KR20140020923A

KR20140020923A - 인간 il33r에 대한 항체 및 이의 용도

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Publication number: KR20140020923A
Application number: KR1020137024495A
Authority: KR
Inventors: 옌스 피셔; 게오르그 페르티그; 가이 조지스; 클라우스 칼루자; 팔레리아 리프케; 외르그 묄레켄; 손야 오프너; 아찰 파샤인; 스테판 시베르
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2014-02-19
Also published as: CA2824500A1; CA2824500C; MX341958B; EP2678358A1; US9309319B2; US8785153B2; US20140302015A1; AR085383A1; RU2013140350A; JP2014508520A; CN103562224B; WO2012113813A1; US20120213774A1; BR112013021473A2; CN103562224A; RU2597288C2; ES2549637T3; EP2678358B1; KR102003075B1; TW201238976A

Abstract

본 발명은 염증 질환의 치료에 유리한 성질을 갖는, 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체, 또는 이의 키메라, 인간화 또는 T 세포 에피토프 결핍 항체 변이체에 관한 것이다.

Description

인간 IL33R에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AGAINST HUMAN IL33R AND USES THEREOF}

본 발명은 인간 IL33R에 대한 항체(IL33R 항체), 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

인간 IL33은 IL-1 수용체-관련 IL33 수용체(수용체: IL1RL1, T1/ST2의 동의어)를 통해 신호를 전달하고 T 헬퍼 타입 2-결합 사이토카인을 유도하는 IL-1 부류의 인터루킨-1-유사 사이토카인이다. IL33(스위스-프롯(Swiss-Prot) 등록 번호 O95760)의 동의어들은 인터루킨-1 부류 구성원 11(IL-1F11) 및 고 내피 세정맥으로부터의 핵 인자(NF-HEV)이다. NF-HEV는 문헌 [Baekkevold, E.S., et al., Am. J. Pathol. 163 (2003) 69-79]에 기술되어 있다. IL33은 문헌 [Schmitz, J., et al., Immunity 23 (2005) 479-490]에 기술되어 있다.

인간 IL33 수용체, IL33R(ILRL1에 대한 동의어; 스위스 프롯 등록 번호 Q01638, 다른 명칭은 ST2, T1/ST2, Fit-1 및 DER4이다)은 섬유아세포에서의 성장 자극에 의해 유도되며, 또한 Th2 세포에서 항원 자극에 의해서도 유도될 수 있다. 본 발명에 따르면, IL33R 및 ST2는 인간 IL33R을 의미한다. 문헌 [Tominaga, S., et al., FEBS Lett. 258 (1989) 301-304; Biochim. Biophys. Acta. 1171 (1992) 215-218; and Yanagisawa, K., FEBS Lett. 318 (1993) 83-87]에서는 인간 ST2(분비된 형태), ST2L(막횡단 수용체 형태) 및 ST2V(변이체 Glu-78)를 동정하였다. 인간 ST2는 오직 성장-자극된 BALB/c-3T3 세포에서만 발현되며, 성장 인자에 의해 유도된 1차 반응 유전자 부류의 일원이다. ST2는 인간 인터루킨 1 수용체 타입 1 및 2 둘 다의 세포외 부분과 서열에서 유사한 단백질을 암호화한다. IL33R 유전자제거(knockout) 마우스를 사용한 연구는 IL33R이 TH2-반응의 초기 결과에 수반됨을 시사한다(문헌 [Kropf, P., et al., Infect. Immunity 70(2002) 5512-5520; Hoshino, K., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 1541-1548; Senn, et al., Eur. J. Immunol. 30 (2000) 1929-1938; Townsend, M.J., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 1069-1076]). ST2는 TH2의 면역의 마커, 활성인자 및 조절인자인 것으로 추정된다(문헌 [Kumar, R.K., et al., Clin. Exp. Allergy 32 (2002) 1394-1396]).

항-IL33R 항체 및 면역 기능에서 이의 역할은 많은 출판물에서 기술되었다. 항-인간 ST2 항체 Mab523 및 다클론성 항체 AF523은 알앤디 시스템즈(R&D Systems, http://www.rndsystems.com)에서 상업적으로 시판한다. 항-인간 ST2 항체 HB12는 안티바디즈-온라인 게엠베하(독일) 및 MBL 인터내셔날 코포레이션(MBL Int. Corp., www.mblintl.com)에서 상업적으로 시판한다. 항-IL33R 항체는 감소된 TH2-타입 면역 반응을 야기하였다. 상기 항체는 호산구 침윤, IL-5 생성 및 IgE 생성을 억제하였다. 천식에 대한 동물 모델에서 ST2의 역할에 대한 평가는 CD4+ T 세포 상에서의 뮤린 IL33R의 증가된 발현을 야기하여, 알레르기 또는 천식 반응에서 IL33R에 대한 역할을 시사하였다(문헌 [Lohning, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 6930-6935; and Xu, D., et al., J. Exp. Med. 187 (1998) 787-794; Coyle, A.J., et al., J. Exp. Med. 190 (1999) 895-902]). 문헌 [Meisel, C., et al., J. Immunol. 166 (2001) 3143-3150]에서는 CD4⁺ T 세포 상에서의 T1/ST2 발현의 조절 및 기능, 및 T1/ST2 가교결합에 의한 타입 2 사이토카인 생성의 유도를 연구하였다. 뢰닝(Lohning, M.) 등은 래트에서 항-마우스 ST2 항체를 생성하였다. 알레르겐 자극 1 시간전에 20 ㎍(약 0.8 mg/kg)의 상기 항체로 예비처리하여 마우스 기도에서 호산구의 수가 70% 감소되었다. 문헌 [Kumar, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 235 (1997) 474-478; and J. Biol. Chem. 270 (1995) 27905-27913]은 초파리(Drosophila)에서 발현된 정제된 가용성 ST2 수용체에 대해 생성된 토끼의 다클론성 항체를 사용한 면역침전법에 의해 검출된 ST2 단백질의 발현을 기술하고 있다. BALB/c 마우스를 사용한 연구는 항-IL33 항체로 처리하여 더 높은 TH1-타입 반응을 유도하였음을 나타내었다. 환자의 혈청내 인간 ST2 단백질을 정량화하기 위한 ELISA 시스템이 문헌 [Kuroiwa, K., et al., Hybridoma 19 (2000) 151-159]에 기술되었다. 항-IL33R 항체도 또한 RSV에 의한 감염으로 인한 영향을 감소시킨다(문헌 [Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792]). 항-IL33R 항체는 또한 천식 동물 모델에서도 연구되었다(문헌 [Leung, B.P., et al., J. Immunol. 173 (2004) 145-150; Walzl, et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 785-792]). 문헌 [Smithgall, M.D., et al., Int. Immunol. 20 (2008) 1019-1030]에서는 항-huST2 항체의 존재하에 NK 세포내 인터페론 γ의 수준을 조사하였다. IL33R 및/또는 IL33R에 대한 항체는 WO 2005/079844 호, US 7,087,396 호, WO 2001/021641 호, WO 2002/038794 호, WO 2003/094856 호에 언급되어 있다. 문헌 [Oboki, K., et al., Allergology Int. 59 (2010) 143-160]에서는 숙주 방어 및 질환에서 IL-33 및 IL-33 수용체의 역할, 및 마우스 기도 염증에 대한 항-ST2 항체, 가용성 ST2 및 항-IL-33 항체의 영향을 검토하였다.

본 발명은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 7을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 상기 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 7을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 8을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, IL33R에 결합하고 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 항체는, C_H1과 C_H2 사이의 아미노산 위치 216 내지 240, 바람직하게는 아미노산 위치 220 내지 240에서의 힌지 영역에서, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간(inter-domain) 영역에서 변형된 인간 IgG1 이소타입(isotype)을 갖는다. 바람직하게, 상기 항체는 돌연변이 L234A(아미노산 위치 234에서 류신 대신 알라닌) 및 L235A를 포함한다. 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 바람직한 중쇄 불변 영역을 서열번호 9에 나타내었다. 바람직하게, IL33R에 결합하고 상기 언급한 아미노산 서열 및 아미노산 서열 단편을 특징으로 하는 항체는, C_H1과 C_H2 사이의 아미노산 위치 216 내지 240, 바람직하게는 아미노산 위치 220 내지 240에서의 힌지 영역에서, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG4 이소타입을 갖는다. 바람직하게, 상기 항체는 돌연변이 L235E(아미노산 위치 235에서 류신 대신 글루탐산) 및 S228P(아미노산 위치 228에서 세린 대신 프롤린)를 포함한다.

항체 ra170(Mab ra170)은 본 발명의 바람직한 태양이다. 본 발명의 다른 태양은 항체 ra170의 키메라, 인간화, 또는 T 세포 에피토프 결핍 항체 변이체이다.

항체 ra170의 바람직한 인간화 항체 변이체는, 중쇄 가변 도메인이 서열번호 24의 CDR3 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하거나, 중쇄 가변 도메인이 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 27의 CDR2 영역 및 서열번호 26의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 인간화 항체는 중쇄 가변 도메인이 서열번호 21 또는 25를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 인간화 항체는 경쇄 가변 도메인이 서열번호 30을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 항체는 10^-10 M 이하의 친화도하에 IL33R에 특이적으로 결합한다.

본 발명은 또한 IL33R에 결합하고, 단클론성 항체 ra170이 결합하는 동일 IL33R 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 적어도 10^-8 내지 10^-12 M^-1의 친화도하에 IL33R에 결합하며, 바람직하게는 C_H1과 C_H2 사이의 아미노산 위치 216 내지 240, 바람직하게는 아미노산 위치 220 내지 240에서의 힌지 영역에서, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG1 이소타입을 갖는다. 바람직하게, 상기 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 이소타입, 또는 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 인간 IgG4 이소타입을 갖는다.

바람직하게, 상기 항체는 인간화 또는 인간 항체이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 항체는, 인간 IL33/IL33R에 대해 0.32 nM, 및 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus) IL33/IL33R에 대해 0.13 nM의 IC₅₀ 값 하에 IL33R에 대한 IL33의 결합을 억제한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 호산구 분석, 비만 세포 분석, Th2 분석, 호염기구 분석(IL-5)에서 5 nM 이하의 IC₅₀ 값을 나타낸다. 상기 항체는 류마티스성 관절염, 천식 또는 궤양성 대장염의 치료에 특히 유용하다.

본 발명의 다른 태양은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 바람직하게, 상기 약학 조성물은, 단클론성 항체 ra170이 결합하는 동일 IL33R 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 약학 조성물의 항체는 적어도 10^-8 내지 10^-12 M^-1의 친화도하에 IL33R에 결합하며, 바람직하게는 C_H1과 C_H2 사이의 아미노산 위치 216 내지 240, 바람직하게는 아미노산 위치 220 내지 240에서의 힌지 영역에서, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG1 이소타입을 갖는다. 바람직하게, 상기 항체는 돌연변이 L234A(아미노산 위치 234에서 류신 대신 알라닌) 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 이소타입, 또는 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 인간 IgG4 이소타입을 갖는다.

본 발명의 다른 태양은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 바람직하게, 상기 약학 조성물은, 단클론성 항체 ra170이 결합하는 동일 IL33R 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 약학 조성물의 항체는 적어도 10^-8 내지 10^-12 M^-1의 친화도하에 IL33R에 결합하며, 바람직하게는 C_H1과 C_H2 사이의 아미노산 위치 216 내지 240, 바람직하게는 아미노산 위치 220 내지 240에서의 힌지 영역에서, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG1 이소타입을 갖는다. 바람직하게, 상기 항체는 돌연변이 L234A(아미노산 위치 234에서 류신 대신 알라닌) 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 이소타입, 또는 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 인간 IgG4 이소타입을 갖는다.

본 발명의 다른 태양은 궤양성 대장염 또는 천식의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 또 다른 태양은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다. 바람직하게, 상기 약학 조성물은, 단클론성 항체 ra170이 결합하는 동일 IL33R 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 약학 조성물의 항체는 적어도 10^-8 내지 10^-12 M^-1의 친화도하에 IL33R에 결합하며, 바람직하게는 C_H1과 C_H2 사이의 아미노산 위치 216 내지 240, 바람직하게는 아미노산 위치 220 내지 240에서의 힌지 영역에서, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG1 이소타입을 갖는다. 바람직하게, 상기 항체는 돌연변이 L234A(아미노산 위치 234에서 류신 대신 알라닌) 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 이소타입, 또는 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 인간 IgG4 이소타입을 갖는다.

본 발명의 다른 태양은, 서열번호 1의 중쇄 CDR3 영역 및 바람직하게는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 서열번호 2의 중쇄 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 태양은, 서열번호 4의 경쇄 CDR3 영역 및 바람직하게는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 서열번호 5의 경쇄 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 태양은 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 가변 경쇄 도메인, 및 바람직하게는 중쇄 인간 IgG1 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A 또는 중쇄 인간 IgG4 불변 도메인에 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이다.

본 발명의 다른 태양은, 서열번호 24의 중쇄 CDR3 영역 및 바람직하게는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 서열번호 23의 중쇄 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 태양은, 서열번호 33의 경쇄 CDR3 영역 및 바람직하게는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 서열번호 32의 경쇄 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 태양은, 서열번호 21의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 30의 가변 경쇄 도메인, 및 바람직하게는 중쇄 인간 IgG1 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A 또는 중쇄 인간 IgG4 불변 도메인에 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이다.

본 발명의 다른 태양은, 서열번호 28의 중쇄 CDR3 영역 및 바람직하게는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 서열번호 27의 중쇄 CDR2 영역 및 서열번호 26의 CDR1 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 태양은, 서열번호 33의 경쇄 CDR3 영역 및 바람직하게는 IgG1 중쇄 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 서열번호 2의 경쇄 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 태양은 서열번호 25의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 30의 가변 경쇄 도메인, 및 바람직하게는 중쇄 인간 IgG1 불변 도메인에 돌연변이 L234A 및 L235A 또는 중쇄 인간 IgG4 불변 도메인에 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 불변 쇄가 인간 기원을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 불변 쇄는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); and Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218]에 기술되어 있다. 예를 들면, 유용한 인간 중쇄 불변 영역은 서열번호 9(돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1) 또는 서열번호 29(돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 인간 IgG4)의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 서열번호 12 또는 34의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 항체가 마우스 기원을 가지며 카밧(문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); and Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218])에 따른 마우스 항체의 항체 가변 서열 프레임을 포함하는 것이 더 바람직하다.

본 발명에 따른 항체는 특히 IL33R에 대한 IL33의 결합을 억제하므로 IL-33R/IL-1RacP 신호전달 복합체를 통한 신호전달을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 이소타입 IgG1을 갖는다. 바람직한 γ1 중쇄 불변 영역은 서열번호 10 또는 29, 및 L234A 및 L235A 돌연변이를 갖지 않는 서열번호 11에 나타내었다. 바람직한 κ 경쇄 불변 영역은 서열번호 12 또는 34에 나타내었다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 보체 인자 C1q에 결합하지 않으며 따라서 CDC 작동인자 기능을 방지하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 C_H1과 C_H2 사이의 아미노산 위치 216 내지 240, 바람직하게는 아미노산 위치 220 내지 240에서의 힌지 영역에서, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG1 이소타입을 갖는다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 L234(아미노산 위치 234에 류신), L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및/또는 P329(EU 인덱스에 따른 번호)에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 이소타입을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 상기 항체는 돌연변이 L234A(아미노산 위치 234에 류신 대신 알라닌) 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 이소타입, 또는 돌연변이 L235E 및 S228P를 포함하는 인간 IgG4 이소타입을 갖는다.

본 발명은 또한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 상기 항체의 재조합 생산을 위한 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현시키고 상기 세포 또는 세포 배양 상등액으로부터 상기 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 재조합 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 재조합 방법에 의해 수득할 수 있는 항체를 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 IL33R 표적 치료를 필요로 하는 환자에 대해 이점을 나타낸다. 본 발명에 따른 항체는 상기 면역학적 질환, 특히 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 앓고 있는 환자에 대해 이익을 유발하는 신규하고 독창적인 성질을 갖는다. 본 발명에 따른 항체는 치료된 환자의 포도상구균 및 장내 세균 감염에 대한 민감성을 유발하지 않는다. 본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 갖는 것으로(따라서 상기 치료를 필요로 하는 것으로) 진단된 환자에게 본 발명에 따른 IL33R에 결합하는 항체 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 항체는 바람직하게는 약학 조성물로 투여된다. 본 발명의 다른 태양은 환자에게 본 발명에 따른 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는, 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 앓고 있는 환자의 치료 방법이다. 본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 앓고 있는 환자의 치료 및 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 또한, 선택적으로 약학적 용도의 항체 제형화에 유용한 완충제 및/또는 보조제와 함께, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체 중에 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 태양에서, 상기 약학 조성물은 제품 또는 키트에 포함될 수 있다.

용어 "항체"는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 형태의 항체 구조물을 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 본 발명에 따른 특징적 성질이 유지되는 경우 다른 유전자 조작 항체이다. "항체 단편"은 전장(full length) 항체의 일부, 바람직하게는 이의 가변 도메인, 또는 적어도 이의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예로는 디아바디(diabody), 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 생성된 다중특이성 항체가 포함된다. scFv 항체는, 예를 들면, 문헌 [Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88]에 기술되어 있다. 또한, 항체 단편은 V_H 도메인의 특징을 갖는, 즉, V_L 도메인과 함께 구성될 수 있거나, IL33R에 결합하는 V_L 도메인의 특징을 갖는, 즉, V_H 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위를 구성함으로써 본 발명에 따른 항체의 성질을 제공할 수 있는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제제를 말한다. 용어 "인간화 항체"는 프레임워크(framework) 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR, complementary determining region)이 모 면역글로불린과 비교할 때 상이한 종의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 말한다. 바람직한 태양에서, 마우스 CDR을 인간 항체의 프레임워크 영역 내에 그라프트시켜 "인간화 항체"를 제조한다(예를 들면, 문헌 [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 참조).

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL33R에 결합하는"은 ELISA 결합 분석에서 고정화된 인간 IL33R에 대한 항체의 결합을 의미한다. 결합은 항체가 12 ng/ml보다 큰 항체 농도에서 항체를 함유하지 않는 대조군의 평균 +3 표준 편차 이상보다 큰 신호를 야기하는 경우에 확인된다.

용어 "친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 항체)와 이의 결합 상대(예를 들면, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당해 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 전형적인 태양들을 하기에 기술한다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 군들로 이루어지며, 통상적으로 에피토프는 특정한 3차원 구조 특징, 및 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적(conformational) 및 비입체형태적 에피토프는, 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 변성 용매의 존재하에 소실되지만 비입체형태적 에피토프에 대한 결합은 소실되지 않는다는 점에서 구별된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 항체는 천연 IL33R에는 특이적으로 결합하지만 변성된 IL33R에는 특이적으로 결합하지 않는다. 본 발명의 IL33R 항체는 항체 Mab ra170이 결합하는 IL33R 상의 동일 에피토프에 결합한다. 본 발명의 IL33R 항체의 에피토프 결합 성질은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. IL33R 항체는 IL33R에 대한 항체 Mab ra170의 결합을 저해하는 시험 항체의 능력을 측정하기 위한 시험관내 교차차단 결합 분석에 의해 시험된다. 적어도 15% 만큼 항체 Mab ra170에 의한 시험 항체의 변위가 존재하는 경우, 에피토프들은 거의 인접해 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(V_L), 중쇄의 가변 도메인(V_H))은 항체를 항원에 결합시키는데 직접 수반되는 경쇄 및 중쇄의 쌍 각각을 의미한다. 가변 경쇄 및 중쇄 도메인들은 동일한 일반 구조를 가지며, 각각의 도메인은 그 서열이 광범위하게 보존되고 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결되는 4개의 프레임워크(FR) 영역들을 포함한다. 프레임워크 영역은 β-시트 입체형태를 취하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 쇄에서 CDR은 프레임워크 영역에 의해 이의 3차원 구조로 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화도에서 특히 중요한 역할을 하므로 본 발명의 또 다른 목적을 제공한다.

용어 "항체의 항원-결합 부분"은 본원에서 사용될 때, 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 항체의 항원-결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들은 N-말단으로부터 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 주로 항원 결합에 기여하는 영역이며 항체의 성질을 규정한다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 표준 정의 및/또는 "초가변 루프"로부터의 상기 잔기들에 따라 결정된다.

본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 알라닌(3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것이다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 상기 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하기 위해 위치하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 동일선상(colinear)에 있으며, 분비 리더의 경우 인접하여 해독 프레임 내에 존재함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접되어서는 안된다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서 접합에 의해 수행된다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 상호교환적으로 사용되며, 모든 상기 호칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환 세포"란 용어는 1차 대상 세포, 및 전이 수에 관계없이 그로부터 유도된 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량에 있어 정확하게 동일하지 않을 수도 있는 것으로 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.

항체의 "Fc 부분"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 수반되지는 않지만, 다양한 작동인자 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 부분"은 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며 항체의 파파인 절단을 근거로 정의된 용어이다. 그 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 항체 또는 면역글로불린은 다음의 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 중쇄 불변 영역에 따라서, 상이한 부류의 면역글로불린들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 근거하여 ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포독성, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 및 CDC(보체-의존성 세포독성)에 직접 수반된다. 보체 활성화(CDC)는 대부분의 IgG 항체 하위부류의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 따라 달라지지만, C1q에 대한 결합은 Fc 부분내 정의된 결합 부위에 의해 야기된다. 상기 결합 부위는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Boackle, R.J. et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R. et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A. et al., Immunology 86 (1995) 319-324] 및 EP 0 307 434 호에 기술되어 있다. 상기 결합부위는, 예를 들면, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다(카밧의 EU 인덱스에 따른 번호(문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])). 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체들은 통상적으로 보체 활성화 및 C1q 결합을 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않으며 C1q에 결합하지 않는다.

본 발명에 따른 항체는 하위부류 IgG1 또는 IgG4의 인간 항체의 Fc 부분인 인간 기원으로부터의 Fc 부분을 포함한다. 본 발명에 따른 항체의 Fc 부분의 경우, 바람직하게는 하기에 정의하는 바와 같은 C1q 결합을 검출할 수 없다.

그러므로, 본 발명은 항체가 IL33R에 결합하고, 인간 기원으로부터의 Fc 부분을 함유하고, 인간 보체 인자 C1q에는 결합하지 않으므로 CDC 작동인자 기능을 방지하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 항체는 L234, L235 및/또는 D265에 돌연변이를 가지고/가지거나 PVA236 돌연변이를 함유하는, 인간 IgG1 또는 IgG2 하위부류의 Fcγ 수용체 결합에 관한 것이다. 돌연변이 L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236[PVA236은 IgG1의 아미노산 위치 233 내지 236으로부터의 아미노산 서열 ELLG(1 문자 아미노산 코드로 나타냄) 또는 IgG4의 EFLG가 PVA로 대체된 것을 의미한다]이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 항체가 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및/또는 P329에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는, 인간 하위부류 IgG1의 항체인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 제공한다. 한 태양에서, 상기 항체는 인간 항체이다. 또 다른 태양에서, 항체는 인간화 항체이다. 한 태양에서, 본 발명은 인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분을 함유하고, 상기 항체가 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 것을 특징으로 하며, 항체가 비아코어(BIAcore) 분석에서 10^-8 M 미만의 K_D 값 하에 IL33R에 결합하는 본 발명에 따른 항체를 제공한다. 또 다른 태양에서, K_D 범위는 10^-11 내지 10^-9 M이다.

C1q 결합은 문헌 [Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]에 따라 측정할 수 있다. 본 발명에 따른 C1q 결합은, ELISA 플레이트를 상이한 농도의 항체로 코팅하는 상기 분석에서 인간 C1q를 첨가하는 것을 특징으로 하지 않는다. C1q 결합은 인간 C1q에 대해 유도된 항체에 이어 퍼옥시다제 기질 ABTS(등록상표)(2,2'-아지노-다이-[3-에틸벤즈티아졸린설포네이트])를 사용한 퍼옥시다제-표지화된 접합체 검출에 의해 검출된다. 본 발명에 따른 C1q 결합은, 405 nm에서 흡광도(OD)가 시험 항체에 대해 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 0.05 미만인 경우 확인되지 않는다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 불변 쇄들이 인간 기원을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 불변 쇄들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); and Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218]에 기술되어 있다. 예를 들면, 유용한 인간 중쇄 불변 영역은 서열번호 10, 11 또는 29를 포함한다. 예를 들면, 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 서열번호 12 또는 34의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양은 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산이다.

본 발명은 환자에게 치료 효과량의 본 발명에 따른 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는, 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법을 포함한다. 본 발명은 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 본 발명은 특히 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 본 발명은 염증성 질환의 치료를 위한, 바람직하게는 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 및 천식의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 또한, 본 발명에 따른 항체의 상기 언급한 특징들에 영향을 미치거나 변화시키지 않는 "보존적 서열 변형"(변이 항체), 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 갖는 상기 항체를 포함한다. 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예를 들면, 부위-지향 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 부류는 당해 분야에서 규정되었다. 상기 부류에는 염기성 측쇄(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파트산, 글루탐산), 변화되지 않은 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산들이 포함된다. 따라서, 인간 항-IL33R 항체중 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 상기 측쇄 부류로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 그러므로, "변이" 항-IL33R 항체는 본원에서, 아미노산 서열에 있어서 "모" 항-IL33R 항체 아미노산 서열과, 모 항체의 하나 이상의 가변 영역에서 10개 이하, 바람직하게는 약 2 내지 약 5개의 부가, 결실 및/또는 치환만큼 상이한 분자를 말한다. 아미노산 치환은 문헌 [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]에 기술된 바와 같은 분자 모델링을 기초로 한 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 태양은, 변형된 항체가 C1q 및/또는 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 방식으로 IL33R에 결합하는 인간 IgG1 타입 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산의 서열을 변형시키고, 상기 변형된 핵산 및 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산을 발현 벡터 내에 삽입하고, 상기 벡터를 진핵 숙주 세포에 삽입하고, 암호화된 단백질을 발현시키고 숙주 세포 또는 상등액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는, Fcγ 수용체 및/또는 C1q에 결합하지 않는 IL33R에 대한 항체의 제조 방법이다.

서열에 관한 동일성 또는 상동성은 본원에서, 필요한 경우 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 모 서열과 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 항체 서열 내로의 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입은 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 이해하지 않아야 한다. 변이체는 인간 IL33R에 결합하는 능력을 유지하며, 바람직하게는 모 항체보다 우수한 성질을 갖는다. 예를 들면, 변이체는 치료시 감소된 부작용을 가질 수 있다.

"모" 항체는 항체 ra170의 CDR 영역을 포함하며 바람직하게는 변이체의 제조에 사용된다. 바람직하게, 모 항체는 인간 프레임워크 영역을 가지며, 존재하는 경우, 인간 항체 불변 영역 또는 인간 항체 불변 도메인을 갖는다. 예를 들면, 모 항체는 인간화 또는 인간 항체일 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합 방법에 의해 생성된다. 상기 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현에 이어서 항체 폴리펩티드의 분리 및 약학적으로 허용되는 순도로의 통상적인 정제를 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터내에 삽입한다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포와 같은 적절한 원핵 또는 진핵 세포에서 수행되며, 항체는 세포(상등액으로부터 또는 세포 용해후에)로부터 회수된다. 항체의 재조합체 생성은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]의 종설 논문에 기술되어 있다. 항체는 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제는 컬럼 크로마토그래피 및 당해 분야에 공지된 기타 방법을 포함하여 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행된다(문헌 [Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조). NS0 세포에서의 발현은, 예를 들면, 문헌 [Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 기술되어 있다. 일시적 발현은, 예를 들면, 문헌 [Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 기술되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌 [Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4258-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 기술되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템(HEK 293)은 문헌 [Schlaeger, E.J., and Christensen, K., Cytotechnology 30 (1990) 71-83; and Schlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 기술되어 있다. 단클론성 항체는, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리된다. 단클론성 항체를 암호화하는 DNA 및 RNA는 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 분리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA의 공급원으로 작용할 수 있다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터내에 삽입될 수 있으며, 이것은 이어서 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 HEK 293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내에 형질감염되어 숙주 세포에서 재조합 단클론성 항체의 합성을 달성한다.

인간 IL33R 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 암호화 DNA 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러나, 상기 변형은, 예를 들면, 전술한 바와 같이, 매우 제한된 범위내에서만 수행될 수 있다. 예를 들면, 변형은 IgG 이소타입 및 에피토프 결합과 같은 상기 언급한 항체 특징을 변화시키지 않으나, 재조합체 생성 수율, 단백질 안정성을 개선하거나 정제를 촉진할 수 있다. 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적 가교결합을 방지하기 위해, 항-IL33R 항체의 적절한 입체형태를 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기도 또한 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합을 항체에 부가하여 이의 안정성을 개선할 수 있다(특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우). 항체의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변화시킨다. "변화시키는"이란 항체내에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 제거하고/하거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-결합된다. N-결합된다는 것은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 결합을 말한다. 트라이펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(이때, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)이 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소적 결합에 대한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중에 상기 트라이펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 제공한다. 항체에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열이 전술한 트라이펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 달성된다(N-결합된 글리코실화 부위의 경우).

항-IL33R 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법으로는 천연 공급원으로부터의 분리(천연 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위-지향) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 인간화 항-IL33R 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

항체의 또 다른 유형의 공유적 변형은, 미국 특허 제 4,640,835 호; 제 4,496,689 호; 제 4,301,144 호; 제 4,670,417 호; 제 4,791,192 호; 제 4,179,337 호에 나타낸 방식으로, 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 결합시키는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 미번역 영역, 폴리아데닐화 및 전사 종료의 서열들과 결합되어 발현 벡터 구조물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조물은 단일 벡터 내에 혼입되거나, 공-형질감염되거나, 연속 형질감염되거나, 숙주 세포 내에 별개로 형질감염된 후 융합되어 두 쇄를 모두 발현하는 단일 숙주 세포를 생성할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된, 본 발명의 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분 중 하나 또는 조합을 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수/재흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 주사 또는 주입에 적합하다. 본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 전문가에 의해 인지되듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 약학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사액 또는 분산액의 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성 물질을 위한 상기 매질 및 약제의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 물 이외에, 담체는, 예를 들면, 등장성 완충 식염수 용액일 수 있다. 선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화된다. 본 발명의 약학 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은, 환자에게 독성이 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양(효과량)을 수득하기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 이의 에스터, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출률, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 컨디션, 일반적인 건강상태 및 이전의 병력, 및 의료 분야에서 공지되어 있는 유사 요인들을 포함한 다양한 약동학적 요인들에 따라 달라질 것이다.

본 발명은 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명의 다른 태양은 TNF 길항물질, 항-CD20 항체, CTLA4Ig 또는 항-IL6 항체를 사용한 치료에 중간 정도로 반응하거나 반응하지 않는, 류마티스성 관절염을 앓고 있는 환자의 치료를 위한, 항-IL33R 항체, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 또 다른 태양은 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 항-IL33R 항체, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 효과량의 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법 및 상기 방법을 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 앓고 있는 환자의 치료를 위한, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 약제의 제조에 효과적인 양의 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식을 앓고 있는 환자의 치료를 위한, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 약제의 제조에 효과적인 양의 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.

서열에 대한 설명

서열번호 1 중쇄 CDR3, Mab ra170

서열번호 2 중쇄 CDR2, Mab ra170

서열번호 3 중쇄 CDR1, Mab ra170

서열번호 4 경쇄 CDR3, Mab ra170

서열번호 5 경쇄 CDR2, Mab ra170

서열번호 6 경쇄 CDR1, Mab ra170

서열번호 7 중쇄 가변 도메인, Mab ra170

서열번호 8 경쇄 가변 도메인, Mab ra170

서열번호 9 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 γ1 중쇄 불변 영역(백인 알로타입(Caucasian Allotype))

서열번호 10 인간 γ1 중쇄 불변 영역(백인 알로타입)

서열번호 11 인간 γ1 중쇄 불변 영역(아프리카계 미국인 알로타입)

서열번호 12 인간 κ 경쇄 불변 영역

서열번호 13 mut1에 대한 치환된 ST2 서열 단편 1

서열번호 14 mut1에 대한 치환된 ST2 서열 단편 2

서열번호 15 mut1에 대한 치환된 ST2 서열 단편 3

서열번호 16 mut1에 대한 치환된 ST2 서열 단편 4

서열번호 17 ST2 단편 SE13을 치환하는, IL-1R 단편 1 mut 1

서열번호 18 ST2 단편 SE14를 치환하는, IL-1R 단편 2 mut 2

서열번호 19 ST2 단편 SE15를 치환하는, IL-1R 단편 3 mut 3

서열번호 20 ST2 단편 SE16을 치환하는, IL-1R 단편 4 mut 4

서열번호 21 중쇄 가변 도메인, 인간화 ra170 11.12(VH11)

서열번호 22 중쇄 CDR1, Mab ra170 11.12

서열번호 23 중쇄 CDR2, Mab ra170 11.12

서열번호 24 중쇄 CDR3, Mab ra170 11.12

서열번호 25 중쇄 가변 도메인, 인간화 ra170 10.12(VH10)

서열번호 26 중쇄 CDR1, Mab ra170 10.12

서열번호 27 중쇄 CDR2, Mab ra170 10.12

서열번호 28 중쇄 CDR3, Mab ra170 10.12

서열번호 29 인간 IgG4 SPLE 주쇄(돌연변이 L235E 및 S228P를 갖는 인간 γ4 중쇄 불변 영역)

서열번호 30 경쇄 가변 도메인, 인간화 ra170(11.12 및 10.12)

서열번호 31 경쇄 CDR1, Mab ra170 10.12 및 11.12

서열번호 32 경쇄 CDR2, Mab ra170 10.12 및 11.12

서열번호 33 경쇄 CDR3, Mab ra170 10.12 및 11.12

서열번호 34 인간 카파 주쇄

실시예

실시예 1

면역화

찰스 리버 래버러토리즈 인터내셔날 인코포레이티드(Charles River Laboratories International, Inc.)로부터의 뉴질랜드 화이트(New Zealand White, NZW) 토끼(오릭토라구스 쿠니쿨러스(Oryctolagus cuniculus))를 면역화에 사용하였다. 이들은 동물실험 윤리심의 위원회(Institutional Animal Care and Use committee) 가이드라인 및 실험동물 관리 평가 인증 협회(Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)에 따라 수용하고 사육하였다.

인간 IgG의 Fc 영역에 융합된 인간 IL-33R의 정제되고, NS0-유도되고, 분비된 가용성 형태를 1 mg/ml의 농도에서 NaCl-히스티딘 완충액(pH 6.1)에 용해시키고 안정한 유화액이 생성될 때까지 완전 프로인트 보조제(CFA)와 혼합(1:1)하였다. 3마리의 토끼에게 2 ml의 유화액을 피내(i.d.) 주사한 후 1주일 간격으로 각각 1 ml씩 2차 근육내(i.m.) 및 3차 피하(s.c) 주사하였다. 2주후에 1 ml를 4차 근육내 주사한 다음 4주 간격으로 2회 더 피하 주사하였다. 3차, 4차, 5차 및 6차 주사 4 내지 6 일후에 각 동물의 말초 전혈 샘플 10 ml를 수거하고 FACS에서 단일 세포 분류에 사용하였다. 각 동물의 추가 0.5 ml 혈청을 동시에 수거하고 IL33R 특이적 항체 반응의 특성화에 사용하였다.

항체 반응

37 ℃에서 96-웰 맥시소프(MaxiSorp) 미세적정 플레이트를 카보네이트 완충액 중의 0.3 ㎍/ml rhIL33R 단백질로 1 시간 동안 코팅시킨, IL33R 특이적 ELISA를 이용하여 혈청의 연속 희석에 의해 면역화에 대한 항체 반응을 측정하였다. 그 후에, 웰을 4 ℃에서 1% 크로테인(Crotein) C(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일)가 보충된 PBS로 밤새 차단하였다. 검출을 위해, 고추냉이 퍼옥시다제(더 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory))에 결합된 염소 항-토끼 IgG를 1:16000 희석률로 사용하였다. 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하의 즉시 사용가능한 용액인 테트라메틸벤지딘(TMB)을 침전시키는 BM 블루 POD 기질을 가시화에 사용하였다. 1N HCl로 반응을 중단시키고, 테칸 인피니트(Tecan Infinite)에서 450/690 nm로 측정하였다.

항체 선별에 대한 설명

멸균 세포 배양 6-웰 플레이트를 4 ℃에서 카보네이트 완충액(0.1 M 중탄산나트륨, 34 mM 탄산수소이나트륨, pH 9.55) 중의 2 ㎍/ml IL33R 단백질로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 사용 전에 멸균 PBS로 3회 세척하였다. 토끼 전혈을 함유하는 EDTA를 1x PBS로 2배 희석한 후 림프용해(lympholyte) 포유동물(세달레인 래버러토리즈(Cedarlane Laboratories)) 상에서 밀도 원심분리를 수행하여 토끼 PBMC를 분리하였다. PBMC를 2회 세척한 후 항체로 염색하였다.

EL -4 B5 배지

10% FCS(하이클론(Hyclone), 로간(Logan), 미국 유타주), 2 mM 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액, 2 mM 나트륨 피루베이트, 10 mM HEPES 및 0.05 mM β-머캅토에탄올을 보충한 RPMI 1640.

대식세포/단핵구의 고갈

멸균 6-웰 플레이트(세포 배양 등급)를 사용하여 비특이적 부착을 통해 대식세포 및 단핵구를 고갈시켰다. 각 웰을 최대 4 ml 배지 및 면역화 토끼로부터의 말초혈 단핵 세포 6 x 10⁶ 이하로 채우고, 37 ℃에서 배양기에서 1 시간 동안 결합시켰다. 상등액 중 세포의 50%를 패닝(panning) 단계에 사용하고; 나머지 50%의 세포를 면역 형광 염색까지 얼음상에 유지시켰다.

IL33R 단백질 상에 B 세포의 농축

IL33R 단백질로 코팅된 6-웰 배양 플레이트에 4 ml 배지 당 6 x 10⁶ 이하의 세포를 접종하고 37 ℃에서 배양기에서 1 시간 동안 결합시켰다. IL33R 단백질 상에서의 농축 단계 후에, 웰을 1x PBS로 1 또는 2회 조심스럽게 세척하여 비-부착 세포를 제거하였다. 남은 점착성 세포를 37 ℃에서 배양기에서 10 분간 트립신으로 분리한 다음 배지에서 2회 세척하였다. 세포를 면역 형광 염색까지 얼음 상에서 유지시켰다.

면역 형광 염색 및 유세포측정

단일 세포 분류에 사용된 항-토끼 IgG FITC를 AbD 세로텍(Serotec)(STAR121F, 독일 뒤셀도르프)에서 입수하였다. 표면 염색을 위해, 고갈 및 패닝 단계로부터의 세포를, 4 ℃에서 냉장실에서 어둠속에서 30 분간의 롤링(rolling) 동안 PBS 중에 최적으로 희석된 항-토끼 IgG FITC 항체와 함께 배양하였다. 원심분리 후에, 상등액을 흡인시켜 제거하였다. PBMC를 원심분리 및 빙냉 PBS를 사용한 세척의 2 주기에 적용하였다. 최종적으로, PBMC를 빙냉 PBS에 재현탁시키고 즉시 FACS 분석에 적용하였다. FACS 분석 전에 5 ㎍/ml(BD 파밍겐(Pharmingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고)의 농도로 프로피듐 요오다이드를 가하여 사멸 세포와 생 세포를 식별하였다. 컴퓨터 및 FACSDiva(등록상표) 소프트웨어(BD 바이오사이언시즈, 미국)가 장착된 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACSAria(등록상표)를 사용하여 데이터를 수집하고 분석하였다.

B 세포 배양

문헌 [Zubler, et al., Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363; Zubler, et al., J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183]에 유사한 방법으로 B 세포 배양물을 제조하였다. 간략하게, 단일 분류된 B 세포를, 37 ℃에서 5% CO의 대기하에 배양기에서 판솔빈(Pansorbin, 등록상표) 세포(1:20000)(칼바이오켐(Calbiochem), 메르크(Merck), 독일 다름스타트), 5% 토끼 흉선세포 상등액(차지 20080910, 프로덕션 이름가르트 토레이(Irmgard Thorey)) 및 감마-조사된 EL-4-B5 뮤린 흉선종 세포(2 x 10⁴/웰)를 함유하는 210 ㎕/웰 배지와 함께 96-웰 플레이트에서 7 일 동안 배양하였다. 선별을 위해 B 세포 배양 상등액을 제거하고 가변 영역 유전자 회수를 위해 세포를 즉시 수거하거나 -80 ℃에서 100 ㎕ RLT 완충액(키아겐(Qiagen), 독일 힐덴) 중에 냉동시켰다.

리보핵산( RNA )의 분리

RNA를 분리해야 하는 세포를 먼저 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 10 ㎕/ml 베타-머캅토에탄올을 함유한 100 ㎕ RLT-완충액을 첨가하여 세포 펠릿을 용해시켰다. 세포를 피펫으로 수회 혼합하여 재현탁하고 다중 웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 200 x g에서 짧게 원심분리하고 -20 ℃에서 냉동시켰다. 뉴클레오스핀(NucleoSpin, 등록상표) 96 RNA 키트(매커레이 앤 나겔(Macherey & Nagel))를 제조사의 지시에 따라 사용하여 RNA의 분리를 수행하였다.

역전사 중합효소 연쇄 반응

슈퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 신테시스 슈퍼믹스(SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix)(인비트로겐(Invitrogen))를 제조사의 지시에 따라 사용하여 역전사를 수행하였다.

중합효소 연쇄 반응

어큐프라임 Pfx 슈퍼믹스(AccuPrime Pfx SuperMix)(인비트로겐)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 별개의 반응에서 증폭시켰다. 표적 항체 발현 벡터에 25 bp 중복서열을 갖는 PCR-프라이머를 사용하였다. PCR-산물은 뉴클레오스핀(등록상표) 96 엑스트랙트(Extract) II 키트(매커레이 앤 나겔)로 정제하였다.

서열분석 및 SLIC 클로닝

PCR 산물을 서열분석하여 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들의 DNA-서열을 결정하였다. PCR-산물을 문헌 [Haun, R.S., et al., BioTechniques 13 (1992) pp. 515-518; and Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) pp. 251-256]에 기술되어 있는 소위 SLIC 클로닝 방법에 의해 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 항체 발현을 위한 플라스미드를 제한 효소 절단에 의해 선형화시켰다. 선형화된 플라스미드를 예비 아가로스 전기영동으로 정제하고 겔로부터 추출하였다(키아퀵 겔 추출 키트(Qiaquick Gel Extraction Kit)/키아겐). 정제된 플라스미드를 클로닝될 PCR-산물에 대한 중복 프라이머(돌출부(bay) 25 bp)를 사용하여 PCR-프로토콜에 부가하였다. 벡터 및 삽입물 둘 다를 dNTP의 부재하에 T4 DNA 폴리머라제(로슈 어플라이드 사이언시즈)로 처리하여 돌출서열(overhang)을 생성한 다음, 벡터 및 삽입물을 RecA(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 단백질 및 ATP와 함께 배양하여 재조합을 촉진시켰다. 생성물을 에스케리키아 콜라이에 형질전환시켰다. 경쇄 및 중쇄를 위한 플라스미드 DNA를 분리하고, 각각의 쌍을 일시적 형질감염을 위해 혼합하였다.

HEK293 세포에서의 항체 발현을 위한 일시적 형질감염

HEK293 세포(인비트로겐)를 F17-배지(깁코(Gibco))에서 1 x 10e6 세포/ml로 성장시켰다. 2 x 10e6 HEK293 세포를 293-프리(노바겐(Novagen)) 및 옵티멤(OptiMEM, 등록상표)(깁코)에 현탁시킨 1 ㎍ HC + LC 플라스미드로 형질감염시켰다. 7 일후에 배양 상등액을 수거하고 분석하였다.

본 발명에 따른 항체는 인간 UT-7 세포에서 IL33 유도된 NFkB 활성화의 억제를 근거로 우수한 특성을 나타낸다. 바람직하게, 본 발명에 따른 항체는 0.05 nM 이하, 보다 바람직하게는 0.03 nM 이하의 IC₅₀ 값을 나타낸다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 호산구 분석, 비만 세포 분석, 호염기구 분석(KU812) 및 TH₂ 분석의 분석 조합에서 유용한 성질을 나타낸다. 0.05 nM 이하, 보다 바람직하게는 0.03 nM 이하의 IC₅₀ 값의, 인간 UT-7 세포에서 IL33 유도된 NFkB 활성화 억제를 나타내는 항체는 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 및 천식의 치료에서 특히 유용한 성질을 나타낼 것으로 밝혀졌다. 호산구 분석, 비만 세포 분석, Th2 분석, 호염기구 분석(IL-5)에서 5 nM 이하의 IC₅₀ 값을 나타내는 항체가 더욱 바람직하다.

실시예 2

ST2 에 대한 IL33 결합의 억제( ELISA )

시험은 RT에서 384 웰 맥시소프(등록상표) 미세적정 플레이트(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 눈크(Nunc). 독일, 카탈로그 번호 464718) 상에서 수행하였다. 각 배양 단계 후에, 플레이트를 PBST(포스페이트 완충 식염수 트윈(등록상표)-20)로 3회 세척하였다. 처음에, 플레이트를 1 ㎍/ml의 염소 항-인간 IgG Fc 단편(잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Imm. Res.), 미국, 카탈로그 번호 109-006-170)으로 2 시간 이상 동안 코팅하였다. 그 후에, 웰을 0.1% 트윈(등록상표)-20 및 2% BSA(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일)를 보충한 PBS로 1 시간 동안 차단하였다. 60 ng/ml의 재조합 인간 ST2/IL-1R4 Fc 키메라(알앤디 시스템즈, 영국, 카탈로그 번호 523-ST) 또는 재조합 사이노몰구스 ST2 Fc 키메라를 1 시간 동안 포획하였다. 0.5% BSA 및 0.05% 트윈(등록상표)-20을 보충한 PBS 중의 하이브리도마/B-세포로부터의 정제된 항체 또는 상등액의 희석물을 수용체 단백질과 함께 1 시간 동안 배양하였다. 비오틴화 인간 IL33(페프로테크(PeproTech), 미국, 카탈로그 번호 500-P261)을 1 시간 동안 더 가하여 복합체를 형성하였다. IL33을 제조사의 프로토콜에 따라 설포-NHS-LC-비오틴(터모 사이언티픽 피어스(Thermo Scientific Pierce, 미국, 카탈로그 번호 21327)으로 비오틴화시키고, 제바(Zeba, 등록상표) 탈염 스핀 컬럼(Desalt Spin Column)(터모 사이언티픽 피어스, 미국, 카탈로그 번호 89889)을 사용하여 정제하였다. 복합체에 대한 비오틴화 IL33의 결합을 1:4000 희석된 스트렙타비딘 HRP(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일, 카탈로그 번호 1108953001)로 검출하였다. 1 시간 후에 플레이트를 PBST로 6회 세척하고 새로 제조한 BM 블루 POD 기질 용액(BM 블루: 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘, 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일, 카탈로그 번호 11484281001)으로 RT에서 12 분 동안 전개시켰다. 흡광도를 370 nm에서 측정하였다. 음성 대조군은 ST2/IL-1R4 단백질을 첨가하지 않는 것으로 규정하였으며, 양성 대조군은 항체는 제외하고 모든 성분을 갖는 것으로 규정하였다.

항체 ra170은 인간 ST2에 대한 결합 억제에 0.32 nM 및 사이노몰구스 ST2에 대해서는 0.13 nM의 IC₅₀ 값을 나타낸다.

실시예 3

인간 ST2 ECD ( His - Avitag 단량체)에 대한 항- hST2 항체의 친화도 측정

기기: 비아코어(BIACORE, 등록상표) T100

칩: CM4(GE 헬쓰케어(Healthcare) BR-1005-34)

커플링: 아민 커플링

완충액: 0.05% 트윈20(PBST)을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수, pH 7.4, 37 ℃

친화도 측정을 위해 10 ㎍/ml의 염소 항 인간 Fcg 항체(잭슨 이뮤노 리서치, 미국, 카탈로그 번호 115-005-098)를, ST2에 대한 항체 결합을 포착하기 위해 칩 표면에 커플링시켰다. 6His Avitag(등록상표)를 갖는 단량체성 인간 ST2 ECD를 다양한 농도로 용액중에 가하였다. 결합은 37 ℃에서 120 초의 접촉 시간 동안 ST2 ECD의 주입에 의해(단일주기-동적) 측정하였으며; 해리는 37 ℃에서 1800 초 동안 칩 표면을 완충액으로 세척함으로써 측정하였다. 겉보기 K_D 및 다른 동적 파라미터의 산출을 위해, 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델을 사용하였다. 결과(두 측정치의 평균)를 표 1에 나타내었다.

37 ℃, pH 7.4에서 10 mM PBST 중에서 SPR(비아코어 T100)로 측정한 친화도 데이터의 평균

항체	겉보기 K_D(M)	K_a(1/Ms)	K_d(1/s)	t₁ _/2(분)
ra170 IgG4 SPLE	2.7 x 10^-12	4.6 x 10⁶	1.3 x 10^-5	881
ra170 10.12	1.1 x 10^-09	4.9 x 10⁶	5.1 x 10^-3	2
ra170 11.12	1.4 x 10^-10	3.1 x 10⁶	4.3 x 10^-4	27

실시예 4

인간 UT -7 세포에서 IL33 유도된 NFkB 활성화의 억제

a) 시약:

UT-7 세포주(DSMZ #ACC 137)

배양 배지: 2 mM L-글루타민(깁코 #25030), 1.0 mM 나트륨 피루베이트(깁코 #11360-039), 0.1 mM NEAA(깁코 #11140-035), 10% FCS(깁코 #10509-24), 10 단위/ml rhGM-CSF(로슈 #11115138)를 보충한 RPMI1640(깁코 #10509-24)

재조합 인간 IL-33(페프로테크 #200-33)

패쓰스캔(PathScan, 등록상표) 포스포-NFkB p65(Ser536) 샌드위치 ELISA 항체 쌍(셀 시그널링(Cell Signaling) #7834)

패쓰스캔(등록상표) 샌드위치 ELISA 용해 완충액(셀 시그널링 #7018)

rhTNF알파(로슈 어플라이드 사이언시즈 #11371843)

b) 절차:

UT-7 세포를 37 ℃에서 7% CO₂/95% 공기 혼합물 중에서 2 mM L-글루타민, 1.0 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM NEAA, 10% FCS 및 10 단위/ml GM-SCF를 보충한 RPMI-1640에서 성장시켰다. 세포가 약 1 x 10⁶ 세포/ml의 밀도에 도달했을 때 이들을 계대배양하고 2 x 10⁵ 세포/ml의 밀도로 희석하였다. 계대배양 2 일후에 세포를 NFkB 분석에 사용하였다. IL33에 효과적인 농도를 측정하기 위해, 세포를 96-웰 폴리프로필렌 세포 배양 플레이트에 접종하고(220 ㎕ 성장 배지의 총 부피중 8.0E+0.5 세포/웰), 37 ℃에서 다양한 농도의 재조합 인간 IL33(0.1 내지 10 ng/ml)으로 15 분간 자극하였다. 이어서, 플레이트를 원심분리하고 빙냉 PBS로 세척하고 다시 원심분리하였다. PBS를 제거하고 웰 당 60 ㎕ 패쓰스캔(등록상표) 샌드위치 ELISA 용해 완충액을 가하였다. 세포를 얼음상에서 용해 완충액과 함께 15 분간 배양하였다. 원심분리에 의해 용해물을 청정화시키고 상등액을 수거하였다. 패쓰스캔(등록상표) 포스포-NF-kB p65 ELISA를 이용하여 NFkB 활성화를 측정할 때까지 용해물을 -80 ℃에서 저장하였다. ELISA는 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 데이터는 NFkB 활성화의 자극이 1 ng/ml IL33에서 최적이었음을 나타내었다. 항체 시험을 위해, UT7 세포를 96-웰 폴리프로필렌 세포 배양 플레이트에 접종하고(8.0E+05 세포/웰), 220 ㎕ 성장 배지의 총 부피 중에서 다양한 농도의 항체(0.15 ng/ml에서 300 ng/ml 최종 농도)와 함께 배양하였다. 세포를 얼음상에서 항체와 함께 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 37 ℃에서 rhIL-33(1 ng/ml 최종 농도)으로 15 분간 자극하였다. 대조군으로서, 37 ℃에서 TNF-알파(30 ng/ml)와 함께 UT7 세포를 15 분간 배양하여 UT7 세포의 최대 NFkB 활성화를 측정하였다. 용해물 제조 및 NFkB 분석은 전술한 바와 같이 수행하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

인간 UT-7 세포에서 IL-33 유도된 NFkB 활성화의 억제

항체	NFkB IC₅₀ [nM]
ra170(토끼 IgG1)	0.025
ra170 10.12	0.28
ra170 11.12	0.04
Mab523¹	1.90
AF523(PAB, 염소 IgG1)¹	0.56
HB12(마우스 IgG1)¹	1.43
2A5²	66.22
FB9²	0.95
¹: 알앤디 시스템즈에서 시판(http://www.rndsystems.com) ²: MBL 인터내셔날 코포레이션에서 시판, 주문 번호: D065-3, D066-3, D067-3 및 ABIN130564

실시예 5

클론 ra170 에 대한 결합 부위 규정

항체 결합 부위의 규정을 위해, 인간 IL-33 수용체 ST2를 클로닝하고 발현시켰다. ST2는 3개의 도메인 D1, D2, D3으로 이루어진다. 이의 D1D2 변이체를 생성하고 ra170의 잔기 결합을 시험하였다. ra170은 ST2 및 절두(truncated) 변이체 D1D2에 결합한다.

ST2-변이체에 대한 결합은 25 ℃에서 비아코어(등록상표) T100 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resornance, SPR)으로 측정하였다. 비아코어(등록상표) 시스템은 분자 상호작용 연구에 잘 확립되어 있다. SPR-기술은 금으로 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 근접한 굴절률의 측정을 기초로 한다. 굴절률의 변화는 고정화 리간드와 용액중 주입된 분석물과의 상호작용에 의해 야기된 표면 상에서의 질량 변화를 나타낸다. 분자가 표면 상의 고정화 리간드에 결합하면, 질량은 증가하고, 해리의 경우 질량 감소는 복합체 해리를 나타낸다. SPR은 리간드/분석물 결합의 연속 실시간 모니터링을 가능하게 하므로, 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 평형 상수(KD)의 측정을 가능하게 한다. 단일 농도값을 주입하면 분석물의 결합 능력에 대한 명확한 표현을 제공하지만, 또한 결합 값에 대해서는 개략적인 제시를 제공한다.

약 8000 공명 단위(RU)의 포획 시스템(ST2-His 특이적 펜타-His 포획, 키아겐, 카탈로그 번호 34660)의 아민 커플링을 GH 헬쓰케어에서 공급한 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에서 수행하였다.

분석을 위해, 30 ㎕/분의 유량에서 1 분 동안 300 nM 용액을 주입함으로써 His-표지된 ST2-변이체를 포획하였다. 이어서, 시험할 항체를 30 ㎕/분의 유량에서 2 분 동안 100 nM의 농도로 주입하였다. 해리상을 1 분 이하 동안 모니터링하고, 샘플 용액으로부터 런닝 완충액으로 교환하여 촉발시켰다. 표면을 30 ㎕/분의 유량에서 글리신 pH 2.0 용액으로 30 초 세척하여 재생하였다.

블랭크-커플링된 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 블랭크 주입도 또한 감한다(= 이중 참조).

ST2 변이체는 ST2 야생형에 필적하게 본 발명에 따른 항체에 의해 결합되므로, 결합 부위가 D1D2 도메인 상에 위치하는 것으로 결론지어진다.

실시예 6

상이한 ST2 - 변이체에 대한 항- IL -33R 항체 결합의 측정

상이한 ST2-변이체에 대한 본 발명에 따른 항체의 결합은 37 ℃에서 비아코어(등록상표) A100 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다. 비아코어(등록상표) 시스템은 분자 상호작용 연구에 대해 잘 확립되어 있다. SPR-기술은 금으로 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 근접한 굴절률의 측정을 기초로 한다. 굴절률의 변화는 고정화 리간드와 용액중 주입된 분석물과의 상호작용에 의해 야기된 표면 상에서의 질량 변화를 나타낸다. 분자가 표면 상의 고정화 리간드에 결합하면, 질량은 증가하고, 해리의 경우 질량 감소는 복합체 해리를 나타낸다. SPR은 리간드/분석물 결합의 연속 실시간 모니터링을 가능하게 하므로, 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 평형 상수(KD)의 측정을 가능하게 한다.

약 800 공명 단위(RU)의 포획 시스템(mFcγ-특이적 항-마우스 Fcγ, 잭슨 이뮤노 리서치, 카탈로그 번호 JIR115-005-071 및 rbFcg-특이적 항-토끼 Fcg, 잭슨 이뮤노 리서치, 카탈로그 번호 JIR111-005-046 포획)의 아민 커플링을 GH 헬쓰케어에서 공급한 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에서 수행하였다.

분석을 위해, 10 ㎕/분의 유량에서 2분 동안 10 nM의 토끼 항체 및 약 30 nM의 마우스 항체 용액을 주입함으로써 상이한 항체들을 포획하였다. 이어서, 시험할 His 표지된 ST2 변이체를 30 ㎕/분의 유량에서 2.5 분 동안 150 nM의 최대 농도를 갖는 연속 희석물로 주입하였다. 해리상을 10 분 이하 동안 모니터링하고, 샘플 용액으로부터 런닝 완충액으로 교환하여 촉발시켰다. 항-마우스 포획 항체의 표면을 기기 프로토콜을 사용하여 글리신 pH 1.5 용액으로 60 초 세척한 후 글리신 pH 2.0 용액으로 60 초 세척하여 재생하였다. 항-토끼 포획 항체의 표면은 글리신 pH 1.7 용액으로 60 초 세척하는 2회 세척 단계에 의해 재생하였다.

ST2 변이체가 ST2 야생형에 필적하게 연구된 항체에 의해 결합되는 경우, 변이체는 ST2에 대한 항체의 결합에 영향을 미치지 않으므로 결합 부위가 돌연변이된 ST2 영역 밖에 위치하는 것으로 결론지어진다.

ST2 변이체가 ST2 야생형에 필적하게 연구된 항체에 의해 결합되지 않는 경우, 변이체는 ST2에 대한 항체의 결합에 영향을 미치므로 결합 부위가 돌연변이된 ST2 영역 내에 위치하는 것으로 결론지어진다.

항체들에 대한 결합 성질은 표 3에 나타내었다. ra170 결합은 Mut2 및 Mut3에 의해 영향을 받아 그 결합 부위가 돌연변이된 서열 연장부와 중복됨을 시사한다. Mab523 결합은 Mut2 및 Mut3에 의해 영향을 받으나, 또한 Mut4에 의해서도 영향을 받아 보다 광범위한 결합 영역을 시사한다.

상이한 ST2-변이체에 대한 항-IL33 항체의 결합

항체	결합
항체	Mut1	Mut2	Mut3	Mut4
ra170	+	-	-	+
Mab523	+	-	-	-

ST2 돌연변이체

돌연변이체	대체된 ST2 서열 단편	ST2 서열 단편을 대체하는 IL-1R 서열 단편
Mut1	서열번호 13	서열번호 17
Mut2	서열번호 14	서열번호 18
Mut3	서열번호 15	서열번호 19
Mut4	서열번호 16	서열번호 20

실시예 7

NK -분석

IL33은 상이한 백혈구 및 또한 NK 세포를 활성화시킴으로써 T_H1 및 T_H2 반응 둘 다를 증폭시킨다(문헌 [Smithgall, M.D., et al., Int. Immunol. 20 (2008) 1019-1030]). 하기 분석에서, NK 세포에 의한 IFN-γ의 분비는 IL12 및 IL33의 공-배양에 의해 유도되었으며, 그 억제는 항-IL33R 항체의 특성화시 판독물로 사용되었다.

건강한 혈액으로부터 백혈구 세포(백혈구)의 분리 후에, 음성 NK 세포 분리 키트(밀테니(Miltenyi), #130-092-657)를 사용하여 PBMC로부터 NK 세포를 정제하였다. 평균 순도는 96% 초과이었다.

시약

- 인간 IL-12(시그마, #12276, 최종 농도[f.c.] = 1 ng/ml)

- 인간 IL-33(페프로테크, #200-33, f.c. = 10 ng/ml)

- IFN-γCBA 플렉스 세트(BD, #558269)

- NK-세포 배지: 10% FCS(인비트로겐 또는 PAA), 1% 나트륨 피루베이트(깁코 인비트로겐, #11360) 및 L-글루타민(깁코 인비트로겐, #25030-024), 및 0.1% β-머캅토에탄올(깁코 인비트로겐, #31350-010)을 보충한 RPMI 1640(PAN, # P04-17500).

선택적으로 상이한 농도의 샘플 또는 이소타입 대조군 항체로 예비처리된 96 웰 평저 플레이트에 1 x 10⁵ NK 세포/웰을 접종하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, NK 세포를 10 ng/ml IL-33 및 1 ng/ml IL-12로 자극하고 20 시간 동안 배양하였다. 이 후에, 상등액을 수거하고 원심분리하고 IFN-γ에 대해 시험하였다. IFN-γ 정량화를 위해, CBA 플렉스 세트 플랫폼(BD(등록상표), FACS Canto II 사용)을 사용하였다. IC₅₀ 값은 ra170의 경우 0.27 nM, ra170 10.12의 경우 1.3 nM, ra170 11.12의 경우 1.8 nM, PAB AF523의 경우 2.3 nM 및 Mab523의 경우 억제없음으로 측정되었다.

실시예 8

호산구 생존력 분석

호산구 생존을 지연시키는데 있어 IL-33의 영향을 설명하기 위해, 문헌 [Chow, J.Y., et al., Cellular & Molecular Immunology 7 (2010) 26-34]에 기초한 분석을 새로 분리된 호산구를 사용하여 수립하였다. 인간 호산구의 생존력은 IL-33의 첨가에 의존하므로, 상이한 농도에서의 항-인간 IL-33R [ST2] mAb와 함께 예비-배양은 상기 효과를 억제하였다. 피콜-팩(Ficoll-Paque, 등록상표) PLUS 구배 원심분리(GE 헬쓰케어, #17-1440-03)에 의해 전혈로부터 과립구를 분리하였다. 적혈구 용해 후에, 침강된 적혈구 세포/과립구 펠릿을 취하여 음성 호산구 분리 키트(밀테니 바이오텍, 베르기슈 글라드바흐, #130-092-010)에 의해 호산구를 정제하였다.

시약

- 인간 IL-33(20 ng/ml)

- 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo, 등록상표), 발광 세포 생존력 분석(프로메가, #7571)

- 호산구 배지: FCS, 1% 나트륨 피루베이트, L-글루타민 및 0.1% β-머캅토에탄올을 보충한 RPMI 1640.

샘플 항체 함유 배지를 첨가[5 ㎍/ml 최종 농도]하기 전에 1 x 10⁵ 호산구/웰을 96 웰 평저 플레이트로 옮기고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, IL33을 20 ng/ml의 최종 농도로 가하고, 호산구를 37 ℃에서 가습 배양기에서 배양하였다. 40 시간후에, 호산구 생존력을 측정하였다. ra170의 경우 1.3 nM의 IC₅₀ 값이 확인되었다.

실시예 9

1차 비만 세포 분석

비만 세포는 선천적 및 후천적 면역 반응 둘 다의 증폭에 의한 알레르기 반응의 발생 및 유지에 있어 핵심이다. 비만 세포는 조직에 위치하며 순환 혈액중에는 존재하지 않는다. 따라서, 혈액으로부터 인간 비만 세포를 수득하기 위해, CD34⁺ 조혈모 세포를 인간 줄기 세포 인자(SCF), IL-3 및 IL-6의 존재하에 5 내지 6 주 이내에 비만 세포로 분화시켰다. 하기의 프로토콜은 문헌 [Saito, H., et al., Nature Protocols 1 (2006), 2178-2183]의 발표를 기초로 한다.

백혈구 세포의 분리(실시예 10 참조) 후에, CD34+ 조혈모 세포를 CD34 마이크로비드 키트(밀테니 바이오텍, #130-046-702)를 사용하여 PBMC로부터 정제하였다. 평균 수율은 공여체 당 1 내지 2 x 10⁵의 총 세포였으며; 통상적으로 50% CD34⁺ CD117⁺ 세포가 수득되었다.

시약 및 분화 프로토콜:

- 메토컬트(Methocult, 등록상표)(스템 셀 테크(Stem Cell Tech), # H4236)

- 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충제(인비트로겐, #51300-044)

- BSA, 소 혈청 알부민

- 인간 SCF

- 인간 IL3 및 IL6

- 기본 비만 세포 배지(bMC): 0.1% β-머캅토에탄올 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 IMDM(이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)).

정제 후에, 1.5 x 10⁵의 정제된 CD34+ 세포를, IL-3, IL-6 및 SCF, 메토컬트(등록상표) 및 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충제로 보충된 bMC 배지에 재현탁하고, 24 웰 플레이트의 10 내지 12개 웰에 접종하고 5 내지 6 주 동안 배양하였다.

기능성 비만 세포 분석

팽창 및 분화 단계 후에, 비만 세포를 항-IL33R 항체의 길항작용 영향을 분석하는 기능성 분석에 사용하였다.

시약 및 배지

- 20 ng/ml 인간 IL-33

- 인간 IL-5

- 인간 IL-13

- 기본 비만 세포 배지.

10⁵ 비만세포/웰을 평저 96 웰 플레이트에 접종하였다. 먼저, 비만 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 샘플 또는 이소타입 대조 항체로 예비처리하였다. IC₅₀ 측정을 위해, 항체를 통상적으로 5 ㎍/ml의 f.c.로 출발하여 상이한 농도로 사용하고 1:3 단계로 희석하였다. 이어서, 20 ng/ml의 IL-33을 가하고, 세포를 37 ℃에서 약 40 내지 48 시간 동안 배양한 후 T_H2 사이토카인 수준(의 억제)를 정량화하였다. 지정된 배양 시간 후에, 세포 현탁액을 V-바닥 플레이트로 옮기고 침강시켰다(400 x g, RT에서 10 분). 이어서, 상등액을 사용하여 사이토카인 수준(IL-5 및 IL-13)을 측정하였다. ra170의 경우 0.4 nM(IL-13) 및 0.2 nM(IL-5) 이하의 IC₅₀ 값이 확인되었다.

실시예 10

인간 Th2 분석

말초혈 단핵 세포(PBMC)를 건강한 지원자로부터 피콜 하이팩(Ficoll Hypaque) 밀도 구배에 의해 분리하였다. 세포를 2 mM EDTA를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 세척한 후, 세포를 0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 1회 세척하였다. CD4+ T 세포 분리 키트 II(밀테니 바이오텍) 및 자력 분리를 이용하여 PBMC로부터 미접촉(naive) T 세포를 분리하였다. 농축된 T 세포를 완전 RPMI 1640(10% FCS, 2-머캅토에탄올, L-글루타민, 나트륨 피루베이트, 비-필수 아미노산 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)을 사용하여 3회 세척하고, 재현탁하고, 1:1 비의 다이나비즈(Dynabeads) T-활성화인자 CD3/CD28(인비트로겐), 10 ng/ml의 IL-2, 10 ng/ml의 IL-4, 5 ㎍/ml의 항-IL-12(알앤디 시스템) 및 5 ㎍/ml의 항-IFNγ(알앤디 시스템)와 함께, 6 웰 평저 플레이트에 0.5 x 10⁶ 세포/ml로 플레이팅하고, 37 ℃에서 4 일 동안 배양하였다. 세포를 분열시킨 후, 동일 배양 조건에서 4 일간 더 유지시켰다. 세포를 완전 RPMI로 2회 세척한 다음 2 ng/ml의 IL2를 함유하는 완전 RPMI에서 1 x 10⁶ 세포/ml로 3 일 동안 휴지시켰다. 분석 하루 전에, 하이-바인딩(Hign-binding) 96-웰 평저 플레이트(코스타(Costar))를 5 ㎍/ml의 가용성 항-CD3e(BD 바이오사이언스)로 코팅하였다. 분석일에, 세포를 완전 RPMI로 2회 세척하고, IL-2 부재하에 4 시간 동안 더 휴지시켰다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 1 x 10⁵ 세포/웰을 1 ㎍/ml의 항-CD28(BD 바이오사이언스)로 보충된 완전 RPMI에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 항-ST2 Ab 또는 이소타입 대조군 Ab(0 내지 10 ㎍/ml)의 연속 희석물로 30 분간 처리한 다음, 200 ㎕의 총 부피로, 10 ng/ml의 IL33(페프로테크)으로 재자극한 후, 5% CO₂ 하에 37 ℃에서 64 시간 동안 배양하였다. IL-5/IL-3 ELISA(알앤디 시스템즈)를 위해 상등액을 수거하였다. ra170의 경우, IC₅₀ 값은 IL-5에 대해 2.77±2.58 nM(평균±SD, n=6) 및 IL-3에 대해 1.10±1.05(평균±SD, n=5)인 것으로 측정되었다.

실시예 11

사이노몰구스 NK 세포 분석

말초혈 단핵 세포(PBMC)를 사이노몰구스 원숭이로부터 피콜 하이팩 밀도 구배에 의해 분리하였다. 세포를 2 mM EDTA를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 세척한 후, 세포를 0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 1회 세척하였다. PBMC로부터 NK 세포를 분리한 후, 비-인간 영장류 CD56 마이크로비즈(밀테니 바이오텍) 및 오토MACS(등록상표) 분리기에 의한 자력 분리에 의해 단핵구 고갈 후 비-인간 영장류 CD16 마이크로비즈 양성 선별을 하였다. 농축된 NK 세포를 완전 RPMI 1640(10% FCS, 2-머캅토에탄올, L-글루타민, 나트륨 피루베이트, 비-필수 아미노산 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)을 사용하여 3회 세척하고, 재현탁하고, 완전 RPMI 중에서 96 웰 환저 플레이트에 2.5 x 10⁴ 세포/웰로 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 항-ST2 Ab 또는 이소타입 대조군 Ab(0 내지 10 ㎍/ml)의 연속 희석물로 30 분간 처리하고, 200 ㎕의 총 부피로, 20 ng/ml의 인간 IL33 및 10 ng/ml의 재조합 사이노몰구스 IL-12로 재자극한 후, 5% CO₂ 하에 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 사이노몰구스 IFNγ ELISA(MabTech)를 위해 상등액을 수거하였다. ra170의 경우 IC₅₀ 값은 0.109±0.073 nM(평균±SD, n=3)인 것으로 측정되었다.

실시예 12

호염기구 세포주( KU812 ) 분석

인간 호염기구 세포주 KU812(ATCC CRL 2099)를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 RPMI 1640에서 배양하였다. 세포를 50 만개 세포/ml 이하의 세포 밀도하에 일주일에 2회 분열시켰다. 특성 검사는 c-키트 및 FceRI의 세포 표면 발현의 FACS 분석에 의해 통상적으로 수행하였다. 분석일에, KU812 세포(20만개 세포/웰)를 새로운 완전 배지를 함유한 96-웰 환저 배양 플레이트에 접종하였다. 세포를 37 ℃에서 항체 또는 대조군 이소타입의 연속 희석물로 1 시간 동안 처리하였다. 처리 후에, 세포를 37 ℃ 배양기에서 10 ng/ml IL-33(페프로테크)으로 밤새 자극하였다. 세포를 스핀 다운시키고 상등액을 사이토카인 분석을 위해 수거하였다. 사이토카인(IL-5, IL-3 및 GM-CSF)은 MSD 제조사 절차에 따라 분석하였다. ra170의 경우, 3회의 독립적 실험으로부터의 IC₅₀ 값은 3.49±3.43 nM (평균±SD, IL-13), 1.48±0.75 nM(평균±SD, IL-5) 및 1.31±1.22 nM(평균±SD, GM-CSF)인 것으로 측정되었다. ra170의 경우, IC₉₀ 값은 7.51±0.99 nM (평균±SD, IL-13), 4.60±1.65 nM(평균±SD, IL-5) 및 9.10±4.74 nM(평균±SD, GM-CSF)인 것으로 측정되었다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibodies against human IL33R and uses thereof <130> 27240 FT <140> PCT/EP2012/052979 <141> 2012-02-22 <150> EP11155684.1 <151> 2011-02-23 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 1 Asp Gln Tyr Arg Ser Ser Gly Val Ser Asp Tyr Asp Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Tyr Ile Trp Ser Asp Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 3 Ser His Asp Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 4 Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp Ala Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 5 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 6 Gln Ser Ser Gln Ser Val Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 7 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly 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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp 85 90 95 Asp Ala Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, Mab ra170 10.12 and 11.12 <400> 31 Arg Ser Ser Gln Ser Val Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, Mab ra170 10.12 and 11.12 <400> 32 Lys Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, Mab ra170 10.12 and 11.12 <400> 33 Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp Ala Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 34 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 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Claims

중쇄 가변 도메인이 서열번호 1의 CDR3 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역 및 서열번호 3의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 4의 CDR3 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역 및 서열번호 6의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 IL33R에 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서,
중쇄 가변 도메인이 서열번호 7을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 2 항에 있어서,
중쇄 가변 도메인이 서열번호 7을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 8을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 3 항에 있어서,
키메라, 인간화 또는 T 세포 에피토프 결핍 항체 변이체인 것을 특징으로 하는 항체.
중쇄 가변 도메인이 서열번호 24의 CDR3 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함하는 인간화 변이체인 것을 특징으로 하는, 인간 IL33R에 결합하는 항체.
중쇄 가변 도메인이 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 27의 CDR2 영역 및 서열번호 26의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함하는 인간화 변이체인 것을 특징으로 하는, 인간 IL33R에 결합하는 항체.
제 5 항에 있어서,
중쇄 가변 도메인이 서열번호 21을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 7 항에 있어서,
중쇄 가변 도메인이 서열번호 21을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 30을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 6 항에 있어서,
중쇄 가변 도메인이 서열번호 25를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 9 항에 있어서,
중쇄 가변 도메인이 서열번호 25를 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 30을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 위치 216 내지 240에서의 힌지 영역, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG1 또는 IgG4 이소타입인 것을 특징으로 하는 항체.
아미노산 위치 216 내지 240에서의 힌지 영역, 및/또는 C_H2와 C_H3 사이의 아미노산 위치 327 내지 331에서의 제 2의 도메인간 영역에서 변형된 인간 IgG1 또는 IgG4 이소타입인, 제 3 항에 따른 항체가 결합하는 것과 동일한 IL33R 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 인간 IL33R에 결합하는 항체.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
아미노산 위치 234에서 류신을 대신하는 알라닌 및 아미노산 위치 235에서 류신을 대신하는 알라닌의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
아미노산 위치 235에서 류신을 대신하는 글루탐산 및 아미노산 위치 228에서 세린을 대신하는 프롤린의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 3 항에 따른 항체가 결합하는 것과 동일한 IL33R 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
약학 조성물의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
약학 조성물의 제조를 위한, 제 3 항에 따른 항체가 결합하는 것과 동일한 IL33R 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체의 용도.
류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식의 치료를 위한, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 또는 천식의 치료를 위한, 제 3 항에 따른 항체가 결합하는 것과 동일한 IL33R 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체의 용도.
항체가 서열번호 1의 중쇄 CDR3 영역, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 영역, 서열번호 3의 중쇄 CDR1 영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR3 영역, 서열번호 5의 경쇄 CDR2 영역 및 서열번호 6의 경쇄 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산.
항체가 서열번호 24의 CDR3 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산.
항체가 서열번호 28의 CDR3 영역, 서열번호 27의 CDR2 영역 및 서열번호 26의 CDR1 영역을 포함하고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 33의 CDR3 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역 및 서열번호 31의 CDR1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산.
원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 IL33R에 결합하는 항체의 발현을 위한, 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 발현시키고 상기 세포 또는 세포 배양 상등액으로부터 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는, IL33R에 결합하는 재조합 항체의 제조 방법.