 CCE 투여로 혈청 HDL-C 농도가 증가하고 LDL-C 의 생성은 억제됨으로써, 혈관에 축적된 콜레스테롤이 감소하고, 체내 지질대사를 또한 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다. 따라서 고지방식 식이는 대사성 스트레스로 인한 간에서의 ALT 및 AST의 활성을 증가시키지만, 이는 CCE 투여로 감소됨으로써 CCE 투여가 간 기능을 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다.

인슐린감수성 호르몬으로 작용하면서 지방세포에서 분비되는 아디포넥틴(adiponectin)의 혈청 중 함량은 도 7-D 에 나타나는 바와 같이, 정상군(NOR)에서 고지방 식이 투여군(HF)보다 감소하였으며, CCE 투여로 혈청 중 아디포넥틴 (adiponectin) 함량은 고지방 식이 투여군(HF)보다 감소하는 경향을 보였다. 반면에, 지방세포에서 분비되는 펩타이드로서, 식욕조절과 관련이 있다고 알려진 렙틴(leptin)의 혈청 중 함량은 도 7-d 에 나타나는 바와 같이, 정상군(NOR)에 비해 고지방 식이 투여군(HF)에서 증가하였으며, CCE 투여로 혈청 중 렙틴(leptin) 함량은 고지방 식이 투여군(HF)보다 유의하게 감소하는 경향을 나타냈다.

실험예 5. CCE 투여가 HF 공급 랫드에 미치는 조직병리학적 영향: 간, 부고환 지방 및 췌장에 미치는 영향평가

간, 부고환 주위 지방 및 췌장 실질조직의 일부를 취하여 10% 중성포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4μm의 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시한 후 광학현미경하에서 관찰하였으며, 췌장섬내 insulin 및 glucagon 생산세포를 avidin-biotin-peroxidase (ABC) 방법을 이용하여 염색하였다. 또한 명확한 조직병리학적 변화의 관찰을 위해 지방간 병변 부위의 비율 (%/mm2 of hepatic parenchyma), 간세포 직경 (μm/hepatocyte), 부고환 지방세포 크기 (μm/adipocyte), 췌장 zymogen 과립이 차지하는 부위 (%/mm2 of exocrine pancreatic parenchyma), 췌장섬의 수 (islet/mm² of pancreas), insulin 및 glucagon 생산세포의 수적 (cells/200μm² of endocrine pancreas) 변화와 이들의 비율 (insulin/glucagon cell ratio) 를 각각의 현미경 시야에서 자동영상분석장치 (DMI-300 Image Processing; DMI, Korea)를 이용하여, histomorphometry 적으로 평가하였다.

실험결과, 도 8 에 나타나는 바와 같이, 고지방사료 공급에 의해 간 소엽 전반에 걸쳐 간세포의 비대와 공포화를 특징으로 하는 지방변화 (fatty changes) 소견이 인정되어 심각한 지방간염이 감지되었으나 CCE 군에서 억제되었음을 알 수 있었다. 도 9에서는 현저한 부고환 지방 세포의 비대가 인정되었으나 CCE 군에 의해 부고환 주위 지방세포의 직경이 감소하였음을 알 수 있었다.

도 10에 나타내는 바와 같이 고지방식이 공급으로 인해 췌장 zymogen 과립의 감소가 관찰 되었으나, CCE군에서는 췌장의 zymogen 과립의 감소 억제가 인정되었음을 확인할 수 있었다. 도 11, 12에서도 고지방식이 공급으로 인한 insulin 및 glucagon 생산세포의 수적 증가와 같은 내분비 장애가 인정되었으나, CCE 군에서는 insulin/glucagon 비율이 NOR 군과 유사하게 관찰되어 insulin, glucagon 생산세포의 증가를 현저히 억제하는 것으로 관찰되었다. 본 실험의 결과, CCE군은 HF 공급으로 유발되는 지방 간병증, 부고환지방 세포 비대, insulin, glucagon 생산세포의 증가를 현저히 억제하는 것으로 관찰되었으며, 특히 췌장의 zymogen 과립의 감소 억제가 인정되어, 이들의 분비 조절을 통한 지방 흡수 및 대사의 제어로 HF 공급에 의해 초래되는 다양한 변화들이 억제되는 것으로 판단되나, 정확한 기전을 알 수 없었다.

실험예 6. 근육에서 AMPK , ACC 의 활성

8주간의 고지방식이로 비만이 유발된 흰쥐의 근육에서 비만관련 지표로 에너지와 지질 대사에 각각 관련된 단백질인 AMPK, ACC의 발현에 대한 CCE의 조절 효과를 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. (Murase T. et, al, Nootkatone, a characteristic constituent of grapefruit, stimulates energy metabolism and prevents diet-induced obesity by activating AMPK, Am J Physiol Endocrinol Metab, 299(2), pp.E266-75, 2010).

흰쥐로부터 분리한 근육 조직을 lysis buffer (137 mM NaCl, 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA, 2 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10% glycerol, 5 ㎍/㎖ leupeptin, 5 ㎍/㎖ aprotinin, 35 μM benzamidine, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF)를 사용하여 균질화시킨 다음 4℃, 14,000 g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수집하였다. 분리된 단백질의 농도를 BSA reagent (#23209, PIERCE, USA)를 이용하여 정량한 뒤, 50 ㎍ 단백을 8% SDS-PAGE에서 전기영동 시켰다. Gel에 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride membranes (PVDF, (HATF09025, 0.45 mm, Millipore))에 transfer한 후 5% bovine serum albumin (BSA)-TBST (TBS, 0.1% Tween-20)로 실온에서 30분 동안 블로킹(blocking)시켜 anti-ACC (#3662, Cell Signaling, MA, USA), P-ACC (#3661, Cell Signaling, MA, USA) , anti-AMPK (#2532, Cell Signaling, MA, USA) , P-AMPK (#2531, Cell Signaling, MA, USA) β-actin (905-733-100, assay designs, USA) primary antibody를 membrane들에 각각 알맞게 밤새 반응시킨 후에 이를 secondary antibody (sc-4777, goat anti-rabbit-HRP, 1:5000 dilution, Santa cruz Biotechnology, USA)로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 ECL reagent(#34079, Amersham Biosciences, IL, USA)를 사용하여 1분간 반응시킨 후 Image Quant software (EW-97701-62, UVP, USA)를 사용하여 membrane에 부착된 타겟 단백질을 확인하였다.

실험결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 세포대사와 에너지 균형을 조절하는 것으로 알려진 AMPK 효소의 활성을 측정하기 위해 AMPK의 인산화 수준을 조사한 결과 NOR군에 비해 HF군에서 AMPK 단백질의 인산화 수준이 감소하였으며, CCE군에서 HF군에 비해 증가하였다. 또한 지방산 대사에 중요한 역할을 하는 ACC 단백질의 인산화 수준을 조사한 결과, NOR군에 비해 HF군에서 ACC 인산화가 감소하였고 CCE군에서 HF군에 비해 증가 되었다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

차전초 에탄올 추출물(CCE) ------------------------------------ 20 mg

유당 -------------------------------------------------------- 100 mg

탈크 --------------------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

차전초 에탄올 추출물(CCE) ------------------------------------ 10 mg

옥수수전분 -------------------------------------------------- 100 mg

유당 -------------------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

차전초 에탄올 추출물(CCE) ------------------------------------ 10 mg

결정성 셀룰로오스 --------------------------------------------- 3 mg

락토오스 --------------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 --------------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

차전초 에탄올 추출물(CCE) ------------------------------------ 10 mg

만니톨 ------------------------------------------------------ 180 mg

주사용 멸균 증류수 ----------------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄,12H2O ------------------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

차전초 에틸아세테이트 분획물(EtOAc) -------------------------- 20 mg

이성화당 ------------------------------------------------------ 10 g

만니톨 --------------------------------------------------------- 5 g

정제수 -------------------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

차전초 에탄올 추출물(CCE) ------------------------------------ 1000 ㎎

비타민 혼합물 --------------------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------------------------- 70 ㎍

비타민 E ----------------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 --------------------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 --------------------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ---------------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 --------------------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ------------------------------------------------------ 10 ㎎

비오틴 -------------------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ----------------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ---------------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ------------------------------------------------ 0.5 ㎎

무기질 혼합물 -------------------------------------------------- 적량

황산제1철 --------------------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ---------------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ------------------------------------------------ 25.3 ㎎

제1인산칼륨 --------------------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 --------------------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ---------------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ----------------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ------------------------------------------------ 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

차전초 에틸아세테이트 분획물(EtOAc) -------------------------- 1000㎎

구연산 ------------------------------------------------------ 1000 ㎎

올리고당 ------------------------------------------------------ 100 g

매실농축액 ------------------------------------------------------ 2 g

타우린 ---------------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 ----------------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 및 비만증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 분획물은 n-헥산, 헵탄, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매에 가용한 추출 분획물임을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 차전초 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 비만증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
5. 제 4항에 있어서, 상기 건강기능식품의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐, 환제, 티백제, 침출차 또는 건강 음료인 건강기능식품.
6. 고지혈증 및 비만증 억제활성을 나타내는 차전초 조추출물 또는 분획물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품.

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