KR101350217B1 - 흑마늘 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본원은 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 조합으로 포함하는 항비만용 조성물에 관한 것이다. 본원의 혼합 조성물은 AMPK 활성화와 그 표적 중 하나인 ACC억제를 통해 지방합성 및 지방세포 분화를 억제하여 항비만 효과를 가지며, 단독으로 사용한 것과 비교하여 상승된 효과를 가져와 비만의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

흑마늘 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for treating or alleviating obesity or hyperlipidemia comprising black garlic extract and Garcinia cambogia extract}

본 발명은 천연 추출물 분야이며, 구체적으로 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 혼합 추출물에 관한 것이다.

비만에 대한 늘어나는 경각심과 비만의 원인을 이해하고 이에 대응하고자 하는 전 지구적 노력에도 불구하고, 비만은 가속적으로 증가하는 추세이다. (Mitchell et al ., Implications for female fertility and obesity. Reproduction. 2005;130:583-97). 2007년 국민건강영양조사 결과에 의하면 최근 5년 동안 국내 비만인구 비율이 해마다 3%씩 증가하여, 현재 비만자 비율이 전체 인구 중 32.7%(남 33.1%, 여 32.2%)이며, 연령별로는 중장년층이 평균 44%로 청년층(22%)의 두 배나 되고, 비만으로 인한 질환이 늘어나면서 2007년 기준으로 사회경제적 비용은 1조8239억 원에 이르는 것으로 추정되고 있다.

비만 문제가 심각해짐에 따라 비만 자체가 곧 질병이라는 인식이 확산되고 있다. 비만 진행 여부의 판단은 대표적으로 과체중 여부로 판단할 수 있으며, 구체적으로 특정 부위에서의 체지방의 증가(예를 들어, 복부 비만 등)로 판단할 수 있다. 비만으로 분류된 경우 즉, 비만자는 다른 질병에 비해 유병률과 사망률이 높고 정상체중을 가진 사람과 비교하여 당뇨병 질환으로 인한 사망률은 4배, 간병경증 질환으로 인한 사망률은 2배, 뇌혈관질환으로 인한 사망률은 1.6배 및 관상동맥질환으로 인한 사망률은 1.8배 정도 높은 것으로 보고되고 있다. 또한, 복부 비만은 동맥경화성 죽종형성(atheroma formation)의 원인으로 보고되었으며 (Kunitomi M et al., Relationship between reduced serum IGF-I levels and accumulation of visceral fat in Japanese men. Int J Obes Relat Metab Disord. 2002;26:361-9), 기타 고혈압, 고지혈증, 면역체계의 이상 및 고인슐린증 등의 여러 질환의 원인으로 보고되고 있으며, 결과적으로 심혈관질환의 이환률(morbidity)과 사망률(mortality) 증가의 원인이 되는 것으로 보고되고 있다 (Hida K, et al., Visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor: a unique insulin-sensitizing adipocytokine in obesity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:10610-5). 현재 알려진 과학적인 치료법들은 이러한 유발 인자들을 저해하거나 항진시켜 비만을 일으키는 요소들을 저해하여 비만의 정도를 완화 혹은 개선하고자 한다.

현재 비만을 치료하기 위한 다양한 방법이 제공되고 있다. 일반적으로 비만증의 치료법은 식이요법, 운동요법, 식욕 억제제, 이뇨제, 설사제 혹은 포만감을 주기 위한 섬유질 등을 사용하는 약물요법, 잘못된 식습관과 생활습관을 교정해 주는 행동수정요법, 외과에서 장이나 위의 용적을 줄이는 수술요법, 성형외과 등에서 초음파를 이용하여 지방세포를 분해, 제거하는 방법 등의 지방제거수술 등이 있다. 또한 대표적 비만 치료제로서 지방흡수 억제제인 제니칼(Roche 사)과 식욕억제제인 리덕틸(Abbott사)이 세계 시장의 80%를 점유하고 있으나, 국내 시장에서는 각각 마이너스 성장에 머물고 있으며(2007년 각각 -10% 정도), 향정신성 의약품으로 분류된 제품의 경우 우울증, 불면증이나 소화장애 등을 포함하는 심각한 부작용으로 장기 복용을 금지하고 있는 문제점이 있다. 국내 제약사들의 제네릭 및 개량신약 제품이 시장 성장을 견인하고 있으나, 실제 의료기관을 방문하여 비만치료를 받는 환자들은 단지 5%, 실제 비만 환자인 경우도 10%에 불과하며, 2008년 비만치료제 시장규모는 약 800억원정도로 전체 비만 시장의 10%미만에 그치고 있는 실정이다.

반면 건강기능식품 시장에서 다이어트 식품 시장이 가장 큰 성장세를 기록하며, 현재 약 2천억원의 규모로 업계는 추산하고 있다. 국건강기능식품협회 2008년도 자료에 따르면 건강기능식품의 소비자 요구에 가장 적합한 기능성의 우선순위 조사 결과, 비만 38%, 면역력 증진 22%, 아토피 14%, 관절건강(류마티스) 11% 순으로 나타났으며 2009년 기능성 유망소재의 결과도 유사하였다. 따라서 보다 천연물질을 유래의 보다 안전하고 우수한 효과를 나타내는 비만억제 또는 치료용 물질 개발이 절실히 필요한 상황이며, 다양한 약용 식물과 농업생명자원으로부터 새로운 작용 기전을 가진 우수한 소재의 개발에 대한 시장의 요구도가 매우 높다.

본원은 천연물질을 이용한 항비만의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있는 추출물, 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 한다.

본원은 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 조합으로 포함하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물의 조합은 흑마늘 추출물 1 중량부에 대하여 8 내지 16 중량부로 포함하는 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 흑마늘 추출물은 원적외선 조사 가온숙성방식에 의해 제조된 것인 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 비만은 대사증후군을 유발하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 대사 증후군은 내당장애, 고혈압, 고지혈증, 간병증 및 신병증 중 하나 이상을 포함하는 증상을 갖는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본원은 또한 상기 조성물은 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제로 제공되는 비만 또는 고지혈증의 개선용 조성물을 제공한다.

본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 조합으로 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 건강식품은 조합으로 단독으로 사용한 경우보다 비만치료, 비만예방과 혈당강하, 신병증, 간병증, 고지혈증 증상의 예방, 치료 및 완화에 있어 상승된 효과를 가진다.

도 1은 가공형태 및 추출방식에 따른 의성 한지 마늘 추출물 분말 및 마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 혼합 분말 사진이다.
도 2는 도 1의 마늘 추출물과 마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 혼합 추출물의 세포에서의 AMPK 활성 변화를 웨스턴블랏 방법으로 분석한 결과이다. (A): 마늘 열수 추출물 (도 1의 a); (B): 원적외선조사 가온숙성방식으로 제조된 흑마늘 열수추출물 (도 1의 b); (C):흑마늘 열수추출물 (도 1의 b)과 가르시니아 캄보지아 추출물의 혼합물 (도 1의 c)이며, 사진 내부의 C 는 대조군을 나타내며 Met는 비교군 메트포르민 (Metformin) 2mM 을 표시한다. pAMPKα는 pACC에서 p는 인산화된 형태를 나타내고, tAMPKα 및 tACC에서 t는 인산화 및 비인산화 형태 전체(total)를 나타낸다.
도 3은 도 1의 마늘 열수 추출물(A)이 지방세포 분화에 미치는 영향 (A) 및 세포내 축적된 지방의 양(B)을 측정한 결과이다.
도 4는 도 1의 원적외선조사 가온숙성방식으로 제조된 흑마늘 열수추출물 이 지방세포 분화에 미치는 영향 (A) 및 세포내 축적된 지방의 양(C)을 측정한 결과이고(왼편 패널), 동일 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 혼합조성물의 지방세포 분화에 미치는 영향 (B) 및 세포내 축전된 지방의 양(D)을 측정한 결과(오른편 패널)이다.
도 5는 원적외선조사 가온숙성방식으로 제조된 흑마늘 열수 추출물과 동일 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 혼합조성물이 지방세포 분화 조절 유전자의 발현 정도에 미치는 영향을 실시간 PCR로 관찰한 결과이다.
도 6은 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물의 조합과 가르시니아 캄보지아 추출물을 단독 처리한 경우 세포내 축적된 지방의 양을 측정하여 비교한 결과이다.

본원은 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물의 조합을 유효성분으로 포함하는 비만 및/또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

최근 항비만 물질 개발을 위한 신규 타겟으로 주목받고 있는 것이 AMPK (AMP activated protein kinase)이다. AMPK는 세포내 AMP(Adenosine Mono-Phosphate)를 감지하여 활성화되는 단백질로서 ATP를 소모하는 신호전달경로를 억제하는 반면 ATP를 합성하는 신호전달경로는 활성화하여 외부 스트레스로부터 세포를 보호하는 역할을 한다. AMPK의 활성을 증가시키는 물질은 ATP (Adenosine Tri-Phosphate) 합성촉진, 글루코스 흡수의 증가, 지방의 β-산화(oxidation) 촉진, 콜레스테롤 합성 저해, 염증 반응 완화 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있어 비만을 포함한 당뇨, 인슐린 저항성, 고지혈증, 염증 등 대사성 질환 치료제 개발을 위한 약물 표적으로 활용되고 있다.

AMPK는 세포 내 ATP 농도 감지 역할을 하는 인산화 효소로서 세포내의 에너지 균형을 유지하는데 매우 중요한 효소로서, 대부분 세포내 생합성 (ATP 소비 과정)에 의해 증가되거나, 운동 등으로 인한 급격한 ATP 소비에 의하여 증가된 AMP:ATP 비율에 의해 활성화 되어 ATP 생성 과정을 유도되는 것으로 알려져 있다. 활성화된 AMPK는 몇몇 하위 단계에 있는 기질을 인산화하여 지방 합성이나 콜레스테롤 합성과 같은 ATP-소비 경로를 차단하고 지방산 산화나 당분해와 같은 ATP-생성 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다 (D.G. Hardie et al., FEBS Lett., 546, pp113-120, 2003; D. Carling, Trends Biochem. Sci., 29, pp18-24, 2004) 지질질대사와 관련되어 AMPK의 중요한 조절기작은 단백질 인산화를 통해 아세틸-CoA 카르복실라제 (Acetyl-CoA carboxylase, ACC)란 효소의 활성을 억제하는 것이다. ACC는 간과 근육 등 여러 조직에서 지질대사를 조절하는 중요한 효소로 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 탄산화시키는 작용을 하며 (B.E. Kemp, Biochem. Soc. Trans., 31, pp162-168, 2003), 말로닐-CoA는 미토콘드리아의 외막에 존재하는 CPT1 (carnitine palmitoyl transferase 1)의 저해제로 작용하고, 이 CPT1의 활성은 미토콘드리아에서 일어나는 지방의 β-산화에 중요한 작용을 하고 있다(Lehninger, Principles of Biochemistry, Worth Publishers, NY, 3rd Ed., pp599-605, 2000; Cohen P., Miyazaki, M., Socci, N. D., Hagge-Greenberg, A., Liedtke, W., Soukas, A. A., Sharma, R., Hudgins, L. C., Ntambi, J. M. & Friedman, J. M., Science 297, 240-243, 2002).

AMPK의 활성화에 의해 ACC의 인산화가 증진되어 효소 활성이 억제되면 말로닐-CoA의 생성량이 감소하게 되어 AMPK의 활성화가 유도되며 (Vavvas D et al., J. Biol. Chem., 272, pp13255-13261, 1997) 지방산을 태우는 산화작용에 의해 ATP 생성량이 증가된다. 즉 AMPK 활성화에 따른 ACC의 인산화는 지방산 산화 증가 기전 의한 체지방 감소에 중요하다. 따라서 지방산 합성초기에 ACC 효소 활성을 AMPK에 의해서 조절하면, 필요 이상의 체내 지방 축적을 억제할 수 있게 되어, 결과적으로 체중 증가를 억제할 수 있다. 나아가 AMPK의 중요한 조절기작 중에 HMG-CoA 리덕타제 (고지혈증 치료제인 스타틴의 타겟분자)의 활성이 또한 억제되는데, 이것은 AMPK 활성화에 의해서 콜레스테롤의 합성도 간조직에서 조절될 수 있음을 의미하는 것으로 혈중 중성지방과 콜레스테롤의 농도를 저하시키는 효과를 또한 얻을 수 있다. 따라서 AMPK가 활성화되면, 지방의 합성이 감소하는 동시에 β-산화가 증가되어 체내지방의 산화가 증가하여 체지방 감소로 인한 체중감소는 물론 혈중 중성지방과 콜레스테롤의 농도를 감소시킬 수 있다.

본원의 조성물은 흑마늘 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 혼합으로 포함하며, AMPK를 활성화여 체지방을 감소시켜 항비만 효과 및 고질혈증의 완화 및/또는 치료 효과를 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 용어 "비만"은 에너지 불균형에 의하여 체내에 축적된 지방이 정상수치보다 높은 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 세계보건기구 WHO에 의하면 아시아태평양 지역의 경우, 비만의 진단에 이용되는 것은 키(meter단위)의 제곱으로 자신의 체중을 나눈 값이 되며, 이 값이 25.0 이상인 경우는 비만이라고 정의하고, 23이상 25미만은 과체중(위험체중)으로 정의하고 있다. 비만은 분류에 따라 내분비성 비만 (내분비 이상 또는 뇌질환으로부터 기인), 단순성 비만(과다한 영양 섭취로부터 기인); 증식성 비만 (지방세포수의 증가로 인한 비만), 비대형비만 (지방세포의 크기 증대로 인한 비만); 상반신 비만, 하반신비만; 및 내장형 비만, 피하지방형 비만 등으로 나눌 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 비만은 대사증후군과 관련된 비만이다. 본 명세서에서 사용된 용어 대사증후군은 제2형 당뇨병, 고지혈증, 비만, 신병증, 간병증과 같은 질환이 동시에 발생하는 것을 의미한다 (Pershadsingh HA, Dual Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-alpha/gamma Agonists : In the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus and the Metabolic Syndrome. Treat Endocrinol. 2006;5(2):89-99).

본 명세서에서 사용된 용어 고지혈증은 혈액 중에 지방성분 특히 콜레스테롤과 중성지방(triglyceride)의 농도가 높은 경우로 일반적으로 240mg/㎗을 넘거나 중성지방이 200mg/㎗ 이상일 때를 고지혈증 이라고 한다. 고지혈증은 유전적 소인, 비만, 식이습관, 당뇨병, 신증후군, 갑상선기능저하증에 의해서 유발될 수 있다.

본원의 추출물이 효과를 나타내는 고지혈증은 비만, 대사증후군, 당뇨, 식이습관, 갑상선기능저하증, 신증후군으로 인한 고지혈증을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서, 본원의 고지혈증은 비만으로 인한 것이다. 다른 구현예에서 본원의 고지혈증은 당뇨병으로 인한 것이다. 다른 구현예에서 본원의 고지혈증은 대사증후군으로 인한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료"란 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 비만 또는 고지혈증 또는 이로 인한 다른 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 비만 또는 고지혈증 또는 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 비만 또는 고지혈증 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 비만 또는 고지혈증에 치료효과가 있는 본원의 추출물은 비만 고지혈증의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "추출물(extract)"란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다.

본원에 사용되는 추출물의 원재료인 마늘 (Allium sativum L.)은 식품으로 사용되며, 파, 양파, 부추 및 달래 등과 함께 백합과의 알리움에 속하는 다년생 구근 식물이다. 본원의 한구현예서 마늘은 의성 한지 마늘이다. 본원의 다른 구현예에서 마늘은 가공마늘, 특히 흑마늘이다. 본원의 다른 구현예에서 흑마늘은 의성 한지마늘로 제조된 흑마늘이다. 흑마늘은 생마늘을 일정기간 동안 알맞은 온도 및 습도 조건에서 숙성하여 제조된다. 이러한 흑마늘의 제조방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 (장은경, 서지현, 이삼빈, 숙성에 의해 제조된 흑마늘 추출물의 생리학적 활성 및 항산화 효과, 한국식품과학회지, 40(4), 443-448, 2008)에 기재된 방법을 사용할 수 있거나, 또한 시중에서 구입할 수 있다 (의성농산, 한국). 본원의 조성물에는 흑마늘 추출물이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 흑마늘 추출물은 원적외선 조사 가온 숙성방식에 의한 흑마늘 추출물이 사용된다. 본원에서 흑마늘 추출물이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미하며, 통상적으로 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 제조되며, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매의 추출물, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다.

본원의 흑마늘 추출물은 가르시니아 캄보지아 추출물과 조합으로 사용된다. 가르시니아 캄보지아(Garcinia cambogia)는 주로 인도를 비롯한 동남아시아에서 자생하는 Guttiferae 과의 열대성 과일나무로서 가르시니아 캄보지아 추출물은 가르시니아 캄보지아 열매, 특히 과피를 추출하여 분말화한 것이다. 가르시니아 캄보지아 추출물 중에는 HCA(hydroxy citric acid) 성분이 약 10~30 %(건조중량기준) 함유되어 있으며, 오렌지나 레몬과 같은 감귤류에 함유되어 있는 시트르산과 매우 유사하나 히드록실기가 붙어 있는 자연계에서 흔하지 않은 물질이다. HCA는 생체 내에서 시트레이트가 아세틸-CoA로 전환되는 과정을 저해하여 지방산의 합성을 억제하고 산화를 촉진하며 글루코겐 합성으로 전환시켜 에너지 생산을 증가시키는 등의 생리활성이 있으며, 본원의 흑마늘 추출물과 조합으로 사용시 항비만에 효과에 있어 상승작용이 있다. 본원의 조성물은 천연식품에서 유래로 독성이나 내성이 없고 다른 식욕 억제제에서 나타나는 불면증, 신경불안, 우울증과 같은 부작용이 없다.

본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아를 포함하는 조성물은 흑마늘 추출물 1 중량부에 대하여 가르시니아 캄보지아를 약 5 내지 20 중량부로 포함한다. 다른 구현예에서 흑마늘 추출물 1 중량부에 대하여 가르시니아 캄보지아를 약 7 내지 17 중량부로 포함한다. 또다른 구현예에서 흑마늘 추출물 1 중량부에 대하여 가르시니아 캄보지아를 약 8 중량부 또는 약 16 중량부로 포함한다.

이러한 흑마늘 및 가르시니아 캄보지아 추출물은 공지의 방법대로 제조될 수 있다. 예를 들면 본원에 사용되는 가르시니아 캄보지아 추출물 및 흑마늘 추출물 또는 이의 분말은 열수 추출 또는 적절한 유기용매 예를 들어, 메탄올, 에탄올 등을 추출용매로 하여 공지의 방법대로 제조될 수 있다 (Nomura T. Phenolic compounds of the mulberry tree and related plants. In: Progress in the Chemistry of Organic Natural Products (Herz W, Grisebach H, Kirby GW, Tamm Ch, eds.), vol. 53. Springe:Vienna, 1988;87-201.)

상기 용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 이로 제한하는 것은 아니나, 구체적으로는 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 등을 포함하는, 탄소수 1 내지 5의 저가 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 특히 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 특히는 물, 50 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있다.

본원의 추출물은 통상의 식물 추출물의 공지된 일반적 제조방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법 또는 상기 용매를 추출용매로 하여 공지의 방법에 의해 제조하는 방법일 수 있다 (예를 들면 Nomura T, 1988 등 참조). 또한 추출과정을 거친 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획 시 용매는 2종이상 개별적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하여 각 용매의 추출물을 제조할 수 있다. 추출물 제조온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 30일 일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 예를 들면, 흑마늘에 용매를 1: 1 내지 1: 20 중량비로 가열 순환식 추출탱크에 넣고, 정제수 또는 식용 알콜을 가하여 80 내지 100℃에서 6-24시간 정도 추출한 후 여과하여 여액을 얻고, 잔여물에 다시 정제수 또는 식용 알콜을 가하여 동일한 과정을 수회 반복할 수 있다. 여액을 합하여, 그 자체로 사용하거나, 이를 진공 농축기로 감압하에서 농축한 후, 열풍 또는 동결 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.

일예로, 본 발명의 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 흑마늘 추출물은, 재료 100 g당 물 0.1 내지 10ℓ를 가한 후 추출하는 방법으로 실시된다. 추출 온도는 약 80 내지 150℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다. 추출시간은 한정되진 않으나 30분 내지 수일 일 수 있으며, 통상의 추출 기기나 초음파분쇄 추출기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 사용될 수 있다.

다른 일예로 가르시니아 캄보지아 추출물 또는 흑마늘 추출물은 재로 100 g당 에탄올 약 0.5 내지 5ℓ를 가해 얻어진 에탄올 추출물을 농축하여 얻은 농축물 약 10 내지 15 g을 물 약 100 내지 1000 ㎖에 현탁하고, 헥산 100 내지 1000 ㎖를 가한 후 추출한 후 헥산 분획추출물을 얻어낸다. 상기 헥산 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 메틸렌 클로라이드 100 내지 1000㎖ 를 가한 후, 추출하여 메틸렌 클로라이드 분획추출물을 얻는다. 상기 메틸렌 클로라이드 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 에틸아세테이트 100 내지 1000㎖를 가한 후, 추출하여 에틸아세테이트 분획추출물을 얻는 방법으로 실시된다. 또한, 상기 에틸아세테이트 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 부탄올 100 내지 1000㎖를 가한 후, 추출하여 흑마늘 부탄올 분획추출물을 얻을 수 있으며, 이 때 상기 부탄올 분획추출물을 제외한 물 층을 물 추출물로 얻을 수 있다. 상기 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 또는 부탄올로 추출할 경우 추출 온도는 20 내지 40℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않으며, 추출시간도 한정되진 않으나 30분 내지 20 시간일 수 있으며, 통상의 추출 기기나 초음파분쇄 추출기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 용매를 제거한다.

또 다른 일예로, 상기 흑마늘 또는 가르시니아 캄보지아 추출물은 재료 100 g당 메탄올 0.1 내지 5 ℓ를 가하여 추출하여 메탄올 추출물을 제조한다. 상기 메탄올 추출물은 추후 헥산 또는 메틸렌클로라이드를 가하여 각 용매별 분획물을 수득함으로써 헥산 추출물 또는 메틸렌클로라이드를 제조한다. 이후 잔류물에 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가하여 분획함으로써 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물을 각각 제조하며, 상기 용매에서 추출되지 않은 물 분획은 물 추출물로 제조된다. 상기 용매를 이용한 분획시, 추출대상물에 대하여 용매를 1: 0.1 내지 10 부피비로 가하여 실시된다. 본 발명에서 여과는 추출물로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 공정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친수성 등에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리과정을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 건조공정은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조 또는 적외선건조 등을 포함하는 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

과량의 지방산 섭취는 몸의 여러 조직, 특히 지방조직에 트리글리세리드의 축적을 가져오고 이로 인해 지방조직에서 지질분해가 증가된다. 이로 인한 혈류의 지방산 증가는 인슐린 저항성을 초래하고 근육, 췌장 및 간과 같은 비지방조직까지 지방산의 증가를 가져온다. 인슐린 저항성이 있는 사람의 경우, 지방 및 비지방조직에서의 지방산결합수송단백질 (FABP 및 CD36)의 농도가 증가하여 지방산의 이용(uptake)를 촉진하게 된다. 이러한 과량의 자유 지방산 및 근육에의 지방산의 축적은 인슐린 신호전달 및 당의 사용에 있어 악순환을 초래한다. 췌장이 자유 지방산에 오래 노출되게 되면 지방독성 기전을 통하여 인슐린 분비에 장애를 가져오는 것으로 알려져 있다 (Lebovitz HE. Insulin resistance: definition and consequences. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2001;109:S135-48). 간에서도 당의 방출을 향상시켜 인슐린의 작용을 방해하는 것으로 알려졌다 (Goldstein BJ. Insulin resistance as the core defect in type 2 diabetes mellitus. Am J Cardiol. 2002;90:3G-10G). 간에 트리글라세리드가 쌓이게 되면 비알콜성 지방간을 초래하며, 이는 지방증, 지방간염, 간세포괴사, 섬유증과 같은 간의 손상을 가져와, 간의 주요기능인, 당대사를 막는다 (Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med. 2002;346:1221-31). 이러한 증상은 대사증후군의 중요 증상이기도 하다 (Kadowaki T, Yamauchi T. Adiponectin and adiponectin receptors. Endocr Rev. 2005;26:439-51).

마늘의 향균, 항암 효과에 대하여는 보고된 바가 있으나, 흑마늘, 특히 원적외선 조사 가온숙성방식에 의해 제조된 흑마늘과 가르시니아 캄보지아를 조합한 경우 항비만 상승 효과에 대하여는 개시된 바 없다.

본원의 흑마늘 및 가르시니아 캄보지아 추출물은 조합으로 사용 시 개별적으로 사용한 경우보다 탁월한 항비만 효과 및 비만으로 인한 대사증후군 및 고지혈증 증상의 개선에 탁월한 효과가 있다.

본원의 흑마늘 추출물 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 약학 조성물은 동시에 또는 연속적으로 투여가능하며, 이들 혼합물을 단독으로 또는 비만 및/또는 대사증후군의 증상 예를 들면 고지혈증의 치료를 위한 다른 약학적 활성성분과 병행하여 투여될 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘, 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 경구 투여가 바람직하다.

경구 투여를 위한 고형 제형에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제형은 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 슈크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제형으로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

더 나아가 본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물의 유효 투여량은 통상적으로 성인(60kg)의 경우, 약 1 내지 100 g/일, 특히 약 10 내지 50g/일, 더욱 바람직하게는 약 30g/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본원의 추출물을 포함하는 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.

본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 약학 조성물은 비만과 이로인한 대사증후군 및 고지혈증 등에 대하여 우수한 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 의한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다. 이에 따라, 상기 본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물이 식품의 주, 부원료 및 식품 첨가제로서 사용이 가능하다.

따라서, 이러한 관점에서, 본 발명은 상기 기술한 본원의 흑마늘 추출물 가르시니아 캄보지아 추출물을 포함하는 조성물은 식품, 예를 들면, 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제 등으로 제공될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "기능성식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 특히 "건강기능식품"을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "건강보조식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 가공한 식품으로서, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품원료에 들어있는 성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말한다.

특히 본 발명에서 기능성식품 또는 건강보조식품은 상기 식품을 섭취하기 전과 비교하여 비만, 고지혈증 및 이로 인해 유발되는 질환의 증상을 개선하거나, 이의 경감 또는 해소에 도움을 줄 수 있는 효과가 있는 식품을 의미하며, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 이러한 질환의 정확한 기준을 알고, 개선된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

상기 기능성식품 및 건강보조식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효 음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본원에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

본원에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미하며, 바람직하게는 대사증후군 증상, 예를 들면 고지혈증 개선을 위한 음료를 의미한다.

상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본원의 흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본원의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.001 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

비만, 고지혈증 및 대사증후군의 개선을 목적으로 하는 식품에 있어서, 상기 본원의 흑마늘 추출물 가르시니아 캄보지아 추출물의 조합은 전체 식품 중량의 약 0.01 내지 90 중량%, 약 0.1 내지 80 중량%, 약 1% 내지 70%, 약 1% 내지 50%, 약 1% 내지 40%, 약 1% 내지 30%, 약 1% 내지 20%의 범위로 포함할 수 있으나, 상기 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 예를 들면 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 추출물의 제조

실시예 1 -1 마늘 열수 추출물의 제조

의성한지 마늘은 의성농산 영농조합법인(대한민국)에서 구입하였다. 건조된 통마늘 100g을 1ℓ증류수에 넣고 환류 하에서 2시간 동안 80℃에서 충분히 달인 후, 이를 흡입여과 하여 추출물을 준비하였다. 여과 후 남은 잔류물에 대하여 동일한 추출과정을 추가로 1회 반복하였다. 추출물을 모두 모아, 회전식 진공증발기 (N-N type; LAB Camp, Dajeon, Korea)로 감압/농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결건조기(PVTFD10A; ilShin Lab, Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 수율 약 12%로 연갈색의 동결건조물을 수득하였다. 상기 추출물은 사용시까지 빛으로부터 차단되어 4℃에서 보관하였다. 분말 0.5g을 증류수 1ml로 용해하여 최종 농도에 맞추어 희석하여 사용하였다.

실시예 1-2 원적외선 조사 가온숙성 흑마늘 추출물의 제조

의성한지 마늘은 의성농산 영농조합법인(대한민국)에서 구입하였다. 구입한 생마늘을 1회 세척후 24시간 동안 45℃에서 원적외선이 장치되어 있는 항온항습기에서 습도 80%이상을 유지하면서 1차 숙성시켰다. 1차 숙성 후 수득된 연갈색의 마늘을 60℃, 습도 85%를 유지한 항온항습기에서 15일간 2차 숙성을 거쳐 진갈색의 흑마늘 (Black garlic, BG)을 제조하였다. 100℃에서 24시간 건조된 통흑마늘 100g을 1ℓ증류수에 넣고 환류 하에서 2시간 동안 80℃에서 충분히 달인 후, 이를 흡입여과 하여 추출물을 준비하였다. 여과 후 남은 잔류물에 대하여 동일한 추출과정을 추가로 1회 반복하였다. 추출물을 모두 모아, 회전식 진공증발기 (N-N type; LAB Camp, Dajeon, Korea)로 감압/농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결건조기(PVTFD10A; ilShin Lab, Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 수율 약 12%로 진갈색의 동결건조물을 수득하였다. 상기 추출물은 사용 시까지 빛으로부터 차단되어 4℃에서 보관하였다. 분말 0.5g을 증류수 1ml로 용해하여 최종 농도에 맞추어 희석하여 사용하였다.

본원에 사용된 가르시니아 캄보지아 추출물은 (주)렉스진바이오텍에서 구입한 분말을 사용하였다.

위에서 제조한 추출물은 의성 한지마늘 열수추출물(a), 원적외선조사 가온숙성방식으로 제조된 흑마늘 열수추출물(b), 흑마늘열수추출물과 가르시니아 캄보지아 혼합추출물(c)로 명명하고 이하 실험에 사용하였다.

실시예 2 흑마늘 및 가르시니아 캄보지아 추출물의 AMPK 활성화 효과

앞서 살펴 본 봐와 같이 AMPK가 활성화되면, ACC (Acetyl-CoA carboxylase) 효소 활성이 억제되어 지방의 합성이 감소하여 필요 이상의 지방의 축적을 억제할 수 있게 되며, 결과적으로 체중 증가를 억제할 수 있고, 동시에 β-산화가 증가되어 체내지방의 산화가 증가한다. 또한 AMPK의 또다른 중요한 타겟 분자인 HMG-CoA 리덕타제 효소의 활성이 조절되어, 간조직에서의 콜레스테롤의 합성이 억제되어 고지혈증에도 효과를 볼 수 있다.

실시예 2-1 L6 근육세포 배양

L6 근육세포는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 10% (vol./vol.) FBS, 1% (vol./vol.) 페니실린 및 스트렙토마이신 (100 U/mlpenicillin, 100 μg/ml streptomycin), 및 1% (vol./vol.) 펀자이존을 포함하는 αMEM 배지를 사용하여 가습된 37°C의 5% CO₂ 95% O₂ 조건에서 배양하였다. L6 세포는 2% FBS를 포함하는 αMEM 배지에서 6일 동안 배양하여 마이오튜브로 분화시켰다. 마이오튜브는 이어 실험 3시간 전에 무혈청 배지에서 배양하였다.

실시예 2-2 마늘의 가공형태에 따른 AMPK 활성화 효과

이어 실시예 1에서 제조된 a, b, c 추출물 각각을 최종농도 2mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml 농도 그리고 참조군으로서 고지방에 의해 유도되는 비만을 저해하는 메트포르민을 2mM 농도로 L6 세포에 처리하였다. 이어서 24시간 후에 세포를 수확하여 총 단백질을 추출하고, AMPK 및 ACC의 인산화 정도를 측정하여 AMPK 및 ACC 활성을 조사하였다.

배양한 L6세포를 세포융해완충액(lysis buffer[0072]에)(20mM Tris, 1mM Na₃VO₄, 1mM phenyl methylsulfonyl fluoride, 50mM NaF)에서 30분간 용해시킨 후, 단백질 정량을 시행 한 후 10mg을 단백질을 전기영동을 한 후, 막에 전달하고, Biorad 웨스턴블랏키트를 제조자의 지시대로 사용하여, phosphoAMPK(Thr-172, Cell Signaling, Beverly, MA USA)와 total AMPK에 대한 일차 항체(Cell Signaling, Beverly, MA USA)와 4℃에서 밤동안 반응시키고, PBS (Phospho buffered saline, pH7.4)로 수차례 세척 후 Goat anti-rabbit IgG (GIBCOBRL, Gaithersburg, MD, USA)에 차례로 반응시켜 발색하였다.

결과는 도 2에 기재되어 있다. 도 2에서 보듯이 한지마늘 열수추출물(A)의 경우 지방세포 산화와 관련된 AMPK 활성변화 및 ACC 활성 억제에 거의 없었으나, 원적외선조사 가온숙성방식으로 제조된 흑마늘 열수추출물(B)의 경우 농도의존적으로 지방세포 산화와 관련된 AMPK 활성이 증가되고, ACC 활성이 억제되는 양상을 확인할 수 있었다. 제조예 2와 같은 비율로 의성한지 흑마늘과 가르시니아 캄보지아를 포함하는 분말(C)의 경우 흑마늘 열수추출물(B)과 유사한 경향성을 나타내었다. 이로부터 가르시니아 캄보지아의 경우 지방세포 산화에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타나, 흑마늘 추출물이 지방세포 산화에 유의성 있는 영향을 주는 것으로 판단된다.

의성 한지 흑마늘 열수추출물과 흑마늘과 가르시니아 캄보지아를 포함하는 분말의 경우 AMPK 활성의 증가와 더불어 인산화된 ACC의 농도도 증가됨을 확인할 수 있어, ACC의 활성이 억제됨을 알 수 있었다.

실시예 3 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 혼합에 의한 지방세포분화 억제효과

실시예 3-1 세포 배양 및 지방세포로의 분화 측정

3T3-L1 프리아디포사이트(preadipocyte)는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; high glucose 4.5g/L), FBS(fetal bovine serum), FCS (Fetal Calf Serum)는 Invitrogen (Grand Island, YK, USA)에서 구입하였으며, 사용된 real-time PCR용 primer들은 Macrogen (Deajeon, Korea)에서 합성하였다. 사용된 일반 시약들은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 bioreagent급을 구매하였다. 3T3-L1 세포는 25 mM glucose (high glucose), 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 100% 습도의 37℃, 5% CO2 환경하에서 배양하였다. 세포의 기능을 유지하기 위하여 약 60% 정도의 포화도에서 세포를 회수하여 계대배양 하였다. 계대배양을 위해 세포를 PBS(Phosphate Buffered Saline, pH8.0)로 1회 세척한 후, trypsin-EDTA(Sigma)를 제조자의 지시대로 처리하여 세포를 바닥에서 분리하였다.

3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화는 ( Elmendorf, J. S., Chen, D. and Pessin, J. E. (1998) Guanosine 5'-O-(3-thiotriphosphate) (GTPgammaS) stimulation of GLUT4 translocation is tyrosine kinase-dependent. J Biol Chem 273,13289-13296.)에 기재된 Elmendorf법을 사용하였다. 요약하면 분화용 배지는 25 mM glucose, 10% FBS, 1 mg/ml 인슐린, 1 mM dexamethasone (Dex), 0.5 mM isobutyl-1- methylxanthine (IBMX) 가 포함된 DMEM배지를 사용하였다. 지방세포로의 분화는 3T3-L1 세포가 배양접시에 100% 포화되었을 때, 분화용 배지로 치환하여 4일간 배양하고, 계속해서 25 mM glucose, 10% FBS, 1 mg/ml 인슐린이 포함된 DMEM 배지로 교환하고 4일간 더 배양하였다. 인슐린 처리가 끝나면 25 mM glucose, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 교환하여 사용할 때까지 배양하였으며, 배양하는 동안 배지는 매 2일 마다 같은 필요한 배지로 교환해 주었다.

실험에 사용된 각 추출물을 도 3 내지 4에 기재된 최종 농도로 처리하였으며, 10일간의 분화기간 배지 교환 시 추출물도 역시 추가하였다. 분화 종료 시 배양용 배지를 제거하고, 고정액 (10% formalin)을 5분간 처리하여 세포를 고정하였다. 이어 고정액을 버리고, 다시 새로운 고정액을 추가하여 1시간 이상 처리하여 세포를 완전히 고정하였다. 고정 후 고정액을 버리고 60% isopropanol로 세포를 세척하고, 완전히 건조 후, 세포 내 지방은 Oil-Red O(Sigma)를 이용하여 염색하였다. 세포 내 지방 측정은 염색에 사용한 Oil-Red O를 iso-propanol로 추출하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 3-2 마늘 추출물 단독 처리 결과

도 4에서 보는 바와 같이 의성 한지 마늘 추출물에 의해 지방 분화가 농도의존적으로 증가하였으며 (도 3A), 지방세포내 지방 축적이 농도 의존적으로 다소 증가하는 것으로 나타났다 (도 3B).

실시예 3-3 흑마늘 추출물 단독 및 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 혼합 처리 결과

의성한지 흑마늘 추출물 (도 4 A,C)은 지방 분화가 농도 의존적으로 증가하였으며 (도 4A), 지방세포내 지방 축적이 농도 의존적으로 다소 증가하는 것으로 나타났다 (도 4C). 반면 제조예 2의 비율로 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 혼합을 실시예 3-1과 같이 처리하여 지방세포 분화를 측정한 결과 지방세포의 분화가 저해되었으며 (도 4B), 세포 내 지방 축적도 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다 (도 4D). 즉 흑마늘과 가르시니아 캄보지아 추출물을 조합으로 사용한 경우 지방세포의 분화 정도가 각 추출물을 단독으로 사용한 것과 비교하여 상당히 감소하고, 세포내 지방 축적 또한 각 추출물을 단독으로 사용한 것과 비교하여 감소함을 알 수 있었다.

실시예 3-4 지방 합성 유전자 발현에 미치는 효과

위 결과가 지방 합성 유전자의 발현 증가에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 실시예 3-1에서와 같이 세포에 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 혼합(150 mg/ml)을 처리하면서 각 분화 단계에서 유전자 발현 정도를 실시간 정량 PCR을 통해서 확인하였다 (도 5). 유전자 발현 분석을 위해 실시간 PCR에 사용한 총 RNA 분리 및 cDNA 합성은 다음과 같이 수행하였다. Trizol (Invitrogen) 용액을 제조회사의 사용법에 따라 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 분리한 총 RNA의 농도는 nanodrop spectrophotometer를 사용하여 정량하였으며, 5 mg의 총 RNA를 cDNA 합성에 사용하였다. cDNA의 합성은 역전사효소 (Takara, Japan) 키트를 제조사의 방법에 따라 사용하여 수행하였으며, 유전자 발현 정도는 Syber Green 키트를 사용하여 제조자의 지시대로 사용하여 Real-time PCR (ABI 7500, ABI, USA)에서 판독하였다. 각 유전자의 검출을 위해 사용하나 프라이머 서열을 다음과 같다: aP2 유전자 검출을 위해 사용한 프라이머는 Forward Primer CCA TCC GGT CAG AGA GTA CTT TTA A 와 Reverse Primer CGA ATT CCA CGC CCA GTT T이다. C/EBPα유전자 검출을 위한 프라이머는 Forward Primer TGC GAG CAC GAG ACG TCT ATA G 와 Reverse Primer GCC AGG AAC TCG TCG TTG A이다. PPARγ 유전자 검출을 위한 프라이머는 Forward Primer CAC AAG AGC TGA CCC AAT GGT와 Reverse Primer GAT CGC ACT TTG GTA TTC TTG 이다. Adiponectin 유전자 검출에 사용된 프라이머는Forward Primer AAC CCC TGG CAG GAA AGG 와 Reverse Primer CAC TGA ACG CTG AGC GAT ACA이다. SREBP1c (ADD1) 유전자 검출에 사용된 프라이머는 Forward Primer AGA GGG TGA GCC TGA CAA와 Reverse Primer CCT CTG CAA TTT CCA GAT 이다. 36B4 (GLUT4)유전자 검출을 위해서는 Forward Primer ACC TCC TTC TTC CGG CTT 와 Reverse Primer CTC CAG TCT TTA TCA GCT를 사용하였다.

흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물 복합 조성물 처리시 흑마늘 추출물을 단독으로 처리한 것과는 달리 지방세포의 분화를 조절하는 마스터 전사조절인자들인 C/EBPa 과 PPARg의 발현 및 지방세포에서 포도당 합성의 흡수를 조절하는 glucose transporter 4 (GLUT4) 유전자와 지방합성 유전자 (fatty acid synthease, FAS)들 또한 흑마늘 가르시니아 추출물과의 조합 처리에 의해 그 발현량이 감소함으로서 지방합성 억제 효과를 확인할 수 있었다. 한편, adiponectin의 발현은 대조군에 비하여 거의 변화가 없는 것으로 나타났다.

또한 가르시아 캄보지아 추출물 단독과 흑마늘 추출물과 가르시니아 캄보지아 추출물의 조합(각 성분 제조예 2의 비율로 포함)을 도 6에 기재된 양으로 사용하여 지방세포 분화를 실시예 3-1과 같이 측정하였다. 결과는 도 6에 있으며, 보는 바와 같이, 가르시니아 캄보지아 추출물을 단독 처리했을 때 보다 의성 흑마늘 분말을 복합으로 처리하였을 경우, 15%~20% 더 우수한 효과로 농도 의존적으로 지방세포 분화가 억제됨을 확인할 수 있었다. 나아가 복합 조성물의 경우 가르시니아 캄보지아 추출물을 단독으로 사용한 것과 비교하여 35% 더 적은 양이 포함되어 있으며, 흑마늘 추출물과의 복합사용에 의해 더 적은 양의 사용으로도 상승효과가 유발되었음을 알 수 있다.

제제예 1 정제의 제조

	원료명	배합량(g)
1	HCA를 가르시니아 캄보지아 분말 (HCA 함량 60%)	35.255
2	흑마늘추출분말	5
3	치커리화이바	2
4	L-카르니틴	0.01
5	락토분말	18.535
6	이산화규소	2
7	결정셀룰로오스	36.2
8	스테아리산마그네슘	1
		100g

위의 분말을 직접 실험에 사용하거나, 통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

	원료명	원료함량	배합량(g)
1	가르시니아 캄보지아 추출물 분말	65.00000%	70.0000
2	비타민B1질산염	79.38000%	0.07000
3	비타민B2	98.00000%	0.05500
4	비타민B6염산염	80.36000%	0.10000
5	흑마늘추출분말		5.00000
6	치커리화이바(이눌린)		2.00000
7	CLA분말(토날린)		1.00000
8	L-카르니틴		0.01000
9	락토분말		18.53500
10	글리세린지방산에스테르		0.03000
11	이산화규소		2.00000
12	HPMC		1.20000
			100.000g

위의 분말을 직접 실험에 사용하거나, 통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3. 액제의 제조

흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 1000mg

설탕 20mg

이성화당 20mg

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제제예 5. 건강 음료의 제조

흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 1000mg

구연산 1000mg

올리고당 100g

메실농축액 2g

타우린 1g

정제수를 가하여 전체 900ml

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

흑마늘 추출물 및 가르시니아 캄보지아 추출물 1000mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70mg

비타민 E 1.0mg

비타민 B1 0.13mg

비타민 B2 0.15mg

비타민 B6 0.5mg

비타민 B12 0.2mg

비타민 C 10mg

비오틴 10mg

니코틴산아미드 1.7mg

엽산 50mg

판토텐산칼슘 0.5mg

비타민 E 1.0mg

무기질 혼합물 적량

황산 제1철 1.75mg

산화아연 0.82mg

탄산 마그네슘 25.3mg

제1인산칼륨 15mg

제2인산칼슘 55mg

구연산칼륨 90mg

탄산칼슘 100mg

염화마그네슘 24.8mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립 제형의 건강식품을 제조하였다.

Claims (6)

1 중량부의 흑마늘 추출물 및 8 내지 16 중량부의 가르시니아 캄보지아 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

제 1 항에 있어서, 상기 흑마늘 추출물 대 가르시니아 캄보지아 추출물의 비는 1 중량부 대 14 중량부인, 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

제 1 항에 있어서, 상기 흑마늘 추출물은 원적외선 조사 가온숙성방식에 의해 제조된 흑마늘인, 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

제 1 항에 있어서 상기 비만은 대사증후군을 유발하는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

제 4 항에 있어서, 상기 대사 증후군은 내당장애, 고혈압, 고지혈증, 간병증 및 신병증 중 하나 이상을 포함하는 증상을 갖는 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

1 중량부의 흑마늘 추출물 및 8 내지 16 중량부의 가르시니아 캄보지아 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 고지혈증의 개선 또는 예방용 식품 조성물.

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