ES2571441B1 - Uso de moléculas que reducen los niveles de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal (AAA) - Google Patents
Uso de moléculas que reducen los niveles de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal (AAA) Download PDFInfo
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
Abstract
Uso de moléculas que reducen los niveles de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal (AAA). Uso de un anticuerpo capaz de unirse a lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal. Uso de una molécula de ácido nucleico antisentido capaz de inhibir la expresión del gen de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.
Description
USO DE MOLÉCULAS QUE REDUCEN LOS NIVELES DE LlPOCALlNA-2 PARA
LA FABRICACiÓN DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE
ANEURISMA AÓRTICO ABDOMINAL (MA)
SECTOR TÉCNICO La invención se encuadra en el campo médico del tratamiento del Aneurisma Aórtico Abdominal (MA).
ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN El aneurisma de aorta abdominal (AAA) es una enfermedad vascular en la que la aorta pierde su capacidad de regular su diámetro produciéndose una dilatación permanente del vaso que puede desembocar en la ruptura del mismo.
En la patogénesis de los AAA se encuentran implicados numerosos procesos y tipos celulares. La importancia de las células inflamatorias en el progreso de la enfermedad ha sido probada en numerosos estudios. Algunos de sus efectos perniciosos ocurren a través de la degradación proteolítica de la elastina de la capa media y del colágeno intersticial mediante la secreción de metaloproteinasas de matriz extracelular (MMPs) y la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y especies reactivas de oxígeno entre otros compuestos. Entre otras células inflamatorias, los neutrófilos participan tanto en la formación como en la expansión del aneurisma.
Las terapias actuales de AAA comprenden acido acetilsalicílico (100mg) y un inhibidor de la hidroximetilglutaril CoA reductasa (20/40mg) una vez al día; en caso de tener algún factor de riesgo adicional, se aplicaria el tratamiento correspondiente. Si tuviera hipertensión arterial, se trataría con un antihipertensivo; el fallo cardíaco se trata con diuréticos, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina, beta bloqueantes yen algún caso, con potasio y digoxina.
La Iipocalina-2 (Lcn2) es una proteína soluble de 25 KDa cuya función inicial descrita estaba relacionada con la inmunidad innata ya que es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. Además de su función como transportador se ha descrito muchas otras funciones tales como factor de crecimiento, regulador del metabolismo lip idico, modulador de la función de las células polimorfonucleares y preservador de la actividad gelatinasa de neutrófilos. Aunque inicialmente su secreción fue descrita por neutrófilos, se conoce hoy en día que es producida por otros tipos celulares tales como hepatocitos, células epiteliales, células epiteliales tubulares o vasculares de músculo liso, entre otras. La Lcn2 se ha descrito como un buen biomarcador de daño renal agudo (Chakraborty, S. y col., "The multifaceted roles of neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL) in inflammation and cancer. Biochim Biophys Acta, 2012. 1826(1): p. 129-69).
La Upocalina 2 (o NGAL) se ha asociado a la prevención y tratamiento de fallo cardiaco (WO 2012/072820 A1). Sin embargo, el fallo cardiaco y el AAA son dos entidades distintas, ya que mientras el fallo cardiaco afecta al corazón, el MA se desarrolla en la aorta a la altura de la zona abdominal. La causa más común del fallo cardíaco es la arteriopatia coronaria, un estrechamiento de los pequeños vasos sanguíneos que suministran sangre y oxígeno al corazón. En cambio, el AAA es una dilatación de la aorta abdominal de etiología desconocida.
Lcn2 está incrementada en el plasma de pacientes con AAA, que se acumula dentro del trombo intraluminal del aneurisma y es liberada al medio extracelular (RamosMozo, P. y col., "Increased plasma levels of NGAL, a marker of neutrophil activation, in patients with abdominal aortic aneurysm". Atherosclerosis, 2012. 220(2): p. 552-6). Esta publicación se considera la más cercana de la técnica, porque identifica Lcn2 como un marcador circulante que podría servir potencialmente para el diagnóstico de AAA. Es importante destacar que el aumento de los niveles extracelulares de Lcn2 pueden reflejar un estado de activación sistémica o local por parte de los neutrófilos y/o un daño a nivel renal, pero en cualquier caso, esta asociación entre Lnc2 circulante y AAA no implica causalidad y por lo tanto, no demuestra que la inhibición de Lcn2 pueda tener un efecto beneficioso en la prevención o tratamiento del AAA. De hecho, el potencial uso terapéutico de inhibir o bloquear Lcn2 en AAA no ha sido previamente demostrado.
El problema de la técnica es encontrar una nueva terapia efectiva de AAA. La solución que propone la presente invención es utilizar Lcn2 como diana terapéutica inhibiendo su expresión o neutralizando su función en el paciente afectado, en particular por un anticuerpo policlonal.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
La presente invención proporciona el uso de un anticuerpo capaz de unirse a lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.
En la presente invención se proporciona el uso de un anticuerpo neutralizante de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.
De forma preferible, dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
Este uso también puede definirse como un anticuerpo capaz de unirse a Iipocalina-2 para uso en el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.
Asimismo, también puede definirse como un método de tratamiento del aneurisma aórtico abdominal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo capaz de unirse a lipocalina-2, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención demuestra que la deficiencia de Lcn2 disminuye la expansión aneurismática, en particular se ha demostrado que los ratones deficientes para la proteína Lcn2 presentaron menor desarrollo aneurismático. También se ha demostrado que el tratamiento con un anticuerpo policlonal neutralizante anti-Lcn2 disminuye las lesiones aneurismáticas.
Esta demostración permite concluir que una molécula de ácido nucleico anti-sentido que inhiba la expresión del gen de Iipocalina-2 es útil en el tratamiento de aneurisma aórtica abdominal.
Por tanto, otra realización de la invención es el uso de una molécula de ácido nucleico anti-sentido capaz de inhibir la expresión del gen de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.
De forma preferible, dicho ácido nucleico es un ARN interferente silente.
Este uso también puede definirse como una molécula de ácido nucleico anti-sentido capaz de inhibir la expresión del gen de Iipocalina-2 para uso en el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.
Asimismo, también puede definirse como un método de tratamiento del aneurisma aórtico abdominal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido nucleico anti-sentido capaz de inhibir la expresión del gen de lipocalina-2, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los ejemplos aportados en la presente solicitud demuestran que la deficiencia de Lcn2 disminuye la expansión aneurismática. Se ha validado que en el modelo murino la inducción de un aneurisma induce un aumento de Lcn2 circulante en sangre (Figura 1A), y los ratones con aneurisma presentan por tanto mayores niveles circulantes de Lcn2 respecto a ratones sanos.
Seguidamente, se muestra que los ratones deficientes para la proteína Lcn2-1presentaron menor desarrollo aneurismático respecto a los ratones de fenotipo salvaje C57BL/6J o control (Figura 1B). Sólo 1 de los 11 ratones Lcn2 deficientes desarrollaron AAA acorde a la definición establecida en el modelo inicial (Pyo, R. y col., "Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms". J Clin Invest, 2000. 105(11): p. 1641-9); mientras que 10 de los 12 animales de fenotipo salvaje mostraron que tenían aneurisma. El diámetro aórtico de los ratones deficientes para Lcn2 resultó ser significativamente menor que los de fenotipo salvaje. Ninguno de los ratones infundidos con suero salino, ya fueran C57BU6J o Lcn2-/-, desarrollaron aneurismas y tuvieron un incremento aórtico similar. Mediante cuantificación de la tinción de Verhoeff Van Gieson se observó que la degradación de las capas de elastina (Figura 1C) era también menor en los ratones Lcn2-/-comparados con los de fenotipo salvaje. Por último, mediante cuantificación de la tinción de a-actina se demostró que la preservación de las células vasculares (Figura 1 D) era mayor en el ratón deficiente para lipocalina-2 respecto a los ratones de fenotipo salvaje.
Las lesiones en los ratones deficientes para Lcn2-/-demostraron tener menor contenido inflamatorio. Se demostró que las lesiones en los ratones KO tenían menor número de neutrófilos en los aneurismas respecto a los de fenotipo salvaje (cuantificación mediante marcaje de Ly.6B-2, Figura 2A), mientras que no hubo cambios en el contenido de linfocitos (C03, Figura 28) ni en monocitos-macrófagos (MOMA2, Figura 2C). La disminución de neutrófilos se ha relacionado directamente con una disminución de la expansión aneurismática (Circulation. 2005 Jul 12; 112(2):232-40). Además, los ratones deficientes para Lcn2-1-poseen menor actividad de las enzimas metaloproteinasas de matriz extracelular (MMP). La remodelación del vaso es un proceso fundamental en la aparición y el desarrollo del aneurisma en el que las enzimas metaloproteinasas juegan un papel importante. Mediante la inyección de una sonda activable por MMPs se determinó la actividad de estas enzimas en el aneurisma; mostrando que los ratones Lcn2-1-tienen menores niveles de actividad MMP en el aneurisma comparado con los ratones de fenotipo salvaje (Figura 20).
El tratamiento con anticuerpo neutralizante anti-Lcn2 disminuye las lesiones aneurismáticas. Tras la caracterización del anticuerpo se realizó una nueva serie de experimentos de inducción de aneurismas en animales C57BU6J tratándolos o con el anticuerpo control (lgG) o con el anticuerpo terapéutico (anti-Lcn2). Al igual que en la comparación de ratones de fenotipo salvaje y deficientes para Lcn2, los ratones tratados con el anticuerpo anti-Lcn2 presentaban menor incidencia de aneurismas que los ratones tratados con el anticuerpo control. El análisis de las lesiones mostraron que los ratones tratados con el anti-Lcn2 presentaban menor incremento del diámetro aórtico que los ratones tratados con el anticuerpo control (Figura 3A). Al contrario que en la comparación de los ratones KO respecto a los de fenotipo salvaje, la tinción no demuestra que la degradación de las capas de elastina fuera menor en los ratones tratados con el anticuerpo terapéutico comparados con los tratados con el anticuerpo control (Figura 3B). En cambio, se observó que la preservación de las células vasculares era mayor en el ratón tratado anti-Lcn2 respecto al tratado con IgG (Figura 3C).
El análisis de neutrófilos en las lesiones aneurismáticas indicó que el tratamiento antiLcn2 disminuía la infiltración de este tipo celular (Figura 4A) y al igual que en modelo KO, el tratamiento con el anticuerpo terapéutico disminuía la actividad MMP asociada al daño vascular (Figura 4B).
El tratamiento terapéutico es capaz de retrasar el crecimiento del aneurisma, copiando la mayoría de eventos fenotípicos que se han analizado en el modelo deficiente para Lcn2 (crecimiento de vaso, conservación de las células vasculares, disminución del infiltrado de neutrófilos y de la actividad MMP), pero no en el daño a las capas de elastina. Las diferencias en el daño de las capas de elastina puede ser debido a que el tratamiento es temporal, mientras que la deficiencia de Lcn2 en el ratón KO es permanente; por lo que puede tener efectos colaterales que no podemos mimetizar mediante un tratamiento puntual y además, hay que recalcar que las series de animales son diferentes por lo que puede haber pequeñas diferencias en el comportamiento fenotípico.
BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.-Reducción de la formación de AAA en los ratones KO Lcn2.
A, Cuantificación relativa de los niveles séricos de Lcn2 en ratones sanos y ratones 14
dias post-perfusión de elastasa (Sano N=12; 6,38 ± 0,74 vs. AAA N=11; 11 ,21 ± 1,99
U.R. , p< 0,05).
B, Cuantificación de las lesiones de AAA en C57BL/6J y Lcn2 KO a los 14 días post
perfusión (C57BU6J N=1 2; 130,6 ± 9,7 VS. Len2-f-N=11 ; 59,4 ± 8,3 %; p< 0,001 and C57BL/6J-Control N=6; 30,9 ± 2,4 vs. Len2-f-Control N=6; 32,S ± 7,1 %, p' 0,05).
C, Cuantificación de la degradación de las capas de elastina mediante tinción de
Verhoeff-van Gieson (C57BL/6J N=1 2; 3,25 ± 0,18 vs. Len2-f-N=11 ; 2,54 ± 0,21 grad e, p< 0,05).
D, Cuantificación del grado de daño en las células de músculo liso vascular mediante
tinción de a-aetina en lesiones de AAA (C57BL/6J N=12; 3,50 ± 0,80 vs. Len2-f-N=11; 2,46 ± 0,69 grado, p< 0,05).
Los valores están representados como MEDIA±ES, ·p<Q,Q5 vs. C57BL/6J y
·"p<O,001 vs. C57BL/6J.
Figura 2.-Los ratones deficientes para Lcn2-1-presentan menor contenido en
polimorfonucleares y menor actividad MMP.
A, Cuantificación de la tindón de polimorfonucleares en lesiones de AAA (Ly-6B.2)
(C57BL/6J N=12; 6,54 ± 1,19 vs. Lcn2-1-N=11; 0,40 ± 0,17 % area total; p= 0,001).
B, Cuantificación de la tinción de linfocitos en lesiones de AAA (CD3) (C57BU6J N=12;
114,4 ± 22,0 vs. Len2-f-N=11 ; 114,9 ± 14,2 células CD3+fmm2).
C, Cuantificación de la tinción de monocitos/macrófagos (MOMA-2) en AAA (C57BL/6J
N=7; 32,3 ± 1,9 vs. Len2-f-N=1 0; 30,2 ± 3,3 % total area).
D, Cuantificación de la actividad MMP mediante inyección de la sonda MMPSense-680 en lesiones de AAA (C57BU6J N=5: 2.74 ± 0.48 vs. Lcn2-1-N=7: 0.69 ± 0.22 pmoL actividad MMP: p< 0.05).
Los valores están representados como MEDIA±ES, **p<0,01 vs. CS7BU6J y ·"p<0,001 vs. C57BU6J. Figura 3.-El tratamiento con anticuerpo neutralizante anti-Lcn2 disminuye las lesiones aneurismáticas. A, Cuantificación de las lesiones de AAA en ratones C57BL/6J tratados con un anticuerpo control (lgG) o el anticuerpo terapéutico anti-Lcn2, a los 14 días postperfusión (lgG N=11 : 102,0±13,6% vs. anti-Lcn2 N=8: 43,0±7,9 p<0,001). B, Cuantificación de la degradación de las capas de elastina mediante tinción de Verhoeff-van Gieson (lgG N=11 : 3,27±0,14 vs. anti-Lcn2 N=8: 2,75±0,16 p<0,05). C, Cuantificación del grado de daño en las células de músculo liso vascular mediante tinción de a-actina en lesiones de AAA (lgG N=11; 3,91±0,09 vs. anti-Lcn2 N=8; 3,50±0,27, p>0,05). Los valores están representados como MEDIA±ES, *p<O,OS vs. IgG y ***p<0,OQ1 vs. IgG. Figura 4.-El tratamiento con anticuerpo neutralizante anti-Lcn2 emula el fenotipo del ratón deficiente para Lcn2. A, Cuantificación de la tinción de polimorfonucleares en lesiones de AAA (Ly-6B.2). (lgG N=11: 3,76±1 ,03 vs. anti-Lcn2 N=8: 1,69±0,39 % area total, p=0,05). B, Cuantificación de la actividad MMP mediante inyección de la sonda MMPSense-680 en lesiones de AAA. (lgG N=6: 1 ,39±0, 17 vs. anti-Lcn2 N=5: 0,77±0,09 pmol actividad MMP, p<0,01).
Los valores están representados como MEDIA±ES, *p<Q,05 vs. IgG y **p<Q,Q1 vs. IgG.
EJEMPLOS Con la intención de mostrar la presente invención de un modo ilustrativo aunque en ningún modo limitante, se aportan los siguientes ejemplos.
Los ratones deficientes para Lipocalina-2 (Lcn2-1-) fueron donados por Mak Taw (Canadá) y los ratones control de fenotipo salvaje (C57BU6J) fueron adquiridos a los laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME). No se detectaron diferencias en el tamaño o peso de los ratones durante el desarrollo del modelo. l a junta de revisión ética aprobó todos los procedimientos según la normativa vigente.
Ejemplo 1.-Modelo quirúrgico de inducción de AAA. Ratones de 12 semanas de edad fueron anestesiados mediante inhalación de isofluorano al 4% y se mantuvo la sedación con isofluorano al 2% durante todo el procedimiento. Se realizó una laparotomía horizontal y mediante la ayuda de un estereomicroscopio quirúrgico se procedió al aislamiento de la aorta abdominal. Se procedió a la ligación temporal de la sección comprendida entre las arterias renales y las ilíacas. A continuación, se hizo una aortotomía mediante una aguja de 30-gauge y se exanguinó. Se introdujo un tubo de polietileno PE-26 a través de la aortotomía y la aorta fue perfundida a una presión de 100 mmHg con suero salino (operación control)
o con elastasa pancreática porcina de tipo 1 (actividad específica de 6 U/mg proteína; E1250; Sigma-Aldrich) durante 5 minutos. Una vez transcurrido este periodo se procedió a la reparación de la aortotomía y se restauró el flujo sanguíneo. Los ratones operados se dejaron en recuperación y tras 14 días del procedimiento quirúrgico los animales fueron sacrificados, obteniendo suero y aislando el AAA para su posterior análisis. En este modelo para considerar que hay un crecimiento aneurismático significativo se debe producir un incremento del diámetro máximo del vaso de al menos el 100 % del diámetro original.
Ejemplo 2.-Generación y purificación del anticuerpo policlonal neutralizante antí-lcn2. Para la generación del anticuerpo policlonal anti-Lcn2 se utilizó un conejo (Orhyctolagus cuniculus, raza New Zealand White) de 8 semanas de edad. Para la inmunización se le administraron 6 inyecciones por vía intramuscular que consistía en 100 ~g de la proteina recombinante Lcn2 (Sino 6iological, 50060-M08H) diluida en 200 fll de PBS, más 350 fll de adyuvante completo de Freund. Las inyecciones fueron semanales. Pasadas las 6 semanas, se procedió al sangrado en la vena marginal de la oreja derecha y a la obtención del suero; para ello se dejó la sangre en incubación 1 h a 37°C y posteriormente toda la noche a 4°C para la formación del coágulo y mediante centrifugación se aisló el suero de conejo con el anticuerpo policlonal (antiLcn2). Como control se utilizó el suero de un conejo sin inmunizar (lgG). Posteriormente el suero fue purificado para la obtención de IgGs, para ello se realizó la diálisis del suero en PBS y se purificó mediante columna de proteína A-Sefarosa (GE Healthcare).
Ejemplo 3.-Detenninación de la actividad del anticuerpo policlonal anti-Lcn2. ELlSA anti-Lcn2. Una vez obtenido el suero de conejo se comprobó la capacidad de detección del anticuerpo de reconocer la proteína recombinante Lcn2 inyectada en el conejo. Se tapizó una placa de p96 con 0,5 )1g de la proteína recombinante y se probaron diluciones seriadas del suero (1/500 a 1/1.000.000). Cada dilución se testó por duplicado y con un control negativo sin proteína para comprobar la especificidad del marcaje. El marcaje fue revelado con un anticuerpo secundario anti-conejo y ensayo colorimétrico.
Western-Blot del anticuerpo políclonal antí-Lcn2. Alícuotas (1 )1.L) de suero de ratón, sano o con AAA, fueron diluidas en PBS hasta un volumen final de 10 )11. Las muestras se resolvieron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes con SDS al 10% (p/v). Las proteínas fu eron transferidas a membranas de PVDF (Immobilion-P; Milipore) y se bloquearon con 10% (p/v) de leche en polvo en TBS-T (0,01 M Tris pH=7,7, 0,1 NaCI y 0,1 % Tween 20). La membrana
con un anticuerpo comercial anti-Lcn2 a una dilución 1: 1 000 (Santa Cruz sc-18698, 1 )1g/ml) a 4°C durante la noche. Posterior a la incubación con el anticuerpo primario las membranas fueron incubadas con un anticuerpo secundario conjugado HRP anti-cabra (Dako) a una dilución 1: 1 000. Las proteínas fueron detectadas por quimioluminiscencia mejorada (ECL Western Blotting Detection Reagents, Amersham Biosciencies) y se cuantificó cuando procedió mediante densitometría (Quantity One; Bio-Rad Laboratories). Se utilizó un marcador de proteínas preteñido (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas) para determinar la masa molecular de las bandas.
Ejemplo 4.-Modelo terapéutico anti-Lcn2. Para demostrar el papel de Lcn2 en el desarrollo de AAA se realizó la inyección del anticuerpo neutralizante anti-Lcn2 o el anticuerpo control anti-lgG en ratones de 12 semanas. Se inyectó por vía intravenosa una dosis de 100 )19 de anticuerpo 24 horas antes de la operación de inducción de aneurismas anteriormente descrita y en los días 5 y 10 post-cirugia. Al igual que se ha descrito anteriormente, los ratones operados fueron sacrificados 14 días tras el procedimiento quirúrgico y se aisló el AAA para posterior análisis.
Ejemplo 5.-Histomorfometría y análisis inmunohistoquímico. Las muestras de AM fueron incluidas en OCT y congeladas. Se realizaron cortes seriados de 5 ~m de grosor para su posterior análisis mediante histomorfometría e
5 inmunohistoquímico. La histomorfometría fue realizada en secciones teñidas mediante tricrómico de Masson. Mediante tinción de Verhoeff Van Giesson se cuantificó la preservación de las capas de elastina y fue clasificada de la siguiente forma: grado 1, láminas intactas, bien organizadas; grado 2, láminas con pequeñas interrupciones y rupturas; grado 3, las capas de elastina tienen múltiples interrupciones y rupturas y
lOgrado 4, fragmentación severa de las capas de elastina y faltan secciones enteras.
Se realizó el análisis de células inflamatorias infiltrantes mediante tinción de MO MA-2 (macrófagos), CD3 (linfocitos) y Ly-6B.2 (neutrófilos). Además, se caracterizó la presencia de células de músculo liso vascular (a-Actina). Como controles negativos se 15 utilizaron IgGs equivalentes para comprobar que la tinción era específica. Se utilizaron anticuerpos secundarios biotilinados, se añadió AB-ComplexlHRP y posteriormente las secciones fueron teñidas con 3,30-diaminobencidina. Los cortes histológicos fueron montados en DPX excepto para las células vasculares en las que el anticuerpo estaba conjugado con un fluoróforo (Cy3). El contenido relativo de macrófagos y neutrófilos
20 fue cuantificado por área positiva; mientras que las células CD3+ fueron cuantificadas como células positivas/mm2 de sección aórtica. La preservación de las células vasculares fue clasificada mediante la siguiente graduación: grado 1, intacta; grado 2, mínimas aberraciones; grado 3, pérdida de pequeñas secciones vasculares y grado 4, daño severo en áreas prolongadas,
25 Ejemplo 6.-Tomografía de fluorescencia molecular. La tomografía de fluorescencia molecular fue realizada con un sistema FMT1 500 (VisEn Medical, Perkin-Elmer, USA). Para detectar la actividad MMP asociada al remodelado vascular, inyectamos una sonda de imagen no invasiva MMPSense-680
30 (VisEn; 5 nmol en 150 ~L en tampón fosfato; longitud de excitación 680±10 nm, longitud de emisión 700±10 nm), 24 horas antes de la toma de las imágenes, el día 13 post-operación. Las imágenes fueron adquiridas y la actividad MMP fue evaluada mediante la ayuda del paquete de software FMT1500.
35 Ejemplo 7.-Análisis estadístico.
Los resultados de los experimentos han sido representados como valor medio ± error estándar. El análisis estadistico fue realizado mediante el uso del software SPSS 20 .0 y analizados mediante prueba t y la incidencia de aneurismas se calculó mediante análisis por Chi-cuadrado. Se considera que hay significación estadística cuando el valor de p es igualo inferior a 0,05.
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Uso de un anticuerpo capaz de unirse a lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.5 2. Uso según la reivindicación 1, en que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
- 3. Uso de una molécula de ácido nucleico anti-sentido capaz de inhibir la expresión del gen de lipocalina-2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de aneurisma aórtico abdominal.
- 4. Uso según la reivindicación 2, en que dicho ácido nucleico es un ARN interferente 10 silente.
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