KR20140023370A

KR20140023370A - 발광 검출 방법

Info

Publication number: KR20140023370A
Application number: KR1020137030499A
Authority: KR
Inventors: 네일 퍼시; 그레고리 더블유. 시튼
Original assignee: 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2014-02-26
Also published as: BR112013027041B1; EP2699889B1; WO2012145450A1; EP3287765A1; CA2833578A1; US8852894B2; JP2014513794A; JP2015064377A; CN103492856A; AU2012245528A1; EP2699889A1; MX2013012039A; US20140038199A1; JP6116540B2; AU2012245528B2; BR112013027041A2; US9845498B2; CN103492856B; US20150004681A1

Abstract

분석물을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 샘플, 벽(115)을 갖는 용기(110), 및 발광 반응을 위한 촉매를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 벽은 착색 부분(115b)을 포함한다. 상기 방법은 상기 용기 내에서 반응물을 형성하는 단계 및 상기 용기 내의 반응 혼합물로부터 방출되는 광의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 용기로부터 방출되는 광을 검출하는 단계는 상기 착색 부분을 통과하는 광을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 상기 착색 부분은 시각적으로 검출될 수 있으며, 상기 색상은 상기 용기 내에 배치된 분석물-특이적 시약의 실체와 연관될 수 있다. 상기 용기 및 발광 반응을 위한 촉매를 포함하는 키트가 또한 제공된다.

Description

발광 검출 방법 {LUMINESCENCE DETECTION METHOD}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2011년 4월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/478,251호의 이익을 주장한다.

실험실에서는, 예를 들어, 병인체(etiological agent)의 존재 또는 실체(identity)를 결정하기 위한 시험과 같은 다양한 시험 절차를 흔히 수행한다. 각각의 시험은 샘플 내의 특정 미생물의 존재를 검출할 수 있는 분석물-특이적 시약 (예를 들어, 효소 기질, 핵산 프라이머 또는 탐침, 항체, 단클론성 항체, 또는 수용체)을 포함할 수 있다.

병인체에 대한 실험실 시험은 흔히 개별 용기 (예를 들어, 튜브 또는 마이크로튜브)에서 수행된다. 게다가, 실험실 작업의 효율을 개선하기 위해 일단의 시험을 동시에 처리하는 것이 드물지 않다. 흔히 동일해 보이는 튜브에서 유사한 시험이 수행되기 때문에, 실험실의 기술자들은 라벨(label)을 사용하여 상이한 샘플 물질 및/또는 분석물-특이적 시약이 담긴 튜브를 구별한다.

라벨은 튜브의 내용물을 확인하기 위해 반응 튜브에 일상적으로 적용된다. 라벨은 튜브 또는 상응하는 뚜껑에 적혀질 수 있다. 영구적인 방수 잉크를 사용하여 취급 중에 라벨이 씻겨 나가거나 지워지는 것을 방지한다. 대안적으로, 튜브의 내용물에 대한 설명을 갖는 접착 라벨이 튜브에 부착될 수 있다.

라벨은 흔히 튜브의 내용물과 관련된 다량의 정보 (예를 들어, 샘플 실체, 날짜, 시험 유형 또는 시약-특이적 분석물, 작업자)를 포함한다. 일부 경우에, 바코드를 사용하여, 상대적으로 다량의 정보를 상대적으로 작은 라벨에 포함시킬 수 있다.

일반적으로, 본 발명은 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은 발광 반응(luminescent reaction)을 검출하여 분석물의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 또한 상기 방법에 사용될 수 있는 착색 용기와 관련된다. 놀랍게도, 시각적으로 서로 구별가능한 다양한 착색 용기가, 상기 용기의 착색 벽을 통과하는 광의 검출을 필요로 하는 검출 방법에 사용될 수 있다. 유리하게는, 착색 용기는 반응물의 하나 이상의 성분의 즉각적인 시각적 확인을 제공하여, 실험실 오류의 가능성을 감소시킨다.

일 태양에서, 본 발명은 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 샘플, 발광 반응을 위한 촉매, 및 용기를 제공하는 단계; 상기 용기 내에서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 상기 용기 내의 상기 반응 혼합물로부터 방출되는 광을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 반응 혼합물은 상기 샘플 및 상기 촉매를 포함할 수 있다. 상기 용기는 하나 이상의 벽을 포함할 수 있다. 상기 벽의 적어도 일부분은 착색제를 포함한다.

임의의 상기 실시 형태에 있어서, 상기 용기는 발광측정기(luminometer)에 사용되도록 구성될 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에 있어서, 반응 혼합물을 형성하는 단계는 발광 반응을 촉진하도록 반응 혼합물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 상기 일부분은 가시적으로 착색될 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 발광 반응으로부터의 광을 검출하는 단계는 검출기를 포함하는 발광측정기 내에 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 것은, 상기 일부분의 적어도 일부가 상기 반응 혼합물과 상기 검출기 사이에 위치되도록 상기 용기를 위치시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 광을 검출하는 단계는 광의 양을 정량하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

임의의 상기 실시 형태에서, 촉매를 제공하는 단계는 재수화가능한 건조 촉매를 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에 있어서, 촉매를 제공하는 단계는 루시페라아제를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에 있어서, 검출 시약 및 용기를 제공하는 단계는 촉매가 내부에 배치되어 있는 용기를 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

임의의 상기 실시 형태에 있어서, 상기 방법은 분석물-특이적 시약을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에 있어서, 분석물-특이적 검출 시약을 제공하는 단계는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에 있어서, 반응 혼합물을 형성하는 단계는 핵산 증폭을 촉진하도록 반응 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에 있어서, 상기 일부분의 색상은 상기 용기 내에 배치된 상기 분석물-특이적 시약의 실체와 연관될 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에 있어서, 상기 분석물은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.

임의의 상기 실시 형태에 있어서, 상기 착색제는 적색 착색제, 청색 착색제, 황색 착색제, 녹색 착색제, 상기 착색제들 중 둘 이상의 혼합물, 또는 상기 착색제들 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 상기 키트는 검출 시약 및 용기를 포함할 수 있다. 상기 용기는 하나 이상의 벽을 포함할 수 있다. 상기 벽의 적어도 일부분은 착색제를 포함할 수 있다. 상기 용기는 발광측정기에 사용되도록 구성될 수 있다.

상기 키트의 임의의 실시 형태에서, 상기 일부분은 가시적으로 착색될 수 있다. 상기 키트의 임의의 실시 형태에서, 상기 검출 시약은 분석물-특이적 시약일 수 있다. 상기 키트의 임의의 실시 형태에서, 상기 일부분의 색상은 상기 분석물-특이적 시약의 실체와 연관될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 키트는 세포 용해제, RNA 폴리머라아제, 또는 DNA 폴리머라아제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트의 임의의 실시 형태에서, 상기 색상은 적색, 황색, 청색, 녹색, 이들의 혼합, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

용어 "분석물"은, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다양한 분자 (예를 들어, 뉴클레오티드, 핵산, 단백질, 효소) 또는 분자의 에피토프 (예를 들어, 단백질, 당단백질, 또는 다당류의 상이한 결합 부위), 또는 미생물의 전세포(whole cell)를 지칭한다. 분석물은 미생물 (즉, 박테리아, 효모, 곰팡이, 또는 바이러스), 또는 관심 미생물들의 군의 특징일 수 있으며, 즉, 샘플 내의 상기 분석물의 존재는 샘플 내의 미생물의 존재를 나타낸다.

단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 환경 하에서 소정의 이득을 제공할 수 있는 본 발명의 실시 형태를 말한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에서 다른 실시 형태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시 형태의 언급은 다른 실시 형태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시 형태를 배제하고자 하는 것은 아니다.

용어 "포함하는" 및 그 변이형은 이들 용어가 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 나타날 경우 제한적 의미를 갖지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어("a," "an," "the"), "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용기는 "하나 이상의" 용기들을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

"및/또는"이라는 용어는 열거된 요소들 중 하나 또는 전부, 또는 열거된 요소들 중 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.

또한, 본 명세서에서 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 설명은 그 범위 이내에 포함된 모든 수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).

본 발명의 상기의 개요는 본 발명의 각각의 개시된 실시 형태 또는 모든 구현 형태를 설명하고자 하는 것은 아니다. 이하의 기재는 더 구체적으로 예시적인 실시 형태를 예증한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통하여 지침이 제공되며, 상기 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 단지 대표적인 군으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안된다.

이들 및 다른 실시 형태의 추가 상세 사항이 첨부 도면 및 이하의 상세한 설명에 설명된다. 다른 특징, 목적 및 이점들은 상세한 설명 및 도면과 특허청구범위로부터 명확하게 될 것이다.

<도 1>
도 1은 본 발명에 따른, 착색제를 포함하는 부분을 갖는 용기의 일 실시 형태의 측면도.
<도 2a>
도 2a는 본 발명에 따른, 착색제를 포함하는 부분을 갖는 용기 및 발광 판독기의 일 실시 형태의 분해 개략 단면도.
<도 2b>
도 2b는 도 2a의 발광 판독기와 작동가능하게 결합된 도 2a의 용기의 개략 단면도.
<도 3>
도 3은 투명한 용기 및 착색제를 포함하는 용기에서 수행된 발광 반응으로부터 방출되는 광의 스펙트럼의 일부분의 그래프.

실험실 시험에서의 경향은 미소체적 시험(microvolume test)을 사용하는 것이다. 이러한 경향은 특정 시약 (예를 들어, 효소, 효소 시약, 염료, 단클론성 항체)의 비용 및 분석물 분자를 매우 작은 체적으로 농축하여 검출 반응의 동역학을 향상시킬 수 있는 샘플 제조 기술의 발달에 따른 것이다. 게다가, 특정 장비 (예를 들어, 실시간 PCR 서모사이클러)를 사용하여 많은 수의 시험을 수행하는 경향이 있으며, 시험들 중 다수는 분석물-특이적 시약 (즉, 프라이머 및/또는 탐침)을 포함한다. 그러한 장비는 흔히 표준화된 용기 (예를 들어, 마이크로튜브)를 사용하는데, 그 안에서 모든 시험이 수행된다. 표준화된 용기들은 동일하게 보이기 때문에, 실험실 기술자는 라벨의 사용에 의존하여 각각의 용기의 내용물을 구별한다.

라벨은 각각의 용기의 내용물과 관련된 다양한 중요 정보 (예를 들어, 샘플 식별 표시, 샘플 공급원, 날짜, 작업자, 시험 유형, 분석물-특이적 시약, 로트(lot) 번호 등)를 기록하는 데 사용될 수 있다. 용기가 매우 작기 때문에, 용기 및/또는 그의 뚜껑의 이용가능한 표면적에 맞는 라벨에 모든 정보를 기록하는 것은 어려울 수 있다. 바코드를 사용하여 특정 샘플을 특유의 코드/번호와 연관시킬 수 있으며, 그에 의해 기술자는 바코드와 연관된 다량의 정보를 기록할 수 있다. 그러나, 그러한 코드는 정보가 저장된 데이터베이스와 접속된 바코드 판독기에 의해서만 오직 용이하게 해석될 수 있으며, 이는 기술자가 즉각적으로 임의의 소정 용기의 내용물의 중요 속성을 시각적으로 인지하기 어렵게 만든다.

라벨의 사용과 연관된 다른 단점은 안에서 시험이 수행되는 용기의 벽 또는 뚜껑의 일부 또는 전부를 라벨이 가릴 수 있다는 점이다. 이는 용기 내에서 일어나는 반응 (예를 들어, 발광에 의한 광의 방출이 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 기준이 되는 반응)의 광학 검출을 필요로 하는 시험의 경우에 문제가 될 수 있다. 광이 광학 검출기 (예를 들어, 광전자 증배관, 광다이오드, 전하결합소자 (CCD), 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS), 반도체, 사진 필름)로 향하는 경로에서 용기를 통과해 빠져나갈 때, 및/또는 광을 광학 검출기로 향하게 하도록 의도된 반사 표면을 향해 광이 통과할 때, 라벨이 발광 반응으로부터의 광을 실질적으로 흡수할 수 있으며, 그에 의해 검출 시스템의 잠재적인 감도를 감소시킬 수 있다.

그러므로, 마이크로용기에서 발광-기반 분석을 수행하고자 하는 기술자가 직면하게 되는 적어도 2가지 문제가 있다: i) 마이크로용기에 담긴 하나 이상의 중요 성분이 기술자 또는 장비에 의해 용이하고 즉각적으로 인식되도록 특정 마이크로용기에 표시(mark)를 하는 것, 및 ii) 마이크로용기 내의 반응의 광학 검출에 대한 표시에 의한 실질적인 방해를 막는 것. 본 발명의 방법은 용기를 표시하는 수단을 제공하되, 상기 수단이 광을 흡수하며 발광 반응물과 광검출기 사이의 경로에 직접 놓이더라도, 놀랍게도 발광 반응의 검출을 실질적으로 방해하지 않는 방식으로 용기를 표시하는 수단을 제공한다. 이론에 의해 구애됨이 없이, 인간 관찰자는 튜브의 색상을 용이하게 검출하는 것으로 여겨지는데, 전형적으로 관찰자는 착색 물질의 적어도 2개의 층 (예를 들어, 벽들)을 통과하는 (마이크로용기 외부의 공급원으로부터의) 광을 시각적으로 검출하기 때문이다. 따라서, 인간의 눈에 의해 검출될 때, 외부 광의 겉보기 흡광도는 적어도 2배로 된다. 대조적으로, 마이크로용기 내에서 발광 반응에 의해 방출되는 광은, 검출기로의 경로를 지날 때, 오직 하나의 벽만을 통과한다. 유리하게는, 이는 마이크로용기 내에서의 반응으로부터 방출되는 광을 상대적으로 적게 방해하면서 (즉, 흡수하면서) 튜브 색상의 용이한 가시적 검출을 가능하게 한다.

본 방법은 샘플, 검출 시약, 및 용기를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 용기는 개구와 내부 저장소를 형성하는 하나 이상의 벽을 포함한다. 상기 샘플은 분석물 (예를 들어, 특정 미생물 또는 미생물들의 군과 연관된 분석물)을 포함하는 것으로 의심될 수 있다. 특정 관심 미생물에는 원핵생물 및 진핵생물, 특히 그램 양성 박테리아, 그램 음성 박테리아, 진균, 원생동물, 미코플라즈마, 효모, 바이러스, 및 심지어 지질-피막 바이러스(lipid-enveloped virus)가 포함된다. 특히 관련 유기체에는 엔테로박테리아세아에 과(Enterobacteriaceae), 또는 마이크로코카세아에 과(Micrococcaceae), 또는 스타필로코커스 속 (Staphylococcus spp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus spp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas spp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus spp.), 살모넬라 속 (Salmonella spp.), 레지오넬라 속 (Legionella spp.), 시겔라 속(Shigella spp.), 예르시니아 속 (Yersinia spp.), 엔테로박터 속 (Enterobacter spp.), 에셰리키아 속(Escherichia spp.), 바실러스 속 (Bacillus spp.), 리스테리아 속 (Listeria spp.), 비브리오 속(Vibrio spp.), 코리네박테리아 속 (Corynebacteria spp) 뿐만 아니라 헤르페스 바이러스, 아스퍼길러스 속 (Aspergillus spp.), 푸사리움 속(Fusarium spp.), 및 칸디다 속 ( Candida spp.)이 포함된다. 특히 독성 유기체에는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus; 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)와 같은 내성 균주 포함), 에스. 에피더미디스 (S. epidermidis), 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 에스. 아갈락티아에 (S. agalactiae), 에스. 피오게네스 (S. pyogenes), 엔테로코커스 파에살리스 (Enterococcus faecalis), 반코마이신 내성 엔테로코커스(VRE), 반코마이신 내성 스타필로코커스 아우레우스 (VRSA), 반코마이신 중간 내성 스타필로코커스 아우레우스 (VISA), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli), 아스퍼길러스 니거 (Aspergillus niger), 에이. 푸미가터스 (A. fumigatus), 에이. 클라바터스 (A. clavatus), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 에프. 옥시스포룸 (F. oxysporum), 에프. 클라미도스포룸 (F. chlamydosporum), 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비 (Listeria ivanovii), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 브이. 파라헤몰리티커스 (V. parahemolyticus), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis), 에스. 티피(S. typhi), 에스. 티피무리움 (S. typhimurium), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 씨. 글라브라타 (C. glabrata), 씨. 크루세이 (C. krusei), 엔테로박터 사카자키 (Enterobacter sakazakii), 이. 콜라이 (E. coli) O157 및 다제 내성 그램 음성 간균 (MDR)이 포함된다.

그램 양성 및 그램 음성 박테리아가 특히 관심을 끈다. 더욱 더 관심을 끄는 것은 그램 양성 박테리아, 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스이다. 전형적으로, 이들은 박테리아의 특징적인 세포벽 성분, 예를 들어, 세포벽 단백질의 존재를 검출함으로써 검출될 수 있다. 또한, MRSA, VRSA, VISA, VRE, 및 MDR을 포함하는 항생제 내성 미생물이 특히 관심을 끈다. 전형적으로, 이들은 항생제 내성을 초래하는 내부 세포 성분, 예를 들어, 막 단백질, 수송 단백질, 효소 등의 존재를 추가로 검출함으로써 검출될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 분석물은 발광 반응을 위한 반응물인 생체 분자 (예를 들어, ATP, 루시페라아제)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 분석물은 발광 반응을 위한 반응물을 생성하는 반응 또는 일련의 반응들에 참여하는 생체 분자 (예를 들어, 핵산)일 수 있다. 특정 핵산 분석물의 존재에 응답하는 발광 반응을 위한 반응물을 생성하는 일련의 반응들의 비제한적인 예는 간델맨(Gandelman) 등의 문헌["Novel Bioluminescent Quantitative Detection of Nucleic Acid Amplification in Real-Time", 2010, Plos ONE, volume 5 (11), article e14155, published at www.plosone.org in November 2010]에 기재된 LAMP-BART 분석이다.

도 1은 본 발명에 따른 용기(110)의 일 실시 형태를 나타낸다. 용기(110)는 개구(120)와 내부 저장소(130)를 형성하는 단일 벽(115)을 포함한다. 선택적으로, 뚜껑 (도시되지 않음)을 사용하여 개구(120)를 밀봉할 수 있다. 용기(110)는 발광측정기에 사용되도록 구성된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발광측정기에 사용되도록 구성된"은, 용기, 또는 용기 안의 내용물 (예를 들어, 반응 혼합물)로부터 방출되는 광이 검출되고 선택적으로 발광측정기에 의해 측정될 수 있도록, 용기(110)가 발광측정기 내에 수용될 수 있는 형상 및 치수를 가짐을 의미한다. 임의의 실시 형태에서, 예를 들어, 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, 용기(110)는 광 검출기에 작동가능하게 결합되는 열전달 장치 내에 수용되도록 구성된다 (즉, 적합한 크기 및 형상을 갖는다). 따라서, 이들 실시 형태에서는, 용기(110), 또는 용기 안의 내용물로부터 방출되는 광이 광 검출기로 들어가면서, 동시에, 용기 및 용기 안의 내용물의 온도가 열전달 장치에 의해 선택적으로 제어되고/되거나 조절된다.

용기(110)는, 광 (예를 들어, 발광 반응으로부터의 가시 파장의 광)이 벽(115)을 통과하여 광 검출기로 향하는 것을 실질적으로 막지 않는, 광학 투명성 및 광학 투과성을 갖는 물질 (예를 들어, 유리; 예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌과 같은 중합체 물질)로부터 제작될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 용기는 시험 튜브, 반응 튜브, 또는 마이크로원심분리 튜브일 수 있다. 예를 들어, 터너 바이오시스템즈(Turner Biosystems; 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)로부터 입수가능한 20/20ⁿ 단일 튜브 발광측정기는, 발광측정기에서 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 사용할 수 있게 하는 샘플 어댑터를 포함한다.

용기(110)의 벽(115)은 착색제를 포함하는 부분(115b)을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태 (도시되지 않음)에서, 착색제를 포함하는 부분은 뚜껑일 수 있으며, 튜브 내의 발광 반응으로부터 검출되는 광은, 광이 상기 뚜껑을 통과한 후에 검출된다. 일부 실시 형태에서, 착색제는 장비를 사용하여 (예를 들어, 분광 광도계를 사용하여) 검출될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 착색제를 포함하는 벽(115)의 부분(115b)과 연관된 색상은 시각적으로 검출될 수 있다. 상기 부분은 벽(115)의 임의의 검출가능한 분율의 표면적을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 1% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 2% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 5% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 10% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 15% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 20% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 30% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 40% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 50% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 60% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 70% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 80% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 90% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 95% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 99% 이하를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 최대 상기 벽의 표면적의 전부를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 1% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 2% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 5% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 10% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 15% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 20% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 30% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 40% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 50% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 60% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 70% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 80% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 90% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 95% 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 상기 벽의 표면적의 약 99% 이상을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 착색제는 용기(110)가 형성되는 물질 (예를 들어, 유리, 중합체 수지)에 포함된 안료 및/또는 염료이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시 형태 (도시되지 않음)에서, 용기(110)는 벽(115)의 표면 (예를 들어, 내부 표면 또는 외부 표면) 부분(115b)에 결합된 층 (예를 들어, 코팅 또는 필름 층)을 추가로 포함한다. 상기 층은 착색제를 포함할 수 있다. 상기 착색제는 적색 착색제, 청색 착색제, 황색 착색제, 녹색 착색제, 상기 착색제들 중 둘 이상의 혼합물, 또는 상기 착색제들 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다.

용기(110)와 마찬가지로, 착색제를 포함하는 벽(115)의 부분(115b)은, 광 (예를 들어, 발광 반응으로부터의 가시 파장의 광)이 상기 부분(115b)을 통과하여 광 검출기로 향하는 것을 실질적으로 막는 광학 투명성 및 광학 투과성을 갖는다. 바람직한 실시 형태에서, 착색제를 포함하지 않는 유사한 용기에 비해, 착색제를 갖는 부분(115b)을 포함하는 용기는 발광 반응으로부터 방출되는 광의 적어도 약 50% 이상의 투과를 허용한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 착색제를 포함하지 않는 유사한 용기에 비해, 착색제를 갖는 부분(115b)을 포함하는 용기는 발광 반응으로부터 방출되는 광의 적어도 약 75% 이상의 투과를 허용한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 착색제를 포함하지 않는 유사한 용기에 비해, 착색제를 갖는 부분(115b)을 포함하는 용기는 발광 반응으로부터 방출되는 광의 적어도 약 85% 이상의 투과를 허용한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 착색제를 포함하지 않는 유사한 용기에 비해, 착색제를 갖는 부분(115b)을 포함하는 용기는 발광 반응으로부터 방출되는 광의 적어도 약 90% 이상의 투과를 허용한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 착색제를 포함하지 않는 유사한 용기에 비해, 착색제를 갖는 부분(115b)을 포함하는 용기는 발광 반응으로부터 방출되는 광의 적어도 약 95% 이상의 투과를 허용한다.

용기(110)의 개구(120)는 용기(110)의 저장소(130) 내로 물질 (도시되지 않음)을 옮길 수 있게 한다. 상기 물질은 발광 반응을 촉진하는 액체 및/또는 고체 물질을 포함할 수 있다. 발광 반응을 촉진하기에 적합한 물질의 비제한적인 예에는 액체 매질 (예를 들어, 물, 완충용액), 효소 (예를 들어, 루시페라아제, 알칼리-포스파타아제), 효소 기질 (예를 들어, 루시페린; ATP; 2-클로로-5-(4-메톡시스피로[1,2-다이옥세탄-3,2'-(5-클로로트라이사이클로[3.3.1.1^3.7]데칸])-4-일]-1-페닐 포스페이트 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 입수가능한, CDP-STAR 화학발광 알칼리 포스파타아제 시약)), 화학발광 시약 (예를 들어, 루미놀), 및 세포 용해제 (예를 들어, 세제, 트리톤(TRITON) X-100)가 포함된다. 효소 (예를 들어, 알칼리 포스파타아제, 루시페라아제)는 결합 파트너 (예를 들어, 항체 또는 수용체와 같은 단백질)에 결합될 수 있다. 샘플 물질을 또한 개구(120)를 통해 저장소(130) 내로 옮길 수 있다.

샘플 물질에는 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 물질이 포함된다. 샘플 물질은 액체, 고체, 액체 중에 현탁되거나 분산된 고체, 하이드로젤일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 샘플은 농축 (예를 들어, 여과, 침전, 응집, 원심분리, 흡수, 및/또는 흡착에 의한 것), 증폭 (예를 들어, 성장 기반 증폭 및/또는 효소적 증폭), 풍부화 (예를 들어, 선택적 성장 풍부화), 추출 (예를 들어, 세포 용해), 및 정제 (예를 들어, 크로마토그래피 정제, 용매 분배)를 포함하지만 이로 한정되지 않는 하나 이상의 샘플 제조 기술을 거친 미생물 및/또는 분자를 포함할 수 있다.

발광 반응을 위한 촉매를 제공하는 단계는, 달리 가능한 것보다 더 빠른 속도로 또는 상이한 조건 하에서 (예를 들어, 더 낮은 온도에서) 발광 반응이 진행될 수 있게 하는 물질을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 촉매는, 예를 들어, 루시페라아제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라아제) 또는 알칼리 포스파타아제와 같은 효소이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 촉매를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 촉매는 재수화가능한 건조 형태로 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 재수화가능한 건조 촉매는 용기(110)의 내부 저장소(115) 내에 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 촉매를 별도의 용기(도시되지 않음)에 제공하고 내부 저장소(115)로 옮길 수 있다. 촉매는 수성 액체 (예를 들어, 물, 완충제)로 재수화하고/하거나 희석할 수 있다.

본 방법은 용기 내에서 반응 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 반응 혼합물은, 형성되었을 때, 발광 반응을 위한 촉매 (예를 들어, 루시페라아제) 및 샘플을 포함한다. 상기 샘플은 발광 반응을 위한 하나 이상의 반응물을 직접적으로 또는 간접적으로 제공한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 샘플은 생체 발광 반응을 위한 반응물로서 ATP를 제공하는 세포 또는 세포 용해물을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 반응 혼합물을 형성하는 단계는 세포 용해제 (예를 들어, 세제)를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 샘플은 핵산 (DNA 또는 RNA)을 포함할 수 있는데, 이는 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트 및 핵산 폴리머라아제의 존재 하에 중합 반응을 촉진하여 DNA 또는 RNA를 형성할 수 있다. 중합 반응은 또한 피로포스페이트 (P₂O₇ ^4-)의 생성을 야기하는데, 이는 아데노신 모노포스페이트 및 ATP 설퍼릴라아제의 존재 하에 ATP를 생성할 수 있으며, ATP는 간델맨 등의 문헌에 기재된 바와 같은 생체 발광 반응을 위한 반응물로서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 반응 혼합물을 형성하는 단계는 핵산 증폭을 촉진하도록 반응 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 반응 혼합물을 형성하는 단계는, 피로포스페이트를 사용하여 발광 반응을 위한 반응물 (예를 들어, ATP)을 생성하는, 핵산 전구체 (예를 들어, dNTP), 핵산 폴리머라아제, 및 효소 (예를 들어, ATP 설퍼릴라아제)를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 것을 포함한다.

전형적으로, 반응 혼합물을 형성하는 단계는 (예를 들어, 수성 유체, 예를 들어, 수성 완충제 중에서) 반응물을 유체 접촉하게 배치하는 것을 포함한다. 예를 들어, 수성 유체를 용기(110)에 부가하기 전 또는 후에 시약들을 용기에 부가함으로써, 반응 혼합물을 용기(110) 내에서 형성할 수 있다. 대안적으로, 반응 혼합물을 별도의 용기 (도시되지 않음)에서 형성하고, 반응 혼합물의 일부 또는 전부를 용기(110)로 옮길 수 있다.

본 방법은 용기로부터 또는 용기 안의 내용물로부터 방출되는 광의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용기로부터 방출되는 광 또는 용기 안의 내용물로부터 방출되는 광의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는, 광을 검출하기 위한 검출기를 포함하는 발광측정기를 사용하여 광을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 본 방법은, 상기 용기로부터 방출되는 광 또는 용기 안의 내용물로부터 방출되는 광이 상기 검출기에 의해 검출될 수 있도록, 상기 발광측정기 내에 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발광측정기 내에 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 단계는 착색제를 포함하는 벽의 부분(115b)의 적어도 일부가 상기 반응 혼합물과 상기 검출기 사이에 위치되도록 상기 용기를 위치시키는 것을 추가로 포함한다.

도 2a 및 도 2b는 분석물을 검출하는 시스템(200)의 일 실시 형태를 나타낸다. 도 2a는 시스템(200)의 구성요소들의 부분적으로 분해된 길이 방향의 개략 단면도를 나타낸다. 시스템(200)은 간델맨 등의 문헌에 기재된 다이오드 기반 장치와 유사한 용기(210) 및 판독기(240)를 포함한다. 용기(210)는 벽(215) 및 뚜껑(218)을 포함한다. 벽(215)은 착색제를 포함하는 부분 (예를 들어, 전체 벽)을 포함한다. 반응 혼합물(230)이 용기(210) 내에 배치된다.

판독기(240)는 용기를 수용하도록 구성된 공동(243)을 포함하는 수납기(receiver; 242)를 포함한다. 수납기(242)는, 예를 들어, 플라스틱 또는 금속을 포함하는 다양한 물질로부터 제작될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 수납기(242)는 열전도성 물질 (예를 들어, 알루미늄)로부터 제작되며, 이는 열원 (예를 들어, 저항기, 도시되지 않음) 및 온도 제어기 (도시되지 않음)에 작동가능하게 결합된다. 예시된 실시 형태에서, 공동은, 뚜껑(218)을 제외한 용기(215)가 수납기(242)의 공동(243)에 작동가능하게 결합될 수 있도록 (즉, 그 안에 완전히 그리고 단단히 설치될 수 있도록) 하는 형상 및 치수를 갖는다.

선택적으로, 판독기(240)는 광-수집 부재(244)를 포함할 수 있다. 광-수집 부재(244)는 원뿔대 형상을 가지며, 검출기(248)로 향하지 않는 방향에서는 용기로부터 방출되는 광을 수집하고, 검출기(248)로 향하는 방향 (화살표 "A")에서는 광을 굴절시키고/시키거나 반사시키도록 의도된다. 일부 실시 형태에서, 광-수집 부재(244)는 거울-유사 표면 (예를 들어, 수납기(242)를 제작하는 데 사용되는 물질의 형상화된, 코팅된 및/또는 폴리싱된 표면)일 수 있다.

검출기(248)는 광자 신호 (즉, 광)를 전기 신호로 변환할 수 있는 임의의 검출기일 수 있다. 적합한 검출기(248)의 예에는, 예를 들어, 광전자 증배관 및 광다이오드 (예를 들어, 애벌런치(avalanche) 광다이오드)가 포함된다. 판독기(240)는 하우징(260), 및 선택적으로, 커버(도시되지 않음)를 추가로 포함하여, 판독기(240)에 의해 샘플이 분석되고 있을 때, 검출기(248)에서 외부의 광을 실질적으로 차단한다.

도 2b는 용기(210)가 판독기(240)에 작동가능하게 위치되어 있는 도 2a의 시스템(200)의 단면 길이 방향 개략 단면도를 나타낸다. 예시된 실시 형태에서는, 전체 벽이 착색제를 포함하기 때문에, 용기(210)를 작동가능하게 위치시키는 단계는, 벽(215)의 착색 부분의 적어도 일부가 반응 혼합물(230)과 검출기(248) 사이에 위치되도록 용기(210)를 위치시키는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 판독기(240)는 발광측정기 내에 포함될 수 있다. 발광측정기는, 예를 들어, 미국 워싱턴주 벨레뷰 소재의 바이오컨트롤 시스템즈, 인크.(BioControl Systems, Inc.)로부터 입수가능한 라이트닝(LIGHTNING) MVP 시스템 발광측정기와 같은 핸드-핼드 발광측정기일 수 있다. 대안적으로, 발광측정기는, 예를 들어, 20/20ⁿ 단일 튜브 발광측정기, 또는 간델맨 등의 문헌에 기재된 것들과 유사한 발광측정기와 같은 벤치-탑(bench-top) 발광측정기일 수 있다.

본 발명에 따르면, 용기로부터 방출되는 광의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 반응 혼합물을 형성하는 단계 후에 수행된다. 반응 혼합물은, 샘플 내의 분석물이, 발광 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 가능하게 하는 성분을 제공하도록 구성된다. 따라서, 반응 혼합물이 형성된 후에, 용기로부터, 또는 용기 안의 내용물 (예를 들어, 반응 혼합물)로부터 방출되는 광의 존재는 시험되는 샘플의 부분에 분석물이 존재함을 나타낸다. 역으로, 반응 혼합물이 형성된 후에, 용기로부터, 또는 용기 안의 내용물로부터 방출되는 광의 부재는 시험되는 샘플의 부분에 분석물이 부재함을 나타낸다.

일부 실시 형태에서, 용기로부터 또는 용기 안의 내용물로부터 방출되는 광의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 용기로부터 방출되는 광의 양을 정량하는 것을 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용기로부터 방출되는 광을 검출하고/하거나 정량한다는 것은 용기의 내용물 (예를 들어, 반응 혼합물)에 의해 방출되고 용기의 착색 부분을 통과하는 적어도 일부 광을 검출하고/하거나 정량한다는 것을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 검출되고/되거나 정량되는 광의 대부분은 용기의 내용물에 의해 방출되고 용기의 착색 부분을 통과한 것이다.

본 방법의 임의의 실시 형태에 있어서, 상기 방법은 분석물-특이적 시약을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에 있어서, 분석물-특이적 시약은 분석물-특이적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 핵산 증폭을 촉진하는 데 사용될 수 있는 프라이머)를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 분석물-특이적 시약을 (예를 들어, 액체 매질 중에서, 또는 탈수된 시약으로서) 용기에 제공할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 용기의 착색 부분의 색상은 용기에 제공되는 분석물-특이적 시약의 실체와 연관될 수 있다. 임의의 색상을 사용하여 분석물-특이적 시약을 갖는 용기를 지정할 수 있다. 예를 들어, 청색 용기는 에셰리키아 콜라이를 검출하기 위한 분석물-특이적 시약을 포함할 수 있고/있거나, 황색 튜브는 스타필로코커스 아우레우스를 검출하기 위한 분석물-특이적 시약을 포함할 수 있고/있거나, 녹색 튜브는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 검출하기 위한 분석물-특이적 시약을 포함할 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 분석물을 검출하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 용기를 포함할 수 있다. 상기 용기는 개구와 내부 저장소를 형성하는 하나 이상의 벽을 포함한다. 상기 벽의 적어도 부분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 착색제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 부분은 가시적으로 착색된다. 상기 용기는 추가로 발광측정기에 사용되도록 구성된다. 상기 키트는, 상기에 기재된 바와 같은, 발광 반응을 위한 촉매를 추가로 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 상기 촉매는, 예를 들어, 루시페라아제를 포함할 수 있다.

임의의 실시 형태에서, 상기 키트는 분석물-특이적 시약을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 분석물-특이적 시약은, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 포함할 수 있다.

임의의 실시 형태에서, 상기 키트는 세포로부터 핵산을 추출 및/또는 정제하는 데 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 시약의 비제한적인 예에는 세포 용해 시약 (예를 들어, 세제, 효소, 리소스타핀)이 포함된다. 임의의 실시 형태에서, 상기 키트는 핵산의 증폭을 촉진하는 데 사용되는 시약 (예를 들어, RNA 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제, 리보뉴클레오티드 트라이포스페이트의 혼합물, 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트의 혼합물)을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 키트는 ATP의 합성을 촉진하는 시약 (예를 들어, ATP 설퍼릴라아제, 아데노신 모노포스페이트)을 추가로 포함할 수 있다.

실시 형태

실시 형태 A는,

샘플; 발광 반응을 위한 촉매; 및 하나 이상의 벽을 포함하는 용기를 제공하는 단계로서,

상기 용기는 발광측정기에 사용되도록 구성되며;

상기 벽의 적어도 일부분은 착색제를 포함하는, 상기 제공 단계;

상기 용기 내에서 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 반응 혼합물은 상기 샘플 및 상기 촉매를 포함하는, 상기 형성 단계;

상기 용기 내의 상기 반응 혼합물로부터 방출되는 광의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 B는, 실시 형태 A에 있어서, 상기 용기가 검출기를 포함하는 발광측정기에 사용되도록 구성되는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 C는, 실시 형태 A 또는 실시 형태 B에 있어서, 반응 혼합물을 형성하는 단계가 발광 반응을 촉진하도록 반응 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 D는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 일부분이 가시적으로 착색되는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 E는, 실시 형태 B 내지 실시 형태 D 중 어느 하나에 있어서, 상기 용기로부터의 광을 검출하는 단계가 상기 발광측정기 내에 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 F는, 실시 형태 E에 있어서, 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 것이 상기 반응 혼합물과 검출기 사이에 상기 일부분의 적어도 일부가 위치되도록 상기 용기를 위치시키는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 G는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 광을 검출하는 단계가 광의 양을 정량하는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 H는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 촉매를 제공하는 단계가 재수화가능한 건조 촉매를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 I는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 촉매를 제공하는 단계가 루시페라아제를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 J는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 검출 시약 및 상기 용기를 제공하는 단계가 상기 촉매가 내부에 배치되어 있는 상기 용기를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 K는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 분석물-특이적 시약을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 L은, 실시 형태 K에 있어서, 상기 일부분의 색상이 상기 용기 내에 배치된 상기 분석물-특이적 시약의 실체와 연관되는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 M은, 실시 형태 K 또는 실시 형태 L에 있어서, 분석물-특이적 시약을 제공하는 단계가 분석물-특이적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 N은, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 반응 혼합물을 형성하는 단계가 핵산 증폭을 촉진하도록 반응 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 O는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 분석물-특이적 시약이 DNA, RNA, 또는 효소-표지된 단백질을 함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 P는, 전술한 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 착색제가 적색 착색제, 황색 착색제, 청색 착색제, 녹색 착색제, 상기 착색제들 중 둘 이상의 혼합물, 또는 상기 착색제들 중 둘 이상의 조합을 포함하는, 분석물 검출 방법이다.

실시 형태 Q는,

발광 반응을 위한 촉매; 및

하나 이상의 벽을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서,

상기 벽의 적어도 일부분은 착색제를 포함하고,

상기 용기는 발광측정기에 사용되도록 구성되는, 키트이다

실시 형태 R은, 실시 형태 Q에 있어서, 상기 일부분이 가시적으로 착색되는, 키트이다.

실시 형태 S는, 실시 형태 Q 또는 실시 형태 R에 있어서, 분석물-특이적 시약을 추가로 포함하는, 키트이다.

실시 형태 T는, 실시 형태 S에 있어서, 상기 시약이 상기 용기 내에 배치된, 키트이다.

실시 형태 U는, 실시 형태 S 또는 실시 형태 T에 있어서, 상기 분석물-특이적 시약이 분석물-특이적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키트이다.

실시 형태 V는, 실시 형태 S 내지 실시 형태 U 중 어느 하나에 있어서, 상기 일부분의 색상이 상기 분석물-특이적 시약의 실체와 연관되는, 키트이다.

실시 형태 W는, 실시 형태 S 내지 실시 형태 V 중 어느 하나에 있어서, 상기 촉매가 루시페라아제를 포함하는, 키트이다.

실시 형태 X는, 실시 형태 S 내지 실시 형태 W 중 어느 하나에 있어서, 세포 용해제, RNA 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제, 또는 ATP 설퍼릴라아제를 추가로 포함하는, 키트이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 예, 물질, 양, 및 절차는 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 본 발명의 범주 및 사상에 따라 넓게 해석되어야 한다는 것을 이해하여야 한다.

실시예

물질

미생물 발광 시스템(Microbial Luminescence System) LL1 시약 및 미생물 발광 시스템 LL1 완충제 (둘 모두 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 쓰리엠 헬스 케어(3M Health Care)로부터 입수가능한, MLS L/L1 리플레이스먼트 키트(Replacement Kit), 카탈로그 #3003B로부터 입수함)

미생물 발광 시스템 (ATP) 양성 대조군 (카탈로그 #3004; 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 쓰리엠 헬스 케어)

분자 등급 물 (Molecular Grade Water); 카탈로그 번호 W4502; 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.)

0.2 mL PCR 튜브 (#34267.8S 투명, #34267.8B 청색, #34267.8G 녹색, #34267.8Y 황색, #34267.8L 연보라색, 변형 청색*, 변형 연보라색*); 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 바이오틱스(Biotix). 파트 번호는 바이오틱스로부터의 스톡 PCR 튜브를 지칭한다. 그러나, 실시예에 사용된 변형 청색 및 변형 연보라색 튜브는 특별 주문하였으며, (스톡 튜브와 비교하여) 스톡 PCR 튜브를 제조하는 데 보통 사용되는 착색제의 양의 1/2을 사용해 바이오틱스에서 제조하였음에 유의하여야 한다.

하이지나 스냅샷(Hygiena Snapshot) 1515 유니버설(Universal) ATP 표면 시험; 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재의 하이지나(Hygiena)

바이오컨트롤 라이트닝 MVP 발광측정기; 미국 워싱턴주 벨레뷰 소재의 바이오컨트롤 시스템즈.

비교예 1. 투명 마이크로튜브를 사용한 생체 발광의 검출

시약: 제조업자의 사용 설명서에 따라, LL1 완충제를 사용해 미생물 발광 시스템 LL1 시약을 재구성하고 휘저어 혼합하였다. 1 mL의 분자 등급 물을 사용하여 ATP 양성 대조군 바이알을 재구성하였다.

하이브리드 장치의 제작: 면도기 날을 사용하여 스냅샷 장치 튜브의 바닥으로부터 1 ㎝ 조각을 잘라내었다. 절단된 부분이 튜브의 종축에 거의 수직하게 되도록 보장하기 위해 주의를 기울였다. (면봉이 부착되어 있는) 뚜껑을 장치로부터 제거하고 약 5 ㎝의 면봉 자루 (섬유질 봉오리를 포함)를 분리하였다. (절단된) 튜브를 진탕하여 튜브의 벽에 느슨하게 붙어있던 임의의 수분을 배출시켰다. 투명 0.2 mL PCR 튜브를 8-튜브 스트립으로부터 절단하고, PCR 튜브의 개방 단부를 스냅샷 튜브의 바닥의 절단 개구 내로 삽입하였다. 약 1 ㎝의 PCR 튜브가 스냅샷 튜브의 바닥 밖으로 연장하도록, PCR 튜브를 스냅샷 튜브 내로 충분히 깊게 삽입하였다. PCR 튜브의 외경과 스냅샷 튜브의 내경은 유사한 치수를 가져서, PCR 튜브가 제자리에 단단히 고정되어 하이브리드 장치에서 액체-저항성 시일(liquid-resistant seal)을 형성하였다.

100 μL의 LL1 시약을 하이브리드 장치의 바닥에 있는 투명 PCR 튜브 내로 피펫팅하고, 하이브리드 장치를 바이오컨트롤 라이트닝 MVP 발광측정기 내에 삽입하고, 제조업자의 사용 설명서에 따라 RLU를 판독함으로써, 블랭크 샘플을 분석하였다. 10 μL의 ATP 용액을 하이브리드 장치 내로 피펫팅한 후, 100 μL의 LL1 시약을 피펫팅하여 시험 샘플을 분석하였다. 마이크로피펫을 사용하여 용액을 혼합하고 하이브리드 장치를 바이오컨트롤 라이트닝 MVP 발광측정기 내에 삽입하여, 제조업자의 사용 설명서에 따라 RLU를 판독하였다. 5개의 복제된 장치들을, 각각의 블랭크 및 시험 용액을 사용하여 시험하였다. 각각의 반응 (즉, 블랭크 반응 및 시험 반응)을 위한 액체의 전부를 하이브리드 장치의 PCR 튜브 부분에 유지하면서, 하이브리드 장치를 발광측정기 내에 배치하여 튜브로부터 방출되는 광을 검출함에 유의하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 추가 대조군으로서, 비어있는 하이브리드 장치 (LL1 시약이 없으며 ATP 용액이 없음)를 발광측정기 내에 배치하고 RLU를 판독하였다.

실시예 1 내지 실시예 4. 착색 마이크로튜브를 사용한 생체 발광의 검출

청색 PCR 튜브를 사용하여 실시예 1의 하이브리드 장치를 제작하고, 녹색 PCR 튜브를 사용하여 실시예 2의 하이브리드 장치를 제작하고, 황색 PCR 튜브를 사용하여 실시예 3의 하이브리드 장치를 제작하고, 연보라색 PCR 튜브를 사용하여 실시예 4의 하이브리드 장치를 제작한 점을 제외하고는, 비교예 1에 기재된 바와 같이 시약 및 하이브리드 장치를 제조하였다. 비교예 1에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 "블랭크" (ATP 없음) 및 "시험" RLU를 판독하였다. 그 결과가 표 1에 요약되어 있다.

[표 1]

투명 및 착색 반응 튜브를 사용한 생체 발광 반응의 검출. 모든 결과가 RLU (Relative Light unit)로서 보고되어 있다.

상기 결과는, 튜브의 색상이 인간 작업자에 의해 용이하게 관찰되고 확인될 수 있음에도 불구하고, 착색 튜브를 사용하여 검출한 광의 양이 투명 튜브를 사용하여 검출한 광의 약 89.9% (연보라색 튜브) 내지 약 99.9% (황색 튜브)의 범위임을 나타낸다.

실시예 5. 착색 마이크로튜브에 의한 광 투과율.

분광 광도계 (영국 캠브리지 소재의 엘케이비 바이오크롬(LKB Biochrom), 모델 번호 80-2097-62)를 사용하여 투명 및 착색 PCR 튜브에 의한 가시광의 투과율을 측정하였다. 비어있는 큐벳을 사용하여 기준 스캔을 행하였다. 상기에 논의된 각각의 투명 및 착색 바이오텍스 PCR 튜브를 담은 개별 큐벳을 사용하여 실험 스캔을 행하였다. 도 3은 투명 PCR 튜브 (선 "A") 및 변형 연보라색 PCR 튜브 (선 "B")를 통과한 500 내지 700 ㎚ 광의 투과율을 비교하여 나타낸다. 표 2는, 각각의 다양한 착색 PCR 튜브를 통과한 500 ㎚ 내지 700 ㎚ 광의 투과율을 투명 PCR 튜브를 통과한 광의 투과율과 비교한 실험의 결과를 나타낸다. 투명 PCR 마이크로튜브를 담은 큐벳을 사용하여 기준 스캔을 행한 점을 제외하고는 상기한 바와 같이 실험을 수행하였다. 모든 튜브가 투명 튜브에 의해 투과되는 광의 80% 이상을 투과하였지만, 녹색, 황색, 변형 청색, 및 변형 연보라색 튜브는 투명 튜브에 의해 투과되는 광의 90% 이상을 투과하였다.

[표 2]

착색 반응 튜브를 통해 투과하는 광의 검출. 모든 결과가 RLU로서 보고되어 있다. 광 투과율은 각각의 스톡 PCR 착색 튜브의 3가지 상이한 로트로부터의 튜브에서 측정하였다. 광 투과율은 또한 각각의 변형 청색 및 변형 라벤더 튜브의 하나의 로트로부터의 튜브에서 측정하였다.

모든 특허, 특허 출원, 및 공보, 그리고 전자적으로 입수가능한 본 명세서에서 언급된 자료의 완전한 개시가 참고로 포함되었다. 본 출원의 개시 내용과 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문서의 개시 내용(들) 사이에 임의의 모순이 존재하는 경우, 본 출원의 개시 내용이 좌우할 것이다. 상기 상세한 설명 및 예들은 단지 명확한 이해를 위해 주어졌다. 이로부터 어떠한 불필요한 제한 사항도 이해되지 않을 것이다. 당업자에게 자명한 변화가 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주 내에 포함될 것이므로, 본 발명은 도시되고 설명된 정확한 상세 사항으로 제한되지 않는다.

모든 표제는 독자의 편리함을 위한 것이며, 그렇게 특정되지 않는 한 표제 이후의 본문의 의미를 한정하기 위하여 사용되어서는 안된다.

본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들 및 다른 실시 형태가 이하의 특허청구범위의 범주 내에 속한다.

Claims

분석물(analyte)을 검출하는 방법으로서,
샘플; 발광 반응(luminescent reaction)을 위한 촉매; 및 하나 이상의 벽을 포함하는 용기를 제공하는 단계로서,
상기 용기는 발광측정기(luminometer)에 사용되도록 구성되며;
상기 벽의 적어도 일부분은 착색제를 포함하는, 상기 제공 단계;
상기 용기 내에서 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 반응 혼합물은 상기 샘플 및 상기 촉매를 포함하는, 상기 형성 단계; 및
상기 용기 내의 상기 반응 혼합물로부터 방출되는 광의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 용기는 검출기를 포함하는 발광측정기에 사용되도록 구성되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 일부분은 가시적으로 착색되는, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 용기로부터의 광을 검출하는 단계는 상기 발광측정기 내에 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 용기를 작동가능하게 위치시키는 것은 상기 반응 혼합물과 검출기 사이에 상기 일부분의 적어도 일부가 위치되도록 상기 용기를 위치시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매를 제공하는 단계는 루시페라아제를 제공하는 것을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약 및 상기 용기를 제공하는 단계는 상기 촉매가 내부에 배치되어 있는 상기 용기를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물-특이적 시약(analyte-specific reagent)을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 일부분의 색상은 상기 용기 내에 배치된 상기 분석물-특이적 시약의 실체(identity)와 연관되는, 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 분석물-특이적 시약을 제공하는 단계는 분석물-특이적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물을 형성하는 단계는 핵산 증폭을 촉진하도록 반응 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물-특이적 시약은 DNA, RNA, 또는 효소-표지된 단백질을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착색제는 적색 착색제, 황색 착색제, 청색 착색제, 녹색 착색제, 상기 착색제들 중 둘 이상의 혼합물, 또는 상기 착색제들 중 둘 이상의 조합을 포함하는, 방법.
발광 반응을 위한 촉매; 및
하나 이상의 벽을 포함하는 용기;를 포함하는 키트로서,
상기 벽의 적어도 일부분은 착색제를 포함하고,
상기 용기는 발광측정기에 사용되도록 구성되는, 키트.
제14항에 있어서, 상기 일부분은 가시적으로 착색되는, 키트.
제14항 또는 제15항에 있어서, 분석물-특이적 시약을 추가로 포함하는, 키트.
제16항에 있어서, 상기 분석물-특이적 시약은 분석물-특이적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키트.
제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 일부분의 색상은 상기 분석물-특이적 시약의 실체와 연관되는, 키트.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매는 루시페라아제를 포함하는, 키트.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 용해제, RNA 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제, 또는 ATP 설퍼릴라아제를 추가로 포함하는, 키트.