KR20140014382A - 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 - Google Patents

이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20140014382A
KR20140014382A KR1020117028863A KR20117028863A KR20140014382A KR 20140014382 A KR20140014382 A KR 20140014382A KR 1020117028863 A KR1020117028863 A KR 1020117028863A KR 20117028863 A KR20117028863 A KR 20117028863A KR 20140014382 A KR20140014382 A KR 20140014382A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
fragment
binding
antibody
parent antibody
Prior art date
Application number
KR1020117028863A
Other languages
English (en)
Inventor
타리크 가유르
수잔 이. 브로피
수실 지. 데바레
프랭크 씨. 그레니어
제프리 에이. 무어
차오차오 루안
세르게이 와이. 테틴
제니퍼 엠. 스테인하우스
준지엔 리우
살만 알리
히나 엔. 시에드
Original Assignee
애브비 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 애브비 인코포레이티드 filed Critical 애브비 인코포레이티드
Publication of KR20140014382A publication Critical patent/KR20140014382A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

가공된 다가 및 다특이적 결합 단백질, 이의 제조 방법, 및 특히 질환의 예방, 진단 및/또는 치료에 사용하기 위한 이의 용도.

Description

이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도{Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof}
관련 출원의 전후 참조
본 출원은 2009년 5월 1일자로 출원된 미국 가 특허원 제61/174,800호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 특허원은 특정한 목적으로 이의 전문이 본원에 참조문헌으로 표현되어 포함된다.
기술분야
본 기재내용은 다가 및 다특이적 결합 단백질, 이의 제조 방법 및 특히, 급성 및 만성 염증 질환, 암 및 기타 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
배경
2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 다특이적 항체와 같이 가공된 단백질은 당업계에 공지되어 있다. 당해 다특이적 결합 단백질은 세포 융합, 화학적 접합 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
이특이적 항체는 이특이적 항체의 목적하는 특이성을 갖는 쥐 모노클로날 항체(mAb)를 발현하는 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합을 기초로 하는 쿼드로마(quadroma) 기술 (문헌참조: Milstein, C. and Cuello, A.C.(1983) Nature 305(5934): p. 537-40)을 사용하여 제조되었다. 수득한 하이브리드-하이브리도마(또는 쿼드로마) 세포주내에서 2개의 상이한 면역글로불린(Ig) 중쇄 및 경쇄의 무작위 쌍 형성 때문에, 10개 이하의 상이한 Ig 종이 제조되고 이중에 하나만이 기능성 이특이적 항체이다. 잘못된 쌍을 형성한 부산물의 존재 및 상당히 감소된 생산 수율은 정교한 정제 과정이 요구됨을 의미한다.
이특이적 항체는 2개의 상이한 mAb의 화학적 접합에 의해 제조될 수 있다 (문헌참조: Staerz, U.D. et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31). 당해 방법은 균질의 제제를 생성시키지 못한다. 다른 방법은 2개의 상이한 mAb 또는 보다 소형의 항체 단편의 화학적 접합을 사용하였다(문헌참조: Brennan, M. et al.(1985) Science 229(4708): 81-3).
이특이적 항체를 생성하기 위해 사용되는 또 다른 방법은 이종 이기능성 가교링커를 사용하여 2개의 모 항체를 커플링시키는 것이지만 수득한 이특이적 항체는 가교링커와 모 항체의 반응이 부위 특이적이지 않기 때문에 분자적으로 상당히 이종성이다. 이특이적 항체의 보다 균질의 제제를 수득하기 위해, 2개의 상이한 Fab 단편은 부위 특이적 방식으로 이들의 힌지 시스테인 잔기에서 화학적으로 가교결합되었다(문헌참조: Glennie, M.J. et al.(1987) J. Immunol. 139(7): 2367-75). 그러나, 이러한 방법으로는 완전한 IgG 분자가 아닌 Fab'2 단편이 수득된다.
광범위한 기타 재조합 이특이적 항체 포맷이 최근에 개발되었다(문헌참조: Kriangkum, J. et al.(2001) Biomol. Engin. 2001. 18(2): 31-40). 이들 중에서, 탠덤(tandem) 단일쇄 Fv 분자 및 디아바디(diabody) 및 이의 다양한 유도체가 가장 광범위하게 사용된다. 통상적으로, 이들 분자의 작제는 상이한 항원을 인지하는 2개의 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로부터 시작된다(문헌참조: Economides, A.N. et al.(2003) Nat. Med. 9(1): 47-52). 탠덤 scFv 분자(taFv)는 추가의 펩타이드 링커를 사용하여 단순히 2개의 scFv 분자를 연결하는 곧은 포맷을 나타낸다. 탠덤 scFv 분자에 존재하는 2개의 scFv 단편은 분리된 폴딩 실체를 형성한다. 다양한 링커를 사용하여 2개의 scFv 단편을 연결시킬 수 있고 링커의 길이는 63개 이하의 잔기이다(문헌참조: Nakanishi, K. et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19: 423-74). 모 scFv 단편은 보통 세균에서 가용성 형태로 발현될 수 있지만 탠덤 scFv 분자는 흔히 세균에서 불용성 응집체를 형성하는 것으로 관찰된다. 따라서, 재폴딩 프로토콜 또는 포유동물 발현 시스템의 사용이 가용성 탠덤 scFv 분자를 제조하는데 적용된다. 최근 연구에서, CD28 및 흑색종 관련 프로테오글리캔에 대해 지시된 탠덤 scFv의 유전자 전이 래빗 및 소에 의한 생체내 발현이 보고되었다(문헌참조: Gracie, J.A. et al.(1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401). 당해 작제에서, 2개의 scFv 분자는 CH1 링커에 의해 연결되고 이특이적 항체의 혈청 농도는 100mg/L 이하인 것으로 밝혀졌다. 도메인 정렬의 변이 및 다양한 길이 또는 유연성을 갖는 중간 링커의 사용을 포함하는 다양한 전략을 사용하여 세균에서 가용성으로 발현시킬 수 있었다. 현재 몇몇 연구가 세균에서, 매우 짧은 Ala3 링커 또는 긴 글라이신/세린 풍부 링커를 사용한 가용성 탠덤 scFv 분자의 발현을 보고하였다(문헌참조: Leung, B.P. et al. (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito, A., et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4802-9; Karni, A. et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2): 134-40). 최근 연구에서, 길이가 3개 또는 6개 잔기인 무작위 중간 링커를 포함하는 탠덤 scFv 레퍼토리의 파아지 디스플레이를 사용하여 세균에서 가용성 및 활성 형태로 생성되는 분자를 집적시켰다. 당해 방법으로 6개의 아미노산 잔기 링커를 갖는 탠덤 scFv 분자를 분리하였다 (문헌참조: Arndt, M. and Krauss, J. (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305-21). 당해 링커 서열이 탠덤 scFv 분자의 가용성 발현을 위한 일반적인 해결책이 되는지는 불명확하다. 하지만, 당해 연구는 지시된 돌연변이 유발과 병용하여 탠덤 scFv 분자의 파아지 디스플레이가 세균에서 활성 형태로 발현될 수 있는 분자를 집적시키기 위한 강력한 도구임을 입증하였다.
이특이적 디아바디 (Db)는 발현을 위해 디아바디 포맷을 사용한다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 링커의 길이를 약 5개의 잔기로 감소시킴에 의해 scFv 단편들로부터 제조된다(문헌참조: Peipp, M. and Valerius, T. (2002) Biochem. Soc. Trans. 2002. 30(4): 507-11). 당해 링커 크기의 감소는 VH와 VL 도메인의 교차 쌍 형성에 의한 2개의 폴리펩타이드 쇄의 이량체화를 촉진시킨다. 이특이적 디아바디는 동일 세포내에서 VHA-VLB 및 VHB-VLA의 구조 (VH-VL 배열), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA의 구조 (VL-VH 배열) 중 어느 하나를 갖는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 발현시킴에 의해 제조된다. 다수의 광범위한 상이한 이특이적 디아바디가 과거에 제조되었었고 이들 대부분은 세균에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 그러나, 최근 비교 연구는 가변성 도메인의 배향이 활성 결합부위의 발현 및 형성에 영향을 줄 수 있음을 입증한다(문헌참조: Mack, M. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15): 7021-5). 하지만, 세균에서 가용성 발현은 탠덤 scFv 분자에 비해 중요한 이점을 나타낸다. 그러나, 2개의 상이한 폴리펩타이드 쇄는 단일 세포내에서 발현되기 때문에, 불활성 동종이량체가 활성 이종이량체와 함께 생성될 수 있다. 이로써, 이특이적 디아바디의 균질의 제제를 수득하기 위해서는 추가의 정제 단계의 수행이 필요하다. 이특이적 디아바디를 생성시키는 한가지 방법은 크놉-인투-홀(knob-into-hole) 디아바디를 생성시키는 것이다(문헌참조: Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-8.18). 이는 HER2 및 CD3에 대해 지시된 이특이적 디아바디에 대해 입증되었다. Val37을 Phe로 대체하고 Leu45를 Trp로 대체함에 의해 대형 크놉이 VH 도메인에 도입되었고 항-HER2 또는 항-CD3 가변 도메인에서, Phe98을 Met로 돌연변이시키고 Tyr87을 Ala로 돌연변이시킴에 의해 상보적인 홀을 VL 도메인에 생성시켰다. 당해 방법을 사용함에 의해 이특이적 디아바디의 생산은 모 디아바디에 의한 72%에서 크놉 인투 홀 디아바디에 의해 90% 이상으로 증가될 수 있었다. 중요하게도, 생산 수율은 이들 돌연변이 결과로서 단지 약간 감소하였다. 그러나, 몇몇 분석된 작제물에 대해서 항원 결합 활성의 감소가 관찰되었다. 따라서, 이것은 당해 방법이 결합 활성이 변형되지 않은 이종이량체성 분자를 생산하는 돌연변이를 동정하기 위해 다양한 작제물의 분석을 필요로 함을 시사한다. 또한, 당해 방법은 생체내 안정성이 불량하고 약리역학이 바람직하지 못한 불변 영역에서의 면역글로불린 서열을 돌연변이로 변형시킴에 따라서 면역원성을 증가시킬 수 있는 비고유 및 비천연 형태의 항체 서열을 제조할 필요가 있다.
단일쇄 디아바디 (scDb)는 이특이적 디아바디형 분자(diabody-like molecule)의 형성을 개선시키기 위한 또 다른 전략을 제공한다(문헌참조: Holliger, P. and Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M. et al.(1996) Immunotechnology 2(1): 21-36). 이특이적 단일쇄 디아바디는 길이가 약 15개 아미노산 잔기인 추가의 중간 링커를 사용하여 2개의 디아바디 형성 폴리펩타이드를 연결시킴에 의해 제조된다. 결론적으로, 단량체 단일쇄 디아바디에 상응하는 분자량(50-60 kDa)을 갖는 모든 분자는 이특이적이다. 몇몇 연구는 이특이적 단일 쇄 디아바디가 세균에서 가용성 및 활성 형태로 발현되고 다수의 정제된 분자가 단량체로서 존재함을 입증하였다 (문헌참조: Holliger, P. and Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M. et al.(1996) Immunotechnology. 2(1): 21-36; Pluckthun, A. and Pack, P. (1997) Immunotechnology. 3(2): 83-105; Ridgway, J.B. et al.(1996) Protein Engin. 9(7): 617-21). 따라서, 단일쇄 디아바디는 탠덤 scFv의 이점(모든 단량체는 이특이적이다)과 디아바디의 이점(세균에서 가용성 발현)을 갖는다.
보다 최근에, 디아바디는 Fc로 융합되어 이중-디아바디로 호칭되는 보다 Ig와 유사한 분자를 제조하였다(문헌참조: Lu, D. et al.(2004) J Biol Chem 279(4): 2856-65). 또한, IgG의 중쇄에서 2개의 Fab 반복체를 포함하고 4개의 항원 분자와 결합할 수 있는 다가의 항체 작제물이 보고되었다(문헌참조: PCT 공보 제WO 0177342A1호, 및 Miller, K. et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61).
당업계에서는 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 개선된 다가 결합 단백질이 요구된다. 미국 특허 제7,612,181호는 고 친화도로 2개 이상의 항원에 결합할 수 있고, 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-IgTM)으로 호칭되는, 신규 계열의 결합 단백질을 제공한다. 본 기재내용은 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 추가의 신규 결합 단백질을 제공한다.
본 기재내용은 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 다가 결합 단백질에 관한 것이다. 본 기재내용은 고 친화도로 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 신규 계열의 결합 단백질을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 기재내용은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 폴리펩타이드이고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다]을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 하나의 양태에서, 결합 단백질의 VD1 및 VD2는 중쇄 가변 도메인이다. 또 다른 양태에서, 중쇄 가변 도메인은 쥐 중쇄 가변 도메인, 인간 중쇄 가변 도메인, CDR 접목 중쇄 가변 도메인 및 인간화된 중쇄 가변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, VD1 및 VD2는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, VD1 및 VD2는 상이한 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, C는 중쇄 불변 도메인이다. 예를 들어, X1은 링커이고, 단 X1은 CH1이 아니다. 예를 들어, X1은 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 2); AKTTPKLGG(서열번호 3); SAKTTPKLGG(서열번호 4); SAKTTP(서열번호 5); RADAAP (서열번호 6); RADAAPTVS (서열번호 7); RADAAAAGGPGS (서열번호 8); RADAAAA(G4S)4 (서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV (서열번호 10); ADAAP (서열번호 11); ADAAPTVSIFPP (서열번호 12); TVAAP (서열번호 13); TVAAPSVFIFPP (서열번호 14); QPKAAP (서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP (서열번호 16); AKTTPP (서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP (서열번호 18); AKTTAP (서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP (서열번호 20); ASTKGP (서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP (서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 23); GENKVEYAPALMALS (서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS (서열번호 25); GHEAAAVMQVQYPAS (서열번호 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(서열번호 27); 및 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(서열번호 28)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커이다. 하나의 양태에서, X2는 Fc 영역이다. 또 다른 양태에서, X2는 변이 Fc 영역이다.
하나의 양태에서, 상기 결합 단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
하나의 양태에서, 결합 단백질의 VD1 및 VD2는 경쇄 가변 도메인이다. 하나의 양태에서, 경쇄 가변 도메인은 쥐 경쇄 가변 도메인, 인간 경쇄 가변 도메인, CDR 접목 경쇄 가변 도메인 및 인간화된 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, VD1 및 VD2는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, VD1 및 VD2는 상이한 항원에 결합할 수 있다. 하나의 양태에서, C는 경쇄 불변 도메인이다. 또 다른 양태에서, X1은 링커이고, 단 X1은 CL1이 아니다. 하나의 양태에서, X1은 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 2); AKTTPKLGG(서열번호 3); SAKTTPKLGG(서열번호 4); SAKTTP(서열번호 5); RADAAP (서열번호 6); RADAAPTVS (서열번호 7); RADAAAAGGPGS (서열번호 8); RADAAAA(G4S)4 (서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV (서열번호 10); ADAAP (서열번호 11); ADAAPTVSIFPP (서열번호 12); TVAAP (서열번호 13); TVAAPSVFIFPP (서열번호 14); QPKAAP (서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP (서열번호 16); AKTTPP (서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP (서열번호 18); AKTTAP (서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP (서열번호 20); ASTKGP (서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP (서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 23); GENKVEYAPALMALS (서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS (서열번호 25); GHEAAAVMQVQYPAS (서열번호 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (서열번호 27); 및 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (서열번호 28)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커이다.
하나의 양태에서, 결합 단백질은 X2를 포함하지 않는다.
하나의 양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 둘 다는 동일한 링커를 포함한다. 또 다른 양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 상이한 링커를 포함한다. 또 다른 양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 둘다는 짧은(약 6개 아미노산) 링커를 포함한다. 또 다른 양태에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 둘다는 긴(6개 초과의 아미노산) 링커를 포함한다. 또 다른 양태에서, 가변 중쇄는 짧은 링커를 포함하고, 가변 경쇄는 긴 링커를 포함한다. 또 다른 양태에서, 가변 중쇄는 긴 링커를 포함하고, 가변 경쇄는 짧은 링커를 포함한다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 결합 단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다]을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용은 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 제공하고, 이때, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역이다]를 포함하고; 제2 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다]를 포함한다. 특히 바람직하게, 이원 가변 도메인 (DVD) 결합 단백질은 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때, 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄 각각은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역이다]을 포함하고; 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄 각각은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다]를 포함한다. 이러한 DVD 단백질은 4개의 항원 결합부위를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 결합 단백질은 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 하나의 양태에서, 당해 표적은 사이토킨, 세포 표면 단백질, 효소 및 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 결합 단백질은 하나 이상의 표적의 생물학적 기능을 조절할 수 있다. 또 다른 양태에서, 결합 단백질은 하나 이상의 표적을 중화시킬 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질은 림포킨, 모노킨 및 폴리펩타이드 호르몬, 수용체 및 종양 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사이토킨과 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 기재내용의 DVD-Ig는 다음 중 2개 이상(예를 들면, 각각의 하나 포함)에 결합할 수 있다: 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL), 인간 면역결핍성 바이러스(HIV), 인터루킨 18(IL-18), 뇌 나트륨뇨배설 펩타이드(BNP), 및 트로포닌 I(TnI)(또한 표 2 참조). 특정 양태에서, 결합 단백질은 NGAL 및 NGAL; HIV 및 HIV; NGAL 및 IL-18; BNP 및 BNP; 및 TnI 및 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 표적의 쌍에 결합할 수 있다.
하나의 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 51, 53 및 55로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 52, 54 및 56으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 51의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 52의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 두번째 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 53의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 54의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 세번째 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 55의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 56의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 3)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 57 및 59로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 58 및 60으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 3)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 57의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 58의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 3)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 59의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 60의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 3)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 역 배향을 지니며 서열번호 61 및 63으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 62 및 64으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 3)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 61의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 62의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, HIV(서열번호 1)와 HIV(서열번호 3)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 63의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 64의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 65 및 67로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 66 및 68로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 65의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 66의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 두번째 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 67의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 68의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, NGAL(서열번호 2)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 69 및 71로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 70 및 72로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, NGAL(서열번호 2)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 69의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 70의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 두번째 양태에서, NGAL(서열번호 2)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 71의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 72의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 73 및 75로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 74 및 76으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 73의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 74의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 75의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 76의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 역 배향을 가지며 서열번호 77 및 79로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 78 및 80으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 77의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 78의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 NGAL(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 79의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 80의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 81, 83 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 82, 84 및 86으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 81의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 82의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 83의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 84의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 85의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 86의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 역 배향을 지니며 서열번호 87, 89 및 91로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 88, 90 및 92로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 87의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 88의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 89의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 90의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, NGAL(서열번호 1)과 IL-18(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 91의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 92의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, BNP(서열번호 1)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 93 및 서열번호 95로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 94와 서열번호 96으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, BNP(서열번호 1)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 93의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 94의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 두번째 양태에서, BNP(서열번호 1)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 95의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 96의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, BNP(서열번호 2)와 BNP(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 97의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 98의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, BNP(서열번호 2)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 99 및 서열번호 101로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 100 및 서열번호 102로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, BNP(서열번호 2)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 99의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 100의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, BNP(서열번호 2)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 101의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 102의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, BNP(서열번호 2)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 103 및 서열번호 105로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 104 및 서열번호 106으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, BNP(서열번호 2)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 103의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 104의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, BNP(서열번호 2)와 BNP(서열번호 1)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 105의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 106의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, BNP(서열번호 4)와 BNP(서열번호 4)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 107의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 108의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, HIV(서열번호 2)와 HIV(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 109와 서열번호 111로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 110과 서열번호 112로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, HIV(서열번호 2)와 HIV(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 109의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 110의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 두번째 양태에서, HIV(서열번호 2)와 HIV(서열번호 2)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 111의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 112의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, HIV(서열번호 4)와 HIV(서열번호 4)에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 113의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 114의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, TnI와 TnI에 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 115의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 116의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 기재내용은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는, 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고; C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하고; (X2)n은 Fc 영역이고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 하나의 양태에서, Fc 영역은 결합 단백질로부터 부재이다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 하나의 양태에서, (X2)n은 결합 단백질로부터 부재이다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용의의 결합 단백질은 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역이고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄, 및 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 결합 단백질은 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄 및 2개의 제2 폴리펩타이드를 쇄를 포함한다. 또 다른 양태에서, (X2)n은 제2 폴리펩타이드로부터 부재이다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩타이드에 존재하는 경우 Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역 및 변이 서열 Fc 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, Fc 영역은 IgG1으로부터의 Fc 영역, IgG2로부터의 Fc 영역, IgG3로부터의 Fc 영역, IgG4로부터의 Fc 영역, IgA로부터의 Fc 영역, IgM으로부터의 Fc 영역, IgE로부터의 Fc 영역, 및 IgD로부터의 Fc 영역으로이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은, 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄 각각이 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역이고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하고, 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄 각각은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 2개의 항원과 결합할 수 있는 DVD-Ig이다.
본 기재내용은 모 항체를 미리 선별함에 의해 DVD-Ig 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 2개의 항원과 결합할 수 있는 DVD-Ig를 제조하는 방법은 a) 제1 항원과 결합할 수 있는 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득하는 단계; b) 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있고 제2 항원과 결합할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)를 수득하는 단계; c) 각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역이고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계; d) 각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계; 및 e) 상기 제1 항원 및 상기 제2 항원과 결합할 수 있는 DV-Ig가 생성되도록 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 발현시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용은 목적하는 성질을 갖는 2개의 항원에 결합할 수 있는 DVD-Ig를 제조하는 방법을 제공하고, 당해 방법은 a) 제1 항원에 결합할 수 있고 이원 가변 도메인 면역글로불린에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)를 수득하는 단계; b) 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있고, 제2 항원과 결합할 수 있으며, 이원 가변 도메인 면역글로불린에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)를 수득하는 단계; c) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역이고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계; d) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 링커이고, 단 이것이 CH1이 아닌 경우 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재이고; (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고 이때 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재이다]를 포함하는 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계; 및 e) 바람직한 특성을 갖는 상기 제1 및 제2 항원에 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 면역글로불린이 생성되도록 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 발현시키는 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 VDI는 동일한 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된다. 다른 양태에서, 본원에 기재된 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 VDI는 상이한 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된다. 다른 양태에서, 본원에 기재된 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 VD2는 동일한 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된다. 다른 양태에서, 제1 및 제2폴리펩타이드 쇄는 상이한 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된다.
하나의 양태에서 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 동일한 항체이다. 다른 양태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 및 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 상이한 항체이다.
하나의 양태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 제1 항원과 결합하고 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 제2 항원과 결합한다. 특정 양태에서, 제1 및 제2 항원은 동일한 항원이다. 또 다른 양태에서, 모 항체는 동일한 항원상에 상이한 에피토프와 결합한다. 또 다른 양태에서 제1 및 제2 항원은 상이한 항원이다. 또 다른 양태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 제2 항원과 결합하는 효능과는 상이한 효능으로 제1 항원과 결합한다. 또 다른 양태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부는, 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 제2 항원과 결합하는 친화도와 상이한 친화도로 제1 항원과 결합한다.
다른 양태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 및 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 인간 항체, CDR 접목 항체 및 인간화된 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 항원 결합부는 Fab 단편; F(ab')2 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; dAb 단편; 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 단일쇄 항체; 및 디아바디로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 또는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는다. 또한, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 및 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 DVD-Ig에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는다. 하나의 양태에서, 당해 목적하는 성질은 하나 이상의 항체 파라미터로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 당해 항체 파라미터는 항원 특이성, 항원에 대한 친화도, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인지, 안정성, 가용성, 생산 효율, 면역원성, 약리역학, 생체 이용률, 조직 교차 반응성 및 이종상동성 항원 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 결합 단백질은 다가이다. 또 다른 양태에서, 결합 단백질은 다특이적이다. 본원에 기재된 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질은 특히 치료학적 관점에서 바람직할 수 있는 성질을 갖는다. 예를 들어, 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질은 (1) 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체 보다 신속하게 내재화(및/또는 동화)될 수 있고; (2) 효능제 항체일 수 있고/있거나 (3) 다가 항체가 결합할 수 있는 항원을 발현하는 세포의 세포사 및/또는 아폽토시스를 유발할 수 있다. 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질의 하나 이상의 항원 결합 특이성을 제공하는 "모 항체"는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화(및/또는 동화)되는 것일 수 있고/있거나 효능제, 세포사 유도 및/또는 아폽토시스 유도 항체일 수 있고 본원에 기재된 바와 같은 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질은 이들 성질중 하나 이상이 개선됨을 나타낼 수 있다. 더욱이, 모 항체는 이들 성질중 임의의 하나 이상이 결여될 수 있지만 본원에 기재된 바와 같은 다가 결합 단백질로서 작제되는 경우 이들 성질들이 부여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 하나 이상의 표적에 대해 약 102M-1s-1 이상; 약 103M-1s-1 이상; 약 104M-1s-1 이상; 약 105M-1s-1 이상 및 약 106M-1s-1 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합율 상수(Kon)를 갖는다. 하나의 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 하나 이상의 표적에 대해 약 102M-1s-1 내지 약 103M-1s-1; 약 103M-1s-1 내지 약 104M-1s-1; 약 104M-1s-1 내지 약 105M-1s-1 또는 약 105M-1s-1 내지 약 106M-1s-1의 Kon을 갖는다.
또 다른 양태에서, 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 하나 이상의 표적에 대해 약 10-3s-1 이하; 약 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하 및 약 10-6s-1 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 해리율 상수(Koff)를 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, 하나 이상의 표적에 대해 약 10-3s-1 내지 약 10-4s-1; 약 10-4s-1 내지 약 10-5s-1 또는 약 10-5s-1 내지 약 10-6s-1의 Koff를 갖는다.
또 다른 양태에서, 결합 단백질은 하나 이상의 표적에 대해 약 10-7 M 이하; 약 10-8 M 이하; 약 10-9 M 이하; 약 10-10 M 이하; 약 10-11 M 이하; 약 10-12 M 이하 및 약 10-13 M 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 해리 상수(KD)를 갖는다. 하나의 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은 이의 표적에 대해 약 10-7 M 내지 약 10-8 M; 약 10-8 M 내지 약 10-9 M; 약 10-9 M 내지 약 10-10 M; 약 10-10M 내지 약 10-11 M; 약 10-11 M 내지 약 10-12 M; 또는 약 10-12 M 내지 약 10-13 M의 KD를 갖는다.
또 다른 양태에서, 상기된 결합 단백질은 면역부착 분자, 이미지화 제제, 치료제 및 세포독성 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제를 포함하는 접합체이다. 하나의 양태에서, 이미지화 제제는 방사선표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생발광 표지, 자기 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 이미지화 제제는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방사선표지이다. 또 다른 양태에서, 치료제 또는 세포독성 제제는 항 대사물, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스 유발 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 상기된 결합 단백질은 결정화된 결합 단백질이고 결정으로서 존재한다. 하나의 양태에서, 결정은 담체 부재의 제어 방출 약제학적 결정이다. 또 다른 양태에서, 결정화된 결합 단백질은 당해 결합 단백질의 가용성 대응물보다 생체내에서 보다 큰 반감기를 갖는다. 또 다른 양태에서, 결정화된 결합 단백질은 생물학적 활성을 보유한다.
또 다른 양태에서, 상기된 결합 단백질은 당화된다. 예를 들어, 당화는 인간 당화 패턴이다.
본 기재내용의 한 측면은 상기된 결합 단백질중 임의의 하나를 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 추가의 양태는 상기된 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하고 이때, 벡터는 pcDNA; pTT (Durocher et al., (2002) Nucl. Acids Res. 30, No.2); pTT3 (추가의 다중 클로닝 부위를 갖는 pTT); pEFBOS (Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucl. Acids Res. 18: 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6TOPO 및 pBJ으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 벡터는 미국특허공보 제2009/0239259호에 기재된 벡터이다.
또 다른 측면에서, 숙주 세포는 상기된 벡터로 형질전환된다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 이.콜라이(E. coli)이다. 관련 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 양태에서, 진핵 세포는 원생 생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 CHO, COS, NS0, SP2, PER.C6을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 세포; 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 진균류 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포이다.
본 기재내용의 또 다른 측면은 상기된 숙주 세포중 임의의 하나를 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양함을 포함하는, 상기된 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 당해 방법에 의해 제조되는 결합 단백질중 50% 내지 75%는 이원 특이적 4가 결합 단백질이다. 특정 양태에서, 당해 방법에 의해 제조되는 결합 단백질중 75% 내지 90%는 이원 특이적 4가 결합 단백질이다. 특정 양태에서, 제조되는 결합 단백질중 90% 내지 95%는 이원 특이적 4가 결합 단백질이다.
하나의 양태는 결합 단백질 방출용 조성물을 제공하고 이때 당해 조성물은 상기된 바와 같은 결정화된 결합 단백질 및 성분 및 하나 이상의 중합 담체를 포함하는 제형을 포함한다. 예를 들어, 중합 담체는 폴리(아크릴산), 폴리 (시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(데프시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프롤락톤), 폴리(디옥사논), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리 (하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루론산 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리캔, 황화 폴리에아카라이드, 이의 블렌드 및 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중합체를 포함한다. 예를 들어, 당해 성분은 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 양태는 상기된 유효량의 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
본 기재내용은 또한 상기된 바와 같은 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다. 예를 들어, 추가의 제제는 치료제, 이미지화제, 세포독성 제제, 혈관형성 억제제 (항-VEGF 항체 또는 VEGF-트랩을 포함하지만 이에 제한되지 않음); 키나제 억제제 (KDR 및 TIE-2 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 공동 자극 분자 차단제(항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20을 포함하지만 이에 제한되지 않음); 부착 분자 차단제(항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴 항체, 소분자 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 항-사이토킨 항체 또는 이의 기능성 단편(항-IL-18, 항-TNF, 항-IL-6/사이토킨 수용체 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제, 마약류 비스테로이드 소염 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항 미생물성 제제, 건선치료제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사선 약제, 항우울증제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 및 사이토킨 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 기재내용은 상기된 결합 단백질을 인간 피검체에 투여하여 인간 피검체내 표적 또는 표적들의 활성이 억제되어 치료가 달성됨을 포함하는, 상기된 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적 또는 표적들이 해로운 장애를 앓는 인간 피검체를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 장애는 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환, 대장염, 장 염증 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부경화증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇼엔라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 질환, 다분비선 제I형 결핍증 및 다분비선 제II형 결핍증, 슈미트 증후군, 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 클라미디아증, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽종 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 크움즈 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질환, 만성 점막 피부 칸디다증, 거세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 감마글로불린저혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전증, 조죽 난소부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유조직 폐포염, 후-염증성 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 조합성 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 범발성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판양 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증, 구드패스튜어 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능항진증, 갑상선종증 자가면역 갑상선 기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알콜성 경변, 알콜 유도 간 손상, 콜레오사타티스(choleosatatis), 특이체질성 간 질환, 약물 유도 간염, 비알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, B 그룹 스트렙토코씨(streptococci) (GBS) 감염, 정신 장애(예를 들어, 우울증 및 정신분열증), Th2 형 및 Th1 형 매개 질환, 급성 및 만성 통증(상이한 형태의 통증), 및 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암종 및 조혈 악성종양(백혈병 및 림프종), A베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프성모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전증, 선암종, 공기 이소성 심방박동, AIDS 치매 합병증, 알콜 유도 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-1-안티트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 앙기나 협심증, 전각 세포 퇴화, 항 cd3 치료, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 대동맥 및 말초 결찰증, 대동맥 해부, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥 누공, 운동실조증, 심방세동 (지연 또는 발작성), 심방조동, 동정맥 막힘, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트 림프종, 화상, 심장성 부정맥, 심장성 기절 증후군, 심장 종양, 심근증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌피질 퇴화, 소뇌 장애, 혼란 또는 다초점 심방 빈맥, 화학치료 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알콜증, 만성 염증 병리, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐 심장, 관상 동맥 질환, 크루츠펠트-자콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양 음성 패혈증, 낭섬유증, 사이토킨 치료 관련 장애, 권투선수치매(Dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기 출혈열, 피부염, 피부학적 증상, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환(diabetic ateriosclerotic disease), 광범위 루이체 질환, 확장성 울혈성 심근증, 기저핵 장애, 중년 다운 증후군, CNS 도파민 수용체 차단 약물에 의해 유도된 약물 유도 운동 장애, 약물 과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 피부홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드리히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 장애, 진균류 패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의 기관 또는 조직 이식 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 기관으로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할레로르덴-스파츠 질환(Hallerrorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 고초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성 요독증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 출혈, 간염(A), 히스 다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환, 과운동성 장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동 부족 장애, 시상하부-뇌하수체-부신피질계 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채섬모체염/자궁염/광학적 신경근염, 허혈 관류 손상, 허혈 뇌졸중, 연소성 류마티스 관절염, 연소성 척추 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프피부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌막염, 수막염 균혈증, 대사/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다중 시스템 장애, 복합 연결 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 퇴화(만셀 데제린-토마스 쉬-드라거 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 감염증, 마이코박테리움 결핵, 골수이형성증후군, 심근 경색, 심근 허혈 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근육 위축증, 호중구감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 지류 폐색, 폐색성 동맥 질환, okt3 치료, 고환염/부고환염, 고환염/절관절제술 반전 과정, 기비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부수종양성 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증 질환, 다년성 비염, 심막 질환, 말초 동맥경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 (다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 자간전증, 전진적 상핵 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료, 레이노드 현상 및 질환, 레이노드 질환, 레프섬 질환, 일반 협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 피부경화증, 노인 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구 빈혈증, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌 퇴화, 스트렙토코커스 근염, 소뇌 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 아나팔락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신 개시 연소성 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 말초혈관 확장증, 폐색성 혈전 혈관염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정 앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판 심장 질환, 하지 정맥, 혈관염, 정맥동 질환, 정맥종 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균류 감염, 바이탈 뇌염/무균성 수막염, 바이탈-연관 적혈구식작용 증후군, 웨른니케-코르사코프 증후군, 윌슨 질환, 또는 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 기재내용의 조성물 및 방법으로 치료되거나 진단될 수 있는 질환은 원발성 및 전이성 암을 포함하지만 이에 제한되지 않고 당해 암은 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구인두암, 두경부암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 방광암 및 담관암, 소장암, 뇨관암(신장암, 방광암 및 요상피암을 포함), 여성 생식관암 (경부암, 자궁암 및 난소암, 및 융모막상피종 및 생식 융모상피성 질환), 남성 생식관암 (전립선암, 저정낭암, 고환암 및 생식 세포 종양을 포함), 내분비선암 (갑상선암, 부신암 및 뇌하수체암을 포함), 및 피부암, 및 혈관종, 흑색종, 육종 (골 기원 암 및 연조직 기원의 암 및 카포시 육종을 포함), 뇌암, 신경암, 안구암, 및 수막암 (성상세포종, 신경아교종, 아교모세포종, 망막아세포종, 신경종, 신경아세포종, 양성종양, 및 수막종을 포함), 조혈 악성 종양으로 유래되는 고형 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종(호지킨 및 비호지킨 림프종 둘다)를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 기재내용의 항체 또는 이의 항원 결합부는, 단독으로 사용되는 경우 또는 방사선치료 및/또는 기타 화학치료제와 병용하여 사용되는 경우, 암을 치료하거나 본원에 기재된 종양 기원의 전이의 억제에 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 기재내용은 상기된 결합 단백질중 임의의 하나를 상기 논의된 바와 같은 제2 제제의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여하는 단계를 포함하는, 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 제2 제제는 부데노사이드, 상피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β mAb, 항-IL-6 또는 IL-6 수용체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13 IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF의 항체 또는 효능제, CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이의 리간드의 항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린 제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β전환 효소 억제제, TNFα전환 효소 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염 사이토킨, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, TGFβ, BNP, NGAL, HIV의 억제제 및 TnI로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 상기된 약제학적 조성물은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 캅셀내, 연골내, 강내, 세포내, 소뇌내, 소뇌심실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 일시주사, 질내, 직장, 협측, 설하, 비내 및 경피투여로부터 선택되는 하나 이상의 방식으로 피검체에게 투여된다.
본 기재내용의 한 측면은 본 기재내용의 하나 이상의 결합 단백질에 대한 하나 이상의 항-이디오타입 항체를 제공한다. 항-이디오타입 항체는 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합부의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역 또는 본 기재내용의 결합 단백질에 도입될 수 있는 이의 부분에 제한되지 않지만 이와 같은 하나 이상의 면역글로불린 분자 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다.
시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 단독 또는 IL-18과 조합된 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터(calibrator) 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 결합 단백질 중 하나는 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다. 또한, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 결쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및 (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료는 환자로부터 취할 수 있으며, 이 경우, 당해 방법은 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 추가로 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 다른 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 단독 또는 IL-18과 조합된 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 결합 단백질 중 하나는 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다. 달리는, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및
(ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료가 환자로부터 취한 것인 경우, 당해 방법은 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 또한 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 또 다른 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 단독 또는 IL-18과 조합된 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 결합 단백질 중 하나는 (i') 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)으로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다. 또한, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및 (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료가 환자로부터 기원하는 경우, 당해 방법은 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 또한 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 또 다른 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 2개의 항원 및 적어도 하나의 검출가능한 표지에 결합할 수 있는 적어도 하나의 DVD-Ig를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 DVD-Ig 중 하나는 (i') 4개의 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제3 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)으로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개의 항원(또는 이의 단편)에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다. 달리는, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및 (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 DVD-Ig이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료가 환자로부터 기원하는 경우, 당해 방법은 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 또한 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
또한 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
또한 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 다른 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
여전히 또한, 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 다른 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 여기서 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)으로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
여전히 또한, 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 다른 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') 4개의 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은, 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 여기서 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)으로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개의 항원(또는 이의 단편)에 결합할 수 있는, DVD-Ig를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
도 1a는 이원 가변 도메인(DVD)-Ig 작제물을 도시하고 2개의 모 항체 기원의 DVD-Ig의 제조 전략을 보여준다.
도 1b는 작제물 DVD1-Ig, DVD2-Ig, 및 하이브리도마 클론 2D13.E3 (항-IL-1α) 및 13F5.G5 (항-IL-1β) 기원의 2개의 키메라 단일특이적 항체를 도시한다.
본 기재내용은 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 기재내용은 DVD-Ig를 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포 뿐만 아니라 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig)에 관한 것이다. 시험관내 또는 생체내에서 특이적 항원을 검출하기 위한 본 기재내용의 DVD-Ig를 사용하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 다른 표시가 없는 한, 본 기재내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술적 용어들은 당업자가 통상적으로 알고 있는 의미를 갖는다. 그러나 용어의 의미 및 범위는 임의의 잠재적인 모호성의 경우, 임의의 사전적 또는 외적인 정의에 대해 사전에 제공된 정의로서 명백해야만 한다. 또한, 정황상 다른 필요가 없는 한, 용어의 단수적 표현은 복수도 포함하며, 복수적 표현은 단수도 포함하는 것이다. 본 명세서에서, "또는"는 다른 표시가 없는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는" 및 이러한 유형어, 예컨대 "포함한다" 및 "포함한" 의 용어의 사용은 제한적 의미가 아니다. 또한, "원소" 또는 "성분" 등의 용어도 다른 구체적 표현이 없는 한, 1 유니트를 포함하는 원소 및 성분은 물론 하나 이상의 서브유니트를 포함하는 원소 및 성분들도 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학 및 하이브리드화 등과 관련하여 사용된 용어들은 당업계에 공지되어 있고 공통적으로 사용되는 것이다. 본 기재내용의 방법 및 기술은 당업계에 공지되어 있고, 다른 표시가 없는 한 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 각종 일반 서적 및 구체적인 문헌들에 기술된 바와 같은 통상의 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 공통적으로 수행되거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조자의 지침에 따라 수행한다. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약제 화학과 관련하여 사용된 용어 및 그 실험 절차 및 기술은 당업계에 공지되어 일반적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제, 제형, 전달 및 환자 치료에 대해서도 표준 기술을 사용한다.
본 기재내용을 더 용이하게 이해할 수 있도록 이하에 사용된 용어들의 정의를 정리할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 쇄을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 쇄을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다. 본원의 "폴리펩타이드"의 사용은 달리 언급되지 않는 경우 폴리펩타이드 및 이의 단편 및 변이체(변이체의 단편을 포함하여)를 포괄하는 것으로 의도된다. 항원성 폴리펩타이드에 대해, 폴리펩타이드의 단편은 임의로 폴리펩타이드의 하나 이상의 연속 또는 비선형 에피토프를 함유한다. 하나 이상의 에피토프 단편의 정확한 경계는 당업계의 통상의 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 당해 단편은 약 5개 이상의 연속 아미노산, 예를 들어, 약 10개 이상의 연속 아미노산, 약 15개 이상의 연속 아미노산 또는 약 20개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 폴리펩타이드의 변이체는 본원에 기재된 바와 같다.
"분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"란 용어는 그 기원이나 파생 급원에 따라서 자연 상태일 때 동반되던 자연 관련 성분과 관련되어 있지 않은 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 즉, 동일한 종 유래의 다른 단백질이 실질적으로 없고; 다른 종 유래의 세포에 의해서 발현되거나; 자연에서 발생되지 않는 것이다. 즉, 자연적으로 생성하는 세포와 다른 세포 시스템에서 합성되거나 화학적으로 합성된 폴리펩타이드는 이의 자연 관련 성분에서 "분리된" 것이다. 또한, 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 분리를 통해 자연 관련 성분으로부터 실질적으로 유리될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "회수하는"이란 용어는 당업계에 공지된 단백질 정제 기술 등을 사용하여 분리에 의해 자연 관련 성분이 실질적으로 제거된 폴리펩타이드와 같은 화학종을 제공하는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "생물학적 활성"은 항원의 모든 고유 생물학적 성질을 언급한다(생체내에서 발견되는 바와 같이 천연에 존재하든 또는 재조합 수단에 의해 제공되거나 가능한 경우이든지간에 상관없이). 생물학적 성질은 수용체에 대한 결합; 세포 증식의 유도, 세포 성장의 억제, 기타 사이토킨의 유도, 아폽토시스의 유도 및 효소 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체, 단백질 또는 펩타이드의 제2 화학종과의 상호작용과 관련하여 본 명세서에 사용된 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 그 상호작용이 화학종 상의 특정 구조(예컨대, 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 따라 이루어진다는 것을 의미한다. 예컨대, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하여 여기에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리된 미표지 A)를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에 사용된 "항체"란 용어는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자 또는 이러한 Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 갖는 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변형체 또는 유도체를 의미한다. 이러한 돌연변이체, 변형체 또는 유도체 항체형은 당업계에 공지되어 있다. 이의 비제한된 예에 대해서는 이하에 논의된다.
완전한 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 약어로 HCVR 또는 VH로 표시됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 약어로 LCVR 또는 VL로 표시됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성 영역들로 나뉠 수 있고, 여기에는 골격 영역(FR)이라는 더 보존적인 영역들이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음과 같은 순서에 따라 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 온전한 항체의 파파인 분해에 의해 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역 또는 변이 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 항체 이펙터 기능을 변경시키기 위한 Fc부 내의 아미노산 잔기의 치환은 당업계에 공지되어 있다(미국 특허 5,648,260; 5,624,821). 항체의 Fc 부는 여러 중요한 이펙터 기능, 예컨대 사이토킨 유도, ADCC, 식세포작용, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체와 항원-항체 복합체의 반감기/제거율 등을 매개한다. 몇몇 경우에는 이러한 이펙터 가능이 치료 항체에 바람직하지만, 어떤 다른 경우에는 치료 목적에 따라서 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다. 특정 인간 IgG 아이소타입, 구체적으로 IgG1 및 IgG3은 각각 FcγR 및 보체 C1q에 대한 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 혈행 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 또 다른 양태에서는, 항체의 불변 영역, 예컨대 항체의 Fc 영역에 존재하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 치환되어 이펙터 기능이 변경된 항체가 제공된다. 면역글로불린의 2개의 동일한 중쇄의 이량체화는 CH3 도메인의 이량체화에 의해 매개되고 힌지 영역내에서 디설파이드 결합에 의해 안정화된다(문헌참조: Huber et al.(1976) Nature; 264: 415-20; Thies et al. (1999) J. Mol. Biol.; 293: 67-79). 중쇄-중쇄 디설파이드 결합을 방지하기 위한 힌지 영역내 시스테인 잔기의 돌연변이는 CH3 도메인의 이량체화를 불안정화시킬 것이다. CH3 이량체화에 관여하는 잔기들은 동정되었다(문헌참조: Dall'Acqua(1998) Biochem. 37: 9266-73). 따라서, 1가의 반쪽 Ig를 생성시킬 수 있다. 흥미롭게도, 이들 1가의 반쪽 Ig 분자는 IgG 및 IgA 서브클래스 둘다에 대해 천연에서 발견되었다(문헌참조: Seligman(1978) Ann. Immunol. 129: 855-70.;Biewenga et al(1983) Clin. Exp. Immunol. 51: 395-400). FcRn: Ig Fc 영역의 화학양론은 2:1인 것으로 측정되었고(문헌참조: West et al.(2000) Biochem. 39: 9698-708), 반쪽 Fc는 FcRn 결합을 매개하기에 충분하다(문헌참조: Kim et al.(1994) Eur. J. Immunol.; 24: 542-548). CH3 이량체화에 중요한 잔기가 CH3 베타 쉬트 구조의 내부 접지면상에 존재하는 반면에, FcRn 결합에 관여하는 영역이 CH2-CH3 도메인의 외부 접지면상에 존재하기 때문에, CH3 도메인의 이량체화를 붕괴시키기 위한 돌연변이는 FcRn 결합에 대해 큰 역효과를 나타내지 않을 수 있다. 그러나, 반쪽 Ig-분자는 통상의 항체 크기와 비교하여 이의 더 작은 크기로 인하여 조직 침투에 있어서 특정 이점들을 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 본 기재내용의 결합 단백질의 불변 영역, 예를 들어, Fc 영역에서 치환되어 중쇄의 이량체화가 붕괴되어 반쪽 DVD-Ig 분자가 생성된다.
본 명세서에 사용된 항체의 "항원 결합부"(또는 간단히 "항체부")란 용어는 항원에 대한 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 하나 이상의 항체 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 완전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 항체 양태들은 또한 2개 이상의 다른 항원에 특이적으로 결합할 수 있는--이특이적, 이중 특이적, 또는 다특이적 형일 수 있다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 2개의 Fab 단편이 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 결합되어 있는 이가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체 한쪽 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 하나의 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(Ward (1989) Nature 341: 544-546; 및 PCT 공보 제WO90/05144A1호); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 다른 유전자에 의해 암호화되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자(일본쇄 Fv(scFv)로 알려진 것; 예컨대 Bird et al.(1998) Science 242: 423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)를 형성하고 있는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커를 이용하여 VL 및 VH 영역은 재조합법으로 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원 결합부"라는 용어에도 포함되는 것으로도 간주된다. 단일쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 디아바디(diabody)도 포함된다. 디아바디는 일본쇄 폴리펩타이드에서 VH 및 VL 도메인이 발현되지만, 동일 쇄 상의 두 도메인 사이에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가의 이특이적 항체이다(예컨대, Holliger, P. et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. et al.(1994) Structure 2: 1121-1123). 이러한 항체 결합부는 당업계에 공지되어 있다(문헌참조: Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. pp. 790(ISBN 3-540-41354-5). 추가로, 단일쇄 항체는 또한 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체"를 포함한다(문헌참조: Zapata et al.(1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062 및 미국 특허 제 5,641,870호).
용어 "다가 결합 단백질"은 본원 명세서 전반에 걸쳐 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 지칭하는데 사용된다. 하나의 양태에서, 다가 결합 단백질은 바람직하게 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 가공되고 일반적으로 천연 항체가 아니다. 용어 "다특이적 결합 단백질"은 2개 이상의 관련 또는 비관련 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 언급한다. 본 기재내용의 이원 가변 도메인 (DVD) 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고 4가 또는 다가의 결합 단백질이다. DVD는 즉, 하나의 항원에 결합하는 일특이적이거나 2개 이상의 항원에 결합하는 다특이적일 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig로 언급된다. DVD Ig의 각 반쪽은 하나의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 하나의 경쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각각의 결합 부위는 항원 결합 부위당 항원 결합에 관여하는 총 6개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이특이적 항체,"는 쿼드로마 기술 (문헌참조: Milstein, C. and Cuello, A.C.(1983) Nature 305(5934): p. 537-540), 2개의 상이한 모노클로날 항체의 화학적 접합 (문헌참조: Staerz, U.D. et al.(1985) Nature, 314(6012): 628-631), 또는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하는 크놉 인투 홀 또는 유사한 방법(문헌참조: Holliger, P. et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448)에 의해, 다중의 상이한 면역글로빈 종(이중에 하나만이 작용성 이특이적 항체이다)을 생성시킴으로써 제조되는 완전한 길이의 항체를 언급한다. 분자 기능에 의해, 이특이적 항체는 이의 2개의 결합 암(한쌍의 HC/LC)중 하나상의 하나의 항원(또는 에피토프)에 결합하고 이의 2번째 암(다른 쌍의 HC/LC)상의 다른 항원(또는 에피토프)에 결합한다. 당해 정의에 따라, 이특이적 항체는 2개의 구분된 항원 결합 암(2개 특이성 및 CDR 서열로)을 갖고 이것이 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이원-특이적 항체"는 이의 결합 암(한 쌍의 HC/LC)의 각각에서 2개의 상이한 항원(또는 에피토프)와 결합할 수 있는 완전한 길이의 항체를 언급한다(문헌참조: PCT 공보 제WO 02/02773호). 따라서, 이원-특이적 결합 단백질은 동일한 특이성 및 동일한 CDR 서열을 갖는 2개의 동일한 항원 결합 암을 갖고 이것이 결합하는 각각의 항원에 대해 2가이다.
결합 단백질의 "작용성 항원 결합 부위"는 표적 항원에 결합할 수 있는 부위이다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화도는 근본적으로 항원 결합 부위가 유래된 모 항체 만큼 강하지 않지만 항원에 결합하는 능력은 항원에 결합하는 항체를 평가하기 위해 공지된 다수의 방법중 임의의 하나를 사용하여 측정가능해야만 한다. 더욱이, 본원에서 다가의 항체의 항원 결합 부위의 항원 결합 친화도는 정량적으로 동일할 필요는 없다.
용어 "사이토킨"은 세포간 매개체로서 다른 세포 집단에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적 용어이다. 당해 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 통상적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토킨중에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 호르몬(LH)와 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 - 베타 뮬러리안 억제 물질; 마우스 생식선자극호르몬 관련 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-알파와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자 (TGF); 인슐린형 성장 인자-1 및 -11; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론-알파, -베타 및 -감마 콜로니 자극 인자(CSF)(예를 들어, 대식세포-CSF(M-CSF))와 같은 인터페론; 과립구 대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23 및 IL-33과 같은 인터류킨(IL); TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)을 포함하는 기타 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물 기원의 단백질을 포함한다.
용어 "링커"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하는데 사용되고 하나 이상의 항원 결합부를 연결하는데 사용된다. 당해 링커 폴리펩타이드는 문헌(참조: 예를 들면, Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J. et al. (1994) Structure 2:1121-1123)에 널리 공지되어 있다. 예시적인 링커는 AKTTPKLEEGEFSEAR (서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (서열번호 2); AKTTPKLGG (서열번호 3); SAKTTPKLGG (서열번호 4); SAKTTP (서열번호 5); RADAAP (서열번호 6); RADAAPTVS (서열번호 7); RADAAAAGGPGS (서열번호 8); RADAAAA(G4S)4 (서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV (서열번호 10); ADAAP (서열번호 11); ADAAPTVSIFPP (서열번호 12); TVAAP (서열번호 13); TVAAPSVFIFPP (서열번호 14); QPKAAP (서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP (서열번호 16); AKTTPP (서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP (서열번호 18); AKTTAP (서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP (서열번호 20); ASTKGP (서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP (서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 23); GENKVEYAPALMALS (서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS (서열번호 25); GHEAAAVMQVQYPAS (서열번호 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(서열번호 27); 및 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(서열번호 28)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 언급한다. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 언급하고, 즉, 개개의 항체를 포함하는 집단은 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원에 대해 지시된 것이다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프들)에 대해 지시된 상이한 항체들을 포함하는 항체 집단과는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의해 항체 생성을 요구하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "인간 항체"는 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 포함하는 것으로 의도된다. 본 기재내용의 인간 항체는 예를 들어, CDR 및 특히 CDR3에서 인간 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유래하는 CDR 서열이 인간 골격 서열상으로 접목된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 생성되거나, 발현되거나, 제작되거나 분리된 모든 인간 항체, 예를 들어, 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기 섹션 II C에서 추가로 기재됨), 재조합, 조합된 인간 항체 라이브러리로부터 유래된 항체 (Hoogenboom, H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy, H. and Highsmith, W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo, J.V. and Larrick, J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H. and Chames, P. (2000) Immunol. Today 21:371-378), 인간 면역글로불린 유전자로 유전자 전이된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체 (Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green, L.L. (2002) Cur. Opin. in Biotechnol. 13:593-597; Little, M. et al (2000) Immunol. Today 21:364-370) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 기타 DNA 서열로 스플라이싱함을 포함하는 임의의 기타 수단에 의해 생성되거나 발현되거나 제작되거나 분리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 당해 재조합 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 양태에서, 당해 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열로 유전자 전이된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용되고 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이와 관련된 것이지만 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"친화도 성숙된" 항체는, 이의 하나 이상의 CDR에서 하나 이상이 변형되어 당해 변형된 것을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 것이다. 예시적인 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 갖는다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 생성된다. 문헌[참조: Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙화를 기재하고 있다. CDR 및/또는 골격 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌[참조: Barbas, et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813; Schier et al.(1995) Gene 169:147-155; Yelton et al., (1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al.(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896]에 기재되어 있고 활성 향상 아미노산 잔기를 이용한 선택적 돌연변이유발 위치, 접촉 또는 과돌연변이 위치에서의 선택적 돌연변이는 미국특허 제6,914,128호에 기재되어 있다.
"키메라 항체"란 용어는 한 종 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열과 다른 종 유래의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예컨대 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 인간 불변 영역에 결합된 항체를 의미한다.
"CDR 접목 항체"란 용어는 한 종에서 유래되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역의 서열들이 다른 종의 CDR 서열로 교체된 항체를 의미하는 것으로서, 예컨대 쥐의 CDR의 하나 이상(예컨대, CDR3)이 인간 CDR 서열로 교체된 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보유한 항체가 있다.
"인간화된 항체"란 용어는 인간을 제외한 종(예컨대, 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더 "인간다운", 즉 인간 배선 가변 서열과 더 유사한 서열로 변경된 항체를 의미한다. 인간화된 항체의 일 형태는 인간 CDR 서열이 대응하는 비인간 CDR 서열을 대신하기 위하여 비인간 VH 및 VL 서열로 도입된 CDR 접목 항체이다. 또한 "인간화된 항체"는 목적하는 항원과 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 FR- 영역 및 실질적으로 비-인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 CDR 영역을 포함하는 항체 또는 변이 유도체, 유사체 또는 이의 단편이다. CDR과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로"는 비-인간 항체 CDR과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 언급한다. 인간화된 항체는 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv)를 포함하고 여기서, CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 CDR에 상응하고 FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 CDR이다. 하나의 양태에서, 인간화된 항체는 또한 인간 면역글로불린의 전형적인 영역인 면역글로불린 Fc 영역의 하나 이상의 부분을 포함한다. 몇몇 양태에서, 인간화된 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄를 함유한다. 당해 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 인간화된 항체는 인간화된 경쇄만을 함유한다. 몇몇 양태에서, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄만을 함유한다. 특정 양태에서, 인간화된 항체는 경쇄 및/또는 인간화된 중쇄의 인간화된 가변 도메인만을 함유한다.
용어 "캐뱃 번호," "캐뱃 정의," 및 "캐뱃 표지"는 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 당해 분야에서 인지되며 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기 보다 더 가변적인(즉, 초가변성) 아미노산 잔기의 번호를 매기는 시스템을 의미한다[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 및 kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 중쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 31 내지 35 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 65 부위, 및 CDR3에 있어서 아미노산 95 내지 102 부위의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 24 내지 34 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56 부위, 및 CDR3에 있어서 아미노산 89 내지 97 부위의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열내 상보성 결정 영역을 언급한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역에는 3개의 CDR이 있고 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 명명된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역내 존재하는 3개의 CDR 그룹을 언급한다. 이들 CDR의 정확한 경계선은 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 문헌[Kabat (Kabat et al. (1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.]에 기재된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR을 한정하는 정확한 잔기 경계선을 제공한다. 이들 CDR은 캐뱃 CDR로서 언급될 수 있다. 문헌[Chothia and coworkers (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; 및 Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883)]에서는, 아미노산 서열 수준에서 다양성이 크다 할지라도 캐뱃 CDR내에 특정 아부위는 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 취하고 있음을 밝혔다. 이들 아부위는 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 명명되었고, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 초티아 CDR로서 언급될 수 있고 이는 캐뱃 CDR과 중복되는 경계선을 갖는다. 캐뱃 CDR과 중복하는 CDR을 한정하는 또 다른 경계선은 문헌[Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139) 및 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계선 한정은 상기 시스템중 하나를 엄격하게 따르지는 않지만, 특정 잔기 또는 잔기 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 영향주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 측면에서 이들이 단축되거나 연장될 수 있다 하더라도 캐뱃 CDR과 중복된다. 본원에 사용된 방법은 당해 시스템중 어느 하나에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있지만 바람직한 양태는 캐뱃 또는 초티아 한정된 CDR을 사용하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골격" 또는 "골격 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 언급한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 골격 서열의 의미는 이에 따라 상이하게 해석된다. 6개의 CDR (경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 또는 중쇄상의 골격 영역을 각 쇄상에 4개의 서브-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치되고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치되고 CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치된다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 서브-영역으로 특정화하는 것 없이 다르게 언급된 골격 영역은 단일의 천연 면역글로불린 쇄의 가변 영역내에 조합 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 FR은 4개의 서브-영역중 하나를 나타내고 FR들은 골격 영역을 구성하는 4개의 서브-영역중 2개 이상을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전학적 재배열 및 돌연변이를 유발하는 성숙 과정을 거치지 않는 비-림프성 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 언급한다[참조문헌: 예를 들면, Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200; Marchalonis et al. (2001), Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30]. 본 기재내용의 다양한 양태에 의해 제공되는 이점 중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙 항체 유전자 보다 종에서 개체에 특징적인 필수 아미노산 서열을 보존할 가능성이 높음에 따라 당해 종에서 치료학적으로 사용되는 경우 외래 공급원으로서 인지될 가능성이 낮다는 사실에 기인한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "중화"는 결합 단백질이 항원에 특이적으로 결합하는 경우 항원의 생물학적 활성을 중화시킴을 언급한다. 하나의 양태에서, 중화 결합 단백질은 사이토킨에 결합하여 약 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상 또는 85% 이상으로 사이토킨의 생물학적 활성을 감소시킨다.
용어 "활성"은 2개 이상의 항원에 대한 DVD-Ig의 결합 특이성/친화도와 같은 활성을 포함한다.
"에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 특정 양태에서, 에피토프 결정인자에는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 기가 포함되고, 특정 양태에서는 특이적인 입체 구조 특징, 및/또는 특이적 하전 특징을 갖는 것일 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 일 영역이다. 따라서, 에피토프는 특이적인 결합 파트너 상의 상보성 부위에 결합하는 것으로 공지된 항원(또는 이의 단편)의 영역의 아미노산 잔기로 이루어진다. 항원성 단편은 하나 이상의 에피토프를 함유할 수 있다. 특정 양태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 배합 혼합물에서 자신의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 항체가 교차 경쟁(하나가 다른 하나의 결합 또는 조절 효과를 방해한다)하는 경우 항체는 "동일한 에피토프에 결합한다"라고 일컫는다. 추가로 에피토프의 구조적인 정의(중첩, 유사, 동일)는 유용하지만 기능적 정의는 흔히 이들이 구조적(결합) 및 기능적(조절, 경쟁) 파라미터를 포괄하기 때문에 보다 관련된다.
본 명세서에 사용된, "표면 플라스몬 공명"이란 용어는 예를 들어, BIAcore? 시스템(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 등을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 생체특이적 상호작용을 실시간 분석할 수 있는 광학 현상을 의미한다. 이에 대한 상세한 설명은 문헌[Jonsson, U. et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U. et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B. et al.(1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; 및 Johnnson, B. et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된, "Kon"이란 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 결합 단백질(예를 들어, 항체)의 결합을 나타내는 온 레이트 상수(on rate constant)를 의미하는 것으로 간주한다. "Kon"은 또한 본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이 용어 "결합율 상수" 또는 "ka"로 공지되어 있다. 표적 항원에 대한 항체의 결합율 또는 항체와 항원간의 복합체 형성율을 지적하는 당해 값은 식: 항체("Ab") + 항원 ("Ag")→→Ab-Ag으로 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Koff"는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 항체/항원 복합체로부터 결합 단백질(예를 들어, 항체)의 해리에 대한 오프 레이트 상수를 의미하는 것으로 간주한다. "Koff"은 또한 본원에 상호교환적으로 사용된 용어 "해리율 상수" 또는 "kd"로 공지되어 있다. 당해 값은 식: Ab + Ag←Ab-Ag에 나타낸 바와 같이 시간 경과에 따라 Ab-Ag 복합체가 유리된 항체 및 항원으로 분리되거나 표적 항원으로부터의 항체의 해리율을 지적한다.
본원에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "평형 해리 상수" 또는 "KD"는 평형에서의 적정 측정 또는 해리율 상수(Koff)를 결합율 상수(Kon)으로 나누어 수득된 값을 언급하는 것으로 간주한다. 결합율 상수, 해리율 상수 및 평형 해리율 상수는 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 나타내는데 사용된다. 결합율 및 해리율 상수를 결정하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 형광계 기술의 사용은 평형상태에서 생리학적 완충액중의 샘플을 조사하기 위해 높은 민감성 및 능력을 제공한다. 다른 실험 방법 및 장비, 예를 들어, BIAcore? (생분자 상호작용 분석) 분석을 사용할 수 있다((예를 들어, 제조원(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden)으로부터 구입가능한 장비). 추가로, KinExA? (동력한 배척 분석) 분석(제조원: Sapidyne Instruments (Boise, Idaho))을 또한 사용할 수 있다.
"표지" 및 "검출가능한 표지"는 특이적 결합 파트너, 예를 들어, 항체 또는 분석물에 부착된 잔기를 이미하고 예를 들어, 당해 잔기는 항체 및 분석물과 같은 특이적 결합 쌍의 구성원간의 반응을 겸출가능하게 하고 당해 표지된 특이적 결합 파트너, 예를 들어, 항체 또는 분석물은 "검출가능하게 표지된"것으로서 언급된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 당해 용어 "표지된 결합 단백질"은 결합 단백질의 동정을 위해 제공된 표지가 혼입된 단백질을 언급한다. 하나의 양태에서, 당해 표지는 가시적 또는 장치적 수단, 예를 들어, 방사선표지된 아미노산 및 마크된 아비딘(예를 들어, 광학적 또는 비색 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩타이드로의 부착에 의해 검출가능한 시그날을 생성할 수 있는 검출가능한 마커이다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 방사선동위원소 또는 방사선핵종(예, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm), 크로마젠, 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 및 란타니드 포스포르스); 효소 표지(예, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 및 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오티닐 기; 2차 리포터(예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인지되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프; 및 자성 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트. 면역분석을 위해 통상적으로 사용되는 표지의 대표적 예는 빛을 생성시키는 잔기, 예를 들어, 아크리디늄 화합물, 및 형광을 생성하는 잔기, 예를 들어, 플루오레세인을 포함한다. 다른 표지는 본원에 기재되어 있다. 이와 관련하여 잔기 자체는 검출가능하게 표지될 수는 없지만 또 다른 잔기와 반응시 검출가능하게 될 수 있다. "검출가능하게 표지된"의 사용은 후자 유형의 검출가능한 표지를 포괄하는 것으로 간주된다.
"접합체"란 용어는 제2 화학 잔기, 예컨대 치료제 또는 세포독성제에 화학적으로 결합된 결합 단백질을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "제제"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 의미한다. 하나의 양태에서, 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스튼, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 면역분석에 사용되는 경우, 접합체 항체는 검출 항체로서 사용되는 검출가능하게 표지된 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결정" 또는 "결정화된"은 결정 형태로 존재하는 결합 단백질(예: 항체) 또는 이의 항원 결합부를 의미한다. 결정은 고체 상태의 물질의 일 형태로서, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 상이하다. 결정은 원자, 이온, 분자(예, 항체와 같은 단백질) 또는 분자 어셈블리(예, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 입체 배열로 구성된다. 이러한 입체 배열은 당업계에 공지된 특이적인 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정 중에서 반복되는 기본 유니트 또는 빌딩 블록은 비대칭 유니트라 한다. 배열내 비대칭 유니트의 반복은 분명한 소정의 결정학적 대칭과 일치하게 하여 결정의 "유니트 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적 해독에 의한 유니트 셀의 반복은 결정을 제공한다[참조문헌: Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 201-16, Oxford University Press, New York, New York (1999)].
"폴리뉴클레오타이드"란 용어는 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 의미하는 것으로서, 리보뉴클레오타이드이거나 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 어느 한 뉴클레오타이드의 변형된 형태를 의미한다. 이 용어에는 일본쇄 및 이본쇄 표준 형태의 DNA가 포함된다.
본 명세서에 사용된 "분리된 폴리뉴클레오타이드"란 용어는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 게놈, cDNA 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합)를 의미하는데, 그 기원에 따라서, "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 자연에서 발견되는 "분리된 폴리뉴클레오타이드"의 폴리뉴클레오타이드 전부 또는 일부와 관련되어 있지 않거나, 자연에서는 결합되지 않았던 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합되거나; 또는 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생되지 않는 폴리뉴클레오타이드이다.
"벡터"라는 용어는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 간주한다. 벡터의 한가지 형태는 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형의 이본쇄 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 형태의 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예컨대, 세균 복제 오리진을 보유한 세균 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈에 따라 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라 한다. 일반적으로 재조합 DNA법에 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본 명세서에 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에 대체되어 사용될 수 있다. 하지만, 본 기재내용은 등가 기능을 하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다.
"작동적으로 결합된"이란 용어는 기술된 성분이 의도한 방식대로 기능할 수 있는 관계에 있는 병치 상태를 의미한다. 암호 서열에 "작동적으로 결합된" 조절 서열은 암호 서열의 발현이 조절 서열에 적합한 조건 하에서 수행되도록 결찰된다. "작동적으로 결합된" 서열에는 당해 유전자에 근접한 발현 조절 서열 번호 및 당해 유전자를 조절하기 위하여 트랜스로 작용하거나 일정 거리에 있는 발현 조절 서열이 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "발현 조절 서열"이란 용어는 이들이 결찰된 암호 서열의 발현과 프로세싱을 수행하는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열에는 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 접목 및 폴리아데닐화 시그날과 같은 효과적인 RNA 프로세싱 시그날; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 증강시키는 서열(즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 필요한 경우 단백질 분비를 증강시키는 서열 번호 등이 포함된다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르며, 원핵생물인 경우, 이러한 조절 서열에는 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열이 있고; 진핵생물인 경우, 이러한 조절 서열에는 프로모터 및 전사 종결 서열이 있다. "조절 서열"이란 용어는 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하는 것으로 간주하고, 리더 서열 번호 및 융합 파트너 서열과 같이 그 존재가 유리한 추가 성분을 포함할 수도 있다.
"형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포로 유입되는 임의의 공정을 의미한다. 형질전환은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 자연 또는 인공 조건 하에서 실시될 수 있다. 형질전환은 이종 핵산 서열을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 따라 달라질 수 있다. 이러한 방법은 형질전환되는 숙주 세포에 따라 선택되는데, 그 예로는 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션 및 입자 충격이 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 이러한 "형질감염된" 세포는 삽입된 DNA가 자율 복제성 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정적으로 형질감염된 세포를 포함한다. 또한, 이들 세포는 삽입된 DNA 또는 RNA를 한정된 시간 동안 일시적으로 발현하는 세포도 포함한다.
"재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 외인성 DNA가 도입된 세포를 의미하는 것으로 간주한다. 이러한 용어는 특정 피검체 세포뿐만 아니라 이 세포의 자손도 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 후속 세대에는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않지만 본 명세서에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에는 포함되는 것으로 간주한다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 임의의 생물계에서 선택되는 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 또 다른 양태에서, 진핵생물 세포에는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포가 포함된다. 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포주 이.콜라이; 포유동물 세포주 CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 및 PER.C6; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애를 포함하며, 이에 국한되지는 않는다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양과 형질전환(예, 전기천공, 리포펙션)에는 표준 기술을 사용할 수 있다. 효소 반응과 정제 기술은 제조업자의 지침에 따라 수행하거나 당업계에서 일반적으로 수행하는 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 상기 기술 및 절차들은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 또는 본 명세서에서 인용되고 논의된 각종 일반 문헌 및 특정 문헌들에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행할 수 있다[본원에 참고인용된 문헌 Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.].
당업계에 공지된 바와 같은 "유전자전이 유기체"란 전이유전자를 포함하는 세포를 가진 유기체를 의미하는 것으로서, 유기체(또는 이 유기체의 선조)에 도입된 전이유전자는 유기체에서 자연 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "전이유전자"는 유전자전이 유기체가 발생하는 세포의 게놈으로 안정적이고 작동적으로 통합되어, 유전자전이 유기체의 하나 이상의 세포 형태 또는 조직에서 암호화된 유전자 산물의 발현을 유도하는 DNA 작제물이다.
"조절하다" 및 "조정하다"란 용어는 당해 분자의 활성(예, 사이토킨의 생물학적 활성)에 있어서 변화 또는 변경을 의미한다. 조절은 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도(magnitude)에 있어서의 증가 또는 감소일 수 있다. 분자 활성 및 기능의 예에는 결합 특징, 효소 활성, 세포 수용체 활성화 및 시그날 전달 등이 있으나, 이에 국한되지는 않는다.
이와 마찬가지로, "조절인자"란 용어는 당해 분자의 활성 또는 기능(예, 사이토킨의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들어, 조절인자는 이 조절인자의 부재 시 관찰되는 활성 또는 기능의 정도에 비교했을 때 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도에 있어서의 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 특정 양태에서, 조절인자는 분자의 하나 이상의 활성 또는 기능의 정도를 감소시키는 억제제이다. 억제제의 예에는 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디(peptibody), 탄수화물 또는 유기 소분자가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 펩티바디는 PCT 공보 제WO 01/83525호 등에 기술되어 있다.
"효능제(agonist)"란 용어는 목적하는 분자와 접촉했을 때 효능제의 부재 시 관찰되는 활성 또는 기능의 정도와 비교했을 때 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도에 있어서의 증가를 유발하는 조절인자를 의미한다. 목적하는 특정 효능제에는 항원에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자가 포함될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"길항제" 또는 "억제제"란 용어는 목적하는 분자와 접촉했을 때, 길항제의 부재 시 관찰되는 활성이나 기능의 정도와 비교했을 때 당해 분자의 특정 활성이나 기능의 정도에 있어서의 감소를 유발하는 조절인자를 의미한다. 목적하는 특정 길항제에는 항원의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단 또는 조절하는 물질이 포함된다. 항원의 길항제 및 억제제에는 항원에 결합하는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속을 경감 또는 완화시키거나, 장애의 진행을 억제 또는 예방하거나, 장애를 퇴화시키거나, 재발, 발병, 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 개시 또는 진행을 억제 또는 예방하거나, 장애를 검출하거나 또 다른 치료의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)(예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제)를 증진시키거나 개선시키는데 충분한 치료양을 언급한다.
"환자" 및 "피검체"는 본원에서 영장류(예를 들어, 인간, 원숭이 및 침팬치), 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피그, 고양이, 개, 랫트, 마우스, 고래)를 포함하는 포유동물, 새(예를 들어, 오리 또는 거위) 및 상어와 같은 동물을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 환자 또는 피검체는 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료되거나 진단되는 인간, 질환, 장애 또는 병태 위험에 처한 인간, 질환, 장애 또는 병태를 갖는 인간 및/또는 질환, 장애 또는 병태를 위해 치료되는 사람과 같은 사람이다.
본 명세서에 사용된, "시료"란 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고 있다. 본 명세서에 사용된, "생물학적 시료"는 생물체 또는 이전 생물체에서 유래하는 임의의 양의 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 생물체에는 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 물질에는 혈액(예를 들어, 전혈), 혈장, 혈청, 뇨, 양막액, 윤활액, 내피 세포, 백혈구, 단핵구, 기타 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장이 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"성분", "성분들" 및 "하나 이상의 성분"은 일반적으로, 본원에 기재된 방법 및 당업계에 공지된 기타 방법에 따라, 시험 시료(예를 들어, 환자 뇨, 혈청 또는 혈장 시료)의 분석을 위해 키트에 포함될 수 있는 포획 항체, 검출 또는 접합체 항체, 대조군, 캘리브레이터, 일련의 캘리브레이터, 민감성 패널, 컨테이너, 완충액, 희석제, 염, 효소, 효소에 대한 조인자, 검출 시약, 전처리 시약/용액, 기질(예를 들어, 용액으로서) 및 종료 용액 등을 언급한다. 따라서, 본원에서, "하나 이상의 성분", "성분" 및 "성분들"은 예를 들어, 항-분석물(예를 들어, 항-폴리펩타이드) 항체에 결합함에 의해 고형 지지체상에 임의로 고정화된 폴리펩타이드와 같은 분석물을 포함하는 조성물과 같은 상기된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 다른 분석물을 포함할 수 있다. 몇몇 성분들은 용액중에 있을 수 있거나 분석용으로 재구성하기위해 동결건조될 수 있다.
"대조군"은 분석물을 함유하지 않는 것으로 공지된 조성물("음성 대조군") 또는 분석물을 함유하는 것으로 공지된 조성물("양성 대조군")을 언급한다. 양성 대조군은 공지된 농도의 분석물을 포함할 수 있다. "대조군", "양성 대조군" 및 "캘리브레이터"는 공지된 농도의 분석물을 포함하는 조성물을 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. "양성 대조군"은 분석 수행능 특성을 설정하기 위해 사용될 수 있고 시약(예를 들어, 분석물)의 위상에 대해 유용한 지표이다.
"예비결정된 컷오프" 및 "예비결정된 수준"은 일반적으로 예비결정된 컷오프/수준(여기서, 예비결정된 컷오프/수준은 이미 다양한 임상 파라미터(예를 들어, 질환의 중증도, 진행성/비진행성/개선 등)와 연계되어 있거나 연관되어 있다)에 대해서 분석 결과를 비교함에 의해 진단/예후/치료학적 효능을 평가하기 위해 사용되는 분석 컷오프값을 언급한다. 본 기재내용은 예시적인 예비결정된 수준을 제공할 수 있고, 컷오프 값이 면역분석(예를 들어, 사용된 항체 등)의 성질에 따라 다양할 수 있음은 널리 공지되어 있다. 추가로 본원에 기재된 바를 토대로 당해 다른 분석을 위한 면역분석-특이적 컷오프 값을 수득하기 위해, 다른 면역분석에 대해서 본원에 기재된 내용을 채택한다는 것은 당업자의 기술 범위내에 있다. 예비결정된 컷오프/수준의 정확한 값은 분석간에 다양할 수 있는 반면, 본원에 기재된 바와 같은 관련성(존재하는 경우)이 일반적으로 적용가능해야만 한다.
본원에 기재된 바와 같은 진단 분석에 사용된 바와 같은 "전처리 시약", 예를 들어, 용해, 침전 및/또는 가용화 시약은 임의의 용해시키는 시약 및/또는 시험 시료에 존재하는 임의의 분석물을 가용화시키는 시약이다. 전처리는 본원에서 추가로 기재한 바와 같이 모든 시료에 대해 필수적인 것은 아니다. 무엇보다, 분석물(예를 들어, 목적하는 폴리펩타이드)을 가용화시켜 시료내 존재하는 임의의 내인성 결합 단백질로부터 분석물을 방출시키는 것이 필수적이다. 전처리 시약은 동종성(분리 단계를 요구하지 않음) 또는 이종성(분리 단계를 요구함)일 수 있다. 이종성 전처리 시약을 사용하여, 다음 단계의 분석으로 진행하기 전에 시험 시료로부터 침전된 분석물 결합 단백질을 제거한다.
상기된 면역분석 및 키트에 대한 내용중에 "품질 대조군 시약"은 캘리브레이터, 대조군 및 민감성 패널을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "캘리브레이터" 또는 "표준물"은 전형적으로 항체 또는 분석물과 같은 분석물의 농도 외삽용 계측(표준) 곡선을 작성하기 위해 사용된다(예를 들어, 하나 이상, 예를 들어, 다수). 또한, 예비결정된 양성/음성 컷오프 근처에 있는 단일 캘리브레이터가 사용될 수 있다. 다중 캘리브레이터(즉, 하나 이상의 캘리브레이터 또는 다양한 양의 캘리브레이터(들))가 "민감성 패널"을 포함하도록 연계하여 사용될 수 있다.
"위험"은 현재 또는 향후 몇몇 시점에서 발생하는 특정 사건의 가능성 또는 가망성을 언급한다. "위험도 층별화(Risk stratification)"는 담당의가 환자를 저, 중, 고 또는 최고 위험의 특정 질환, 장애 또는 병태의 발병으로 분류할 수 있게 해주는 일련의 공지된 임상적 위험 인자를 언급한다.
특이적 결합쌍(예를 들어, 항원(또는 이의 단편) 및 항체(또는 이의 항원적으로 반응성인 단편))의 구성원간의 상호작용에서 "특이적" 및 "특이성"은 상호작용의 선택적 반응성을 언급한다. 용어 "특이적으로 결합하는" 및 이의 유사 용어는 항체(또는 이의 항원적 반응성 단편)이 분석물(또는 이의 단편)에 특이적으로 결합하지만 다른 실체에는 특이적으로 결합하지 않는 능력을 언급한다.
"특이적 결합 파트너"는 특이적 결합쌍의 구성원이다. 특이적 결합쌍은 화학적 또는 물리적 수단을 통해 서로 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 분자를 포함한다. 따라서, 통상의 면역분석의 항원 및 항체 특이적 결합쌍에 추가로, 다른 특이적 결합쌍은 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙타비딘), 탄수화물 및 렉틴, 상보적 뉴클레오타이드 서열, 효능인자 및 수용체 분자, 조인자 및 효소, 효소 억제제 및 효소 등을 포함할 수 있다. 추가로, 특이적 결합 쌍은 본래의 특이적 결합 구성원의 유사체, 예를 들어, 분석물-유사체인 구성원을 포함할 수 있다. 면역반응성 특이적 결합 구성원은 분리되거나 재조합적으로 제조되거나 상관없이 항원, 항원 단편 및 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 포함하는 항체 및 이의 복합체, 단편 및 변이체(변이체의 단편을 포함)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "변이체"는 아미노산의 부가(예를 들어, 삽입), 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열에 있어서 소정의 폴리펩타이드(예를 들어, IL-18, BNP, NGAL, TnI 또는 HIV 폴리펩타이드 또는 항-폴리펩타이드 항체)와는 상이하지만 소정의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하는(예를 들어, 변이체 IL-18은 IL-18에 결합하는 것에 대해 항-IL-18 항체와 경쟁할 수 있다) 폴리펩타이드를 의미한다. 아미노산의 보존성 치환, 즉, 유사한 성질(예를 들어, 소수성 및 하전 정도 및 하전 영역의 분포)을 갖는 상이한 아미노산으로의 대체는 전형적으로 최소의 변화를 포함하는 것으로서 인지된다. 이들 최소의 변화는 부분적으로 당업계(문헌참조: 예를 들면, Kyte et al. (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132)에서 이해되는 바와 같이 아미노산의 하이드로패틱 지수(hydropathic index)를 고려하여 동정될 수 있다. 아미노산의 하이드로패틱 지수는 소수성 및 하전의 고려를 기준으로 한다. 유사한 하이드로패틱 지수의 아미노산이 치환되어 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 하나의 측면에서, ± 2의 하이드로패틱 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 또한 아민산의 친수성은 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 유도하는 치환을 밝히기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성을 고려하여 펩타이드의 최대 국소 평균 친수성을 계산할 수 있고 이는 항원성 및 면역원성과 연관된 것으로 보고된 유용한 측정치이다(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,554,101호). 유사한 친수성값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어, 당업계에서 이해되는 바와 같은 면역원성을 보유하는 펩타이드를 유도할 수 있다. 하나의 측면에서, 치환은 서로 ± 2 이내의 친수성값을 갖는 아미노산으로 수행된다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘다는 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향받는다. 당해 관찰과 일관되게 생물학적 기능과 양립할 수 있는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 하전, 크기 및 다른 성질에 의해 나타나는 바와 같이 아미노산 및 특히 아미노산의 측쇄의 상대적 유사성에 의존하는 것으로 이해된다. "변이체"는 또한 단백질 용해, 인산화, 또는 기타 해독후 변형과 같은 차등적으로 처리되었으나 이의 생물학적 활성 또는 항원 반응성, 예를 들어, IL-18에 결합하는 능력을 보유하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 기재하는데 사용될 수 있다. 본원에서 "변이체"의 사용은 본원에서 달리 언급되지 않는 경우 변이체의 단편을 포괄하는 것으로 의도된다.
I. DVD 결합 단백질의 제조
본 기재내용은 하나 이상의 표적과 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 결합 단백질 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 결합 단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 폴리펩타이드이고, X2는 Fc 영역이고 n은 0 또는 1이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 본 기재내용의 결합 단백질은 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 기재내용은 발현 벡터, 숙주 세포 및 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
A. 모 모노클로날 항체의 제조
DVD 결합 단백질의 가변 도메인은 목적하는 항원에 결합할 수 있는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하는, 모 항체로부터 수득될 수 있다. 이들 항체는 천연에 존재할 수 있거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
MAb는 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기술 또는 이의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 광범위한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, mAb는 당업계에 공지된 기술을 포함하여 예를 들어, 문헌[Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.); Hammerling, et al.(1981) in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y.,)]에 교시된 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 포함하여 단일 클론으로부터 유래되지만 이를 생성시키는 방법에 의해 유래되지 않는 항체를 언급한다. 하이브리도마는 하기 실시예 1에서 논의되는 바와 같이 선별하고 클로닝하고 추가로 강한 하이브리도마 성장, 고 항체 생산 및 목적하는 항체 특성을 포함하여 목적하는 특성에 대해 스크리닝한다. 하이브리도마는 동일유전자계 동물, 면역계가 결핍된 동물, 예를 들어, 누드 마우스와 같은 생체내에서 또는 시험관내 세포 배양에서 배양하고 증식시킬 수 있다. 하이브리도마를 선별하고 클로닝하고 증식시키는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특정 양태에서, 하이브리도마는 상기 논의된 바와 같이 마우스 하이브리도마이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 랫트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비인간, 비마우스 종에서 제조된다. 또 다른 양태에서, 하이브리도마는 인간 하이브리도마이고 이때 인간 비-분비 골수종이 특이 항원과 결합할 수 있는 항체를 발현하는 인간 세포와 융합된다.
재조합 mAb는 문헌[미국 특허 5,627,052; PCT Publication WO 92/02551, 및 Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848]에 기재된 바와 같이 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)과 같이 당업계에 언급된 과정을 사용하여 단일의 분리된 림프구로부터 생성된다. 본 방법에서, 목적하는 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들어, 면역화된 동물로부터 유래된 림프구는 동정되고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 역전사효소 PCR에 의해 세포로부터 수득한다. 이들 가변 영역을 적절한 면역글로불린 불변 영역(예를 들어, 인간 불변 영역)과 관련하여 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 생체내 선별된 림프구로부터 유래된 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포를 이어서 추가 분석하고 예를 들어, 형질감염된 세포를 선별하여 목적하는 항원에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리함에 의해 선별할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 추가로 예를 들어, 문헌[PCT Publication Nos. WO 97/29131 및 WO 00/56772]에 기재된 바와 같은 시험관내 친화도 성숙화 방법에 의해 추가로 조작할 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 인간 면역글로불린 좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비-인간 동물을 목적하는 항원으로 면역화시켜 제조된다. 하나의 양태에서, 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 좌의 대형 단편을 포함하고 마우스 항체 생산이 결핍된 유전자 조작된 마우스 균주인 XENOMOUSE 유전자 전이 마우스이다. 예를 들면, 문헌[참조: Green et al.(1994) Nature Genet. 7: 13-21 및 미국 특허 5,916,771; 5,939,598; 5,985,615; 5,998,209; 6,075,181; 6,091,001; 6,114,598; 및 6,130,364]을 참조한다. WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/33735; WO98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00 09560; 및 WO 00/037504도 참조한다. XENOMOUSE 유전자 전이 마우스는 완전하게 인간 항체의 성인계 인간 목록을 생산하고, 항원 특이적인 인간 Mab를 생성한다. XENOMOUSE 유전자 전이 마우스는 인간 중쇄 좌 및 x 경쇄 좌의 메가염기 크기의 배선 형태 YAC 단편의 도입을 통해 인간 항체 목록의 약 80%를 포함한다[본원에 참고인용된 Mendez et al.(1997) Nature Genet. 15: 146-156; Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188: 483-495 참조].
또한, 본 발명의 항체 제조에는 시험관내 방법도 사용할 수 있는데, 여기서 항체 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체를 동정한다. 재조합 항체 라이브러리를 선별하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Ladner et al., 미국 특허 5,223,409; PCT 공보 WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 및 WO 97/29131; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acid Res. 19: 4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982, 및 미국 특허 공보 2003/0186374] 등에 설명된 방법을 포함한다.
본 기재내용의 모 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 파아지 입자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 파아지 입자 표면상에 나타난다. 특히, 당해 파아지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 나타내는데 사용될 수 있다. 목적하는 항원과 결합하는 항원 결합 도메인 발현 파아지는 예를 들어, 표지된 항원 또는 고형 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선별되거나 동정될 수 있다. 이들 방법에 사용되는 파아지는 전형적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 필라멘트형 파아지이다. 본 기재내용의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182: 41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184: 177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al. (1997) Gene 187 : 9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunol. 57: 191-280; PCT Application No. PCT/GB91/01134; PCT Publication Nos. WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 미국 특허 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108]에 기재된 것들을 포함한다.
상기 문헌에 기재된 바와 같이, 파아지 선별 후, 파아지로부터 항체 암호화 영역을, 하기에 상세히 기재되는 바와 같이 분리할 수 있고 이를 사용하여 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현되는 인간 항체 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하기 위한 기술은 또한 문헌[PCT 공보 WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6): 864-869; Sawai et al. (1995) AJRI 34: 26-34; 및 Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043]에 기재된 것들과 같은 방법을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 사용될 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 기술의 예는 문헌[미국 특허 4,946,778 및 5,258, 498; Huston et al. (1991), Methods Enzymol. 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999; 및 Skerra et al., (1988) Science 240: 1038-1040]에 기재된 것들을 포함한다.
파아지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 대한 대안으로, 대형 조합 라이브러리에 대해 당업계에 공지된 기타 방법을 적용하여 본 발명의 이원 특이성 항체를 동정할 수 있다. 한가지 유형의 또 다른 발현 시스템은 문헌[PCT Publication No. WO 98/31700 및 in Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302]에 기재된 바와 같이 재조합 항체 라이브러리가 RNA 단백질 융합으로서 발현되는 것이다. 당해 시스템에서, 공유 융합은 mRNA 및 3' 말단에 푸로마이신, 펩티딜 수용체 항생제를 함유하는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해, 암호화된 펩타이드 또는 단백질 사이에서 형성된다. 따라서, 특이적 mRNA는 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 일부(예를 들어, 항체 결합부 또는 이의 일부)의 이원 특이성 항원에 대한 성질을 기준으로 mRNA의 배합 혼합물(예를 들어, 조합 라이브러리)로부터 집적될 수 있다. 당해 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수된 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상기된 바와 같이(예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서) 재조합 수단에 의해 발현될 수 있고 특히, 본래에 선별된 서열에 돌연변이가 도입된 mRNA-펩타이드 융합을 추가로 스크리닝함에 의해 또는 상기된 바와 같은 재조합 항체의 친화도 성숙화를 위한 기타 방법에 의해 친화도가 추가로 성숙화될 수 있다.
또 다른 방법에서, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 효모 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 유전학적 방법을 사용하여 항체 도메인을 효모 세포벽에 부착시키고 이들을 효모의 표면상에 나타나게 할 수 있다. 특히, 당해 효모를 사용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 쥐)로부터 발현되는 항원 결합 도메인이 나타나게 할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 문헌[미국 특허 6,699,658]에 기재된 것들을 포함한다.
상기된 항체는 추가로 변형시켜 CDR 접목 및 인간화된 모 항체를 생성시킬 수 있다. CDR-접목된 모 항체는 인간 항체 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 이때, VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역은 목적하는 항원과 결합할 수 있는 쥐 항체의 CDR 서열로 대체된다. 임의의 인간 항체 기원의 골격 서열은 CDR 접목을 위한 주형으로서 작용할 수 있다. 그러나, 당해 골격상으로의 직쇄 대체는 흔히 항원에 대한 결합 친화도를 약간 손상시킨다. 인간 항체가 본래의 쥐 항체와 보다 동일할수록 쥐 CDR과 인간 골격의 조합이 CDR내에서 뒤틀림을 유발하여 친화도를 감소시킬 가능성이 보다 적어진다. 따라서, CDR을 제외한 쥐 가변 골격을 대체하도록 선택된 인간 가변 골격은 쥐 항체 가변 영역 골격과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 바람직할 수 있다. CDR을 제외한 인간 및 쥐 가변 영역은 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 보다 바람직할 수 있다. 하나의 양태에서, CDR을 제외한 인간 및 쥐 가변 영역은 쥐 항체 가변 영역 골격과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 보다 더 바람직할 수 있다. 특정 양태에서, CDR을 제외한 인간 및 쥐 가변 영역은 쥐 항체 가변 영역 골격과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 가장 바람직할 수 있다. 또 다른 양태에서, 당해 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고(문헌참조: EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 및 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링 또는 재표면화(문헌참조: EP 592,106; EP 519,596; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498; Studnicka et al. (1994) Prot. Engineer. 7(6): 805-814; 및 Roguska et al. (1994) Proc. Acad. Sci. USA 91: 969-973), 쇄 셔플링(미국 특허 5,565,352); 및 항-이디오타입 항체가 있다.
인간화된 항체는 비-인간 종 기원의 하나 이상의 CDR 및 인간 면역글로불린 분자 기원의 골격 영역을 갖는, 목적하는 항원에 결합하는 비-인간 종 기원의 항체 분자이다. 공지된 인간 Ig 서열은 예를 들어, 본원에 전반적인 내용이 참조로서 인용되는 하기 인터넷 주소 및 문헌에 기재되어 있다:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html; 및 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). 당해 입수된 서열을 사용하여 당업계에 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나 결합, 친화도, 결합율, 해리율, 결합도(avidity), 특이성, 반감기 또는 임의의 기타 적합한 특징을 감소시키거나 증진시키거나 변형시킬 수 있다.
인간 골격 영역내 골격 잔기는 상응하는 CDR 공여자 항체로 대체하여 항원 결합을 변화, 바람직하게는 개선시킬 수 있다. 이들 골격 대체는 예를 들어, CDR 및 골격 잔기의 상호작용에 대해 모델링하여 항원 결합과 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 동정하여 특정 위치에서의 특정 골격 잔기를 동정함에 의해 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 동정된다(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 5,585,089; Riechmann et al.(1988) Nature 332:323). 입체 면역글로불린 모델은 통상적으로 유용하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 나타내는 컴퓨터 프로그램은 유용하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 가능한 잔기의 역할에 대한 분석, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 선별될 수 있고 컨센서스 및 입수 서열로부터 조합될 수 있어 표적 항원에 대한 증가된 친화도와 같은 목적하는 항체 특성이 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 관여한다. 항체는 문헌[Jones et al. (1986) Nature 321: 522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534; Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151: 2623; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498; Studnicka et al. (1994) Prot. Engineer. 7(6): 805-814; Roguska et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973; PCT Publication No. WO 91/09967: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; 및 WO90/14430; European Patent Publication Nos. EP 229246; EP 592,106; EP 519,596; 및 EP 239,400; 및 미국 특허 5,565,332; 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 및 4,816,567]에 기재된 것들을 제한 없이 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
B. 모 모노클로날 항체를 선별하기 위한 기준
본 기재내용의 한 양태는 DVD-Ig 분자내 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는 모 항체를 선별하는 것이다. 하나의 양태에서, 목적하는 성질은 하나 이상의 항체 파라미터로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 항체 파라미터는 항원 특이성, 항원에 대한 친화도, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인지, 안정성, 용해도, 생산 효율, 면역원성, 약리역학, 생물유용성, 조직 교차 반응성 및 유사 항원 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
B1. 항원에 대한 친화도
치료학적 mAb의 목적하는 친화도은 항원의 성질 및 목적하는 치료학적 엔드포인트에 따라 다양할 수 있다. 한 양태에서, 모노클로날 항체는 당해 상호작용이 통상적으로 고친화도 상호작용 (예를 들어, <pM - <nM 범위)임으로 사이토킨-사이토킨 수용체 상호작용을 차단하는 경우 보다 높은 친화도(Kd = 0.01 - 0.50 pM)를 갖는다. 이 경우에, 이의 표적에 대한 mAb 친화도는 이의 수용체에 대한 사이토킨(리간드)의 친화도 이상이어야만 한다. 한편, 보다 적은 친화도를 갖는 mAb (> nM 범위)는 예를 들어, 시퀘스터(sequester) 및 A-β 아밀로이드의 명백한 순환 종과 결합하는, 잠재적으로 순환하는 병원성 단백질, 예를 들어, 모노클로날 항체를 제거하는데 치료학적으로 효과적일 수 있다. 다른 경우에, 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 기존의 고친화도 mAb의 친화도를 감소시키거나 표적에 대해 낮은 친화도를 갖는 mAb를 사용하여 잠재적인 부작용을 피할 수 있는데, 예를 들어, 고친화도 mAb는 이의 의도된 표적 모두를 격리/중화시켜 표적화된 단백질의 기능을 완전히 고갈/제거할 수 있다. 이러한 시나리오에서, 저친화도 mAb는 질환 증상(병리학적 또는 과생성 수준)에 관여할 수 있는 표적의 일부를 격리/중화시켜 표적의 일부가 계속해서 이의 정상적인 생리학적 기능을 수행할 수 있게 한다. 따라서, 용량을 조정하고/하거나 부작용을 감소시키기 위해 Kd를 감소시킬 수 있다. 모 mAb의 친화도은 목적하는 치료학적 결과를 달성하기 위해 세포 표면 분자를 적당히 표적화하는데 역할을 수행할 수도 있다. 예를 들어, 표적이 고밀도로 암 세포상에 및 저 밀도로 정상 세포상에 발현되는 경우, 저친화도 mAb는 정상 세포 보다는 종양 세포상의 다수의 표적물에 결합하여 ADCC 또는 CDC를 통해 종양 세포를 제거할 수 있고 따라서 치료학적으로 바람직할 수 있는 효과를 가질 수 있다. 따라서, 목적하는 친화도를 갖는 mAb의 선별은 가용성 및 표면 표적 둘다를 위해 적절할 수 있다.
리간드와의 상호작용시 수용체를 통한 시그날 전달은 수용체 리간드 상호작용의 친화도에 의존할 수 있다. 유사하게, 표면 수용체에 대한 mAb의 친화도은 세포내 시그날 전달의 성질을 결정할 수 있고 mAb는 효능제 또는 길항제 시그날을 전달할 수 있는 것으로 생각할 수 있다. mAb 매개 시그날 전달의 친화도 기반 성질은 이의 부작용 프로필에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 치료학적 모노클로날 항체의 목적하는 친화도 및 목적하는 기능은 시험관내 및 생체내 실험에 의해 결정될 필요가 있다.
결합 단백질(예를 들어, 항체)의 목적하는 Kd는 목적하는 치료학적 결과에 따라 실험적으로 결정될 수 있다. 하나의 양태에서, 동일한 항원에 대한 DVD-Ig의 목적하는 친화도 이상의 특정 항원에 대한 친화도(Kd)를 갖는 모 항체가 선택된다. 주어진 DVD-Ig 분자에 대한 모 항체는 동일하거나 상이한 항체일 수 있다. 항원 결합 친화도 및 동력학은 바이어코어(Biacore) 또는 또 다른 유사 기술에 의해 평가된다. 하나의 양태에서, 각각의 모 항체는 최대 약 10-7 M; 최대 약 10-8 M; 최대 약 10-9 M; 최대 약 10-10 M; 최대 약 10-11 M; 최대 약 10-12 M; 및 최대 약 10-13 M로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 대한 해리 상수(Kd)를 갖는다. VD1이 수득된 제1 모 항체 및 VD2가 수득된 제2 모 항체는 각각의 항원에 대해 유사하거나 상이한 친화도(KD)를 가질 수 있다. 각각의 모 항체는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 적어도 약 102M-1s-1; 적어도 약 103M-1s-1; 적어도 약 104M-1s-1; 적어도 약 105M-1s-1; 및 적어도 약 106M-1s-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 대한 결합율 상수(Kon)를 갖는다. VD1이 수득된 제1 모 항체 및 VD2가 수득되 제2 모 항체는 각각의 항원에 대해 유사하거나 상이한 결합율 상수(Kon)를 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 각각의 모 항체는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 최대 약 10-3s-1; 최대 약 10-4s-1; 최대 약 10-5s-1; 및 최대 약 10-6s-1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원에 대한 해리율 상수(Koff)를 갖는다. VD1이 수득된 제1 모 항체 및 VD2가 수득된 제2 모 항체는 각각의 항원에 대해 유사하거나 상이한 해리율 상수(Koff)를 가질 수 있다.
B2. 효능
모 모노클로날 항체의 목적하는 친화도/효능은 목적하는 치료학적 결과에 의존할 것이다. 예를 들어, 수용체-리간드(R-L) 상호작용에 대해 친화도(kd)는 R-L kd (pM 범위) 이상이다. 예를 들어, 병리학적 순환 단백질의 단순한 제거를 위해, kd는 예를 들어, 다양한 종의 순환 A-β 펩타이드의 제거를 위해 낮은 nM 범위일 수 있다. 추가로, kd는 또한 표적이 예를 들어, Aβ 올리고머에서 mAb 표적화 특정 형태의 에피토프인 다중 카피의 동일한 에피토프를 발현하는지에 따라 다양할 것이다.
VD1 및 VD2가 동일한 항원에 결합하지만 구분되는 에피토프를 갖는 경우, DVD-Ig는 동일한 항원에 대해 4개의 결합 부위를 함유함에 따라서 결합가(avidity) 및 DVD-Ig의 겉보기 Kd를 증가시킨다. 하나의 양태에서, DVD-Ig에서 목적하는 것 이하의 Kd를 갖는 모 항체가 선택된다. 모 mAb의 친화도 고려는 또한 DVD-Ig가 4개 이상의 동일한 항원 결합 부위(즉, 단일 mAb로부터 DVD-Ig)를 함유하는지에 의존할 수 있다. 이 경우에, 겉보기 Kd는 결합가로 인해 mAb 보다 클 것이다. 이러한 DVD-Ig는 표면 수용체를 가교결합시키거나, 중화 효능을 증가시키거나 병리학적 단백질의 제거를 증진시키는 것 등을 위해 사용될 수 있다.
하나의 양태에서 동일한 항원에 대해 DVD-Ig의 목적하는 중화 효능 이상의 특이적 항원에 대한 중화 효능을 갖는 모 항체가 선택된다. 중화 효능은 표적 의존적 생분석에 의해 측정될 수 있고, 이때 적당한 유형의 세포는 측정가능한 시그날(즉, 증식 또는 사이토킨 생산)을 표적 자극에 응답하여 생성하고 mAb에 의한 표적 중화는 용량-의존적 방식으로 시그날을 감소시킬 수 있다.
B3. 생물학적 기능
모노클로날 항체는 잠재적으로 여러 기능을 수행할 수 있다. 이들 기능중 몇몇은 표 1에 기재한다. 이들 기능은 시험관내 분석(예를 들어, 세포 기반 및 생화학적 분석) 및 생체내 동물 모델 둘다에 의해 평가될 수 있다.
Figure pct00001
본원의 실시예에 기재된 구분되는 기능을 갖는 MAb(표 1)는 목적하는 치료학적 결과를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 2개 이상의 선택된 모노클로날 항체를 이어서 DVD-Ig 포맷에 사용하여 단일 DVD-Ig 분자에 2개의 구분된 기능을 달성할 수 있다. 예를 들어, DVD-Ig는 특이적 사이토킨의 기능을 중화시키는 모 mAb를 선별하고, 병리학적 단백질의 제거를 증진시키는 모 mAb를 선별함에 의해 제조될 수 있다. 유사하게, 예를 들면, 하나의 수용체에 대해 효능제 기능을 갖는 하나의 mAb 및 다른 수용체에 대해 길항제 효능을 갖는 다른 mAb와 같은, 2개의 상이한 세포 표면 수용체를 인지하는 2개의 모 모노클로날 항체를 선별할 수 있다. 각각 구분된 기능을 갖는 이들 2개의 선택된 모노클로날 항체를 사용하여 단일 분자에서 선택된 모노클로날 항체의 2개의 구분된 기능(효능제 및 길항제)을 갖는 단일 DVD-Ig 분자를 작제할 수 있다. 유사하게, 각각의 수용체 리간드(예를 들어, EGF 및 IGF)의 결합을 각각 차단하는 세포 표면 수용체에 대한 2개의 길항작용 모노클로날 항체는 DVD-Ig 포맷에 사용될 수 있다. 역으로, 길항작용 항-수용체 mAb(예를 들어, 항-EGFR) 및 중화성 항-가용성 매개체(예를 들어, 항-IGFl/2) mAb는 DVD-Ig를 제조하기 위해 선별될 수 있다.
B4. 에피토프 인지:
상이한 영역의 단백질은 상이한 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 사이토킨의 특정 영역이 사이토킨 수용체와 상호작용하여 수용체 활성화를 유도할 수 있는 반면에 당해 단백질의 다른 영역은 사이토킨을 안정화시키기 위해 요구될 수 있다. 이 경우에 사이토킨 상에 수용체 상호작용 영역에 특이적으로 결합하여 사이토킨-수용체 상호작용을 차단하는 mAb를 선별할 수 있다. 몇몇 경우에, 예를 들어 다중 리간드에 결합하는 특정 케목킨 수용체, 단지 하나의 리간드와 상호작용하는 에피토프(케목킨 수용체 상의 영역)에 결합하는 mAb를 선별할 수 있다. 다른 경우에, 모노클로날 항체는 직접적으로 생리학적 기능의 단백질에 대해 관여하지 않는 표적상의 에피토프에 결합할 수 있지만 이들 영역으로의 mAb의 결합은 생리학적 기능을 방해하거나(입체 장애) 단백질이 기능하지 않도록(어느 리간드도 결합할 수 없도록 수용체 형태를 변화시킨 다중 리간드를 갖는 수용체에 대한 mAb) 단백질의 형태를 변화시킬 수 있다. 사이토킨의 이의 수용체로의 결합을 차단하지 않지만 시그날 전달은 차단하는 항-사이토킨 모노클로날 항체가 또한 동정되었다(예를 들어, 125-2H, 항-IL-18 mAb).
에피토프 및 mAb 기능의 예는 수용체-리간드(R-L) 상호작용의 차단(R-상호작용 부위에 결합하는 중화성 mAb); 감소된 R-결합 또는 R-결합 부재를 유발하는 입체 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Ab는 수용체 결합 부위와는 다른 부위에서 표적에 결합할 수 있지만, 형태적 변화를 유도하고 기능(예를 들어, Xolair)을 제거함으로써, 예를 들면, R에 결합하지만 시그날링 전달(125-2H)을 차단함으로써 수용체 결합 및 표적의 기능을 여전히 방해할 수 있다.
하나의 양태에서, 모 Ab는 최대 효능을 위해 적당한 에피토프를 표적화할 필요가 있다. 당해 에피토프는 DVD-Ig에서 보존되어야만 한다. mAb의 결합 에피토프는 공동-결정분석, mAb 항원 복합체의 제한된 단백질용해 + 질량 분광측정 펩타이드 맵핑(Legros V. et al.(2000) Protein Sci. 9:1002-10), 파아지 디스플레이된 펩타이드 라이브러리(O'Connor, K.H. et al.(2005) J. Immunol. Methods 299:21-35), 및 돌연변이 유발(Wu C. et al.(2003) J. Immunol. 170:5571-7)를 포함하는, 여러 방법에 의해 측정될 수 있다.
B5. 생리화학적 및 약제학적 성질:
항체를 사용한 치료학적 치료는 흔히 수 mg/kg의 고용량의 투여를 필요로한다(전형적으로 분자량이 높은 결과로서 질량을 기초로 낮은 효능 때문에). 환자 순응을 수용하고 만성 질환 치료법 및 외래환자 치료를 적당히 해결하기 위해, 치료학적 mAb를 피하(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 피하 투여를 위한 최대 바람직한 용량은 약 1.0 mL이고 따라서 용량당 주사 횟수를 제한하기 위해 >100 mg/mL의 농도가 바람직할 수 있다. 하나의 양태에서, 치료학적 항체는 1회 용량으로 투여된다. 그러나 당해 제형의 개발은 단백질-단백질 상호작용(예를 들어, 면역원성 위험을 잠재적으로 증가시키는 응집) 및 프로세싱 및 전달동안에 한계(예를 들어, 점도)에 의해 제한된다. 결과적으로, 임상적 효능을 위해 요구되는 대용량 및 관련된 개발 한계점이 항체 제형의 잠재력 및 고용량 치료계획에서의 피하 투여를 완전하게 사용하는 것을 제한한다. 단백질 분자 및 단백질 용액의 생리화학적 및 약제학적 성질, 예를 들어, 안정성, 용해도 및 점도 특징이 가장 중요하다는 것은 명백하다.
B5.1. 안정성:
"안정한" 항체 제형은 본원의 항체가 필수적으로 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 저장시 생물학적 활성을 보유하는 제형이다. 안정성은 선택된 시간동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 하나의 양태에서, 제형중의 항체는 실온(약 30℃) 또는 40℃에서 1개월 이상동안 안정하고/하거나 약 2 내지 8℃에서 1년 이상, 예를 들면, 2년 이상 동안 안정하다. 추가로 하나의 양태에서, 당해 제형은 이후 "동결/해동 사이클"로서 언급되는 제형의 동결(예를 들어 -70℃까지) 및 해동 후 안정하다. 또 다른 예에서, "안정한" 제형은 약 10% 미만 및 약 5% 미만의 단백질이 제형내에 응집체로서 존재하는 제형일 수 있다.
연장된 시간동안 다양한 온도에서 시험관내에서 안정한 DVD-Ig는 바람직할 수 있다. 이것은 승온, 예를 들어, 40℃에서 2 내지 4주동안 시험관내에서 안정한 모 mAb의 신속한 스크리닝에 의해 달성될 수 있고 이어서 안정성을 평가할 수 있다. 2 내지 8℃에서 저장동안에, 당해 단백질은 12개월 이상동안, 예를 들어 24개월 이상동안 안정함을 나타낸다. 안정성(단량체성 온전한 분자의 %)은 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE, 및 생활성 시험과 같은 다양한 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 공유 및 형태적 변형을 분석하기 위해 사용될 수 있는 분석 기술의 보다 이해할 수 있는 목록은 문헌[참조: Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems. In: Formulation and delivery of peptides and proteins, Cleland and Langer, eds. 1st edition, ACS, Washington, pg. 22-45; 및 Pearlman, R. and Nguyen, T. H. (1990) Analysis of protein drugs. In: Peptide and protein drug delivery, Lee, ed. 1st edition, Marcel Dekker, Inc., New York, pg. 247-301]을 참조한다.
이종성 및 응집체 형성: 항체의 안정성은 제형이 약 10% 미만, 예를 들면, 약 5% 미만, 예를 들면, 약 2% 미만 또는 응집체로서 존재하는 GMP 항체 물질 중 0.5% 내지 1.5% 이하의 범위내일 수 있도록 한다. 크기 배제 크로마토그래피는 단백질 응집체의 검출에서 민감성이고 재생가능하고 매우 강력한 방법이다.
낮은 응집체 수준 외에도, 항체는 하나의 양태에서 화학적으로 안정해야만 한다. 화학적 안정성은 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 등전점 포커싱 또는 모세관 전기영동과 같은 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 화학적 안정성은 2 내지 8℃에서 12개월 이상동안 저장 후 양이온 교환 크로마토그래피에서 비변형된 항체를 나타내는 피크를 저장 시험 전의 항체와 비교하여 20% 이하, 예를 들면, 10% 이하, 또는 예를 들면, 5% 이하로 증가시킬 수 있다.
하나의 양태에서, 모 항체는 구조적 위상을 나타낸다; 올바른 디설파이드 결합 형성 및 올바른 폴딩. 항체의 2차 또는 3차 구조에서의 변화로 인한 화학적 불안정성은 항체 활성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 항체의 활성에 의해 저적된 바와 같은 안정성은, 2 내지 8℃에서 12개월 이상의 저장 후, 항체의 활성을 저장 시험 전의 항체 용액과 비교하여 50% 이하, 예를 들면, 30% 이하 또는 10% 이하 또는 5% 또는 1% 이하로 감소시킬 수 있다. 적합한 항원 결합 분석을 사용하여 항체 활성을 측정할 수 있다.
B5.2. 용해도:
mAb의 "용해도"는 올바르게 폴딩된 단량체성 IgG의 생성과 관련이 있다. IgG의 용해도는 따라서 HPLC에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 가용성 (단량체성) IgG는 HPLC 크로마토그램에 단일 피크를 생성시키는 반면 불용성(예를 들어, 다량체 및 응집된)은 다수의 피크를 생성시킨다. 당업자는 따라서 통상적인 HPLC 기술을 사용하여 IgG의 용해도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 용해도를 분석하기 위해 사용될 수 있는 분석 기술의 보다 이해될 수 있는 목록을 위해 문헌(참조: Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK. Editor(s): Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-117. Publisher: Butterworth-Heinemann, Oxford, UK and Pearlman, Rodney; 및 Nguyen, (1990) Advances in Parenteral Sciences, 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301)을 참조한다. 치료학적 mAb의 용해도는 흔히 적당한 용량을 위해 요구되는 고농도로 제형화시키는데 있어서 중요하다. 본원에 명시된 바와 같이, > 100 mg/mL의 용해도가 효율적인 항체 용량을 수용하기 위해 요구될 수 있다. 예를 들어, 항체 용해도는 조기 연구 단계에서 약 5mg/ml 이상일 수 있고, 예를 들면, 진보 과정 과학 단계에서 예를 들면, 약 25 mg/mL 이상, 예를 들면, 약 100 mg/mL 이상, 또는 약 150mg/ml 이상일 수 있다. 단백질 분자의 고유 성질, 예를 들어, 단백질 용액의 물리-화학적 성질, 예를 들어, 안정성, 용해도, 점도가 중요함은 당업자에게 자명하다. 그러나 당업자는 광범위한 부형제가 최종 단백질 제형의 특성에 이롭게 영향을 주는 첨가제로서 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 이들 부형제는 다음을 포함할 수 있다: (i) 액체 용매, 공용매(예를 들어, 알콜, 예를 들어, 에탄올); (ii) 완충제(예를 들어, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 및 아미노산 완충제); (iii) 당 또는 당 알콜 (예를 들어, 슈크로스, 트레할로스, 프럭토스, 라피노스, 만니톨, 소르비톨, 및 덱스트란); (iv) 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 40, 60 및 80, 및 폴록사머); (v) 등장성 개질제 (예를 들어, 염, 예를 들어, NaCl, 당 및 당 알콜); 및 (vi) 기타 (예를 들어, 방부제, 킬레이팅제, 항산화제, 킬레이팅 물질(예를 들어, EDTA), 생분해성 중합체, 및 담체 분자(예를 들어, HSA, 및 PEG).
점도는 항체 제조 및 항체 프로세싱(예를 들어, 정용여과/한외여과), 충전-마무리 공정(펌핑 측면, 여과 측면) 및 전달 측면(주사능, 정교한 장치 전달)과 관련하여 매우 중요한 파라미터이다. 낮은 점도는 항체 용액이 보다 높은 농도가 되도록 할 수 있다. 이것은 동일 용량이 보다 적은 용적으로 투여될 수 있게 해준다. 적은 주사 용액은 주사시 통증을 보다 낮게 한다는 이점을 갖게 하고 당해 용액은 환자내 주사시 통증을 감소시키기 위해 등장성일 필요는 없다. 항체 용액의 점도는, 100(1/s)의 전단 비율에서, 항체 용액 점도는 200mPa s미만, 예를 들면, 125mPa s 미만, 예를 들면, 70mPa s미만, 예를 들면, 25mPa s미만이거나, 심지어 10mPa s 미만일 수 있다.
B 5.3. 생성 효율
차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포에서 효율적으로 발현되는 DVD-Ig의 생성은 하나의 양태에서, 이들 자체가 포유동물 세포에서 효율적으로 발현되는 2개의 모 모노클로날 항체를 요구한다. 안정한 세포주(즉, CHO)로부터 생성 효율은 약 0.5g/L 이상, 예를 들면, 약 1 g/L 이상, 및 예를 들면, 약 2 내지 약 5 g/L 이상의 범위이어야만 한다(Kipriyanov, S.M. and Little M.(1999) Mol. Biotechnol. 12:173-201; Carroll, S. and Al-Rubeai, M.(2004) Expert. Opin. Biol. Ther. 4:1821-9).
포유동물 세포에서 항체 및 Ig 융합 단백질의 제조는 여러 인자에 의해 영향받는다. 강한 프로모터, 인핸서 및 선별 마커의 혼입을 통한 발현 벡터는 통합된 벡터 카피로부터 목적하는 유전자의 전사를 최대화시킬 수 있다. 고수준의 유전자 전사를 허용하는 벡터 통합 부위의 동정은 벡터 기원의 단백질 발현을 증강시킬 수 있다(Wurm et al.(2004) Nature Biotech. 22(11):(1393-1398). 추가로, 생성 수준은 항체 중쇄 및 경쇄의 비율 및 단백질 어셈블리 및 분비 공정에서 다양한 단계에 의해 영향받는다(Jiang et al.(2006) Biotechnol. Prog. 22(1), p. 313-8).
B 6. 면역원성
치료학적 mAb의 투여는 특정 빈도의 면역 반응(즉, 치료학적 mAb에 대한 내인성 항체의 형성)을 유도할 수 있다. 면역원성을 유도할 수 있는 잠재적인 요소는 모 모노클로날 항체의 분비동안에 분석되어야만 하고 당해 위험을 감소시키는 단계는 DVD-Ig 작제 전에 모 모노클로날 항체를 최대화하기 위해 수행될 수 있다. 마우스 유래된 항체는 환자에서 고도로 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 마우스 가변 및 인간 불변 영역으로 이루어진 키메라 항체의 생성은 치료학적 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 필연적인 다음 단계를 제공한다. 또한, 치료학적 항체에 대해 문헌[Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]에 의해 기재된 바와 같이 면역원성은 쥐 CDR 서열을 인간 항체 골격(재형성/CDR 접목/인간화)으로 전달함에 의해 감소될 수 있다. 또 다른 방법은 설치류 가변 경쇄 및 중쇄 도메인으로 시작하는 "재표면화" 또는 "베니어링"으로 언급되고 단지 표면-접근 골격 아미노산이 인간의 것으로 변화되고 CDR 및 묻혀진 아미노산은 모 설치류 항체의 것으로 유지한다(문헌참조: Roguska et al. (1996) Prot. Engineer 9:895-904). 또 다른 유형의 인간화에서, 전체 CDR을 접목시키는 것 대신, 하나의 기술이 항체의 이의 표적으로의 결합에 관여하는 CDR 잔기의 서브셋으로서 정의된 단지 "특이성-결정 영역"(SDR)을 접목시킨다(문헌참조: Kashmiri et al.(2005) Methods 36(1): 25-34). 이것은 가용한 항체-표적 복합체의 가용한 3차원 구조의 분석 또는 표적과의 상호작용하는지를 결정하기 위한 항체 CDR 잔기의 돌연변이 분석을 통해 SDR의 동정을 가능하게 한다. 또한, 완전한 인간 항체는 쥐, 키메라 또는 인간화된 항체와 비교하여 감소된 면역원성을 가질 수 있다.
치료학적 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 또 다른 방법은 면역원성인 것으로 예측되는 특정 특이적 서열의 제거이다. 하나의 방법에서, 제1 세대 생물작용은 인간에서 시험되었고 수용가능하지 않게 면역원성인 것으로 밝혀진 후, B-세포 에피토프는 맵핑되고 면역 검출을 피하기 위해 변화될 수 있다. 또 다른 방법은 잠재적인 T 세포 에피토프를 예측하고 제거하는 방법을 사용한다. 컴퓨터 방법은 MHC 단백질과 결합하는 잠재력을 갖는 생물학적 치료제의 펩타이드 서열을 스캐닝하고 동정하기 위해 개발되었다(Desmet et al. (2005) Proteins 58: 53-69). 또한 인간 수지상 세포계 방법을 사용하여 잠재적인 단백질 알레르겐에서 CD4+ T-세포 에피토프를 동정할 수 있다(문헌참조: Stickler et al. (2000) J. Immunother. 23: 654-60; S.L. Morrison and J. Schlom (1990) Important Adv. Oncol.3-8; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Roguska et al. (1996) Protein Engineer. 9: 895-904; Kashmiri et al. (2005) Methods 36(1): 25-34; Desmet et al. (2005) Proteins 58: 53-69; 및 Stickler et al. (2000) J. Immunotherapy 23: 654-60).
B 7. 생체내 효능
목적하는 생체내 효능을 갖는 DVD-Ig 분자를 생성하기 위해, 배합으로 주어지는 경우 유사하게 목적하는 생체내 효능을 갖는 mAb를 생성하고 선별하는 것이 중요하다. 그러나, 몇몇 경우에 DVD-Ig는 2개의 별도의 mAb를 배합하여 달성될 수 없는 생체내 효능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, DVD-Ig는 2개의 표적을 근접하게 하여 2개의 별도의 mAb의 배합으로 달성될 수 없는 활성을 유도할 수 있다. 추가의 바람직할 수 있는 생물학적 기능은 섹션 B3에 본원에 기재되어 있다. DVD-Ig 분자에 바람직할 수 있는 특성을 갖는 모 항체는 약제동력학 t 1/2; 조직 분포; 가용성 대 세포 표면 표적 및 표적 농도-가용성/밀도-표면과 같은 인자를 기초로 선택될 수 있다.
B 8. 생체내 조직 분포
목적하는 생체내 조직 분포를 갖는 DVD-Ig 분자를 생성하기 위해, 하나의 양태에서, 유사한 목적하는 생체내 조직 분포 프로필을 갖는 모 mAb가 선택되어야만 한다. 이와 관련하여, 모 mAb는 동일한 항체 또는 상이한 항체일 수 있다. 또한, 이원 특이적 표적화 전략의 기작을 기준으로, 다른 시점에서 배합으로 주어지는 경우 유사하게 목적하는 생체내 조직 분포를 갖는 모 mAb를 선별하는 것이 요구되지 않을 수 있다(예를 들어, 하나의 결합 성분이 DVD-Ig를 특이적 부위로 표적화하여 제2 결합 성분이 동일한 표적 부위에 오도록 유도하는 DVD-Ig의 경우에서). 예를 들어, DVD-Ig의 하나의 결합 특이성은 췌장(섬 세포)을 표적화할 수 있고 다른 특이성은 GLP1을 췌장으로 오게하여 인슐린을 유도할 수 있다.
B 9. 이소타입:
이소타입, 이펙터 기능, 및 순환 반감기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적하는 성질을 갖는 DVD-Ig 분자를 생성하기 위해, 하나의 양태에서, 치료학적 용도 및 목적하는 치료학적 엔드포인트에 따라 적당한 Fc 이펙터 기능을 갖는 모 mAb를 선택한다. 모 mAb는 동일한 항체 또는 상이한 항체일 수 있다. 5개의 주요 중쇄 부류 또는 이소타입이 있고 이중 몇몇은 여러 서브타입을 갖고 이들은 항체 분자의 이펙터 기능을 결정한다. 이들 이펙터 기능은 항체 분자의 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인에 있다. 그러나, 항체 분자의 다른 부분에서의 잔기는 또한 이펙터 기능에 효과를 가질 수 있다. 힌지 영역 Fc-이펙터 기능은 다음을 포함한다: (i) 항체 의존성 세포독성, (ii) 보체(C1q) 결합, 활성화 및 보체 의존성 세포독성 (CDC), (iii) 항원-항체 복합체의 식세포작용/제거, 및 (iv) 몇몇 경우에 사이토킨 방출. 항체 분자의 이들 Fc-이펙터 기능은 Fc-영역과 한 세트의 부류 특이적 세포 표면 수용체의 상호작용을 통해 매개된다. IgG1 이소타입의 항체는 대부분 활성이지만 최소 또는 IgG2 및 IgG4는 최소로 또는 어떠한 이펙터 기능을 갖지 않는다. IgG 항체의 이펙터 기능은 3개의 구조적으로 유사한 세포 Fc 수용체 유형(및 서브타입)(FcgRl, FcgRII 및 FcgRIII)의 상호작용을 통해 매개된다. IgG1의 이들 이펙터 기능은 FcgR 및 C1q 결합을 위해 요구되는 하부 힌지 영역(예를 들어, L234A, L235A)에서 특이적 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 제거될 수 있다. Fc 영역에서 아미노산 잔기, 특히, CH2-CH3 도메인은 또한 항체 분자의 순환 반감기를 결정한다. 이러한 Fc 기능은 산성 리소좀으로부터 항체 분자의 일반적 순환으로 복귀시키는 재순환에 관여하는 신생 Fc 수용체(FcRn)으로의 Fc-영역의 결합을 통해 매개된다.
mAb가 활성 또는 불활성 이소타입을 가져야만 하는지의 여부는 항체에 대해 목적하는 치료학적 엔드포인트에 의존한다. 이소타입의 용도 및 목적하는 치료학적 결과에 대한 몇몇 예는 하기에 열거한다:
a) 목적하는 엔드포인트가 가용성 사이토킨의 기능성 중화작용인 경우, 불활성 이소타입이 사용될 수 있고;
b) 목적하는 결과가 병리학적 단백질의 제거인 경우 활성 이소타입이 사용될 수 있고;
c) 목적하는 결과가 단백질 응집체의 제거인 경우 활성 이소타입이 사용될 수 있고;
d) 목적하는 결과가 표면 수용체를 길항시키는 것인 경우, 불활성 이소타입이 사용되고(Tysabri, IgG4; OKT3, 돌연변이된 IgG1);
e) 목적하는 결과가 표적 세포를 제거하는 것인 경우, 활성 이소타입이 사용되고(Herceptin, IgG1 (및 증진된 이펙터 기능과 함께);
f) 목적하는 결과가 CNS에 진입하는 것 없이 순환으로부터 단백질을 제거하는 것인 경우 IgM 이소타입이 사용될 수 있다(예를 들어, 순환하는 Ab 펩타이드 종의 제거).
모 mAb의 Fc 이펙터 기능은 당업계에 널리 공지된 다양한 시험관내 방법에 의해 측정될 수 있다.
논의된 바와 같이, 이소타입의 선별 및 이에 의한 이펙터 기능은 목적하는 치료학적 엔드포인트에 의존한다. 순환 표적의 단순한 중화가 요구되는 경우, 예를 들어, 수용체-리간드 상호작용을 차단시키는 경우, 이펙터 기능은 요구되지 않을 수 있다. 당해 경우에 이펙터 기능을 제거하는 항체의 Fc-영역내 이소타입 또는 돌연변이가 바람직할 수 있다. 표적 세포의 제거가 치료학적 엔드포인트인 다른 경우에, 예를 들어, 종양 세포를 제거하는 경우, 이펙터 기능을 증진시키는 Fc 영역에서 이소타입 또는 돌연변이 또는 탈푸코실화가 바람직할 수 있다(문헌참조: Presta G.L. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58:640-656 및 Satoh, M. et al. (2006) Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1161-1173). 유사하게, 치료학적 용도에 의존하여 항체 분자의 순환 반감기는 Fc 영역에서 특이적 돌연변이를 도입함에 의해 항체-FcRn 상호작용을 조절함에 의해 감소되거나/지연될 수 있다(문헌참조: Dall'Acqua, W.F. et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 23514-23524; Petkova, S.B. (2006) et al., Internat. Immunol. 18:1759-1769; Vaccaro, C. et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18709-18714).
정상의 치료학적 mAb의 상이한 이펙터 기능에 영향을 주는 다양한 잔기에 대한 공개된 정보는 DVD-Ig에 대해 확인될 필요가 있을 수 있다. DVD-Ig 포맷에서 모노클로날 항체 이펙터의 조절을 위해 동정된 것들 이외에 추가의(상이한) Fc-영역 잔기가 중요할 수 있다.
전반적으로, Fc-이펙터 기능(이소타입)이 최종 DVD-Ig 포맷에서 중요한지에 관한 결정은 질환 증상, 치료학적 표적, 목적하는 치료학적 엔드포인트 및 안정성 고려에 따라 다양할 것이다.
o IgG1 - 알로타입: Glmz
o IgG1 돌연변이 - A234, A235
o IgG2 - 알로타입: G2m(n-)
o 카파 - Km3
o Lambda를 포함하지만 이에 제한되지 않은 적당한 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 예시된다.
Fc 수용체 및 C1q 연구: 세포 막상에 임의의 과발현된 표적과 복합체를 형성하는 항체에 의한 원치않는 항체 의존적 매개된 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)의 가능성은 (예를 들어, L234A, L235A) 힌지 영역 돌연변이에 의해 제거될 수 있다. mAb의 IgG1 힌지 영역에 존재하는 이들 치환된 아미노산은 FcgR 결합이 IgG1 힌지 영역상의 중첩 부위내에 존재하는 것으로 사료됨에 따라 mAb의 인간 Fc 수용체(FcRn이 아니라)의 결합을 감소시킬 것으로 예상된다. 이러한 mAb의 특징은 야생형 IgG를 포함하는 항체에 대해 개선된 안전성 프로필을 유도할 수 있다. 인간 Fc 수용체로의 mAb의 결합은 FcgRIIb (또는 기타 FcgRs)를 발현하는 세포주(예를 들어, THP-l, K562) 및 조작된 CHO 세포주를 사용하는 유동 세포 측정 실험에 의해 결정될 수 있다. IgG1 대조군 모노클로날 항체와 비교하는 mAb는 FcgRI 및 FcgRIIa로의 감소된 결합을 보여주는 반면 FcgRIIb로의 결합은 영향받지 않는다. 항원/IgG 면역 복합체에 의한 C1q의 결합 및 활성화는 결과적으로 발생하는 염증 및/또는 면역조절 반응과 함께 전형적인 보체 캐스케이드를 유발한다. IgG상의 C1q 결합 부위는 IgG 힌지 영역에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 증가하는 농도의 mAb에 결합하는 C1q는 C1q ELISA에 의해 평가되었다. 당해 결과는 야생형 대조군 IgG1의 결합과 비교하는 경우 예상되는 바와 같이 mAb가 C1q에 결합할 수 없음을 입증한다. 전반적으로, L234A, L235A 힌지 영역 돌연변이는 mAb의 FcgRI, FcgRIIa 및 C1q로의 결합을 제거시키지만 mAb와 FcgRIIb의 상호작용에는 영향을 주지 않는다. 이러한 데이터는 돌연변이 Fc를 갖는 생체내 mAb가 정상적으로 억제 FcgRIIb와 상호작용하지만 활성화 FcgRI 및 FcgRIIa 수용체 또는 C1q와는 상호작용하지 않을 가능성이 있음을 시사한다.
인간 FcRn 결합: 신생아 수용체(FcRn)는 태반을 거치는 IgG의 수송에 관여하고 IgG 분자의 이화작용 반감기를 조절한다. 효능을 개선시키거나, 용량 또는 투여 횟수를 감소시키거나 표적물로의 국소화를 개선시키기 위해 항체의 최종 반감기를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 역으로 즉, 항체의 최종 반감기를 감소시켜 전신 노출을 감소시키거나 표적 대 비표적 결합 비율을 개선시키는 것이 유리할 수 있다. IgG와 이의 구제 수용체 FcRn간의 상호작용을 조작하는 것이 IgG의 최종 반감기를 증가시키거나 감소시키는 방법을 제공한다. 순환내 IgG를 포함하는 단백질은 혈관 내피세포와 같은 특정 세포에 의한 미세음세포작용을 통해 유체 상에 흡수된다. IgG는 약산성 조건 (pH 6.0-6.5)하에 엔도좀내 FcRn과 결합할 수 있고 세포 표면으로 재순환될 수 있으며, 이것은 거의 중성 조건(pH 7.0-7.4)하에 방출된다. FcRn80, 16, 17상의 Fc-영역 결합 부위의 맵핑은 종 His310 및 His435에 걸쳐 보존된 2개의 히스티딘 잔기가 당해 상호작용의 pH 의존성에 관여함을 보여주었다. 파아지-디스플레이 기술을 사용하여, FcRn으로의 결합을 증가시키고 마우스 IgG의 반감기를 연장시키는 마우스 Fc-영역 돌연변이가 동정되었다(문헌참조: Victor, G. et al. (1997) Nature Biotechnol., 15(7); 637-640). pH 6.0에서 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합 친화도를 증가시키지만 pH 7.4에서는 증가시키지 않는 Fc-영역 돌연변이가 또한 동정되었다(문헌참조: Dall'Acqua William F., et al.,(2002) J. Immunol. 169(9); 5171-80). 더욱이, 한 경우에, 결합에서 유사한 pH 의존성 증가(27배 이하)는 또한 레서스 FcRn에 대해 관찰되었고, 이것은 모 IgG와 비교하여 레서스 몽키에서 혈청 반감기를 2배 증가시켰다(문헌참조: Hinton, Paul R. et al. (2004) J. Biol. Chemi. 279(8); 6213-6216). 이들 발견은 Fc 영역과 FcRn의 상호작용을 조작함에 의해 항체 치료제의 혈장 반감기를 연장시킬 수 있음을 지적한다. 역으로, FcRn과의 상호작용을 감쇠시키는 Fc-영역 돌연변이는 항체 반감기를 감소시킬 수 있다.
B.10 약리역학( PK ):
목적하는 약리역학 프로필을 갖는 DVD-Ig 분자를 생성하기 위해, 하나의 양태에서, 유사하게 목적하는 약리역학 프로필을 갖는 모 mAb가 선택된다. 하나의 고려는 모노클로날 항체에 대한 면역원성 반응(즉, HAHA, 인간 항-인간 항체 반응; HACA, 인간 항-키메라 항체 반응)은 추가로 이들 치료학적 제제의 약리역학을 복잡하게 한다는 것이다. 하나의 양태에서, 최소의 면역원성을 갖거나 어떠한 면역원성을 갖지 않는 모노클로날 항체는 수득한 DVD-Ig가 또한 최소의 면역원성을 갖거나 어떠한 면역원성을 갖지 않도록 DVD-Ig 분자를 작제하기 위해 사용된다. mAb의 PK를 결정하는 인자 몇몇은 mAb의 고유 성질(VH 아미노산 서열), 면역원성, FcRn 결합, 및 Fc 기능을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
선택된 모 모노클로날 항체의 PK 프로필은 설치류에서 PK 프로필이 시노몰거스 몽키 및 인간에서 모노클로날 항체의 PK 프로필과 양호하게 관련됨(또는 근접하게)으로써 설치류에서 용이하게 결정될 수 있다. PK 프로필은 실시예 섹션 1.2.2.3.A에서 기재된 바와 같이 결정된다.
목적하는 PK 특성(및 본원에서 논의된 바와 같은 기타 목적하는 기능성 성질)을 갖는 모 모노클로날 항체가 선택된 후, DVD-Ig가 작제된다. DVD-Ig 분자가 2개의 모 모노클로날 항체 기원의 2개의 항원 결합 도메인을 함유함으로 DVD-Ig의 PK 성질이 또한 평가된다. 따라서, DVD-Ig의 PK 성질을 결정하면서, 2개의 모 모노클로날 항체 기원의 항원 결합 도메인 둘다의 기능성을 기준으로 PK 프로필을 결정하는 PK 분석이 사용될 수 있다. DVD-Ig의 PK 프로필은 실시예 1.2.2.3.A에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. DVD-Ig의 프로필에 영향을 줄 수 있는 추가의 인자는 항원-결합 도메인(CDR) 배향; 링커 크기; 및 Fc/FcRn 상호작용을 포함한다. 모 상체의 PK 특성 분석은 하기의 파라미터를 평가함에 의해 평가될 수 있다: 흡수, 분배, 대사 및 분비.
흡수: 지금까지, 치료학적 모노클로날 항체의 투여는 비경구 경로(예를 들어, 정맥내(IV), 피하(SC), 또는 근육내(IM)를 통해서이다. 간질 공간으로부터 SC 또는 IM 투여 후 전신 순환으로의 mAb의 흡수는 주로 림프 경로를 통해서이다. 포화될 수 있는, 예비전신성 단백질 용해 분해는 혈관외 투여 후 다양한 절대적 생물유용성을 유도할 수 있다. 일반적으로, 모노클로날 항체의 용량 증가와 함께 절대적 생물유용성의 증가는 보다 높은 용량에서 포화된 단백질 용해 능력으로 인해 관찰될 수 있다. mAb에 대한 흡수 과정은 통상적으로 림프액이 서서히 혈관계로 누출됨에 따라서 매우 느리고 흡수의 지속시간은 수시간 내지 수일간에 걸쳐 일어날 수 있다. SC 투여 후 모노클로날 항체의 절대적 생물유용성은 50% 내지 100%이다.
분배: IV 투여 후, 모노클로날 항체는 신속한 분배 상에 이어서 느린 제거 상으로 시작하여 통상적으로 2상 혈청(또는 혈장) 농도-시간 프로필에 따른다. 일반적으로, 이중지수적 약동력학모델은 당해 종류의 약리동력학적 프로필을 최상으로 기재한다. mAb에 대한 중추 격막(Vc)내 분배 용적은 통상적으로 혈장 용적(2 내지 3 리터)과 동일하거나 약간 크다. 시간 프로필에 대한 혈청(혈장) 농도에서 구분되는 2상 패턴은 투여의 또 다른 비경구 경로(예를 들어, IM 또는 SC)와 함께 명백하지 않을 수 있는데 그 이유는 혈청(혈장) 농도-시간 곡선의 분배 상이 긴 흡수부에 의해 차폐되기 때문이다. 물리화학적 성질, 부위 특이적 및 표적 배향된 수용체 매개된 흡수, 조직의 결합 능력 및 mAb 용량을 포함하는 많은 인자는 mAb의 생분배에 영향을 줄 수 있다. 이들 요소중 일부는 mAb에 대한 생분배에 비선형성으로 기여할 수 있다.
대사 및 분비: 분자 크기로 인해, 온전한 모노클로날 항체는 신장을 통해 뇨로 분비되지 않는다. 이들은 주로 대사(예를 들어, 이화작용)에 의해 불활성화된다. IgG-기본 치료학적 모노클로날 항체에 대해 반감기는 전형적으로 수시간 내지 1 내지 2일에서 20일 이상의 범위이다. mAb의 제거는 FcRn 수용체에 대한 친화도, mAb의 면역원성, mAb의 당화정도, 단백질용해에 대한 mAb의 민감성 및 수용체 매개 제거를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 인자에 의해 영향 받을 수 있다.
B.ll 인간 및 tox 종 상의 조직 교차-반응성 패턴:
동일한 염색 패턴은 잠재적인 인간 독성이 tox 종에서 평가될 수 있음을 시사한다. Tox 종은 관련되지 않은 독성이 연구되는 동물들이다.
개별 항체는 2개의 기준을 충족하도록 선택된다. (1) 항체 표적의 공지된 발현을 위해 적당한 조직 염색 및 (2) 동일한 기관으로부터 기원하는 인간과 tox종 조직간의 유사한 염색 패턴.
기준 1 : 면역화 및/또는 항체 선별은 전형적으로 재조합 또는 합성된 항원(단백질, 탄수화물 또는 기타 분자)을 사용한다. 관련되지 않은 항원에 대한 천연 대응물과 역스크린에 결합하는 것은 흔히 치료학적 항체를 위한 스크리닝 퍼넬(funnel)이다. 그러나, 다수의 항원에 대한 스크리닝은 흔히 비현실적이다. 따라서, 모든 주요 기관 기원의 인간 조직을 갖는 조직 교차-반응성 연구는 임의의 관련되지 않은 항원으로의 항체의 원치않는 결합을 배제하는 작용을 한다.
기준 2: 인간과 tox 종 조직(시노몰거스 몽키, 개, 능히 설치류 및 기타, 동일한 36개 또는 37개 조직이 인간 연구에서와 같이 시험된다)은 tox 종의 선별을 입증하는 것을 도와준다. 동결된 조직 절편상의 전형적인 조직 교차 반응성 연구에서 치료학적 항체는 공지된 항원으로의 예상된 결합 및/또는 보다 적은 정도로 낮은 수준의 상호작용(비특이적 결합, 유사한 항원으로의 낮은 수준의 결합, 낮은 수준의 전하에 기초한 상호작용 등)을 기초로 하는 조직으로의 결합을 입증할 수 있다. 임의의 경우, 대부분의 관련 독성학 동물 종은 인간 및 동물 조직에 동시에 고도로 결합하는 종이다.
조직 교차-반응성 연구는 다음 지침서[EC CPMP Guideline 111/5271/94 "Production and quality control of mAbs" and the 1997 U.S. FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use"]를 포함하는 적당한 조절 지침에 따른다. 부검 또는 생검에서 수득된 인간 조직의 동결절편(5 μm)을 고정시키고 대물 유리상에서 건조시킨다. 조직 절편의 퍼옥시다제 염색은 아비딘-비오틴 시스템을 사용하여 수행하였다(FDA's 지침 "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use").
조직 교차-반응성 연구는 흔히 2개의 단계로 수행되고 제1 단계는 인간 공여자 기원의 32개 조직(전형적으로: 부신, 위장관, 전립선, 방광, 심장, 골격근, 혈액 세포, 신장, 피부, 골수, 간, 척수, 유방, 페, 비장, 소뇌, 림프절, 고환, 대뇌피질, 난소, 흉선, 결장, 췌장, 전립선, 갑상선, 내피, 부갑상선, 수뇨관, 눈, 뇌하수체, 자궁, 나팔관 및 태반)의 동결절편을 포함한다. 제2 단계에서, 완전한 교차 반응성 연구는 3명의 관련되지 않은 성인 기원의 38개 이하의 조직(부신, 혈액, 혈관, 골수, 소뇌, 대뇌, 자궁경관, 식도, 눈, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 유방 유선, 난소, 난관, 췌장, 부갑상선, 말초 신경, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침선, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 횡문근, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 수뇨관, 뇨 방광 및 자궁)을 사용하여 수행된다. 연구는 전형적으로 최소로 2개의 용량 수준에서 수행된다.
치료학적 항체(즉, 시험 제품) 및 이소형 매치된 대조군 항체는 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 검출을 위해 비오티닐화될 수 있다. 기타 검출 방법은 FITC(또는 그 밖에) 표지된 시험 제품에 대한 3차 항체 검출 또는 비표지된 시험 제품에 대한 표지된 항-인간 IgG와의 예비 복합체 형성을 포함할 수 있다.
간략하게, 부검 또는 생검에서 수득된 인간 조직의 동결절편(약 5 μm) 을 고정화하고 대물 글래스상에서 건조시킨다. 조직 절편의 퍼옥시다제 염색은 아비딘-비오틴 시스템을 사용하여 수행한다. 먼저(예비 복합체 형성 검출 시스템의 경우), 시험 제품은 2차 비오티닐화된 항-인간 IgG로 항온처리하고 면역 복합체가 되도록 한다. 시험 제품 2 및 10 μg/mL의 최종 농도에서 면역 복합체는 대물 글래스상의 조직 절편상으로 첨가하고 조직 절편은 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 키트와 30분동안 반응시킨다. 이어서 DAB (3,3'-디아미노벤지딘), 퍼옥시다제 반응을 위한 기질을 조직 염색을 위해 4분동안 적용한다. 항원-세파로스 비드는 양성 대조군 조직 절편으로서 사용한다.
임의의 특이적 염색은 미지의 표적 항원의 공지된 발현을 토대로 예상되거나(예를 들어, 항원 발현과 일치하여) 예상치 않은 반응성인 것으로 판단된다. 특이적인 것으로 판단된 임의의 염색은 강도 및 분포에 대해 스코어된다. 항원 또는 혈청 경쟁 또는 차단 연구는 관찰된 염색이 특이적 또는 비특이적인지를 결정하는데 도움을 줄 수 있다.
2개의 선택된 항체가 선택 기준(적당한 조직 염색, 및 인간과 독성 동물 특이적 조직 간에 염색의 일치)을 충족하는 것으로 밝혀진 경우, 이들은 DVD-Ig 생성을 위해 선택될 수 있다.
조직 교차-반응성 연구는 최종 DVD-Ig 작제물을 사용하여 반복되어야만 하지만 이들 연구는 본원에 명시된 바와 동일한 프로토콜을 따르고 이들은 평가를 위해 보다 복잡한데 그 이유는 임의의 결합이 2개의 모 항체중 어느 하나에 기인할 수 있고 임의의 설명되지 않은 결합이 복합체 항원 경쟁 연구를 사용하여 확인될 필요가 있다.
DVD-Ig와 같은 다특이적 분자를 사용한 복잡한 조직 교차반응성 연구의 착수는 2개의 모 항체가 (1) 예상되지 않은 조직 교차 반응성 발견의 부재 및 (2) 상응하는 인간과 독성 동물 종 조직간의 조직 교차 반응성의 적당한 유사성에 대해 선별되는 경우 크게 단순화된다는 것은 명백하다.
B.12 특이성 및 선택성:
목적하는 특이성 및 선택성을 갖는 DVD-Ig 분자를 제조하기 위해, 목적하는 특이성 및 선택성 프로필이 유사한 모 mAb를 제조하고 선택할 필요가 있다. 이와 관련하여, 모 mAb는 동일한 항체 또는 상이한 항체일 수 있다.
DVD-Ig을 사용하는 특이성 및 선택성에 대한 결합 연구는 4개 이상의 결합 부위(2개 각각은 2개 항원에 대한 것이다)로 인해 복잡할 수 있다. 간략하게, DVD-Ig와 함께 ELISA(효소 결합된 면역흡착 분석), BIAcore, KinExA 또는 기타 상호작용 연구는 DVD-Ig 분자에 대한 1개 또는 2개 이상의 항원 결합을 모니터할 필요가 있다. BIAcore 기술은 다중 항원의 연속적 독립적 결합을 해결할 수 있지만 KinExA와 같은 ELISA 또는 보다 근대의 기술을 포함하는 보다 통상적인 방법은 할 수 없다. 따라서 각각의 모 항체의 주의깊은 특징 분석은 주요하다. 각각의 개별 항체가 특이성에 대해 특성 분석된 후, DVD-Ig 분자에서 개별 결합 부위의 특이성 보유에 대한 확인은 크게 단순화된다.
DID-Ig의 특이성을 결정하는 복잡한 연구 착수는 2개의 모 항체가 DVD-Ig로 배합되기 전에 특이성에 대해 선택되는 경우 크게 단순화된다는 것은 명백하다. 모 항체는 동일한 항체 또는 상이한 항체일 수 있다.
항원-항체 상호작용 연구는 많은 전형적인 단백질-단백질 상호작용 연구를 포함하는 임의의 형태를 취할 수 있고, 이는 ELISA, 질량 분광법, 화학적 교차 결합, 광 산란을 갖는 SEC, 평형 투석, 겔 침투, 한외여과, 겔 크로마토그래피, 대형-지대 분석 SEC, 미세정제용 한외원심분리 (침강 평형), 분광 방법, 적정 마이크로칼로리측정기, 침강 평형 (분석 한외원심분리기), 침강 속도(분석적 원심분리기에서), 및 표면 플라스몬 공명(BIAcore를 포함)을 포함한다. 관련 문헌은 문헌["Current Protocols in Protein Science," Coligan, J.E. et al. (eds.) Volume 3, chapters 19 and 20, published by John Wiley & Sons Inc., 및 "Current Protocols in Immunology," Coligan, J.E. et al. (eds.) published by John Wiley & Sons Inc., 및 본원에 포함된 관련 문헌]을 포함한다.
전혈에서 사이토킨 방출: 인간 혈액 세포외 mAb의 상호작용은 사이토킨 방출 분석에 의해 조사될 수 있다(문헌참조: Wing, M. G. (1995) Therapeut. Immunol. 2(4),: 183-190; "Current Protocols in Pharmacology," Enna, S.J. et al. (eds.) published by John Wiley & Sons Inc; Madhusudan, S. (2004) Clin. Cancer Res. 10(19): 6528-6534; Cox, J. (2006) Methods 38(4): 274-282; Choi, I. (2001) Eur. J. Immunol. 31(1): 94-106). 간략하게, 다양한 농도의 mAb는 24시간동안 인간 전혈과 함께 항온처리한다. 시험된 농도는 환자에서 전형적인 혈액 수준과 유사한(100 ng/ml - 100μg/ml을 포함하지만 이에 제한되지 않음) 최종 농도를 포함하는 광범위를 포괄해야만 한다. 항온처리 후, 상등액 및 세포 용해물은 IL-1Rα, TNF-α, IL-1b, IL-6 및 IL-8의 존재에 대해 분석하였다. mAb에 대해 생성된 사이토킨 농도 프로필은 음성 인간 IgG 대조군과 양성 LPS 또는 PHA 대조군에 의해 생성된 프로필과 비교하였다. 세포 상등액과 세포 용해물 둘다 기원의 mAb에 의해 나타낸 사이토킨 프로필은 대조군 인간 IgG와 비교할 수 있었다. 하나의 양태에서, 모노클로날 항체는 염증 사이토킨을 자발적으로 방출하기 위해 인간 혈액 세포와 상호작용하지 않는다.
DVD-Ig에 대한 사이토킨 방출 연구는 4개 이상의 결합 부위로 인해 복잡하고 2개 각각은 각각의 항원에 대한 것이다. 간략하게, 사이토킨 방출 연구는 본원에 기재된 바와 같이 전혈 또는 기타 세포 시스템에 대해 전체 DVD-Ig 분자의 효과를 측정하는 것이지만 분자의 어느 부분이 사이토킨 방출을 유발하는지를 해결할 수 있다. 일단 사이토킨 방출이 검출된 경우, 몇몇 보조 정제 세포 성분이 사이토킨 방출 자체를 유발할 수 있기 때문에 DVD-Ig 제제의 순도가 확인되어야만 한다. 순도가 문제가 아닌 경우, DVD-Ig(Fc 부분의 제거, 결합 부위의 분리 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 단편화, 결합 부위 돌연변이유발 또는 기타 방법은 임의의 관찰을 평활화하는데 사용될 필요가 있을 수 있다. 이러한 복잡한 과정은 2개의 모 항체가 DVD-Ig로 배합되기 전에 사이토킨 방출의 부재를 위해 선택되는 경우 크게 단순화된다는 것은 명백하다
B.13 독성학적 연구를 위한 다른 종에 대한 교차 반응성:
하나의 양태에서, 개별 항체는 적당한 tox 종, 예를 들어, 시노몰구스 몽키에 대해 충분한 교차-반응성을 갖는 것으로 선택된다. 모 항체는 유사 종 표적(즉, 시노몰구스 몽키)에 결합하고 적당한 반응(조절, 중화, 활성화)을 유발할 필요가 있다. 하나의 양태에서, 유사 종 표적에 대한 교차 반응성(친화도/효능)은 인간 표적의 10배 이내이어야만 한다. 실제로, 모 항체는 마우스, 랫트, 개, 원숭이(및 기타 인간을 제외한 영장류) 및 질환 모델 종(즉, 천식 모델에 대한 양)을 포함하는 다양한 종양에 대해서 평가된다. 모 모노클로날 항체 기원의 tox 종에 대해 허용가능한 교차 반응성은 동일한 종에서 DVD-Ig-Ig의 향후 독성학 연구를 허용한다. 그 이유 때문에, 2개의 모 모노클로날 항체는 통상의 tox 종에 대해 허용가능한 교차 반응성을 가져서, 동일한 종에서 DVD-Ig의 독성학 연구를 가능하게 해야 한다.
모 mAb는 당업계에 널리 공지되어 있는 특정 표적에 결합할 수 있는 다양한 모노클로날 항체로부터 선택될 수 있다. 모 항체는 동일한 항체 또는 상이한 항체일 수 있다. 이들은 항-TNF 항체(미국 특허 제6,258,562호), 항-IL-12 및/또는 항-IL-12p40 항체(미국 특허 제6,914,128호); 항-IL-18 항체(미국 특허 공보 2005/0147610 A1), 항-C5, 항-CBL, 항-CD147, 항-gp120, 항-VLA-4, 항-CD11a, 항-CD18, 항-VEGF, 항-CD40L, 항CD-40(예: 참조 PCT Publication No. WO2007/124299), 항-Id, 항-ICAM-1, 항-CXCL13, 항-CD2, 항-EGFR, 항-TGF-베타 2, 항-HGF, 항-Met, 항 DLL-4, 항-NPR1, 항-PLGF, 항-ErbB3, 항-E-셀렉틴, 항-Fact VII, 항-Her2/neu, 항-F gp, 항-CD11/18, 항-CD14, 항-ICAM-3, 항-RON, 항-SOST, 항 CD-19, 항-CD80(예를 들어, PCT Publication No. WO2003/039486), 항-CD4, 항-CD3, 항-CD23, 항-베타2-인테그린, 항-알파4베타7, 항-CD52, 항-HLA DR, 항-CD22(예: 참조: 미국 특허 제5,789,544호), 항-CD20, 항-MIF, 항-CD64 (FcR), 항-TCR 알파 베타, 항-CD2, 항-Hep B, 항-CA 125, 항-EpCAM, 항-gp120, 항-CMV, 항-gpIIbIIIa, 항-IgE, 항-CD25, 항-CD33, 항-HLA, 항-IGF1,2, 항 IGFR, 항-VNR인테그린, 항-IL-1알파, 항-IL-1베타, 항-IL-1 수용체, 항-IL-2 수용체, 항-IL-4, 항-IL-4 수용체, 항-IL5, 항-IL-5 수용체, 항-IL-6, 항-IL-8, 항-IL-9, 항-IL-13, 항-IL-13 수용체, 항-IL-17 및 항-IL-23을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌참조: Presta L.G. (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731-6 및 http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html).
모 mAb는 또한 임상적 시험용 또는 임상 사용 개발용으로 승인된 다양한 치료학적 항체로부터 선택될 수 있다. 당해 치료학적 항체는 리툭시마브 (Rituxan?, IDEC/Genentech/Roche) (문헌참조: 예를 들어 미국 특허 제5,736,137호), 비호지킨 림프종을 치료하기 위해 승인된 키메라 항-CD20 항체; HuMax-CD20, Genmab에 의해 현재 개발된 항-CD20, 미국 특허 제5,500,362호에 기재된 항-CD20 항체, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), 및 PRO70769 (PCT Application No. PCT/US2003/040426), 트라스투즈마브 (Herceptin?, Genentech) (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,677,171호), 유방암을 치료하기 위해 승인된 인간화된 항-Her2/neu 항체; Genentech에 현재 개발된 퍼투주마브 (rhuMab-2C4, Omnitarg?); 항-Her2 항체(미국 특허 제4,753,894호); 세툭시마브 (Erbitux?, Imclone) (미국 특허 제4,943,533호; PCT Publication No. WO 96/40210), 다양한 암에 대해 임상 시험중의 키메라 항-EGFR; Abgenix-Immunex-Amgen에 의해 현재 개발된 ABX-EGF(미국 특허 제6,235,883호); Genmab에 의해 현재 개발된 HuMax-EGFr (미국 특허 제247,301호); 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000 (Merck KGaA) (미국 특허 제5,558,864호; Murthy, et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2): 549-60; Rodeck, et al. (1987) J. Cell. Biochem. 35(4): 315-20; Kettleborough, et al. (1991) Protein Eng. 4(7): 773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT Publication No. WO 95/20045; Modjtahedi, et al. (1993) J. Cell. Biophys. 22(1-3): 129-46; Modjtahedi, et al. (1993) Br. J. Cancer 67(2): 247-53; Modjtahedi, et al. (1996) Br. J. Cancer 73(2): 228-35; Modjtahedi, et al. (2003) Int. J. Cancer 105(2): 273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (미국 특허 5,891,996; 미국 특허 6,506,883; Mateo, et al. (1997) Immunotechnol. 3(1): 71-81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT Publication No. WO 01/62931A2); 및 SC100 (Scancell) (PCT Publication No. WO 01/88138); B-세포 만성 림프구 백혈병의 치료를 위해 현재 승인된 인간화된 모노클로날 항체인 알렘투주마브 (Campath?, Millenium); 무로모나브-CD3 (Orthoclone OKT3?), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의해 개발된 항-CD3 항체, 이브리투모마브 티욱세탄(Zevalin?), IDEC/Schering AG에 의해 개발된 항-CD20 항체, 겜시투주마브 오조가미신(Mylotarg?), Celltech/Wyeth에 의해 개발된 항-CD33(p67 단백질), 알레파셉트(Amevive?), Biogen에 의해 개발된 항-LFA-3 Fc 융합체, Centocor/Lilly에 의해 개발된 아브식시마브(ReoPro?), Novartis에 의해 개발된 바실릭시마브(Simulect?), Medimmune에 의해 개발된 팔리비주마브(Synagis?), 인플릭시마브 (Remicade?), Centocor에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 아달리무마브 (Humira), Abbott에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 후미카데?, Celltech에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 골리무마브(CNTO-148), Centocor에 의해 개발된 완전한 인간 TNF 항체, 에타네르셉트 (Enbrel?), an Immunex/Amgen에 의해 개발된 p 75 TNF 수용체 Fc 융합체, 레너르셉트, Roche에 의해 이전에 개발된 p55TNF 수용체 Fc 융합체, ABX-CBL, Abgenix에 의해 개발된 항-CD147 항체, ABX-IL8, Abgenix에 의해 개발된 항-IL-8 항체, ABX-MA1, Abgenix에 의해 개발된 항-MUC18 항체, 펨투모마브 (R1549, 90Y-muHMFG1), Antisoma에 의해 개발중인 항-MUC1, 테렉스 (R1550), Antisoma에 의해 개발된 항-MUC1 항체, Antisoma에 의해 개발된 AngioMab(AS1405), Antisoma에 의해 개발된 HuBC-1, Antisoma에 의해 개발된 티오플라틴 (AS1407), Antegren? (나탈리주마브), Biogen에 의해 개발된 항-알파-4-베타 -1 (VLA-4) 및 알파 -4-베타 -7 항체, VLA-1 mAb, Biogen에 의해 개발된 항-VLA-1 인테그린 항체, LTBR mAb, Biogen에 의해 개발된 항 림포톡신 베타 수용체(LTBR) 항체, CAT-152, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발된 항-TGF-2 항체, ABT 874(J695), Cambridge Antibody Technology 및 Abbott에 의해 개발된 항-IL-12 항체, CAT-192, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에 의해 개발된 항-TGF1 항체, CAT-213, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발된 항-에오탁신1 항체, LymphoStat-B?, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에 의해 개발된 항- Blys 항체, TRAIL-R1mAb, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences, Inc.에 의해 개발된 항-TRAIL-R1 항체, Avastin? 베바시주마브, rhuMAb-VEGF, Genentech에 의해 개발된 항-VEGF 항체, Genentech에 의해 개발된 항-HER 수용체 계열 항체, 항-조직 인자 (ATF), Genentech에 의해 개발된 항-조직 인자 항체, Xolair(오말리주마브), Genentech에 의해 개발된 항-IgE 항체, Raptiva? (에팔리주마브), Genentech 및 Xoma에 의해 개발된 항-CD11a 항체, Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals에 의해 개발된 MLN-02 항체 (이전에는 LDP-02), HuMax CD4, Genmab에 의해 개발된 항-CD4 항체, HuMax-IL15, Genmab 및 Amgen에 의해 개발된 항-IL15 항체, Genmab 및 Medarex에 의해 개발된 HuMax-Inflam, HuMax-암, Genmab 및 Medarex 및 Oxford GcoSciences에 의해 개발된 항-헤파라나제 I 항체, Genmab 및 Amgen에 의해 개발된 HuMax-림프종, Genmab에 의해 개발된 HuMax-TAC, IDEC-131, 및 IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD40L 항체, IDEC-151 (클레놀릭시마브), IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD4 항체, IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD80 항체, IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD23, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-대식세포 이동 인자(MIF) 항체, BEC2, Imclone에 의해 개발된 항-이디오타입 항체, IMC-1C11, Imclone에 의해 개발된 항-KDR 항체, DC101, Imclone에 의해 개발된 항-flk-1, Imclone에 의해 개발된 항-VE 캐드헤린 항체, CEA-Cide? (라베투주마브), Immunomedics에 의해 개발된 항-암배아 항원(CEA) 항체, LymphoCide? (에프라투주마브), Immunomedics에 의해 개발된 항-CD22 항체, Immunomedics에 의해 개발된 AFP-Cide, Immunomedics에 의해 개발된 골수종 Cide, Immunomedics에 의해 개발된 LkoCide, Immunomedics에 의해 개발된 ProstaCide, MDX-010, Medarex에 의해 개발된 항-CTLA4 항체, MDX-060, Medarex에 의해 개발된 항-CD30 항체, Medarex에 의해 개발된 MDX-070, Medarex에 의해 개발된 MDX-018, Osidem? (IDM-1), 및 Medarex 및 Immuno-Designed Molecules에 의해 개발된 항-Her2 항체, HuMax?-CD4, Medarex 및 Genmab에 의해 개발된 항-CD4 항체, HuMax-IL15, Medarex 및 Genmab에 의해 개발된 항-IL15 항체, CNTO 148, Medarex 및 Centocor/J&J에 의해 개발된 항-TNFα 항체, CNTO 1275, Centocor/J&J에 의해 개발된 항-사이토킨 항체, MOR101 및 MOR102, MorphoSys에 의해 개발된 항-세포간 부착 분자-1(ICAM-1)(CD54) 항체, MOR201, MorphoSys에 의해 개발된 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR-3), Nuvion? (비실리주마브), Protein Design Labs에 의해 개발된 항-CD3 항체, HuZAF?, Protein Design Labs에 의해 개발된 항-감마 인터페론 항체, Protein Design Labs에 의해 개발된 항-α5β1 인테그린, Protein Design Labs에 의해 개발된 항-IL-12, ING-1, Xoma에 의해 개발된 항-Ep-CAM 항체, Xolair?(Omalizumab), Genentech 및 Novartis에 의해 개발된 인간화된 항-IgE 항체, 및 MLN01, Xoma에 의해 개발된 항-베타2 인테그린 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 양태에서, 치료제는 KRN330 (Kirin); huA33 항체 (A33, Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95 (알파 V 인테그린, Centocor); MEDI-522 (알파 Vβ3 인테그린, Medimmune); 볼록이시마브 (알파 Vβ1 인테그린, Biogen/PDL); 인간 mAb 216 (B 세포 당화 에피토프, NCI); BiTE MT103 (이특이적 CD19 x CD3, Medimmune); 4G7xH22 (이특이적 BcellxFc감마R1, Medarex/Merck KGa); rM28 (Bispecific CD28 x MAPG, EP Patent No. EP1444268); MDX447 (EMD 82633) (이특이적 CD64 x EGFR, Medarex); 카투막소마브(Catumaxomab)(레모바브) (이특이적 EpCAM x 항-CD3, Trion/Fres); 에르투마속마브(Ertumaxomab) (이특이적 HER2/CD3, Fresenius Biotech); 오레고보마브 (OvaRex) (CA-125, ViRexx); 렌카렉스(Rencarex)? (WX G250) (카보닉 안하이드라제 IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (엔도글린), Tracon); BMS-663513 (CD137 효능제, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); 시플리주마브(MEDI-507) (CD2, Medimmune); 오파투무마브(Ofatumumab) (Humax-CD20) (CD20, Genmab); 리툭시마브(Rituximab) (Rituxan) (CD20, Genentech); 벨투주마브(veltuzumab) (hA20) (CD20, Immunomedics); 에프라투주마브(Epratuzumab) (CD22, Amgen); 루밀릭시마브(lumiliximab) (IDEC 152) (CD23, Biogen); 무로모나브(muromonab)-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (CD3 fc 수용체, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (린투주마브) (CD33, Seattle Genentics); 자놀리무마브(Zanolimumab) (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campath1h (알렘투주마브(Alemtuzumab)) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hLL1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); 갈릭시마브 (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (절단된 콜라겐, 트라콘); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); 이필리무마브 (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); 트레멜리무마브(Tremelimumab)(Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (마파투무마브(Mapatumumab)) (DR4 TRAIL-R1 효능제, Human Genome Science /Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); 아포마브(Apomab) (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (렉사투무마브(lexatumumab)) (DR5 TRAIL-R2 효능제, HGS); 세툭시마브(Cetuximab) (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); 니모투주마브(EGFR, YM Bio); 파니투무마브(Panitumumab) (Vectabix) (EGFR, Amgen); 잘루투무마브(Zalutumumab) (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics); 아데카투무마브(adecatumumab) (MT201) (Epcam, Merck); 에드레콜로마브(edrecolomab) (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (폴레이트 수용체 a, Morphotech); KW-2871 (갱글리오사이드 GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); 트라스투주마브(Trastuzumab) (Herceptin) (HER2, Celldex); 페르투주마브(rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); 아폴리주마브(apolizumab) (HLA-DR 베타쇄, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); 항-IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-베타-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); 항-KIR (1-7F9) (킬러 세포 Ig형 수용체(KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11 (LTβR, Biogen); HuHMFG1 (MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (N-연결된 탄수화물 에피토프, Raven); CAL (파라티로이드 호르몬-관련 단백질(PTH-rP), University of California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); 바비툭시마브 (포스파티딜세린, 페레그린); huJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 (TGFb (pan) 억제제 (IgG4), Genzyme); 인플릭시마브(Infliximab) (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (트랜스페린 수용체, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (트랜스페린 수용체, Salk Institute); 베바시주마브(Bevacizumab) (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab-, PCT Publication No. WO/2000/034337, University of Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone)을 포함한다.
B. DVD 분자의 작제:
이원 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자는, 동일하거나 상이할 수 있는, 2개의 모 모노클로날 항체 기원의 2개의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 직접적으로 탠덤으로 연결되거나 재조합 DNA 기술에 의해 짧은 링커를 통해 연결되고 이어서, 경쇄 불변 도메인, 및 임의로 Fc 영역이 연결되도록 디자인한다. 유사하게, 중쇄는 탠덤으로 연결된 2개의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH)에 이어서 불변 도메인 CH1 및 Fc 영역을 포함한다 (도 1a).
가변 도메인은 상기된 방법중 어느 하나에 의해 생성된 모 항체로부터 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 하나의 양태에서, 가변 도메인은 쥐 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다. 또 다른 양태에서, 가변 도메인은 CDR 접목되거나 인간화된 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인이다. 하나의 양태에서, 가변 도메인은 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 가변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 서로 직접적으로 연결된다. 또 다른 양태에서, 가변 도메인은 링커 서열을 통해 연결된다. 하나의 양태에서, 2개의 가변 도메인이 연결된다. 3개 이상의 가변 도메인은 또한 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 가변 도메인은 동일한 항원에 결합할 수 있거나 상이한 항원에 결합할 수 있다. 본 기재내용의 DVD 분자는 수용체의 리간드 결합 도메인, 또는 효소의 활성 도메인과 같은 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 하나의 비-면역글로불린 가변 도메인을 포함할 수 있다. DVD 분자는 또한 2개 이상의 비-Ig 도메인을 포함할 수 있다.
링커 서열은 단일 아미노산 또는 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 하나의 양태에서, 링커 서열은 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 1); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 2); AKTTPKLGG(서열번호 3); SAKTTPKLGG(서열번호 4); SAKTTP(서열번호 5); RADAAP (서열번호 6); RADAAPTVS (서열번호 7); RADAAAAGGPGS (서열번호 8); RADAAAA(G4S)4 (서열번호 9), SAKTTPKLEEGEFSEARV (서열번호 10); ADAAP (서열번호 11); ADAAPTVSIFPP (서열번호 12); TVAAP (서열번호 13); TVAAPSVFIFPP (서열번호 14); QPKAAP (서열번호 15); QPKAAPSVTLFPP (서열번호 16); AKTTPP (서열번호 17); AKTTPPSVTPLAP (서열번호 18); AKTTAP (서열번호 19); AKTTAPSVYPLAP (서열번호 20); ASTKGP (서열번호 21); ASTKGPSVFPLAP (서열번호 22), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 23); GENKVEYAPALMALS (서열번호 24); GPAKELTPLKEAKVS (서열번호 25); GHEAAAVMQVQYPAS (서열번호 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (서열번호 27); 및 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (서열번호 28)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커이다. 링커 서열의 선택은 여러 Fab 분자의 결정 구조 분석을 기초로 한다. Fab 또는 항체 분자 구조에서 가변 도메인과 CH1/CL 불변 도메인간에는 천연 유연성 연결이 있다. 당해 천연 연결체는 약 10 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함하고, 이중 4 내지 6개의 잔기는 V 도메인의 C-말단으로부터 유래된 것이고 4 내지 6개의 잔기는 CL/CH1 도메인의 N-말단으로부터 유래된 것이다. 본 발명의 DVD Ig는 각각 DVD-Ig의 경쇄 및 중쇄에서 링커로서 CL 또는 CH1의 N-말단의 5 내지 6개의 아미노산 잔기 또는 11개 내지 12개의 아미노산 잔기를 사용하여 제조된다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기, 특히 처음 5개 내지 6개의 아미노산 잔기는 강한 2차 구조 없이 루프 형태를 취함에 따라서 2개의 가변 도메인간의 유연성 링커로서 작용할 수 있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기, 특히 처음 5 내지 6개의 아미노산 잔기는 강한 2차 구조 없이 루프 형태를 취함에 따라서 2개의 가변 도메인간에 유연성 링커로서 작용할 수 있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기는 천연 연장의 가변 도메인이고 이들은 Ig 서열의 일부임으로 링커 및 연결부로부터 잠재적으로 유발되는 면역원성을 크게 감소시킨다.
또 다른 링커 서열은 임의의 길이의 CL/CH1 도메인의 임의의 서열, 예를 들어, CL/CH1 도메인의 처음 5 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있지만 CL/CH1 도메인의 모든 잔기를 포함하지는 않는다. 경쇄 링커는 Cκ 또는 Cλ로부터 비롯될 수 있고; 중쇄 링커는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를 포함하는 임의의 이소형의 CH1으로부터 비롯될 수 있다. 링커 서열은 또한 Ig-형 단백질 (예를 들어, TCR, FcR, KIR)과 같은 기타 단백질; G/S 기본 서열 (예를 들어, G4S 반복체); 힌지 영역 유래 서열 및 기타 단백질 기원의 기타 천연 단백질로부터 유래할 수 있다.
하나의 양태에서, 불변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 2개의 연결된 가변 도메인에 연결한다. 하나의 양태에서, 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 중쇄 불변 도메인에 연결하고 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 경쇄 불변 도메인에 연결한다. 하나의 양태에서, 불변 도메인은 각각 인간 중쇄 불변 도메인 및 인간 경쇄 불변 도메인이다. 하나의 양태에서, DVD 중쇄는 추가로 Fc 영역에 연결한다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 또 다른 양태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 또 다른 양태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD기원의 Fc 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드는 조합되어 DVD-Ig 분자를 형성한다. 표 2는 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, 암을 치료하기 위해 유용한 표적에 대한 예시적인 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열을 열거한다. 하나의 양태에서, 본 기재내용은 임의의 배향으로 표 2에 열거된 VH 및/또는 VL 영역중 2개 이상을 포함하는 DVD를 제공한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004

특정 표적에 결합할 수 있는 특이적 DVD-Ig 분자 및 이를 제조하는 방법의 상세한 설명은 하기의 실험부에서 제공된다.
D. DVD 단백질의 제조
본 기재내용의 결합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 다수의 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포로부터 발현되고 여기서, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄를 암호화하는 발현 벡터는 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염된다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 외인성 DNA를 도입시키는데 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 간주한다. 본 기재내용의 DVD 단백질은 원핵생물 숙주 세포 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있지만, 진핵생물 예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서의 DVD 단백질의 발현이 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵생물 세포(특히 포유동물 세포)가 적당한 폴딩을 이루어 면역학적 활성인 DVD 단백질을 회합(assembly)하여 분비하는데 원핵생물 세포보다 더 적당하기 때문이다.
본 기재내용의 재조합 항체를 발현하기에 예시적인 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예컨대, Kaufman, R.J. and Sharp, P.A. (1982) Mol. Biol. 159:601-621에 기술된 바와 같은 DHFR 선택성 마커와 함께 사용된, Urlaub and Chasin(1980) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:4216-4220에 기술된 dhfr-CHO 세포), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 및 PER.C6 세포가 있다. DVD 단백질을 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, DVD 단백질은 숙주 세포에서 DVD 단백질이 발현되기에 또는 바람직하게는 숙주 세포가 증식되는 배양 배지로 DVD 단백질이 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 생산한다. DVD 단백질은 표준 단백질 정제법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 기재내용의 DVD 단백질의 재조합 발현을 위한 예시적인 시스템에서, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄 둘다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포로 도입된다. 재조합 발현 벡터내에서, DVD 중쇄 및 경쇄는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 각각 작동적으로 결합되어 상기 유전자의 높은 전사율을 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 보유하며, 이 유전자는 메토트렉세이트 선별/증폭을 통해 상기 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선별할 수 있게 해준다. 선별된 형질전환 숙주 세포는 DVD 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 있도록 배양하고, 이러한 배양 배지로부터 완전한 DVD를 회수한다. 재조합 발현 벡터 제조, 숙주 세포 형질감염, 형질전환체 선별, 숙주 세포 배양 및 배양 배지로부터 DVD의 회수에는 표준 분자 생물학 기술을 사용한다. 또한, 본 기재내용은 본 기재내용의 숙주 세포를 본 발명의 DVD 단백질이 합성될 때까지 적당한 배양 배지에서 배양하여 본 기재내용의 DVD 단백질을 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 추가로 배양 배지로부터 DVD 단백질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
DVD-Ig의 중요한 특징은 이것이 통상적인 항체와 유사한 방법으로 제조되고 정제될 수 있다는 것이다. DVD-Ig의 제조는 목적하는 이원-특이적 활성을 갖는 균질의 단일 주요 생성물을 유도하고 불변 영역의 임의의 서열의 변형 또는 임의의 종류의 화학적 변형이 필요 없다. "이특이적," "다특이적," 및 "다특이적 다가"의 완전한 길이의 결합 단백질을 제조하기 위해 이전에 기재된 방법은 단일의 주요 생성물을 유도하지 못하고 대신 어셈블리된 불활성, 단일 특이적, 다특이적, 다가, 완전한 길이의 결합 단백질 및 다가의 완전한 길이의 결합 단백질 및 상이한 결합 부위가 조합된 다가의 완전한 길이의 결합 단백질을 유도한다. 일례로서, 문헌[참조:Miller 및 Presta (PCT 공보 WO2001/077342)에 기재된 디자인을 기초로, 16개의 가능한 중쇄 및 경쇄의 조합이 있다. 결과적으로, 단백질의 단지 6.25%만이 목적하는 활성 형태에 있을 가능성이 있으며, 다른 15개 조합과 비교하여 주요 생성물 또는 단일 1차 생성물이 아니다. 전형적으로 대규모 제조에 사용되는 표준 크로마토그래피 기술을 사용한 불활성 및 부분 활성 형태의 단백질로부터 완전한 활성 형태의 단백질의 분리는 아직 입증되어야만 한다.
놀랍게도, 본 기재내용의 "이원 특이적 다가 완전한 길이의 결합 단백질"의 디자인은 주로 목적하는 "이원-특이적 다가의 완전한 길이의 단백질"로 어셈블리하는 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 유도한다.
어셈블리되고 발현된 이원 가변 도메인 면역글로불린 분자중 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상 및 보다 바람직하게는 90% 이상은 목적하는 이원-특이적 4가 단백질이다. 당해 측면은 특히, 본 기재내용의 상업적 용도를 증진시킨다. 따라서, 본 기재내용은 "이원-특이적 4가 완전한 길이의 결합 단백질"의 단일 주요 생성물을 유도하는 단일 세포에서 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 방법을 포함한다.
본 기재내용은 단일 세포에서 "이원 특이적 4가의 완전한 길이의 결합 단백질"의 "주요 생성물"을 유도하는, 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 바람직한 방법을 제공하고 여기서, "주요 생성물"은 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 포함하는 50% 초과의 모든 어셈블리된 단백질이다.
본 기재내용은 단일 세포에서 "이원 특이적 4가의 완전한 길이의 결합 단백질"의 "주요 생성물"을 유도하는, 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 바람직한 방법을 제공하고 여기서, "주요 생성물"은 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 포함하는 75% 초과의 모든 어셈블리된 단백질이다.
본 기재내용은 단일 세포에서 "이원 특이적 4가의 완전한 길이의 결합 단백질"의 "주요 생성물"을 유도하는, 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 바람직한 방법을 제공하고 여기서, "주요 생성물"은 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 포함하는 90% 초과의 모든 어셈블리된 단백질이다.
II. 유도체화된 DVD 결합 단백질:
일 양태는 본 기재내용의 결합 단백질이 유도체화되거나 또는 다른 기능성 분자(예컨대, 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합된 표지된 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 기재내용의 표지된 결합 단백질은 본 기재내용의 결합 단백질(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 연합 등에 의해)을 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 다른 항체(예, 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출성 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자와 결합 단백질의 연합을 매개할 수 있는 단백질이나 펩타이드(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그) 등에 기능적으로 연결시켜 수득할 수 있다.
본 기재내용의 결합 단백질이 유도체화될 수 있는 유용한 검출성 제제에는 형광 화합물이 포함된다. 검출성 형광 제제의 예에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등이 있다. 또한, 결합 단백질은 검출성 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 결합 단백질이 검출성 효소로 유도체화된 경우에는, 효소가 검출성 반응 산물을 생산하기 위해 사용하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 검출성 제제 서양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 발색 반응 생성물을 유도한다. 결합 단백질은 또한 비오틴으로 유도체화될 수 있고, 이 경우 아비딘이나 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출한다.
본 기재내용의 다른 양태는 결정화된 결합 단백질, 및 이러한 결정을 포함하는 제형 및 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 결정화된 결합 단백질은 이에 대응하는 가용성 결합 단백질보다 생체내 반감기가 더 길다. 또 다른 양태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 보유한다.
본 기재내용의 결정화된 결합 단백질은 당업계에 공지되어 있고 PCT 공보 WO 02/072636에 개시된 바와 같이 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 항체 또는 이의 항원 결합부가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 당화된 결합 단백질을 제공한다. 생체내 생산된 초기 단백질은 해독후 변형으로 알려진 추가 프로세싱으로 처리될 수 있다. 구체적으로, 당(글리코실) 잔기는 당화로 알려진 방법에 의해 효소적으로 첨가될 수 있다. 그 결과 수득되는 공유 결합된 올리고사카라이드 측쇄를 보유한 단백질은 당화된 단백질 또는 당단백질로서 공지되어 있다. 항체는 가변성 도메인 뿐만 아니라 Fc 도메인에 하나 이상의 탄수화물 잔기를 갖는 당단백질이다. Fc 도메인내 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 이펙터 기능에 중요한 효과를 나타내고 항체의 항원 결합 또는 반감기에 최소의 효과를 나타낸다(Jefferis, R.(2005) Biotechnol. Prog. 21: pp. 11 - 16). 대조적으로, 가변성 도메인의 당화는 항체의 항원 결합 활성에 효과를 가질 수 있다. 가변성 도메인내 당화는 항체 결합 친화도에 대해 음성 효과를 나타낼 수 있고 이는 입체 장애때문이거나(Co, M.S. et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361-1367), 항원에 대한 친화도를 증가시키기 때문이다(Wallick, S.C. et al. (1998) Exp. Med. 168:1099-1109; Wright, A. et al. (1991) EMBO J. 10:2717 2723).
본 기재내용의 한 측면은 결합 단백질의 O- 또는 N- 결합된 당화 부위가 돌연변이된 당화 부위 돌연변이체를 제조하는 것에 관한 것이다. 당업자는 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 당해 돌연변이체를 제조할 수 있다. 생물학적 활성을 보유하지만 결합 활성이 증가되거나 감소된 당화 부위 돌연변이체는 본 기재내용의 또 다른 목적이다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용의 항체 또는 항원 결합부의 당화는 변형된다. 예를 들어, 당화되지 않은 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 당화되어 있지 않다). 항원에 대한 항체의 특이성을 증가시키기 위해 당화가 변형될 수 있다. 당해 당화 변형은 예를 들어, 항체 서열내 하나 이상의 당화 부위를 변형시킴에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 치환되어 하나 이상의 가변 영역 당화 부위가 제거됨으로써 그 부위에서의 당화가 제거된다. 당해 당화 제거는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 당해 방법은 문헌[PCT 공보 WO2003/016466A2, 및 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861]에 상세하게 추가로 기재되어 있다.
또한 또는 대안적으로, 본 기재내용의 변형된 결합 단백질은 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화된 항체(문헌참조: Kanda et al. (2007) J. Biotechnol. 130(3): 300-310) 또는 GlcNAc 구조의 2등분이 증가된 항체와 같은 변형된 유형의 당화를 가질 수 있다. 당해 변형된 당화 패턴은 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 당해 탄수화물 변형은 예를 들어, 변형된 당화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시켜 달성될 수 있다. 변형된 당화 기구를 갖는 세포는 당업계에 보고되어 있고 본 기재내용의 재조합 항체를 발현시켜 변형된 당화를 갖는 항체를 제조하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 및 EU Patent No. EP 1,176,195; PCT Publication Nos. WO 03/035835; 및 WO 99/54342 80].
단백질 당화는 당해 단백질의 아미노산 서열, 및 단백질이 발현되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 다른 유기체는 다른 당화 효소(예를 들면, 글리코실트란스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산하고, 이용할 수 있는 기질(뉴클레오타이드 당)이 다를 수 있다. 이러한 요인으로 인해, 단백질 당화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질이 발현되는 숙주계에 따라 다를 수 있다. 본 기재내용에 유용한 글리코실 잔기는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, n-아세틸글루코사민 및 시알산 등을 이에 국한됨이 없이 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 이러한 당화된 결합 단백질은 당화 패턴이 인간이도록 글리코실 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 상이한 단백질 당화는 상이한 단백질 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생산되고 효모 내인성 경로를 이용하여 당화된 치료 단백질의 효능은 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포에서 발현된 동일 단백질 효능에 비해 저하될 수 있다. 이러한 당단백질은 또한 인간 중에서 면역원성일 수 있고 투여 후 생체내 반감기가 감소될 수 있다. 인간 및 다른 동물에 존재하는 특정 수용체는 특정 당화 잔기를 인식하고 혈류로부터 그 단백질의 신속 제거를 촉진할 수 있다. 다른 부작용으로, 단백질 폴딩, 용해성, 프로테아제에 대한 민감성, 트래픽킹(trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른 단백질이나 인자에 의해 인식, 항원성 또는 알레르기원성 등의 변화를 포함할 수 있다. 따라서, 당업자는 특정 조성과 당화 패턴을 가진 치료 단백질, 예컨대 인간 세포 또는 의도된 피검체 동물의 종 특이적 세포에서 생산되는 것과 동일하거나 적어도 유사한 당화 조성 및 패턴을 가진 치료 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포와 상이한 당화된 단백질의 발현은 숙주 세포의 유전자 변형을 통해 이종 당화 효소를 발현하도록 함으로서 수득될 수 있다. 인간 단백질 당화를 나타내는 항체 또는 항원 결합부는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 당업자라면 제조할 수 있다. 예를 들어, 효모 균주는 비자연발생의 당화 효소를 발현하도록 유전자 변형되어, 이 효모 균주에서 생산된 당화된 단백질(당단백질)이 동물 세포, 특히 인간 세포에서 생산된 것과 동일한 단백질 당화가 수득된 바 있다(미국 특허 7,449,308 및 7,029,872 및 PCT 공개공보 WO2005/100584).
결합 단백질 외에도, 본 기재내용은 또한 본 기재내용의 당해 결합 단백질에 특이적인 항-이디오타입(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 일반적으로 또 다른 항체의 항원 결합 영역과 연합된 유일한 결정인자를 인지하는 항체이다. 항-Id는 결합 단백질 또는 CDR 함유 영역으로 동물을 면역화시켜 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 면역화 항체의 이디오타입 결정인자를 인지하고 이에 응답하여 항-Id 항체를 생산한다. 이는 DVD-Ig 분자로 2개 이상의 모 항체를 혼입하여 항-이디오타입 항체를 제조하기가 수월하고 당업계에 널리 공지된 방법(예를 들어, BIAcore, ELISA)에 의해 결합 연구를 확인하여 각각의 모 항체의 이디오타입에 대해 특이적인 항-이디오타입 항체가 또한 DVD-Ig와 관련하여 당해 이디오타입(예를 들어, 항원 결합 부위)을 인지함을 입증하기가 수월해짐은 명백하다. DVD-Ig의 2개 이상의 항원 결합부 각각에 대해 특이적인 항-이디오타입 항체는 환자 혈청에서 인간 DVD-Ig의 DVD-Ig 농도를 측정하기 위해 이상적인 시약을 제공한다. DVD-Ig 농도 분석은 "샌드위치 분석 ELISA 포맷"을 사용하여 확립될 수 있고 여기에 사용되는 제1 항원 결합 영역에 대한 항체는 고형상(예를 들어, BIAcore 칩, ELISA 플레이트 등)상에 피복되고 세정 완충액으로 세정되고, 혈청 샘플로 항온처리하고 다시 세정을 수행하고 궁극적으로 또 다른 항원 결합 부위에 대한 또 다른 항-이디오타입 항체와 항온처리하고 그 자체를 결합 반응의 정량을 위해 효소로 표지시킨다. 하나의 양태에서, 2개 이상의 상이한 결합 부위를 갖는 DVD-Ig에 대해, 최외곽 부위(불변 영역으로부터 가장 원거리 및 근거리)에 대한 항-이디오타입 항체는 인간 혈청에서 DVD-Ig 농도를 결정하는 것을 도와줄 뿐만 아니라 생체내 분자의 통합성을 입증한다. 각각의 항-Id 항체는 또한 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도하기 위한, 소위 항-항-Id 항체를 제조하는 "면역원"으로서 사용될 수 있다.
또한, 목적하는 단백질은 다양한 당화 효소를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여 발현시킬 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이며, 이에 따라 상기 라이브러리의 구성 숙주 세포는 변형된 당화 패턴을 가진 당해의 단백질을 생산한다. 그 다음, 당업자는 새로운 특정 당화 패턴을 가진 당해의 단백질을 선별하여 분리할 수 있다. 하나의 양태에서, 특별하게 선별된 신규 당화 패턴을 가진 단백질은 생물학적 성질이 개선되거나 변경된 단백질인 것이 바람직하다.
III. DVD-Ig의 용도
2개 이상의 항원에 결합하는 성질이 있다면, 본 기재내용의 결합 단백질은 통상의 면역분석법, 예컨대 ELISA, 방사선면역분석법(RIA), 또는 조직 면역조직화학법을 통해 항원(예컨대 혈청이나 혈장과 같은 생물학적 시료에서)을 검출하는데 사용할 수 있다. DVD-Ig는 결합 또는 미결합된 항체의 검출을 촉진시키기 위해 직간접적으로 검출성 물질로 표지화된다. 적당한 검출성 물질에는 각종 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능 물질이 있다. 적당한 효소의 예에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 및 아세틸콜린에스터라제가 있고; 적당한 보결분자족 복합체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며; 적당한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린이 있고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 있으며; 적당한 방사능 물질의 예에는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm이 있다.
하나의 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은 시험관내 및 생체내 모두에서 항원의 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 당해 DVD-Ig를 사용하여, 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 피검체 또는 본 기재내용의 결합 단백질이 교차 반응하는 항원을 갖는 기타 포유동물 피검체에서 항원 활성을 억제할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 기재내용은 항원 활성이 해로운 질환 또는 장애를 앓는 피검체에서 항원 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 기재내용의 결합 단백질은 치료 목적을 위해 인간 피검체에 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 활성이 해로운 장애"는 장애를 앓는 피검체에서 항원의 존재가 장애의 병리에 관여하거나 장애의 악화에 기여하는 인자이거나 의심되는 것으로 나타나는 질환 및 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 항원 활성이 해로운 장애는 항원 활성의 감소가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. 당해 장애는 예를 들어, 장애를 앓는 피검체의 생물학적 유체중에 항원 농도를 증가시켜(예를 들어, 피검체의 혈청, 혈장, 윤활액중의 항원 농도의 증가) 입증될 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질로 치료될 수 있는 장애의 비제한적인 예는 하기에서 및 본 기재내용의 항체의 약제학적 조성물에 관한 부분에서 논의되는 장애를 포함한다.
본 기재내용의 DVD-Ig는 하나의 항원 또는 다중 항원에 결합할 수 있다. 당해 항원은 본원에 하기의 데이터베이스에 열거된 표적물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 표적 데이터베이스는 하기와 같은 목록을 포함한다:
치료학적 표적 (xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp);
사이토킨 및 사이토킨 수용체 (www.cytokinewebfacts.com, www.copewithcytokines.de/cope.cgi, 및
cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html);
케목킨 (cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);
케목킨 수용체 및 GPCRs (csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/);
올팩터리 수용체 (senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);
수용체 (www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm);
암 표적 (cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi);
잠재적 항체 표적으로서 분비된 단백질 (spd.cbi.pku.edu.cn/);
단백질 키나제 (spd.cbi.pku.edu.cn/), 및
인간 CD 마커 (content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf) 및 (Zola H (2005) Blood, 106:3123-6).
DVD-Ig는 효능/안정성을 증진시키고/시키거나 환자의 적용 범위를 증가시키기 위해 2개의 상이한 표적을 동시에 차단시키는 치료제로서 유용하다. 당해 표적은 가용성 표적 (예: TNF) 및 세포 표면 수용체 표적 (예: VEGFR 및 EGFR)을 포함할 수 있다. 이것은 또한 암 치료를 위해 종양 세포와 T세포(예: Her2 및 CD3)간에, 또는 자가면역/이식을 위해 자가반응성 세포와 이펙터 세포간에 또는 임의의 특정 질환에서 발병 세포를 제거하기 위한 임의의 표적 세포와 이펙터 세포간에 재지시된 세포독성을 유도하는데 사용될 수 있다.
추가로, 동일한 수용체상에 2개의 상이한 에피토프를 표적화하도록 디자인되는 경우, DVD-Ig는 수용체 클러스터링 및 활성화를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 효능성 및 길항성 항-GPCR 치료제를 제조하는데 이득일 수 있다. 이 경우에, DVD-Ig를 사용하여 클러스터링/시그날 전달(2개의 세포 표면 분자) 또는 시그날 전달(하나의 분자상에)을 위해 하나의 세포에 대해 2개의 상이한 에피토프를 표적화할 수 있다. 유사하게, DVD-Ig 분자는 CTLA-4 연결, 및 CTLA-4 세포외 도메인의 2개의 상이한 에피토프(또는 2개 카피의 동일한 에피토프)를 표적화함에 의한 음성 시그날을 유발하여 면역 반응을 하향 조절하도록 디자인될 수 있다 CTLA-4는 다수의 면역학적 장애의 치료를 위해 임상적으로 유효하다. CTLA-4/B7은 세포 주기 진행, IL-2 생성 및 활성화 후 T 세포의 증식을 약화시킴에 의해 T 세포 활성화를 음성으로 조절하고 CTLA-4 (CD152) 관여는 T 세포 활성화를 하향 조절할 수 있고 면역 내성의 유도를 촉진시킬 수 있다. 그러나, CTLA-4의 효능성 항체 관여에 의해 T 세포 활성화를 약화시키는 전략은 CTLA-4 활성화가 연결을 요구하기 때문에 성공적이지 못하였다. CTLA-4/B7의 분자 상호작용은 결정 구조 분석 (Stamper 2001 Nature410:608)에 의해 입증된 바와 같이 "경사진 지퍼" 정렬로 있다. 그러나, 항-CTLA-4 모노클로날 항체를 포함하는, 현재 시판되는 CTLA-4 결합 시약의 어떠한 것도 연결 성질을 갖지 않는다. 이러한 문제를 해결하기 위한 여러 시도가 있었다. 한 경우에, 세포 구성원 결합 단일쇄 항체가 제조되었고 마우스에서 동형접합성 거부를 억제하였다 (Hwang (2002) J. Immunol. 169:633). 별도의 경우에, CTLA-4에 대한 인공 APC 표면 연결된 단일쇄 항체를 제조하고 T세포 반응을 약화시키는 것으로 입증되었다(Griffin (2000) J. Immunol. 164:4433). 2개의 경우에, CTLA-4 연결은 인공 시스템에서 막 결합 항체를 밀접하게 국소화시킴으로써 달성되었다. 당해 실험은 CTLA-4 음성 시그날 전달에 의해 면역을 하향조절한다는 개념의 증거를 제공하지만 이들 보고에 사용되는 시약은 치료학적 용도로서 적합하지 않다. 이에 대해, CTLA-4 연결은 CTLA-4 세포외 도메인의 2개의 상이한 에피토프(또는 2개 카피의 동일한 에피토프)에 표적화되는 DVD-Ig 분자를 사용함에 의해 달성될 수 있다. 추론적으로 IgG의 2개의 결합 부위간의 거리는 약 150-170Å으로서 CTLA-4의 활성 연결(2개의 CTLA-4 동종이량체간에 30 내지 50Å)에 대해서 너무 크다. 그러나, DVD-Ig(하나의 암)상의 2개의 결합 부위간의 거리는 30 내지 50Å의 범위로서 훨씬 짧고 CTLA-4의 적당한 연결을 허용한다.
유사하게, DVD-Ig는 2개의 상이한 세포 표면 수용체 복합체의 구성원(예를 들어, IL12-R 알파 및 베타)을 표적화할 수 있다. 추가로, DVD-Ig는 CR1 및 가용성 단백질/병원체를 표적화하여 표적 가용성 단백질/병원체의 신속한 제거를 구동시킬 수 있다.
또한, DVD-Ig는 세포내 전달(내재화 수용체 및 세포내 분자를 표적화하는) 또는 뇌의 내부로의 전달(혈뇌 장벽을 통과하기 위해 트랜스페린 수용체 및 CNS 질환 매개체를 표적화)을 포함하는, 조직-특이적 전달(국소 PK가 증진됨에 따라 효능을 보다 증진시키고/시키거나 독성을 저하시키기 위한 조직 마커 및 질환 매개체를 표적화함)을 위해 사용될 수 있다. DVD-Ig는 또한 항원의 비중화 에피토프에 결합함으로써 특정 위치로 항원을 전달하고 또한 항원의 반감기를 증가시키는 캐리어 단백질로서 작용할 수 있다. 또한, DVD-Ig는 환자에게 이식된 의료 장치에 물리적으로 연결되거나 이들 의료 장치를 표적화하도록 디자인될 수 있다(문헌참조: Burke, S. E. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand, H. F. et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324; Wu, P. et al. (2006) Biomaterials 27(11): 2450-2467; Marques, A. P. et al. (2005) Biodegrad. Syst. Tissue Eng..and Regen. Med. 377-397). 간략하게, 적당한 유형의 세포를 의학적 이식체 부위에 지시함으로써 정상적인 조직 기능을 치유하고 회복시킬 수 있다. 또한, 매개체(사이토킨을 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 억제는 커플링된 DVD에 의한 장치 이식 즉시 또는 장치에 표적화되는 즉시 제공된다. 예를 들어, 스텐트는 차단된 동맥을 청소하고 심근으로의 혈류를 개선시키기 위해 개재 심장학에서 수년동안 사용되어 왔다. 그러나, 통상적인 노출된 금속 스텐트는 몇몇 환자에서 재발협착증(처리된 영역에서 동맥의 재협소화)을 일으켜 혈액 응고를 유발할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 최근에, 항-CD34 항체 피복된 스텐트가 보고되었고 이는 혈액 전반에 걸쳐 순환하는 내피 선조 세포(EPC)를 포획함으로 인해 발생되는 혈액 응고를 방지하고 재발협착증을 감소시킨다. 내피 세포는 혈관을 따라 존재하여 혈류를 원할하게 하는 세포이다. EPC는 스텐트의 경표면에 부착하여 연한 층을 형성하고 치유를 촉진시킬 뿐만 아니라 이전에 스텐트의 사용과 연관된 합병증인 재발협착증 및 혈액 응고를 방지한다 (Aoji et al . 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9). 스텐트를 필요로 하는 환자에 대한 성과를 개선시킬 뿐만 아니라 심혈관 우회 수술을 필요로 하는 환자와도 관련이 있다. 예를 들어, 항-EPC 항체로 피복된 보족 혈관(인공 동맥)은 우회 수술 이식을 위해 환자 다리 또는 팔로부터 동맥을 사용할 필요가 없다. 이것은 수술 및 마취 시간을 감소시키고 이어서 관상 수술 사망을 감소시킬 것이다. DVD-Ig는 세포 보강을 촉진시키는 이식된 장치상에 피복된 단백질(또는 지질 및 폴리사카라이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종류의 에피토프) 뿐만 아니라 세포 표면 마커(CD34와 같은)에 결합되도록 하는 방식으로 디자인된다. 당해 방법은 또한 일반적으로 기타 의학적 이식체에 적용될 수 있다. 또한, DVD-Ig는 의료 장치에 피복될 수 있고 이식 및 장치로부터 모든 DVD가 방출되는 즉시(또는 이미 로딩된 DVD-Ig의 노화 및 변성을 포함하는 추가의 신선한 DVD-Ig를 필요로 할 수 있는 임의의 기타 요구시), 당해 장치는 신선한 DVD-Ig를 환자에게 전신 투여하여 재로딩될 수 있고 이때, DVD-Ig는 목적하는 표적(사이토킨, 세포 표면 마커(예를 들어, CD34)등)에 결합하도록 디자인되고 이는 장치상에 피복된 표적(지질, 폴리사카라이드 및 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종류의 단백질, 에피토프를 포함함)에 대한 한 세트의 결합 부위와 다른 결합 부위를 갖는다. 당해 기술은 피복된 이식체의 유용성을 연장시키는 이점을 갖는다.
A. 다양한 질환에서 DVD-Ig의 용도
본 기재내용의 DVD-Ig 분자는 또한 다양한 질환을 치료하기 위한 치료학적 분자로서 유용하다. 당해 DVD 분자는 특정 질환에 관련된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 다양한 질환에서 당해 표적의 예는 하기된 바와 같다.
1. 인간 자가면역 및 염증 반응
많은 단백질은 일반적인 자가면역 및 염증 반응에 연루되어 있고 다음을 포함한다: C5, CCL1 (I-309), CCL11 (에오탁신), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC / IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (내피 단핵구 활성화 사이토킨), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, 및 RNF110 (ZNF144). 한 측면에서, 상기 열거된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 DVD-Ig가 제공된다.
2. 천식
알레르기성 천식은 상승된 혈청 IgE 수준 뿐만 아니라 호산구증가증, 배상세포 이형성증, 상피 세포 변화, 기도 과민반응 (AHR), 및 Th2 및 Th1 사이토킨 발현의 존재를 특징으로 한다. 현재 기도 염증이, T세포, B 세포, 호산구, 비만세포 및 대식세포의 복합 상호작용 및 사이토킨 및 케목킨을 포함하는 이들의 분비 매개체의 상호작용을 포함하는, 천식 병리학의 주요 인자인 것으로 광범위하게 수긍되고 있다. 코르티코스테로이드는 오늘날 천식에 대해 가장 중요한 소염 치료제이지만 이의 작용 기작은 비특이적이고 특히 어린 환자 집단에서 안전성 문제가 존재한다. 따라서 보다 특이적이고 표적화된 치료제의 개발이 요구된다. 마우스에서 IL-13이, 호산구 염증과는 무관하게, AHR, 점액 과분비 및 기도 섬유증을 포함하는 천식의 많은 특징을 모방하고 있다는 증거가 증가하고 있다 (Finotto, et al. (2005) Internat. Immunol. 17(8): 993-1007; Padilla, et al. (2005) J. Immunol. 174(12): 8097-8105).
IL-13은 천식과 연관된 병리학적 반응을 유발하는데 주요 역할을 가짐으로서 관련되어 있다. 폐에서 IL-13의 효과를 감소시키는 항-IL-13 모노클로날 항체 치료제 개발은 신규 천식 치료제의 개발을 위해 상당히 전망있는 흥미로운 신규 방법이다. 그러나, 상이한 면역학적 경로의 기타 매개체가 또한 천식 병리에 연루되어 있고 IL-13 뿐만 아니라 이들 매개체를 차단하는 것이 추가의 치료학적 이득들 제공할 수 있다. 당해 표적 쌍은 IL-13, 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)와 같은 프로-염증 사이토킨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. TNF-α는 천식에서 염증 반응을 증폭시킬 수 있고 질환 중증도와 관련될 수 있다 (McDonnell, et al. (2001) Prog. Respir. Res. 31 247-250). 이것은 IL-13 및 TNF-α 둘다의 차단이 특히, 심각한 기도 질환에서 이로운 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 DVD-Ig는 표적 IL-13 및 TNFα에 결합하고 천식을 치료하기 위해 사용된다.
염증 및 AHR 둘다가 평가될 수 있는 OVA 유도된 천식 마우스 모델과 같은 동물 모델은 당업계에 공지되어 있고 천식을 치료하는 다양한 DVD-Ig의 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 천식을 연구하기 위한 동물 모델은 문헌[참조: Coffman et al. (2005) J. Exp. Med. 201(12): 1875-1879; Lloyd et al. (2001) Adv. Immunol. 77: 263-295; Boyce et al. (2005) J. Exp. Med. 201(12): 1869-1873; 및 Snibson et al. (2005) J. Brit. Soc. Allerg. Clin. Immunol. 35(2): 146-52]에 기재되어 있다. 당해 표적 쌍의 통상적인 안전성 평가 뿐만 아니라, 면역억제 정도에 대한 특이적 시험이 요구될 수 있고 최상의 표적 쌍을 선별하는데 도움이 된다(문헌참조: Luster et al. (1994) Toxicology 92(1-3): 229-43; Descotes et al. (1992) Devel. Biol. Stand. 77: 99-102; Hart et al. (2001) J. Allerg. Clin. Immunol. 108(2): 250-257).
상기된 추론 및 효능 및 안정성에 대한 동일한 평가 모델을 사용함을 기초로, DVD-Ig 분자가 결합할 수 있고 천식을 치료하는데 유용한 기타 표적 쌍을 측정할 수 있다. 하나의 양태에서, 당해 표적은 IL-13과 IL-1베타(IL-1베타는 또한 천식에서 염증 반응에 연루되어 있다); IL-13과 염증에 관여하는 사이토킨과 케목킨, 예를 들어 IL-13과 IL-9; IL-13과 IL-4; IL-13과 IL-5; IL-13과 IL-25; IL-13과 TARC; IL-13과 MDC; IL-13과 MIF; IL-13과 TGF-b; IL-13과 LHR 효능제; IL-13과 CL25; IL-13과 SPRR2a; IL-13과 SPRR2b; 및 IL-13과 ADAM8을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 기재내용은 또한 하기의 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 천식에 연루된 하나 이상의 표적과 결합할 수 있는 DVD-Ig를 제공한다: CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, 히스타민 및 히스타민 수용체, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, 및 키티나제.
3. 류마티스 관절염
전신성 질환인 류마티스 관절염(RA)는 관절 활막에서의 만성 염증 반응을 특징으로 하고 연골의 퇴화 및 관절 인접 골의 부식과 연관되어 있다. TNF, 케목킨 및 성장 인자를 포함하는 많은 염증 촉진 사이토킨은 환부 관절에서 발현된다. RA의 마우스 모델에 항-TNF 항체 또는 sTNFR 융합 단백질 융합 단백질의 전신성 투여는 소염 및 관절 보호성 인것으로 나타났다. RA 환자에서 TNF의 활성이 정맥내 투여되는 인플릭시마브에 차단된 임상적 연구(Harriman, G. et al. (1999) Ann. Rheum. Dis. 58 (Suppl 1): I61-4)에서, 키메라 항-TNF 모노클로날 항체(mAB)는 TNF가 IL-6, IL-8, MCP-1 및 VEGF의 생산, 면역 및 염증 세포의 관절로의 보강, 혈관형성 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 및 3의 혈액 수준의 감소를 조절한다는 증거를 제공했다. 류마티스 관절염에서 염증 경로의 보다 나은 이해를 통해 류마티스 관절염에 연루된 기타 치료학적 표적을 동정하게 되었다. 인터류킨-6 길항제, Chugai, Roche에 의해 개발된 IL-6 수용체 항체 MRA(문헌참조: Nishimoto, N. et al. (2004) Arthrit. Rheum. 50(6): 1761-1769), CTLA4Ig(abatacept, Genovese, M. et al. (2005) N. Engl. J. Med. 353: 1114-23), 및 항-B 세포 치료 (rituximab; Okamoto, H. and Kamatani, N. (2004) N. Engl. J. Med. 351: 1909)와 같은 전망있는 치료제가 지난해에 걸쳐 무작위 조절된 시험에서 이미 시험되었다. 인터류킨-15(치료학적 항체 HuMax-IL_15, AMG714, 문헌참조: Baslund, B. et al. (2005) Arthrit. Rheum. 52(9): 2686-2692), 인터류킨-17 및 인터류킨-18을 포함하는 기타 사이토킨이 동정되었고 동물 모델에서 이로운 것으로 나타났고 이들 제제의 임상적 시험이 진행중에 있다. 항-TNF와 또 다른 매개체를 병용하는 이원 특이적 항체 치료는 임상적 효능 및/또는 환자 보호에 큰 잠재력을 갖는다. 예를 들어, TNF 및 VEGF 둘다를 차단함으로써 RA의 병생리학에 연루된 염증 및 혈관형성을 잠재적으로 박멸시킬 수 있다. TNF와 IL-18; TNF와 IL-12; TNF와 IL-23; TNF와 IL-1베타; TNF와 MIF; TNF와 IL-17; TNF와 IL-15 및 TNF와 SOST를 포함하지만 이에 제한되지 않는 RA에 연루된 기타 표적쌍을 특이적 DVD Ig로 차단시키는 것이 또한 고려된다. 이들 표적 쌍에 대한 통상적인 안정성 평가 뿐만 아니라 면역 억제 정도에 대한 특정 시험이 요구될 수 있고 표적 쌍을 선별하는데 도움이 된다(문헌참조: Luster et al. (1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43; Descotes et al. (1992) Devel. Biol. Stand. 77: 99-102; Hart et al. (2001) J. Allerg. Clin. Immunol. 108(2): 250-257). DVD Ig 분자가 류마티스 관절염 치료를 위해 유용할 것인지의 여부는 콜라겐 유도된 관절염 마우스 모델과 같은 임상전 동물 RA 모델을 사용하여 평가할 수 있다. 기타 유용한 모델은 또한 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Brand D.D. (2005) Comp. Med. 55(2):114-22). 인간 및 마우스 유사체에 대한 모 항체의 교차 반응성을 기준으로(예를 들어, 인간 및 마우스 TNF, 인간 및 마우스 IL-15 등에 대한 반응성), 마우스 CIA 모델에서 입증 연구는 "일치된 대용 항체" 유래된 DVD-Ig 분자로 수행될 수 있고; 간략하게 2개(또는 그 이상)의 마우스 표적 특이적 항체를 기초로 하는 DVD-Ig는 인간 DVD-Ig 작제에 대해 사용된 모 인간 또는 인간화된 항체의 특성(유사 친화도, 유사 중화 효능, 유사 반감기 등)에 가능한한 정도로 일치될 수 있다
4. SLE
SLE의 면역병리학적 특징은 폴리클로날 B 세포가 활성화되어 글로불린 과다 혈증, 자가항체 생산 및 면역 복합체의 형성이 유도된다는 것이다. 기본적인 비정상적 현상은 T 세포가, 일반화된 T 세포 조절불능으로 인해 막아야 될 B 세포 클론을 억제하지 못한다는 것이다. 또한, B 및 T-세포 상호작용은, 제2 시그날을 개시하는 CD40, CD40L, B7, CD28, 및 CTLA-4와 같은 공동 자극 분자 뿐만 아니라 여러 사이토킨(예를 들어, IL-10)에 의해 촉진된다. 이들 상호작용은, 면역 복합체 및 아폽토시스 물질에 대한 식세포 제거의 손상과 함께 면역 반응을 존속시키고 조직 손상이 유발된다. 하기의 표적이 SLE에 연루될 수 있고 잠재적으로 치료학적 중재를 위한 DVD-Ig 방법(B 세포 표적 치료)을 위해 잠재적으로 사용될 수 있다: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, 및 NT5E; 공동 자극 시그날: CTLA4 또는 B7.1/B7.2; B 세포 생존 억제: BlyS 또는 BAFF; 보체 불활성화: C5; 사이토킨 조절. 주요 원리는 임의의 조직에서 총 생물학적 반응이 염증 촉진 또는 소염 사이토킨의 국소적 수준간에 이의 균형에 따른 결과인 것이다(문헌참조: Sfikakis P.P. et al. (2005) Curr. Opin. Rheumatol. 17:550-7). SLE는 혈청중에서 IL-4, IL-6, IL-10이 상승하는 것으로 입증된 Th-2 유발 질환인 것으로 간주된다. IL-4, IL-6, 및 IL-10, IFN-α, 및 TNF-α로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 표적과 결합할 수 있는 DVD Ig가 또한 고려된다. 상기 논의된 표적의 조합은 SLE에 대한 치료학적 효능을 증진시킬 것이고 이것은 다수의 낭창 임상전 모델에서 시험될 수 있다(문헌참조: Peng S.L. (2004) Methods Mol Med.;102:227-72). 인간에 대한 모 항체 및 마우스 유사체의 교차 반응성을 기준으로(예를 들어, 인간 및 마우스 CD20, 인간 및 마우스 인터페론 알파 등에 대한 반응성), 마우스 낭창 모델에서 "일치된 대용 항체" 유래된 DVD-Ig 분자를 사용하여 확인 연구를 수행할 수 있다. 간략하게, DVD-Ig 기반 2개(이상)의 마우스 표적 특이적 항체는 인간 DVD-Ig 작제를 위해 사용되는 모 인간 또는 사라화된 항체의 특성(유사한 친화도, 유사한 중화 효능, 유사한 반감기 등)을 분석할 수 있을 정도로 일치할 수 있다).
5. 다발성 경화증
다발성 경화증 (MS)은 병인이 명백하게 미지인 복합 인간 자가면역형 질환이다. 신경계 전반에 걸친 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 면역학적 파괴는 다발성 경화증의 주요 병리이다. MS는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 침투를 포함하는 복합 병리 질환이고 중추 신경계내 반응 질환이다. 사이토킨, 반응성 질소 종 및 동시자극인자 분자의 CNS내 발현은 모두 MS에서 기재되었다. 주로 고려되는 것은 자가면역 발병에 기여하는 면역학적 기작이다. 특히, 항원 발현, 사이토킨 및 백혈구 상호작용 및 조절 T-세포는 Th1 및 Th2 세포와 같은 기타 T-세포의 균형/조절을 도와주고 치료학적 표적 동정을 위해 중요한 영역이다.
IL-12는 염증 촉진 사이토킨이고 APC에 의해 생성되어 Th1 이펙터 세포의 분화를 촉진한다. IL-12는 MS를 앓는 환자 및 EAE-에 걸린 동물의 발생 병변에서 생성된다. 이전에, IL-12 경로에서의 간섭은 설치류에서 EAE를 예방하고 항-IL-12 mAb를 사용한 IL-12p40의 생체내 중화는 통상의 마모셋에서 미엘린 유도된 EAE 모델에서 이로운 효과를 갖는 다는 것을 보여주었다.
TWEAK는 TNF 계열의 구성원이고, 염증 촉진, 증식 또는 아폽토시스 효과가 세포 유형에 의존하는 중추 신경계(CNS)내에서 항상성으로 발현된다. 이의 수용체인 Fn14는 내피 세포, 반응성 성상세포 및 뉴런에 의해 CNS에서 발현된다. TWEAK 및 Fn14 mRNA 발현은 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안에 척수에서 증가된다. C57BL/6 마우스에서 미엘린 올리고수지상세포 당단백질(MOG) 유도된 EAA에서 항 -TWEAK 항체 처리는 마우스가 적응(priming) 기간 후 처리되는 경우 질환 중증도 및 백혈구 침투를 감소시킨다.
본 기재내용의 한 측면은 IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN감마, GM-CSF, FGF, C5, CD52, 및 CCR2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상, 예를 들어, 2개의 표적과 결합할 수 있는 DVD Ig 분자에 관한 것이다. 하나의 양태는 MS의 치료에 이로운 치료제로서 이원-특이적 항-IL-12/TWEAK DVD Ig를 포함한다.
MS를 치료하기 위한 DVD 분자의 유용성을 평가하기 위한 여러 동물 모델은 당업계에 공지되어 있다 (문헌참조: Steinman. L. et al. (2005) Trends Immunol. 26(11): 565-71; Lublin, F.D. et al. (1985) Springer Semin. Immunopathol. 8(3): 197-208; Genain, C.P. et al. (1997) J. Mol. Med. 75(3): 187-97; Tuohy, V.K. et al. (1999) J. Exp. Med. 189(7): 1033-42; Owens, T. et al. (1995) Neurol. Clin.13(1): 51-73; 및 Hart, B.A. et al. (2005) J. Immunol. 175(7): 4761-8). 인간 및 동물 종 유사체에 대한 모 항체의 교차 반응성(예를 들어, 인간 및 마우스 IL-12, 인간 및 마우스 TWEAK 등에 대한 반응성)을 기준으로 "일치된 대용 항체" 유래 DVD-Ig 분자를 사용하여 마우스 EAE 모델에서 확인 연구를 수행할 수 있다. 간략하게, 2개(이상)의 마우스 표적 특이적 항체에 대한 것을 기초로 하는 DVD-Ig는 인간 DVD-Ig 작제를 위해 사용되는 모 인간 또는 인간화된 항체의 특성 (유사한 친화도, 유사한 중화 효능, 유사한 반감기 등)을 분석할 수 있는 정도 일치될 수 있다. 동일한 개념을 기타 비-설치류 종의 동물 모델에 적용하고, 여기서 "일치된 대용 항체" 유래 DVD-Ig는 예상된 약리학 및 가능한 안정성 연구를 위해 선별된다. 이들 표적 쌍의 통상적인 안전성 평가 뿐만 아니라 면역 억제 정도에 대한 특정 시험이 요구될 수 있고 최상의 표적 쌍을 선택하는데 도움이 된다(문헌참조: Luster et al. (1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43; Descotes et al. (1992) Devel. Biol. Stand. 77: 99-102; Jones, R. (2000) IDrugs 3(4): 442-6).
6. 패혈증
패혈증의 병생리학은 그람 음성 유기체의 외막 성분(리포폴리사카라이드(LPS), 지질 A, 내독소) 및 그람 양성 유기체의 외막 성분(리포테이코산, 펩티도글리캔)에 의해 개시된다. 이들 외막 성분은 단핵구의 표면상의 CD14 수용체와 결합할 수 있다. 이어서 최근에 보고된 톨(toll)형 수용체에 의해, 시그날은 세포로 전달되어 결국 염증 촉진 사이토킨 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파) 및 인터류킨-1(IL-1)의 생성을 유발한다. 압도적인 염증 및 면역 반응은 패혈성 쇼크의 필수적 특징이고 조직 손상, 다발성 기관 부전증 및 패혈증 유도된 사멸의 병리에 중추 역할을 한다. 사이토킨, 특히, 종양 괴사 인자 (TNF) 및 인터류킨 (IL)-1은 패혈성 쇼크의 중요한 매개체인 것으로 밝혀졌다. 이들 사이토킨은 조직에 대한 직접적인 독성 효과를 갖고 이들은 또한 포스포리파제 A2를 활성화시킨다. 이들 및 기타 효과는 혈소판 활성화 인자의 농도를 증가시키고 산화질소 신타제 활성을 촉진시키고 호중구에 의한 조직 침투를 촉진시키고 호중구 활성을 촉진시킨다.
패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료는 임상적 난제로서 남아있고 염증 반응에 겨냥된 생물학적 반응 개질제(즉, 항-TNF, 및 항-MIF)를 사용한 최근 기대되는 시험이 단지 약간의 임상적 이득을 나타내었다. 최근에, 관심이 면역 억제의 수반된 기간을 역전시키것을 목표로 하는 치료쪽으로 전환되었다. 실험 동물 및 중증 환자에 대한 연구는 림프성 기관 및 몇몇 유조직의 증가된 아폽토시스가 당해 면역 억제, 아네르기 및 기관계 기능부전에 기여하는 것임을 입증하였다. 패혈증 증후군동안에, 림프구 아폽토시스는 IL-12의 부재 또는 글루코코르티코이드, 그랜자임 또는 소위 '사멸' 사이토킨, 종양 괴사 인자 알파 또는 Fas 리간드의 방출에 의해 유발될 수 있다. 아폽토시스는 시토졸 및/또는 미토콘드리아 카스파제의 자가 활성화를 통해 진행하고, 당해 카스파제는 Bcl-2 계열의 아폽토시스 촉진 및 항-아폽토시스 구성원에 의해 영향받을 수 있다. 실험적 동물에서, 아폽토시스의 억제제를 사용한 치료로 림프구 세포 아폽토시스를 방지할 수 있을 뿐만 아니라 이것은 또한 당해 결과를 개선시킬 수 있다. 항-아폽토시스 제제를 사용한 임상적 시도는 대부분 이들의 투여 및 조직 표적화와 연관된 기술적 어려움으로 인해 아득하지만 림프구 아폽토시스의 억제는 패혈성 환자에 대한 매력적인 치료학적 표적을 나타낸다. 또한, 염증 매개체 및 아폽토시스 매개체를 표적화하는 이원 특이적 제제는 부가 이득을 가질 수 있다. 본 기재내용의 한 측면은 하기의 표적으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 패혈증에 연루된 하나 이상의 표적, 바람직하게는 2개의 표적과 결합할 수 있는 DVD Ig에 관한 것이다: TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, 톨형 수용체, TLR-4, 조직 인자, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, 미드킨, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, 및 TREM1. 패혈증에 대한 당해 DVD Ig의 효능은 당업계에 공지된 임상전 동물 모델에서 평가될 수 있다(문헌참조: Buras, J.A. et al. (2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10): 854-65; 및 Calandra, T. et al. (2000) Nat. Med. 6(2): 164-70).
7. 신경학적 장애
7.1. 신경퇴행성 질환
만성 퇴행성 질환은 일반적으로 연령에 의존하는 질환으로서, 신경 기능의 점진적인 상실(뉴런 세포사, 탈수초성), 운동성 상실 및 기억 상실을 특징으로 한다. 이들은 뉴런 기능의 점진적인 상실(뉴런 세포 사멸, 탈수초화), 운동성 상실 및 기억 상실을 특징으로 한다. 만성 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머 질환)을 뒷받침하는 기작에 대한 새로운 지식은 복합적 병인을 보여주고, 다양한 인자, 예를 들어, 혈당 상태, 아밀로이드 생산 및 다량체화, 수용체 RAGE(AGE에 대한 수용체)에 결합하는 진전된 당화 최종 생성물(AGE)의 축적, 증가된 뇌 산화 스트레스, 감소된 뇌 혈류, 염증성 사이토킨 및 케목킨을 포함하는 신경염증, 뉴런 기능부전 및 소교 세포 활성화가 이들의 발병 및 진행에 기여하는 것으로 인지되었다. 따라서, 이들 만성 신경퇴행성 질환은 다발성 세포 유형 및 매개체간에 복잡한 상호작용을 나타낸다. 당해 질환에 대한 치료 전략은 제한되고 대부분 비특이적 소염제(예를 들어, 코르티코스테로이드, COX 억제제)로 염증 과정을 차단하거나 당해 제제로 뉴런 상실 및/또는 시냅스 기능을 차단하는 것으로 구성된다. 이들 치료는 질환 진행을 중지시키는데 실패한다. 최근 연구는 가용성 A-b 펩타이드(A-b 올리고머 형태를 포함함)에 대한 항체와 같은 보다 표적화된 치료가 질환 진행의 중지를 도와줄수 있을 뿐만 아니라 기억의 유지를 도와줄 수 있음을 시사한다. 이들 예비 관찰은 하나 이상의 질환 매개체(예를 들어, A-b, 및 TNF와 같은 염증 촉진 사이토킨)를 표적화하는 특정 치료가 단일 질환 기작(예를 들어, 가용성 Aβ 단독)을 표적화하여 관찰되는 것 보다 만성 신경퇴행성 질환에 대해 보다 우수한 치료학적 효능을 제공할 수 있음을 시사한다(문헌참조: Nelson, R.B. (2005) Curr. Pharm. Des. 11: 3335; Klein. W. (2002) Neurochem. Int. 41: 345; Janelsins, M.C. et al. (2005) J. Neuroinflamm. 2: 23; Soloman, B. (2004) Curr. Alzheimer Res. 1: 149; Klyubin, I. et al. (2005) Nat. Med. 11: 556-61; Bornemann, K.D et al. (2001) Am. J. Pathol. 158: 63; Deane, R. et al. (2003) Nat. Med. 9: 907-13; 및 Masliah, E. et al. (2005) Neuron. 46: 857).
본 기재내용의 DVD-Ig 분자는 알츠하이머와 같은 만성 신경퇴행성 질환에 연루된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 당해 표적은 AD 병리학에 연루된 임의의 매개체, 가용성 또는 세포 표면, 예를 들어, AGE(S100A, 암포테린), 염증 촉진 사이토킨(예를 들어, IL-1), 케목킨(예를 들어, MCP 1), 신경 재생을 억제하는 분자(예를 들어, Nogo, RGM A) 및 신경 성장을 증진시키는 분자(뉴로트로핀)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. DVD-Ig 분자의 효능은 아밀로이드 전구체 단백질 또는 RAGE를 과발현하고 알츠하이머 질환 유사 증상을 나타내는 유전자 전이 마우스와 같은 임상전 동물 모델에서 유효할 수 있다. 또한, DVD-Ig 분자는 작제되고 동물 모델에서 효능에 대해 시험될 수 있고 인간 환자에서 시험하기 위한 최상의 치료학적 DVD-Ig 가 선택될 수 있다. DVD-Ig 분자는 또한 파킨슨 질환과 같은 기타 신경퇴행성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 알파-시누클레인은 파킨슨 병리학에 관여한다. 알파-시누클레인 및 염증 매개체(예를 들어, TNF, IL-1, MCP-1)를 표적화할 수 있는 DVD-Ig는 파킨슨 질환에 대해 효과적인 치료임을 입증할 수 있고 본 기재내용에 고려된다.
7.2 신경 소생 및 척수 손상
병리학적 기작의 지식이 증가했음에도 불구하고 척수 손상(SCI)은 여전히 황무지인 상태이고 고도의 의학적 요구를 특징으로 하는 의학적 징후를 나타낸다. 대부분의 척수는 타박상이거나 압착 손상이고 1차 손상은 일반적으로 2차 손상 기작(염증 매개체, 예를 들어, 사이토킨 및 케목킨)에 따른 것이고 이것은 초기 손상을 악화시키고 환부를, 때때로 10배 이상으로 증대시킨다. SCI에서 이들 1차 및 2차 기작은 기타 수단에 의해 유발되는 뇌 손상, 예를 들어, 뇌졸중의 기작과 매우 유사하다. 어떠한 만족할만한 치료가 존재하지 않고 메틸프레드니솔론(MP)의 고 투여량의 일시 주사가 손상 후 8시간의 좁은 시간 범위에서만 사용되는 치료이다. 그러나, 당해 치료는 단지 임의의 상당한 기능적 회복 없이 2차 손상을 예방하기 위해 의도된다. 명백한 효능의 부재 및 후속 감염 및 중증 조직학적 근육 변형을 갖는 면역억제와 같이 중증 역효과 때문에 가혹하게 비판받고 있다. 내인성 소행 잠재력을 자극하는 어떠한 다른 약물, 생물학적 또는 소분자도 승인되지 않았지만 최근해에 SCI의 동물모델에서 전망있는 치료 원리 및 약물 후보가 효능을 나타내었다. 인간 SCI에서 기능적 회복의 부재는 대부분, 환부, 상처 조직, 미엘린에서 및 손상 관련 세포상에서 신경돌기 성장을 억제하는 인자에 의해 유발된다. 당해 인자는 미엘린 연관 단백질 NogoA, OMgp 및 MAG, RGM A, 상처 연관 CSPG(콘드로이틴 설페이트 프로테오글리캔) 및 반응성 성상세포에 대한 억제 인자(몇몇 세마포린 및 에프린)이다. 그러나, 환부에는 성장 억제 인자 뿐만 아니라 뉴로트로핀, 라미닌, L1 및 기타와 같은 신경돌기 성장 자극 인자가 존재한다. 신경돌기 성장 억제 및 성장 촉진 분자의 전체적 효과는 NogoA 또는 RGM A와 같은 단일 인자의 차단이, 억제 영향의 감소가 성장 억제로부터 성장 촉진으로의 균형을 전환시킬 수 있기 때문에, 설치류 SCI 모델에서 기능적으로 상당히 회복시킴을 설명할 수 있다. 그러나, 단일 신경돌기 과증식 억제 분자를 차단함으로써 관찰되는 회복은 완전하지 않다. 보다 신속하고 보다 명백한 회복을 달성하기 위해, Nogo 및 RGM A와 같은 2개의 신경돌기 과증식 억제 분자를 차단하거나 신경돌기 과증식 억제 분작를 차단하고 신경돌기 과증식 증진 분자(예를 들어, Nogo 및 뉴로트로핀)의 기능을 증진시키거나 신경돌기 과증식 억제 분자(Nogo 및 염증 촉진 분자, 예를 들어, TNF )를 차단하는 것이 바람직할 수 있다 (문헌참조: McGee, A.W. et al. (2003) Trends Neurosci. 26: 193; Domeniconi, M. et al. (2005) J. Neurol. Sci. 233: 43; Makwana1, M. et al. (2005) FEBS J. 272: 2628; Dickson, B.J. (2002) Science 298: 1959; Yu, F. and Teng, H. et al. (2005) J. Neurosci. Res. 79: 273; Karnezis, T. et al. (2004) Nature Neurosci. 7: 736; Xu, G. et al. (2004) J. Neurochem. 91: 1018).
한 측면에서, NgR과 RGM A; NogoA와 RGM A; MAG과 RGM A; OMGp와 RGM A; RGM A와 RGM B; CSPG와 RGM A; 아그레칸, 미드킨, 뉴로칸, 베르시칸, 포스파칸, Te38 및 TNF-α; 및 Aβ 원형체 특이적 항체와 같은 표적 쌍과 결합할 수 있는 DVD-Ig가 수지상세포 및 액손 발아를 촉진하는 항체와 배합되어 제공된다. 수지상세포 병리는 AD에 대한 매우 조기 징후이고 NOGO A가 수지상세포 성장을 제한시키는 것으로 공지되어 있다. 당업자는 당해 유형의 Ab를 SCI-후보물(미엘린-단백질) Ab와 배합할 수 있다. 기타 DVD-Ig 표적은 NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG 및 Omgp의 조합체를 포함할 수 있다. 추가로, 표적은 또한 신경돌기의 억제에 연루된 임의의 매개체, 가용성 또는 세포 표면, 예를 들어, Nogo, Ompg, MAG, RGM A, 세마포린, 에프린, 가용성 A-b, 염증 촉진 사이토킨(예를 들어, IL-1), 케목킨(예를 들어, MIP 1a), 및 신경 퇴행을 억제하는 분자를 포함할 수 있다. 항-Nogo/항-RGM A 또는 유사한 DVD-Ig 분자의 효능은 척수 손상의 임상전 동물 모델에서 유효할 수 있다. 또한, 이들 DVD-Ig 분자가 작제될 수 있고 동물 모델에서 효능에 대해 시험될 수 있고 최상의 치료학적 DVD-Ig가 인간 환자에서 시험하기 위해 선택될 수 있다. 또한, 단일 수용체, 예를 들어, 3개의 리간드 Nogo, Ompg 및 MAG와 결합하는 Nogo 수용체 및 A-b 및 S100 A와 결합하는 RAGE상에 2개의 별도의 결합 부위를 표적화하는 DVD-Ig 분자가 작제될 수 있다. 추가로, 신경돌기 과증식 억제제, 예를 들어, Nogo 및 Nogo 수용체는 또한 다발성 경화증과 같은 면역학적 질환에서 신경 소생을 방지하는 역할을 한다. Nogo-Nogo 수용체 상호작용의 억제는 다발성 경화증의 동물 모델에서 회복을 증진시키는 것으로 나타났다. 따라서, 하나의 면역 매개체, 예를 들어, IL-12와 같은 사이토킨의 기능 및 신경돌기 과증식 억제제 분자, 예를 들어, Nogo 또는 RGM의 기능을 을 차단할 수 있는 DVD-Ig 분자는 면역 또는 신경돌기 억제제 분자만을 차단하는 것 보다 신속하고 보다 큰 효능을 제공할 수 있다.
8. 종양학적 장애
모노클로날 항체 치료는 암에 대한 중요한 치료학적 방식으로서 나타났다 (von Mehren M, et al. (2003) Annu. Rev. Med.54:343-69). 항체는 아폽토시스, 재-지시된 세포독성, 리간드-수용체 상호작용의 간섭을 유도하거나 신생물 표현형에 중요한 단백질의 발현을 차단함에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 항체는 종양 미세환경의 성분을 표적화하여 종양 연관 혈관형성과 같은 중요한 구조물을 교란시킬 수 있다. 항체는 또한 리간드가 성장 인자인 수용체, 예를 들어, 상피 성장 인자 수용체를 표적화할 수 있다. 따라서, 당해 항체는 표적화된 종양 세포에 결합하여 세포 성장을 자극하는 중성 리간드를 억제한다. 또한, 항체는 항-이디오타입 네트워크, 보체 매개 세포독성, 또는 항체 의존성 세포성 세포 독성(ADCC)를 유도할 수 있다. 2개의 별도의 종양 매개체를 표적화하는 이원-특이적 항체의 사용은 단일 특이적 치료에 비하여 추가의 이득을 제공한다. 종양 질환을 치료하기 위한 다음의 표적 쌍에 결합할 수 있는 DVD Ig가 또한 고려된다: IGF1과 IGF2; IGF1/2와 HER-2; VEGFR과 EGFR; CD20과 CD3; CD138과 CD20; CD38과 CD20; CD38과 CD138; CD40과 CD20; CD138과 CD40; CD38과 CD40; CD-20과 CD-19; CD-20과 EGFR; CD-20과 CD-80; CD-20과 CD-22; CD-3과 HER-2; CD-3과 CD-19; EGFR과 HER-2; EGFR과 CD-3; EGFR과 IGF1,2; EGFR과 IGF1R; EGFR과 RON; EGFR과 HGF; EGFR과 c-MET; HER-2와 IGF1,2; HER-2와 IGF1R; RON과 HGF; VEGF와 EGFR; VEGF와 HER-2; VEGF와 CD-20; VEGF와 IGF1,2; VEGF와 DLL4; VEGF와 HGF; VEGF와 RON; VEGF와 NRP1; CD20과 CD3; VEGF와 PLGF; DLL4와 PLGF; ErbB3과 EGFR; HGF와 ErbB3, HER-2와 ErbB3; c-Met와 ErbB3; HER-2와 PLGF; HER-2와 HER-2; TNF와 SOST.
기타 표적 조합은 EGF/erb-2/erb-3 계열의 하나 이상의 구성원을 포함한다. DVD-Ig가 결합할 수 있는 종양약적 질환에 관여하는 기타 표적(하나 이상)은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, ILIA, ILlB, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSFlO, BMP6, EGF, FGFl, FGFlO, FGFl1, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGFl, IGF2, IL 12A, ILIA, ILlB, IL2, INHA, TGFA, TGFBl, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGFlO, FGFl8, FGF2, FGF4, FGF7, IGFlR, IL2, BCL2, CD164, CDKNlA, CDKNlB, CDKNlC, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRHl, IGFBP6, ILIA, ILlB, ODZl, PAWR, PLG, TGFBlIl, AR, BRCAl, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENOl, ERBB2, ESRl, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKDl, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRHl, IGFl, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NRlDl, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESRl, ESR2, NROBl, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGFl, FGF2, FGF6, KLK3, KRTl, APOCl, BRCAl, CHGA, CHGB, CLU, COLlAl, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGFl, FGFlO, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRHl, IGFl, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, ILlB, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLKlO, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZl, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDHl, CDHlO, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDHl, CDHlO, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGAl, APC, CD164, COL6A1, MTSSl, PAP, TGFBlIl, AGR2, AIGl, AKAPl, AKAP2, CANTl, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYCl, DAB2IP, DES, DNCLl, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEBl, GAGECl, GGTl, GSTPl, HIPl, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAIl, KRT2A, MIBl, PARTl, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PRl, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPMl, TPM2, TRPC6, ANGPTl, ANGPT2, ANPEP, ECGFl, EREG, FGFl, FGF2, FIGF, FLTl, JAGl, KDR, LAMA5, NRPl, NRP2, PGF, PLXDCl, STABl, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAIl, COL4A3, IL8, LAMA5, NRPl, NRP2, STABl, ANGPTL4, PECAMl, PF4, PROK2, SERPINFl, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCLl, CXCLlO, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNAl, IFNBl, IFNG, ILlB, IL6, MDK, EDGl, EFNAl, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGFl, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFBl, TGFB2, TGFBRl, CCL2, CDH5, COLl 8Al, EDGl, ENG, ITGAV, ITGB3, THBSl, THBS2, BAD, BAGl, BCL2, CCNAl, CCNA2, CCNDl, CCNEl, CCNE2, CDHl (E-캐드헤린), CDKNlB (p27Kipl), CDKN2A (pl6INK4a), COL6A1, CTNNBl (b-카테닌), CTSB (카뎁신 B), ERBB2 (Her-2), ESRl, ESR2, F3 (TF), FOSLl (FRA-I), GATA3, GSN (겔솔린), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (당단백질 130), ITGA6 (a6 인테그랄), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki- 67), NGFB (NGF), NGFR, NMEl (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (마스핀), SERPINEl (PAI-I), TGFA, THBSl (트롬보스폰딘-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (토포이소머라제 Iia), TP53, AZGPl (zinc-a-당단백질), BPAGl (플렉틴), CDKNlA (p21Wapl/Cipl), CLDN7 (클라우딘-7), CLU (클루스테린), ERBB2 (Her-2), FGFl, FLRTl (피브로넥틴), GABRP (GABAa), GNASl, ID2, ITGA6 (a6 인테그린), ITGB4 (b 4 인테그린), KLF5 (GC Box BP), KRTl 9 (케라틴 19), KRTHB6 (모발 특이적 II형 케라틴), MACMARCKS, MT3 (메탈로티오넥틴-III), MUCl (뮤신), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (리포필린 B), SCGB2A1 (맘마글로빈 2), SCGB2A2 (맘마글로빈 1), SPRRlB (Sprl), THBSl, THBS2, THBS4, 및 TNFAIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, 포스파티딜세린, ROBO4, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFRl, MTSPl, MSP, EPHB2, EPHAl, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR 알파, PDGFR 베타, RORl, PSMA, PSCA, SCDl, 및 CD59.
9. 다른 질병, 질환 및 병태
BNP는 심장 기능과 관련되어 왔다. 다른 질병 중에서, BNP DVD-Ig는 심장, 혈관 또는 순환에 관련된 다양한 임상 질병, 질환 또는 병태를 포함하는 심혈관 질병의 치료에 잠재적으로 사용될 수 있다. 질병, 질환 또는 병태는 심장, 대뇌 또는 말초 동맥의 죽상경화성 손상에 기인할 수 있다. 이러한 잠재적으로 치료가능한 심혈관 질병은 관상 동맥질환, 말초 동맥질환, 고혈압, 심근경색, 심부전 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유사하게, HIV DVD-Ig가 AIDS 또는, AIDS의 증상의 치료시 사용될 수 있다.
IL-18은 염증 질환, 예를 들면, 알레르기 및 자가면역병(문헌참조: Kawashima et al. (1997) J. Educ. Inform. Rheumatol. 26(2): 77), 급성 신장 손상(문헌참조: Parikh et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16: 3046-3052; 및 Parikh et al. (2006) Kidney Int'l. 70: 199-203), 만성 신장병(패널 분석(panel assay)의 일부로 사용되는 경우와 같이), 최소-변화 신장염 증후군(MCNS)(문헌참조: Matsumoto et al. (2001) Nephron 88: 334-339), 성인-발병 스틸병(adult-onset Still's disease)(문헌참조: Kawaguchi et al. (2001) Arthrit. Rheum. 44(7): 1716-1717), 소아 아토피 피부염(문헌참조: Hon et al. (2004) Ped. Derm. 21(6): 619-622), 적혈구잠식성 림프조직구증(HLH)(문헌참조: Takeda et al. (1999) Brit. J. Haematol. 106(1): 182-189), 소아 특발성 관절염(문헌참조: Lotito et al. (2007) J. Rheumatol. 34(4): 823-830), 난소암(문헌참조: Le Page et al. (20060 Int'l J. Cancer 118: 1750-1758), 전신 홍반 루푸스(문헌참조: Amerio et al. (2002) Clin. Exp. Rheum. 20(4): 535-538), 및 미래 심혈관 사건(future cardiovascular event)(문헌참조: Blankenberg et al. (2003) Circul. 108(20): 2453-2459)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 병태 또는 질병 상태에 대한 마커인 것으로 측정되어 왔다.
NGAL은 급성 신장 손상 또는 질병에 대한 조기 마커이다. 활성화된 인간 호중구의 특이적인 과립에 의해 분비되는 것 외에, NGAL은 요세관 내피 손상에 대한 반응시 네프론에 의해 생산되며 요세관간질신장염(TI) 손상의 마커이다. NGAL 수준은 심지어 온화환 "아임상" 신장 허혈 후에도, 허혈 또는 신독성으로부터 급성 요세관괴사(ATN)를 유발한다. 또한, NGAL은 만성 신장병(CKD) 및 급성 신장손상((AKI); 문헌참조: 예를 들면, Devarajan et al. (2008) Amer. J. Kidn. Dis. 52(3): 395-399 및 Bolignano et al. (2008) Amer. J. Kidn. Dis. 52(3): 595-605)의 경우에 신장에 의해 발현되는 것으로 공지되어 있다. 상승된 뇨 NGAL 수준은 진행성 신부전을 예측가능한 것으로 제안되어 왔다. NGAL은 동물 및 인간 모델 둘다에서 허혈성 또는 신장독성 손상 후의 아주 초기에 뇨세관에 의해 표시되게 나타내어지는 것으로 앞서 입증되어 왔다. NGAL은 용이하게 검출되어 측정될 수 있는 뇨내로 신속하게 분비되며, 허혈성 손상의 다른 어떠한 공지된 뇨 또는 혈청 마커의 출현을 앞서간다. 단백질은 프로테아제에 대해 내성이며, 이는, 이것이 신장 뇨세관내 NGAL 발현의 신뢰되는 마커로서 뇨내에서 회수될 수 있음을 제안한다. 또한, 신장의 외부로부터 기원하는, 예를 들면, 혈액으로부터 여과된 NGAL은 뇨내에서 존재하지 않으며, 오히려 근접한 요세관에 의해 다량 흡수된다. NGAL은 또한 감염과 관련된 것과 같은 염증을 포함하는, 다수의 다른 질병(문헌참조: 예를 들면, Xu et al. (2000) Biochim. et Biophys. Acta 1482: 298-307), 질환 및 병태의 진단 및/또는 예측시 마커이다. 이는 다른 것들 중에서도 비자극성 장 질환(문헌참조: 미국 특허 공보 2008/0166719 및 2008/0085524); 신장 질환, 질병 및 손상(문헌참조: 예를 들며, 미국 특허 공보 2008/0090304, 2008/0014644, 2008/0014604, 2007/0254370, 및 2007/0037232); 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크 및 다중 기관 기능장애 증후군(MODS)(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 공보 2008/0050832 및 2007/0092911; 또한 미국 특허 6,136,526 참조); 치주병(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 5,866,432); 및 정맥 혈전색전성 질병(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 공보 2007/0269836)에 대한 마커이다. 이의 유리되고, 착화되지 않은 형태에서, 이는 난소암, 침입성 및 비침입성 유방암 및 유방암에 대한 주요 위험 인자인, 비정형 관상 증식증(atypical ductal hyperplasia)에 대한 마커이다(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허공보 2007/0196876; 또한 암종의 증식성 상태의 평가와 관련하여 미국 특허 5,627,034 및 5,846,739 참조). 이는 또한 결장(Nielsen et al. (1996) Gut 38: 414-420), 췌장(Furutani et al. (1998) Canc. Lett. 122: 209-214), 및 식도암에 대한 마커이다. MMP-9와 함께 착화되는 경우, 이는 또한 조직 리모델링과 관련된 병태에 대한 마커이다(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 7,432,066 및 7,153,660). 고 수준의 NGAL(예를 들면, 대략 350 ㎍/L(Xu et al. (1995) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 55: 125-131)을 또한 바이러스 감염(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 7,056,702)에 대치되는 것으로서 세균 감염의 지표일 수 있다.
다른 질병 중에서, IL-18 및 NGAL DVD-Ig는 예를 들면, 급성 신부전, 급성 신장염증후군, 진통제신장병, 신죽종색전병, 만성 신부전, 만성 신장염, 선천성 신장염, 말기-단계 신장병, 굿파스처 증후군(Goodpasture syndrome), 간질신장염, 신장암, 신장 손상, 신장 감염, 신장 손상, 신장 결석, 루푸스 신장염, 막증식 GN I, 막증식 GN II, 막성 신장병, 미세변화병, 괴사성 사구체신염, 신장모세포종, 신장석회증, 신장기원요붕증, 신장병 - IgA, 신장병(신장병성 증후군), 다낭성 신장병, 후-스트렙토코쿠스성(post-streptococcal) GN, 환류 신장병, 신동맥색전술, 신동맥협착, 신장유두괴사, 신요세관산증 I형, 신요세관산증 II형, 신장 하관류(renal underperfusion), 신정맥혈전증 등을 포함하는, 신장에 대한 어떠한 질병, 질환, 또는 신장의 손상을 포함한, 신장병의 치료에 잠재적으로 사용될 수 있다.
IV. 약제학적 조성물
또한, 본 기재내용은 본 기재내용의 결합 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 기재내용의 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 장애를 진단, 검출 또는 모니터링하거나 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방(예를 들면, 질환, 장애 또는 기타 상태의 개시의 억제 또는 지연), 치료, 처리 또는 완화시키고/시키거나 연구에 사용하기 위한 것이다. 특정 양태에서, 조성물은 본 기재내용의 하나 이상의 결합 단백질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 약제학적 조성물은 본 기재내용의 하나 이상의 결합 단백질, 및 본 기재내용의 결합 단백질 이외에 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 하나의 양태에서, 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방(예를 들면, 질환, 장애 또는 기타 상태의 개시의 억제 또는 지연), 치료, 처리 또는 완화시키는데 유용한 것으로 공지되거나 이에 사용되었거나 현재 사용중인 것들이다. 이들 양태에 따라, 당해 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 기재내용의 결합 단백질은 피검체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 본 기재내용의 결합 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어에는 생리학적으로 화합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 식염수, 인산염완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상 또는 이의 배합물이 포함된다. 몇몇 양태에서, 조성물에 당과 같은 등장제, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜 또는 염화나트륨이 포함되는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 항체 일부의 유효 수명이나 효과를 증강시키는 습윤화제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 보조 물질을 소량 포함할 수도 있다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방(예를 들면, 질환, 장애 또는 기타 상태의 개시의 억제 또는 지연)하거나 처리하거나 치료하거나 완화시키는데 유용한 본 기재내용의 하나 이상의 항체 또는 본 기재내용의 조합된 하나 이상의 항체 및 예방제 또는 치료제를 투여하는데 사용될 수 있고, 리포좀내 캅셀화제, 미세입자, 미세캅셀제, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포내이입[Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432], 레트로바이러스 또는 기타 벡터 등의 일부로서 핵산의 작제를 예로 들 수 있다. 본 기재내용의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 뇌척수 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여 (예를 들어, 비내 및 경구 경로)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 흡입기 또는 분무기 및 분무제를 갖는 제형을 사용하는 폐 투여가 사용될 수 있다[미국 특허 6, 019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290, 540, 및 4,880,078; 및 PCT 공보 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903]. 하나의 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질, 병용 치료제 또는 본 기재내용의 조성물은 Alkermes AIR?폐 약물 전달 기술 (Alkermes, Inc., Cambridge, MA)을 사용하여 투여된다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 예방 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구적으로, 비내, 폐 또는 피하로 투여된다. 예방제 또는 치료제는 임의의 간편한 경로, 예를 들어, 주입 또는 일시 주사, 상피 또는 점막 내층(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장내 점막등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다.
특정 양태에서, 치료를 필요로 하는 영역에 본 기재내용의 예방제 또는 치료제를 국소적으로 투여하는 것이 요구될 수 있다. 이것은 예를 들어, 비제한적으로, 국소 주입, 주사 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있고 당해 임플란트는 막 및 매트릭스, 예를 들어, 시알라스틱 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예를 들어, Tissuel?) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함하는 다공성 또는 비-다공성 물질로 이루어진다. 한 양태에서, 본 기재내용의 길항제인 유효량의 하나 이상의 항체는 장애 또는 이의 증상을 예방, 치료, 처리 및/또는 완화시킥 위해 피검체의 환부에 국소적으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 기재내용의 유효량의 하나 이상의 항체는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처리 및/또는 완화시키기 위해 본 기재내용의 피검체 외에도 유효량의 하나 이상의 치료제(예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)와 병용하여 피검체의 환부에 국소적으로 투여된다.
또 다른 양태에서, 예방제 또는 치료제는 제어 방출 또는 지연 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 양태에서, 펌프를 사용하여 조절된 또는 지연된 방출을 달성할 수 있다(see Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al.(1989), N. Engl. J. Med. 321:574). 또 다른 양태에서, 중합재를 사용하여 본 기재내용의 치료제의 조절되거나 지연된 방출을 달성할 수 있다[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas (1983) J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al. (1985) Science 228: 190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105); 미국 특허 5,679,377; 5, 916,597; 5,912,015; 5,989,463; 및 5,128,326; 및 PCT Publication Nos. WO 99/15154; WO 99/20253]. 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리언하이드라이드, 폴리(N- 비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 양태에서, 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 누출되는 불순물이 없고, 저장시 안정하고 생분해성이다. 또 다른 양태에서, 조절되거나 지연된 방출 시스템은 예방제 또는 치료제와 근접하게 위치됨에 따라서 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다(Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
조절된 방출 시스템은 문헌[Langer (1990) Science 249:1527-1533)]에서 논의되었다. 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본 기재내용의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지연된 방출 제형을 제조할 수 있다[참조: 예를 들면, U. S. Patent No. 4,526,938; PCT Publication Nos. WO 91/05548; WO 96/20698, Ning et al. (1996) Radiotherap. Oncol. 39: 179-189; Song et al. (1995) PDA J. Pharma. Sci. Tech. 50:372-397; Cleek et al. (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Matter. 24: 853-854, 및 Lam et al. (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Matter. 24:759-760].
본 기재내용의 조성물이 예방제 또는 치료제를 암호화하는 핵산인 특정 양태에서, 핵산은 생체내 투여되어 암호화된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진시킬 수 있고 당해 핵산은 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성되고 이것이 세포내로 투여되도록 하며, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(U. S. Patent. No. 4,980,286) 또는 직접 주사 또는 미세입자 충격(예를 들어, 유전자 총; 바이올리스틱, 듀폰트) 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염제로의 피복을 투여에 사용하거나 핵으로 진입하는 것으로 공지된 호메오박스형 펩타이드에 연결시켜 투여한다(Joliot et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). 또한, 핵산은 세포내로 도입되고 발현을 위해 상동성 재조합에 의해 숙주 세포 DNA 내로 통합된다.
본 기재내용의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비내(예를 들어, 흡입), 경피(예를 들어, 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 당해 조성물은 인간에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비내 또는 경구 투여용으로 채택된 약제학적 조성물로서 통상적인 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액중의 용액이다. 필요한 경우, 당해 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리그노캠과 같은 국소 마취제를 함유할 수 있다.
본 기재내용의 조성물이 국소적으로 투여되어야만 하는 경우, 당해 조성물은 연고, 크림, 경피 패취, 로션, 젤, 샴프, 분무제, 에어로졸 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 형태로 제형화될 수 있다[Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]. 하나의 양태에서, 분무 불가능한 국소 투여 형태를 위해, 통상적으로 국소 적용과 양립할 수 있는 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 바람직하게 물 보다 큰 역학 점도를 갖는 조성물이 사용될 수 있다. 적합한 제형은 제한없이 용제, 현탁제, 유제, 크림, 연고, 산제, 도찰제, 고약등을 포함하고 경우에 따라 이들은 예를 들어, 삼투압과 같은 다양한 성질에 영향을 미치기 위해 보조제(에를 들어, 방부제, 안정화제, 습윤화제, 완충제 또는 염)과 함께 멸균되거나 혼합된다. 기타 적합한 국소 투여 형태는 바람직하게 고체 또는 액체 불활성 담체와 배합된 활성 성분이 가압된 휘발성 물질(예를 들어, 가스 추진제, 예를 들어, 프레온)과의 혼합물 또는 압착병에 팩키징된 분무 가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 수분화제 또는 보습제가 또한 경우에 따라 약제학적 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 당해 추가의 성분의 예는 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 기재내용의 방법이 조성물의 비내 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 에어로졸 형태, 분무, 연무 또는 적가 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 기재내용에 다라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 간편하게 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공 형태로 적합한 추진제(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스)의 사용과 함께 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양이 전달되도록 밸브를 설치하여 측정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캅셀제 및 카트릿지(예를 들어, 젤라틴으로 구성된)는 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본 기재내용의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 정제, 캅셀제, 카쉐제, 젤캡, 용제, 현탁제의 형태로 경구적으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캅셀제는 결합제(예를 들어, 예비젤화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들어, 락토스, 미세결정 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트) 또는 습윤화제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상적인 수단으로 제조될 수 있다. 정제는 당업자에게 널리 공지된 방법으로 피복될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 제한 없이 용제, 시럽 또는 현탁제 형태를 취할 수 있거나 이들은 사용전에 물 또는 기타 적합한 비히클과의 구성을 위해 무수 생성물로서 제공될 수 있다. 당해 액상 제제는 현탁화제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들어, 렉시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들어, 아몬드유, 오일 에스테르, 에틸 알콜 또는 분획화된 식물성 오일) 및 방부제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 사용한 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 당해 제제는 또한 적절하게 완충염, 향제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 적합하게 예방제 또는 치료제의 느린 방출, 조절된 방출 또는 지연된 방출용으로 제형화될 수 있다.
본 기재내용의 방법은 예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 사용함에 의해 분무화제로 제형화된 조성물을 폐 투여함을 포함할 수 있다[미국 특허 번호 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; 및 PCT Publication Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903]. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질, 병용 치료제 및/또는 본 기재내용의 조성물은 Alkermes AIR? 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, MA)을 사용하여 투여된다.
본 기재내용의 방법은 주사(예를 들어, 일시 주사 또는 연속 주입)에 의해 비경구 투여용으로 제형화된 조성물을 투여함을 포함할 수 있다. 주사용 제형은 방부제 첨가와 함께 단위 용량 형태(예를 들어, 앰푸울 또는 다용량 컨테이너)로 제공될 수 있다. 당해 조성물은 현탁제, 용제 또는 유제와 같은 형태를 취할 수 있고 현탁화제, 가용화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 사용전에 적합한 비히클(예를 들어, 멸균 발연원 부재 물)과의 구성을 위해 분말 형태일 수 있다.
본 기재내용의 방법은 추가로 데포우 제제로서 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 당해 오래 지속적인 제제는 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당해 조성물은 적합한 중합재 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일중 유제로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 불량한 가용성 유도체 (예를 들어, 불량한 가용성 염으로서)로 제형화될 수 있다.
본 기재내용의 방법은 중성 또는 염 형태로서 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산 및 타르타르산 등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온과 함께 형성된 것들 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2 수산화철, 이소프로필아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 및 프로카인 등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온과 함께 형성된 것들을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분은 별도로 함께 혼합하여, 예를 들어, 앰푸울 또는 사쉐트(활성제의 양을 나타냄)와 같은 밀폐된 컨테이너에서 무수 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 단위 용량 형태로 공급된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰푸울을 제공하여 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있다.
특히, 본 기재내용은 또한 예방제 또는 치료제, 또는 본 기재내용의 약제학적 조성물이 제제의 양을 나타내는 앰푸울 또는 사쉐트와 같은 밀폐된 컨테이너에 팩키징된 것을 제공한다. 한 양태에서, 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 본 기재내용의 약제학적 조성물은 밀폐된 컨테이너에서 무수 멸균된 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 공급되고 피검체 투여용으로 적당한 농도로 재구성(예를 들어, 물 또는 식염수와 함께)될 수 있다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 본 기재내용의 약제학적 조성물은 밀폐된 컨테이너에 무수 멸균 동결건조된 분말로서 제공되고 단위 용량은 5 mg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg 이상, 15 mg 이상, 25 mg 이상, 35 mg 이상, 45 mg 이상, 50 mg 이상, 75 mg 이상 또는 100 mg 이상이다. 동결건조된 예방제 또는 치료제 또는 본 기재내용의 약제학적 조성물은 이들의 본래의 컨테이너에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야만 하고 본 기재내용의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 재구성된 후 1주 이내, 바람직하게는 5일 이내, 72시간 이내, 48시간 이내, 24시간 이내, 12시간 이내, 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 1시간 이내에 투여되어야만 한다. 선택적인 양태에서, 본 기재내용의 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 제제의 양 및 농도를 나타내는 밀폐된 컨테이너에서 액체 형태로 공급된다. 한 양태에서, 투여된 조성물의 액체 형태는 밀폐된 컨테이너에 0.25 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mg/ml 이상, 1 mg/ml 이상, 2.5 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 15 mg/ml 이상, 25 mg/ml 이상, 50 mg/ml 이상, 75 mg/ml 이상 또는 100 mg/ml 이상의 농도로 공급된다. 액체 형태는 이의 본래의 컨테이너에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야만 한다.
본 기재내용의 결합 단백질은 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 한 양태에서, 항체 또는 항체 일부는 항체 0.1 내지 250mg/ml를 포함하는 주사 용액으로 제조하는 것이 바람직하다. 주사 용액은 플린트 또는 호박색 바이엘, 앰플 또는 사전충진 주사기 중의 액체 또는 동결건조 투여 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)의 L-히스티딘(1-50mM), 최적으로는 5-10mM일 수 있다. 다른 적당한 완충액으로는 석신산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 염화나트륨은 0 내지 300mM(액체 투여 형태인 경우 최적으로는 150mM)의 농도로 용액의 독성을 개질하는데 사용될 수 있다. 동결건조 투여 형태에는 동결방지제, 주로 0 내지 10% 슈크로스(최적으로는 0.5 내지 1.0%)가 첨가될 수 있다. 다른 적당한 동결방지제에는 트레할로스 및 락토스가 있다. 동결건조 투여 형태에는 벌크 제제(Bulking agent), 주로 1 내지 10% 만니톨(최적으로는 2 내지 4%)이 첨가될 수 있다. 액체 및 동결건조 투여 형태에는 안정화제, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적으로는 5 내지 10mM)이 첨가될 수 있다. 다른 적당한 벌크 제제(Bulking agent)에는 글리신 및 아르기닌이 있으며, 이들 중의 어느 것도 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80(최적으로는 0.005 내지 0.01%의 농도로 포함됨)의 농도로 포함될 수 있다. 또 다른 계면활성제에는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 비경구 투여용의 주사가능한 용액으로 제조된 본 기재내용의 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 보조제로서 유용한 제제, 예를 들어, 치료학적 단백질(예를 들어, 항체)의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 것들을 추가로 포함할 수 있다. 특히 유용한 보조제는 Hylenex?과 같은 하이알루로니다제(재조합 인간 하이알루로니다제)이다. 주사가능한 용액중에 하이알루로니다제의 첨가는 비경구 투여 후, 특히 피하 투여 후 인간 생물유용성을 개선시킨다. 이는 또한 보다 큰 주사 부위 용적(즉 1ml 초과)을 가능하게 하고 통증 및 불괘감이 덜하고 주사 부위 반응이 최소로 발생한다(문헌참조: PCT 공보 WO2004078140 및 미국 특허 공보 US2006104968).
본 기재내용의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이러한 형태에는 예컨대 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예, 주사 용액 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌약 등이 포함된다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료 용도마다 다르다. 일반적으로 바람직한 조성물은 주사 용액 또는 주입 용액 형태, 예컨대 다른 항체로 인간을 수동 면역화하는데 사용되는 조성물과 유사한 조성물이다. 선택한 투여 방식은 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다. 한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 또 다른 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 일반적으로 멸균될 수 있고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 이러한 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적당한 다른 주문 구조로 조제될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요량의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부)을, 필요에 따라 앞에서 열거한 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적당한 용매에서 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 필요에 따라 전술한 다른 성분을 포함하는 멸균 매개제에 활성 화합물을 첨가하여 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조에 유용한 멸균 동결건조 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 전술한 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분과 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적당한 유체성은 예컨대 레시틴과 같은 피복의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 주사 조성물의 지속적 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 첨가하여 제공할 수 있다.
본 기재내용의 결합 단백질은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 다양한 치료학적 용도에서 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 이 화합물이 신속 방출되지 않게 하는 담체와 함께 조제될 수 있으며, 그 예에는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제형이 있다. 여기에는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체화합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다[예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은 예컨대 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 이러한 화합물(및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 충진되거나, 정제로 압착되거나 또는 피검체 식이에 직접 첨가될 수도 있다. 경구 치료 투여용인 경우, 상기 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취성 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐; 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여외 다른 방식으로 본 기재내용의 화합물을 투여하기 위해서는 화합물을 불활성화 방지용 물질로 피복하거나 또는 상기 방지용 물질과 함께 공동 투여할 필요가 있을 수 있다.
또한, 보충적 활성 화합물이 상기 조성물에 첨가될 수도 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질은 본 기재내용의 결합 단백질과 함께 장애를 치료하기에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 공동제형화되고/되거나 동시 투여된다. 예를 들어, 본 기재내용의 결합 단백질은 다른 표적(예컨대, 다른 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)에 결합하는 하나 이상의 추가 항체와 공동조제 및/또는 공동투여될 수 있다. 또한, 본 기재내용의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 2종 이상과 함께 사용될 수 있다. 이러한 병용 치료는 투여되는 치료제를 보다 낮은 투여량으로 사용할 수 있게 하여 각종 단독치료법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있으므로 바람직하다.
특정 양태에서, 결합 단백질은 당업계에 공지된 반감기 연장 비히클에 연결되기도 한다. 이러한 비히클에는 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 미국 특허 6,660,843 및 공개된 PCT 공개번호 WO 99/25044에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 본 기재내용의 또 다른 예방제 또는 치료제는 유전자 치료에 의해 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 처리하거나 완화시키기 위해 투여된다. 유전자 치료법은 피검체에게 발현되거나 발현 가능한 핵산을 투여함에 의해 수행되는 치료법을 언급한다. 본 기재내용의 당해 양태에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 이의 암호화된 본 기재내용의 항체 또는 예방제 또는 치료제를 생산한다.
당업계에서 유용한 임의의 유전자 치료법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유전자 치료법의 일반적인 검토를 위해 문헌[참조: Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharm. 12: 488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan (1993) Science 260: 926- 932; 및 Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May (1993) TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 관해 당업계에 일반적으로 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기재되어 있다. 다양한 유전자 치료법에 대한 상세한 설명은 문헌(미국 특허공보 20090297514)에 기재되어 있다.
본 기재내용의 결합 단백질은 결합 단백질에 의해 인식되는 표적이 해로운 각종 질환을 치료하는데 유용하다. 이러한 질병에는 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아만성관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응 관절염, 척추관절염, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양성 결장염, 염증장병, 인슐린 의존 당뇨병, 갑상샘염, 천식, 알레르기병, 건선, 피부경화증, 이식대숙주병, 기관 이식거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역병, 사르코이드증, 죽상경화증, 파종 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신장증후군, 만성피로증후군, 베게너 육아종증, 헨녹-쇈라인 자반증(Henoch-Schonlein purpurea), 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질병, 기생충병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단 척수염, 헌팅톤씨 무도병, 파킨슨씨병, 알쯔하이머병, 졸중, 원발성 담관성간경화증, 용혈빈혈, 악성암, 심장부전, 심근경색, 애디슨씨병, 산발성, 다선성 결핍 I형 및 다선성 결핍 II형, 슈미트씨 증후군, 성인(급성) 호흡곤란증후군, 탈모증, 원형탈모증, 흠성혈청 관절증, 관절증, 라이터씨병, 건선관절증, 궤양성결장염관절증, 창자병 윤활막염, 클라미디아증, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽상병/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역수포병, 보통천포창, 낙엽천포창, 유사천포창, 선형 IgA 병, 자가면역 용혈빈혈, 쿰스 양성 용혈빈혈, 후천성 악성빈혈, 소아악성빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리병(Royal Free Disease), 만성 점막피부칸디다증, 거대세포 동맥염, 원발성 경화증 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍증후군, 후천성 면역결핍 관련병, B형 간염, C형 간염, 공통가변성면역결핍(공통가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근증, 여성 불임, 난소부전증, 조숙 난소부전, 섬유소성 폐질환, 잠복성 섬유화 폐포염, 염증후 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 결합조직병 관련 간질성 폐병, 복합 결합조직병 관련 폐병, 전신 경화증 관련 간질성 폐병, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐병, 전신홍반루푸스 관련 폐병, 피부근육염/다발근육염 관련 폐병, 쇼그렌병 관련 폐병, 강직척추염 관련 폐병, 혈관염성 광범위 폐병, 혈철소증 관련 폐병, 약물 유도 간질성 폐병, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐쇄세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤 폐병, 감염후 간질성 폐병, 통풍 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(고전적 자가면역 또는 루푸스 간염), 2형 자가면역 간염(항LKM 항체 간염), 자가면역 매개 저혈당증, 흑색가시세포증 관련 B형 인슐린 내성, 부갑상샘항진증, 기관 이식 관련 급성 면역 질환, 기관 이식 관련 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발 백혈구감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장병 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원반형 홍반루푸스, 특발성 또는 NOS 남성 불임, 정자 자가면역성, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합조직 질환에 부차적인 폐 고혈압, 굿파스쳐 증후군, 결절다발동맥염의 폐동맥 징후, 급성 류마티스열, 류마티스성 척추염, 스틸스병, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스씨병/동맥염, 자가면역 저혈소판증, 특발 저혈소판증, 자가면역 갑상샘 질환, 갑상샘항진증, 갑상샘종 자가면역 갑상샘항진증(하시모토씨병), 위축 자가면역 갑상샘항진증, 원발성 점액부종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간질환, 만성 간질환, 알콜간경화증, 알콜 유도 간 손상, 담즙정체, 특이 간질환, 약물 유도 간염, 비알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 질환(예, 우울증 및 정신분열병), Th2 타입 및 Th1 타입 매개 병, 급성 및 만성 통증 및 암, 예컨대 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선 및 직장의 암 및 조혈계 암(백혈병 및 림프종), A베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프성모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전증, 선암종, 공기 이소성 심방박동, AIDS 치매 합병증, 알콜 유도 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-1-안티트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 앙기나 협심증, 전각 세포 퇴화, 항 cd3 치료, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 대동맥 및 말초 결찰증, 대동맥 해부, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥 누공, 운동실조증, 심방세동 (지연 또는 발작성), 심방조동, 동정맥 막힘, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트 림프종, 화상, 심장성 부정맥, 심장성 기절 증후군, 심장 종양, 심근증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌피질 퇴화, 소뇌 장애, 혼란 또는 다초점 심방 빈맥, 화학치료 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알콜증, 만성 염증 병리, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐 심장, 관상 동맥 질환, 크루츠펠트-자콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양 음성 패혈증, 낭섬유증, 사이토킨 치료 관련 장애, 권투선수치매(Dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기 출혈열, 피부염, 피부학적 증상, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환(diabetic ateriosclerotic disease), 광범위 루이체 질환, 확장성 울혈성 심근증, 기저핵 장애, 중년 다운 증후군, CNS 도파민 수용체 차단 약물에 의해 유도된 약물 유도 운동 장애, 약물 과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 피부홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드리히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 장애, 진균류 패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의 기관 또는 조직 이식 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 기관으로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할레로르덴-스파츠 질환(Hallerrorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 고초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성 요독증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 출혈, 간염(A), 히스 다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환, 과운동성 장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동 부족 장애, 시상하부-뇌하수체-부신피질계 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채섬모체염/자궁염/광학적 신경근염, 허혈 관류 손상, 허혈 뇌졸중, 연소성 류마티스 관절염, 연소성 척추 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프피부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌막염, 수막염 균혈증, 대사/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다중 시스템 장애, 복합 연결 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 퇴화(만셀 데제린-토마스 쉬-드라거 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 감염증, 마이코박테리움 결핵, 골수이형성증후군, 심근 경색, 심근 허혈 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근육 위축증, 호중구감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 지류 폐색, 폐색성 동맥 질환, okt3 치료, 고환염/부고환염, 고환염/절관절제술 반전 과정, 기비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부수종양성 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증 질환, 다년성 비염, 심막 질환, 말초 동맥경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 (다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 자간전증, 전진적 상핵 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료, 레이노드 현상 및 질환, 레이노드 질환, 레프섬 질환, 일반 협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 피부경화증, 노인 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구 빈혈증, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌 퇴화, 스트렙토코커스 근염, 소뇌 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 아나팔락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신 개시 연소성 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 말초혈관 확장증, 폐색성 혈전 혈관염, 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정 앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판 심장 질환, 하지 정맥, 혈관염, 정맥동 질환, 정맥종 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균류 감염, 바이탈 뇌염/무균성 수막염, 바이탈-연관 적혈구식작용 증후군, 웨른니케-코르사코프 증후군, 윌슨 질환, 및 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌참조: PCT Publication Nos. WO 2002/097048; WO 95/24918, 및 WO 00/56772).
본 기재내용의 결합 단백질은 자가면역 질환, 특히, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨병 및 자가면역 포도막염을 포함하는, 염증과 관련된 자가면역 질환을 앓는 인간을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 기재내용의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부를 사용하여 류마티스 관절염, 크론 질환, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병 및 건선을 치료하기 위해 사용된다.
하나의 양태에서, 본 기재내용의 조성물과 방법으로 치료되거나 진단될 수 있는 질환은 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구인두암, 두경부암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 방광암 및 담관암, 소장암, 뇨관암(신장암, 방광암 및 요상피암을 포함), 여성 생식관암 (경부암, 자궁암 및 난소암, 및 융모막상피종 및 생식 융모상피성 질환), 남성 생식관암 (전립선암, 저정낭암, 고환암 및 생식 세포 종양을 포함), 내분비선암 (갑상선암, 부신암 및 뇌하수체암을 포함), 및 피부암, 및 혈관종, 흑색종, 육종 (골 기원 암 및 연조직 기원의 암 및 카포시 육종을 포함), 뇌암, 신경암, 안구암, 및 수막암 (성상세포종, 신경아교종, 아교모세포종, 망막아세포종, 신경종, 신경아세포종, 양성종양, 및 수막종을 포함), 조혈 악성 종양으로 유래되는 고형 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종(호지킨 및 비호지킨 림프종 둘다)를 포함하는, 원발성 및 전이성 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 본 기재내용의 항체 또는 이의 항원 결합부는 단독으로 또는 방사선치료 및/또는 다른 화학치료제와 조합하여 사용되는 경우 암을 치료하거나 본원에 기재된 종양으로부터의 전이를 예방하기 위해 사용된다.
본 기재내용의 항체 또는 이의 항원 결합부는 항신생물제, 방사선치료 및 화학치료제(예를 들어, DNA 알킬화제, 시스플라틴, 카보플라틴, 항-튜불린제, 파클리탁셀, 도세탁셀, 탁솔, 독소루비신, 겜시타빈, 겜자르, 안트라사이클린, 아드리아마이신, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 5-플루오로우라실(5-FU), 류코보린, 이리노테칸, 수용체 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 에를로티니브, 게피티니브), COX-2 억제제(예를 들어, 셀렉콕시브), 키나제 억제제 및 siRNA))를 포함하지만 이에 제한되지 않는 제제와 배합될 수 있다.
또한, 본 기재내용의 결합 단백질은 각종 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본 기재내용의 결합 단백질은 전술한 질환의 치료에 단독으로 또는 배합물로서 사용될 수 있다. 당해 결합 단백질은 단독으로 사용되거나 또는 의도한 목적에 따라 당업자에 의해 선택된 추가 제제, 예컨대 치료제와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 추가 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질병이나 증상의 치료에 유용한 것으로 인식된 치료제 분야일 수 있다. 또한, 추가 제제는 치료 조성물에 유익한 특성을 부여하는 제제, 예컨대 조성물의 점도에 유효한 제제일 수 있다.
또한, 본 기재내용에 포함되어야 하는 배합물은 의도한 목적에 유용한 배합물로 이해되어야 한다. 이하에 설명되는 제제는 목적에 유용한 예시적 제제로서, 한정하기 위한 것이 아니다. 본 기재내용의 일부인 배합물은 본 기재내용의 항체와 이하에 기술되는 목록 중에서 선택되는 하나 이상의 추가 제제일 수 있다. 이러한 배합물은 또한 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수 있으며, 예를 들어 형성된 조성물이 의도한 기능을 수행할 수 있을 정도의 배합이라면 2개 또는 3개의 추가 제제가 첨가될 수도 있다.
자가면역 및 염증 질환을 치료하기 위한 바람직한 배합물은 이부프로펜과 같은 약물을 포함하는 NSAID로 언급되기도 하는 비스테로이드 소염 약물이다. 다른 바람직한 배합물은 프레드니솔론을 비롯한 코르티코스테로이드류이며; 본 기재내용의 DVD Ig와 함께 환자를 치료하는 경우, 필요한 스테로이드 용량이 점감되어 스테로이드 사용 시의 공지된 부작용이 저하되거나 심지어 제거될 수 있다. 본 기재내용의 항체 또는 항체 결합부와 함께 류마티스성 관절염용 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 사이토킨 억제성 소염제(CSAID); 다른 인간 사이토킨 또는 성장인자(예컨대, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-23, 인터페론, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF)에 대한 항체 또는 길항제. 본 기재내용의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90, 및 CTLA와 같은 세포 표면 분자 또는 이들의 리간드, 예컨대 CD154(gp39 또는 CD40L)에 대한 항체와 조합될 수 있다.
치료제의 바람직한 배합물은 자가면역 및 후속 염증 캐스캐이드의 여러 지점에서 방해할 수 있다; 바람직한 예에는 TNF 길항제, 예를 들어, 키메라, 인간화된 또는 인간 TNF 항체, 아달리무마브(ADALIMUMAB), (PCT 공개 번호 제WO 97/29131), CA2(RemicadeTM) CDP571, 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체, (p75TNFR1gG (EnbrelTM) 또는 p55TNFR1gG (Lenercept), 및 또한 TNFα전환 효소(TACE) 억제제가 있고, 유사하게 IL-1 억제제(인터류킨-1-전환 효소 억제제, IL-1RA등)는 동일 이유때문에 유효하다. 다른 바람직한 배합물에는 인터류킨 11이 있다. 또 다른 바람직한 배합물은 IL-12 기능과 병행하거나, IL-12 기능에 의존적이거나 IL-12 기능과 협동적인 작용을 할 수 있는 자가면역 반응의 다른 주요 작용인자를 포함하고, 특히 IL-18 항체 또는 가용성 IL-18 수용체를 포함하는 IL-18 길항제, 및 IL-18 결합 단백질이다. 확인된 바에 따르면, IL-12와 IL-18이 중복되지만 독특한 기능을 보유하여, 이 둘에 대한 길항제의 배합물이 가장 효과적이었다. 또 다른 바람직한 배합물은 비고갈성 항-CD4 억제제이다. 또 다른 바람직한 배합물에는 공동자극 경로의 길항제 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2), 예컨대 항체, 용해성 수용체, 및 길항제성 리간드 등이 포함된다.
본 기재내용의 결합 단백질은 또한 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사), 베타-2 아드레날린수용체 효능제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, 전염증성 사이토킨, 예컨대 TNF-α 또는 IL-1에 의한 시그날 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제, TNFα전환효소(TACE) 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제(예: 키나제 억제제), 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 용해성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG(Enbrel™ 및 p55TNFRIgG(Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, 및 sIL-6R), 소염성 사이토킨(예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 셀레콕시브, 엽산, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 로페콕시브, 에타너셉트, 인플릭시마브, 나프록센, 발데콕시브, 설파살라진, 메틸프레드니솔론, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 골드 나트륨 티오말레이트, 아스피린, 트리암시놀론 아세토나이드, 프로폭시펜 나프실레이트/apap, 폴레이트, 나부메톤, 디클로페낙, 피록시캄, 에토돌락, 디클로페낙 나트륨, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 펜타닐, 아나킨라, 인간 재조합체, 트라마돌 hcl, 살살레이트, 설린닥, 시아노코발라민/fa/피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트 나트륨, 프레드니솔론, 몰핀 설페이트, 리도카인 하이드로클로라이드, 인도메타신, 글루코사민 설프/콘드로이틴, 아미트립틸린 hcl, 설파디아진, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 올로파타딘 hcl, 미소프로스톨, 나프록센 나트륨, 오메프라졸, 시클로포스파미드, 리툭시마브, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18BP, 항-IL-18, 항-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, 로플루밀라스트, IC-485, CDC-801 및 메소프람 등의 제제와도 배합될 수 있다. 바람직한 배합물에는 메토트렉세이트 또는 레플루노미드가 있으며, 보통 또는 중증 류마티스성 관절염 증례에는 사이클로스포린이 있다.
류마티스 관절염을 치료하기 위해 결합 단백질과 배합하여 사용될 수 있는 비제한적인 추가의 제제는 하기의 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 비-스테로이드 소염 약물(NSAID); 사이토킨 억제 소염 약물(CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 (인간화된 항-TNFα 항체; Celltech/Bayer); cA2/인플릭시마브 (키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/에타너셉트 (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Immunex; 참조, 예를 들면, (1994) Arthr. Rheum. 37: S295; (1996); J. Invest. Med. (1996): 235A); 55 kdTNF-IgG (55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (비-고갈 영장류화된 항-CD4 항체; IDEC/SmithKline; 참조: 예를 들면, (1995) Arthr. Rheum. 38: S185); DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2 (IL-2 융합 단백질; Seragen; (1993) Arthr. Rheum. 36, 1223); 항-Tac (인간화된 항-IL-2Ra; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (소염 사이토킨; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; 재조합 IL-10, 소염 사이토킨; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 및/또는 IL-4 효능제 (예를 들어, 효능제 항체); IL-1RA (IL-1 수용체 길항제; Synergen/Amgen); 아나킨라(Kineret?Amgen); TNF-βp/s-TNF (가용성 TNF 결합 단백질; 참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement)): S284; S284; (1995) Amer. J. Physiol. - Heart and Circ. Physiol. 268: 37-42); R973401 (포스포디에스테라제 IV형 억제제; 참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282); MK-966 (COX-2 억제제; 참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S81); 일로프로스트(참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S82); 메토트렉세이트; 탈리도미드(참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282) 및 탈리도미드-관련 약물(예를 들어, 셀겐); 레플루노미드 (소염 및 사이토킨 억제제; 참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S131; (1996) Inflamm. Res. 45: 103-107); 트라넥삼산(플라스미노겐 활성화 억제제; 참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S284); T-614 (사이토킨 억제제; 참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282); 프로스타글란딘 E1 (참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S282); 테니댑 (비스테로이드 소염 약물; 참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S280); 나프록센(비스테로이드 소염 약물; 참조, 예를 들면, (1996) Neuro. Report 7: 1209-1213); 멜록시캠(비스테로이드 소염 약물); 이부프로펜(비스테로이드 소염 약물); 피록시캠(비스테로이드 소염 약물); 디클로페낙 (비스테로이드 소염 약물); 인도메타신(비스테로이드 소염 약물); 설파살라진(참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S281); 아자티오프린(참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S281); ICE 억제제(효소 인터류킨-1b 전환 효소의 억제제); zap-70 및/또는 lck 억제제 (타이로신 키나제 zap-70 또는 lck의 억제제); VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제 (혈관 내피 세포 성장 인자 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체의 억제제; 혈관형성의 억제제); 코르티코스테로이드 소염 약물(예를 들어, SB203580); TNF-컨버타제 억제제; 항-IL-12 항체; 항-IL-18 항체; 인터류킨-11 (참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S296); 인터류킨-13 (참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S308); 인터류킨-17 억제제(참조, 예를 들면, (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (supplement): S120); 금; 페니실라민; 클로로퀸; 클로람부실; 하이드록시클로로퀸; 사이클로스포린; 사이클로포스파미드; 총 림프계 조사; 항-흉선 글로불린; 항-CD4 항체; CD5-독소; 경구 투여된 펩타이드 및 콜라겐; 로벤자리트 이나트륨; 사이토킨 조절제(CRA) HP228 및 HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고-데옥시뉴클레오타이드(ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성 보체 수용체 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); 프레드니손; 오르고테인; 글리코사미노글리캔 폴리설페이트; 미노사이클린; 항-IL2R 항체; 해양 및 식물 지질(어류 및 식물 종자 씨드 지방산; DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); 아우라노핀; 페닐부타존; 메클로페남산; 플루페남산; 정맥내 면역글로불린; 질레우톤; 아자리빈; 마이코페놀산(RS-61443); 타크롤리무스(FK-506); 시롤리무스 (라파마이신); 아미프릴로스(테라펙틴); 클라드리빈(2-클로로데옥시아데노신); 메토트렉세이트; bcl-2 억제제(참조: Bruncko, M. et al. (2007) J. Med. Chem. 50(4): 641-662); 및 항바이러스제 및 면역-조절제.
한 양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 류마티스 관절염 치료를 위해 하기의 제제중 하나와 배합하여 투여된다: KDR의 소분자 억제제, Tie-2의 소분자 억제제; 메토트렉세이트; 프레드니손; 셀레콕시브; 폴산; 하이드록시클로로퀸 설페이트; 로페콕시브; 에타너셉트; 인플릭시마브; 레플루노미드; 나프록센; 발데콕시브; 설파살라진; 메틸프레드니솔론; 이부프로펜; 멜록시캠; 메틸프레드니솔론 아세테이트; 금 나트륨 티오말레이트; 아스피린; 아자티오프린; 트리암시놀론 아세토니드; 프로프시펜 나프실레이트/apap; 폴레이트; 나부메톤; 디클로페낙; 피록시캠; 에토돌락; 디클로페낙 나트륨; 옥사프로진; 옥시코돈 hcl; 하이드로코돈 비타르트레이트/apap; 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨; 펜타닐; 아나킨라, 인간 재조합 트라마돌 hcl; 살살레이트; 설린닥; 시아노코발라민/fa/피리독신; 아세트아미노펜; 알렌드로네이트 나트륨; 프레드니솔론; 모르핀 설페이트; 리도카인 하이드로클로라이드; 인도메타신; 글루코사민 설페이트/콘드로이틴; 사이클로스포린; 아미트립틸린 hcl; 설파디아진; 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜; 올로파타딘 hcl; 미소프로스톨; 나프록센 나트륨; 오메프라졸; 미코페놀레이트 모페틸; 사이클로포스파미드; 리툭시마브; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; 항-IL 18; 항-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; 로플루밀라스트; IC-485; CDC-801; 및 메소프람.
본 기재내용의 결합 단백질이 배합될 수 있는 염증장병에 유용한 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 부데노사이드; 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린, 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 항산화제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1β 모노클로날 항체; 항-IL-6 모노클로날 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; 및 다른 인간 사이토킨 또는 성장 인자, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF 등에 대한 항체 또는 길항제. 본 기재내용의 항체 또는 이의 항원 결합부는 세포 표면 분자, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, 및 CD90 또는 이들의 리간드에 대한 항체와 조합될 수도 있다. 본 기재내용의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토킨에 의한 시그날 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제, TNFα전환효소 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 용해성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, 및 sIL-6R), 소염성 사이토킨(예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 및 bcl-2 억제제와 배합될 수 있다.
결합 단백질이 배합될 수 있는 크론병 치료제의 예에는 다음과 같은 것이 있다: TNF 길항제, 예컨대 항-TNF 항체, 아달리무마브(PCT 공개 WO 97/29131; HUMIRA), CA2(REMICADE), CDP 571, TNFR-Ig 작제물, (p75TNFR1gG(ENBREL) 또는 p55TNFR1gG(LENERCEPT)) 억제제 및 PDE4 억제제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 코르티코스테로이드, 예컨대 부데노사이드 및 덱사메타손과 배합될 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 또한 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 올살라진과 같은 제제, 및 전염증성 사이토킨, 예컨대 IL-1, 예를 들어 IL-1β 전환효소 억제제 및 IL-1ra의 합성 또는 작용을 방해하는 제제와 배합될 수 있다. 본 기재내용의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 T 세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 타이로신 키나제 억제제 6-머캅토퓨린과 함께 사용될 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 IL-11과 배합될 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 메살라민, 프레드니손, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 인플릭시마브, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 디페녹실레이트/아트로프 설페이트, 로퍼아미드 하이드로클로라이드, 메토트렉세이트, 오메프라졸, 폴레이트, 시프로플록사신/덱스트로스-물, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 테트라사이클린 하이드로클로라이드, 플루오시노나이드, 메트로니다졸, 티메로살/붕산, 콜레스티라민/슈크로스, 시프로플록사신 하이드로클로라이드, 하이오시아민 설페이트, 메페리딘 하이드로클로라이드, 미다졸람 하이드로클로라이드, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 프로메타진 하이드로클로라이드, 인산나트륨, 설파메톡사졸/트리메토프림, 셀레콕시브, 폴리카르보필, 프로폭시펜 나프실레이트, 하이드로코르티손, 멀티비타민, 발살라지드 이나트륨, 코데인 포스페이트/apap, 콜레세벨람 hcl, 시아노코발라민, 엽산, 레보플록사신, 메틸프레드니솔론, 나탈리주마브 및 인터페론-감마와 배합될 수 있다.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 사이클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; 인터페론-β1a(AVONEX; Biogen); 인터페론-β1b(BETASERON; Chiron/Berlex); 인터페론 α-n3(Interferon Sciences/Fujimoto), 인터페론-α(Alfa Wassermann/J&J), 인터페론 β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics), 페그인터페론 α2b(Enzon/Schering-Plough), 코폴리머 1(Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; 다른 인간 사이토킨 또는 성장인자 및 이의 수용체, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제. 본 기재내용의 결합 단백질은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90과 같은 세포 표면 분자 또는 이의 리간드에 대한 항체와 조합될 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질은 또한 제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토킨에 의한 시그날 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제, TACE 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 용해성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) 및 소염성 사이토킨(예, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ) 및 bcl-2 억제제와 배합될 수 있다.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 바람직한 예에는 인터페론 β, 예컨대 IFNβ1a 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, 카스파제 억제제, 예컨대 카스파제-1 억제제, IL-1 억제제, TNF 억제제 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체가 포함된다.
본 기재내용의 결합 단백질은 또한 제제, 예컨대 알렘투주마브, 드로나비놀, 유니메드, 다클리주마브, 미토크산트론, 크살리 프로덴 하이드로클로라이드, 팜프리딘, 글라티라머 아세테이트, 나탈리주마브, 신나비돌, a-임뮤노킨 NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, 케목킨 수용체 길항제, BBR-2778, 칼라구알린, CPI-1189, LEM(리포좀 캡슐화된 미토크산트론), THC.CBD(칸나비노이드 효능제) MBP-8798, 메소프람(PDE4 억제제), MNA-715, 항-IL-6 수용체 항체, 뉴로박스, 피르페니돈, 알로트랩 1258(RDP-1258), sTNF-R1, 탈람파넬, 테리플루노마이드, TGF-베타2, 티플리모타이드, VLA-4 길항제(예컨대, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), 인터페론 감마 길항제, 및 IL-4 효능제와 배합될 수 있다.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 협심증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 아스피린, 니트로글리세린, 이소소르비드 모노니트레이트, 메토프롤롤 석시네이트, 아테놀로, 메토프롤롤 타르트레이트, 암로디핀 베실레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 이소소르비드 디니트레이트, 클로피도그렐 비설페이트, 니페디핀, 이토바스타틴 칼슘, 염화칼륨, 후로세미드, 심바스타틴, 베라파밀 hcl, 디곡신, 프로프라놀롤, 하이드로클로라이드, 카베딜롤, 리시노프릴, 스피로노락톤, 하이드로클로로티아지드, 에나라프릴 말레이트, 나돌로, 라미프릴, 에녹사파린 나트륨, 헤라핀 나트륨, 발사르탄, 소탈롤 하이드로클로라이드, 페노피브레이트, 에제티미브, 부메타니드, 로사탄 포타슘, 리시노프릴/하이드로클로로티아지드, 펠로디핀, 캅토프릴, 비소프롤롤 푸마레이트.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 강직 척추염 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 이브푸로펜, 디클로페낙 및 미소프로스톨, 나프록센, 멜록시캄, 인도메타신, 디클로페낙, 셀레콕시브, 로페콕시브, 설파살라진, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 미노시클린, 프레드니손, 에타너셉트, 및 인플릭시마브.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 천식 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 알부테롤, 살메테롤/플루티카손, 몬텔루카스트 나트륨, 플루티카손 프로피오네이트, 부데소니드, 프레드니손, 살메테롤 크시나포에이트, 레발부테롤 hcl, 알부테롤 설페이트/이프라트로퓸, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 이프라트로퓸 브로마이드, 아지트로마이신, 피르부테롤 아세테이트, 프레드니솔론, 무수 테오필린, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 클라리트로마이신, 자피르루카스트, 포르모테롤 푸마레이트, 인플루엔자 바이러스 백신, 메틸프레드니솔론, 아목시실린 트리하이드레이드, 플루니솔라이드, 알레르기 주사, 크로몰린 나트륨, 펙소페나딘 하이드로클로라이드, 플루니솔라이드/멘톨, 아목시실린/클라불라네이트, 레보플록사신, 흡입기 보조 장치, 구아이페네신, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 목시플록사신 hcl, 독시사이클린 하이클레이트, 구아이페네신/d-메토판, p-에페드린/cod/클로페니르, 가티플록사신, 세테리진 하이드로클로라이드, 모메타손 퓨로에이트, 살메테롤 신나포에이트, 벤조나테이트, 세팔렉신, pe/하이드로코돈/클로르페니르, 세티리진 hcl/슈도에페드, 페닐에프린/cod/프로메타진, 코데인/프로메타진, 세프프로질, 덱사메타손, 구아이페네신/슈도에페드린, 클로페니라민/하이드로코돈, 네도크로밀 나트륨, 테르부탈린 설페이트, 에피네프린, 메틸프레드니솔론, 메타프로테레놀 설페이트.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 COPD 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 알부테롤 설페이트/이프라트로퓸, 이프라트로퓸 브로마이드, 살메테롤/플루티카손, 알부테롤, 살메테롤 크시나포에이트, 플루티카손 프로피오네이트, 프레드니손, 무수 테오필린, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 몬텔루카스트 나트륨, 부데소니드, 포르모테롤 푸마레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 레보플록사신, 구아이페네신, 아지트로마이신, 베클로메타손 디프로피오네이트, 레발부테롤 hcl, 플루니솔라이드, 세프트리악손 나트륨, 아목시실린 트리하이드레이트, 가티플록사신, 자피르루카스트, 아목시실린/클라불라네이트, 플루니솔라이드/멘톨, 클로르페니라민/하이드로코돈, 메타프로테레놀 설페이트, p-데페드린/로라타딘, 테르부탈린 설페이트, 티오트로퓸 브로마이드, (R,R)-포르모테롤, TgAAT, 실로밀라스트, 및 로플루밀라스트.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 HCV 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 인터페론-알파-2a, 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파 con1, 인터페론-알파-n1, 페길화된 인터페론-알파-2a, 페길화된 인터페론-알파-2b, 리바비린, 페그인터페론 알파-2b + 리바비린, 우르소데옥시콜린산, 글리시리진산, 티말파신, 막사민, VX-497 및 표적, 즉 HCV 폴리머라제, HCV 프로테아제, HCV 헬리카제, HCV IRES(내부 리보솜 진입 부위)의 간섭을 통해 HCV를 치료하는데 사용되는 임의의 화합물.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 특발폐섬유증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 프레드니손, 아자티오프린, 알부테롤, 콜히친, 알부테롤 설페이트, 디곡신, 감마 인터페론, 메틸프레드니솔론 sod succ. 로라제팜, 후로세미드, 리시노프릴, 니트로글리세린, 스피로놀락톤, 시클로포스파미드, 이프라트로퓸 브로마이드, 악티노마이신 d, 알테플라스, 플루티카손 프로피오네이트, 레보플록사신, 메타프로테레놀 설페이트, 몰핀 설페이트, 옥시코돈 hcl, 염화칼륨, 트리암시놀론 아세토나이드, 무수 태크로리무스, 칼슘, 인터페론-α, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 모페틸, 및 인터페론-감마-1β.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 심근경색 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 아스피린, 니트로글리세린, 메토프롤롤 타르트레이트, 에녹사파린 나트륨, 헤파린 나트륨, 클로피도그렐 비설페이트, 카베딜롤, 아테놀롤, 몰핀 설페이트, 메토프롤롤 석시네이트, 워파린 나트륨, 리시노프릴, 이소소르비드 모노니트레이트, 디곡신, 후로세미드, 심바스타틴, 라미프릴, 테넥테플라스, 에나라프릴 말레이트, 토르세미드, 레타바스, 로사탄 포타슘, 퀴나프릴 hcl/mag carb, 부메타니드, 알테플라스, 아날라프릴라트, 아미오다론 하이드로클로라이드, 티로피반 hcl m-하이드레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 캡토프릴, 이르베사탄, 발사탄, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 호시노프릴 나트륨, 리도카인 하이드로클로라이드, 엡티피바타이드, 세파졸린 나트륨, 아트로핀 설페이트, 아미노카프린산, 스피로노락톤, 인터페론, 소탈롤 하이드로클로라이드, 염화칼륨, 도큐세이트 나트륨, 도부타민 hcl, 알프라졸람, 프라바스타틴 나트륨, 아토바스타틴 칼슘, 미다졸람 염삼염, 메페리딘 하이드로클로라이드, 이소소르비드 디니트레이트, 에피네프린, 도파민 하이드로클로라이드, 비파리루딘, 로수바스타틴, 엑제티미브/심바스타틴, 아바시미브, 및 카리포라이드.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 건선 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: KDR의 소분자 억제제, Tie-2의 소분자 억제제, 칼시포트리엔, 클로베타솔 프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 할로베타솔 프로피오네이트, 타자로텐, 메토트렉세이트, 플루오시노나이드, 베타메타손 diprop 보강형, 플루오시놀론 아세토나이드, 아시트레틴, 타르 샴푸, 베타메타손 발레레이트, 모메타손 후로에이트, 케토코나졸, 프라목신/플루오시놀론, 하이드로코르티손 발레레이트, 플루안드레놀라이드, 우레아, 베타메타손, 클로베타솔 프로피오네이트/에몰, 플루티카손 프로피오네이트, 아지트로마이신, 하이드로코르티손, 보습 포뮬라, 엽산, 데소니드, 피메크로리무스, 콜타르, 디플로라손 디아세테이트, 에타너셉트 폴레이트, 젖산, 메톡살렌, hc/비스무스 subgal/znox/resor, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 프레드니손, 선스크린, 할시노나이트, 살리실산, 안트랄린, 클로코르톨론 피발레이트, 석탄 추출물, 콜타르/살리실산, 콜타르/살리실산/황, 데속시메타손, 디아제팜, 피부연화제, 플루오시노나이드/피부연화제, 광유/피마자유/na lact, 광유/땅콩유, 석유/이소프로필 미리스테이트, 프소랄렌, 살리실산, 비누/트리브롬살란, 티메로살/붕산, 셀레콕시브, 인플릭시마브, 사이클로스포린, 알레파셉트, 에팔리주마브, 태크로리무스, 피메크로리무스, PUVA, UVB, 및 설파살라진.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 건선 관절염 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 메토트렉세이트, 에타너셉트, 로페콕시브, 셀레콕시브, 엽산, 설파살라진, 나프록센, 레플루노미드, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 인도메타신, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 프레드니손, 설린닥, 베타메타손 diprop 보강형, 인플릭시마브, 메토트렉세이트, 폴레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 디클로페낙, 디메틸설폭사이드, 피록시캄, 디클로페낙 나트륨, 케토프로펜, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론, 나부메톤, 톨메틴 나트륨, 칼시포트리엔, 사이클로스포린, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 플루오시노나이드, 글루코사민 설페이트, 골드 나트륨 티오말레이트, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 이부프로펜, 리세드로네이트 나트륨, 설파디아진, 티오구아닌, 발데콕시브, 알레파셉트, 에팔리주마브, 및 bcl-2 억제제.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 재협착증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 시로리무스, 파클리탁셀, 에버로리무스, 타크로리무스, 조타롤리무스, 및 아세타미노펜.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 좌골신경통 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 로페콕시브, 시클로벤자프린 hcl, 메틸프레드니솔론, 나프록센, 이부프로펜, 옥시코돈 hcl/아세타미노펜, 셀렉코시브, 발데콕시브, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 프레드니손, 코데인 포스페이트/apap, 트라마돌 hcl/아세타미노펜, 메탁사론, 멜록시캄, 메토카르바몰, 리도카인 하이드로클로라, 디플로페낙 나트륨, 가바펜틴, 덱사메타손, 카리소프로돌, 케토롤락 트로메타민, 인도메타신, 아세타미노펜, 디아제팜, 나부메톤, 옥시코돈 hcl, 티자니딘 hcl, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 프로폭시펜 냅실레이트/apap, asa/oxycod/옥시코돈 ter, 이부프로펜/하이드로코돈 bit, 트라마돌 hcl, 에토돌락, 프로폭시펜 hcl, 아미트립틸린 hcl, 카리소프로돌/코데인 phos/asa, 몰핀 설페이트, 멀티비타민, 나프록센 나트륨, 오르페나드린 시트레이트, 및 테마제팜.
본 기재내용의 결합 단백질과 배합될 수 있는 SLE(루푸스) 치료제의 바람직한 예에는 다음과 같은 것이 있다: NSAID, 예컨대 디클로페낙, 나프록센, 이부프로펜, 피록시캄, 인도메타신; COX2 억제제, 예컨대 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브; 항말라리아제, 예컨대 하이드록시클로로퀸; 스테로이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 부데노사이드, 덱사메타손; 세포독성제, 예컨대 아자티오프린, 시클로포스파미드, 미코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트; 및 PDE4 억제제 또는 퓨린 합성 억제제, 예컨대 셀레셉트. 본 기재내용의 결합 단백질은 또한 설파살라진, 5-아미노살리실산, 올살라진, 이뮤란 및 IL-1과 같은 전염증성 사이토킨의 합성, 생산 또는 작용을 방해하는 제제, 예컨대 IL-1β 전환효소 억제제 및 IL-1ra와 같은 카스파제 억제제와 배합될 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질은 또한 T 세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 티로신 키나제 억제제 또는 T 세포 활성화 분자를 표적으로 하는 분자, 예컨대 CTLA-4-IgG 또는 항-B7계 항체, 및 항-PD-1계 항체 등과 함께 사용될 수 있다. 본 기재내용의 결합 단백질은 IL-11 또는 항사이토킨 항체, 예컨대 포노토리주마브(항-IFNg 항체) 또는 항수용체 항체, 예컨대 항-IL-6 수용체 항체 및 B-세포 표면 분자에 대한 항체와 조합될 수 있다. 또한, 본 기재내용의 항체 또는 이의 항원 결합부는 LJP 394(아베티무스), B-세포를 불활성화시키거나 고갈시키는 제제, 예컨대 리툭시마브(항-CD20 항체), 림포스태트-B(항-BlyS 항체), TNF 길항제, 예컨대 항-TNF 항체, D2E7(PCT 공개 WO 97/29131; HUMIRA), CA2(REMICADE), CDP571, TNFR-Ig 작제물(P75TNFRIgG(ENBREL) 및 p55TNFRIgG(LENERCEPT)) 및 bcl-2 억제제와 함께 사용될 수 있는데 그 이유는 유전자전이 마우스에서 bcl-2 과발현이 낭창과 같은 표현형을 유발하는 것으로 입증되었고(문헌참조: Marquina, R. et al. (2004) J. Immunol.: 172(11), 7177-7185) 따라서 이의 억제가 치료학적 효과를 가질 것으로 예상되기 때문이다.
본 기재내용의 약제학적 조성물은 본 기재내용의 결합 단백질의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"이란 용어는 원하는 치료 결과를 수득하기 위한 투여량과 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 상기 항체 또는 항체 일부의 치료학적 유효량은 당업자라면 결정할 수 있는 것으로서, 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중과 개체 내에서 원하는 반응을 유도해내는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 치료학적 유익 효과가 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 수득하기 위한 투여량 및 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 일반적으로, 예방학적 용량은 질병의 초기 단계전이나 초기 단계에 피검체에 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적은 양일 것이다.
투여 계획은 원하는 최적 반응(예컨대, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 1회의 일시주사를 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며 또는 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소 또는 증가된 용량을 투여할 수도 있다. 특히, 투여 용이성과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료하는 포유동물 피검체에 대하여 단일 투여량으로서 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 따라서, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 기재내용의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 수득하고자 하는 특정 치료 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 민감도 치료에 있어서 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 제한에 따라 결정되고 직접 좌우된다.
본 기재내용의 결합 단백질의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 비제한의 예시적 범위는 0.1 내지 20mg/kg, 더 바람직하게는 1 내지 10mg/kg 이다. 용량 값이 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 다양할 수 있음을 주지해야 한다. 또한, 투여량 값은 개체의 필요 및 조성물 투여를 관리하거나 감독하는 자의 전문가적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 투여량 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님을 명심해야 한다.
V. 진단
본원에 기재된 내용은 또한 진단 적용을 제공한다. 이것은 하기에서 추가로 설명된다.
A. 분석 방법
본 기재내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DVD-Ig를 사용하여 시험 샘플에서 분석물(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 결정하는 방법을 제공한다. 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 분석이 당해 방법에 사용될 수 있다. 이의 예는 면역분석, 예를 들어, 샌드위치 면역분석(예를 들어, 모노클로날, 폴리클로날 및/또는 DVD-Ig 샌드위치 면역분석 또는 이의 임의의 변형(예를 들어, 모노클로날/DVD-Ig, DVD-Ig/폴리클로날 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않고 방사성동위원소 검출(방사성면역분석 (RIA)) 및 효소 검출 (효소 면역분석 (EIA) 또는 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA) (예를 들어, Quantikine ELISA 분석, R&D Systems, Minneapolis, MN))), 경쟁 억제 면역분석(예를 들어, 정배향 및 역배향), 형광 편광 면역분석(FPIA), 효소 다중 면역분석 기술(EMIT), 생발광 공명 에너지 전달(BRET), 및 균일한 화학발광 분석 등을 포함한다. SELDI 기본 면역분석에서, 목적하는 분석물(이의 단편)에 특이적으로 결합하는 포획 시약은 질량 분광측정 프로브, 예를 들어, 예비활성화된 단백질 칩 어레이에 부착된다. 당해 분석물(또는 이의 단편)은 이어서 바이오칩상에 특이적으로 포획되고 포획된 분석물(또는 이의 단편)은 질량 분광측정에 의해 검출된다. 또는 분석물(또는 이의 단편)은 포획 시약으로부터 용출되고 통상의 MALDI (매트릭스 원조 레이저 탈착/이온화 또는 SELDI에 의해 검출된다. 화학발광 나노입자 면역분석, 특히, ARCHITECT? 자동화 분석기(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)를 사용하는 면역분석은 바람직한 면역분석의 한 예이다.
뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 및 기타 체액을 수거하고, 취급하고 프로세싱하기 위해 당업계에 널리 공지된 방법이 본 발명의 수행을 위해 사용되고, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 DVD-Ig가 면역진단 시약으로서 및/또는 분석물 면역분석 키트에서 사용되는 경우이다. 시험 샘플은 목적하는 분석물에 추가로 항체, 항원, 합텐, 호르몬, 약물, 효소, 수용체, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 당해 샘플은 피험체로부터 수득되는 전혈 샘플일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 면역 분석 전에 시험 샘플, 특히, 전혈을 전처리 시약으로 처리될 필요가 있거나 요망될 수 있다. 전처리가 필요하지 않은 경우라도(예를 들어, 대부분 뇨 샘플), 전처리가 임의로 수행될 수 있다(예를 들어, 상업적 플랫폼상의 계획의 일부로서).
전처리 시약은 본 기재내용의 면역분석 및 키트와 함께 사용하기에 적당한 임의의 시약일 수 있다. 전처리는 임의로 다음을 포함한다: (a) 하나 이상의 용매(예를 들면, 메탄올 및 에틸렌 글리콜) 및 임의로 염, (b) 하나 이상의 용매 및 염, 및 임의로 세제, (c) 세제, 또는 (d) 세제 및 염. 전처리 시약은 당업계에 공지되어 있고 이러한 전처리는 예를 들어, 문헌[참조: 예를 들어, Yatscoff et al., (1990) Clin. Chem. 36: 1969-1973 및 Wallemacq et al. (1999) Clin. Chem. 45: 432-435 (1999))에 기재된 바와 같은 Abbott TDx, AxSYM?, 및 ARCHITECT? 분석기(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), 및/또는 상업적으로 시판되는 것으로서 사용될 수 있다. 추가로, 전처리는 문헌[참조: 미국 특허 5,135,875, EU 특허 공보 EU0471293, 미국 특허 6,660,843, 및 미국 특허원 2008/0020401]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 전처리 시약은 이종성 제제 또는 동종성 제제일 수 있다.
이종성 전처리 시약의 사용으로, 전처리 시약은 샘플에 존재하는 분석물 결합 단백질(예를 들어, 분석물 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 단백질)을 침전시킨다. 당해 전처리 단계는 샘플에 전처리 제제의 첨가로 형성된 혼합물의 상등액을 침전된 분석물 결합 단백질로부터 분리함에 의해 임의의 분석물 결합 단백질을 제거함을 포함한다. 당해 분석에서, 임의의 결합 단백질이 부재인 혼합물의 상등액이 당해 분석에 사용되고 직접 항체 포획 단계로 진행한다.
동종의 전처리 시약의 사용시에는 당해 분리 단계가 없다. 시험 샘플 및 전처리 시약의 전체 혼합물을 표지된 항-분석물 항체(또는 항원적으로 반응성인 이의 단편)와 같은 분석물(또는 이의 단편)에 대해 표지된 특이적 결합 파트너와 접촉시킨다. 당해 분석을 위해 사용되는 전처리 시약은 제1 특이적 결합 파트너에 의한 포획 전 또는 포획 동안에 전처리된 시험 샘플 혼합물중에 희석시킨다. 당해 희석에도 불구하고, 특정 양의 전처리 시약은 포획동안에 시험 샘플 혼합물중에 존재(또는 잔류)한다. 본 기재내용에 따라, 표지된 특이적 결합 파트너는 DVD-Ig (또는 이의 단편, 변이체, 또는 변이체의 단편)일 수 있다.
이종성 포맷에서, 시험 샘플이 피험체로부터 수득된 후 제1 혼합물을 제조한다. 당해 혼합물은 분석물(또는 이의 단편)에 대해 평가된 시험 샘플 및 제1 특이적 결합 파트너를 포함하고, 여기서 제1 특이적 결합 파트너 및 시험 샘플중에 함유된 임의의 샘플은 제1 특이적 결합 파트너-분석물 복합체를 형성한다. 바람직하게, 제1 특이적 결합 파트너는 항-분석물 항체 또는 이의 단편이다. 제1 특이적 결합 파트너는 본원에 기재된 바와 같은 DVD-Ig (또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편). 혼합물을 형성하기 위해 시험 샘플 및 기타 특이적 결합 파트너가 첨가되는 순서는 중요하지 않다. 바람직하게, 제1 특이적 결합 파트너는 고형상에 고정화된다. 면역분석(제1 특이적 결합 파트너 및 임의로 제2 특이적 결합 파트너에 대해)에 사용되는 고형상은 자기 입자, 비드, 시험 튜브, 미세적정 플레이트, 큐벳, 막, 스캐폴딩 분자, 필름, 여과지, 디스크 및 칩(이에 제한되지 않음)과 같은 당업계에 공지된 임의의 고형상일 수 있다.
제1 특이적 결합 파트너-분석물 복합체를 함유하는 혼합물이 형성된 후, 임의의 결합되지 않은 분석물이 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 복합체로부터 제거된다. 예를 들면, 비결합된 분석물은 세척에 의해 제거될 수 있다. 바람직하게, 그러나, 제1 특이적 결합 파트너는 시험 샘플중에 존재하는 임의의 분석물을 초과하여 존재하여 시험 샘플중에 존재하는 모든 분석물은 제1 특이적 결합 파트너에 의해 결합되어 있다.
임의의 비결합된 분석물이 제거된 후, 제1 특이적 결합 파트너는 제1 특이적 결합 파트너-분석물-제2 특이적 결합 파트너 복합체를 형성하기 위해 혼합물에 첨가된다. 제2 특이적 결합 파트너는 바람직하게 제1 특이적 결합 파트너에 의해 결합된 분석물상의 에피토프와는 상이한 분석물상의 에피토프에 결합하는 항-분석물 항체이다. 더욱이, 또는 바람직하게, 제2 특이적 결합 파트너는 상기된 바와 같은 검출가능한 표지로 표지되거나 이를 포함한다. 제2 특이적 결합 파트너는 본원에 기재된 바와 같은 DVD-Ig (또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)일 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 검출가능한 표지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 방사성활성 표지(예를 들어, 3H, 1251, 35S, 14C, 32P, 및 33P), 효소적 표지(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 퍼옥시다제, 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 등), 화학발광 표지(예를 들어, 아크리디늄 에스테르, 티오에스테르, 또는 설폰아미드; 루미놀, 이소루미놀, 펜안트리디늄 에스테르 등), 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인(예를 들어, 5 -플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 3'6-카복시플루오레세인, 5(6)-카복시플루오레세인, 6-헥사클로로-플루오레세인, 6-테트라클로로플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등)), 로다민, 물리화학적 단백질, R-피지코에리트린, 쿠안텀 도트(예를 들어, 황화아연-캡핑된 셀렌화카드뮴), 온도측정 표지, 또는 면역-폴리머라제 연쇄 반응 표지일 수 있다. 표지로의 도입, 표지 과정 및 표지 검출은 문헌[참조: Polak and Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), 및 in Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)(조합된 핸드북 및 문헌(참조: Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon에 의해 공개된 카탈로그)]에서 밝혀졌다. 형광 표지는 FPIA(문헌참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,593,896호, 제5,573,904호, 제5,496,925호, 제5,359,093호, 및 제5,352,803호)에 사용될 수 있다. 아크리디늄 화합물은 동종 또는 이종 화학발광 분석중에 검출가능한 표지로서 사용될 수 있다(문헌참조: Adamczyk et al. (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328; Adamczyk et al. (2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317; Adamczyk et al. (2004) Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921; 및 Adamczyk et al. (2003) Org. Lett. 5: 3779-3782).
바람직한 아크리디늄 화합물은 아크리디늄-9-카복스아미드이다. 아크리디늄 9-카복스아미드를 제조하는 방법은 문헌[참조: Methods for preparing acridinium 9-carboxamides are described in Mattingly (1991) J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114; Adamczyk et al. (1998) J. Org. Chem. 63: 5636-5639; Adamczyk et al. (1999) Tetrahedron 55: 10899-10914; Adamczyk et al. (1999) Org. Lett. 1: 779-781; Adamczyk et al. (2000) Biocon. Chem. 11: 714-724; Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al. (2003) Org. Lett. 5: 3779-3782; 및 미국 특허 5,468,646; 5,543,524; 및 5,783,699]에 기재되어 있다. 또 다른 바람직한 아크리디늄 화합물은 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르이다. 아크리디늄-9-카복실레이트 에스테르의 예는 10-메틸-9-(페녹시카보닐)아크리디늄 플루오로설포네이트(제조원(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)으로부터 시판됨)이다. 아크리디늄 9-카복실레이트 아릴 에스테르를 제조하는 방법은 문헌[참조: McCapra et al. (1965) Photochem. Photobiol. 4: 1111-21; Razavi et al. (2000) Luminescence 15: 245-249; Razavi et al. (2000) Luminescence 15: 239-244; 및 미국 특허 5,241,070]에 기재되어 있다. 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르 및 이의 용도에 관한 추가의 세부사항은 미국 특허 공개공보 20080248493에 기재되어 있다.
화학발광 분석(상기된 바와 같은 아크리디늄 또는 다른 화학발광제를 사용하는)은 문헌[참조: Adamczyk et al.(2006) Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67]에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다. 임의의 적합한 분석 포맷이 사용될 수 있지만, 미세플레이트 화학발광측정기(Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, TN)로 신속하게 소량의 다발성 샘플 분석을 수행할 수 있다.
시험 샘플 및 특이적 결합 파트너가 화학발광 분석용 혼합물을 형성하기 위해 첨가되는 순서는 중요하지 않다. 제1 특이적 결합 파트너가 화학발광제(예를 들어, 아크리디늄 화합물)로 표지되는 경우, 검출가능하게 표지된 제1 특이적 결합 파트너-분석물 복합체가 형성된다. 또한, 제2 특이적 결합 파트너가 사용되고 제2 특이적 결합 파트너가 아크리디늄 화합물과 같은 화학발광제로 검출가능하게 표지되는 경우, 검출가능하게 표지된 제1 특이적 결합 분석물 제2 비특이적 결합 파트너 복합체가 형성된다. 임의의 비결합된 특이적 결합 파트너는 표지된 또는 비표지된 것에 상관없이 세척과 같은 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 혼합물로부터 제거될 수 있다.
과산화수소는 혼합물중에서 동일계에서 생성될 수 있거나 상기된 아크리디늄 화합물 첨가 전, 이와 동시에 또는 이후에 혼합물에 제공되거나 공급될 수 있다(예를 들어, 과산화수소의 공급원은 과산화수소를 함유하는 것으로 공지된 하나 이상의 완충액 또는 기타 용액이다). 과산화수소는 당업자에게 자명한 바와 같은 다수의 방식으로 동일계에서 생성될 수 있다.
샘플에 하나 이상의 염기성 용액의 동시 또는 후속적 첨가시, 검출가능한 시그날, 즉, 화학발광 시그날(분석물의 존재를 지적함)이 생성된다. 염기성 용액은 10 이상, 바람직하게는 12 이상의 pH를 갖는다. 염기성 용액의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화암모늄, 수산화마그네슘, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화칼슘, 탄산칼슘, 및 중탄산칼슘을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 샘플에 첨가된 염기성 용액의 양은 염기성 용액의 농도에 의존한다. 사용되는 염기성 용액의 농도를 기준으로, 당업자는 샘플에 첨가하기 위한 염기성 용액의 양을 용이하게 결정할 수 있다.
생성된 화학발광 시그날은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 생성된 시그날 강도를 기준으로, 샘플중의 분석물의 양은 정량될 수 있다. 구체적으로, 샘플중의 분석물의 양은 생성된 시그날의 강도에 비례한다. 존재하는 분석물의 양은 분석물에 대한 표준 곡선에 대해 생성된 빛의 양을 비교하거나 참조 표준 물질과 비교하여 정량할 수 있다. 표준 곡선은 질량 분광측정, 중력측정 방법 및 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 공지된 농도의 분석물의 연속 희석액 또는 용액을 사용하여 생성될 수 있다. 화학발광제로서 아크리디늄 화합물의 사용에 대한 강조와 함께 기재되지만 당업자는 기타 화학발광제의 사용을 위해 당해 기내내용을 용이하게 적용할 수 있다.
분석물 면역분석은 일반적으로 샌드위치 포맷(이에 제한되지 않음)과 같은 당업계에 공지된 임의의 포맷을 사용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 하나의 면역분석 포맷에서, 2개 이상의 항체를 사용하여 샘플중의 인간 분석물 또는 이의 단편과 같은 분석물을 분리하고 정량한다. 보다 구체적으로, 2개 이상의 항체는 "샌드위치"로서 언급되는 면역 복합체를 형성하는 분석물(또는 이의 단편)상에 상이한 에피토프에 결합한다. 일반적으로, 면역분석에서, 하나 이상의 항체(이들 항체는 "포획" 항체 또는 "포획" 항체들로서 흔히 언급된다)를 사용하여 시험 샘플중에 분석물(또는 이의 단편)을 포획하고 하나 이상의 항체를 사용하여 샌드위치에 검출가능한(즉, 정량가능한) 표지를 결합시킬 수 있다(이들 항체는 흔히 "검출 항체", "검출 항체들", "접합체" 또는 "접합체들"로서 언급된다). 따라서, 샌드위치 면역분석 포맷과 관련하여, 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질 또는 DVD-Ig (또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)를 포획 항체, 검출 항체 또는 둘다로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물(또는 이의 단편)상에 제1 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 갖는 하나의 결합 단백질 또는 DVD-Ig는 포획체로서 사용될 수 있고/있거나 분석물(또는 이의 단편)상에 제2 에피토프와 결합할 수 있는 도메인을 갖는 또 다른 결합 단백질 또는 DVD-Ig는 검출체로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 분석물(이의 단편)상에 제1 에피토프와 결합할 수 있는 제1 도메인 및 분석물(또는 이의 단편)상에 제2 에피토프와 결합할 수 있는 제2 도메인을 갖는 결합 단백질 또는 DVD-Ig는 포힉 항체 및/또는 검출 항체로서 사용될 수 있다. 또한, 제1 분석물(또는 이의 단편)상에 에피토프를 결합할 수 있는 제1 도메인 및 제2 분석물(또는 이의 단편)상에 에피토프와 결합할 수 있는 제2 도메인을 갖는 하나의 결합 단백질 또는 DVD-Ig는 2개 이상의 분석물을 검출하고 임의로 정량하기 위해 포획체 및/또는 검출제로서 사용될 수 있다. 분석물이 동종성 또는 이종성일 수 있는 단량체 형태 및 이량체/다량체 형태와 같은 1개 이상의 형태로 샘플중에 존재할 수 있는 경우에, 단량체 형태상에서만 노출된 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 갖는 하나의 결합 단백질 또는 DVD-Ig 및 이량체/다량체 형태의 상이한 부분상의 에피토프와 결합할 수 있는 도메인을 갖는 또 다른 결합 단백질 또는 DVD-Ig는 포획제 및/또는 검출제로서 사용되어 검출을 가능하게 하고 상이한 형태의 소정의 분석물을 정량할 수 있게 한다. 추가로, 단일 결합 단백질 또는 DVD-Ig내 및/또는 결합 단백질 또는 DVD-Ig 사이에 차등적 친화도를 갖는 결합 단백질 또는 DVD-Ig를 사용하여 결합가 이점을 제공할 수 있다. 본원에 기재된 면역분석과 관련하여, 이것은 일반적으로 결합 단백질 또는 DVD-Ig의 구조물내 하나 이상의 링커를 혼입시키기 위해 도움을 줄 수 있거나 요망될 수 있다. 존재하는 경우, 최적으로 링커는 외곽 도메인에 의한 또 다른 에피토프의 결합 뿐만 아니라 내부 도메인에 의한 에피토프의 결합을 가능하게 하기 위해 충분한 길이 및 구조적 실행가능성을 가져야만 한다. 이와 관련하여, 결합 단백질 또는 DVD-Ig가 2개의 상이한 분석물과 결합할 수 있고 하나의 분석물이 또 다른 분석물보다 큰 경우, 바람직하게 대형 분석물은 외곽 도메인에 의해 결합된다.
일반적으로 말해서, 분석물(또는 이의 단편)에 대해(함유된 것으로 의심되는) 시험된 샘플은 동시에 또는 후속적으로 및 임의의 순서로 하나 이상의 포획제(또는 제제들) 및 하나 이상의 검출 항체(이것은 제2 검출제 또는 제2 검출제일 수 있거나 심지어 연속적으로 번호를 매긴 제제, 예를 들어, 경우에 따라 포획제 및/또는 검출제가 다중 제제를 포함한다)와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 시험 샘플은 먼저 하나 이상의 포획제와 접촉시킴에 이어서 연속적으로 하나 이상의 검출제와 접촉시킬 수 있다. 또한 시험 샘플은 먼저 하나 이상의 검출제와 접촉시키고 이어서 (연속적으로) 하나 이상의 포획제와 접촉시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 시험 샘플은 포획제 및 검출제와 동시에 접촉시킬 수 있다.
샌드위치 분석 포맷에서, 분석물(또는 이의 단편)을 함유하는 의심되는 샘플은 먼저 제1 항체/분석물 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 하나 이상의 제1 포획제와 접촉시킨다. 하나 이상의 포획제가 사용되는 경우, 2개 이상의 포획제를 포함하는 제1 포획제/분석물 복합체가 형성된다. 샌드위치 분석에서, 당해 항체, 즉, 바람직하게 하나 이상의 포획제가 시험 샘플에서 예상되는 몰 과량의 최대량의 분석물(또는 이의 단편)에 사용된다. 예를 들어, 완충액(예를 들어, 미세입자 피복 완충액) ml당 약 5 μg 내지 약 1 mg의 제제가 사용될 수 있다.
단지 하나의 항체(즉, 본 기재내용의 의미에서 결합 단백질 및/또는 DVD-Ig)에 의한 결합이 요구되기 때문에 작은 분석물을 측정하기 위해 흔히 사용되는 경쟁 억제 면역분석은 연속적 및 통상적 포맷을 포함한다. 연속적 경쟁 억제 면역분석에서, 목적하는 분석물에 대한 포획제를 미세적정 플레이트 또는 기타 고체 지지체의 웰상으로 피복시킨다. 목적하는 분석물을 함유하는 샘플이 웰에 첨가되는 경우, 목적하는 분석물은 포획제에 결합한다. 세척 후, 포획 항체를 결합할 수 있는 공지된 양의 표지된(예를 들어, 비오틴 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)) 분석물을 당해 웰에 첨가한다. 효소적 표지에 대한 기질은 시그날을 생성할 필요가 있다. HRP를 위해 적합한 기질의 예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)이다. 세척 후, 표지된 분석물에 의해 생성된 시그날은 측정하고 샘플중의 분석물의 양과 반비례한다. 통상적인 경쟁 억제 면역분석에서, 전형적으로, 목적하는 분석물에 대한 항체(즉, 본 기재내용의 의미에서 결합 단백질 및/또는 DVD-Ig)는 고형상 지지체(예를 들어, 미세역가 플레이트의 웰)상으로 피복시킨다. 그러나, 연속적인 경쟁 억제 면역분석 같지 않게 당해 샘플 및 표지된 분석물은 동시에 웰에 첨가한다. 샘플 중의 임의의 분석물은 포획제에 결합하는 것에 대해 표지된 분석물과 경쟁한다. 세척 후, 표지된 분석물에 의해 생성된 시그날을 측정하고 샘플중의 분석물의 양에 반비례한다. 물론, 예를 들면, 고체 기재에 대한 결합이 일어나는 경우, 포맷이 1단계, 2단계, 지영된 2 단계 등인지 여부에 대한 것과 같은, 이들 포맷들 중의 많은 변형이 존재하여, 이들은 당해 분야의 숙련가에 의해 인지될 것이다.
임의로, 시험 샘플을 하나 이상의 포획 항체(예를 들어, 제1 포획제)와 접촉시키기 전에, 하나 이상의 포획제를, 시험 샘플로부터 제1 제제/분석물(또는 이의 단편) 복합체의 분리를 촉진시키는 고형 지지체상에 결합시킬 수 있다. 포획제가 결합된 기질은 샘플로부터 포획제-분석물 복합체의 분리를 촉진시키는 임의의 적합한 고형 지지체 또는 고형상일 수 있다.
이의 예는 미세적정 플레이트와 같은 플레이트의 웰, 시험 튜브, 다공성 겔(예를 들어, 실리카 겔, 아가로스, 덱스트란, 또는 젤라틴), 중합체 필름(예를 들어, 폴리아크릴아미드), 비드(예를 들어, 폴리스티렌 비드 또는 자기 비드), 여과기/막(예를 들어, 니트로셀룰로스 또는 나일론) 스트립, 미세입자(예를 들어, 라텍스 입자, 자기화될 수 있는 미세입자(예를 들어, 산화철 또는 산화크로뮴 및 동종 또는 이종 중합체 피복물을 갖고 반경이 약 1 내지 10㎛)를 포함한다. 당해 기질은 항원과 결합하기에 적합한 표면 친화도 및 검출 항체에 의한 접근을 허용하기에 충분한 다공성을 갖는 적합한 다공성 물질을 포함할 수 있다. 수화된 상태의 젤라틴성 물질이 사용될 수 있지만 미세다공성 물질이 일반적으로 바람직하다. 당해 다공성 기질은 바람직하게 두께가 약 0.01 내지 약 0.5mm, 바람직하게는 약 0.1mm인 쉬트 형태이다. 공극 크기는 상당히 다양할 수 있지만 바람직하게 공극 크기는 약 0.025에서 약 15㎛이고 보다 바람직하게는 약 0.15에서 약 15㎛이다. 당해 기질의 표면은 항체의 기질로의 공유 결합을 유발하는 화학적 공정에 의해 수동적으로 코팅되거나 활성화될 수 있다. 일반적으로 항원 또는 항체의 기질로의 소수성 힘을 통한 흡착에 의한 비가역적 결합이 생성된다. 또한, 화학적 커플링 제제 또는 기타 다른 수단을 사용하여 항체를 기질로 공유결합시킬 수 있고, 단 당해 결합은 분석물에 결합하는 항체의 능력을 방해하지 않는다. 또한, 당해 항체(즉, 본 기재내용의 의미에서 결합 단백질 및/또는 DVD-Ig)는 사전에 스트렙트아비딘 (예를 들어, DYNAL? Magnetic Beads, Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 비오틴으로 피복된 미세입자(예를 들어, Power-BindTM-SA-MP 스트렙트아비딘 피복된 미세입자(Seradyn, Indianapolis, IN)) 또는 항-종-특이적 모노클로날 항체(즉, 본 기재내용의 의미에서 결합 단백질 및/또는 DVD-Ig)와 결합될 수 있다. 필요하다면 또는 목적한다면, 당해 기질(예: 표지에 대하여)은 항체(즉, 본 기재내용의 의미에서 결합 단백질 및/또는 DVD-Ig) 위의 다양한 기능성 그룹과의 반응을 허용하기 위해 유도체화될 수 있다. 당해 유도체화는 특정 커플링제의 사용을 요구하고 이의 예는 말레산 무수물, N-하이드록시숙신이미드, 및 l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 하나 이상의 포획제, 예를 들어, 항체(또는 이의 단편)(즉, 본 기재내용의 의미에서 결합 단백질 및/또는 DVD-Ig)를 포함하지만 이에 제한되지 않고 분석물에 특이적인 이의 각각은 상이한 물리적 또는 허용가능한 위치(예를 들어, 바이오칩 배위(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,225,047호; PCT Publication No. WO 99/51773; 미국 특허 제6,329,209호; PCT 공보 WO 00/56934, 및 미국 특허 5,242,828)]에서 고형상에 부착될 수 있다. 포획제가 고형 지지체로서 질량 분광측정 프로브에 부착되는 경우, 당해 프로브에 결합된 분석물의 양은 레이져 탈착 이온화 질량 분광측정에 의해 검출될 수 있다. 또는, 단일 칼럼은 상이한 비드로 팩킹될 수 있고 당해 비드는 하나 이상의 포획제로 유도체화되어 단일 위치에서 분석물을 포획한다(참조: 항체 유도체화된 비드 기본 기술, 예를 들어, 루미넥스 xMAP 기술(Austin, TX)). 분석물(또는 이의 단편)에 대해 분석된 시험 샘플을 하나 이상의 포획제(예를 들어, 제1 포획제)와 접촉시킨 후, 당해 혼합물을, 제1 포획제(또는 다중 항체)-분석물(이의 단편) 복합체가 형성되도록 항온처리한다. 항온처리는 약 2℃ 내지 약 45℃의 온도에서 약 4.5 내지 약 10.0의 pH에서 적어도 약 1분 내지 약 18시간, 바람직하게는 약 1 내지 약 24분, 가장 바람직하게는 약 4 내지 약 18분동안 수행될 수 있다. 본원에 기재된 면역분석은 1단계(샘플, 하나 이상의 포획제 및 하나 이상의 검출제가 모두 연속적으로 또는 동시에 반응 용기에 첨가됨을 의미하는) 또는 1개 이상의 단계, 예를 들어, 1단계 이상, 예를 들어, 2단계, 3단계 등으로 수행할 수 있다.
(제1 또는 다중) 포획제/분석물(또는 이의 단편) 복합체의 형성 후, 당해 복합체를 이어서 (제1 또는 다중) 포획제/분석물(또는 이의 단편)/제2 검출제 복합체)의 형성을 허용하는 조건하에서 하나 이상의 검출제와 접촉시킨다. 명백하기 위해 "제2" 제제로서(예를 들어, 제2 검출제) 포획되지만, 사실 다중 제제가 포획 및/또는 검출을 위해 사용되는 경우, 하나 이상의 검출제가 면역분석에서 사용되는 제2, 제3, 제4 항체 등일 수 있다. 포획제/분석물(또는 이의 단편) 복합체가 하나 이상의 검출제와 접촉되는 경우, (제1 또는 다중) 포획제/분석물(또는 이의 단편)/(다중) 검출제 복합체가 형성된다. 포획제(예를 들어, 제1 포획제)에 대하여, 하나 이상의 (예를 들어, 제2 및 임의의 연속) 검출제가 포획제/분석물(또는 이의 단편) 복합체와 접촉되는 경우 상기된 것들과 유사한 조건하에서 항온 처리가 (제1 또는 다중) 포획제/분석물(또는 이의 단편)/(제2 또는 다중) 검출제 복합체의 형성을 위해 요구된다. 바람직하게, 하나 이상의 검출제는 검출 가능한 표지를 포함한다. 검출가능한 표지는 (제1 또는 다중) 포획제/분석물(또는 이의 단편)(제2 또는 다중) 포획제/분석물(또는 이의 단편)/(제2 또는 다중) 검출제 복합체의 형성 전, 이와 동시에 이후에 하나 이상의 검출제(예를 들어, 제2 검출제)에 결합될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 검출 가능한 표지가 사용될 수 있다(상기 논의를 참조: the Polak and Van Noorden (1997) and Haugland (1996)).
검출가능한 표지는 제제에 직접적으로 또는 커플링제를 통해 결합될 수 있다. 사용될 수 있는 커플링제의 예는 EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, 하이드로클로라이드)(제조원: Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이다. 사용될 수 있는 다른 커플링 제제는 당업계에 공지되어 있다. 항체에 검출가능한 표지를 결합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 추가로, 많은 검출가능한 표지는 구입될 수 있거나 합성될 수 있고 당해 표지는 항체로의 검출 가능한 표지의 커플링을 촉진시키는 목적 그룹을 이미 함유하고 있고 예를 들어, CPSP-아크리디늄 에스테르(즉, 9-[N-토실-N-(3-카복시프로필)]-10-(3-설포프로필)아크리디늄 카복스아미드) 또는 SPSP-아크리디늄 에스테르(즉, N10-(3-설포프로필)-N-(3-설포프로필)-아크리디늄-9-카복스아미드)가 있다.
(제1 또는 다중) 포획제/분석물/(제2 또는 다중) 검출제 복합체는 표지의 정량 전에 시험 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있거나 분리될 필요가 없다. 예를 들어, 하나 이상의 포획제(예를 들어, 제1 포획제, 예를 들어, 본 기재내용에 따라 결합 단백질 및/또는 DVD-Ig)가 웰 또는 비드와 같은 고형 지지체에 결합되는 경우, 분리는 고형 지지체와의 접촉으로부터 유체(시험 샘플의 유체)를 제거함에 의해 달성될 수 있다. 또는, 적어도 제1 포획제가 고형 지지체에 결합되는 경우, 이것은 분석물-함유 샘플 및 하나 이상의 제2 검출제와 동시에 접촉시켜 제1(다중) 제제/분석물/제2 (다중) 제제 복합체를 형성할 수 있고 이어서 당해 고형 지지체와의 접촉으로부터 유체(시험 샘플)을 제거한다. 적어도 제1 포획제가 고형 지지체에 결합되지 않은 경우(제1 또는 다중) 포획제/분석물/(제2 또는 다중) 검출제 복합체는 표지 양의 정량을 위해 시험 샘플로부터 제거될 필요는 없다.
표지된 포획제/분석물/검출제 복합체(예를 들어, 제1 포획제/분석물/제2 검출제 복합체)의 형성 후, 복합체내 표지의 양은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 정량한다. 예를 들어, 효소적 표지가 사용되는 경우, 표지된 복합체는 발색과 같이 반응이 정량가능할 수 있는 표지에 대한 기질과 반응시킨다. 표지가 방사성활성 표지인 경우, 당해 표지는 섬광 계수기와 같은 적당한 수단을 사용하여 정량한다. 표지가 형광 표지인 경우, 당해 표지는 한 색상의 빛("여기 파장"으로서 공지됨)으로 표지를 자극시키고 자극에 반응하여 표지에 의해 방출되는 또 다른 색상("방출 파장"으로서 공지됨)을 검출함에 의해 정량한다. 표지가 화학발광 표지인 경우, 당해 표지는 가시적으로 또는 발광측정기, X-선 필름, 고속 사진 필름, CCD 필름 등을 사용함에 의해 방출되는 빛을 검출함에 의해 정량된다. 일단 복합체내 표지의 양이 정량된 경우 시험 샘플중의 분석물 또는 이의 단편의 농도는 적당한 수단, 예를 들어, 공지된 농도의 분석물 또는 이의 단편의 연속 희석을 사용하여 생성된 표준 곡선을 사용함에 의해 결정한다. 분석물 또는 이의 단편의 연속 의석을 사용하는 것 외에 표준 곡선은 질량 분광측정 및 다른 당업계에 공지된 기술에 의한 중력측정으로 생성될 수 있다.
ARCHITECT? 분석기를 사용하는 화학발광 미세입자 분석에서, 접합체 희석 pH는 약 6.0 +/- 0.2이어야만 하고, 미세입자 피복 완충액은 약 실온(즉, 약 17 내지 약 27℃에서)에서 유지되어야만 하고, 미세입자 피복 완충액 pH는 약 6.5 +/- 0.2이어야만 하고, 미세입자 희석 pH는 약 7.8 +/- 0.2이어야만 한다. 고체는 바람직하게 약 0.2% 미만, 예를 들어, 0.15% 미만, 약 0.14% 미만, 약 0.13% 미만, 약 0.12% 미만, 또는 약 0.11% 미만, 예를 들어, 약 0.10%이다.
FPIA는 경쟁 결합 면역분석 원리를 기초로 한다. 형광 표지된 화합물이 선형 편광 빛에 의해 여기되는 경우 이의 회전율에 역비례하는 편광 정도를 갖는 형광을 방출한다. 형광 표지된 추적-항체 복합체가 서형 편광된 빛에 의해 여기되는 경우, 방출된 빛은 형광단이, 빛이 흡수되고 방출되는 시간 사이에 회전하는 것으로 제약을 받기 때문에 고도로 편광된 상태로 있다. "자유" 추적 화합물(즉, 항체에 결합되지 않은 화합물)이 선형 편광 빛에 의해 여기되는 경우, 이의 회전은 경쟁 결합 면역분석에서 생성되는 상응하는 추적-항체 접합체(또는 본 기재내용에 따라 추적-결합 단백질 및/또는 추적-DVD-Ig) 보다 훨씬 신속하다. FPIA는 특별한 취급 및 처리를 요하는 방사성활성 물질이 없기 때문에 RIA 보다 이점을 갖는다. 또한, FPIA는 용이하게 및 신속하게 수행될 수 있는 균일한 분석이다.
상기 관점에서, 시험 샘플중에 분석물(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 결정하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 (i) (i') 분석물에 결합할 수 있는 항체 또는 항체의 단편, 분석물에 결합할 수 있는 항체의 변이체, 분석물에 결합할 수 있는 항체의 변이체의 단편 및 분석물에 결합할 수 있는 DVD-Ig(또는 단편, 변이체 또는 이의 변이체의 단편), 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 및 (ii') 하나 이상의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 대조군 또는 캘리브레이터내 분석물(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직간접적인 징후로서 생성된 시그날과, 시험 샘플중의 분석물(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직간접적인 징후로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 비교함을 포함하는 분석에 의해 분석물(또는 이의 단편)에 대해 시험 샘플을 분석함을 포함한다. 캘리브레이터는 임의로 일련의 캘리브레이터의 일부이고 여기서, 캘리브레이터 각각은 분석물의 농도에 의해 다른 캘리브레이터로부터 상이하다.
당해 방법은 (i) 분석물에 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편, 분석물에 결합할 수 있는 항체의 변이체, 분석물에 결합할 수 있는 항체의 변이체의 단편, 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 및 분석물에 결합할 수 있는 DVD-Ig(또는 단편, 변이체 또는 이의 변이체의 단편)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분석물(또는 이의 단편)에 대한 하나 이상의 제1 특이적 결합 파트너를 시험 샘플과 접촉시켜 제1 특이적 결합 파트너/분석물(또는 이의 단편)을 형성하는 단계, (ii) 분석물에 결합할 수 있는 검출가능하게 표지된 항-분석물 항체 또는 검출가능하게 표지된 항-분석물 항체의 단편, 분석물과 결합할 수 있는 항-분석물 항체의 검출가능하게 표지된 변이체, 분석물과 결합할 수 있는 항-분석물 항체의 변이체의 검출가능하게 표지된 단편, 분석물에 결합할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 검출가능하게 표지된 결합 단백질, 및 검출가능하게 표지된 DVD-Ig(또는 단편, 변이체, 이의 변이체의 단편)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분석물(또는 이의 단편)에 대한 하나 이상의 제2 특이적 결 결합 파트너와 제1 특이적 결합 파트너/분석물(또는 이의 단편) 복합체를 접촉시켜 제1 특이적 결합 파트너/분석물(또는 이의 단편)/제2 특이적 결합 파트너 복합체를 형성하는 단계 및 (iii) (ii)에서 형성된 제1 특이적 결합 파트너/분석물(또는 이의 단편/제2 특이적 결합 파트너 복합체)에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 검출하거나 측정함에 의해 시험 샘플내 분석물의 존재, 양 또는 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 분석물(또는 이의 단편)에 대한 하나 이상의 제1 특이적 결합 파트너 및/또는 분석물(또는 이의 단편)에 대한 하나 이상의 제2 특이적 결합 파트너가 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질 또는 본원에 기재된 DVD-Ig(또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)인 방법이 바람직할 수 있다.
또는, 당해 방법은 분석물에 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편, 분석물에 결합할 수 있는 항체의 변이체, 분석물에 결합할 수 있는 항체의 변이체의 단편, 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 및 DVD-Ig(또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분석물(또는 이의 단편)에 대한 하나 이상의 제1 특이적 결합 파트너와 시험 샘플을 접촉시키는 단계 및 동시에 또는 연속으로 어느 한 순서로 하나 이상의 제1 특이적 결합 파트너에 결합하는 것에 대해 분석물(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있고, 제1 특이적 결합 파트너에 결합할 수 있는 검출가능하게 표지된 분석물, 검출가능하게 표지된 분석물의 단편, 제1 특이적 결합 파트너와 결합할 수 있는 분석물의 검출가능하게 표지된 변이체, 제1 특이적 결합 파트너와 결합할 수 있는 분석물의 변이체의 검출가능하게 표지된 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제2 특이적 결합 파트너와 시험 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 시험 샘플에 존재하는 임의의 분석물(또는 이의 단편) 및 하나 이상의 제2 특이적 결합 파트너는 서로 경쟁하여 각각 제1 특이적 결합 파트너/분석물(또는 이의 단편) 복합체 및 제1 특이적 결합 파트너/제2 특이적 결합 파트너 복합체를 형성한다. 당해 방법은 추가로 (ii)에서 형성된 제1 특이적 결합 파트너/제2 특이적 결합 파트너 복합체중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 검출하거나 측정함에 의해 시험 샘플내 분석물의 존재, 양 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하고, 이때, 제1 특이적 결합 파트너/제2 특이적 결합 파트너 복합체내 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 샘플중에 분석물의 양 또는 농도에 반비례한다.
상기 방법은 추가로 시험 샘플이 수득된 환자의 치료학적/예방학적 치료의 효능을 진단하거나, 예후하거나 평가함을 포함할 수 있다. 당해 방법이 추가로 시험 샘플이 수득된 환자의 치료학적/예방학적 치료의 효능을 평가하는 단계를 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하기 위해 채택될 수 있다.
보다 상세하게는, 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 단독 또는 IL-18과 조합된 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 결합 단백질(i') 중 하나는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)으로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이고 (ii')는 NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다. 또한, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및 (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료는, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 추가로 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 다른 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 단독 또는 IL-18과 조합된 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 결합 단백질 중 하나는 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다. 또한, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및
(ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료가 환자로부터 기원한 경우, 당해 방법은 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 추가로 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 여전히 또 다른 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 단독으로 또는 IL-18과 조합하여 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 결합 단백질 중 하나는 (i') 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다. 또한, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및 (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료가 환자로부터 기원하는 경우, 당해 방법은 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 또한 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 추가로 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 여전히 또 다른 방법이 제공된다. 항원(또는 이의 단편)은 HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 당해 방법은 면역검정에 의해 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 2개의 항원 및 적어도 하나의 검출가능한 표지에 결합할 수 있는 적어도 하나의 DVD-Ig를 사용하고 (ii) 시험 시료 중에서 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함한다. 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 (또는 이의 단편)의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하다. 적어도 하나의 DVD-Ig 중 하나는 (i') 4개의 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제3 폴리펩타이드 쇄는 임의로 존재하는, 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은, 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)으로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)으로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개의 항원(또는 이의 단편)에 결합할 수 있다. 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계, (ii) 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원(또는 이의 단편)/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 DVD-Ig이다)를 포함할 수 있다. 또한, 당해 방법은 (i) 시험 시료를, 항원(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원(또는 이의 단편)과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편)과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원(또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원(또는 이의 단편) 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 각각을 형성한다], 및 (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 DVD-Ig이고 포획제/검출가능하게 표지된 항원(또는 이의 단편) 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원(또는 이의 단편)의 양 또는 농도에 반비례한다]를 포함할 수 있다. 시험 시료가 환자로부터 기원하는 경우, 당해 방법은 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법은 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 추가로 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하도록 조정될 수 있다.
분석 방법(및 이에 대한 키트)과 관련하여 상업적으로 시판되는 항-분석물 항체 또는 문헌에 기재된 바와 같은 항 분석물의 제조 방법을 사용할 수 있다. 다양한 항체의 공급원은 다음을 포함한다: Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA), 및 R&D Systems (RDS; Minneapolis, MN).
일반적으로, 미리 결정된 수준은 분석물 또는 이의 단편에 대한 시험 샘플을 분석시, 예를 들어, 질환 또는 질환의 위험을 검출하기 위해 수득된 결과를 평가하기 위한 벤치마크로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 비교를 하는데 있어서, 미리 결정된 수준은 질환, 장애 또는 병태의 특정 단계 및 종점 또는 특정 임상적 지적과 관련하여 분석물 존재, 양 또는 농도의 연계 또는 연합이 만들어 질수 있도록 충분한 횟수 및 적당한 조건하에서 특정 분석을 수행함에 의해 수득된다. 전형적으로 미리 결정된 수준은 참조 피험체(또는 피험체 집단)의 분석과 함께 수득된다. 측정된 분석물은 이의 단편, 이의 분해 생성물 및/또는 이의 효소적 절단 생성물을 포함할 수 있다.
특히, 질환 진행 및/또는 치료를 모니터링하기 위해 사용되는 바와 같은 미리 결정된 수준과 관련하여, 분석물 또는 이의 단편의 양 또는 농도는 "비변화", "선호적으로" (또는 "선호적으로 변형된") 또는 "비선호적으로"(또는 "비선호적으로 변형된)일 수 있다. "상승된" 또는 "증가된"은 전형적인 또는 정상의 수준 또는 범위(예를 들어, 미리 결정된 수준) 보다 높은 또는 또 다른 참조 수준 또는 범위(예를 들어, 보다 조기에 또는 기본 샘플) 보다 높은 시험 샘플내 양 또는 농도를 언급한다. 용어 "저하된" 또는 "감소된"은 전형적이거나 정상의 수준 또는 범위(예를 들어, 미리결정된 수준)보다 낮거나 또 다른 참조 수준 또는 범위(예를 들어, 조기 또는 기본 샘플) 보다 낮은, 시험 샘플내 양 또는 농도를 언급한다. 용어 "변화된"은 전형적이거나 정상의 수준 또는 범위(예를 들어, 미리 결정된 수준) 또는 또 다른 표준 수준 또는 범위(예를 들어, 조기 또는 기본 샘플)에 비해 변화된 샘플내 양 또는 농도를 언급한다.
분석물에 대해 전형적이거나 정상의 수준 또는 범위는 표준 관행에 따라 정의된다. 몇몇 경우에 분석물 수준은 매우 낮기 때문에, 소위 변화된 수준 또는 변화는 실험적 오차 또는 샘플 변화에 의해 설명될 수 없는 전형적이거나 정상적인 수준 또는 범위 또는 표준 수준 또는 범위와 비교하여 임의의 총 변화가 있는 경우 발생한 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 특정 샘플에서 측정된 수준은 소위 정상의 피험체로부터 유사한 샘플내에서 결정된 수준 또는 수준 범위과 비교한다. 이와 관련하여, "정상의 피험체"는 예를 들어, 어떠한 감지할만한 질환이 없는 개체이고 "정상"(때때로, "대조군"으로서 언급됨) 환자 또는 집단은 예를 들어, 각각 검출가능한 질환을 나타내지 않는 환자 또는 집단이다. 추가로, 분석물이 대부분의 인간 집단에서 고준에서 통상적으로 발견되지 않는 경우, "정상의 피험체"는 어떠한 실질적인 검출가능한 증가되거나 상승된 양 또는 농도의 분석물이 없는 피험체로서 고려될 수 있고 "정상" (때때로 "대조군"으로서 언급됨) 환자 또는 집단은 어떠한 실질적으로 검출가능한 증가되거나 상승된 양 또는 농도의 분석물을 나타내지 않는 환자 또는 집단이다. "명백하게 정상인 피험체"는 분석물이 아직 존재하지 않거나 현재 존재하지 않는 것으로 평가된 피험체이다. 분석물 수준은 분석물이 정상적으로는 검출될 수 없지만(예를 들어, 정상 수준은 제로이거나 정상 집단의 약 25 내지 약 75%의 범위내에 있다) 시험 샘플에서는 검출되는 경우 및 분석물이 정상 수준 보다 높은 수준으로 시험 샘플에 존재하는 경우인 경우 "상승된" 것으로 말한다. 따라서, 특히, 당해 기재내용은 특정 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 가질 위험에 처한 환자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 당해 분석 방법은 또한 다른 마커 등의 분석을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 방법은 또한 피험체가 소정의 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 가질 위험에 처해 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 구체적으로 당해 방법은:
(a) 분석물(또는 이의 단편)의 피험체로부터 시험 샘플내 농도 또는 양을 결정하는 단계(본원에 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여); 및
(b) 단계(a)에서 결정된 분석물(또는 이의 단편)의 양을, 미리 결정된 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 이때, 단계(a)에서 결정된 분석물의 농도 또는 양이 미리결정된 수준과 관련하여 선호되는 경우 피험체는 소정의 질환, 장애 또는 병태를 갖지 않거나 위험에 처하지 않는 것으로 결정된다. 그러나, 단계 (a)에서 결정된 분석물의 농도 또는 양이 미리 결정된 수준과 비선호되는 경우 피험체는 소정의 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이의 위험에 처한 것으로 결정된다.
추가로, 피험체에서 질환의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 최적으로 당해 방법은:
(a) 분석물 피험체로부터 시험 샘플내 농도 또는 양을 측정하는 단계;
(b) 분석물의 피험체로부터 후반 시험 샘플내 농도 또는 양을 측정하는 단계; 및
(c) 단계(a)에서 결정된 분석물의 농도 또는 양과 단계 ( b)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양을 비교하는 단계를 포함하고 단계 (b)에서 결정된 농도 또는 양이 단계(a)에서 결정된 분석물의 농도 또는 양과 비교하는 경우 변화되지 않거나 비선호성인 경우, 피험체내 질환은 계속되는 진행성 또는 악화된 것으로 결정된다. 비교에 의해, 단계(b)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양이 단계(a)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양과 비교하여 선호성인 경우, 피험체내 질환은 중단되거나 퇴행성이거나 개선된 것으로 결정된다.
임의로, 당해 방법은 추가로 예를 들어, 미리 결정된 수준과 단계 (b)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양을 비교함을 추가로 포함한다. 추가로, 임의로 당해 방법은 비교시 단계(b)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양이 예를 들어, 미리 결정된 수준과 비교하여 비선호성으로 변화됨을 보여주는 경우 일정 시간동안 피험체를 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료함을 포함한다.
여전히 추가로, 당해 방법은 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료받은 환자에서 치료를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 당해 방법은 피험체에 하나 이상의 약제학적 조성물을 투여하기 전에 피험체로부터 제1 시험 샘플을 제공함을 포함한다. 다음에 분석물의 피험체로부터 제1 시험 샘플에서의 농도 또는 양을 결정한다(예를 들어, 본원에 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용한다). 분석물의 농도 또는 양을 결정한 후, 임의로 분석물의 농도 또는 양을 이어서 미리 결정된 수준과 비교한다. 제1 시험 샘플에 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양이 미리 결정된 수준 보다 낮은 경우, 피험체는 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료되지 않는다. 그러나, 분석물의 농도 또는 양이 미리 결정된 수준 보다 높은 경우, 피험체는 일정 시간동안 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료된다. 피험체가 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료되는 시간은 당업자에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 시간은 약 7일 내지 약 2년일 수 있고 능히 약 14일 내지 약 1년일 수 있다).
하나 이상의 약제학적 조성물을 사용한 치료 과정 동안에, 제2 및 후속 시험 샘플을 이어서 피험체로부터 수득한다. 시험 샘플의 수 및 시험 샘플이 피험체로부터 수득되는 시간은 중요하지 않다. 예를 들어, 제2 시험 샘플은 피험체에 먼저 하나 이상의 약제학적 조성물을 투여한지 7일 후 제2 시험 샘플이 투여될 수 있고 제3 시험 샘플은 피험체에 하나 이상의 약제학적 조성물을 투여한지 2주 후 수득될 수 있고, 제4 시험 샘플은 피험체에 먼저 하나 이상의 약제학적 조성물을 투여한지 3주 후 수득될 수 있고 제5 시험 샘플은 피험체에 먼저 하나 이상의 약제학적 조성물 등을 투여한지 4주 후에 수득될 수 있다.
각각 제2 또는 후속 시험 샘플이 피험체로부터 수득된 후, 분석물의 농도 또는 양을 제2 또는 후속 시험 샘플에서 결정된다(예를들어, 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 방법을 사용한다). 제2 및 후속 샘플 각각에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양은 이어서 제1 시험 샘플(예를 들어, 본래에 임의로 미리 결정된 수준과 비교된 시험 샘플)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양과 비교한다. 단계 (c)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양이 단계(a)에서 결정된 바와 같은 분석물의 농도 또는 양과 비교하여 선호성인 경우 피험체내 질환은 중단되거나 퇴행성이거나 개선된 것으로 결정되고 피험체에는 단계 (b)의 하나 이상의 약제학적 조성물이 계속 투여되어야만 한다. 그러나, 단계 (c)에서 결정된 농도 또는 양이 단계 (a)에 결정된 분석물의 농도 또는 양과 비교하여 변화되지 않은 경우 피험체내 질환은 게속되거나 진행성이거나 악화된 것으로 결정되고 피험체는 단계 (b)에서 피험체에 보다 높은 농도의 약제학적 조성물이 투여되어 치료되어야만 하거나 피험체는 단계 (b)에서 피험체에 투여되는 하나 이상의 약제학적 조성물과는 상이한 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료되어야만 한다. 구체적으로, 당해 피험체가 피험쳉의 분석물 수준을 감소시키거나 저하시키기 위해 사전에 투여받은 하나 이상의 약제학적 조성물과는 상이한 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료될 수 있다.
일반적으로, 반복 시험이 수행될 수 있는 분석을 위해(예를 들어, 치료에 대한 질환 진행 및/또는 반응을 모니터링하기 위한), 제2 또는 후속 시험 샘플은 제1 시험 샘플이 피험체로부터 수득된 후 시점에 수득된다. 구체적으로 피험체로부터 제2 시험 샘플은 제1 시험 샘플이 피험체로부터 수득된지 수분, 수시간, 수일 또는 수년 후 수득될 수 있다. 예를 들어, 제2 시험 샘플은 피험체로부터 제1 시험 샘플이 수득된지 약 1분, 약 5 분, 약 10분, 약 15분, 약 30분, 약 45 분, 약 60 분, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 2일, 약 3일, 약 4 일, 약 5일, 약 6 일, 약 7 일, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 약 15 주, 약 16 주, 약 17 주, 약 18 주, 약 19 주, 약 20 주, 약 21 주, 약 22 주, 약 23 주, 약 24 주, 약 25 주, 약 26 주, 약 27 주, 약 28 주, 약 29 주, 약 30 주, 약 31 주, 약 32 주, 약 33 주, 약 34 주, 약 35 주, 약 36 주, 약 37 주, 약 38 주, 약 39 주, 약 40 주, 약 41 주, 약 42 주, 약 43 주, 약 44 주, 약 45 주, 약 46 주, 약 47 주, 약 48 주, 약 49 주, 약 50 주, 약 51 주, 약 52 주, 약 1.5 년, 약 2 년, 약 2.5 년, 약 3.0 년, 약 3.5 년, 약 4.0 년, 약 4.5 년, 약 5.0 년, 약 5.5. 년, 약 6.0 년, 약 6.5 년, 약 7.0 년, 약 7.5 년, 약 8.0 년, 약 8.5 년, 약 9.0 년, 약 9.5 년 또는 약 10.0 년 후 시점에 피험체로부터 수득될 수 있다.
질환 진행을 모니터링하기 위해 사용되는 경우, 상기 분석을 사용하여 급성 병태를 앓는 피험체에서 질환의 진행을 모니터링할 수 있다. 또한 임상적 치료 병병태로서 공지된 급성 병태는 예를 들어, 심혈관계 또는 분비계가 관여하는 급성, 생명 위협 질환 또는 기타 위독한 의학적 병태를 언급한다. 전형적으로, 중요한 치료 병태는 병원 기반 세팅(응급실, 중환자실, 외상후 센터 또는 기타 응급 치료 세팅을 포함하지만 이에 제한되지 않는다)에서 급성 의학적 간섭 또는 위생 또는 기타 분야별 의료진에 의한 투여를 요하는 병태를 언급한다. 위독한 치료 병태에 대해 반복 투여는 일반적으로 보다 짧은 시간 프레임내에, 즉, 수분, 수시간 또는 일(예를 들어, 약 1 분, 약 5 분, 약 10 분, 약 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 60 분, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일 또는 약 7일)에 투여되고 초기 분석은 또한 일반적으로 보다 짧은 시간 프레임내에, 예를 들어, 질환 또는 병태의 발병 약 수분, 수시간 또는 수일에 수행된다.
또한 당해 분석을 사용하여 만성 또는 비-급성 병태를 앓는 피험체에서 질환의 진행을 모니터링할 수 있다. 비-위독성 치료 또는 비-급성 병태는 예를 들어, 심혈관계 및/또는 분비계가 관여하는 급성 생명 위협 질환 또는 기타 위독한 의학적 병태 이외의 병태를 언급한다. 전형적으로, 비-급성 병태는 장기 또는 만성의 지속적인 병태를 포함한다. 비-급성 병태에 대해, 반복 모니터링은 보다 긴 시간 프레임내에, 예를 들어, 수시간, 수일, 수주, 수개월 또는 수년 (예를 들어, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 13 주, 약 14 주, 약 15 주, 약 16 주, 약 17 주, 약 18 주, 약 19 주, 약 20 주, 약 21 주, 약 22 주, 약 23 주, 약 24 주, 약 25 주, 약 26 주, 약 27 주, 약 28 주, 약 29 주, 약 30 주, 약 31 주, 약 32 주, 약 33 주, 약 34 주, 약 35 주, 약 36 주, 약 37 주, 약 38 주, 약 39 주, 약 40 주, 약 41 주, 약 42 주, 약 43 주, 약 44 주, 약 45 주, 약 46 주, 약 47 주, 약 48 주, 약 49 주, 약 50 주, 약 51 주, 약 52 주, 약 1.5 년, 약 2 년, 약 2.5 년, 약 3.0 년, 약 3.5 년, 약 4.0 년, 약 4.5 년, 약 5.0 년, 약 5.5. 년, 약 6.0 년, 약 6.5 년, 약 7.0 년, 약 7.5 년, 약 8.0 년, 약 8.5 년, 약 9.0 년, 약 9.5 년 또는 약 10.0 년)에 수행되고, 초기 분석은 또한 일반적으로 장시간 프레임내에 질환 또는 병태의 발병 약 시간, 수일, 수개월 또는 수년에 수행된다.
추가로, 상기 분석은 제1 시험 샘플이 하나의 공급원, 예를 들어, 뇨, 혈청 또는 혈장으로부터 수득되는 피험체로부터 수득된 제1 시험 샘플을 사용하여 수행될 수 있다. 임의로, 상기 분석은 이어서 제2 시험 샘플이 또 다른 공급원으로부터 수득된 피험체로부터 수득된 제2 시험 샘플을 사용하여 반복될 수 있다. 예를 들어, 제1 시험 샘플이 뇨로부터 수득된 경우, 제2 시험 샘플은 혈청 또는 혈장으로부터 수득될 수 있다. 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플을 사용한 분석으로부터 수득된 결과를 비교할 수 있다. 당해 비교를 사용하여 피험체내 질환 또는 병태의 상태를 평가할 수 있다.
더욱이, 본원의 기재는 또한 소정의 질환, 장애 또는 병태를 앓거나 예비 진단된 피험체가 치료로부터 이득을 얻을 것인지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본원의 기재는 분석물 기반 진단 방법 및 제품에 관한 것이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 "피험체내 질환 치료를 모니터링"하는 방법은 또한 추가로 최적으로 치료를 위한 후보물을 선별하거나 동정하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 특정 양태에서, 본원의 기재는 또한 소정의 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이의 위험에 처한 피험체가 치료를 위한 후보물인지를 결정하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 피험체는 소정의 질환, 장애 또는 병태의 몇몇 증상을 경험하거나 실제로 소정의 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이의 위험에 처한 것으로 진단되고/되거나 본원에 기재된 바와 같은 분석물 또는 이의 단편의 비선호성 농도 또는 양을 입증하는 피험체이다.
당해 방법은 임의로 본원에 기재된 바와 같은 분석을 포함하고 여기서 분석물은 하나 이상의 약제학적 조성물(예를 들어, 특히 분석물이 관련된 작용 기작과 관련된 약제), 면역억제 치료 또는 면역흡착 치료에 의한 피험체의 치료 전 및 후에 평가되거나 여기서, 분석물은 당해 치료 후 평가되고 분석물의 농도 또는 양은 미리 결정된 수준과 비교한다. 치료 후 관찰되는 분석물의 양의 비선호성 농도는 피험체가 추가로 또는 계속되는 치료를 받는 것으로부터 이득을 받지 못하는 것으로 확인되는 반면, 치료 후 관찰되는 분석물의 선호성 농도 또는 양은 피험체가 추가로 또는 계속되는 치료로부터 이득을 받을 것으로 확인된다. 이러한 확증은 임상적 연구의 관리 및 개선된 환자 치료를 원조한다.
본원의 특정 양태는 본원에 논의된 바와 같은 소정의 질환, 장애 또는 병태를 평가하기 위해 사용되는데 유리하지만 당해 분석 및 키트는 기타 질환, 장애 및 병태에서 분석물을 평가하기 위해 사용될 수 있는 것은 말할 필요도 없다. 분석 방법은 또한 기타 마커 등의 분석을 포함할 수 있다.
또한 분석 방법을 사용하여 소정의 질환, 장애 또는 병태를 완화시키는 화합물을 동정할 수 있다. 예를 들어, 분석물을 발현하는 세포는 후보 화합물과 접촉시킬 수 있다. 당해 화합물과 접촉된 세포에서 분석물의 발현 수준은 본원에 기재된 분석 방법을 사용하는 대조군 세포의 수준과 비교할 수 있다.
B. 키트
시험 샘플내 분석물(또는 이의 단편)의 존재, 양 또는 농도에 대한 시험 샘플을 평가하기 위한 키트가 또한 제공된다. 당해 키트는 분석물(또는 이의 단편)에 대한 시험 샘플을 평가하기 위한 하나 이상의 성분 및 분석물(또는 이의 단편)에 대해 시험 샘플을 평가하기 위한 지침서를 포함한다. 분석물(또는 이의 단편)에 대한 시험 샘플을 평가하기 위한 하나 이상의 성분은, 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질 및/또는 임의로 고형상에 고정화된 항-분석물 DVD-Ig(또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
당해 키트는 면역분석, 예를 들어, 화학발광 미세입자 면역분석에 의한 분석물에 대한 시험 샘플을 평가하기 위한 하나 이상의 성분 및 면역분석, 예를 들어, 화학발광 나노입자 면역분석에 의한 분석물에 대한 시험 샘플을 평가하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 당해 키트는 분석물에 대한 하나 이상의 특이적 결합 파트너, 예를 들어, 항-분석물, 모노클로날/폴리클로날 항체(또는 분석물에 결합할 수 있는 이의 단편, 분석물에 결합할 수 있는 이의 변이체, 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 또는 분석물에 결합할 수 있는 변이체의 단편) 또는 항-분석물 DVD-Ig(또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)을 포함할 수 있고 이중 어느 하나는 검출가능하게 표지될 수 있다. 또한 추가로, 당해 키트는 항-분석물, 모노클로날/폴리클로날 항체(또는 분석물과 결합할 수 있는 단편, 분석물과 결합할 수 있는 변이체 또는 분석물과 결합할 수 있는 변이체의 단편), 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 또는 항-분석물 DVD-Ig(또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)(이중 하나는 고형 지지체상에 고정화될 수 있다)에 결합하는 것에 대해 시험 샘플내 임의의 분석물과 경쟁할 수 있는 검출가능하게 표지된 분석물 (또는 항분석물, 모노클로날/폴리클로날 항체, 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 또는 항분석물 DVD-Ig(또는 단편, 변이체 또는 변이체의 단편))를 포함할 수 있다. 당해 키트는 캘리브레이터 또는 대조군, 예를 들어, 분리된 또는 정제된 분석물을 포함할 수 있다. 당해 키트는 분석 및/또는 완충액, 예를 들어, 분석 완충 또는 세척 완충(이중 어느 하나는 농축 용액, 검출가능한 표지(예를 들어, 효소적 표지)용 기질 용액 또는 종료 용액으로서 제공될 수 있다)을 수행하기 위해 하나 이상의 컨테이너(예를 들어, 제1 특이적 결합 파트너로 이미 피복될 수 있는 튜브, 미세적정 플레이트 또는 스트립)를 포함할 수 있다. 바람직하게는 당해 키트는 분석을 수행하기 위해 필요한 모든 성분, 즉, 시약, 표준물, 완충액, 희석제 등을 포함한다. 지침서는 종이 형태 또는 디스크, CD, DVD 등과 같은 컴퓨터 판독할 수 있는 형태일 수 있다.
보다 상세하게는, 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분, 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지된 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
또한 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 다른 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분, 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지된, 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
또한, 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 다른 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 여기서 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지된 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
또한 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 다른 키트가 제공된다. 당해 키트는 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원(또는 이의 단편)에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 (i') 4개의 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 여기서 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체(또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개의 항원(또는 이의 단편)에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지된, DVD-Ig를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함한다.
항-분석물 항체 또는 항 분석물 DVD-Ig와 같은 임의의 항체 또는 추적자는 본원에 기재된 바와 같은 검출가능한 표지, 예를 들어, 형광단, 방사성활성 잔기, 효소, 비오틴/아비딘 표지, 발색단, 화학발광 표지 등을 혼입시킬 수 있거나 당해 키트는 검출가능한 표지화를 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 항체, 캘리브레이터 및/또는 대조군은 별도의 컨테이너에 제공될 수 있거나 적당한 분석 포맷으로, 예를 들어, 미세적정 플레이트내로 제공될 수 있다.
임의로, 당해 키트는 품질 대조군 성분(예를 들어, 민감성 패널, 캘리브레이터 및 양성 대조군)을 포함한다. 품질 대조군 시약의 제법은 당업계에 널리 공지되어 있고 다양한 면역진단 제품에 대한 삽입 쉬트상에 기재된다. 민감성 패널 구성원은 임의로 분석 수행능 특성을 확립하기 위해 사용되고 임의로 추가로 면역분석 키트 시약의 통합성 및 분석의 표준화에 대해 유용한 지표이다.
당해 키트는 또한 임의로 진단 분석을 수행하거나 품질 대조군 평가를 촉진시키기 위해 요구되는 기타 시약, 예를 들어, 완충제, 염, 효소, 효소 조인자, 효소 기질, 검출 시약등을 포함한다. 완충제 및 시험 샘플의 분리 및/또는 치료용 용액(예를 들어 전처리 시약)과 같은 기타 성분들이 또한 키트에 포함될 수 있다. 당해 키트는 하나 이상의 기타 대조군을 포함할 수 있다. 키트의 하나 이상의 성분은 동결건조될 수 있고 이 경우에 당해 키트는 추가로 동결건조된 성분의 재구성을 위해 적합한 시약을 포함할 수 있다.
키트의 다양한 성분은 임의로 필요한 만큼 적합한 컨테이너, 예를 들어, 미세적정 플레이트로 제공된다. 당해 키트는 추가로 샘플을 유지하거나 저장하기 위한 컨테이너(예를 들어, 뇨 샘플용 컨테이너 또는 카트릿지)를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 당해 키트는 임의로 또한 반응 용기, 혼합 용기 및 시약 또는 시험 샘플의 제조를 촉진시키는 기타 성분을 포함할 수 있다. 당해 키트는 또한 시험 샘플을 수득하기 위한 하나 이상의 장비, 예를 들어, 시린지, 피펫, 포르셋, 측정 스푼 등을 포함할 수 있다.
검출가능한 표지가 하나 이상의 아크리디늄 화합물인 경우, 키트는 하나 이상의 아크리디늄-9-카복스아미드, 하나 이상의 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르, 또는 이의 임의의 배합물을 포함할 수 있다. 검출가능한 표지가 하나 이상의 아크리디늄 화합물인 경우, 당해 키트는 또한 과산화수소 공급원, 예를 들어, 완충액, 용액 및/또는 하나 이상의 염기성 용액을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 당해 키트는 고형상, 예를 들어, 자기 입자, 비드, 시험 튜브, 미세적정 플레이트, 큐벳, 막, 스캐폴딩 분자, 필름, 여과지, 디스크 또는 칩을 함유할 수 있다.
C. 키트 및 방법의 변형
본원에 기재된 바와 같은 면역분석과 같은 분석에 의한 시험 샘플중에 분석물의 존재, 양 또는 농도를 결정하는 방법 뿐만 아니라 키트(또는 이의 성분들)은 예를 들어, 미국 특허 제5,089,424호 및 제5,006,309호에 기재된 바와 같이 및 제조원[Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)]에서 ARCHITECT?로서 시판되는 바와 같이 다양한 자동화된 반-자동화된 시스템(고형상이 미세입자를 포함하는 것들을 포함)에 사용하기 위해 변형될 수 있다.
비자동화된 시스템(예를 들어, ELISA)과 비교하여 자동화되거나 반자동화된 시스템간의 몇몇 차이는 제1 특이적 결합 파트너(예를 들어, 항-분석물, 모노클로날/폴리클로날 항체(또는 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 변이체의 단편), 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 또는 항-분석물 DVD-Ig(또는 이의 단편, 이의 변이체 또는 변이체의 단편)이 부착되는 기질(어느 방식으로든지 샌드위치 형성 및 분석물 반응이 영향받을 수 있다) 및 포획 길이 및 시간, 검출 및/또는 임의의 선택적 세척 단계들을 포함한다. 비자동화된 포맷, 예를 들어, ELISA는 샘플 및 포획 시약과 비교적 긴 항온처리 시간(예를 들어 약 2시간)을 필요할 수 있는 반면 자동화 또는 반자동화된 포맷(예를 들어, ARCHITECT?, Abbott Laboratories)은 비교적 짧은 항온처리 시간(예를 들어, 대략 (예를 들어, ARCHITECT?에 대해 18분)을 가질 수 있다. 유사하게, 비자동화된 포맷, 예를 들어, ELISA는 비교적 긴 항온처리 시간(예를 들어, 약 2시간)동안 접합체 시약과 같은 검출 항체를 항온처리할 수 있는 반면 자동화 또는 반자동화 포맷(예를 들어, ARCHITECT?)은 비교적 짧은 항온처리 시간(예를 들어, ARCHITECT?에 대해 약 4분)을 가질 수 있다.
제조원[Abbott Laboratories]으로부터 시판되는 다른 플랫폼은 AxSYM?, IMx? (참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,294,404호), PRISM?, EIA (비드), 및 Quantum™ II, 및 기타 플랫폼을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 당해 분석, 키트 및 키트 성분들을 다른 포맷, 예를 들어, 전기화학적 또는 기타 수동 또는 포인트 오브 케어 분석 시스템에 사용될 수 있다. 본 기재내용은 예를 들어, 샌드위치 면역분석을 수행하는 시판되는 제품[Abbott Point of Care (i-STAT?, Abbott Laboratories)] 전기화학적 면역분석 시스템에 적용될 수 있다. 단일 용도 시험 장치에서 면역센서 및 이들의 제조 및 작동 방법은 예를 들어, 미국 특허 제 5,063,081호, 제7,419,821호; 및 제7,682,833호; 및 미국 특허원 공개 번호 제2004/0018577호 및 제2006/0160164호에 기재되어 있다.
특히, I-STAT? 시스템에 대한 분석물 분석 적용과 관련하여, 하기의 배열이 바람직하다. 마이크로 조립된 규소 칩은 한쌍의 골드 전류측정 작동 전극 및 실버-실버 클로라이드 표준 전극과 함께 제조된다. 작동 전극중 하나에 대해, 고정화된항-분석물, 모노클로날/폴리클로날 항체(또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체의 단편), 본문에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 또는 항-분석물 DVD-Ig(또는 이의 단편, 변이체 또는 변이체 단편)이 고정화된 폴리스티렌 비드(0.2mm 직경)을 전극에 대해 패턴화된 폴리비닐 알콜의 중합체 피복물에 부착시킨다. 이러한 칩은 면역분석에 적합한 유체공학적 포맷을 갖는 I-STAT? 카트릿지로 어셈블리된다. 카트릿지 샘플 유지 챔버 벽 부분상에 분석물에 대한 특이적 결합 파트너, 예를 들어, 항-분석물인 모노클로날/폴리클로날 항체(또는 분석물에 결합할 수 있는 이의 단편, 변이체 또는 변이체의 단편), 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 또는 항-분석물 DVD-Ig(또는 분석물에 결합할 수 있는 이의 단편, 변이체 또는 변이체의 단편)(이중 어느 하나는 검출 가능하게 표지될 수 있다)를 포함하는 층이 있다. 카트릿지의 유체 파우치내에는 p-아미노페놀 포스페이트를 포함하는 수성 시약이 있다.
작업에서, 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 시험 카트릿지의 보유 챔버에 첨가되고 당해 카트릿지는 I-STAT? 판독기로 삽입된다. 분석물에 대한 특이적 결합 파트너가 샘플에 용해된 후, 카트릿지내 펌프 요소는 샘플을, 칩을 함유하는 회로로 강제 이동시킨다. 여기서, 이것은 샌드위치의 형성을 촉진시키기 위해 진동시킨다. 분석의 끝에서 두번째 단계에서, 유체를 파우치로부터 당해 회로로 강제 배출시켜 칩으로부터 샘플을 세척하고 폐기 챔버내로 보낸다. 분석의 두번째 단계에서, 알칼린 포스파타제 표지를 p-아미노페놀 포스페이트와 반응시켜 포스페이트 그룹을 절단하고 유리된 p-아미노페놀이 작동 전극에서 전기화학적으로 산화되도록 한다. 측정된 전류를 기준으로 판독기는 내장된 알고리듬 및 공장-결정된 계산 곡선을 수단으로 샘플내 분석물의 양을 계산할 수 있다.
또한 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 키트는 필수적으로 면역분석을 수행하기 위한 다른 시약 및 방법을 포함한다. 예를 들어, 당업계에 공지되고/되거나 용이하게 제조되거나, 예를 들어, 접합체 희석제로서, 미세입자 희석제로서 및/또는 계산기 희석제로서 세척을 위해 사용되도록 최적화된 다양한 완충제가 포함된다. 예시적인 접합체 희석제는 특정 키트 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)에 사용되는 ARCHITECT? 접합체 희석제이고 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 염, 단백질 차단제, 항미생물 제제 및 세제를 함유한다. 예시적인 계산기 희석제는 특정 키트(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)에 사용되는 ARCHITECT? 인간 계산기 희석제이고 이는 MES, 기타 염, 단백질 차단제 및 항미생물제를 함유하는 완충액을 포함한다. 추가로 2008년 12월 31일자로 출원된 미국 특허원 제61/142,048호에 기재된 바와 같이 예를 들어, 시그날 증폭기로서 시그날 항체에 연결된 핵산 서열을 사용하여 I-Stat 카트릿지 포맷에서 개선된 시그날 생성이 수득될 수 있다.
본원에 기술된 방법의 다른 적합한 변형 및 적응은 명백하며 특허청구된 발명 또는 본원에 기재된 양태의 영역으로부터 벗어나지 않고 적합한 등가물을 사용하여 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 이제 본 발명을 상세히 기술하였지만, 이는, 단지 설명의 목적으로 포함되고 특허청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 다음 실시예를 참조로 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: DVD-Ig의 디자인, 작제 및 분석
실시예 1.1: 모 항체 및 DVD-Ig를 동정하고 특성 분석하기 위해 사용되는 분석
하기의 분석은 달리 언급되지 않는 경우 실시예 전반에 걸쳐 사용되어 모 항체 및 DVD-Ig를 동정하고 특성 분석하였다.
실시예 1.1.1: 이들의 표적 항원에 대한 모 항체 및 DVD-Ig의 결합 및 친화도를 결정하기 위해 사용되는 분석
실시예 1.1.1.A: ELISA
목적하는 표적 항원에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위한 효소 연결된 면역흡착 분석을 다음과 같이 수행하였다. ELISA 플레이트(Corning Costar, Acton, MA)를 포스페이트 완충 식염수(PBS)중에서 4℃에서 밤새 5OμL/웰의 5μg/ml의 염소 항-마우스 IgG Fc 특이적인(Pierce #31170, Rockford, IL)로 피복하였다. 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 1회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간동안 PBS(BioRad #170-6404, Hercules, CA)중에서 2%로 희석된 200 μL/웰 차단 용액으로 차단하였다. 플레이트를, 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 차단시킨 후 1회 세척하였다.
50 μL/웰의 예를 들면, 마우스 혈청, 하이브리도마 상층액, 또는 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma, St. Louis, MO.)을 함유하는 PBS 중에 희석시킨 항체 또는 DVD-Ig 제제를 상기에서 기술한 바와 같이 제조된 ELISA 플레이트에 가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 웰을 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중에 100ng/mL로 희석시킨 50μL의 바이오티닐화된 재조합체 정제된 표적 항원을 각각의 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 HRP(Pierce #21126, Rockland, IL.)를 0.1% PSA를 함유하는 PBS중에 1:20,000으로 희석시키고; 50μL/웰을 가하고 플레이트를 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 50μL의 TMB 용액(Sigma #T0440, St. Louis, MO)를 각각의 웰에 가하고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 1N 황산을 첨가하여 반응을 중지시킨다. 플레이트를 450nm의 파장에서 판독한다.
실시예 1.1.1.B: BIACORE 기술을 사용하는 친화도 측정
바이아코어 분석(Biacore, Inc, Piscataway, NJ)으로 결합속도 및 해리속도 상수의 역학적 측정으로 항체 또는 DVD-Ig의 친화도를 측정한다. 표적 항원(예를 들어, 정제된 재조합 표적 항원)에 대한 항체 또는 DVD-Ig의 결합은 25℃에서 Biacore? 1000 또는 3000 장치(Biacore? AB, Uppsala, Sweden)(작동 HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% 계면활성제 P20을 사용함)으로 표면 플라스몬 공명 기반 측정으로 측정한다. 모든 화학물질은 Biacore? AB (Uppsala, Sweden)로 부터 구입하거나 텍스트에 기재된 바와 같은 다른 공급원으로부터 구입한다. 예를 들어, 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에 희석된 대략 5000 RU의 염소 항-마우스 IgG, (Fcγ), 단편 특이적 폴리클로날 항체(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)는 25㎍/ml에서 제조업자의 지침 및 과정에 따라 표준 아민 커플링 키트를 사용하는 CM5 연구 등급 바이오센서 칩 전반에 걸쳐 직접 고정화시킨다. 바이오센서 표면상에 미반응된 잔기는 에탄올아민으로 차단시킨다. 플로우셀 2 및 4에서 변형된 카복시메틸 덱스트란 표면은 반응 표면으로서 사용한다. 플로우 셀 1 및 3에서 염소 항-마우스 IgG 없이 변형되지 않은 카복시메틸 덱스트란은 표준 표면으로서 사용한다. 역학적 분석을 위해, 1:1 랑그뮈르 결합 모델로부터 유래된 속도 방정식은 Biaevaluation 4.0.1 소프트웨어를 사용한 모든 8개 주사(범용 적용 분석)의 연합 및 해리 단계에 동시에 적용한다. 정제된 항체 또는 DVD-Ig는 염소 항-마우스 IgG 특이적 반응 표면에 걸친 포획을 위해 HEPES 완충 식염수에 희석시킨다. 리간드(25㎍/ml)로서 포획된 항체 또는 DVD-Ig는 5㎕/분의 유속에서 반응 매트릭스상에 주사한다. 결합 및 해리 속도 상수, kon (M-1s-1) 및 kOff (s-1)는 25㎕/분의 연속적인 유속하에 측정한다. 속도 상수는 10 내지 200nM 범위의 상이한 항원 농도에서 역학적 결합 측정을 수행함에 의해 유도된다. 항체 또는 DVD-Ig와 표적 항원간의 반응의 평형 결합 상수(M)는 이어서 하기 식에 의해 역학적 속도 상수로부터 계산한다: KD = kOff/kon. 결합은 시간의 함수로서 기록하고 역학적 속도 상수를 계산한다. 본 분석에서, 106M-1s-1로 신속한 결합 속도 및 10-6s-1로 느린 해리 속도가 측정될 수 있다.
실시예 1.1.2: 모 항체 및 DVD-Ig의 기능적 활성을 결정하기 위해 사용되는 분석
실시예 1.1.2.A: 사이토킨 생분석
항-사이토킨 또는 항-성장 인자 모 항체 또는 항-사이토킨 또는 항-성장 인자 서열을 함유하는 DVD-Ig가 표적 사이토킨 또는 성장 인자 생화성을 억제하거나 중화시키는 능력은 항체 또는 DVD-Ig의 억제 능력을 결정함에 의해 분석한다. 예를들어, IL-4 매개된 IgE 생성을 억제하는 항-IL-4 항체의 능력을 사용할 수 있다. 예를들어, 인간 순수 B 세포는 피콜-플라크 밀도 원심분리에 이어서 인간 sIgD FITC 표지된 염소 F(ab)2 항체에 대해 특이적인 MACS 비드(Miltenyi Biotec)에 이어서 항-FITC MACS 비드를 사용한 자기적 분리에 의해 각각 말초 혈액, 연막으로 부터 분리한다. 자기적으로 분류된 순수 B 세포는 XV15에서 ml당 3 x 105 세포로 조정하고 5% CO2의 존재하에 37℃에서 배양 10일동안에 PBS 채워진 웰에 의해 둘려싸여진 플레이트의 중앙에 6 x 6 배열로 96웰 플레이트 웰당 100 μl로 분주하였다. 각각의 하나의 플레이트는 시험될 항체당 제조하고 각각 비유도된 및 유도된 대조군, 및 7㎍/ml에서 시작하여 항체 적정의 4회 반복체 및 50㎕ 4회 농축된 예비 희석에 첨가된 29ng/ml 최종 농도로 하향된 3배 희석으로의 작동의 각각의 3개의 웰로 이루어진다. IgE 생산을 유도하기 위해, 20ng/ml에서 rhIL-4 및 50㎕ 중의 0.5ug/ml 최종 농도에서 항-CD40 모노클로날 항체(Novartis) 각각을 각각의 웰에 첨가하고 IgE 농도는 표준 샌드위치 ELISA 방법에 의한 배양 시기의 말기에 측정한다.
실시예 1.1.2.B: 사이토킨 방출 분석
사이토킨 방출을 유발하는 모 항체 또는 DVD-Ig의 능력을 분석한다. 말초 혈액을 혈관구멍에 의해 헤파린 처리된 혈관 튜브내로 3명의 건강한 공여자로부터 인출한다. 전혈을 RPMI-1640 배지로 1:5로 희석하고 웰당 0.5ml에서 24웰 조직 배양 플레이트에 첨가한다. 항-사이토킨 항체(예를들어, 항-IL-4)를 RPMI-1640상으로 희석하고 200, 100, 50, 10, 및 1 μg/mL의 최종 농도가 되도록 0.5mL/웰로 플레이트에 첨가한다. 배양 플레이트내 전혈의 최종 희석은 1:10이다. LPS 및 PHA를 사이토킨 방출을 위한 양성 대조군으로서 별도의 웰에 2 μg/mL 및 5 μg/mL의 최종 농도로 가한다. 폴리클로날 인간 IgG를 네가티브 대조군 항체로서 사용한다. 당해 실험을 2회 수행한다. 플레이트를 5% CO2에서 37℃에서 배양한다. 24시간 후 웰의 내용물을 시험관으로 옮기고 1200rpm에서 5분동안 회전시킨다. 무세포 상등액을 수거하고 사이토킨 분석을 위해 동결시킨다. 플레이트상 및 튜브내에 잔류하는 세포를 0.5 mL의 용해 용액으로 용해시키고 -20℃에 놓고 해동시킨다. 0.5 mL의 배지를 첨가하고(용량이 무세포 상등액 샘플과 동일한 수준이 되도록 하면서) 세포 제제를 수거하고 사이토킨 분석을 위해 동결시킨다. 세포 부재 상등액 및 세포 용해물을 ELISA에 의해 사이토킨 수준, 예를 들어, IL-8, IL-6, IL-1β, IL-1RA, TNF-α 수준에 대해 분석한다.
실시예 1.1.2.C: 사이토킨 교차-반응성 연구
목적하는 사이토킨에 대해 지시된 항-사이토킨 모 항체 또는 DVD-Ig가 기타 사이토킨과 교차 반응하는 능력을 분석한다. 모 항체 또는 DVD-Ig를 바이아코어(BIAcore) 바이오센서 매트릭스상에 고정화시킨다. 항-인간 Fc mAb를 유리 아민 그룹을 통해 10OmM N-하이드록시숙신이미드(NHS) 및 40OmM N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 함께 매트릭스 상에 제1 활성화 카복실 그룹에 의해 덱스트란 매트리그로 공유 결합시킨다. 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에서 희석된 25㎍/ml의 농도에서 각각의 항체 또는 DVD-Ig 제제 각각의 대략 50μL를 활성화된 바이오센서를 거쳐 주사하고 단백질상의 유리 아민을 활성화된 카복실 그룹으로 직접 결합시킨다. 전형적으로, 5000 공명 유니트(RU's)를 고정화시킨다. 미반응된 매트릭스 EDC-에스테르를 1M 에탄올아민의 주사에 의해 불활성화시킨다. 1초 유속 세포를 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 인간 IgG1/K를 고정화시킴에 의해 표준 물질로서 제조한다. SPR 측정은 CM 바이오센서 칩을 사용하여 수행한다. 바이오센서 표면상에 분석될 모든 항원은 0.01% P20을 함유하는 HBS-EP 작동 완충액중에 희석시킨다.
사이토킨 특이성을 조사하기 위해, 목적하는 과량의 사이토킨(10OnM, 예를들어, 가용성 재조합 인간)을 항-사이토킨 모 항체 또는 DVD-Ig 고정화된 바이오센서 표면(5분 접촉 시간)에 걸쳐 주사한다. 목적하는 사이토킨의 주사 전 및 이후 즉시, HBS-EP 완충액 단독을 각각의 유동 셀을 통해 유동시킨다. 사이토킨 주입 완료 후 대략 30초에 상응하는 시점 및 기준선간의 총 차이는 최종 결합 값을 나타내도록 취한다. 다시, 당해 반응은 공명 유니트로 측정한다. 바이오센서 매트릭스는 결합 반응이 관찰되는 다음 샘플의 주사 전에 10mM HCl을 사용하여 소행시키거나 작동 완충액을 매트릭스상에 주사하였다. 인간 사이토킨(예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-1l, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-27, TNF-α, TNF-β, 및 IFN-γ)은 또한 동시에 고정화된 마우스 IgG1/K 표준 표면상에 주사하여 임의의 비특이적 결합 배경을 기록한다. 표준 및 반응 표면을 제조함에 의해, 바이아코어는 굴절 지수 변화 및 주사 노이즈의 대부분을 제거하기 위해 반응 표면으로부터 참조 표면 데이터를 자동적으로 공제할 수 있다. 따라서, 항-사이토킨 항체 또는 DVD-Ig 결합 반응으로 인한 튜브 결합 반응을 확인할 수 있다.
목적하는 사이토킨이 고정화된 항-사이토킨 항체를 거쳐 주사되는 경우, 상당한 결합이 관찰된다. 1OmM HCl 소생은 완전히 모든 비-공유 결합된 단백질을 제거한다. 센서그람의 조사는 가용성 사이토킨에 결합하는 고정화된 항-사이토킨 항체 또는 DVD-Ig가 강함을 보여준다. 목적하는 사이토킨과 예상된 결과를 확인 한 후 재조합 인간 사이토킨을 잔류하는 패널을 각각의 항체 또는 DVD-Ig에 대해 별도로 시험한다. 각각의 주사 사이클에 대해 항-사이토킨 항체 또는 DVD-Ig 결합되거나 미결합된 사이토킨의 양을 기록한다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 결과를 사용하여 각각의 항체 또는 DVD-Ig의 특이성 프로필을 결정한다. 목적하는 사이토킨에 대한 예상되는 결합을 갖고 임의의 다른 사이토킨에는 결합하지 하지 않는 항체 또는 DVD-Ig를 선별한다.
실시예 1.1.2.D: 조직 교차 반응성
조직 교차 반응성 연구는 3단계로 수행하고 제1 단계는 32개 조직의 냉동절편을 포함하고, 제2 단계는 38개 이하의 조직을 포함하고 제3 단계는 하기에 기재된 바와 같은 관련없는 3명의 성인으로부터의 추가의 조직을 포함한다. 연구는 통상 2개의 용량 수준에서 수행된다.
단계 1: 인간 조직(부검 또는 생검으로부터 수득된 하나의 인간 공여자 기원의 32개 조직(전형적으로, 부신, 위장관, 전립선, 방광, 심장, 골격근, 혈액 세포, 신장, 피부, 골수, 간, 척수, 유방, 폐, 비장, 소뇌, 림프절, 고환, 대뇌피질, 난소, 흉선, 결장, 췌장, 갑상선, 내피, 부갑상선, 수뇨관, 안구, 뇌하수체, 나팔관 및 태반))의 냉동절편(약 5 μm)을 대물 글래스상에 고정시키고 건조시킨다. 조직 절편의 퍼옥시다제 염색은 아비딘-비오틴 시스템을 사용하여 수행한다.
단계 2: 부검 또는 생검에서 수득된 3명의 비관련 성인 기원의 38개 조직(부신, 혈액, 혈관, 골수, 소뇌, 대뇌, 자궁경관, 식도, 안구, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 유방 유선, 난소, 난관, 췌장, 부갑상선, 말초 신경, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 횡문근, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 수뇨관, 뇨 방광 및 자궁을 포함함) 기원의 인간 조직의 냉동절편(약 5 μm)을 대물 글래스상에 고정시키고 건조시킨다. 조직 절편의 퍼옥시다제 염색은 아비딘-비오틴 시스템을 사용하여 수행한다.
단계 3: 부검 또는 생검에서 수득된 3명의 비관련 성숙한 원숭이 기원의 38개 조직(부신, 혈액, 혈관, 골수, 소뇌, 대뇌, 자궁경관, 식도, 안구, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 유방 유선, 난소, 난관, 췌장, 부갑상선, 말초 신경, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 횡문근, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 수뇨관, 뇨 방광 및 자궁을 포함함) 기원의 시노몰구스 원숭이 조직의 냉동절편(약 5 μm)을 대물 글래스상에 고정시키고 건조시킨다. 조직 절편의 퍼옥시다제 염색은 아비딘-비오틴 시스템을 사용하여 수행한다.
항체 또는 DVD-Ig는 제2 비오티닐화된 항-인간 IgG로 항온처리하고 면역 복합체가 되도록 한다. 항체 또는 DVD-Ig의 최종 농도 2 및 10 μg/mL에서 면역 복합체를 대물 글래스상의 조직 절편상으로 첨가함에 이어서 조직 절편을 아비틴-비오틴 퍼옥시다제 키트를 사용하여 30분동안 반응시킨다. 후속적으로, 퍼옥시다제 반응을 위한 기질인 DAB (3,3'-디아미노벤지딘)은 조직 염색을 위해 4분동안 적용한다. 항원-세파로스 비드를 양성 대조군 조직 절편으로서 사용한다. 표적 항원 및 인간 혈청 차단 연구는 추가의 대조군으로서 작용한다. 항체 또는 DVD-Ig의 최종 농도 2 및 10 μg/mL에서의 면역 복합체는 표적 항원(최종 농도 100 μg/ml) 또는 인간 혈청(최종 농도 10%)과 미리 30분동안 항온처리함에 이어서 대물 글래스상의 조직 절편상으로 첨가함에 이어서 조직 절편을 30분동안 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 키트와 반응시킨다. 후속적으로, 퍼옥시다제 반응을 위한 기질인 DAB (3,3'-디아미노벤지딘)을 조직 염색을 위해 4분동안 적용한다.
임의의 특이적 염색은 미지의 표적 항원의 공지된 발현시 예상치 않은 반응성 또는 예상된(예를 들어, 항원 발현과 일치) 것으로 판단된다. 특정 판단된 염색은 강도 및 횟수에 대해 스코어한다. 단계 2(인간 조직)와 단계 3(시노몰구스 원숭이 조직) 사이의 조직 염색은 유사하거나 상이한 것으로 판단된다.
실시예 1.1.2.E: 시험관내 모 또는 DVD-Ig 항체의 살종양 효과
종양 세포상의 표적 항원에 결합하는 모 항체 또는 DVD-Ig 항체는 살종양 활성에 대해 분석될 수 있다. 간략하게, 모 항체 또는 DVD-Ig 항체는 D-PBS-BSA (0.1% BSA를 갖는 듈베코 포스페이트 완충 식염수)에 희석시키고 최종 농도 0.01 μg/mL 내지 100 μg/mL 200μL로 인간 종양 세포에 첨가한다. 당해 플레이트를 3일동안 습한 5% CO2 대기에서 37℃에서 항온처리한다. 각각의 웰에서 생존 세포 수를 제조업자의 지침에 따라 MTS 시약을 사용하여 정량하고 종양 성장 억제%를 측정한다. 항체 처리되지 않은 세포를 0% 억제의 대조군으로서 사용하는 반면 세포가 없는 세포를 100% 억제를 보여주는 것으로 고려한다.
아폽토시스 평가를 위해, 카스파제-3 활성화는 하기의 프로토콜을 사용하여 측정한다: 96웰 플레이트에서 항체 처리된 세포는 120 μl의 1 x 용해 완충액(1.67mM Hepes, pH 7.4, 7mM KCl, 0.83mM MgCl2, 0.11mM EDTA, 0.11mM EGTA, 0.57% CHAPS, 1mM DTT, 1 x 프로테아제 억제제 칵테일 정제; EDTA-부재; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ)중에서 실온에서 20분동안 진탕시키면서 용해시킨다. 세포 용해 후, 80 μl의 카스파제-3 반응 완충액(48mM Hepes, pH 7.5, 252mM 슈크로스, 0.1 % CHAPS, 4mM DTT, 및 20 μM Ac-DEVD-AMC 기질; Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 2시간동안 항온처리한다. 당해 플레이트를 하기의 셋팅을 사용하여 1420 VICTOR 다중 표지 계수기(Perkin Elmer Life Sciences, Downers Grove, IL)상에서 판독한다: 여기= 360/40, 방출= 460/40. 이소타입 항체 대조군 처리된 세포와 비교하여 항체 처리된 세포 기원의 형광 단위의 증가가 발견되며, 이는 아폽토시스를 나타낸다.
실시예 1.1.2.F: 시험관내 항체 또는 DVD-Ig에 의한 수용체 활성화의 억제
세포 수용체 또는 이들의 리간드에 결합하는 모 항체 또는 DVD-Ig를 수용체 활성화의 억제를 위해 시험할 수 있다. D-PBS-BSA (0.1% BSA를 갖는 듈베코 포스페이트 완충 식염수)중에 희석된 모 항체 또는 DVD-Ig를 최종 농도 0.01 μg/mL-100 μg/mL로 인간 암종 세포에 첨가한다. 플레이트를 습윤화된, 5% CO2 대지 중에서 1시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 성장 인자(예: IGF1 또는 IGF2)를 1-1OOng/mL의 농도로 세포에 5 내지 15분 동안 첨가하여 수용체(예: IGF1R) 자동포스포릴화를 자극한다. 항체 처리하지 않은 웰을 0% 억제율의 대조군으로 사용하는 반면, 성장인자 자극이 없는 웰은 100% 억제율을 나타내는 것으로 고려된다. 세포 용해물은 세포 추출 완충액 (10 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM 나트륨오르토바나데이트, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 0.1% SDS, 및 프로테아제 억제제 칵테일)로 항온처리하여 제조한다. 이들 세포 용해물중의 포스포-IGF1R은 R&D 시스템에서 구입한 특이적인 ELISA 키트를 사용하여 측정한다.
실시예 1.1.2.G: 인간 암종 이종이식체(옆구리 피하, 정위 또는 자연발생적인 전이)의 성장에 대한 단독 또는 화학치료요법과 조합된 항-종양 세포 항원 항체 또는 DVD-Ig의 효능
인간 암세포를 생체내에서 조직 배양 플라스크에서 99% 생존력, 85% 컨플루언스까지 성장시킨다. 19 내지 25g의 SCID 암컷 또는 수컷 마우스(Charles Rivers Labs, Wilmington, MA)를 귀 태그하고 면도한다. 마우스를 이후에 연구 0일째에 오른쪽 옆구리에 2ml의 2 x 106 인간 종양 세포 (1:1 마트리겔)을 피하 주사한다. 비히클(PBS), 항체 또는 DVD-Ig 및/또는 화학치료요법의 투여(IP, Q3D/주)는 마우스를 평균 종양 용적이 대략 150 내지 200 mm3인 마우스 그룹으로 크기별로 일치시킨 후 개시하였다. 종양을 접종 후 약 10일경에 시작하여 주당 2회 한쌍의 캘리퍼(caliper)로 측정하고 종양 용적은 수학식 V = L x W2/2 (V: 용적, mm3; L: 길이, mm; W: 너비, mm)에 따라 계산하였다. 종양 용적의 감소는 비히클 또는 이소타입 대조군 mAb만을 투여받은 동물에서의 종양과 비교하여 항체 또는 DVD-Ig 단독 또는 화학치료요법과 조합gkdu 처리된 동물에서 나타난다.
실시예 1.1.2.H: 유동 세포측정에 의해 평가된 바와 같이 인간 종양 세포주의 표면으로의 모노클로날 항체의 결합
목적하는 세포 표면 항원을 과발현하는 안정한 세포주 또는 인간 종양 세포주를 조직 배양 플라스크로부터 수거하고 5% 태아 송아지 혈청(PBS/FCS)를 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 재현탁시켰다. 염색 전에, 인간 종양 세포를 빙상에서 PBS/FCS중의 인간 IgG 200μg/ml로 항온처리하였다. 1-5 x lO5 세포를 빙상에서 30 내지 60분동안 PBS/FCS에서 항체 또는 DVD-Ig(1-2 μg/mL)로 항온처리하였다. 세포를 2회 세척하고 lOOμl의 염소 항 마우스 IgG, 피코에리트린(PBS/BSA 중의 1:300 희석) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat.# 115-115-164)을 첨가하였다. 빙상에서 30분 항온처리한 후, 세포를 3회 세척하고 PBS/FCS중에 재현탁시켰다. 형광을 Becton Dickinson FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 측정하였다.
실시예 1.2: 목적하는 인간 항원에 대한 모 모노클로날 항체의 생성
목적하는 인간 항원에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 모 마우스 mAb 및 이의 변이체를 다음과 같이 수득하였다:
실시예 1.2.A: 목적하는 인간 항원을 사용한 마우스의 면역화
완전 프룬트 보조제 또는 면역분석 보조제 (Qiagen, Valencia, CA)와 혼합된 20㎍의 재조합 정제된 인간 항원(예를 들어, IGF 1,2)을 1일째에 5마리의 6-8 주령 Balb/C, 5마리의 C57B/6 마우스, 및 5마리의 AJ 마우스로 피하 주사하였다. 24일, 38일 및 49일째에, 불완전 프룬트 보조제 또는 면역분석 보조제와 혼합된 20㎍의 재조합 정제된 인간 항원 변이체를 동일한 마우스에 피하 주사한다. 84일째 또는 112일째 또는 144일째에, 마우스를 목적하는 1ug의 재조합 정제된 인간 항원으로 정맥내 주사한다.
실시예 1.2.B: 하이브리도마의 생성
실시예 1.2.A에 기재된 면역화된 마우스로부터 수득된 비장세포는 문헌[참조: Kohler, G. and Milstein (1975) Nature, 256:495]에 기재된 확립된 방법에 따라 5:1의 비율로 SP2/O-Ag-14 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성한다. 웰당 2.5 x 106 비장 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에서 아자세린 및 하이포산틴을 함유하는 선택 배지에 플레이팅하였다. 융합한지 7일 내지 10일 후, 거시적 하이브리도마 콜로니를 관찰한다. 하이브리도마 콜로니를 함유하는 각각의 웰 기원의 상등액은 목적하는 항원에 대한 항체의 존재에 대해 ELISA로 시험한다(실시예 1.1.1.A에 기재된 바와 같이). 항원-특이적 활성을 나타내는 상등액을 이어서 활성(실시에 1.1.2의 분석에 기재된 바와 같이), 예를 들어, 실시예 1.1.2.I에 기재된 바와 같이 생분석에서 목적하는 항원을 중화시키는 능력에 대해 시험한다.
실시예 1.2.C: 목적하는 인간 표적 항원에 대한 모 모노클로날 항체의 동정 및 특성 분석
실시예 1.2.C.1: 모 모노클로날 항체 중화 활성의 분석
하이브리도마 상등액은 실시예 1.2.A 및 1.2.B에 따라 생성된 목적하는 항원에 결합하고 또한 목적하는 항원의 변이체("항원 변이체")에 결합할 수 있는 모 항체의 존재에 대해 분석한다. 2개 분석에서 양성인 항체를 갖는 상등액은 이어서 예를 들어, 실시예 1.1.2.I의 사이토킨 생분석에서 이들의 항원 중화 효능에 대해 시험한다. 생분석에서 1,000pM 미만, 하나의 양태에서, 100pM 미만의 IC50 값으로 항체를 생성하는 하이브리도마는 제한 희석에 의해 스케일 업하고 클로닝한다. 하이브리도마 세포를 10% 낮은 IgG 태아 소 혈청(Hyclone #SH30151, Logan, UT)을 함유하는 배지로 증식시킨다. 평균적으로, 250 mL의 각각의 하이브리도마 상등액(클론 집단으로부터 유래함)을 문헌[참조: Harlow, E. and Lane, D. 1988 "Antibodies: A Laboratory Manual"]에 기재된 바와 같이 수거하고 농축시키고 정제한다. 표적 항원의 활성을 억제하는 정제된 mAb의 능력은 예를 들어, 실시예 1.1.2.I에 기재된 바와 같은 사이토킨 생분석을 사용하여 측정한다.
실시예 1.2.C.2: 목적하는 시노몰구스 표적 항원에 대한 모 모노클로날 항체 교차 반응성의 분석
본원에 기재된 선별된 mAb가 목적하는 시노몰구스 항원을 인지하는지의 여부를 측정하기 위해, 본원(실시예 1.1.1.G)에 기재된 바와 같이 재조합 시노몰구스 표적 항원을 사용하여 BIACORE 분석을 수행한다. 또한, 목적하는 재조합 시노몰구스 항원에 대한 mAb의 중화 효능은 또한 사이토킨 생분석(실시예 1.1.2.I)에서 측정할 수 있다. 양호한 cyno 교차 반응성(하나의 양태에서, 인간 항원의 반응성의 5배 이내)을 갖는 MAb는 향후 특성 분석을 위해 선별한다.
실시예 1.2.D: 각각의 쥐 항-인간 모노클로날 항체에 대한 가변 영역의 아미노산 서열의 측정
cDNA의 분리, 재조합 항-인간 마우스 mAb의 발현 및 특성 분석은 다음과 같이 수행한다. 각각의 아미노산 서열 측정을 위해, 대략 1 x 106 하이브리도마 세포를 원심분리로 분리하고 프로세싱하여 제조업자의 지침에 따라 트리졸(Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.)을 사용하여 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 제조업자의 지침에 따라 Superscript 제1 쇄 합성 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제1 쇄 DNA 합성에 적용한다. 올리고(dT)를 사용하여 제1 쇄 합성을 프라이밍하여 폴리(A)+ RNA에 대해 선별한다. 제1 쇄 cDNA 생성물은 이어서 쥐 면역글로불린 가변 영역 (Ig-프라이머 세트, Novagen, Madison, WI)의 증폭을 위해 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨다. PCR 생성물을 아가로스 겔상에서 분리하고 절단하고 정제함에 이어서 TOPO 클로닝 키트를 사용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 서브클로닝하고 TOP10 화학적 컴피턴트 이.콜라이(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 형질전환시킨다. 콜로니 PCR은 형질전환체상에서 수행하여 삽입체를 함유하는 클론을 동정한다. 플라스미드 DNA를 QIAprep 미니프렙 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 삽입체를 함유하는 클론으로부터 분리한다. 플라스미드내 삽입체를 양 쇄에 대해 서열 분석하여 M13 정배향 및 M13 역배향 프라이머 (Fermentas Life Sciences, Hanover MD)를 사용하여 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 DNA 서열을 측정한다. mAb의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 동정한다. 하나의 양태에서, 다음 단계로의 전개(인간화)를 위해 선행 mAb의 판넬에 대한 선별 기준은 다음을 포함한다:
■ 항체는 CH2내 표준물을 제외하고는 임의의 N-연결된 당화 부위(NXS)를 함유하지 않는다.
■ 항체는 항체 마다 정상적인 시스테인에 추가로 임의의 여분의 시스테인을 함유하지 않는다.
■ 항체 서열은 VH 및 VL에 대한 가장 밀접한 인간 배선 서열과 정렬시키고 임의의 범상한 아미노산은 다른 천연 인간 항체에서의 존재에 대해 검사되어야만 한다.
■ N-말단 글루타민(Q)은 이것이 항체의 활성에 영향을 주지 않는다면 글루탐산(E)로 대체시킨다. 이것은 Q의 폐환으로 인해 이종성을 감소시킬 것이다
■ 효율적인 시그날 서열 절단은 질량 분광측정기로 확인한다. 이것은 COS 세포 또는 293 세포 물질로 수행할 수 있다
■ 단백질 서열은 실활시킬 수 있는 Asn의 탈아미드화의 위험성에 대해 검사한다
■ 항체는 저수준의 응집을 갖는다
■ 항체는 >5-10 mg/ml용해도(연구단계에서) ; >25 mg/ml의 용해도를 갖는다.
■ 항체는 동력 광 산란(DLS)에 의한 표준 크기((5-6 nm)를 갖는다
■ 항체는 낮은 전하 이종성을 갖는다.
■ 항체는 사이토킨 분비가 없다(참조: 실시예 1.1.2.B)
■ 항체는 의도된 사이토킨에 대해 특이성을 갖는다(참조: 실시예 1.1.2.C)
■ 항체는 예상된 조직 교차 반응성이 없다(참조: 실시예 1.1.2.D)
■ 항체는 인간과 시노몰구스 조직 교차 반응성간에 유사성을 갖는다(참조: 실시예 1.1.2.D)
실시예 1.2.2: 재조합 인간화된 모 항체
실시예 1.2.2.1: 재조합 키메라 항 인간 모 항체의 작제 및 발현
마우스 항-인간 모 mAb의 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA는 세균에서 상동성 재조합에 의해 2 힌지-영역 아미노산 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역을 암호화하는 cDNA 단편으로 대체한다. 이들 돌연변이는 234 위치(EU 넘버링)에서 류신의 알라닌으로의 대체이고 235위치에서 류신의 알라닌으로의 대체이다(문헌참조: Lund et al. (1991), J. Immunol., 147:2657). 3개 항체 각각의 경쇄 불변 영역은 인간 카파 불변 영역으로 대체한다. 전장 키메라 항체는 pBOS 발현 플라스미드 (Mizushima and Nagata (1990) Nucl. Acids Res. 18: pg 5322)로 연결된 키메라 중쇄 및 경쇄 cDNA의 동시 형질감염에 의해 COS 세포에서 일시적으로 발현된다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상등액을 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체를 산 완충액의 첨가로 용출시킨다. 항체를 중화시키고 PBS내로 투석시킨다.
키메라 mAb를 암호화하는 중쇄 cDNA를 이의 키메라 경쇄 cDNA (이 둘다는 pBOS 벡터에서 연결된다)와 함께 COS 세포내로 동시 형질감염시킨다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상등액은 단백질 A 세파로스 크로마토그래피에 의해 정제하고 결합된 항체를 산 완충액의 첨가로 용출시킨다. 항체를 중화시키고 PBS내로 투석시킨다.
정제된 키메라 항-인간 환자 mAb를 이어서 결합하는 능력(바이어코어에 의해) 및 기능성 활성, 예를 들어, 실시예 1.1.1.G 및 1.1.2.B에 기재된 바와 같은 IgE의 사이토킨 유도된 생산을 억제하는 능력에 대해 시험한다. 모 하이브리도마 mAb의 활성을 유지하는 키메라 mAb는 추가의 전개를 위해 선별한다.
실시예 1.2.2.2: 인간화된 항 인간 모 항체의 작제 및 발현
실시예 1.2.2.2.A: 인간 항체 골격의 선별
각각의 쥐 가변 중쇄 및 가변 경쇄 유전자 서열은 별도로 벡터 NTI 소프트웨어를 사용하여 44개 인간 면역글로불린 배선 가변 중쇄 또는 46개 배선 가변 경쇄 서열(NCBI Ig Blast 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.로부터 유래됨)에 대해 정렬시킨다.
인간화는 아미노산 서열 상동성, CDR 클러스터 분석, 발현된 인간 항체중에서 사용 횟수 및 인간 항체의 결정 구조에 대한 가용한 정보를 기초로 한다. 항체 결합, VH-VL 쌍형성 및 기타 인자에 대한 가능한 효과를 고려하여, 쥐 잔기를 인간 잔기로 돌연변이시키고 여기서 쥐 및 인간 골격 잔기는 몇가지를 제외하고는 상이하다. 추가의 인간화 전략은 쥐 항체 가변 영역의 아미노산 서열과 고도의 상동성, 즉 서열 유사성을 갖는 인간 배선 항체 서열 또는 이의 서브그룹을 기초로 디자인한다.
상동성 모델링을 사용하여 항체 결합 부위, CDR의 구조에 중요한 것으로 예상되는 쥐 항체 서열에 독특한 잔기를 동정한다. 상동성 모델링은 컴퓨터 방법으로서 이에 의해 대략적인 3차원 배위가 단백질에 대해 생성된다. 이들의 배위의 출처 및 추가 쇄신을 위한 가이드는 제2 단백질인 참조 단백질이고 이에 대한 3차원 배위는 공지되어 있고 이의 서열은 제1 단백질의 서열과 관련된다. 2개 단백질의 서열간의 관계를 사용하여 참조 단백질 및 이에 대한 배위가 요망되는 단백질인 표준 단백질간에 상응성을 생성시킨다. 참조 및 표적 단백질의 1차 서열은 표준 단백질로부터 표적 단백질로 직접 전달된 2개 단백질의 동일한 부분의 배위로 정렬한다. 2개 단백질의 불일치 부분, 예를 들어, 잔기 돌연변이, 삽입 또는 결실로부터의 불일치 부분에 대한 배위는 일반적인 구조 주형 및 이미 전달된 모델 배위와의 일치성을 보장하기 위해 개량된 에너지로부터 작제한다. 이러한 컴퓨터 단백질 구조는 모델링 연구에서 추가로 개량되거나 직접적으로 사용될 수 있다. 모델 구조의 질은 표준 및 표적 단백질이 관련되는 내용의 정확성 및 서열 정렬이 작제되는 정밀성에 의해 결정된다.
쥐 mAb에 대해, BLAST 탐색 및 육안 조사의 조합을 사용하여 적합한 표준 구조를 동정한다. 표준 및 표적 아미노산 서열간의 25%의 서열 동일성은 상동성 모델링 관행을 시도하는데 필요한 최소값으로 고려된다. 서열정렬은 수동으로 작제하고 모델 배위는 프로그램 Jackal로 생성시킨다(문헌참조: Petrey, D. et al. (2003) Proteins 53 (Suppl. 6): 430-435).
선택된 항체의 쥐 및 인간 골격 영역의 1차 서열은 상당한 동일성을 공유한다. 상이한 잔기 위치는 쥐 항체의 관찰된 결합 효능을 보유하기 위해 인간화된 서열에서 쥐 잔기 내포에 대한 후보이다. 인간과 쥐 서열간에 상이한 골격 잔기의 목록은 수동으로 작제한다.
주어진 골격 잔기가 항체의 결합 성질에 영향을 줄 가능성은 CDR 잔기로의 이의 접근성에 의존한다. 따라서, 모델 구조를 사용하여, 쥐와 인간 서열간에 상이한 잔기는 CDR 내 임의의 원자로부터 이들의 거리에 따라 등급화된다. 임의의 CDR 원자의 4.5Å내에 있는 잔기가 가장 중요한 것으로 동정되고 인간화된 항체(즉, 역돌연변이)내 쥐 잔기의 보유에 대한 후보물로 추천된다.
특히, 작제된 인간화된 항체는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 작제된다. 각각의 가변 영역 cDNA에 대한, 60 내지 80개 뉴클레오타이드의 6개 올리고뉴클레오타이드 각각은 각각의 올리고뉴클레오타이드의 5' 및/또는 3' 말단에서 20개 뉴클레오타이드까지 서로 중첩하도록 디자인한다. 어닐링 반응에서, 모든 6개 올리고뉴클레오타이드를 dNTP의 존재하에 조합하고, 비등시키고 어닐링시킨다. DNA 폴리머라제 I, 대형(Klenow) 단편(New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.)을 중첩 올리고뉴클레오타이드 간에 대략 40bp의 갭을 채우도록 첨가한다. 변형된 pBOS 벡터에서 다중 클로닝 부위에 상보적인 오버행 서열을 함유하는 2개의 최외곽 프라이머를 사용하는 PCR을 수행하여 전체 가변 영역 유전자를 증폭시킨다(문헌참조: Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 17). 각각의 cDNA 어셈블리로부터 유래된 PCR 생성물을 아가로스 겔상에서 분리하고 예측된 가변 영역 cDNA 크기에 상응하는 밴드를 절개하고 정제한다. 가변 중쇄 영역을 세균에서 상동성 재조합에 의해 2개 힌지-영역 아미노산 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역을 암호화하는 cDNA 단편상으로 프레임내 삽입한다. 이들 돌연변이는 234번 위치(EU 넘버링)에서 류신의 알라닌의 대체 및 235번 위치에서 류신의 알라닌으로의 대체이다(문헌참조: Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657). 가변 경쇄 영역은 상동성 재조합에 의해 인간 카파 불변 영역과 함께 프레임내 삽입한다. 세균 콜로니를 분리하고 플라스미드 DNA를 추출한다. cDNA 삽입물은 이들의 전체를 서열 분석한다. 각각의 항체에 상응하는 올바른 인간화된 중쇄 및 경쇄를 COS 세포내로 동시 형질감염시켜 일시적으로 전장 인간화된 항-인간 항체를 제조한다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상등액은 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체를 산 완충액을 첨가하여 용출시킨다. 항체는 중화시키고 PBS내로 투과시킨다.
실시예 1.2.2.3: 인간화된 항체의 특성 분석
기능적 활성을 억제하는 정제된 인간화된 항체의 능력은 예를 들어, 실시예 1.1.2.A에 기재된 바와 같은 사이토킨 생분석을 사용하여 측정한다. 재조합 인간 항원에 대한 인간화된 항체의 결합 친화도은 실시예 1.1.1.B에 기재된 바와 같은 표면 플라스몬 공명 (Biacore?) 측정을 사용하여 결정한다. 인간화된 항체의 생분석 및 친화도로부터의 IC50 값을 등급화한다. 모 하이브리도마 mAb의 활성을 완전히 유지하는 인간화된 mAb는 향후 전개를 위한 후보물로서 선택한다. 최상의 2 내지 3개의 가장 선호되는 인간화된 mAb는 추가로 특징 분석한다.
실시예 1.2.2.3.A: 인간화된 항체의 약리역학적 분석
약리역학적 연구는 스프라그 돌리 랫트 및 시노몰구스 몽키에서 수행한다. 수컷 및 암컷 랫트 및 시노몰구스 몽키에게 단일 용량의 4mg/kg mAb를 정맥내 또는 피하 투여하고 샘플을 항원 포획 ELISA를 사용하여 분석하고 약리역학적 파라미터를 비격막 분석에 의해 측정한다. 간략하게, ELISA 플레이트를 염소 항-비오틴 항체로 피복시키고(5 mg/ml, 4°C, 밤새), Superblock (Pierce)으로 차단시키고, 실온에서 2시간동안 10% Superblock TTBS에서 50ng/ml의 비오티닐화된 인간 항원으로 항온처리한다. 혈청 샘플을 연속으로 희석하고(TTBS중의 0.5% 혈청, 10% Superblock) 실온에서 30분동안 플레이트상에서 항온처리한다. 검출은 HRP-표지된 염소 항 인간 항체로 수행하고 농도는 4개 파라미터 로그 피트를 사용하여 표준 곡서의 도움으로 결정한다. 약리역학적 계수에 대한 값은 WinNonlin 소프트웨어(Pharsight Corporation, Mountain View, CA)를 사용한 비격막 모델에 의해 결정한다. 양호한 약리역학적 프로필(T1/2는 8 내지 13일 또는 그보다 양호하고 낮은 제거 및 우수한 생물유용성 50 내지 100%)을 갖는 인간화된 mAb를 선별한다.
실시예 1.2.2.3.B: 인간화된 모노클로날 항체의 물리화학적 및 시험관내 안정성 분석
크기 배제 크로마토그래피
항체는 물을 사용하여 2.5mg/ml로 희석하고 20ml를 TSK 겔 G3000 SWXL 칼럼(Tosoh Bioscience, cat# k5539-05k)을 사용하여 시마즈 HPLC 시스템상에서 분석한다. 샘플은 211mM 황산나트륨, 92 mM 인산나트륨, pH 7.0, 유속 0.3ml/분을 사용하여 칼럼으로부터 용출시킨다. HPLC 시스템 작동 조건은 다음과 같다:
이동상: 211 mM Na2SO4, 92 mM Na2HPO4*7H2O, pH 7.0
농도구배: 등용매
유속: 0.3 mL/분
검출 파장: 280 nm
자동샘플채취기 냉각기 온도: 4°C
칼럼 오븐 온도: 주위 온도
수행 시간: 50분
SDS-PAGE
항체는 환원 및 비환원 조건 둘다에서 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석한다. Adalimumab lot AFP04C를 대조군으로서 사용한다. 환원 조건을 위해, 샘플은 1:1로 2X 트리스 글라이신 SDS-PAGE 샘플 완충액(Invitrogen, cat# LC2676, lot# 1323208) 및 100 mM DTT와 함께 혼합하고, 30분동안 60℃에서 가열한다. 비환원 조건을 위해, 당해 샘플은 샘플 완충액과 1:1로 혼합하고 5분동안 100℃에서 가열한다. 환원된 샘플(레인당 10mg)을 12% 프리캐스트 트리스-글라이신 겔(Invitrogen, cat# EC6005box, lot# 6111021)상에 로딩하고, 비환원된 샘플(레인당 10 mg)을 8%-16% 프리캐스트 트리스-글라이신 겔(Invitrogen, cat# EC6045box, lot# 6111021)상에 로딩한다. SeeBlue Plus 2 (Invitrogen, cat#LC5925, lot# 1351542)를 분자량 마커로서 사용한다. 당해 겔을 XCeIl SureLock 소형 세포 겔 박스(Invitrogen, cat# EIOOOl)내에서 전개하고 단백질은 먼저 75 전압을 적용하여 샘플을 겔에 첨가하고 이어서 선행 염료가 겔의 바닥에 도달할때까지 125의 정전압을 걸어 분리한다. 사용되는 전개 완충액은 10 x 트리스 글라이신 SDS 완충액(ABC, MPS-79-080106)으로부터 제조된 1 x 트리스 글라이신 SDS 완충액이다. 당해 겔은 콜로이드 블루 염색 (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016)을 사용하여 밤새 염색시키고 배경이 청명해질때까지 Milli-Q 물을 탈염색시킨다. 염색된 겔을 이어서 Epson Expression 스캐너 (model 1680, S/N DASX003641)를 사용하여 스캐닝한다.
침강 속도 분석
항체는 3개의 표준 2-섹터 카본 에폰 센터피스의 샘플 챔버로 로딩한다. 이들 센터피스는 1.2cm 광학 경로 길이를 갖고 사파이어 윈도우로 구성된다. PBS는 표준 완충액으 위해 사용되고 각각의 챔버는 140 μL를 함유한다. 모든 샘플은 Beckman ProteomeLab XL-I 분석 초원심분리(serial # PL106C01)에서 4-구멍(AN-60Ti)를 사용하여 동시에 조사한다.
수행 조건은 프로그램화되어 있고 원심분리 조절은 ProteomeLab (v5.6)를 사용하여 수행한다. 샘플 및 로터는 분석전에 1시간동안 열이 균질해지도록 한다(20.0 ± 0.1℃). 적당한 세포 로딩의 확인은 3000rpm에서 수행하고 단일 스캔은 각각의 세포에 대해 기록한다. 침강 속도 조건은 하기와 같다:
샘플 세포 용적: 420 mL
표준 셀 용적: 420 mL
온도: 20℃
로터 속도: 35,000 rpm
시간: 8:00 시간
UV 파장: 280nm
방사상 단계 크기: 0.003cm
데이터 수집: 시그날 평균화 없이 단계 마다 원 데이터 포인트
스캔 총 수: 100
온전한 항체의 LC-MS 분자량 측정
온전한 항체의 분자량은 LC-MS에 의해 분석한다. 각각의 항체는 물을 사용하여 대략 1mg/ml로 희석시킨다. 단백질 마이크로트랩(Michrom Bioresources, Inc, cat# 004/25109/03)을 사용한 1100 HPLC (Agilent) 시스템을 사용하여 탈염시키고 5mg의 샘플을 API Qstar 펄서 i 질량 분광측정기 (Applied Biosystems)에 도입한다. 짧은 농도 구배를 사용하여 샘플을 용출시킨다. 농도 구배는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 물중의 0.08% FA, 0.02% TFA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.08% FA 및 0.02% TFA)를 사용하여 수행한다. 질량 분광측정기는 질량 대 전하 비율이 2000 내지 3500인 스캔 범위로 4.5 k볼트 분무 전압으로 수행한다.
항체 경쇄 및 중쇄의 LC-MS 분자량 측정
항체 경쇄(LC), 중쇄(HC) 및 탈당화된 HC의 분자량 측정은 LC-MS에 의해 분석한다. 항체는 물을 사용하여 1 mg/mL로 희석시키고 샘플은 37℃에서 30분동안 10mM DTT의 최농 농도로 LC 및 HC로 감소시킨다. 항체 탈당화시키기 위해, 100 mg의 항체를 37℃에서 총 용적 100ml중에서 밤새 2 mL의 PNGase F, 5 mL의 10% N-옥틸글루코사이드로 항온처리한다. 탈글루코실화 후 샘플은 37℃에서 30분동안 10mM DTT의 최종 농도로 감소한다. C4 칼럼(Vydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069)을 갖는 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 샘플(5mg)을 탈염시키고 API Qstar 펄서 i 질량 분광측정기(Applied Biosystems)에 도입한다. 짧은 농도 구배를 사용하여 샘플을 용출시킨다. 농도 구배는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 물중의 0.08% FA, 0.02% TFA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.08% FA 및 0.02% TFA)를 사용하여 수행한다. 질량 분광측정기는 질량 대 전하 비율이 800 내지 3500인 스캔 범위로 4.5 k볼트 분무 전압으로 수행한다.
펩타이드 맵핑
항체를 실온에서 15분동안 75mM의 중탄산암모늄중의 6M 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도로 변성시킨다. 변성된 샘플을 60분동안 37℃에서 10mM DTT의 최종 농도로 감소시킴에 이어서 30분동안 37℃에서 암실에서 50mM 요오도아세트산(IAA)를 사용하여 알킬화시킨다. 알킬화 후, 샘플을 4℃에서 4리터의 10mM 중탄산암모늄에 대해 밤새 투석시킨다. 투석된 샘플을 10mM 중탄산암모늄, pH 7.8을 사용하여 1mg/ml로 희석시키고 100 mg의 항체를 4시간동안 37℃에서 트립신/Lys-C:항체 1:20(w/w) 비율에서 트립신 (Promega, cat# V5111) 또는 Lys-C (Roche, cat# 11 047 825 001)로 분해시킨다. 분해물을 1 mL의 1 N HCl로 켄칭시킨다. 질량 분광측정기 검출을 사용한 펩타이드 맵핑을 위해 40ml의 분해물을, Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용한 C18 칼럼상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RPHPLC)에 의해 분리한다(Vydac, cat# 218TP51, S/N NE 9606 10.3.5). 펩타이드 분리는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 물중의 0.02% TFA, 0.08% FA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.02% TFA 및 0.08% FA)를 사용하여 수행한다. API QSTAR 펄서 i 질량 분광측정기를 4.5k볼트 분무 전압 및 질량 대 하전비가 800 내지 2500인 스캔 범위에서 양성 모드로 작동시킨다.
디설파이드 결합 맵핑
항체를 변성시키기 위해, 100 mL의 항체를 100mM의 중탄산암모늄 중의 300ml의 8M 구아니딘과 혼합한다. pH가 7 내지 8이 되도록 조사하고 샘플을 6M 구아니딘 HCl의 최종 농도에서 실온에서 15분동안 변성시킨다. 변성된 샘플의 일부(100mL)를 Milli-Q 물로 600ml로 희석시켜 최종 구아니딘-HCl 농도가 1M이 되게한다. 샘플(220 mg)을 대략 16시간동안 37℃에서 1:50 트립신 또는 1:50 Lys-C: 항체(w/w) 비율(4.4mg 효소: 220mg 샘플)에서 트립신(Promega, cat # V5111, lot# 22265901) 또는 Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lot# 12808000)를 사용하여 분해시킨다. 추가 5mg의 트립신 또는 Lys-C를 샘플에 첨가하고 37℃에서 추가로 2시간동안 분해가 진행되도록 한다. 분해는 1mg의 TFA를 각각의 샘플에 첨가함에 의해 종료시킨다. 분해된 샘플은 Agilent HPLC 시스템상에서 C18 칼럼을 사용하는 RPHPLC(Vydac, cat# 218TP51 S/N NE020630-4-1A)에 의해 분리한다. 당해 분리는 분당 50ml의 유속으로 이동상 A(HPLC 등급 물중의 0.02% TFA, 0.08% FA) 및 이동상 B (아세토니트릴중의 0.02% TFA 및 0.08% FA)를 사용하는 펩타이드 맵핑을 위해 사용되는 동일한 농도 구배로 수행한다. HPLC 작동 조건은 펩타이드 맵핑을 위해 사용되는 것들과 동일하다. API QSTAR 펄서 i 질량 분광측정기는 4.5k볼트 분무 전압 및 800 내지 2500 질량 대 하전 비율의 스캔 범위에서 양성 모드로 작동시킨다. 디설파이드 결합은 페타이드의 관찰된 MW와 디설파이드 결합에 의해 결합된 트립신 또는 Lys-C 펩타이드의 예측된 MW를 일치시켜 할당한다.
유리된 설프하이드릴 측정
항체에서 유리된 시스테인을 정량하기 위해 사용되는 방법은 특징적인 발색단 생성물, 5-티오-(2-니트로벤조산) (TNB)을 유발하는 설프하이드릴 그룹(SH)과 엘만 시약, 5,5￠-디티오-비스(2-니트로벤조산) (DTNB)의 반응을 기초로 한다. 반응은 하기의 식에서 설명된다:
DTNB + RSH ? RS-TNB + TNB- + H+
TNB-의 흡광도는 Cary 50 분광측정기를 사용하여 412nm에서 측정한다. 흡광도 곡선은 유리된 SH 표준물로서 2 머캅토에탄올(b-ME)의 희석물을 사용하여 플롯팅하고 단백질내 유리된 설프하이드릴 그룹의 농도는 샘플의 412nm에서의 흡광도로부터 측정한다.
b-ME 표준 스톡은 HPLC 등급의 물로 14.2M b-ME를 최종 농도 0.142mM로 연속 희석시켜 제조한다. 이어서 각각의 농도에 대해 3회 표준물을 제조한다. 항체는 아미콘 울트라 10,000 MWCO 원심분리 여과기(Millipore, cat# UFC801096, lot# L3KN5251 )를 사용하여 10mg/ml로 농축시키고 완충액을 아달리무마브용 제제 완충액(5.57 mM 1염기성 인산나트륨, 8.69 mM 2염기성 인산나트륨, 106.69 mM NaCl, 1.07 mM 나트륨 시트레이트, 6.45 mM 시트르산, 66.68 mM 만니톨, pH 5.2, 0.1% (w/v) Tween)으로 대체시킨다. 당해 샘플을 20분동안 실온에서 진탕기상에서 혼합한다. 이어서 180 mL의 100 mM Tris 완충액, pH 8.1을 각각의 샘플 및 표준물에 첨가하고 이어서 10mM 인산 완충액(pH 8.1)중의 2mM DTNB의 300ml를 첨가한다. 완전히 혼합한 후, 샘플 및 표준물을 Cary 50 분광측정기상의 412nm에서의 흡광도에 대해 측정한다. 표준 곡선은 b-ME 표준물의 유리된 SH의 양 및 OD412을 플롯팅함에 의해 수득한다. 샘플의 유리된 SH 함량은 블랭크 공제 후 당해 곡선을 기준으로 계산한다.
약 양이온 교환 크로마토그래피
항체는 10 mM 인산나트륨, pH 6.0을 사용하여 0.1mg/ml로 희석시킨다. 하전 이종성은 WCX-10 ProPac 분석 칼럼(Dionex, cat# 054993, S/N 02722)을 갖는 시마쯔 HPLC 시스템을 사용하여 분석한다. 당해 샘플은 80% 이동상 A(10mM 인산나트륨, pH 6.0) 및 20% 이동상 B(10mM 인산나트륨, 500mM NaCl, pH 6.0)중에서 칼럼상으로 로딩하고 분당 1.0ml의 유속으로 용출시킨다.
올리고사카라이드 프로파일링
항체의 PNGase F 처리 후 방출된 올리고사카라이드는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB) 표지화 시약을 사용하여 유도체화한다. 형광 표지된 올리고사카라이드를 정상의 고성능 액체 크로마토그래피(NPHPLC)로 분리하고 사이한 형태의 올리고사카라이드를 공지된 표준물과의 체류시간 비교를 기초로 특징 분석한다.
항체를 먼저 PNGaseF로 분해시켜 중쇄의 Fc 부분으로부터 N-연결된 올리고사카라이드를 절단한다. 당해 항체(200 mg)를 2 mL의 PNGase F 및 3 mL의 10% N-옥틸글루코시드와 함께 500mL의 에펜도르프 튜브에 첨가한다. 인산 완충식염수를 첨가하여 최종 용적이 60ml이 되게한다. 당해 샘플을 700RPM으로 설정된 에펜도르프 열혼합기중에서 37℃에서 밤새 항온처리한다. 아달리무마브 로트 AFP04C는 또한 대조군으로서 PNGase F로 분해시킨다.
PNGase F 처리 후, 샘플은 750RPM으로 설정된 에펜도르프 열혼합기에서 5분동안 95℃에서 항온처리하고 단백질을 침출시킴에 이어서 샘플을 2분동안 10,000 RPM에서 에펜도르프 원심분리기에 놓고 침전된 단백질을 침강시킨다. 올리고사카라이드를 함유하는 상등액을 500ml 에펜도르프 튜브로 옮기고 65℃에서 스피드-백에서 건조시킨다.
올리고사카라이드를 제조원(Prozyme (cat# GKK-404, lot# 132026))으로부터 구입한 2AB 표지화 키트를 사용하여 2AB로 표지시킨다. 표지 시약은 제조업자의 지침에 따라 제조한다. 아세트산(150 mL, 키트로 제공됨)을 DMSO 바이엘(키트로 제공됨)에 첨가하고 용액을 피펫팅으로 수회 상승 하강시켜 혼합한다. 아세트산/DMSO 혼합물(100 mL)을 사용 직전에 2-AB 염료 바이알에 옮기고 염료가 완전히 용해될때까지 혼합한다. 이어서 염료 용액을 환원제의 바이알(키트로 제공됨)에 첨가하고 잘 혼합한다(표지화 시약). 표지화 시약(5 mL)을 각각의 건조된 올리고사카라이드 샘플 바이알에 첨가하고 완전히 혼합한다. 당해 반응 바이알을 반응 2시간동안 65℃에서 및 700 내지 800 RPM으로 설정된 에펜도르프 열혼합기에 놓는다.
표지화 반응 후, 과량의 형광 염료를 제조원(Prozyme (cat# GKI -4726))으로부터 글리코클린 에스 카트릿지를 사용하여 제거한다. 샘플을 첨가하기 전에, 카트릿지를 1 m의 밀리-Q 물로 세척하고 이어서 1ml의 30% 아세트산 용액으로 5회 세척한다. 샘플 첨가하기 직전에, 1 mL의 아세토니트릴(Burdick and Jackson, cat# AHO15-4)을 카트릿지에 첨가한다.
모든 아세토니트릴이 카트릿지를 통과한 후, 샘플을 새로이 세척된 디스크 의 중앙에 점적하고 10분동안 디스크상으로 흡수되도록 한다. 디스크를 1ml의 아세토니트릴로 세척함에 이어서 96% 아세토니트릴 1ml로 5회 세척한다. 카트릿지를 1.5mL 에펜도르프 튜브상에 놓고 2-AB 표지된 올리고사카라이드를 밀리 Q 물로 3회 세척(각 세척당 400ml)으로 용출시킨다.
올리고사카라이드를 시마즈(Shimadzu) HPLC 시스템에 연결된 Glycosep N HPLC (cat# GKI-4728) 칼럼을 사용하여 분리한다. 시마즈 HPLC 시스템은 시스템 조절자, 탈기 장치, 이원 펌프, 샘플 냉각기가 있는 자동샘플채취기 및 형광 검출기로 이루어진다.
승온에서의 안정성
항체 완충액은 Amicon 초원심분리 여과기를 사용하는 5.57 mM 1염기성 인산나트륨, 8.69 mM 2염기성 인산나트륨, 106.69 mM NaCl, 1.07 mM 나트륨 시트레이트, 6.45 mM 시트르산, 66.68 mM 만니톨, 0.1% (w/v) Tween, pH 5.2; 또는 10 mM 히스티딘, 10 mM 메티오닌, 4% 만니톨, pH 5.9이다. 항체의 최종 농도는 적당한 완충액으로 2 mg/mL로 조정한다. 항체 용액은 이어서 여과 멸균하고 0.25 mL의 적정액을 멸균 조건하에 제조한다. 적정액을 1, 2 또는 3주동안 -80℃, 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 방치한다. 항온처리 기간 말기에, 샘플은 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE로 분석한다.
안정성 샘플은 환원 및 비환원 조건하에 SDS-PAGE로 분석한다. 사용되는 과정은 본원에 기재된 바와 동일하다. 당해 겔은 콜로이드성 블루 염색(Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016)으로 염색시키고 배경이 청명해질때까지 Milli-Q 물로 탈염색시킨다. 염색된 겔을 이어서 Epson Expression 스캐너(model 1680, S/N DASX003641)를 사용하여 스캔한다. 보다 높은 민감성을 수득하기 위해, 동일한 겔을 실버 염색 키트 (Owl Scientific)를 사용하여 염색하고 제조업자에 의해 추천된 과정을 사용한다.
실시예 1.2.2.3.C: 인간화된 모노클로날 항체 그 자체 또는 화학치료요법과 조합된 인간 암종 이종이식체의 성장에 대한 효능
인간 암 세포는 조직 배양 플라스크에서 시험관내에서 99% 생존성, 85% 컨플루언스때까지 성장시킨다. 19 내지 25g의 SCID 암컷 또는 수컷 마우스의 귀에 태그하고 면도시킨다. 이어서 0일째에 마우스의 오른쪽 옆구리에 0.2ml의 2 x 106 인간 종양 세포 (1:1 마트리겔)을 피하 접종하였다. 비히클(PBS), 인간화된 항체 및/또는 화학치료제의 투여(IP, Q3D/주)는 마우스를 평균 종양 용적이 대략 150 내지 200 mm3인 마우스의 별도의 케이지에 크기별로 일치시킨 후 개시하였다. 접종 후 대략 10일째에 개시하여 1주일에 2회 한쌍의 캘리퍼로 측정하고 종양 용적은 수학식 V = L x W2/2 (V: 용적, mm3; L: 길이, mm; W: 너비, mm)에 따라 계산하였다. 종양 용적의 감소는 비히클 또는 이소타입 대조군 mAb만을 투여받은 동물에서의 종양과 비교하여 mAb 단독 또는 화학치료요법과 조합된 mAb로 처리된 동물에서 나타난다.
실시예 1.4: DVD - Ig 의 생성
2개의 항원에 결합할 수 있는 DVD-Ig 분자는 2개의 모 모노클로날 항체, 즉, 본원에 기재된 바와 같이 선별된 인간 항원 A에 대한 항체 및 인간 항원 B에 대한 다른 항체를 사용하여 작제한다.
실시예 1.4.1: 2개의 링커 길이를 갖는 DVD-Ig의 생성
234번, 및 235번에서 돌연변이를 갖는 1㎕의 Fc를 포함하는 불변 영역은 ADCC/CDC 이펙터 기능을 제거하기 위해 사용한다. 4개의 상이한 항-A/B DVD-Ig 작제물을 생성한다: 2개는 짧은 링커(SL)를 갖고 2개는 긴 링커(LL)를 갖고, 각각은 2개의 상이한 도메인 배향: VA-VB-C 및 VB-VA-C으로 있다(표 3 참조). 인간 Cl/Ck 또는 CHl 도메인의 N-말단 서열 유래의 링커 서열은 다음과 같다:
DVDAB 작제물에 대해:
경쇄 (항-A가 λ를 갖는 경우):짧은 링커: QPKAAP (서열번호 15); 긴 링커: QPKAAPSVTLFPP (서열번호 16)
경쇄(항-A가 κ를 갖는 경우):짧은 링커: TVAAP (서열번호 13); 긴 링커: TVAAPSVFIFPP (서열번호 14)
중쇄 (γ1): 짧은 링커: ASTKGP (서열번호 21); 긴 링커: ASTKGPSVFPLAP (서열번호 22)
DVDBA 작제물에 대해:
경쇄(항-B가 λ를 갖는 경우):짧은 링커: QPKAAP (서열번호 15); 긴 링커:QPKAAPSVTLFPP (서열번호 16)
경쇄(항-B가 k를 갖는 경우): 짧은 링커: TVAAP (서열번호 13); 긴 링커: TVAAPSVFIFPP (서열번호 14)
중쇄 (γl): 짧은 링커: ASTKGP (서열번호 21); 긴 링커: ASTKGPSVFPLAP (서열번호 22)
중쇄 및 경쇄 작제물은 pBOS 발현 벡터에 서브클로닝하고 COS 세포에서 발현시킴에 이어서 단백질 A 크로마토그래피로 정제한다. 정제된 물질은 SDS-PAGE 및 SEC 분석에 적용한다.
표 3은 각각 항-A/B DVD-Ig 단백질을 발현하기 위해 사용되는 중쇄 및 경쇄를 기재한다.
Figure pct00005
실시예 1.4.2: DVDABSL 및 DVDABLL에 대한 DNA 작제물의 분자 클로닝
중쇄 작제물 DVDABHC-LL 및 DVDABHC-SL를 제조하기 위해, A 항체의 VH 도메인을 특이적 프라이머(3 ' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧은/긴 링커 서열을 포함한다)를 사용하여 PCR 증폭시키고; B 항체의 VH 도메인은 특이적 프라이머(5' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧고/긴 서열을 포함한다)를 사용하여 증폭시킨다. PCR 반응 둘다는 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행한다. 2개의 PCR 생성물은 겔 정제하고 후속 중첩 PCR 반응에 대해 중첩 주형으로서 함께 사용한다. 중첩 PCR 생성물은 표준 상동성 재조합 방법을 사용함에 의해 Srf I 및 Sal I 이중 분해된 pBOS-hCγl,z 비-a 포유동물 발현 벡터(Abbott)에 서브클로닝한다.
경쇄 작제물 DVDABLC-LL 및 DVDABLC-SL를 제조하기 위해, A 항체의 VL 도메인을 특이적 프라이머(3 ' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧은/긴 링커 서열을 포함한다)를 사용하여 PCR 증폭시키고; B 항체의 VL 도메인은 특이적 프라이머(5' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧고/긴 서열을 포함한다)를 사용하여 증폭시킨다. PCR 반응 둘다는 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행한다. 2개의 PCR 생성물은 겔 정제하고 표준 PCR 조건하에서 후속 중첩 PCR 반응에 대해 중첩 주형으로서 함께 사용한다. 중첩 PCR 생성물은 표준 상동성 재조합 방법을 사용함에 의해 Srf I 및 Sal I 이중 분해된 pBOS-hCk 포유동물 발현 벡터(Abbott)에 서브클로닝한다. 유사한 방법을 사용하여 하기에 기재된 바와 같은 DVDBASL 및 DVDBALL을 제조한다:
실시예 1.4.3: DVDBASL 및 DVDBALL에 대한 DNA 작제물의 분자 클로닝
중쇄 작제물 DVDBAHC-LL 및 DVDBAHC-SL를 제조하기 위해, B 항체의 VH 도메인을 특이적 프라이머(3 ' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧은/긴 링커 서열을 포함한다)를 사용하여 PCR 증폭시키고; A 항체의 VH 도메인은 특이적 프라이머(5' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧고/긴 서열을 포함한다)를 사용하여 증폭시킨다. PCR 반응 둘다는 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행한다. 2개의 PCR 생성물은 겔 정제하고 표준 PCR 조건을 사용하여 후속 중첩 PCR 반응에 대해 중첩 주형으로서 함께 사용한다. 중첩 PCR 생성물은 표준 상동성 재조합 방법을 사용함에 의해 Srf I 및 Sal I 이중 분해된 pBOS-hCγl,z 비-a 포유동물 발현 벡터(Abbott)에 서브클로닝한다.
경쇄 작제물 DVDBALC-LL 및 DVDBALC-SL를 제조하기 위해, B 항체의 VL 도메인을 특이적 프라이머(3 ' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧은/긴 링커 서열을 포함한다)를 사용하여 PCR 증폭시키고; A 항체의 VL 도메인은 특이적 프라이머(5' 프라이머는 각각 SL/LL 작제물에 대해 짧고/긴 서열을 포함한다)를 사용하여 증폭시킨다. PCR 반응 둘다는 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행한다. 2개의 PCR 생성물은 겔 정제하고 표준 PCR 조건을 사용하여 후속 중첩 PCR 반응에 대해 중첩 주형으로서 함께 사용한다. 중첩 PCR 생성물은 표준 상동성 재조합 방법을 사용함에 의해 Srf I 및 Sal I 이중 분해된 pBOS-hCk 포유동물 발현 벡터(Abbott)에 서브클로닝한다.
실시예 1.4.4: 추가 DVD-Ig의 작제 및 발현
실시예 1.4.4.1: DVD-Ig 벡터 작제물의 제조
DVD-Ig로의 혼입을 위한, 특이적 항원 또는 이의 에피토프를 인지하는 특이적 항체에 대한 모 항체 아미노산 서열은 상기된 바와 같이 하이브리도마를 제조함에 의해 수득될 수 있거나 공지된 항체 단백질 또는 핵산을 서열분석함에 의해 수득될 수 있다. 추가로 공지된 서열은 문헌으로부터 수득될 수 있다. 당해 서열은 세포에서의 발현을 위해 표준 DNA 합성 또는 증폭 기술을 사용하여 핵산을 합성하고 목적하는 항체 단편을 발현 벡터로 어셈블리하기 위해 사용될 수 있다.
DVD-Ig 서열을 표준 방법에 따라 pHyb-C 벡터 또는 pHyb-E 벡터(문헌참조: 미국 특허 공개공보 20090239259)내로 클로닝하였다.
pHyb-C 벡터는 SV40 진핵세포 복제 오리진, 사이토메갈로바이러스 진핵세포 발현 프로모터(pCMV), 3부(Tripartite) 리더 서열(TPL), 스플라이스 공여자 부위(SD), 아데노바이러스 주요 말기 인핸서 성분(enh MLP), 스플라이스 수용체 부위(SA), 목적 유전자에 대한 개방 판독 프레임(ORF) 영역에 이은 폴리 A 시그날(pA), 다이아드(dyad) 대칭 성분(DS), 엡슈타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus)-기원한 진핵세포 복제 오리진(OriP), 반복 영역(FR), 암필리신 내성 마커(AmpR) 및 세균 복제 오리진(pMB1ori)을 포함한다.
pHyb-E 벡터는 SV-40 진핵세포 복제 오리진, EF-1a 진핵세포 프로모터, 목적 유전자에 대한 개방 판독 프레임(ORF) 영역에 이은 폴리 A 시그날(pA), 다이드 대칭 성분(DS), 엡슈타인 바르 바이러스-기원한 진핵세포 복제 오리진(OriP), 반복 영역(FR), 암필리신 내성 마커(AmpR) 및 세균 복제 오리진(pMB1ori)을 포함한다. 예시적인 pHyb-E 벡터는 pHybE-hCk, pHybE-hCl, 및 pHybE-hCg1,z,non-a(문헌참조: 미국 특허 공개공보 20090239259)를 포함한다.
실시예 1.4.4.2: 293 세포에서 형질감염 및 발현
DVD-Ig 벡터 작제물을 DVD-Ig 단백질의 생산을 위해 293 세포내로 형질감염시킨다. 사용된 293 일시적인 형질감염 과정은 문헌[Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2): E9 and Pham et al. (2005) Biotech. Bioengineering 90(3): 332-44]에 발표된 방법의 변형이다. 형질감염에 사용된 시약은 다음을 포함하였다:
· HEK 293-6E 세포(EBNA1을 안정하게 발현하는 인간 배아 신장 세포주; National Research Council Canada로부터 입수)를 130 rpm, 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤화된 항온처리기 중에서 1회용 얼렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 중에서 배양하였다.
· 배양 배지: 프리스타일(FreeStyle) 293 발현 배지(Invitrogen 12338-018) 및 25㎍/mL 제네티신(G418)(Invitrogen 10131-027) 및 0.1% 플루로닉 F-68(Invitrogen 24040-032).
· 형질감염 배지: 프리스타일 293 발현 배지 및 10 mM HEPES(Invitrogen 15630-080).
· 폴리에틸렌이민(PEI) 스톡: 선형 25kDa PEI(제조원: Polysciences)를 사용하여 제조하고 -15℃ 미만에서 저장한, 1 mg/mL 멸균 스톡 용액, pH 7.0.
· 트립톤 공급 배지: 프리스타일 293 발현 배지 중 트립톤 N1(Organotechnie, 19554)의 5% w/v 멸균 스톡.
형질감염용 세포 제조: 형질감염 전 약 2 내지 4시간째에, HEK 293-6E 세포를 원심분리로 수거하고 배양 배지 중에 약 1백만개의 생존 세포/mL의 세포 밀도로 현탁시켰다. 각각의 형질감염의 경우, 40 mL의 세포 현탁액을 1회용 250-mL 얼렌마이어 플라스크내로 이전시키고 2 내지 4시간 동안 항온처리하였다.
형질감염: 형질감염 배지 및 PEI 스톡을 실온(RT)으로 예비가온시킨다. 각각의 형질감염의 경우, 25㎍의 플라스미드 DNA 및 50㎍의 폴리에틸렌이민(PEI)을 5 mL의 형질감염 배지 중에서 합하고 15 내지 20분 동안 RT에서 항온처리하여 DNA:PEI 복합체가 형성되도록 한다. BR3-Ig 형질감염의 경우, 25㎍의 BR3-Ig 플라스미드를 형질감염당 사용한다. 5-mL의 DNA:PEI 복합체 혼합물 각각을 앞서 제조한 40-mL 배양물에 가하고 130 rpm, 37℃ 및 5% CO2로 설정된 습윤화된 항온처리기에 다시 넣었다. 20 내지 28시간 후, 5 mL의 트립톤 공급 배지를 각각의 형질감염에 가하고 배양을 6일 동안 지속한다.
실시예 1.4.5: A/B DVD-Ig의 특성 분석 및 선두 선별
항-A/B DVD-Ig의 결합 친화도은 단백질 A 및 단백질 B 둘다에 대해 분석한다. DVD-Ig의 4가 성질은 바이어코어상의 다중 결합 연구에 의해 조사한다. 한편, 단백질 A 및 단백질 B에 대한 DVD-Ig의 중화성 효능은 각각 본원에 기재된 바와 같이 생분석에 의해 평가한다. 본래의 모 mAb의 친화도 및 효능을 최상으로 보유하는 DVD-Ig 분자는 각각 mAb에 대해 본원에 기재된 바와 같이 면밀한 물리화학적 및 생분석적(랫트 PK) 특성 분석을 위해 선별한다. 일련의 분석을 기초로, 최종 선두 DVD-Ig는 CHO 안정한 세포주 개발 단계로 진행시키고 CHO-유래 물질은 시노몰구스 원숭이 및 및 예비 제형 활성에서 안정성, 약리역학적 및 효능 연구에 사용한다.
실시예 2: 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig)의 생성 및 특징 분석
공지된 아미노산 서열을 갖는 모 항체를 사용하는 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig)은 DVD-Ig 가변 중쇄 및 DVD-Ig 가변 경쇄 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 합성하고 당해 단편을 실시예 1.4.4.1에 따라 pHybC-D2 벡터로 클로닝하여 제조하였다. DVD-Ig 작제물을 실시예 1.4.4.2에 기재된 바와 같이 클로닝시키고 293 세포에서 발현시켰다. DVD-Ig 단백질은 표준 방법에 따라 정제하였다. 기능적 특성 분석은 지적된 바와 같이 실시예 1.1.1 및 1.1.2에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
다음 실시예는 2개의 표 각각을 포함한다. 각각의 실시예에서 제1 표는 DVD-Ig를 생성하는데 사용된 2개의 모 항체의 VH 및 VL 서열을 함유한다. 각각의 실시예에서 제2 표는 제1 표의 서열로부터 작제된 DVD-Ig VH 및 VL 쇄의 서열을 함유한다.
실시예 2.1: TNF 및 IL -17A의 생성
Figure pct00006
실시예 2.2: 링커 세트 1 및 2를 갖는 HIV(서열 1) 및 HIV(서열 3) DVD-Ig의 생성
Figure pct00007
실시예 2.3: 링커 세트 1 및 2를 갖는 NGAL (서열 1) 및 NGAL (서열 1) DVD -Ig의 생성
Figure pct00008
실시예 2.4: 링커 세트 1 및 2를 갖는 NGAL (서열 1) 및 NGAL (서열 2) DVD -Ig의 생성
Figure pct00009
실시예 2.5: 링커 세트 1 및 2를 갖는 NGAL (서열 1) 및 NGAL (서열 2) DVD -Ig의 생성
Figure pct00010
실시예 2.6: 링커 세트 1, 2 및 3을 갖는 NGAL (서열 1) 및 IL -18(서열 1)의 생성
Figure pct00011
Figure pct00012

실시예 2.7: 링커 세트 1 및 2를 갖는 BNP (서열 1) 및 BNP (서열 1) DVD - Ig 의 생성
Figure pct00013
실시예 2.8: 링커 세트 1을 갖는 BNP (서열 2) 및 BNP (서열 2) DVD - Ig 의 생성
Figure pct00014
실시예 2.9: 링커 세트 1 및 2를 갖는 BNP (서열 2) 및 BNP (서열 1) DVD - Ig 의 생성
Figure pct00015
실시예 2.10: 링커 세트 1을 갖는 BNP (서열 4) 및 BNP (서열 4) DVD - Ig 의 생성
Figure pct00016
실시예 2.11: 링커 세트 1 및 2를 갖는 HIV (서열 2) 및 HIV (서열 2) DVD - Ig 의 생성
Figure pct00017
실시예 2.12: 링커 세트 1을 갖는 HIV (서열 4) 및 HIV (서열 4) DVD - Ig 의 생성
Figure pct00018
실시예 2.13: 링커 세트 1을 갖는 TnI 및 TnI DVD - Ig 의 생성
Figure pct00019
실시예 2.14: 생산된 DVD - Ig
표 17은, 0.5 L 배양물로부터 생산된 DVD-Ig를 나타낸다. 각각의 DVD-Ig(mg)에 대한 수율은 마지막 컬럼에 나타낸다. 짧은("S"), 긴("L") 및 이중의 긴("긴X2") 링커를 나타낸 바와 같이 사용하였다. 상세하게는, 서열 번호 21은 중쇄 링커("H 링커")에 대한 짧은 링커로서 사용한 반면, 서열 번호 13은 경쇄 링커("L 링커")에 대한 짧은 링커로서 사용하였다. 서열 번호 22는 H쇄 링커("H")에 대해 긴 링커로서 사용한 반면, 서열 번호 14는 L 링커에 대한 긴 링커로서 사용하였다. 서열 번호 28은 H 링커에 대한 이중의 긴 링커로서 사용한 반면, 서열 번호 27은 L 링커에 대한 이중의 긴 링커로 사용하였다.
Figure pct00020
주:
* Out = 외부 가변 결합 도메인. In = 내부 가변 결합 도메인
** ABXX = 키메라 모노클로날 항체
실시예 2.15: 형광성 표지 및 퀀쳐(quencher) 각각을 사용한 DVD-Ig 및 상응하는 항원의 표지화
정제된 항원(NGAL, IL-18, BNP 및 HIV)을 ALEXA Fluor 488 카복실성, 석신이미딜 에스테르(제조원: Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)로 표지하고 DVD-Ig를 BHQ-10S 석신이미딜 에스테르(Black Hole Quencher?, Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA)를 사용하여 표지하였다. 표지되지 않은 BHQ-10S 및 ALEXA Fluor 488을 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 평형화시킨 G-25 컬럼상에서 제거하였다.
표지된 항원의 농도를 BHQ-10S로부터의 분포에 대해 포함된 교정과 함께 카리(Cary) 4 분광광도계(Varian, Sugarland, TX) 상에서 상응하는 ε280을 사용하여 1cm 큐벳 중에서 UV 흡수에 의해 측정하였다. 표지된 DVD-Ig의 농도를 BHQ로부터의 분포을 위해 포함된 교정과 함께, E279 1mg/mL = 1.50을 사용하는 1cm 큐벳 중에서 UV 흡수에 의해 측정하였다.
표지화 과정을 제조업자가 제공한 지침에 따라 수행하였다.
실시예 2.16: DVD-Ig 및 이들의 상응하는 항원의 해리 상수
표 18은 DVD-Ig 및 이들의 상응하는 항원의 해리 상수(KD)를 나타낸다. 해리는 형광 공명 에너지 전달(FRET)계 방법(Ruan et al., Analyt. Biochem. 393: 196-204 (2009))을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 제공된 DVD-Ig 및 이의 상응하는 항원의 외부 가변 결합 도메인 및 내부 가변 결합 도메인에 대한 해리 상수는 직접적인 결합 실험에서 측정하였다. ALEXA 488-표지된 항원을 0.05 내지 0.2 nM의 범위의 고정 농도로 유지시킨 한편 BHQ-DVD Ig 농도는 일련의 시료에서 피코몰로부터 마이크로몰 이하의 범위로 점진적으로 증가시켰다. 30분의 항온처리 후, 모든 시료를 SLM 8100 양성자 계수 분광형광계상에서 측정하였다. 시료를 480 nm에서 여기시키고, 방사를 530 nm(30 nm 밴드너비) 간섭 여과기(Chroma Technology Corp., Rockingham, VT)를 통해 수집하였다. 모든 결합 측정을 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% 표면활성제 P20을 함유하는 10 mM HEPES 완충제, pH 7.4 중에서 수행하였다.
BHQ-표지된 DVD Ig에 대한 결합시, ALEXA 488-표지된 항원의 형광성 방사는 20 내지 40%로 퀀치(quench)되는 것으로 밝혀졌다.
형광성 강도에 있어서의 변화가 특수 BHQ-DVD-Ig에 대해 결합된 항원의 분획에 직접적으로 비례하는 것으로 추정하여, 유리된 BHQ-DVD-Ig의 농도를 하기 수학식 1로부터 계산할 수 있다:
Figure pct00021
상기 수학식에서,
Ligandtotal 및 ABStotal은 각각 -항원 농도 및 이러한 항원에 대한 총 DVD-Ig 결합 부위이고,
Fbound는 결합한 항원의 분획이다. 결합 데이타는 수학식 2에 따른 평형 해리 상수(KD)를 수득하기 위해 단순 결합 모델을 사용하여 핏팅하였다:
Figure pct00022
DVD-Ig 및 각각의 모 mAb에 대한 계산된 평형 해리 상수는 표 18에 제공된다. 당해 표로부터 알 수 있는 바와 같이, DVD-Ig의 KD 값은 이들의 모 mAb의 것과 비교가능하다.
Figure pct00023
실시예 2.17: 친화도가 감소된 항원 둘다에 대한 DVD - Ig 의 동시 결합
다른 항원의 부재 및 존재하에서 각각의 항원에 대한 항-IL-18 및 항-IL-12 DVD-Ig의 해리 상수(1D4.1-ABT325, published by Wu et al. (2007) Nature Biotechn.25(11): 1290-7에 발표)를 표 19에 나타낸다. 단백질은 상기 기술된 바와 같이 표지하였다.
Figure pct00024
표 19에 나타낸 바와 같이, 항-IL-18 및 항-IL-12 DVD-Ig는 친화도의 감소없이 IL-12 및 IL-18에 결합할 수 있다. 따라서, DVD-Ig는 친화도를 절충하지 않으면서 항원 둘다에 동시에 결합할 수 있으며, 면역검정과 관련하여, 및 하나 이상의 항원의 동시 결합이 요구되는 다른 상황에서 사용될 수 있다.
실시예 3: ARCHITECT ? 분석 양식을 사용한 NGAL DVD-Ig의 평가
실시예 3.1 DVD-Ig-피복된 미세입자의 제조
600μL의 미세입자(5중량%/용적, 5.4 마이크로 직경, 제조원: Polymer Labs, Palo Alto, CA)를 525μL의 MES 완충액, pH 5.8과 혼합하였다. 자석으로 미세입자를 분리한 후, 상층액을 제거하였다. 입자를 1.13 mL의 MES 피복 완충액 중에 재현탁시키고, 항-NGAL DVD-Ig 중 하나를 0.17 mg/ml의 최종 농도로 가하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 혼합하였다. 미세입자를 세척하고 MES 피복 완충액 중에 재-현탁시키고, EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, 하이드로클로라이드)를 0.150 mg/mL의 최종 농도를 수득하도록 가하였다. 다시 세척한 후, 미세입자를 1.50 ml의 MES 피복 완충액 중에 재현탁시켰다. 미세입자 용액을 혼합하고 5분 동안 실온에서 텀블링한 후, 동일한 완충액으로 3회 세척하였다. 미세입자 용액을 미세입자 희석액(NaCl, 트리톤 X-100, 및 BSA를 함유하는 비스-트리스 완충액, pH 7.0 포함) 중에 0.1%의 최종 농도로 희석시켰다.
실시예 3.2: 아크리디늄과 DVD-Ig의 접합
20 mM 인산염 완충액(pH 7.2), 150 mM NaCl, 및 0.1% 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) 중의 각각의 DVD-Ig의 0.75mg/mL의 100μL를 6.7μL의 접합 완충액(150 mM 인산염 완충액, pH 8, 7.5% CHAPS, 및 376 mM NaCl) 및 2μL의 N10-(3-설포프로필)-N-(3-카복시프로필)-아크리디늄-9-카복사미드(또는 CPSP-아크리디늄 에스테르) N-하이드록시설신이미드(0.37 mg/mL의 농도에서)와 혼합하였다. 시료를 실온에서 밤새 항온처리하였다. 과도한 표지를 각각의 시료를 2개의 연속적인 탈염 컬럼(Zeba Desalt spin column, Thermo Scientific, Waltham, MA)을 통과시켜 제거하였다. 각각의 시료의 농도 및 표지화 효율을 UV 흡광에 의해 DVD-Ig의 경우 ε280 = 300,000 M-1cm-1, 및 아크리디늄의 경우 e370nm = 14,950 M-1cm-1을 사용하여 측정하였다. 접합체 중의 혼입비(I.R.)는 1.5 내지 6.0의 범위내에서 변하였다.
실시예 3.3: 제조된 NGAL-DVD-Ig 미세입자 및 접합체
9개의 NGAL DVD-Ig를 미세입자상에 별도로 피복시켜 접합체가 ARCHITECT? 분석포맷을 사용하여 평가되도록 제조하였다. DVD-Ig는 mAb 1-2322-455(달리는 "2322"로 언급)의 가변 결합 도메인, 또는 mAb 1-903-430(달리는 "903"으로 언급)의 가변 결합 도메인을 갖는 호모- 및 헤테로-DVD를 포함하였다. 예를 들어, DVD721은 동일한 가변 도메인, 예를 들면, DVD721은 동일한 가변 도메인, 즉 903을 함유하는 동종-DVD인 반면, DVD723은 상이한 가변 도메인, 즉, 903 및 2322를 함유하는 이종-DVD이다. 표 20은 항-NGAL DVD-Ig를 사용하여 제조된 NGAL DVD-Ig 미세입자 및 접합체를 나타낸다.
Figure pct00025
주:
Y = 제조된 미세입자 또는 접합체를 나타낸다.
N = 제조되지 않은 미세입자 또는 접합체를 나타낸다.
NA = 평가되지 않음
IR* = 접합체에 대한 아크리디늄 혼입비
실시예 3.4: ARCHITECT ? NGAL 면역검정
재조합체 NGAL 시료(0, 10, 1,000 및 1,500 ng/mL)를 ARCHITECT? 분석기(제조원: Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) 상에서 항-NGAL DVD-Ig을 사용하여 제조된 미세입자와 접합체 시약을 사용하여 평가하였다. 표 21에 나타낸 바와 같이, 항-NGAL DVD-Ig를 미세입자 및/또는 접합체 상에 피복하고 모 mAb 1-2322-455, 모 mAb 1-903-430, 키메라 mAb AB082(mAb 1-2322-455의 가변 결합 도메인, 달리는 "2322"로 언급), 또는 키메라 mAb AB083(mAb 1-903-430의 가변 결합 도메인, 달리는 "903"으로 언급)(즉, 키트 #2-12 및 #14-24 중에 합해진)과 함께 사용하였다. 미세입자 상에 피복된 DVD-Ig 중 일부를 DVD 접합체(즉, 키트 #26-31중에 합해진)와 함께 사용하였다. 3개의 대조군 키트를 미세입자상에 피복된 mAb를 사용하여 평가하고 접합체(#1-사용된 모 mAb, #13-사용된 키메라 mAb, 및 #25 사용된 1개의 모 mAb 및 1개의 키메라 mAb)로서 사용하였다. 시료를 7분의 예비처리 단계, 18분의 미세입자 및 시료 항온처리 단계, 및 4분의 미세입자 접합체 항온처리 단계를 사용하여 시험하였다.
Figure pct00026
주: DVD의 경우, 나열된 제1 가변 도메인은 외부 도메인이고, 나열된 제2 가변 도메인은 내부 도메인(예를 들면, DVD726은 외부 가변 도메인 903 및 내부 가변 도메인 2322를 갖는다)이다.
상대적인 광 단위(RLU)에 있어서의 증가가 4개의 재조합체 NGAL 시료(0, 10, 1,000, 및 1,500 ng/mL)의 경우 다양한 미세입자 및 접합체를 사용한 시험시 관측되었다(참조: 표 22). 따라서, DVD-Ig는 ARCHITECT? NGAL 면역검정에 성공적으로 사용되었다. 키트들 사이의 RLU에 있어서의 가변성은 미세입자 상에서 및 접합체 중에서 사용된 접합체 및/또는 항체의 아크리디늄 혼입 비에 있어서의 변화에 기여할 수 있었다.
Figure pct00027
Figure pct00028
3개의 키트, 즉, 표 22에 굵은 글씨로 강조한 키트 6, 21 및 26은 0 ng/mL 시료와 비교하여 NGAL 시료(10 ng/mL, 1,000 ng/mL, 및 1,500 ng/mL)에 대한 RLU에 있어서 최소 증가되었다. 이들 키트의 경우, DVD의 외부 가변 도메인은 미세입자 및 접합체(키트 6 및 21) 상의 mAb와 동일하거나 2개의 DVD가 동일하였다(키트 26). 그러나, RLU가 DVD-Ig의 동일한 외부 가변 도메인에 의해 영향받지 않고, mAb가 동일한(예를 들면, 키트 9, 18 및 27) 몇가지 예가 존재하였다.
따라서, ARCHITECT? NGAL 면역검정에서 시약으로서 사용된 NGAL DVD-Ig는 재조합체 NGAL 시료에서 NGAL의 농도에 있어서의 증가와 함께 RLU에 있어서의 증가를 생성하였다.
참조 문헌 삽입
본 기재내용은 분자생물학 및 약물 전달 분야에서 널리 공지된 전반적인 기술에 대한 참조문헌을 인용한다. 이들 기술은 하기의 공개문헌에 기재된 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993);
Ausubel et al. (eds.), Short Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (4th edition, 1999) (ISBN 0-471-32938-X);
Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999);
Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984);
Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981;
Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);
Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991);
Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;
Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5);
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);
Langer and Wise (eds.), Medical Applications of Controlled Release, CRC Press, Boca Raton, FL (1974);
Lu and Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X);
Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4); Robinson, J.R. (ed.), Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., NY (1978);
Ruan, Q., Skinner, J.P. and Tetin, S.Y. Using non-fluorescent FRET acceptors in protein binding studies. Analyt. Biochemistry (2009), 393, 196-204;
Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6);
Smolen and Ball (eds.), Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, John Wiley & Sons, NY (1984);
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).
모든 인용된 문헌(특정 분야의 문헌, 특허, 특허원, 데이터베이스 및 웹사이트를 포함)의 내용이 본원에 참조로서 인용될 수 있고 이에 의해 본원에 인용된 참조문헌으로서 임의의 목적에 대한 이들의 전문이 특별하게 인용된다. 본 기재내용의 수행은 달리 언급되지 않는 경우 당업계에 널리 공지된 바와 같은 면역학, 분자 생물학 및 세포 생물학을 사용한다.
균등 범위
본 기재내용은 취지 또는 필수 특성을 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서 이전의 양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 발명을 제한하기 보다는 설명하기 위해 제공된 것으로 간주되어야 한다. 발명의 범위는 따라서 이전에 기재된 것 보다는 첨부된 특허청구범위에 지적되어 있고 따라서 특허청구범위의 균등한 의미 및 범위내에서의 모든 변화는 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBOTT LABORATORIES <120> DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF <130> 9799US01 <150> 61/174,800 <151> 2009-05-01 <160> 117 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 1 5 10 15 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 1 5 10 15 Val <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ser Ala Lys Thr Thr Pro 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Arg Ala Asp Ala Ala Pro 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala 1 5 10 15 Arg Val <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Ala Asp Ala Ala Pro 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Thr Val Ala Ala Pro 1 5 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Gln Pro Lys Ala Ala Pro 1 5 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ala Lys Thr Thr Pro Pro 1 5 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Ala Lys Thr Thr Ala Pro 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gln Val Gln Tyr Pro Ala Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 20 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 20 25 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Lys Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ile Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg <210> 35 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile His Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Met Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Arg 100 105 <210> 37 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Arg Glu Gly His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Thr Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Thr Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 39 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Phe Gly Ser Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 43 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Val Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 46 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 46 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 47 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Val Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 48 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Thr Asp Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 49 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Tyr Asp Tyr Asp Tyr Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 50 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Thr Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Leu Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 51 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gln Val Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Glu 145 150 155 160 Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile 165 170 175 Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe Arg Asp Lys 180 185 190 Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu 195 200 205 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 210 215 220 Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ala <210> 52 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125 Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser 130 135 140 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu 145 150 155 160 Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln 180 185 190 Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro 195 200 205 Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 210 215 220 <210> 53 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met 130 135 140 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 145 150 155 160 Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn 180 185 190 Asn Glu Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser 195 200 205 Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 250 <210> 54 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 130 135 140 Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser 180 185 190 Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Leu Lys Arg 225 <210> 55 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 145 150 155 160 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 165 170 175 Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys 195 200 205 Phe Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 210 215 220 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 260 <210> 56 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn 145 150 155 160 Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 165 170 175 His Leu Leu Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn 195 200 205 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 210 215 220 Asp Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 235 240 <210> 57 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val 130 135 140 Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser 145 150 155 160 Phe Thr Ala Tyr Thr Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Asn 165 170 175 Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr 180 185 190 Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 195 200 205 Ser Ile Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Arg Glu Gly His Tyr Tyr 225 230 235 240 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 58 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 130 135 140 Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Thr Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 145 150 155 160 Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Thr Thr Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser 180 185 190 Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln His His Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Leu Lys Arg 225 <210> 59 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160 Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Ala 165 170 175 Tyr Thr Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp 180 185 190 Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys 195 200 205 Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ile Ala 210 215 220 Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Arg Glu Gly His Tyr Tyr Ala Met Asp 245 250 255 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 260 265 <210> 60 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 130 135 140 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 145 150 155 160 Ile Tyr Thr Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 165 170 175 Gln Leu Leu Val Tyr Thr Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Lys 195 200 205 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 210 215 220 Gly Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 235 240 <210> 61 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Arg Glu Gly His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 130 135 140 Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala 145 150 155 160 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg 165 170 175 Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly 180 185 190 Ser Leu Asn Asn Asn Glu Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala 195 200 205 Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 210 215 220 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly 225 230 235 240 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 250 255 <210> 62 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Thr Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Thr Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 130 135 140 Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser 180 185 190 Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln His His Tyr Asp Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Leu Lys Arg 225 <210> 63 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Tyr Asp Arg Glu Gly His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 145 150 155 160 Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 165 170 175 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Asn 195 200 205 Asn Asn Glu Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 210 215 220 Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Asp Gly Trp Phe Ala 245 250 255 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 260 265 <210> 64 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Thr Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Thr Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn 145 150 155 160 Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 165 170 175 His Leu Leu Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn 195 200 205 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 210 215 220 Asp Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 235 240 <210> 65 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg 165 170 175 Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 180 185 190 Ser Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg 195 200 205 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala 210 215 220 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 66 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 130 135 140 Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 145 150 155 160 Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser 180 185 190 Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Leu Lys Arg 225 <210> 67 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Ser 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile 165 170 175 Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Arg Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His 210 215 220 Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 68 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125 Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser 130 135 140 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu 145 150 155 160 Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln 180 185 190 Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro 195 200 205 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 210 215 220 <210> 69 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Lys Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ile Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Lys Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 130 135 140 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 145 150 155 160 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 180 185 190 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr 195 200 205 Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 210 215 220 Tyr Leu Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Ile Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 70 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile 115 120 125 Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys 130 135 140 Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Asp 145 150 155 160 Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 165 170 175 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp 180 185 190 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 195 200 205 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His 210 215 220 Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 235 240 <210> 71 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Lys Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ile Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Lys Ile Gln Leu 115 120 125 Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn 165 170 175 Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn 195 200 205 Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Arg Asp Ser 210 215 220 Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 72 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser 115 120 125 Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser 130 135 140 Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 145 150 155 160 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala 165 170 175 Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 180 185 190 Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu 195 200 205 Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly 210 215 220 Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 <210> 73 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Lys Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys 130 135 140 Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 145 150 155 160 Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 180 185 190 Ala Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala 195 200 205 Thr Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala 210 215 220 Thr Tyr Leu Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Ile Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 74 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys 130 135 140 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala 145 150 155 160 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 165 170 175 Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 195 200 205 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe 210 215 220 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 <210> 75 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Lys Ile Gln 115 120 125 Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 145 150 155 160 Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile 165 170 175 Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe Leu Gln Ile 195 200 205 Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Arg Asp 210 215 220 Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 76 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala 115 120 125 Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile 130 135 140 Ser Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 145 150 155 160 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly 165 170 175 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu 180 185 190 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 195 200 205 Asn Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 210 215 220 Leu Lys Arg 225 <210> 77 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Lys Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ile Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160 Asn Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser 180 185 190 Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 78 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 78 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile 115 120 125 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr 130 135 140 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr Leu Ala 145 150 155 160 Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn 165 170 175 Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp 195 200 205 Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu Thr Phe 210 215 220 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 <210> 79 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Lys Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ile Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ile Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Ser Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser 165 170 175 Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr 195 200 205 Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Phe 210 215 220 Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 80 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala 115 120 125 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 130 135 140 Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly 145 150 155 160 Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly 165 170 175 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu 180 185 190 Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln 195 200 205 His His Tyr Asp Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 210 215 220 Leu Lys Arg 225 <210> 81 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gln Val Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 145 150 155 160 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile 165 170 175 Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys Asn Lys 180 185 190 Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu 195 200 205 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp 210 215 220 Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 82 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala 115 120 125 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn 130 135 140 Asp Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 165 170 175 Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln 180 185 190 Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Asp Tyr Ser Ser Pro 195 200 205 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 210 215 220 <210> 83 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val 130 135 140 Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 145 150 155 160 Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr 180 185 190 Asp Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser 195 200 205 Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 84 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro 115 120 125 Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala 165 170 175 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 195 200 205 His Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Ile Lys Arg 225 <210> 85 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly 145 150 155 160 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 165 170 175 Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys 195 200 205 Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220 Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 260 <210> 86 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu 130 135 140 Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 165 170 175 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp 180 185 190 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 195 200 205 Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Asp Tyr 210 215 220 Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 225 230 235 240 <210> 87 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Ser Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser 165 170 175 Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr 195 200 205 Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Phe 210 215 220 Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 88 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125 Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser 130 135 140 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu 145 150 155 160 Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln 180 185 190 Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Ile Pro 195 200 205 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 210 215 220 <210> 89 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160 Asn Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser 180 185 190 Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 90 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 130 135 140 Ala Ser Glu Asn Phe Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 145 150 155 160 Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser 180 185 190 Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln His His Tyr Asp Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Leu Lys Arg 225 <210> 91 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Val Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 145 150 155 160 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 165 170 175 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 180 185 190 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 195 200 205 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 210 215 220 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg His Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 260 <210> 92 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 115 120 125 Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 165 170 175 Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn 195 200 205 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 210 215 220 Asp Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 235 240 <210> 93 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro 130 135 140 Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160 His Tyr Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys 165 170 175 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp 180 185 190 Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr 195 200 205 Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr 210 215 220 Phe Cys Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 94 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 94 Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Asn Val Leu 115 120 125 Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn Gly Asp Ser Tyr 145 150 155 160 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Phe Leu Ile 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu 195 200 205 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe 210 215 220 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 225 230 235 <210> 95 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gln Ile Gln Leu Val 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly Ile Asn Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr 165 170 175 His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala 180 185 190 Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn 195 200 205 Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Ser His Arg 210 215 220 Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 <210> 96 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu 115 120 125 Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp 130 135 140 Pro Val Asp Tyr Asn Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 145 150 155 160 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu 165 170 175 Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 180 185 190 Asn Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 195 200 205 Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 210 215 220 Leu Glu Ile Lys Arg 225 <210> 97 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 97 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Val Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gln Val Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 145 150 155 160 Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile 165 170 175 Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys 180 185 190 Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Val Gln Leu 195 200 205 Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Asp 210 215 220 Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 98 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 98 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Val Val 115 120 125 Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly Gln Pro Ala 130 135 140 Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys 145 150 155 160 Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 195 200 205 Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Thr His Phe 210 215 220 Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 225 230 235 <210> 99 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 99 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Val Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gln Ile Gln 115 120 125 Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly Ile Asn 145 150 155 160 Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile 165 170 175 Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile 195 200 205 Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Ser 210 215 220 His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 100 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 100 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Asn Val 115 120 125 Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala 130 135 140 Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn Gly Asp Ser 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Phe Leu 165 170 175 Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 180 185 190 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His Pro Val Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro 210 215 220 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 225 230 235 <210> 101 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 101 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Val Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln 130 135 140 Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys 145 150 155 160 Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly Ile Asn Trp Val Lys 165 170 175 Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His 180 185 190 Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe 195 200 205 Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu 210 215 220 Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys Thr Arg Ser His Arg Phe 225 230 235 240 Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 102 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 102 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala 115 120 125 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys 145 150 155 160 Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala 180 185 190 Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala 210 215 220 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 245 <210> 103 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 103 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150 155 160 Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln 180 185 190 Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 195 200 205 Ala Phe Val Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 104 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 104 Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Val Val Met 115 120 125 Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly Gln Pro Ala Ser 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu 165 170 175 Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 180 185 190 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 195 200 205 Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Thr His Phe Pro 210 215 220 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 225 230 235 <210> 105 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 105 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Lys Asp Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Gly Asp Met Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gln 130 135 140 Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser 145 150 155 160 Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 165 170 175 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 180 185 190 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 195 200 205 Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Val 210 215 220 Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val 225 230 235 240 Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 106 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 106 Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Trp Pro Val Asp Tyr Asn 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Phe Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Asn Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala 115 120 125 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp 165 170 175 Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Val 180 185 190 Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 210 215 220 Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 245 <210> 107 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 107 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Val Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Asp Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gln Val Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 145 150 155 160 Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile 165 170 175 Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys 180 185 190 Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Val Gln Leu 195 200 205 Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Asp 210 215 220 Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 108 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 108 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Thr Asp Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Val Val 115 120 125 Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Thr Gly Gln Pro Ala 130 135 140 Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys 145 150 155 160 Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Glu Ser Pro Lys Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Val Thr Asp Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 195 200 205 Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Thr His Phe 210 215 220 Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 225 230 235 <210> 109 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile His Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro 130 135 140 Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro 165 170 175 Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile His Thr Glu Thr Gly Glu 180 185 190 Pro Arg Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu 195 200 205 Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu 210 215 220 Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Phe Gly Ser 225 230 235 240 Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 110 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 110 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Met Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His 115 120 125 Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 165 170 175 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Met Asp Phe Thr 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Leu Glu Arg 225 <210> 111 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile His Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Val Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 130 135 140 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 165 170 175 Gly Trp Ile His Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Val Asp Asp Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 195 200 205 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 210 215 220 Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 112 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 112 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Met Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val 115 120 125 Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser 130 135 140 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Gly Met Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln 180 185 190 Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro 195 200 205 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Arg 210 215 220 <210> 113 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 113 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Phe Gly Ser Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 130 135 140 Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His 165 170 175 Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly 180 185 190 Ser Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp 195 200 205 Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Ser Glu 210 215 220 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Phe Gly Ser 225 230 235 240 Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 114 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 114 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys 115 120 125 Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala 130 135 140 Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 145 150 155 160 Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly 165 170 175 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 195 200 205 Gln His Tyr Ser Thr Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 210 215 220 Lys Arg 225 <210> 115 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 115 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Tyr Asp Tyr Asp Tyr Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val 130 135 140 Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 145 150 155 160 Phe Thr Asp Tyr Asn Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser 165 170 175 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Gly Tyr 180 185 190 Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser 195 200 205 Asn Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220 Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Asp Tyr Asp Tyr Leu Thr Asp 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 250 <210> 116 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 116 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Thr Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Leu Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg 130 135 140 Thr Ser Lys Asn Val Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr 145 150 155 160 Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Leu Pro 165 170 175 Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Ile Lys Arg 225 <210> 117 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (80)

  1. VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서:
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역이고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    여기서, 제1 모 항체와 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원의 쌍과 결합할 수 있는, 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 VD1 및 VD2가 서열번호 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  3. VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서:
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역이고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    여기서, 제1 모 항체와 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원의 쌍과 결합할 수 있는, 결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 각각의 VD1 및 VD2가 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, (X2)n이 부재하는, 결합 단백질.
  6. 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서, 여기서,
    제1 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서:
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역이고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하고;
    여기서, 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서:
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하며,
    여기서 제1 모 항체와 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있고, 여기서 결합 단백질은 NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항원의 쌍과 결합할 수 있는, 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 각각의 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인이 서열번호 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인이 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  8. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (X2)n이 서열번호 1 내지 28 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열인, 결합 단백질.
  9. 제6항에 있어서, 상기 결합 단백질이 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄 및 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는, 결합 단백질.
  10. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이 본래의 서열 Fc 영역 및 변이 서열 Fc 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 결합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD 기원의 Fc 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 결합 단백질.
  12. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄의 VD1 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄의 VD1이 동일한 제1 및 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득되는, 결합 단백질.
  13. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄의 VD1 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄의 VD1이 상이한 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득되는, 결합 단백질.
  14. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄의 VD2 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄의 VD2가 각각 동일한 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득되는, 결합 단백질.
  15. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄의 VD2 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄의 VD2가 상이한 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득되는, 결합 단백질.
  16. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 모 항체가 상기 항원상의 상이한 에피토프에 결합하는, 결합 단백질.
  17. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부가, 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 상기 제2 항원에 결합하는 효능과 상이한 효능으로 상기 제1 항원에 결합하는, 결합 단백질.
  18. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부가, 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 상기 제2 항원에 결합하는 친화도와 상이한 친화도로 상기 제1 항원에 결합하는, 결합 단백질.
  19. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 및 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가, 인간 항체, CDR 접목 항체 및 인간화된 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  20. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 및 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가, Fab 단편; a F(ab')2 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 단일 암(arm)의 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; dAb 단편; 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 단일쇄 항체; 및 디아바디(diabody)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  21. 제1항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부, 또는 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는, 결합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 상기 목적하는 성질이 하나 이상의 항체 파라미터로부터 선택되는, 결합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 상기 항체 파라미터가 항원 특이성, 항원에 대한 친화도, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인지, 안정성, 용해도, 생산 효율, 면역원성, 약리역학, 생물유용성, 조직 교차 반응성, 및 유사 항원 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  24. 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 2개의 항원에 결합할 수 있는 DVD-Ig로서,
    여기서 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역이고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]을 포함하고;
    여기서, 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하며,
    여기서, 제1 모 항체와 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있고,
    여기서, 각각의 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인은 서열번호 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인은 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, DVD-Ig.
  25. 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 2개의 항원에 결합할 수 있는 DVD-Ig로서, 여기서,
    제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄가 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역이고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하고;
    제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하며,
    여기서, 제1 모 항체와 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있고,
    여기서, DVD-Ig는 NGAL, HIV, IL-18, BNP 및 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 항원에 결합하는, DVD-Ig.
  26. (a) 제1 항원과 결합할 수 있는 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득하는 단계;
    (b) 제2 항원과 결합할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득하는 단계;
    (c) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고,
    VD2는 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고,
    C는 중쇄 불변 도메인이고,
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하고;
    (X2)n는 Fc 영역이고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하는 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계;
    (d) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고,
    VD2는 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고,
    C는 경쇄 불변 도메인이고,
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하는 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계; 및
    (e) 상기 제1 및 상기 제2 항원과 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 면역글로불린이 생성되도록 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 발현시키는 단계를 포함하며;
    여기서, 상기 제1 모 항체 및 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있고, 여기서 이원 가변 도메인 면역글로불린은 NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원의 쌍과 결합할 수 있는, 2개의 항원에 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 면역글로불린을 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 각각의 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인이 서열번호 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인은 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 각각의 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 및 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 인간 항체, CDR 접목 항체 및 인간화된 항체로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  29. 제26항에 있어서, 각각의 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 및 각각의 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 Fab 단편; a F(ab')2 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 단일 암(arm)의 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; dAb 단편; 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 단일쇄 항체; 및 디아바디로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 이원 가변 도메인 면역글로불린에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는, 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가, 이원 가변 도메인 면역글로불린에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는, 방법.
  32. 제26항에 있어서, 상기 Fc 영역이 본래의 서열 Fc 영역 및 변이 서열 Fc 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제26항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 및 IgD 기원의 Fc 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 바람직한 특성이 하나 이상의 항체 매개변수 중에서 선택되는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 바람직한 특성이 하나 이상의 항체 매개변수 중에서 선택되는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 항체 매개변수가 항원 특이성, 항원에 대한 친화도, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인지, 안정성, 가용성, 생산 효율, 면역원성, 약리역학, 생체 이용률, 조직 교차 반응성 및 이종상동성 항원 결합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 방법.
  37. 제35항에 있어서, 항체 매개변수가 항원 특이성, 항원에 대한 친화도, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인지, 안정성, 가용성, 생산 효율, 면역원성, 약리역학, 생체 이용률, 조직 교차 반응성 및 이종상동성 항원 결합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 방법.
  38. 제26항에 있어서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부가, 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 제2 항원에 결합하는 친화도와는 상이한 친화도로 제1 항원에 결합하는, 방법.
  39. 제26항에 있어서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부가, 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 제2 항원에 결합하는 효능과는 상이한 효능으로 제1 항원에 결합하는, 방법.
  40. (a) 제1 항원과 결합할 수 있고 이원 가변 도메인 면역글로불린에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득하는 단계;
    (b) 제2 항원과 결합할 수 있고 이원 가변 도메인 면역글로불린에 의해 나타나는 하나 이상의 목적하는 성질을 갖는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부를 수득하는 단계;
    (c) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서:
    VD1은 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고,
    VD2는 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이고,
    C는 중쇄 불변 도메인이고,
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역이고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하는 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계;
    (d) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서:
    VD1은 상기 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고,
    VD2는 상기 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이고,
    C는 경쇄 불변 도메인이고,
    (X1)n은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, 여기서 당해 (X1)n은 존재하거나 또는 부재하며;
    (X2)n은 Fc 영역을 포함하지 않고, 여기서 당해 (X2)n은 존재하거나 또는 부재한다]를 포함하는 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 작제하는 단계; 및
    (e) 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 쇄를 발현시키는 단계를 포함하는, 바람직한 특성을 갖는 2개의 항원에 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 면역글로불린을 생성하는 방법으로서,
    여기서, 제1 모 항체 및 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있고,
    목적하는 성질을 갖는, 상기 제1 및 상기 제2 항원과 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 면역글로불린이 생성되도록 하며,
    여기서, 상기 이원 가변 도메인 면역글로불린은 NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍과 결합할 수 있는, 방법.
  41. 시험 시료 중에서 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법으로서,
    여기서, 항원 또는 이의 단편이, 단독으로 또는 IL-18과 조합하여, HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    여기서, 당해 방법이 면역검정에 의해 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석함을 포함하며,
    여기서, 면역검정이 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고 (ii) 검출가능한 표지에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날을, 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함하고,
    여기서, 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 또는 이의 단편의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하고,
    여기서, 상기 적어도 하나의 결합 단백질중 하나가 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]을 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있고,
    이에 의해, 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도가 측정되는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계,
    (ii) 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원 또는 이의 단편 /검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및
    (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원 또는 이의 단편/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원 또는 이의 단편과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원 (또는 이의 단편) 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 각각을 형성한다], 및
    (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고, 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 양 또는 농도에 반비례한다]에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정함을 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제41항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  48. 제42항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  49. 제43항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  50. 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법으로서,
    여기서, 항원 또는 이의 단편이, 단독 또는 IL-18과 조합하여 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    여기서, 당해 방법이 면역검정에 의해 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석함을 포함하며,
    여기서, 면역검정이 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고, (ii) 검출가능한 표지에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날을, 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함하고,
    여기서, 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 또는 이의 단편의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하고,
    여기서, 상기 적어도 하나의 결합 단백질중 하나가 (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있고,
    이에 의해, 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도가 측정되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계,
    (ii) 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원 또는 이의 단편/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및
    (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원 또는 이의 단편/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하여, 이에 의해 시험 시료 중의 항원의 존재, 양 또는 농도가 측정되는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함하는, 방법.
  52. 제50항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원 또는 이의 단편과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원 또는 이의 단편 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 각각을 형성한다], 및
    (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고, 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 양 또는 농도에 반비례한다]에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정함을 포함하는, 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제52항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제50항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  57. 제51항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  58. 제52항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  59. 시험 시료 중에서 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법으로서,
    여기서, 항원 또는 이의 단편이 단독으로 또는 IL-18과 조합하여 HIV, BNP, TnI, 및 NGAL로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    여기서, 당해 방법이 면역검정에 의해 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석함을 포함하며,
    여기서, 면역검정이 (i) 적어도 하나의 결합 단백질 및 적어도 하나의 검출가능한 표지를 사용하고, (ii) 검출가능한 표지에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날을, 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함하고,
    여기서, 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 또는 이의 단편의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하고,
    여기서, 상기 적어도 하나의 결합 단백질 중 하나가 (i') 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩타이드 쇄가 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 (또는 이의 항원 결합부)로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 쇄가 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]을 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있고,
    이에 의해, 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도가 측정되는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계,
    (ii) 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원 또는 이의 단편/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및
    (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원 또는 이의 단편/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하여, 이에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도가 측정되는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 결합 단백질이다)를 포함하는, 방법.
  61. 제59항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원 또는 이의 단편과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원 또는 이의 단편 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 각각을 형성한다], 및
    (ii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 결합 단백질이고, 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 양 또는 농도에 반비례한다]에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정함을 포함하는, 방법.
  62. 제59항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제60항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 임의로 추가로 변형시킴을 포함하는, 방법.
  65. 제59항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  66. 제60항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  67. 제61항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  68. 시험 시료 중에서 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법으로서,
    여기서, 항원 또는 이의 단편이 HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    여기서, 당해 방법이 면역검정에 의해 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석함을 포함하며,
    여기서, 면역검정이 (i) 2개의 항원 및 적어도 하나의 검출가능한 표지에 결합할 수 있는 적어도 하나의 DVD-Ig를 사용하고 (ii) 검출가능한 표지에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날을, 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적이거나 또는 간접적인 지표로서 생성된 시그날과 비교함을 포함하고,
    여기서, 상기 캘리브레이터는 일련의 캘리브레이터들의 임의의 부분이며, 상기 캘리브레이터 각각은 항원 또는 이의 단편의 농도에 의해 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하고,
    여기서, 상기 적어도 하나의 DVD-Ig 중 하나가 (i') 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄가 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄가 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]을 포함하고, (ii') HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개의 항원 또는 이의 단편에 결합할 수 있는, 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키는 단계,
    (ii) 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 포획제에 의해 결합되지 않는 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하여 포획제/항원 또는 이의 단편/검출제 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 검출제와 접촉시키는 단계, 및
    (iii) 단계 (ii)에서 형성된 포획제/항원 또는 이의 단편/검출제 복합체 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하여, 이에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도가 측정되는 단계(여기서, 적어도 하나의 포획제 및/또는 적어도 하나의 검출제는 적어도 하나의 DVD-Ig이다)를 포함하는, 방법.
  70. 제68항에 있어서,
    (i) 시험 시료를, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합함으로써 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체를 형성하는, 적어도 하나의 포획제와 접촉시키고, 동시에 또는 후속적으로 어떤 순서로도 시험 시료를, 적어도 하나의 포획제에 결합하기 위한 시험 시료 중의 특정 항원 또는 이의 단편과 경쟁할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계[여기서, 시험 시료 중에 존재하는 특정 항원 또는 이의 단편 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 포획제/항원 또는 이의 단편 복합체 및 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 각각을 형성한다], 및
    (ii) 단계 (i)에서 형성된 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 중에서 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날을 바탕으로 하여 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계[여기서, 적어도 하나의 포획제는 적어도 하나의 DVD-Ig이고, 포획제/검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 시그날은 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 양 또는 농도에 반비례한다]에 의해 시험 시료 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정함을 포함하는, 방법.
  71. 제68항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  72. 제69항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제70항에 있어서, 상기 시험 시료가 환자로부터 기원하고, 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 진단하거나, 예측하거나 평가하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 치료 효능을 평가하는 것을 추가로 포함하는 경우, 당해 방법이 효능을 개선시킬 필요가 있는 환자의 치료학적/예방학적 치료를 변형시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제68항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  75. 제69항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  76. 제70항에 있어서, 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하도록 조정되는, 방법.
  77. 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 성분은, (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지되는 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함하는, 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 키트.
  78. 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은, (i') VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지되는 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함하는, 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 키트.
  79. 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은, (i') 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄{여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 여기서 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함한다}를 포함하고, (ii') NGAL과 NGAL; HIV와 HIV; NGAL과 IL-18; BNP와 BNP; 및 TnI와 TnI로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지되는 결합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함하는, 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 키트.
  80. 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 적어도 하나의 성분 및 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은, (i') 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서 제1 및 제3 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, 여기서 제2 및 제4 폴리펩타이드 쇄는, 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제1 모 항체와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부로부터 수득된 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, (X1)n은, 임의로 존재하며, 존재할 경우, CH1이 아닌 링커이며, (X2)n은 임의로 존재하는 Fc 영역이다]를 포함하고, (ii') HIV, BNP, TnI, NGAL 및 IL-18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개의 항원 또는 이의 단편에 결합할 수 있는, 임의로 검출가능하게 표지된 DVD-Ig를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함하는, 항원 또는 이의 단편에 대해 시험 시료를 분석하기 위한 키트.
KR1020117028863A 2009-05-01 2010-04-30 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 KR20140014382A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17480009P 2009-05-01 2009-05-01
US61/174,800 2009-05-01
PCT/US2010/033246 WO2010127294A2 (en) 2009-05-01 2010-04-30 Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140014382A true KR20140014382A (ko) 2014-02-06

Family

ID=43032808

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117028863A KR20140014382A (ko) 2009-05-01 2010-04-30 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20110008766A1 (ko)
EP (1) EP2424566A4 (ko)
JP (1) JP2012525441A (ko)
KR (1) KR20140014382A (ko)
CN (1) CN102458459A (ko)
AU (1) AU2010242840B2 (ko)
BR (1) BRPI1012195A2 (ko)
CA (1) CA2760332A1 (ko)
IL (1) IL216048A0 (ko)
MX (1) MX2011011670A (ko)
RU (1) RU2011148918A (ko)
SG (1) SG175426A1 (ko)
TW (1) TW201116624A (ko)
WO (1) WO2010127294A2 (ko)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2552281T3 (es) 2001-05-11 2015-11-26 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Proteínas de unión específica y usos de las mismas
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US9090693B2 (en) * 2007-01-25 2015-07-28 Dana-Farber Cancer Institute Use of anti-EGFR antibodies in treatment of EGFR mutant mediated disease
MX2009009782A (es) * 2007-03-15 2010-09-10 Ludwig Inst Cancer Res Metodo de tratamiento que utiliza anticuerpos egfr e inhibidores de src y formulaciones relacionadas.
WO2009023265A1 (en) 2007-08-14 2009-02-19 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2726087A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153578A (ru) * 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
BRPI0922807A2 (pt) * 2008-12-04 2015-12-22 Abbott Lab imonuglobulinas de domínio variável duplo e usos dos mesmos
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
KR20120060877A (ko) 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US20110076232A1 (en) * 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2542582A4 (en) 2010-03-02 2013-12-04 Abbvie Inc THERAPEUTIC PROTEINS LINKING TO DLL4
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN103596591B (zh) 2011-02-08 2016-08-24 Abbvie公司 骨关节炎和疼痛的治疗
WO2012118903A2 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Amgen Inc. Bispecific binding agents
AU2011382454B2 (en) 2011-11-30 2017-02-23 Abbvie Biotechnology Ltd Vectors and host cells comprising a modified SV40 promoter for protein expression
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
JOP20200308A1 (ar) 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
JP6401702B2 (ja) 2012-09-07 2018-10-10 ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー オブ・アルバータ 炎症性肝疾患の診断のための方法および組成物
CA2890263C (en) 2012-11-01 2020-03-10 Abbvie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
GB201308271D0 (en) * 2013-05-08 2013-06-12 Nat Univ Ireland Semi-automated whole blood immuno potency assay
EP3049442A4 (en) 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
CN105793439B (zh) 2013-11-06 2020-09-04 阿斯图特医药公司 以生物样品进行的针对igfbp7的具有改进的性能的测定
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
US9993551B2 (en) 2014-09-13 2018-06-12 Novartis Ag Combination therapies of EGFR inhibitors
BR112017010268B1 (pt) * 2014-11-19 2024-01-16 P & M Venge Ab Agente de ligação, composição de diagnóstico, kit de diagnóstico, método de diagnóstico de uma infecção bacteriana ou de diferenciação entre uma infecção bacteriana e uma infecção de viral, métodos para descartar uma infecção bacteriana ou viral em um indivíduo, métodos para considerar uma infecção bacteriana ou viral em um indivíduo, método para distinguir entre uma infecção bacteriana ou mista e uma infecção viral em um indivíduo, método para descartar uma doença infecciosa, método para identificação do tipo de infecção e dispositivo para o diagnóstico de infecções bacterianas
ES2571441B1 (es) * 2014-11-24 2017-03-07 Instituto De Investigación Sanitaria - Fundación Jiménez Díaz Uso de moléculas que reducen los niveles de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal (AAA)
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
JP7432502B2 (ja) * 2017-09-22 2024-02-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 分析目的のための多価単一または二重特異性組換え抗体
CN109678958B (zh) * 2019-01-31 2022-03-18 重庆探生科技有限公司 一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体及其制备方法和应用
MX2023000949A (es) 2020-07-23 2023-02-22 Othair Prothena Ltd Anticuerpos anti-beta-amiloide (abeta).
WO2023278520A1 (en) * 2021-06-30 2023-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Polypeptides targeting cd70-positive cancers
CN114366853B (zh) * 2022-01-20 2023-04-14 华东理工大学 一种高诱骨活性牙种植体涂层及其制备方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2134212T3 (es) * 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
CA2149329C (en) * 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US6491916B1 (en) * 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
HUP0104865A3 (en) * 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6818392B2 (en) * 2000-12-06 2004-11-16 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus and uses thereof
EP2340849A1 (en) * 2001-05-30 2011-07-06 Genentech, Inc. Anti-NGF antibodies for the treatment of various disorders
CA2461529A1 (en) * 2001-09-25 2003-04-03 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Recombinant anti-osteopontin antibody and use thereof
JP5105874B2 (ja) * 2003-07-18 2012-12-26 アムジエン・インコーポレーテツド 肝細胞増殖因子に対する特異的結合因子
CN1871259A (zh) * 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
KR101370253B1 (ko) * 2004-10-22 2014-03-05 암젠 인크 재조합 항체의 재접힘 방법
US8048992B2 (en) * 2005-02-28 2011-11-01 Institute For Antibodies Co., Ltd. Anti-IgSF4 antibody and utilization of the same
PT1869085E (pt) * 2005-03-24 2012-06-01 Vlaams Interuniv Inst Biotech Vzw Novo anticorpo anti-plgf
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US20070041905A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
RU2515108C2 (ru) * 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2007319672B2 (en) * 2006-06-06 2011-06-30 Genentech, Inc. Anti-DLL4 antibodies and methods using same
EP2032989B2 (en) * 2006-06-30 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Igfbp2 biomarker
ES2902063T3 (es) * 2006-09-08 2022-03-24 Abbvie Bahamas Ltd Proteínas de unión a interleucina-13
GB0708002D0 (en) * 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
US8227201B2 (en) * 2007-06-27 2012-07-24 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University BETA2-microglobulin and C reactive protein (CRP) as biomarkers for peripheral artery disease
US8753839B2 (en) * 2007-08-08 2014-06-17 Abbvie Inc. Compositions and methods for crystallizing antibodies
WO2009021754A2 (en) * 2007-08-15 2009-02-19 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Monospecific and multispecific antibodies and method of use
JP2011501673A (ja) * 2007-10-19 2011-01-13 アボット・ラボラトリーズ グリコシル化された哺乳動物ｎｇａｌ及びその使用
WO2010017103A2 (en) * 2008-08-04 2010-02-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Fully human anti-human nkg2d monoclonal antibodies
NZ591544A (en) * 2008-09-30 2013-01-25 Abbott Lab Improved method of rna display
CA2816803A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120263722A1 (en) * 2010-11-04 2012-10-18 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
TW201333035A (zh) * 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
TW201333033A (zh) * 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 雙可變域免疫球蛋白及其用途
JP2015509704A (ja) * 2011-12-30 2015-04-02 アッヴィ・インコーポレイテッド 受容体に対する二重可変ドメイン免疫グロブリン

Also Published As

Publication number Publication date
IL216048A0 (en) 2012-01-31
WO2010127294A2 (en) 2010-11-04
MX2011011670A (es) 2011-11-18
SG175426A1 (en) 2011-12-29
RU2011148918A (ru) 2013-06-10
JP2012525441A (ja) 2012-10-22
US20110008766A1 (en) 2011-01-13
EP2424566A4 (en) 2013-07-31
CN102458459A (zh) 2012-05-16
AU2010242840B2 (en) 2014-04-17
BRPI1012195A2 (pt) 2018-04-24
CA2760332A1 (en) 2010-11-04
AU2010242840A1 (en) 2011-12-15
WO2010127294A3 (en) 2011-01-20
TW201116624A (en) 2011-05-16
EP2424566A2 (en) 2012-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9046513B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256250B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2010289527C1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6009455B2 (ja) Ｉｌ−１アルファおよびベータ二重特異的二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
US8716450B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2010242840B2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20170226200A1 (en) Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US20150104452A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120014957A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20090304693A1 (en) Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
KR20120044294A (ko) 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2011050262A2 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013211542A1 (en) Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid