KR20130132934A

KR20130132934A - 과산을 사용하는 제모 제품을 위한 기질을 전달하기 위한 안정한 비-수성 조성물

Info

Publication number: KR20130132934A
Application number: KR1020137019083A
Authority: KR
Inventors: 수에핑 지앙; 타냐 마리아 그루버; 피에르 이. 루비에
Original assignee: 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-12-05
Also published as: WO2012087975A2; RU2013133845A; CN103282016A; WO2012087968A3; US20120317733A1; US20120317731A1; CA2821166A1; EP2654696A4; AU2011349449A1; CN103260597A; WO2012087968A2; WO2012087972A2; EP2654697A2; JP2014505046A; JP2014501761A; KR20130128442A; US20130171217A1; CA2822499A1; WO2012087975A3; WO2012087972A3

Abstract

효소에 의해 생성되는 과산을 사용하여 제모 제품을 위한 기질을 전달하는 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 더욱 구체적으로, (a) 고체 과산소원, 에스테르 기질 및 임의의 유기 공용매를 포함하는 제1 비-수성 조성물, 및 (b) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 및 완충제를 포함하는 적어도 pH 4의 수성 성분을 포함하는 2성분 시스템이 제공된다. 과가수분해 효소 촉매는 임의의 펩티드 링커를 통해 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 효소를 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다.

Description

과산을 사용하는 제모 제품을 위한 기질을 전달하기 위한 안정한 비-수성 조성물{A NON-AQUEOUS STABLE COMPOSITION FOR DELIVERING SUBSTRATES FOR A DEPILATORY PRODUCT USING PERACIDS}

관련-출원과의 상호 참조

본 출원은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된 미국 가특허 출원 제61/424,847호(출원일: 2010년 12월 20일)에 대한 우선권을 청구한다.

본 발명은 모발 관리 유익제(benefit agent)로서 적어도 하나의 효소에 의해 생성되는 과산을 포함하는 개인 관리 제품의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 2성분 과산 생성 시스템을 포함하는 모발 관리 제품이 제공되며, 여기서, 제1 성분은 카르복실산 에스테르 및 고체 과산화수소원을 포함하는 비-수성 조성물이며, 제2성분은 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 수성 조성물이다. 2성분은 배합되어 과산 유익제를 생성한다. 과가수분해 효소는 모발에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 함유하도록 엔지니어링된 융합 단백질의 형태일 수 있다.

퍼옥시카르복실산("과산")은 효과적인 항미생물제이다. 원치않는 미생물 성장에 대하여 경질 표면, 식품, 살아있는 식물 조직 및 의료 장치를 세정하고/거나 소독하고/거나 살균하는 방법이 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,545,047호; 미국 특허 제6,183,807호; 미국 특허 제6,518,307호; 미국 특허 제5,683,724호; 및 미국 특허 출원 공개 제2003-0026846 A1호). 또한, 과산은 세탁용 세제 응용을 위한 표백(bleaching) 조성물을 제조하는데 유용한 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제3,974,082호; 미국 특허 제5,296,161호; 및 미국 특허 제5,364,554호).

또한, 과산이 케라틴성 물질, 예를 들어, 모발, 피부 및 네일(nail)을 산화시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, 알렉산더, 피.(Alexander, P.) 등의 영국 공개 특허 제GB 692,478(A)호에는 산화된 물질이 묽은 알칼리에 용이하게 용해되도록 100℃ 미만의 온도에서 4 초과의 탄소 원자수를 갖지 않는 지방족과산(peraliphatic acid)의 포화 수용액을 사용하여 케라틴성 물질의 이황화 결합을 설피드릴 또는 설폰산으로 산화시키는 방법이 기재되어 있다. 릴리(Lillie) 등 (문헌[J. Histochem. Cytochem., (1954) 95-102])은 케라틴성 구조의 산화-유도성 호염기구증가를 개시하고 있다. 반 다이크(Van Dyke) 등의 미국 특허 제6,270,791호에는 수용액 중의 케라틴-함유 물질을 산화시켜, 수용성 펩티드를 형성하는 것을 포함하는, 케라틴-함유 공급원, 예를 들어, 모발로부터 수용성 펩티드를 수득하는 방법이 개시되어 있다. 산화제는 과아세트산을 포함할 수 있다.

과산의 사용을 언급하는 모발 관리 조성물 및 방법이 보고되어 있다. 젱, 와이.(Zheng, Y.)의 중국 특허 출원 공개 제CN101440575 A호에는 모발을 과아세트산 및 카탈라아제(catalase)로 처리하는 것에 이어서, 모발을 프로테아제로 처리하는 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 출원 공개 US2002-0053110 A1호; 미국 특허 U.S. 6,022,381호; 미국 특허 U.S. 6,004,355호; 국제 특허 공개 WO97/24106호; 및 국제 특허 공개 제WO97/24108호(Dias et al.)에는 퍼옥시산 산화제 및 산화 모발 착색제를 포함하는 모발 착색 조성물이 기재되어 있다. 브라운, 에프.(Brown, F.)의 미국 특허 제3,679,347호에는 퍼옥시 화합물 및 반응성 염료를 사용하여 인간 모발을 염색하는 것이 기재되어 있다. 클라크(Clark) 등의 영국 특허 제GB1560399 A호에는 유기 과산 성분, 및 유기 계면활성제 및 C10 내지 C21 지방산 아미드를 포함하는 수성 거품-형성 용액을 포함하는 모발 처리용 조성물이 기재되어 있다. 틸(Till) 등의 독일 특허 출원 공개 제DE19733841 A1호에는 마그네슘 모노퍼프탈레이트를 포함하는 인간 모발의 산화적 처리제가 개시되어 있다.

한, 에프.(Hahn, F.) 등 (문헌[Leder (1967) 18(8):184-192])은 모발 케라틴을 과아세트산, Na₂O₂ 및 카로아트(Caroat)(등록 상표) 또는 ClO₂로 산화시키고; 이어서, 산화된 모발을 알칼리로 용해시킴에 의한 제모 방법을 개시하였다. 한 등의 미국 특허 제3,479,127호에는 과산(0.5 내지 5 wt%의 과아세트산, pH 2 내지 5.5의 3시간 처리)에 이은 중성염 또는 약하거나 강한 알칼리 작용성 염 또는 염기로의 처리를 사용한 피부(송아지 가죽, 염소 가죽, 양 가죽) 및 소가죽의 제모 방법이 개시되어 있다.

바디 케어(body care) 제품에 과가수분해 활성을 갖는 특정 변이체 서브틸리신 칼스베르그(subtilisin Carlsberg) 프로테아제를 포함하는 것이 빌란트(Wieland) 등의 미국 특허 제7,510,859호에 개시되어 있다. 특정 변이체 프로테아제를 뛰어넘는 과가수분해 효소가 기재되어 있지 않거나, 개인 관리 유익제로서 과산의 효소에 의한 생성을 설명하는 어떠한 실험예도 존재하지 않는다.

미국 특허 출원 공개 제2008-0176783 A1호; 제2008-0176299 A1호; 제2009-0005590 A1호; 제2010-0087529 A1호; 및 제2010-0041752 A1호(디코시모(DiCosimo 등)에는 카르복실산 에스테르 기질을 소독제 및/또는 탈색제로 사용하기에 충분한 농도로 퍼옥시카르복실산으로 전환시키기 위한 상당한 과가수분해 활성을 특징으로 하는, 구조적으로 탄수화물 에스테라제의 CE-7 패밀리의 구성원으로 분류된 효소(즉, 세팔로스포린 C 데아세틸라제[CAH] 및 아세틸 자일란 에스테라제[AXE])가 개시되어 있다.

공동-소유의 공동계류 중인 특허 출원(명칭: "ENZYMATIC PERACID GENERATION FOR USE IN HAIR CARE PRODUCTS (대리인 문서 번호 CL5175))에서는 모발 관리 제품에서 유익제로서의 과산의 용도가 개시되어 있다. 과산계 유익제는 제모, 모발 약화, 모발 탈색, 모발 스타일링, 모발 컬링, 모발 컨디셔닝, 비-과산계 유익제의 적용 전의 모발 사전처리 및 그들의 조합과 같은 이익을 제공하기 위해 사용된다.

과산을 효소에 의해 생성하는 경우 반응 성분은 통상 (a) 과가수분해 효소, (b) 적절한 카르복실산 에스테르, 및 (3) 과산소원을 필요로 하며, 여기서, 하나 이상의 성분은 사용될 때까지 분리되어 유지된다. 이와 같이, 반응 성분이 저장 안정성이며 적절한 반응 조건 하에서 배합되는 경우 유효 농도의 과산을 신속하게 생성할 수 있게 하는 다성분 생성 시스템이 필요하다. 효소 성분이 실질적으로 비-수성 카르복실산 에스테르 중에 저장되고, 이어서, 과산화수소를 포함하는 수성 성분과 혼합되어 과산을 생성하게 하는 몇몇 생성 시스템이 고안된다. 그러나, 일부 모발 관리 응용 및 제품은 효소 촉매가 카르복실산 에스테르 기질에 저장되지 않는 생성 시스템을 필요로 할 수 있다.

해결해야 할 문제는 사용될 때까지 효소 촉매 및 기질들 둘 모두에 대하여 연장된 기간 동안 저장 안정성인, 특정 모발 관리 응용, 예를 들어, 제모 응용에 적절한 효소에 의한 생성 시스템을 제공하는 것이다.

과산은 원하는 혜택에 대하여 표적화되지 않은 물질을 포함하는 다양한 물질에 대하여 반응성일 수 있는 강력한 산화제이다. 이와 같이, 특정 개인 관리 응용은 원하는 표적 체표면 상에 또는 그 근처에 과산 생성을 국소화시킴으로써 과산 유익제를 원하는 체표면에 표적화/집중시키는 능력으로부터 유리할 수 있다. 효소에 의한 과산 생성은 과가수분해효소를 체표면에 표적화시킴으로써 유리할 수 있다.

미용 유익제를 체표면에 표적화시키기 위한 더 짧은 바이오패닝된(biopanned) 펩티드의 이용이 기재되어 있다(미국 특허 제7,220,405호; 제7,309,482호; 제7,285,264호 및 제7,807,141호; 미국 특허 출원 공개 제2005-0226839 A1호; 제2007-0196305 A1호; 제2006-0199206 A1호; 제2007-0065387 A1호; 제2008-0107614 A1호; 제2007-0110686 A1호; 제2006-0073111 A1호; 제2010-0158846호; 제2010-0158847호; 및 제2010-0247589호; 및 PCT 출원 공개 WO2008/054746호; WO2004/048399호 및 WO2008/073368호). 과산 유익제의 생성을 위해 활성 과가수분해 효소(즉, "표적화된 과가수분해효소")를 결합시키기 위한 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 물질을 이용하는 것이 기재된 적이 없다.

이와 같이, 해결해야 할 추가의 문제는 표적화된 효소 전달 시스템과 상용성인 저장 안정성 모발 관리 조성물을 제공하는 것이다.

제모(제모제), 모발 인장 강도의 감소, 기타 제모 제품을 보강하기 위해 사용되는 모발 사전처리(예를 들어, 티오글리콜산염계 제모 제품), 모발 탈색, 모발 염모제(산화성 모발 염모제) 사전처리, 모발 컬링(curling) 및 모발 컨디셔닝(conditioning)과 같은 응용에서 사용될 수 있는 과산 유익제를 효소에 의해 생성하는 모발 관리 제품 및 사용 방법이 제공된다.

모발 관리 제품은 (1) 임의로 유기 공용매로 희석한 카르복실산 에스테르 기질 및 고체 과산소원, 예를 들어, 과탄산염 또는 과붕산염을 포함하는 비-수성 성분, 및 (2) 과가수분해 효소 및 완충제를 포함하는 수성 조성물 - 여기서, 수성 조성물은 2가지 성분의 배합 전에(즉, 저장 동안) 적어도 pH 4의 pH 값을 갖는다 - 을 포함하는 2성분 시스템으로 이루어지며, 이에 의해, 원하는 과산이 성분 (1)과 (2)의 배합에 의해 생성된다.

생물학적 서열의 간단한 설명

하기의 서열들은 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허출원에 관한 요건 - 서열 규정")를 따르며 세계지적재산권기구(World Intellectual Property Organization, WIPO) 표준 ST.25(2009), 및 유럽 특허 조약(EPC) 및 특허 협력 조약(PCT)의 서열 목록 요건(규정 5.2 및 49.5(a-bis)) 및 시행세칙의 섹션 208 및 부칙 C에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 체제는 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규정을 따른다.

서열 번호 1은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 세팔로스포린 X 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 2는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 세팔로스포린 X 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 3은 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 4는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 5는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표)6633(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 6은 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표)6633(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 7은 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) ATCC(등록 상표) 14580(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 8은 바실러스 리케니포르미스 ATCC(등록 상표) 14580(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 9는 바실러스 푸밀러스(B. pumilus) PS213으로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 10은 바실러스 푸밀러스 PS213으로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 11은 클로스트리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum) ATCC(등록 상표) 27405(상표명)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.서열 번호 12는 클로스트리듐 써모셀룸 ATCC(등록 상표) 27405(상표명)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 13은 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 14는 써모토가 네아폴리타나로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 15는 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) MSB8로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 16은 써모토가 마리티마 MSB8로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 17은 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium) 종 JW/SL YS485로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 18은 써모아나에로박테리움 종 JW/SL YS485로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 19는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 핵산 서열이다. 진뱅크(GENBANK)(등록 상표) 수탁 번호 ZP_01168674에 보고된 바와 같이, 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이 다른 세팔로스포린 C 데아세틸라제와의 서열 정렬, 및 보고된 길이(340개 아미노산) 대 다른 CAH 효소의 관찰된 길이(전형적으로, 길이가 318 내지 325개 아미노산; 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제US-2010-0087528-A1호 참조)의 비교에 기초하여, 아마도 부정확할 것 같은 15개 아미노산 N-말단 부가물을 암호화하는 것으로 보이는 것에 주의해야 한다. 이와 같이, 본 명세서에 보고된 바와 같은 핵산 서열은 진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 ZP_01168674 하에 보고된 N-말단 15개 아미노산이 없는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제 서열을 암호화한다.

서열 번호 20은 서열 번호 19의 핵산 서열에 의해 암호화되는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 21은 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) C-125로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 22는 바실러스 할로두란스 C-125로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 23은 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii) KSM-K16으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 24는 바실러스 클라우시이 KSM-K16으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 25는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 29233(상표명) 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH)를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 26은 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 29233(상표명) 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH)의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 27은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함)로부터의 써모토가 네아폴리타나 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 28은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 마리티마 MSB8 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 29는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 레틴가에(Thermotoga lettingae) 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 30은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 31은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 "RQ2(a)" 유래의 써모토가 종 RQ2 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 32는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 "RQ2(b)" 유래의써모토가 종 RQ2 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 278에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 33은 써모토가 레틴가에 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 34는 써모토가 페트로필라 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 35는 본 명세서에서 "RQ2(a)"로 기재된 써모토가 종 RQ2로부터의 제1 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 36은 본 명세서에서 "RQ2(b)"로 기재된 써모토가 종 RQ2로부터의 제2 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다. 서열 번호 37은 써모아네아로박테리움 사카롤리티쿰(Thermoanearobacterium saccharolyticum) 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열이다.

서열 번호 38은 써모아네아로박테리움 사카롤리티쿰 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 39는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 EU255910)이다.

서열 번호 40은 락토코커스 락티스(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 ABX75634.1)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 41은 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti)(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 NC_002678.2)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 42는 메소리조비움 로티(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 BAB53179.1)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 43은 게오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 AF038547.2)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 44는 게오바실러스 스테아로써모필러스(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 AAF70202.1)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 45는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제(변이체 "A3"로 알려져 있는)를 암호화하는 핵산 서열이다: (F24I/S35T/Q179L/N275D/C277S/S308G/F317S).

서열 번호 46은 "A3" 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 47은 N275D/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 48은 N275D/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 49는 C277S/F317S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 50은 C277S/F317S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 51은 S35T/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 52는 S35T/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 53은 Q179/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 54는 Q179L/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 55는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843H9를 암호화하는 핵산 서열이다: (L8R/L125Q/Q176L/V183D/F247I/C277S/P292L).

서열 번호 56은 843H9 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 57은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843F12를 암호화하는 핵산 서열이다: K77E/A266E/C277S.

서열 번호 58은 843F12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 59는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843C12를 암호화하는 핵산 서열이다: F27Y/I149V/A266V/C277S/I295T/N302S.

서열 번호 60은 843C12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 61은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 842H3을 암호화하는 핵산 서열이다: L195Q/C277S.

서열 번호 62는 842H3 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 63은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 841A7을 암호화하는 핵산 서열이다: Y110F/C277S.

서열 번호 64는 841A7 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 65 내지 221, 271, 290 및 291은 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 아미노산 서열의 비제한적인 목록이다.

서열 번호 217 내지 269는 피부에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 아미노산 서열이다.

서열 번호 270 및 271은 네일(nail)에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 아미노산 서열이다.

서열 번호 272 내지 285는 펩티드 링커/스페이서의 아미노산 서열이다.

서열 번호 286은 융합 펩티드 C277S-HC263을 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 287은 융합 구축물 C277S-HC1010을 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 288은 융합 펩티드 C277S-HC263의 아미노산 서열이다.

서열 번호 289는 융합 펩티드 C277S-HC1010의 아미노산 서열이다.

서열 번호 290은 모발-결합 도메인 HC263의 아미노산이다.

서열 번호 291은 모발-결합 도메인 HC1010의 아미노산 서열이다.

서열 번호 292는 발현 플라스미드 pLD001의 핵산 서열이다.

서열 번호 293은 써모토가 마리티마 변이체 C277S의 아미노산 서열이다.

서열 번호 294는 D128G 치환("CPAH-HC263")을 추가로 포함하는 융합 펩티드 C277S-HC263의 아미노산 서열이다.

서열 번호 295는 D128G 치환("CPAH-HC1010")을 추가로 포함하는 융합 펩티드 C277S-HC1010의 아미노산 서열이다.

서열 번호 296은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 006A10를 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호; 본 명세서에 참고로 포함된다): (F268S/C277T).

서열 번호 297는 006A10 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 298은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 006E10를 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호): (R218C/C277T/F317L).

서열 번호 299는 006E10 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 300은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 006E12를 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호): (H227L/T233A/C277T/A290V).

서열 번호 301은 006E12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 302는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 006G11을 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호): (D254G/C277T).

서열 번호 303은 006G11 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 304는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 006F12를 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호): (R261S/I264F/C277T).

서열 번호 305는 006F12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 306은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 006B12를 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호): (W28C/F104S/C277T/).

서열 번호 307은 006B12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 308은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 874B4를 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호; 본 명세서에 참고로 포함된다): (A266P/C277S).

서열 번호 309는 873B4 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 310은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 비해 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 006D10를 암호화하는 핵산 서열이다(미국 가특허 출원 제61/425561호; 본 명세서에 참고로 포함된다): (W28C/L32P/D151E/C277T).

서열 번호 311은 006D10 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 312는 10개의 라이신 잔기가 10개의 아르기닌 잔기로 대체된 모발 결합 도메인 "HC263"(서열 번호 290)의 변이체인 모발-결합 도메인 "HC263KtoR"의 아미노산 서열이다.

서열 번호 313은 하전된 펩티드 (GK)₅-H6의 아미노산 서열이다.

서열 번호 314는 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 315는 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 316은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 317은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 318은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 락토코커스 락티스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 319는 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 락토코커스 락티스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 320은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 메소리조비움 로티로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 321은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 메소리조비움 로티로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 322는 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 323은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 324는 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263KtoR에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 325는 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263KtoR에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 326은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC1010(서열 번호 291)에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 327은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC1010에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 328은 가요성 링커를 통하여 하전된 펩티드 (GK)₅-His6에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 329는 가요성 링커를 통하여 하전된 펩티드 (GK)₅-His6에, 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 330은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 331은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 332는 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263KtoR에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 333은 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC263FtoR에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 334는 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC1010(서열 번호 291)에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 335는 가요성 링커를 통하여 모발 결합 도메인 HC1010에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 336은 가요성 링커를 통하여 하전된 펩티드 (GK)₅-His6에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 337은 가요성 링커를 통하여 하전된 펩티드 (GK)₅-His6에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체의 아미노산 서열이다.

서열 번호 338은 야생형 마이코박테리움 스메그마티스 아릴 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 339는 야생형 슈도모나스 플루오레슨스 에스테라제의 아미노산 서열이다.

본 개시내용에서, 다수의 용어 및 약어가 사용된다. 하기의 정의는 특별히 다르게 언급되지 않는 한 적용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사("a", "an") 및 정관사("the")는 요소 또는 성분의 경우(즉, 발생)의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 부정 관사("a", "an") 및 정관사("the")는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백하게 단수임을 의미하는 것이 아니라면 복수형도 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 특허청구범위에서 인용된 바와 같은 언급된 특징, 정수, 단계, 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 그의 그룹의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"에 의해 포함되는 실시형태를 포함하고자 한다. 유사하게, 용어 "본질적으로 이루어진"은 용어 "이루어진"에 의해 포함되는 실시형태를 포함하고자 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사용되는 성분 또는 반응물질의 양을 수식하는 용어 "약"은 예를 들어, 현장에서 농축물 또는 사용 용액을 제조하는 데 사용되는 전형적인 측정 및 액체 취급 절차를 통해; 이들 과정에서의 우발적인 오차를 통해; 조성물을 제조하거나 방법을 실행하기 위해 적용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이 등을 통해 발생할 수 있는 수치 분량의 변이를 말한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유발되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수식 여부를 불문하고, 특허청구범위는 분량의 균등물을 포함한다.

모든 범위는 존재하는 경우 포괄적이며 조합가능하다. 예를 들어, "1 내지 5 의 범위가 기재되는 경우, 기재된 범위는 범위 "1 내지 4", "1 내지 3", "1 내지 2", "1 내지 2 및 4 내지 5", "1 내지 3 및 5" 등을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 "접촉"은 원하는 결과(표적 표면 결합, 과산 기반의 효과 등)를 달성하는데 충분한 기간 동안 조성물을 표적 체표면과 접촉하게 배치하는 것을 말한다 일 실시형태에서, "접촉"은 원하는 결과를 달성하는데 충분한 기간 동안 유효 농도의 과산을 포함하는(또는 이를 생성할 수 있는) 조성물을 표적 체표면과 접촉하게 배치하는 것을 말할 수 있다. 다른 실시형태에서, "접촉"은 또한 개인 관리 조성물의 적어도 하나의 성분, 예를 들어, 효소에 의한 과가수분해에 사용되는 하나 이상의 반응 성분을 표적 체표면과 접촉하게 배치하는 것을 말할 수 있다. 접촉은 유효 농도의 과산을 포함하는 과산 용액 또는 조성물, 유효 농도의 과산을 형성하는 용액 또는 조성물, 또는 유효 농도의 과산을 형성하는 조성물의 한 성분을 체표면으로의 분무, 처리, 침지, 플러싱(flushing), 그의 위 또는 안으로의 주입, 혼합, 조합, 페인팅, 코팅, 도포, 부착 및 다르게는 전달을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "기질", "적절한 기질" 및 "카르복실산 에스테르 기질"은 상호교환적으로, 구체적으로

(a) 구조

[X]_mR₅

(여기서,

X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며;

R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;

R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고, R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;

m은 1 내지R₅ 내의 탄소 원자수이다)를 갖는 하나 이상의 에스테르 - 상기 하나 이상의 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ; 또는

(b) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₃ 및 R₄는 각각 H 또는 R₁C(O)이다)를 갖는 하나 이상의 글리세리드; 또는

(c) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 또는

(d) 하나 이상의 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 또는 아세틸화 다당류; 또는

(e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과산"은 퍼옥시산, 퍼옥시카르복실산, 퍼옥시산, 퍼카르복실산 및 퍼옥소산과 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과아세트산"은 "PAA"로 약칭되며, 퍼옥시아세트산, 에탄퍼옥소산 및 CAS 등록 번호 79-21-0의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모노아세틴"은 글리세롤 모노아세테이트, 글리세린 모노아세테이트 및 글리세릴 모노아세테이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다이아세틴"은 글리세롤 다이아세테이트; 글리세린 다이아세테이트, 글리세릴 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 25395-31-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이아세틴"은 글리세린 트라이아세테이트; 글리세롤 트라이아세테이트; 글리세릴 트라이아세테이트, 1,2,3-트라이아세톡시프로판; 1,2,3-프로판트라이올 트라이아세테이트 및 CAS 등록 번호 102-76-1의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모노부티린"은 글리세롤 모노부티레이트, 글리세린 모노부티레이트 및 글리세릴 모노부티레이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다이부티린"은 글리세롤 다이부티레이트 및 글리세릴 다이부티레이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이부티린"은 글리세롤 트라이부티레이트, 1,2,3-트라이부티릴글리세롤 및 CAS 등록 번호 60-01-5의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모노프로피오닌"은 글리세롤 모노프로피오네이트, 글리세린 모노프로피오네이트 및 글리세릴 모노프로피오네이트와 같은 의미이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "다이프로피오닌"은 글리세롤 다이프로피오네이트 및 글리세릴 다이프로피오네이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이프로피오닌"은 글리세릴 트라이프로피오네이트, 글리세롤 트라이프로피오네이트, 1,2,3-트라이프로피오닐글리세롤 및 CAS 등록 번호 139-45-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "아세틸화 당" 및 "아세틸화 당류"는 적어도 하나의 아세틸기를 포함하는 단당류, 이당류 및 다당류를 말한다. 예에는, 글루코스 펜타아세테이트; 자일로스 테트라아세테이트; 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란 단편; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 및 트라이-O-아세틸-글루칼이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "하이드로카르빌", "하이드로카르빌기" 및 "하이드로카르빌 모이어티"는 단일, 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합 및/또는 에테르 결합으로 연결되고, 이에 따라 수소 원자로 치환된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 배열의 탄소 원자를 의미한다. 이러한 하이드로카르빌기는 지방족 및/또는 방향족일 수 있다. 하이드로카르빌기의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, t-부틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 메틸사이클로펜틸, 헥실, 사이클로헥실, 벤질 및 페닐이 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 하이드로카르빌 모이어티는 단일 탄소-탄소 결합 및/또는 에테르 결합으로 연결되고 이에 따라 수소 원자로 치환된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 배열의 탄소 원자이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 1,2-에탄다이올; 1,2-프로판다이올; 1,3-프로판다이올; 1,2-부탄다이올; 1,3-부탄다이올; 2,3-부탄다이올; 1,4-부탄다이올; 1,2-펜탄다이올; 2,5-펜탄다이올; 1,5-펜탄다이올; 1,6-펜탄다이올; 1,2-헥산다이올; 2,5-헥산다이올; 1,6-헥산다이올 및 그들의 혼합물의 "모노에스테르" 및 "다이에스테르"는 화학식 RC(O)O(여기서, R은 C1 내지 C7 선형 하이드로카르빌 모이어티이다)의 적어도 하나의 에스테르기를 포함하는 상기 화합물을 말한다. 일 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질은 프로필렌 글리콜 다이아세테이트(PGDA), 에틸렌 글리콜 다이아세테이트(EDGA) 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로필렌 글리콜 다이아세테이트"는 1,2-다이아세톡시프로판, 프로필렌 다이아세테이트, 1,2-프로판다이올 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 623-84-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "에틸렌 글리콜 다이아세테이트"는 1,2-다이아세톡시에탄, 에틸렌 다이아세테이트, 글리콜 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 111-55-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "적절한 효소적 반응 혼합물", "과산의 동소 생성에 적절한 성분", "적절한 반응 성분", "적절한 수성 반응 혼합물", "반응 혼합물" 및 "과산-생성 성분"은 반응물질 및 과가수분해 효소 촉매가 접촉되는 물질 및 물을 말한다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분은 바람직하게는 체표면, 예를 들어, 모발에 대하여 친화성을 갖는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질의 형태의 적어도 하나의 과가수분해효소, 적어도 하나의 적절한 카르복실산 에스테르 기질, 과산소원 및 물을 포함할 것이다. 바람직한 태양에서, 과가수분해효소는 바람직하게는 체표면, 예를 들어, 모발에 표적화된 융합 단백질의 형태의 CE-7 과가수분해효소이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과가수분해"는 과산을 형성하기 위한 선택된 기질과 과산화물의 반응으로 정의된다. 전형적으로, 무기 과산화물은 촉매의 존재 하에 선택된 기질과 반응하여, 퍼옥시카르복실산을 생성한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "화학적 과가수분해"는 기질(퍼옥시카르복실산 전구체)을 과산화수소원과 배합하는 과가수분해 반응을 포함하며, 퍼옥시카르복실산은 효소 촉매의 부재 하에 형성된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "효소에 의한 과가수분해"는 카르복실산 에스테르 기질(과산 전구체)을 과산화수소원 및 물과 배합하여, 효소 촉매가 과산의 형성을 촉매작용시키는 과가수분해 반응을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과가수분해효소 활성"은 단백질, 건조 세포 중량 또는 고정화된 촉매 중량의 단위 질량(예를 들어, 밀리그램)당 촉매 활성을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 "효소 활성 1 유닛" 또는 "활성 1 유닛" 또는 "U"는 특정 온도에서 분당 1 μmol의 퍼옥시카르복실산 생성물의 생성에 필요한 과가수분해효소 활성의 양으로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "효소 촉매" 및 "과가수분해효소 촉매"는 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 촉매를 말하며, 온전한 미생물 세포, 투과화된(permeabilized) 미생물 세포(들), 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소 또는 정제된 효소의 형태일 수 있다. 또한, 효소 촉매는 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 페길화(pegylation)에 의하여 또는 가교 결합 시약과의 반응에 의하여). 또한, 과가수분해효소 촉매는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 용해성 또는 불용성 지지체 상에 고정화될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997]을 참조한다.

본 명세서에 사용되는 "아세틸 자일란 에스테라제"는 아세틸화 자일란 및 기타 아세틸화 당류의 탈아세틸화를 촉매작용시키는 효소(E.C. 3.1.1.72; AXE)를 말한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "세팔로스포린 C 데아세틸라제" 및 "세팔로스포린 C 아세틸 가수분해효소"는 세팔로스포린, 예를 들어, 세팔로스포린 C 및 7-아미노세팔로스포란산의 탈아세틸화를 촉매작용시키는 효소(E.C. 3.1.1.41)를 말한다(문헌[Mitsushima et al., (1995) Appl . Env . Microbiol. 61(6):2224-2229]).

본 명세서에서 사용되는 용어 "바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)"는 국제 기탁소 수탁 번호가 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)에 기탁된 박테리아 세포를 말한다. 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 유의미한 과가수분해효소 활성을 갖는 효소는 서열 번호 2로 제공된다(미국 특허 출원 공개 제2010-0041752호 참조). 분리된 효소의 아미노산 서열은 진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 BAA01729.1에 의해 제공되는 세팔로스포린 C 데아세틸라제에 대하여 100% 아미노산 동일성을 갖는다(상기 문헌[Mitsushima et al.]).

본 명세서에 사용되는 용어 "써모토가 마리티마 MSB8"은 아세틸 자일란 에스테라제 활성을 갖는 것으로 보고된 박테리아 세포이다(진뱅크(등록 상표) NP_227893.1; 미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호 참조). 써모토가 마리티마 MSB8로부터의 과가수분해효소 활성을 갖는 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 16으로 제공되어 있다.

용어 "아미노산"은 단백질 또는 폴리펩티드의 기본 화학 구조 단위를 지칭한다. 하기의 약어는 특정 아미노산을 확인하기 위해 본 명세서에서 사용된다.

예를 들어, 주어진 부위에 화학적으로 균등한 아미노산의 생성을 유발하면서 암호화된 단백질의 기능적 특성에 영향을 미치지 않는 유전자의 변경이 흔하다는 것은 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 목적상, 치환은 하기 5 개 그룹 중 하나의 그룹 내에서의 교환으로 정의된다:

1. 비극성 또는 약간 극성인 작은 지방족 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. 음으로 하전된 극성 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. 양으로 하전된 극성 잔기: His, Arg, Lys;

4. 비극성인 큰 지방족 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys); 및

5. 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.

따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 소수성이 보다 낮은 다른 잔기(예를 들어, 글리신) 또는 소수성이 보다 높은 잔기(예를 들어, 발린, 류신 또는 아이소류신)를 암호화하는 코돈으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 음으로 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하거나(예를 들어 글루탐산을 아스파르트산으로) 양으로 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하는(예를 들어, 아르기닌을 라이신으로) 변화도 기능적으로 균등한 생성물을 생성시킬 수 있을 것으로 예상된다. 많은 경우에, 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 부분의 변경을 유발하는 뉴클레오티드 변화도 단백질의 활성을 변경하지 않을 것으로 예상된다. 각각의 제안된 변형은 당업계의 통상적 기술로 충분히 가능하며, 암호화된 생성물의 생물학적 활성의 보유를 결정하는 것도 그러하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "시그니처 모티프" 및 "진단 모티프"는 정의된 활성을 갖는 효소의 패밀리 중에 공유되는 보존된 구조를 지칭한다. 시그니처 모티프를 사용하여, 정의된 기질의 패밀리에 대하여 유사한 효소 활성을 갖는 구조적으로 관련된 효소의 패밀리를 정의하고/거나 동정할 수 있다. 시그니처 모티브는 단일의 연속 아미노산 서열 또는 함께 시그니처 모티프를 형성하는 보존된 불연속 모티프의 집합일 수 있다. 전형적으로, 보존된 모티프(들)는 아미노산 서열로 나타낸다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 CE-7 탄수화물 에스테라제 시그니처 모티프를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 분석하는데 유용한 임의의 컴퓨터 알고리듬 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수할 수 있거나 독립적으로 개발할 수 있다. 통상적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 모음(위스콘신 패키지 버전 9.0, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG: Genetics Computer Group)), BLASTP, BLASTN, BLASTX(문헌[Altschul et al., J. Mol Biol. 215:403-410 (1990)]) 및 DNASTAR(미국 위스콘신주 53715 파크 스트리트 매디슨 1228 S 소재의 디엔에이스타, 인포레이티드(DNASTAR, Inc.)), 클러스털더블유(예를 들어, 버전 1.83; 문헌[Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680 (1994)]) 및 스미스 워터만 알고리듬(Smith-Waterman algorithm)이 통합된 FASTA 프로그램(문헌[W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res ., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY]), 벡터(Vector) NTI (미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 인포맥스(Informax)) 및 시퀀처(Sequencher) v. 4.05를 포함할 것이나 이들에 한정되지 않는다. 본 출원과 관련하여, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용된 경우에는, 그 분석 결과가 달리 명시되지 않는 한, 참조한 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것임을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용된 "디폴트 값"은 최초 초기화할 때에 소프트웨어에 원래 로딩된 소프트웨어 제조처에 의해 설정된 임의의 수치 또는 파라미터의 세트를 의미할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "체표면"은 유익제, 예를 들어, 과산 유익제에 대한 표적으로 삼을 수 있는 임의의 인간 체표면을 말한다. 전형적인 체표면은 모발, 피부, 네일, 치아 및 잇몸을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법 및 조성물은 모발 관리 응용 및 제품에 관한 것이다. 이와 같이, 체표면은 모발을 포함한다. 일 실시형태에서, 체표면은 인간 모발이다.

본 명세서에서 사용되는 "개인 관리 제품"은 샴푸, 바디 로션, 샤워젤, 국소 모이스처라이저, 치약, 투스젤(toothgel), 구강청결제, 구강헹굼제(mouthrinse), 플라그 방지 헹굼제(anti-plaque rinse) 및/또는 기타 국소 세정제(cleanser)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 모발, 피부, 두피 및 치아의 세정, 탈색 및/또는 소독에 사용되는 제품을 의미한다. 특히 바람직한 일부 실시형태에서, 이들 제품은 인간에서 사용되는 한편, 다른 실시형태에서, 이들 제품은 비-인간 동물(예를 들어, 수의학 응용에서)에서 이용된다. 바람직한 실시형태에서, 용어 "개인 관리 제품"은 모발 관리 제품 또는 피부 관리 제품을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "과산소원" 및 "과산소의 공급원"은 과산화수소, 과산화수소 부가물(예를 들어, 우레아-과산화수소 부가물(카르바미드 퍼옥시드)), 과붕산염 및 과탄산염을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 수용액에 존재하는 경우 약 1 mM 이상의 농도로 과산화수소를 제공할 수 있는 화합물을 말한다. 본 발명의 모발 관리 조성물 및 방법은 특히 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매가 수성 조성물에 따로 저장되는 한편, 카르복실산 에스테르 기질을 포함하는 비-수성 성분 중에 고체 형태로 저장되는 고체 과산소원의 용도에 관한 것이다. 2가지 조성물을 배합하여, 원하는 과산을 효소에 의해 생성한다. 전형적으로, 사용되는 고체 과산소원의 양은 특히 반응 성분의 배합 시에 방출되는 생성되는 작용 농도의 과산화수소가 유효량의 과산화수소를 제공할 수 있도록 선택된다. 일 실시형태에서, 반응 성분의 배합 시에 제공되는 생성된 과산화수소의 농도는 초기에 적어도 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 10 mM, 100 mM, 200 mM 또는 500 mM 이상이다. 수성 반응 제형 중의 과산화수소 대 효소 기질, 예를 들어, 트라이글리세리드, (H₂O₂:기질)의 몰비는 약 0.002 내지 20, 바람직하게는 약 0.1 내지 10, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 5일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "부형제"는 제형 중의 활성 성분에 대한 담체로 사용되는 불활성 물질을 말한다. 부형제를 사용하여 활성 성분의 저장 안정성과 같이, 제형 중의 활성 성분을 안정화시킬 수 있다. 또한, 부형제는 때때로 활성 성분을 함유하는 제형의 부피를 늘리기 위해 사용된다. 본 명세서에 기재되는 "활성 성분"은 과가수분해 활성을 갖는 효소, 적절한 반응 조건 하에서 과가수분해 효소에 의해 생성되는 과산 또는 그들의 조합일 수 있다.

본 발명의 모발 관리 제품의 고안은 (2) 비-수성 시스템(다시 말하면, 카르복실산 에스테르 및 임의로 하나 이상의 유기 공용매) 중에 저장되는 (1) 고체 형태의 과산소(예를 들어, 과탄산염)를 포함하는 제1 조성물 및 과가수분해 효소 촉매 및 완충제를 포함하는 수성 제2 조성물을 포함한다. 고체 과산소원의 존재 하에서 카르복실산 에스테르의 안정성을 유지하기 위하여, 제1 조성물에는 실질적으로 물이 없다. 용어 "실질적으로 물이 없는"은 고체 형태의 과산소와 함께 저장되는 경우 카르복실산 에스테르 기질의 저장 안정성에 해로운 영향을 주지 않는 물의 농도를 지칭할 것이다. 추가의 실시형태에서, "실질적으로 물이 없는"은 고체 과산소원 및 카르복실산 에스테르를 포함하는 성분 중의 2000 ppm 미만, 바람직하게는 1000 ppm 미만, 더욱 바람직하게는 500 ppm 미만, 더더욱 바람직하게는 250 ppm 미만의 물을 의미할 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 효소가 수용액(예를 들어, 저장 동안 효소에 의해 가수분해될 수 있는 상당한 농도의 카르복실산 에스테르 기질을 함유하지 않는 용액) 중에 안정적이도록 생성 시스템이 고안된다면, 수용액 중에 저장될 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 효소의 저장 안정성을 위하여 원하는 pH를 제공할 수 있는 하나 이상의 완충제를 포함하는 수성 조성물 중에 저장될 수 있다(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염). 바람직한 태양에서, 완충제는 효소를 포함하는 수성 성분에 4 이상의 pH를 제공하고 유지할 수 있다.

과가수분해 활성을 갖는 효소

과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합으로 분류된 일부 효소를 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(서브틸리신 칼스베그 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 아릴 에스테라제(슈도모나스 플루오레슨스; 서열 번호 315[L29P 변이체] 및 서열 번호 339[야생형]; 미국 특허 제7,384,787호), 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 과가수분해 아릴 에스테라제(서열 번호 314[S54V 변이체] 및 서열 번호 338[야생형]; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호) 및 과가수분해 탄수화물 에스테라제가 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 서열 번호 314로 제공되는 마이코박테리움 스메그마티스 S54V 아릴 에스테라제에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 태양에서, 과가수분해 탄수화물 에스테라제는 CE-7 탄수화물 에스테라제이다.

일 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 본 명세서에 기재된 바와 같은 과가수분해 활성을 갖는 효소를 암호화하는 임의의 아미노산 서열에 대하여 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 314, 315, 338 및 339에 대하여 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 서열 번호 314, 315, 338 및 339에 대하여 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 실질적으로 유사한 과가수분해 효소는 매우 엄격한 혼성화 조건(0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃, 및 2× SSC, 0.1% SDS로의 세정에 이은, 0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃의 최종 세정) 하에서 본 발명의 임의의 과가수분해 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 포함할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 과가수분해효소는 적어도 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 갖는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소(융합 단백질)가 본 명세서에 기재된 임의의 과가수분해효소와 실질적으로 유사한 서열을 함유하는지 결정하기 위해 사용되는 모든 정렬은 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 없는 과가수분해 효소의 아미노산 서열에 기초한다.

CE -7 과가수분해효소

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 모발 관리 조성물 및 방법은 구조적으로 효소의 탄수화물 패밀리 에스테라제 패밀리 7(CE-7 패밀리)의 구성원으로 분류되는 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함한다(문헌[Coutinho, P.M., Henrissat, B. "Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach" in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12] 참조). 효소의 CE-7 패밀리는 과산소원과 배합되는 경우 다양한 카르복실산 에스테르 기질로부터 퍼옥시카르복실산을 생성하는데 특히 효과적인 것으로 증명되었다(WO2007/070609호 및 미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호, 제2008-176783호, 제2009-0005590호, 제2010-0041752호 및 제2010-0087529호뿐 아니라, 미국 특허 출원 제12/571702호 및 미국 가특허 출원 제61/318016호(디코시모 등); 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다).

CE-7 패밀리의 구성원은 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH; E.C. 3.1.1.41) 및 아세틸 자일란 에스테라제(AXE; E.C. 3.1.1.72)를 포함한다. CE-7 에스테라제 패밀리의 구성원은 보존된 시그니처 모티프를 공유한다(문헌[incent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606(2003)]). CE-7 시그니처 모티프("CE-7 과가수분해효소") 및/또는 실질적으로 유사한 구조를 포함하는 과가수분해효소는 본 명세서에 기재된 조성물과 방법에 사용하기에 적절하다. 실질적으로 유사한 생물학적 분자를 동정하는 수단은 당업계에 널리 알려져 있다(예를 들어, 서열 정렬 프로토콜, 핵산 혼성화 및/또는 보존된 시그니처 모티프의 존재). 일 태양에서, 과가수분해효소는 CE-7 시그니처 모티프, 및 본 명세서에 기재된 서열 중 하나에 대하여 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 33%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 42%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하는 효소를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 어구 "효소는 구조적으로 CE-7 효소로 분류된다", "CE-7 과가수분해효소" 또는 "구조적으로 탄수화물 에스테라제 패밀리 7 효소로 분류된"은 구조적으로 CE-7 탄수화물 에스테라제로 분류된 과가수분해 활성을 갖는 효소를 지칭하기 위해 사용될 것이다. 이러한 효소의 패밀리는 시그니처 모티프의 존재에 의해 정의될 수 있다(상기 문헌[Vincent et al.]). CE-7 에스테라제에 대한 시그니처 모티프는 3가지 보존된 모티프를 포함한다(서열 번호 2의 참조 서열에 대한 잔기 위치 넘버링; 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 CE-7 과가수분해효소):

a) Arg118-Gly119-Gln120;

b) Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183; 및

c) His298-Glu299.

전형적으로, 아미노산 잔기 위치 180에서의 Xaa는 글리신, 알라닌, 프롤린, 트립토판 또는 트레오닌이다. 촉매 트라이아드에 속하는 3개의 아미노산 잔기 중 2개를 볼드체로 나타내었다. 일 실시형태에서, 아미노산 잔기 위치 180에서의 Xaa는 글리신, 알라닌, 프롤린, 트립토판 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리 내의 보존된 모티프의 추가의 분석에 의해, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리에 속하는 과가수분해효소를 추가로 정의하기 위해 사용될 수 있는 추가의 보존된 모티프(서열 번호 2의 아미노산 위치 267 내지 269에서의 LXD)의 존재가 나타난다. 추가의 실시형태에서, 상기 정의된 시그니처 모티프는 하기로 정의된 추가의(제4) 보존된 모티프를 포함할 수 있다:

Leu267-Xaa268-Asp269.

아미노산 잔기 위치 268에서의 Xaa는 전형적으로, 아이소류신, 발린 또는 메티오닌이다. 제4 모티프는 촉매 트라이아드(Ser181-Asp269-His298)에 속하는 아스파르트산 잔기(볼드체)를 포함한다.

CE-7 과가수분해효소는 적어도 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 갖는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소(융합 단백질)가 CE-7 시그니처 모티프를 포함하는지를 결정하기 위해 사용되는 모든 정렬은 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 없는 과가수분해 효소의 아미노산 서열에 기초할 것이다.

많은 널리 공지된 전반적인 정렬 알고리듬(즉, 서열 분석 소프트웨어)을 사용하여 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 대표하는 둘 이상의 아미노산 서열을 정렬하여, 효소가 본 발명의 시그니처 모티프로 이루어지는지 결정할 수 있다. 정렬된 서열(들)을 참조 서열(서열 번호 2)과 비교하여, 시그니처 모티프의 존재를 결정한다. 일 실시형태에서, 참조 아미노산 서열을 사용하는 클러스털(CLUSTAL) 정렬(예를 들어, 클러스털더블유)(본 명세서에 사용되는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 과가수분해효소 서열(서열 번호 2)⁾을 사용하여 CE-7 에스테라제 패밀리에 속하는 과가수분해효소를 동정한다. 보존된 아미노산 잔기의 상대적 넘버링은 참조 아미노산 서열의 잔기 넘버링에 기초하여, 정렬된 서열 내의 작은 삽입 또는 결실(예를 들어, 전형적으로 5개 이하의 아미노산)을 설명한다.

(참조 서열에 비하여) 본 발명의 시그니처 모티프를 포함하는 서열을 동정하기 위해 사용될 수 있는 다른 적절한 알고리듬의 예에는 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)(문헌[J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)]; 전체 정렬 도구) 및 스미스-워터만(Smith-Waterman)(문헌[J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)]; 국소 정렬 도구)이 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 스미스-워터만 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 이행된다. 적절한 디폴트 파라미터의 예에는 블로섬(BLOSUM)62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)의 사용이 포함되며, 갭 개방 페널티(GAP open penalty)는 10이고, 갭 연장 페널티(GAP extension penalty)는 0.5이다.

과가수분해효소 중의 전체 동일성 백분율의 비교에 의해, (시그니처 모티프를 보유하면서) 서열 번호 2에 대하여 대략 30%만큼 적은 아미노산 동일성을 갖는 효소가 유의미한 과가수분해효소 활성을 나타내는 것으로 표현되며, 구조적으로 CE-7 탄수화물 에스테라제로 분류된다. 일 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 CE-7 시그니처 모티프, 및 서열 번호 2에 대하여 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하는 효소를 포함한다.

과가수분해 활성을 갖는 적절한 CE-7 탄수화물 에스테라제의 예에는 아미노산 서열, 예를 들어, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309 및 311을 갖는 효소가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 효소는 14, 16, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 실시형태에서, CE-7 탄수화물 에스테라제는 써모토가 마리티마 CE-7 탄수화물 에스테라제(서열 번호 16)로부터 유래된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "CE-7 변이체", "변이체 과가수분해효소" 또는 "변이체"는 CE-7 시그니처 모티프 및 관련 과가수분해 활성이 유지되는 한, 변이체가 유래되는 해당하는 효소(전형적으로 야생형 효소)에 비하여, 적어도 하나의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 야기하는 유전자 변형을 갖는 CE-7 과가수분해효소를 지칭할 것이다. 또한, CE-7 변이체 과가수분해효소는 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. CE-7 변이체의 예는 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309 및 311로 제공된다. 일 실시형태에서, 변이체는 서열 번호 27, 28, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64를 포함할 수 있다.

당업자는 실질적으로 유사한 CE-7 과가수분해효소 서열(시그니처 모티프 보유)이 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있음을 인식한다. 일 실시형태에서, 실질적으로 유사한 서열은 매우 엄격한 조건 하에서 본 명세서에 예시된 서열과 관련된 핵산 분자와 혼성화하는 그들의 능력에 의해 정의된다. 다른 실시형태에서, 서열 정렬 알고리듬을 사용하여, 본 명세서에 제공되는 DNA 또는 아미노산 서열에 대한 동일성 백분율에 기초하여 실질적으로 유사한 효소를 정의할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 핵산 분자는 제1 분자의 단일의 가닥이 적절한 온도 및 용액 이온 세기의 조건 하에서 다른 분자에 어닐링될 수 있는 경우, 다른 핵산 분자, 예를 들어, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA에 "혼성화가능하다". 혼성화 및 세정 조건은 널리 공지되어 있으며, 문헌[Sambrook, J. and Russell, D., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)]에 예시되어 있다. 온도 및 이온 세기 조건은 혼성화의 "엄격성(stringency)"을 결정한다. 엄격성 조건을 조정하여, 관계가 먼 유기체로부터의 상동 서열과 같은 중등으로 유사한 분자 내지 밀접하게 관련된 유기체로부터의 기능성 효소를 중복시키는 유전자와 같은 고도로 유사한 분자를 스크리닝할 수 있다. 혼성화 후 세정이 전형적으로 엄격성 조건을 결정한다. 한 세트의 바람직한 조건은 실온에서 15분 동안 6× SSC, 0.5% SDS로 시작한 다음, 45℃에서 30분 동안 2× SSC, 0.5% SDS로 반복한 다음, 50℃에서 30분 동안 0.2× SSC, 0.5% SDS로 2회 반복한 일련의 세정을 사용한다. 더욱 바람직한 세트의 조건은 더 높은 온도를 사용하며, 여기서, 세정은 0.2× SSC, 0.5% SDS에서의 최종 2회의 30분 세정의 온도가 60℃로 증가된 것을 제외하고 상기와 동일하다. 다른 바람직한 세트의 고도로 엄격한 혼성화 조건은 0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃이며, 2× SSC, 0.1% SDS로 세정하고, 0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃의 최종 세정으로 이어진다.

혼성화의 엄격성에 따라 염기 간의 미스매치가 가능하지만, 혼성화를 위해서는 2개의 핵산이 상보적 서열을 함유하는 것이 요구된다. 혼성화되는 핵산에 대해 적절한 엄격성은, 당업계에 주지된 변수인 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 의존한다. 2개 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 이들 서열을 가진 핵산의 하이브리드에 대한 Tm의 값이 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(높은 Tm에 상응함)은 하기의 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 100개 뉴클레오티드 길이를 초과하는 하이브리드에 대하여, Tm을 계산하는 수학식이 유도되었다(상기 문헌[Sambrook and Russell]). 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 있어서는 미스매치의 위치가 더욱 중요해지며 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다(상기 문헌[Sambrook and Russell]). 일 태양에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 혼성화가능한 핵산의 최소의 길이는 적어도 약 15개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20개 뉴클레오티드 길이, 더더욱 바람직하게는 적어도 30개 뉴클레오티드 길이, 더더욱 바람직하게는 적어도 300개 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 적어도 800개 뉴클레오티드 길이이다. 또한, 프로브의 길이와 같은 인자에 따라 필요한 경우에 온도 및 세정 용액 염 농도를 조정할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성 백분율"은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계로서, 서열을 비교함으로써 결정된다. 당업계에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서, 서열의 스트링(string) 간의 매치에 의해 결정되는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 하기의 문헌에 기재된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988)]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993)]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994)]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991)]. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중에게 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 명시되어 있다. 레이저진(LASERGENE) 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(bioinformatics computing suite)(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타 인코포레이티드)의 멕얼라인(Megalign) 프로그램, 벡터 NTI v. 7.0(미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 인포맥스, 인코포레이티드)의 얼라인엑스(AlignX) 프로그램, 또는 엠보스 오픈 소프트웨어 스위트(EMBOSS Open Software Suite)(EMBL-EBI; 문헌[Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)])를 사용하여 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산을 수행할 수 있다. 서열의 다중의 정렬은 디폴트 파라미터와 함께 클러스털 정렬 방법(예를 들어, 클러스털더블유; 예를 들어, 버전 1.83)(문헌[Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)]; 문헌[Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994)]; 및 문헌[Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500 (2003)], 유럽 바이오인포매틱스 연구소(European Bioinformatics Institute)를 통하여 유럽 분자 생물학 실험실로부터 입수가능함)을 사용하여 수행할 수 있다. 클러스털더블유 단백질 정렬에 적절한 파라미터는 갭 존재 페널티(GAP Existence penalty)=15, 갭 연장=0.2, 매트릭스=고넷(Gonnet)(예를 들어, 고넷250), 단백질 엔드갭(ENDGAP)=-1, 단백질 갭디스트(GAPDIST)=4, 및 KTUPLE=1을 포함한다. 일 실시형태에서, 고속 또는 저속 정렬은 디폴트 설정으로 사용되며, 저속 정렬이 바람직하다. 대안적으로, 클러스털더블유 방법(예를 들어, 버전 1.83)을 사용하는 파라미터는 또한 KTUPLE=1, 갭 페널티=10, 갭 연장=1, 매트릭스=블로섬(예를 들어, 블로섬64), 윈도우(WINDOW)=5 및 탑 디아고날 세이브드(TOP DIAGONALS SAVED)=5를 사용하여 변경될 수 있다.

일 태양에서, 적절한 분리된 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 태양에서, 적절한 분리된 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하되; 단, 폴리펩티드는 CE-7 시그니처 모티프를 보유한다. 적절한 핵산 분자는 상기 상동성을 가질 뿐 아니라, 또한 전형적으로 약 210 내지 340개 아미노산 길이, 약 300 내지 약 340개 아미노산, 바람직하게는 약 310 내지 약 330개 아미노산, 가장 바람직하게는 약 318 내지 약 325개 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 암호화하며, 각 폴리펩티드는 과가수분해 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

표적화된 과가수분해효소

본 명세서에 사용되는 용어 "표적화된 과가수분해효소" 및 "과가수분해 활성을 갖는 표적화된 효소"는 표적 표면, 바람직하게는 표적화된 체표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 융합/결합된 적어도 하나의 과가수분해 효소(야생형 또는 그의 변이체)를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 것이다. 표적화된 과가수분해효소 내의 과가수분해 효소는 임의의 과가수분해 효소일 수 있으며, 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합물을 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(서브틸리신 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 에스테라제(슈도모나스 플루오레슨스; 미국 특허 제7,384,787호; 서열 번호 315[L29P 변이체] 및 서열 번호 339[야생형]), 과가수분해 아릴 에스테라제(마이코박테리움 스메그마티스; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호; 서열 번호 314[S54V 변이체] 및 338[야생형])가 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모발에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 결합 도메인", "체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분", "모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분" 및 "HSBD"는 펩티드 결합에 의해 결합된 둘 이상의 아미노산의 적어도 하나의 폴리머를 포함하는 과가수분해 효소의 부분이 아닌 융합 단백질의 펩티드 성분을 지칭할 것이며; 여기서, 성분은 모발, 바람직하게는 인간 모발에 대하여 친화성을 갖는다.

일 실시형태에서, 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, F_ab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대 항체(문헌[Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol. (2001) 74:277-302]), 비-항체 스캐폴드 디스플레이 단백질(다양한 스캐폴드-보조 방법의 검토를 위한 문헌[Hosse et al., Prot. Sci. (2006) 15(1): 14-27] 및 문헌[Binz, H. et al. (2005) Nature Biotechnology 23, 1257-1268]) 또는 면역글로불린 폴드(immunoglobulin fold)가 결여된 단쇄 폴리펩티드일 수 있다. 다른 태양에서, 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드이다(즉, 모발에 대하여 친화성을 갖는 체표면-결합 펩티드 또는 적어도 하나의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 체표면-결합 도메인). 바람직한 실시형태에서, 펩티드 성분은 모발에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드이다.

모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 임의의 펩티드 링커에 의해 과가수분해 효소로부터 분리될 수 있다. 소정의 펩티드 링커/스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다.

일 실시형태에서, 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 각각이 임의로, 그리고 독립적으로 길이가 1 내지 100개 아미노산인 펩티드 스페이서에 의해 분리된 하나 이상의 모발-결합 펩티드를 포함할 수 있다. 모발-결합 펩티드 및/또는 모발-결합 펩티드를 포함하는 모발-결합 도메인의 예에는 서열 번호 65 내지 221, 271, 290, 291, 312 및 313이 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 펩티드 링커/스페이서의 예에는 서열 번호 272 내지 285가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

이전에 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 것으로 동정된 펩티드는 모발에 대한 친화성도 또한 가질 수 있다. 이와 같이, 융합 펩티드는 다른 체표면, 예를 들어, 피부(서열 번호 217 내지 269) 또는 네일(서열 번호 270 및 271)에 대하여 친화성을 갖는 것으로 이전에 보고된 적어도 하나의 것을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 펩티드는 표적 체표면에 정전기 인력을 갖도록 고안된 임의의 체표면-결합 펩티드(예를 들어, 표적 체표면에 정전기적으로 결합되도록 엔지니어링된 체표면-결합 펩티드)를 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해 효소의 예에는 서열 번호 288, 289, 294, 295, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335 및 337 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적화된 과가수분해 효소의 예에는 서열 번호 288, 289, 294, 295, 317, 319, 321, 323, 325, 327 및 329 중 하나 이상이 포함될 수 있다.

표적화된 CE -7 과가수분해효소

바람직한 실시형태에서, "표적화된 과가수분해효소"는 과가수분해 활성을 갖는 표적화된 CE-7 탄수화물 에스테라제이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "표적화된 CE-7 과가수분해효소" 및 "표적화된 CE-7 탄수화물 에스테라제"는 표적화된 표면, 바람직하게는 모발에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 융합/결합된 적어도 하나의 CE-7 과가수분해효소(야생형 또는 변이체 과가수분해효소)를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 것이다. 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 상기 기재된 임의의 것일 수 있다. 바람직한 태양에서, 표적화된 CE-7 과가수분해효소의 펩티드 성분은 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드이다(즉, 모발에 대하여 친화성을 갖는 체표면-결합 펩티드 또는 적어도 하나의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 체표면-결합 도메인). 바람직한 실시형태에서, 펩티드 성분은 모발에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드이다.

모발/모발 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 임의의 펩티드 링커에 의해 CE-7 과가수분해효소로부터 분리될 수 있다. 소정의 펩티드 링커/스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다.

이와 같이, 표적화된 CE-7 과가수분해효소의 예에는 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 301, 303, 305, 307, 309 및 311로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CE-7 과가수분해효소가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소의 예에는 모발에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 체표면-결합 펩티드에 (임의로 펩티드 스페이서를 통해) 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 301, 303, 305, 307, 309 및 311로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CE-7 과가수분해효소가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

융합 펩티드는 다른 체표면, 예를 들어, 피부(서열 번호 217 내지 269) 또는 네일(서열 번호 270 및 271)에 대하여 친화성을 갖는 것으로 이전에 보고된 적어도 하나의 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, CE-7 융합 펩티드는 서열 번호 65 내지 221, 271, 290 및 291을 포함하는 군으로부터의 적어도 하나의 모발-결합 펩티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, CE-7 과가수분해효소 융합 펩티드는 표적 체표면에 정전기 인력을 갖도록 고안된 임의의 체표면-결합 펩티드(예를 들어, 표적 체표면에 정전기적으로 결합되도록 엔지니어링된 체표면-결합 펩티드)를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 표적화된 CE-7 과가수분해효소의 예에는 서열 번호 288, 289, 294, 295, 317, 319 및 321이 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드

적어도 하나의 체표면에 결합할 수 있는 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드는 "체표면-결합 펩티드"(BSBP)로 지칭되며, 예를 들어, 모발, 피부 또는 네일에 결합하는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 적어도 인간 모발에 결합하는 것으로 동정된 펩티드는 "모발-결합 펩티드(HBP)"로 지칭된다. 또한, 적어도 인간 피부에 결합하는 것으로 동정된 펩티드는 "피부-결합 펩티드(SBP)"로 지칭된다. 또한, 적어도 인간 네일에 결합하는 것으로 동정된 펩티드는 "네일-결합 펩티드(NBP)"로 지칭된다. 짧은 단쇄 체표면-결합 펩티드는 실험으로 생성하거나(예를 들어, 음으로 하전된 표면에 표적화된 양으로 하전된 폴리펩티드) 또는 표적 체표면에 대한 바이오패닝을 사용하여 생성할 수 있다.

다양한 체표면에 대하여 강력한 친화성을 갖는 짧은 펩티드가 보고되어 있다(미국 특허 제7,220,405호; 제7,309,482호; 제7,285,264호 및 제7,807,141호; 미국 특허 출원 공개 제2005-0226839호; 제2007-0196305호; 제2006-0199206호; 제2007-0065387호; 제2008-0107614호; 제2007-0110686호; 제2006-0073111호; 제2010-0158846호 및 제2010-0158847호; 및 PCT 출원 공개 WO2008/054746호; WO2004/048399호 및 WO2008/073368호). 체표면-결합 펩티드를 사용하여 유익제를 표적 체표면에 결합시킬 수 있는 펩티드계 시약을 구축하였다. 그러나, 과산 유익제의 생성을 위해 활성 과가수분해효소를 표적 체표면에 결합시키기 위한(다시 말하면, "표적화된 과가수분해효소") 이들 펩티드의 이용은 기재된 적이 없다.

모발(서열 번호 65 내지 221, 271, 290 및 291로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 모발-결합 펩티드), 피부(피부-결합 펩티드는 서열 번호 217 내지 269로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다) 및 네일(네일-결합 펩티드는 서열 번호 270 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다)에 대하여 친화성을 갖는 것을 포함하는 적어도 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 비제한적인 체표면-결합 펩티드의 목록이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 체표면-결합 도메인은 길이가 최대 약 60개 아미노산인 체표면-결합 펩티드로 이루어진다. 일 실시형태에서, 체표면-결합 펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 체표면-결합 펩티드는 길이가 7 내지 50개 아미노산이거나, 길이가 7 내지 30개 아미노산이다. 또 다른 실시형태는 길이가 7 내지 27개 아미노산인 체표면-결합 펩티드이다.

단일 모발-, 피부-, 네일-결합 펩티드를 포함하는 체표면-결합 펩티드를 포함하는 융합 펩티드가 본 발명의 특정 실시형태이지만, 본 발명의 다른 실시형태에서, 다수의 체표면-결합 펩티드를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 다수, 즉, 둘 이상의 체표면-결합 펩티드의 포함은 예를 들어, 심지어 단일 체표면-결합을 포함하는 결합 요소보다 더 내구성 있는 펩티드 성분을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 체표면-결합 도메인은 2 내지 약 50개 또는 2 내지 약 25개의 체표면-결합 펩티드를 포함한다. 다른 실시형태는 2 내지 약 10개 또는 2 내지 5개의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 체표면-결합 도메인을 포함한다.

다수의 결합 요소(즉, 체표면-결합 펩티드 또는 체표면-결합 도메인)는 서로 직접 결합될 수 있거나, 이들은 펩티드 스페이서를 사용하여 함께 결합될 수 있다. 소정의 펩티드 스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다.

체표면-결합 도메인 및 그들을 구성하는 더 짧은 체표면-결합 펩티드는 예를 들어, 임의의 공지되어 있는 바이오패닝 기술, 예를 들어, 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 그들의 조합을 비롯한 당업계에 공지되어 있는 많은 방법을 사용하여 동정할 수 있다. 전형적으로, 펩티드의 무작위 또는 실질적인 무작위(사건에서 편향이 존재) 라이브러리를 표적 체표면에 대하여 바이오패닝하여, 표적 체표면에 대하여 친화성을 갖는 라이브러리 내의 펩티드를 동정한다.

펩티드의 무작위 라이브러리의 생성은 널리 공지되어 있으며, 박테리아 디스플레이(문헌[Kemp, D.J.; Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78(7):4520-4524 (1981)] 및 문헌[Helfman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1):31-35, (1983)]), 효모 디스플레이(문헌[Chien et al., Proc Natl Acad Sci USA 88(21):9578-82 (1991)]), 조합 고체상 펩티드 합성(미국 특허 제5,449,754호, 미국 특허 제5,480,971호, 미국 특허 제5,585,275호, 미국 특허 제5,639,603호) 및 파지 디스플레이 기술(미국 특허 제5,223,409호, 미국 특허 제5,403,484호, 미국 특허 제5,571,698호, 미국 특허 제5,837,500호); 리보솜 디스플레이(미국 특허 제5,643,768호; 미국 특허 제5,658,754호; 및 미국 특허 제7,074,557호),및 mRNA 디스플레이 기술(프로퓨젼(상표명); 미국 특허 제6,258,558호; 제6,518,018호; 제6,281,344호; 제6,214,553호; 제6,261,804호; 제6,207,446호; 제6,846,655호; 제6,312,927호; 제6,602,685호; 제6,416,950호; 제6,429,300호; 제7,078,197호; 및 제6,436,665호 참조)을 포함하는 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다.

결합 친화성

체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 10^-5 몰(M) 이하의 인간 모발, 피부 또는 네일에 대한 결합 친화성을 포함한다. 특정 실시형태에서, 펩티드 성분은 10^-5 몰(M) 이하의 인간 모발, 피부 또는 네일에 대한 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 체표면-결합 펩티드 및/또는 결합 도메인(들)이다. 일부 실시형태에서, 결합 펩티드 또는 도메인은 적어도 약 50 내지 500 mM 염의 존재 하에 10^-5 M 이하의 결합 친화성 값을 가질 것이다. 용어 "결합 친화성"은 결합 펩티드와 그의 각각의 기질, 이 경우에는 인간 모발, 피부 또는 네일의 상호작용의 강도를 말한다. 결합 친화성은 결합 펩티드의 해리 상수("K_D") 또는 "MB₅₀"에 관하여 정의되거나 측정될 수 있다.

"K_D"는 표적 상의 결합 부위가 절반 점유된, 다시 말하면, 펩티드가 결합된 표적(결합 표적 물질)의 농도가 펩티드가 결합되지 않은 표적의 농도와 같은 경우의 펩티드의 농도에 해당한다. 해리 상수가 더 작을수록, 펩티드가 더욱 단단히 결합된다. 예를 들어, 나노몰(nM) 해리 상수를 갖는 펩티드는 마이크로몰(μM) 해리 상수를 갖는 펩티드보다 더욱 단단히 결합한다. 본 발명의 특정 실시형태는 K_D 값이 10^-5 이하일 것이다.

"MB₅₀"은 ELISA-기반의 결합 검정법에서 수득되는 최대 신호의 50%의 신호를 제공하는 결합 펩티드의 농도를 말한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2005/022683호의 실시예 3을 참고한다. MB₅₀은 복합체의 성분의 결합 상호작용 또는 친화성의 세기의 표시를 제공한다. MB₅₀의 값이 더 낮을수록, 펩티드와 그의 해당하는 기질의 상호작용이 더욱 강력하며, 다시 말하면, 더 낫다. 예를 들어, 나노몰(nM) MB₅₀을 갖는 펩티드는 마이크로몰(μM) MB₅₀을 갖는 펩티드보다 더욱 단단하게 결합한다. 본 발명의 특정 실시형태는 MB₅₀ 값이 10^-5 M 이하일 것이다.

일부 실시형태에서, 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 K_D 또는 MB₅₀ 값으로 측정시, 결합 친화성이 약 10^-5 M 이하, 약 10^-6 M 이하, 약 10^-7 M 이하, 약 10^-8 M 이하, 약 10^-9 M 이하, 또는 약 10^-10 M 이하일 수 있다.

일부 실시형태에서, 체표면-결합 펩티드 및/또는 체표면-결합 도메인은 K_D 또는 MB₅₀ 값으로 측정시, 결합 친화성이 약 10^-5 M 이하, 약 10^-6 M 이하, 약 10^-7 M 이하, 약 10^-8 M 이하, 약 10^-9 M 이하, 또는 약 10^-10 M 이하일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "강력한 친화성"은 K_D 또는 MB₅₀ 값이 약 10^-5 M 이하, 바람직하게는 약 10^-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10^-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10^-8 M 이하, 약 10^-9 M 이하, 또는 가장 바람직하게는 약 10^-10 M 이하인 결합 친화성을 지칭할 것이다.

다성분 퍼옥시카르복실산 생성 시스템

다수의 활성 성분을 분리하고 배합하는 시스템 및 수단의 고안은 일반적으로 개별 반응 성분의 물리적 형태에 좌우될 것이다. 예를 들어, 다수의 활성 유체(액체-액체) 시스템은 전형적으로 멀티-챔버 디스펜서(multi-chamber dispenser) 병 또는 2상 시스템(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2005/0139608호; 미국 특허 제5,398,846호; 미국 특허 제5,624,634호; 미국 특허 제6,391,840호; 유럽 특허 제0807156B1호; 미국 특허 출원 공개 제2005/0008526호; 및 PCT 공개 WO 00/61713호), 예컨대 원하는 탈색제가 반응성 유체의 혼합시에 생성되는 일부 탈색 응용에서 관찰되는 것을 사용한다. 퍼옥시카르복실산을 생성하기 위해 사용되는 다른 형태의 다성분 시스템은 하나 이상의 고체 성분 또는 고체-액체 성분의 조합, 예를 들어, 분말(예를 들어, 미국 특허 제5,116,575호), 다층 정제(예를 들어, 미국 특허 제6,210,639호), 다수의 구획을 갖는 수용해성 패킷(packet)(예를 들어, 미국 특허 제6,995,125호) 및 물의 첨가 시에 반응하는 고체 응집체(예를 들어, 미국 특허 제6,319,888호)를 위해 고안된 것들을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 개별 성분은 연장된 기간 동안 안정적이며, 취급하기에 안전해야 한다(다시 말하면, 혼합 시에 생성되는 퍼옥시카르복실산의 농도로 측정시). 일 실시형태에서, 다성분 효소적 퍼옥시카르복실산 생성 시스템의 저장 안정성은 효소 촉매 안정성에 관하여 측정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 다성분 시스템의 저장 안정성은 효소 촉매 안정성 및 기질(예를 들어, 카르복실산 에스테르) 안정성 둘 모두에 관하여 측정한다.

원하는 퍼옥시카르복실산 농도를 갖는 과산 수용액을 빠르게 생성하기 위해 효소 촉매를 사용하는, 다성분 퍼옥시카르복실산 생성 제형을 포함하는 개인 관리 제품이 본 명세서에 제공된다. 혼합은 사용 직전에 및/또는 적용 부위(동소)에서 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 개인 관리 제품 제형은 사용될 때까지 계속 분리되는 적어도 2개의 성분으로 이루어질 것이다. 성분의 혼합에 의해, 과산 수용액이 신속하게 형성된다. 생성된 과산 수용액이 의도된 최종 용도(예를 들어, 과산 기반의 제모, 과산 기반의 모발 인장 강도의 감소, 다른 제모 제품(예를 들어, 티오글리콜산염계 제모 제품)에 사용하기 위한 과산-증진된 제모, 모발 탈색, 모발 염료 사전처리(산화적 모발 염료), 모발 컬링, 모발 컨디셔닝, 피부 미백, 피부 탈색, 피부 컨디셔닝, 피부 주름 외양 감소, 피부 원기회복, 피부 유착(dermal adhesion) 감소, 체취 감소 또는 제거, 네일 표백 또는 네일 소독)에 적절한 유효 농도의 과산을 포함하도록 각 성분이 고안된다. 개별 성분의 조성은 (1) 연장된 저장 안정성을 제공하고/거나 (2) 퍼옥시카르복실산으로 이루어진 적절한 수성 반응 제형의 형성을 증진시키는 능력을 제공하도록 고안되어야 한다.

다성분 제형은 적어도 2개의 실질적으로 액체인 성분으로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 다성분 제형은 제1 액체 성분 및 제2 액체 성분을 포함하는 2성분 제형일 수 있다. 용어 "제1" 또는 "제2" 액체 성분의 이용은 상대적이되, 단 특정 성분을 포함하는 2가지 상이한 액체 성분은 사용할 때까지 계속 분리된다. 최소한도로, 다성분 퍼옥시카르복실산 제형은 (1) 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 효소 촉매, (2) 카르복실산 에스테르 기질 및 (3) 과산소원 및 물을 포함하며, 제형은 성분의 혼합시에 목적하는 과산을 효소에 의해 생성한다.

2성분 제형에 사용되는 다양한 성분의 유형 및 양은 (1) 효소 촉매의 과가수분해 활성 및 각 기질의 안정성/반응성을 포함하는 각 성분의 저장 안정성, 및 (2) 용해성 및/또는 원하는 퍼옥시카르복실산 수용액을 효율적으로 형성하는 능력을 증진시키는 물리적 특성을 제공하도록 조심히 선택되고 균형을 이루어야 한다(예를 들어, 수성 반응 혼합물 중의 에스테르 기질의 용해성을 증진시키는 성분 및/또는 적어도 하나의 액체 성분의 점도 및/또는 농도를 변경하는 성분[다시 말하면 효소에 의한 과가수분해 활성에 대한 상당한 역효과를 갖지 않는 적어도 하나의 공용매]).

효소에 의한 과산 생성 시스템의 성능 및/또는 촉매 안정성을 향상시키는 다양한 방법이 개시된다 (미국 특허 출원 공개 제2010-0048448호, 제2010-0086534호 및 제2010-0086535호).

본 발명의 모발 관리 제품은 사용될 때까지 분리되어 유지되는 2가지 조성물을 포함한다. 제1 조성물은

1) i) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며;

R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;

m은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;

ii) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₃ 및 R₄는 각각 H 또는 R₁C(O)이다)를 갖는 글리세리드;

iii) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;

2) 고체 과산소원, 예를 들어, 과붕산염, 과탄산염 또는 그들의 조합; 및

3) 임의의 유기 공용매의 혼합물을 포함하는 비-수성 조성물이다.

제2 성분은

1) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매; 및

2) 적어도 하나의 완충제를 포함하는 수성 조성물이며, 여기서, 수성 조성물은 적어도 4의 pH로 이루어진다.

비-수성 조성물 및 수성 조성물은 사용 전에 분리되어 유지되고, 효소에 의해 생성되는 과산은 비-수성 및 수성 조성물의 배합 시에 생성된다.

수성 조성물에 혼입되는 완충제(들)의 유형 및 양은 수성 조성물의 pH가 (사용 전에) 적어도 4, 바람직하게는 약 4 내지 약 9 범위의 pH로 유지되도록 선택된다. 반응 성분은 비-수성 조성물 및 수성 조성물의 배합 시에 수득되는 생성되는 반응 혼합물이 효소 촉매가 과가수분해 활성을 가지며, 이에 의해 적어도 하나의 과산이 생성되는 pH로 이루어지도록 선택된다.

본 명세서에 기재된 2 조성물 중의 성분의 배치는 효소 촉매(반응의 시작시에 관찰되는 효소 활성으로 측정시) 및 기질(저장 동안 실질적으로 분해되지 않는 카르복실산 에스테르 및 과산소원) 둘 모두에 대하여 저장 안정성을 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 안정한"은 질의 성분의 저장 안정성이 활성(예를 들어 효소 촉매 활성)을 유지하거나 저장 중에(사용 전에) 조성물 중에서 유의미하게 변경되지 않는 것(예를 들어, 기질의 농도는 저장 동안 실질적으로 변경되지 않는다)을 의미한다. 일 실시형태에서, 저장 조건은 25℃에서 적어도 14일 동안의 조성물의 저장을 포함하며; 여기서, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더더욱 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 약 100%의 원래 활성(예를 들어, 효소 촉매 활성) 및 원래 기질 농도(예를 들어, 카르복실산 에스테르 기질)가 조성물의 생성시에 수득되는 활성/농도에 비례하여 유지된다. 촉매 안정성 및 기질 안정성을 측정하는 수단이 본 명세서에 기재된다.

효소 분말

일부 실시형태에서, 개인 관리 조성물은 안정화된 효소 분말 형태의 효소 촉매를 사용할 수 있다. 효소 분말을 포함하는 제형을 제조하고 안정화시키는 방법은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086534호 및 제2010-0086535호에 기재되어 있다.

일 실시형태에서, 효소는 효소 분말의 건조 중량에 기초하여, 약 5 중량 퍼센트(wt%) 내지 약 75 wt% 범위의 양의 효소 분말일 수 있다. 효소 분말/분무-건조된 혼합물 중의 효소의 바람직한 중량% 범위는 약 10 wt% 내지 50 wt%이며, 효소 분말/분무-건조된 혼합물 중의 효소의 더욱 바람직한 중량% 범위는 약 20 wt% 내지 33 wt%이다.

일 실시형태에서, 효소 분말은 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일 태양에서, 부형제는 효소 분말의 건조 중량에 기초하여 약 95 wt% 내지 약 25 wt%의 범위의 양으로 제공된다. 효소 분말 중의 부형제의 바람직한 wt % 범위는 약 90 wt% 내지 50 wt%이며, 효소 분말 중의 부형제의 더욱 바람직한 wt % 범위는 약 80 wt% 내지 67 wt%이다.

일 실시형태에서, 효소 분말을 제조하기 위해 사용되는 부형제는 올리고당 부형제일 수 있다. 일 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1250이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 9000이다. 일부 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1700이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 15000이다. 특정 올리고당은 말토덱스트린, 자일란, 만난, 후코이단, 갈락토만난, 키토산, 라피노스, 스타키오스, 펙틴, 인슐린, 레반, 그라미난, 아밀로펙틴, 수크로스, 락툴로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 니제로트라이오스(nigerotriose), 말토트라이오스, 멜레지토스, 말토트라이울로스(maltotriulose), 라피노스, 케스토스(kestose) 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 올리고당 부형제는 말토덱스트린이다. 또한, 올리고당계 부형제는 수용성 비이온성 셀룰로스 에테르, 예를 들어, 하이드록시메틸-셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이은에 한정되지 않는다. 추가의 실시형태에서, 부형제는 하기의 화합물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다: 트레할로스, 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 셀로비오스, α-사이클로덱스트린 및 카르복시메틸셀룰로스.

제형은 적어도 하나의 임의의 계면활성제를 포함할 수 있으며, 여기서, 적어도 하나의 계면활성제의 존재가 바람직하다. 계면활성제는 이온성 및 비이온성 계면활성제 또는 습윤제, 예를 들어, 에톡실화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 유도체, 모노글리세리드 또는 그의 에톡실화 유도체, 다이글리세리드 또는 그의 폴리옥시에틸렌 유도체, 소듐 도쿠세이트, 소듐 라우릴설페이트, 콜린산 또는 그의 유도체, 레시틴, 인지질, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 블록 코폴리머 및 비이온성 유기규소를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이며, 폴리소르베이트 80이 더욱 바람직하다.

일 실시형태에서, 적절한 비이온성 계면활성제는 세토마크로골(cetomacrogol) 1000(폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르), 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 코코-베타인, 코카미드 DEA, 코카미드 MEA, 코코글리세리드, 코코-글루코시드, 데실 글루코시드, 글리세릴 라우레이트, 글리세릴 올레에이트, 아이소세테스(isoceteth)-20, 라우릴 글루코시드, 좁은 범위(narrow range) 에톡실레이트, 노니데트(Nonidet)(등록 상표) P-40, 노녹시놀-9, 노녹시놀, NP-40, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥틸 글루코시드, 올레일 알코올, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 폴록사머(Poloxamer), 폴록사머 407, 폴리글리세롤 폴리리시놀레에이트, 폴리글리세릴-10 라우레이트, 폴리소르베이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 소듐 코코-설페이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트라이스테아레이트, 스테아릴 알코올, 수크로스 라우레이트, 트리톤(Triton)(등록 상표) X-100, 트윈(등록 상표)-20 및 트윈(등록 상표)-80을 포함할 수 있다.

제형이 효소 분말을 포함하는 경우, 분말을 제조하는데 사용되는 계면활성제는 효소 분말에 존재하는 단백질의 중량에 기초하여, 약 5 wt% 내지 0.1 wt%, 바람직하게는 효소 분말에 존재하는 단백질의 중량에 기초하여, 약 2 wt% 내지 0.5 wt% 범위의 양으로 존재할 수 있다.

효소 분말은 추가로 1가지 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염), 및 효소 안정화제(예를 들어, 에틸렌다이아민테트라아세트산, (1-하이드록시에틸리덴)비스포스폰산)를 포함할 수 있다.

효소 분말을 형성하기 위한 제형의 분무 건조는 예를 들어, 문헌[Spray Drying Handbook, 5^th ed., K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1991)] 및 PCT 특허 출원 공개 WO 97/41833호 및 WO 96/32149호(Platz, R. et al.)에 일반적으로 기재된 바와 같이 수행된다.

일반적으로, 분무 건조는 고도로 분산된 액체와 충분한 양의 고온 공기를 함께 접촉시켜서 증발이 일어나게 하는 단계 및 액적을 건조시키는 단계로 구성된다. 전형적으로, 공급물은 용매를 증발시키고 건조된 생성물을 수집기로 이동시키는 따뜻한 여과된 공기의 흐름으로 분무된다. 소모된 공기는 이어서 용매와 함께 배기된다. 당업자는 몇몇 상이한 유형의 장치를 사용하여 원하는 제품을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 부치 리미티드(Buchi Ltd.)(스위스 포스트파치 소재) 또는 지이에이 니로 코포레이션(GEA Niro Corp.)(덴마크 코펜하겐 소재)에 의해 제조되는 시판용 분무 건조기는 원하는 크기의 입자를 효율적으로 생성할 것이다. 이들 분무 건조기 및 특히 이중 노즐 기술을 사용하는 2가지 용액의 동시의 분무와 같은 특정 응용을 위해 그들의 아토마이저(atomizer)가 변경되거나 맞춤화될 수 있음을 추가로 인식할 것이다. 더욱 구체적으로, 유중수형 에멀젼은 하나의 노즐로부터 아토마이징될 수 있으며, 만니톨과 같은 부착-방지제(anti-adherent)를 함유하는 용액을 제2 노즐로부터 공동-아토마이징할 수 있다. 다른 경우에, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프를 사용하여 맞춤 설계된 노즐을 통해 공급 용액을 미는 것이 바람직할 수 있다. 정확한 형태 및/또는 조성을 포함하는 미세구조체가 생성된다면, 장치의 선택은 중요하지 않으며, 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.

분무된 재료를 건조시키는데 사용되는 기체의 양쪽 입구 및 출구의 온도는 분무된 재료에서 효소의 분해를 야기하지 않는 정도이다. 이러한 온도는 전형적으로 실험에 의해 측정되지만, 일반적으로, 입구 온도는 약 50℃ 내지 약 225℃ 범위이면서 출구 온도는 약 30℃ 내지 약 150℃ 범위일 것이다. 바람직한 파라미터는 약 0.14 MPa 내지 1.03 MPa(20 내지 150 psi), 바람직하게는 약 0.21-0.28 MPa 내지 0.69 MPa(30-40 내지 100 psi) 범위의 아토마이징 압력을 포함한다. 전형적으로, 사용되는 아토마이징 압력은 다음 중 하나일 것이다(MPa): 0.14, 0.21, 0.28, 0.34, 0.41, 0.48, 0.55, 0.62, 0.69, 0.76, 0.83 또는 그 이상.

효소에 의해 촉매작용되는, 카르복실산 에스테르 및 과산화수소로부터의 과산의 제조에 적절한 반응 조건

본 발명의 개인 관리 조성물 및 방법에서, 과가수분해 활성을 갖는 하나 이상의 효소를 사용하여 유효 농도의 원하는 과산(들)을 생성할 수 있다. 원하는 퍼옥시카르복실산은 카르복실산 에스테르를 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매의 존재 하에 과산화수소, 과붕산나트륨 또는 과탄산나트륨을 포함하나 이에 한정되지 않는 과산소원과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

표적화된 과가수분해효소 내의 과가수분해 효소는 임의의 과가수분해 효소일 수 있으며, 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합물을 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(서브틸리신 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 에스테라제(슈도모나스 플루오레슨스; 미국 특허 제7,384,787호; 서열 번호 315[L29P 변이체] 및 서열 번호 339[야생형]) 및 과가수분해 아릴 에스테라제(마이코박테리움 스메그마티스; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호; 서열 번호 314[S54V 변이체] 및 338[야생형])가 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 적어도 하나의 효소를 포함하며, 상기 효소는 구조적으로, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리(CE-7; 상기 문헌[Coutinho, P.M., and Henrissat, B.] 참조)의 구성원으로 분류된다. 다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 구조적으로, 세팔로스포린 C 데아세틸라제로 분류된다. 다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 구조적으로, 아세틸 자일란 에스테라제로 분류된다.

일 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해 활성, 및

a) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 118 내지 120과 정렬되는 RGQ 모티프;

b) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 179 내지 183과 정렬되는 GXSQG 모티프; 및

c) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 298 및 299와 정렬되는 HE 모티프를 포함하는 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 서열 번호 2의 참조 서열에 대한 정렬은 클러스털더블유를 사용하여 수행된다.

추가의 실시형태에서, 추가의 CE-7 시그니처 모티프가 포함될 수 있으며, 추가의(즉, 제4) 모티프는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬하는 경우 아미노산 잔기 267 내지 269에서의 LXD 모티프로 정의된다.

다른 실시형태에서 과가수분해효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 포함하며, 상기 효소는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309 및 311로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 포함하며, 상기 효소는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309 및 311로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, 상기 효소는 시그니처 모티프가 보존되고, 과가수분해효소 활성이 유지되는 한 하나 이상의 부가, 결실 또는 치환을 가질 수 있다.

상술된 바와 같이, CE-7 과가수분해효소는 CE-7 과가수분해효소를 포함하는 제1 부분, 및 과가수분해효소가 원하는 체표면에 "표적화"되도록 표적 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 포함하는 제2 부분을 갖는 융합 단백질일 수 있다. 일 실시형태에서, 임의의 CE-7 과가수분해효소(CE-7 시그니처 모티프의 존재로 정의)는 효소를 체표면에 표적화시킬 수 있는 임의의 펩티드 성분/결합 요소에 융합될 수 있다. 일 태양에서, 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, 항체 단편(F_ab)뿐 아니라 단쇄 가변 단편(scFv; 면역글로불린의 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L)의 가변 영역의 융합), 단일 도메인 카멜리드 항체, 스캐폴드 디스플레이 단백질 및 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 친화성 펩티드를 포함할 수 있다. 항체, 항체 단편 및 다른 면역글로불린-유래의 결합 요소뿐 아니라 라지 스캐폴드 디스플레이 단백질을 포함하는 조성물은 종종 경제적으로 실행가능하지 않다. 이와 같이, 그리고 바람직한 태양에서, 펩티드 성분/결합 요소는 면역글로불린 폴드 및/또는 면역글로불린 도메인이 결여된 단쇄 친화성 펩티드이다. 짧은 단쇄 체표면-결합 펩티드는 실험에 의해 생성하거나(예를 들어, 음으로 하전된 표면에 표적화된 양으로 하전된 폴리펩티드) 또는 표적 체표면에 대한 바이오패닝을 사용하여 생성할 수 있다. 많은 디스플레이 기술(예를 들어, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이)을 사용하여 친화성 펩티드를 동정/수득하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 개별 모발-결합 펩티드는 임의의 스페이서/링커를 통해 함께 결합되어 더 큰 결합 "도메인"(본 명세서에서 결합 "손(hand)"으로도 지칭)을 형성하여, 과가수분해 효소의 모발으로의 부착/국소화를 증진시킬 수 있다.

또한, 융합 단백질은 CE-7 과가수분해효소 및 모발 결합 도메인 및/또는 상이한 모발-결합 펩티드(예를 들어, 복수의 모발 결합 펩티드가 함께 결합되어 더 큰 표적 모발 결합 도메인을 형성하는 경우) 사이를 분리하는 하나 이상의 펩티드 링커/스페이서를 포함할 수 있다. 예시적인 펩티드 스페이서의 비제한적인 목록은 서열 번호 290, 291, 312 및 313의 아미노산 서열에 의해 제공된다.

모발에 대하여 친화성을 갖는 적절한 펩티드가 본 명세서에서 상기에 기재되어 있다. 상기 "디스플레이" 기술 중 임의의 것을 사용하는 추가의 모발-결합 펩티드의 동정 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이를 사용하여 추가의 모발-결합 펩티드를 동정할 수 있다.

적절한 카르복실산 에스테르 기질은 하기의 화학식을 갖는 에스테르를 포함할 수 있다:

(a) 구조

[X]_mR₅

(여기서,

X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며;

R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;

m은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 하나 이상의 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ; 또는

(b) 구조

(c) 화학식

(e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 말한다.

또한, 적절한 기질은 아실화 단당류, 이당류 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아실화 당류를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 아실화 당류는 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란의 단편; 아세틸화 자일로스(예컨대, 자일로스 테트라아세테이트); 아세틸화 글루코스(예컨대, α-D-글루코스 펜타아세테이트; β-D-글루코스 펜타아세테이트; 1-티오-β-D-글루코스-2,3,4,6-테트라아세테이트); β-D-갈락토스 펜타아세테이트;소르비톨 헥사아세테이트; 수크로스 옥타아세테이트; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; β-D-리보푸라노스-1,2,3,4-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; β-D-자일로푸라노스 테트라아세테이트, α-D-글루코피라노스 펜타아세테이트; β-D-글루코피라노스-1,2,3,4-테트라아세테이트; β-D-글루코피라노스-2,3,4, 6-테트라아세테이트; 2-아세트아미도-2-데옥시-1,3,4,6-테트라아세틸-β-D-글루코피라노스; 2-아세트아미도-2-데옥시-3,4,6-트라이아세틸-1-클로라이드-α-D-글루코피라노스; α-D-만노피라노스 펜타아세테이트 및 아세틸화 셀룰로스로 이루어진 군으부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 아세틸화 당류는 β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; 수크로스 옥타아세테이트; 및 아세틸화 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시형태에서, 추가의 적절한 기질은 또한 5-아세톡시메틸-2-푸르알데히드; 3,4-다이아세톡시-1-부텐; 4-아세톡시벤조산; 바닐린 아세테이트; 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트; 메틸 락테이트; 에틸 락테이트; 메틸 글리콜레이트; 에틸 글리콜레이트; 메틸 메톡시아세테이트; 에틸 메톡시아세테이트; 메틸 3-하이드록시부티레이트; 에틸 3-하이드록시부티레이트; 및 트라이에틸 2-아세틸 시트레이트를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 적절한 기질은 모노아세틴; 다이아세틴; 트라이아세틴; 모노프로피오닌; 다이프로피오닌; 트라이프로피오닌; 모노부티린; 다이부티린; 트라이부티린; 글루코스 펜타아세테이트; 자일로스 테트라아세테이트; 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란 단편; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; 1,2-에탄다이올; 1,2-프로판다이올; 1,3-프로판다이올; 1,2-부탄다이올; 1,3-부탄다이올; 2,3-부탄다이올; 1,4-부탄다이올; 1,2-펜탄다이올; 2,5-펜탄다이올; 1,5-펜탄다이올; 1,6-펜탄다이올; 1,2-헥산다이올; 2,5-헥산다이올; 1,6-헥산다이올의 모노에스테르 또는 다이에스테르; 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 기질은 하나 이상의 에스테르기를 포함하는 C1 내지 C6 폴리올이다. 바람직한 실시형태에서, C1 내지 C6 폴리올 상의 하나 이상의 하이드록실기는 하나 이상의 아세톡시기(예를 들어, 1,3-프로판다이올 다이아세테이트; 1,2-프로판다이올 다이아세테이트; 1,4-부탄다이올 다이아세테이트; 1,5-펜탄다이올 다이아세테이트 등)로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 기질은 프로필렌 글리콜 다이아세테이트(PGDA), 에틸렌 글리콜 다이아세테이트(EGDA) 또는 그들의 혼합물이다.

추가의 실시형태에서, 적절한 기질은 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴, 모노프로피오닌, 다이프로피오닌, 트라이프로피오닌, 모노부티린, 다이부티린 및 트라이부티린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 기질은 다이아세틴 및 트라이아세틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 적절한 기질은 트라이아세틴을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 카르복실산 에스테르는 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴 및 그들의 조합(즉, 혼합물)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 액체 기질이다. 카르복실산 에스테르는 효소-촉매작용되는 과가수분해시에 원하는 농도의 퍼옥시카르복실산을 생성하기에 충분한 농도로 반응 제형에 존재한다. 카르복실산 에스테르는 반응 제형 중에서 완전히 용해성일 필요는 없으나, 과가수분해효소 촉매에 의한 에스테르의 상응하는 퍼옥시카르복실산으로의 전환을 가능하게 하기에 충분한 용해성을 갖는다. 카르복실산 에스테르는 반응 제형의 0.05 wt% 내지 40 wt%의 농도, 바람직하게는 반응 제형의 0.1 wt% 내지 20 wt%의 농도, 더욱 바람직하게는 반응 제형의 0.5 wt% 내지 10 wt%의 농도로 반응 제형 중에 존재한다.

과산소원은 과산화수소, 과산화수소 부가물(예를 들어, 우레아-과산화수소 부가물(카르바미드 과산화물)), 과붕산염 및 과탄산염을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 반응 제형 중의 과산소 화합물의 농도는 0.0033 wt% 내지 약 50 wt%, 바람직하게는 0.033 wt% 내지 약 40 wt%, 더욱 바람직하게는 0.1 wt% 내지 약 30 wt%의 범위일 수 있다.

또한, 과산소원(즉, 과산화수소)은 유효량의 과산화수소를 생성할 수 있는 효소를 사용하여 효소에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 글루코스 산화효소, 락토스 산화효소, 탄수화물 산화효소, 알코올 산화효소, 에틸렌 글리콜 산화효소, 글리세롤 산화효소 및 아미노산 산화효소를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 산화효소가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되어, 유효량의 과산화수소를 생성할 수 있다.

많은 과가수분해효소 촉매(전체 세포, 투과화된 전체 세포 및 부분 정제된 전체 세포 추출물)는 카탈라아제 활성(EC 1.11.1.6)을 갖는 것으로 보고되었다. 카탈라아제는 과산화수소의 산소 및 물로의 전환을 촉매작용시킨다. 일 태양에서, 과가수분해 촉매에는 카탈라아제 활성이 결여되어 있다. 다른 태양에서, 카탈라아제 억제제는 반응 제형에 첨가될 수 있다. 당업자는 필요에 따라 카탈라아제 억제제의 농도를 조절할 수 있다. 카탈라아제 억제제의 농도는 통상 0.1 mM 내지 약 1 M; 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 50 mM; 더욱 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 20 mM의 범위이다.

다른 실시형태에서, 효소 촉매에는 상당한 카탈라아제 활성이 결여되거나, 카탈라아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 엔지니어링될 수 있다. 숙주 세포 내의 카탈라아제 활성은 트랜스포손(transposon) 돌연변이유발, RNA 안티센스 발현, 표적화된 돌연변이유발 및 무작위 돌연변이유발을 포함하나 이에 한정되지 않는 널리 공지되어 있는 기술을 사용하여 카탈라아제 활성을 담당하는 유전자(들)의 발현을 파괴시킴으로써 하향 조절되거나 제거될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 내인성 카탈라아제 활성을 암호화하는 유전자(들)는 하향 조절되거나 파괴된다(즉, 낙-아웃). 본 명세서에 사용되는 "파괴된" 유전자는 변형된 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성 및/또는 기능이 더 이상 존재하지 않는 것이다. 유전자를 파괴시키는 수단은 해당 분야에 널리 공지되어 있으며, 해당하는 단백질의 활성 및/또는 기능이 더 이상 존재하지 않는 한, 유전자에 대한 삽입, 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 생성 숙주는 katG 및 katE로 이루어진 군으로부터 선택되는 파괴된 카탈라아제 유전자를 포함하는 이. 콜라이(E. coli) 생성 숙주이다(미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호 참조). 다른 실시형태에서, 생성 숙주는 katG 및 katE 카탈라아제 유전자 둘 모두에서의 하향 조절 및/또는 파괴를 포함하는 에스케리키아 콜라이 균주이다.

수성 반응 제형 중의 촉매의 농도는 촉매의 특정 촉매 활성에 좌우되며, 원하는 반응 속도를 수득하도록 선택된다. 과가수분해 반응물 중의 촉매의 중량은 전형적으로 총 반응 부피 ㎖당 0.0001 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 ㎖당 0.001 mg 내지 2.0 mg 범위이다. 또한, 촉매는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 용해성 또는 불용성 지지체 상에 고정화될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997]을 참조한다. 고정화된 촉매의 사용에 의해, 이후의 반응에서 촉매의 회수 및 재사용이 가능하게 된다. 효소 촉매는 전체 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포, 미생물 세포 추출물, 부분 정제되거나 정제된 효소 및 그들의 혼합물의 형태일 수 있다.

일 태양에서, 카르복실산 에스테르의 화학적 과가수분해 및 효소에 의한 과가수분해의 조합에 의해 생성되는 퍼옥시카르복실산의 농도는 선택된 개인 관리 응용을 위해 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공하기에 충분하다. 다른 태양에서, 본 발명은 효소 및 효소 기질의 조합을 제공하여, 원하는 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 생성하며, 여기서, 첨가되는 효소의 부재 하에서, 유의미하게 더 낮은 농도의 퍼옥시카르복실산의 생성이 존재한다. 일부 경우에, 무기 과산화물과 효소 기질의 직접적인 화학적 반응에 의한 효소 기질의 상당한 화학적 과가수분해가 존재할 수 있지만, 원하는 응용에서 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공하기 위해 생성되는 충분한 농도의 퍼옥시카르복실산이 존재하지 않을 수 있으며, 총 퍼옥시카르복실산 농도의 유의미한 증가는 적절한 과가수분해효소 촉매를 반응 제형에 첨가함으로써 달성된다.

적어도 하나의 카르복실산 에스테르의 과가수분해에 의해 생성되는 퍼옥시카르복실산(예를 들어, 퍼아세트산)의 농도는 과가수분해 반응의 개시 60분 내, 바람직하게는 30분 내에 적어도 약 0.1 ppm, 바람직하게는 적어도 0.5 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 500 ppm, 700 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 5000 ppm 또는 10,000 ppm의 과산이다. 퍼옥시카르복실산을 포함하는 제품 제형은 임의로, 표적 적용에 대해 원하는 더 낮은 농도의 퍼옥시카르복실산 베이스를 갖는 제형을 생성하도록 물 또는 주로 물로 이루어진 용액으로 희석될 수 있다. 당업자가 반응 성분 및/또는 희석량을 조절하여, 선택된 개인 관리 제품을 위한 원하는 과산 농도를 달성할 수 있는 것이 명백하다.

본 명세서에 기재된 방법에 따라 형성되는 과산은 개인 관리 제품/응용에서 사용되며, 여기서, 과산은 표적 체표면과 접촉시켜, 과산 기반의 이익, 예를 들어, 제모(과산 제모제), 모발 인장 강도의 감소, 다른 제모 제품(예컨대, 티오글리콜산염계 제모 제품)을 증진시키기 위해 사용되는 모발 사전처리, 모발 탈색, 모발 염료 사전처리(산화성 모발 염료), 모발 컬링 및 모발 컨디셔닝, 피부 미백, 피부 탈색, 피부 컨디셔닝, 피부 주름 외양 감소, 피부 원기회복, 피부 유착 감소, 체취 감소 또는 제거, 네일 표백 또는 네일 소독을 제공한다. 일 실시형태에서, 표적 체표면을 위한 과산의 생성 방법은 동소에서 행해진다.

반응의 온도를 선택하여, 반응 속도와 효소 촉매 활성의 안정성을 조절할 수 있다. 명백하게, 특정 개인 관리 응용을 위하여, 표적 체표면의 온도가 반응 온도일 수 있다. 반응 온도는 반응 제형의 동결점 바로 위의 온도(대략 0℃) 내지 약 95℃ 범위일 수 있으며, 바람직한 범위는 5℃ 내지 약 75℃이고, 더욱 바람직한 범위는 약 5℃ 내지 약 55℃의 반응 온도이다.

퍼옥시카르복실산을 함유하는 최종 반응 제형의 pH는 약 2 내지 약 9, 바람직하게는 약 3 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.5이다. 반응물 및 최종 반응 제형의 pH는 임의로 포스페이트, 피로포스페이트, 바이카르보네이트, 아세테이트 또는 시트레이트를 포함하나 이들에 한정되지 않는 적절한 완충제의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 완충제가 사용되는 경우, 완충제의 농도는 전형적으로 0.1 mM 내지 1.0 M, 바람직하게는 1 mM 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM이다.

다른 태양에서, 효소에 의한 과가수분해 반응 제형은 분산제로 작용하는 유기 용매를 함유하여, 반응 제형 중의 카르복실산 에스테르의 용해 속도를 증진시킬 수 있다. 이러한 용매는 프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 아세톤, 사이클로헥산온, 다이에틸렌 글리콜 부틸 에테르, 트라이프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 다이에틸렌 글리콜 메틸 에테르, 프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 다이프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 사이클로헥산올, 벤질 알코올, 아이소프로판올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 그들의 혼합물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

단일 단계 대 다단계 적용 방법

전형적으로, 과산 유익제를 효소에 의해 생성하기 위한 최소 반응 성분 세트는 (1) 본 명세서에 기재된 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 효소, 예를 들어, CE-7 과가수분해효소(임의로, 표적화된 융합 단백질 형태), (2) 적어도 하나의 적절한 카르복실산 에스테르 기질 및 (3) 과산소원을 포함할 것이다.

개인 관리 조성물의 과산 생성 반응 성분은 사용할 때까지 계속 분리될 수 있다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분을 배합한 다음, 표적 체표면과 접촉시켜, 이에 의해, 생성되는 과산계 유익제가 체표면에 대한 이익을 제공하게 한다. 성분을 배합한 다음 표적 체표면과 접촉시키거나, 또는 표적 체표면 상에서 배합할 수 있다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분은 과산이 동소에서 생성되도록 배합한다.

또한, 다단계 적용이 사용될 수 있다. 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 적용하기 전에, 과산 생성 시스템(즉, 체표면 상에서의, 3가지 기본 반응 성분 중 적어도 하나의 순차적 적용) 조성물의 1가지 또는 2가지의 개별 성분을 모발과 접촉시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 모발을 카르복실산 에스테르 기질 및/또는 과산소원과 접촉시키기 전에 모발과 접촉시킨다(즉, "2-단계 적용"). 일 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 배합하기 전에 모발에 적용되는 표적화된 과가수분해효소이다.

바람직한 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 배합하기 전에 모발에 적용되는(즉, 2-단계 적용 방법) "표적화된 CE-7 과가수분해효소"(즉, CE-7 융합 단백질)이다. 표적화된 과가수분해효소는 모발 표면에 대한 융합 단백질의 비공유 결합을 촉진시키는 적절한 조건 하에서 모발과 접촉한다. 나머지 반응 성분을 배합하기 전에, 임의의 헹굼 단계를 사용하여 과잉의 및/또는 미결합 융합 단백질을 제거할 수 있다.

다른 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질 및 과산소원(예를 들어, 카르복실산 에스테르 및 하나 이상의 임의의 공용매 중의 고체 과산소원의 비-수성 현탁액을)을 과가수분해 효소(임의로 모발에 표적화된 융합 단백질 형태)의 첨가 전에 모발에 적용한다.

또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 방법 중 임의의 것이 본 발명을 실시하기 위한 키트에 통합될 수 있다. 키트는 효소에 의한 과산의 생성을 용이하게 하는 재료 및 시약을 포함할 수 있다. 예시적인 키트는 (1) 고체 과산소원, 카르복실산 에스테르 기질 및 임의로 하나 이상의 유기 공용매를 갖는 비-수성 조성물을 포함하는 제1 용기 또는 구획, 및 (2) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 및 적어도 하나의 완충제를 포함하는 수성 조성물을 갖는 제2 용기 또는 구획을 포함하며, 여기서, 효소 촉매는 임의로, 모발 또는 모발을 포함하는 체표면에 표적화될 수 있다. 기타 키트 성분은 제한 없이, 다음의 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 시료 튜브, 고체 지지체, 지시 자료 및 과산을 효소에 의해 생성하는데 유용한 기타 용액 또는 기타 화학 시약, 예를 들어, 허용되는 성분 또는 담체.

피부에 허용가능한 성분/ 담체 /매질

본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 모발 관리, 또는 다른 개인 관리 제품에 사용하는 것으로 공지되어 있거나 다르게는 이에 사용하기에 효과적인 하나 이상의 피부에 또는 미용상 허용가능한 성분을 추가로 포함할 수 있되, 단, 임의의 성분은 본 명세서에 기재된 필수 성분과 물리적으로 그리고 화학적으로 상용성이거나 다르게는 제품 안정성 미감(aesthetics) 또는 성능을 과도하게 손상시키지 않는다. 이러한 임의의 성분의 비제한적인 예는 문헌[International Cosmetic Ingredient Dictionary, Ninth Edition, 2002] 및 문헌[CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Tenth Edition, 2004]에 개시되어 있다.

일 실시형태에서, 피부에 허용가능한 담체는 약 10 wt% 내지 약 99.9 wt%, 대안적으로 약 50 wt% 내지 약 95 wt%, 대안적으로 약 75 wt% 내지 약 95 wt%의 피부에 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 조성물(들)에 사용하기에 적절한 담체는 예를 들어, 헤어 스프레이, 무스, 토닉, 겔, 피부 모이스처라이저, 로션 및 잔류성 컨디셔너(leave-on conditioner)의 제형에 사용되는 것이 포함될 수 있다. 담체는 물; 유기 오일; 실리콘, 예를 들어, 휘발성 실리콘, 아미노 또는 비-아미노 실리콘 고무 또는 오일 및 그들의 혼합물; 광유; 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 피마자유, 평지씨유, 코코넛유, 밀 배아유, 스위트 아몬드 오일, 아보카도 오일, 마카다미아 오일, 살구씨 오일, 홍화유, 캔들넛 오일(candlenut oil), 폴스 플랙스(false flax) 오일, 타마누 오일(tamanu oil), 레몬 오일(lemon oil) 및 그들의 혼합물; 왁스; 및 유기 화합물, 예를 들어, C₂-C₁₀ 알칸, 아세톤, 메틸 에틸케톤, 휘발성 유기 C₁-C₁₂ 알코올, C₁-C₂₀ 산 및 C₁-C₈ 알코올의 에스테르(에스테르가 과가수분해효소에 대한 카르복실산 에스테르 기질로 작용할 수 있는지 여부에 에스테르(들)의 선택이 좌우될 수 있다는 점을 포함하여), 예를 들어, 메틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 및 아이소프로필 미리스테이트, 다이메톡시에탄, 다이에톡시에탄, C₁₀ 내지 C₃₀ 지방 알코올, 예를 들어, 라우릴 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 및 베헤닐 알코올; C₁₀ 내지 C₃₀ 지방산, 예를 들어, 라우르산 및 스테아르산; C₁₀ 내지 C₃₀ 지방 아미드, 예를 들어, 라우릭 다이에탄올아미드; C₁₀ 내지 C₃₀ 지방 알킬 에스테르, 예를 들어, C₁₀ 내지 C₃₀ 지방 알킬 벤조에이트; 하이드록시프로필셀룰로스 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 담체는 물, 지방 알코올, 휘발성 유기 알코올 및 그들의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 조성물(들)은 추가로 약 0.1% 내지 약 10%, 대안적으로 약 0.2% 내지 약 5.0%의 겔화제를 포함하여, 조성물(들)에 원하는 점도를 제공하는 것에 도움이 될 수 있다. 적절한 임의의 겔화제의 비제한적인 예에는 가교결합된 카르복실산 폴리머; 중화되지 않은 가교결합된 카르복실산 폴리머; 중화되지 않은 변형되고 가교결합된 카르복실산 폴리머; 가교결합된 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머; 중화되지 않은 가교결합된 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머(예를 들어, 몬산토(Monsanto)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 EMA 81); 중화되지 않은 가교결합된 알킬 에테르/아크릴레이트 코폴리머(예를 들어, 알리이드 콜로이즈(Allied Colloids)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 살케어(Salcare)(상표명) SC90); 중화되지 않은 가교결합된 소듐 폴리아크릴레이트, 광유 및 PEG-1 트라이데세트(trideceth)-6의 코폴리머(예를 들어, 알리이드 콜로이즈로부터 상업적으로 입수할 수 있는 살케어(상표명) SC91); 중화되지 않은 가교결합된 메틸 비닐 에테르 및 말레산 무수물의 코폴리머(예를 들어, 인터네이셔널 스페셜티 프로덕츠(International Specialty Products)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 스타빌레즈(Stabileze)(상표명) QM-PVM/MA 코폴리머); 소수성으로 변형된 비이온성 셀룰로스 폴리머; 소수성으로 변형된 에톡실레이트 우레탄 폴리머(예를 들어, 유니온 카바이드(Union Carbide)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 알칼리 팽윤성 폴리머의 유케어(Ucare)(상표명) 폴리포베(Polyphobe) 시리즈; 및 그들의 조합이 포함된다. 이러한 문맥에서, 용어 "중화되지 않은"은 임의의 폴리머 및 코폴리머 겔화제 물질이 중화되지 않은 산 모노머를 함유함을 의미한다. 바람직한 겔화제는 중화되지 않은 가교결합된 수용성 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머, 중화되지 않은 가교결합된 수용성 카르복실산 폴리머, 소수성으로 변형된 수용성 비이온성 셀룰로스 폴리머 및 계면활성제/지방 알코올 겔 네트워크, 예를 들어, 모발 컨디셔닝 제품에 사용하기에 적절한 것들을 포함한다.

모발 관리 조성물

과산 생성 성분을 모발 관리 조성물 및 제품에 혼입시켜, 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 생성할 수 있다. 원하는 양의 과산을 생성하는데 사용되는 과가수분해효소는 융합 단백질의 형태로 사용될 수 있으며, 여기서, 융합 단백질의 제1 부분은 과가수분해효소를 포함하고, 제2 부분은 모발에 대하여 친화성을 갖는다.

생성되는 과산은 모발에 이익을 제공한다(다시 말하면, "과산계 유익제"). 과산은 제모제, 모발의 인장 강도를 감소시키기 위한 모발 처리제, 기타 제모 제품(예를 들어, 티오글리콜산염계 제모 제품)의 성능을 증진시키는데 사용되는 모발 사전처리제, 모발 탈색제, 모발 염모제 사전처리제, 모발 컬링/스타일링제 및 모발 컨디셔닝 제품 내의 한 성분으로 사용될 수 있다.

모발 관리 제품 및 제형은 또한 과산계 유익제에 더하여, 모발 관리 제품에서 통상적으로 관찰되는 많은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 추가의 성분은 모발의 외양, 감촉, 색상 및 윤기의 개선뿐 아니라 모발 풍성함 또는 유연함을 증가시키는 것에 도움이 될 수 있다.

모발 컨디셔닝제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 그린(Green) 등의 WO 0107009호를 참조하며, 다양한 공급처로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 모발 컨디셔닝제의 적절한 예에는 양이온성 폴리머, 예를 들어, 양이온화 구아 고무(guar gum), 다이알릴 4차 암모늄 염/아크릴아미드 코폴리머, 4차화 폴리비닐피롤리돈 및 그들의 유도체 및 다양한 폴리쿼터늄(polyquaternium)-화합물; 양이온성 계면활성제, 예를 들어, 스테아르알코늄 클로라이드, 센트리모늄 클로라이드 및 사파민 하이드로클로라이드; 지방 알코올, 예를 들어, 베헤닐 알코올; 지방 아민, 예를 들어, 스테아릴 아민; 왁스; 에스테르; 비이온성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 실록산, 예를 들어, 데카메틸사이클로펜타실록산; 폴리머 에멀젼, 예를 들어, 아모다이메티콘; 및 나노입자, 예를 들어, 실리카 나노입자 및 폴리머 나노입자가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

또한, 모발 관리 제품은 미용상 허용가능한 매질에서 통상적으로 관찰되는 추가의 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분의 비제한적인 예는 문헌[International Cosmetic Ingredient Dictionary, Ninth Edition, 2002] 및 문헌[CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Tenth Edition, 2004]에 개시되어 있다. 모발 관리를 위한 미용상 허용가능한 매질에 종종 포함되는 성분의 비제한적인 목록은 또한 필립(philippe) 등의 미국 특허 제6,280,747호 및 오무라(Omura) 등의 미국 특허 제6,139,851호 및 카넬(Cannell) 등의 미국 특허 제6,013,250호(이들 모두는 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 예를 들어, 모발 관리 조성물은 수성, 알코올성 또는 수성-알코올성 용액일 수 있으며, 알코올은 바람직하게는 수성-알코올성 용액에 대하여, 총 중량에 비해 약 1 내지 약 75 중량%의 비의 에탄올 또는 아이소프로판올이다. 추가로, 모발 관리 조성물은 항산화제, 보존제, 충전제, 계면활성제, UVA 및/또는 UVB 선스크린, 향료, 증점제, 겔화제, 습윤제 및 음이온성, 비이온성 또는 양쪽성 폴리머 및 염료 또는 안료를 포함하나 이들에 제한되지 않는 하나 이상의 통상적인 미용상의 또는 피부과 첨가제 또는 보조제를 함유할 수 있다.

또한, 모발 관리 조성물 및 방법은 모발, 피부 또는 네일의 색을 바꾸기 위해 사용될 수 있는 적어도 하나의 착색제, 예를 들어, 임의의 염료, 레이크(lake), 안료 등을 포함할 수 있다. 모발 착색제는 당업계에 널리 알려져 있으며(예를 들어, 상기 그린 등의 문헌[CFTA International Color Handbook, 2^nd ed., Micelle Press, England (1992)] 및 문헌[Cosmetic Handbook, US Food and Drug Administration, FDA/IAS Booklet (1992)]), 다양한 공급처로부터 상업적으로 입수할 수 있다(예를 들어, 미국 펜실베니아주 피츠버그 소재의 바이엘(Bayer); 미국 뉴욕주 태리타운 소재의 시바-가이기(Ciba-Geigy); 미국 뉴저지주 브리지워터 소재의 아이씨아이(ICI); 오스트리아 비엔나 소재의 산도즈(Sandoz); 미국 뉴저지주 마운트 올리브 소재의 바스프(BASF); 및 독일 프랑크푸르트 소재의 훼히스트(Hoechst)). 적절한 모발 착색제에는 염료, 예를 들어, 4-하이드록시프로필아미노-3-니트로페놀, 4-아미노-3-니트로페놀, 2-아미노-6-클로로-4-니트로페놀, 2-니트로-파라페닐렌다이아민, N,N-하이드록시에틸-2-니트로-페닐렌다이아민, 4-니트로-인돌, 헤나(Henna), HC 블루(Blue) 1, HC 블루 2, HC 옐로우(Yellow) 4, HC 레드(Red) 3, HC 레드 5, 디스퍼스 바이올렛(Disperse Violet) 4, 디스퍼스 블랙(Disperse Black) 9, HC 블루 7, HC 블루 12, HC 옐로우 2, HC 옐로우 6, HC 옐로우 8, HC 옐로우 12, HC 브라운(Brown) 2, D&C 옐로우 1, D&C 옐로우 3, D&C 블루 1, 디스퍼스 블루(Disperse Blue) 3, 디스퍼스 바이올렛 1, 에오신 유도체, 예를 들어, D&C 레드 21호 및 할로겐화 플루오레세인 유도체, 예를 들어, D&C 레드 27호, D&C 레드 21호 및 D&C 오렌지 10호와 조합된 D&C 레드 오렌지 5호; 및 안료, 예를 들어, D&C 레드 36호 및 D&C 오렌지 17호, D&C 레드 7, 11, 31 및 34호의 칼슘 레이크, D&C 레드 12호의 바륨 레이크, D&C 레드 13호의 스트론튬 레이크, FD&C 옐로우 5호의, FD&C 옐로우 6호의, D&C 레드 27호의, D&C 레드 21호의 및 FD&C 블루 1호의 알루미늄 레이크, 산화철, 망가네즈 바이올렛(manganese violet), 산화크롬, 이산화티탄, 이산화티탄 나노입자, 산화아연, 산화바륨, 울트라마린 블루(ultramarine blue), 비스무스 시트레이트 및 카본 블랙 입자가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 모발 착색제는 D&C 옐로우 1 및 3, HC 옐로우 6 및 8, D&C 블루 1, HC 블루 1, HC 브라운 2, HC 레드 5, 2-니트로-파라페닐렌다이아민, N,N-하이드록시에틸-2-니트로-페닐렌다이아민, 4-니트로-인돌 및 카본 블랙이다. 또한, 금속 및 반도체 나노입자는 그들의 강력한 발광 때문에 모발 착색제로 사용될 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2004-0010864호(빅(Vic) 등).

모발 관리 조성물은 샴푸, 컨디셔너, 로션, 에어로졸, 겔, 무스 및 모발 염료를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 실시형태에서,

a) 1) i) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

ii) 구조

iii) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및

iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;

2) 과붕산염, 과탄산염 또는 그들의 조합을 포함하는 고체 과산소원; 및

3) 임의의 유기 공용매의 혼합물을 포함하는 비-수성 조성물; 및

b) 1) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매; 및

2) 적어도 하나의 완충제를 포함하는 수성 조성물 - 여기서, 수성 조성물은 적어도 4의 pH로 이루어진다 - 을 포함하는 모발 관리 제품으로서,

비-수성 조성물 및 수성 조성물이 사용 전에 분리되어 유지되고, 효소에 의해 생성되는 과산이 비-수성 및 수성 조성물의 배합 시에 생성되는 모발 관리 제품이 제공된다.

수성 조성물 중의 완충제(들)는 저장 동안 수용액을 적어도 4의 pH로 유지시킬 수 있어야 한다. 바람직한 태양에서, 수성 조성물 성분은 적어도 약 4 내지 약 9의 pH를 유지하도록 선택된다. 반응 성분의 배합 시에 수득되는 생성되는 pH는 효소 촉매가 과가수분해 활성을 가지며, 적어도 하나의 과산의 생성을 촉매작용시킬 수 있는 범위 내에 있어야 한다.

일 실시형태에서, 임의의 유기 공용매는 프로필렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 트라이에틸렌 글리콜, 1,3-프로판다이올, 1,3-부탄다이올, 헥실렌 글리콜 또는 그들의 임의의 조합이다.

일 실시형태에서, 완충제는 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 글리신, 바이카르보네이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 말레에이트 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매는

a) 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 제1 부분; 및

b) 인간 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 갖는 제2 부분을 포함하는 융합 단백질의 형태이다.

추가의 태양에서, 융합 단백질은 하기의 일반 구조를 갖는다:

PAH-[L]_y-HSBD

또는

HSBD-[L]_y-PAH

상기 식에서,

PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;

HSBD는 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고;

L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 링커이며;

y는 0 또는 1이다.

상기 모발 관리 제품의 비-수성 조성물 및 수성 조성물은 사용될 때까지 분리되어 유지된다. 이와 같이, 모발 관리 제품은 다중-구획 패킷(multi-compartment packet), 다중-구획 병(bottle), 적어도 2개의 개별 용기 및 그들의 조합의 형태이다.

비-수성 성분에는 사용될 때까지(다시 말하면, 반응 성분을 배합하여 효소에 의한 과가수분해를 개시할 때까지) 실질적으로 물이 없다. 일 실시형태에서, 비-수성 성분은 적어도 하나의 건조제(desiccant)를 추가로 포함할 수 있다.

일 실시형태에서,

a) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는

i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;

ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및

iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - ;

b) i) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티(moiety)이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;

ii) 구조

iii) 화학식

c) 과산소원; 및

d) 피부에 허용가능한 담체 매질을 포함하는 모발 관리 조성물이 제공되며, 여기서, 조성물은 (a), (b) 및 (c)가 배합되는 경우 과산을 포함한다.

다른 실시형태에서, 모발 관리 조성물에 사용되는 과가수분해 효소는

a) 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 제1 부분, 및

b) 모발에 대하여 친화성을 갖는 제2 부분을 포함하는 융합 단백질이다.

일 실시형태에서, 모발 관리 조성물에 형성되는 과산은 과아세트산이다.

모발 관리 조성물의 성분은 사용될 때까지 계속 분리될 수 있다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분을 배합한 다음, 모발 표면과 접촉시켜, 이에 의해, 생성되는 과산계 유익제가 제모, 모발 약화(모발의 인장 강도의 감소로 측정시), 모발 탈색, 모발 염모제(산화적 모발 염모제) 사전처리, 모발 컬링 및 모발 컨디셔닝으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이익을 제공한다(다시 말하면 1단계 적용 방법). 다른 실시형태에서, 과산-생성 성분은 과산이 동소에서 생성되도록 배합된다. 모발 관리 조성물 중의 성분의 상대적 양은 원하는 효과에 따라 달라질 수 있다.

일 실시형태에서,

1) a) i) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

ii) 구조

iii) 화학식

iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류;

b) 과산소원; 및

c) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 클러스털더블유(CLUSTALW)를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는

iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - 를 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계;

2) (1)의 반응 성분을 배합하는 단계 - 이에 의해 적어도 하나의 과산이 생성된다 - ; 및

3) 모발을 상기 과산과 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 생성돤 과산계 유익제가 제모, 모발 약화, 모발 탈색, 모발 염료 사전처리, 모발 컬링 및 모발 컨디셔닝으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이익을 제공하며; 미용상 허용가능한 매질의 하나 이상의 성분이 존재할 수 있다 - 를 포함하는 단일 단계 모발 처리 방법이 제공된다.

효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 적용하기 전에, 과산 생성 시스템(즉, 체표면 상에서의 순차적 적용) 조성물의 1가지 또는 2가지의 개별 성분을 모발 표면과 접촉시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 기질 및 과산소원과 접촉시키기 전에 모발과 접촉시킨다(즉, "2-단계 적용"). 바람직한 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분 전에 모발에 적용하는 표적화된 과가수분해효소(즉, 융합 단백질)이다(즉, 2-단계 적용 방법).

다른 실시형태에서,

1) a) 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 제1 부분 - 상기 효소는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 가지며, 상기 시그니처 모티프는

모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 포함하는 제2 부분 - 이에 의해, 융합 펩티드가 모발에 결합된다 - 을 포함하는 융합 단백질과 모발을 접촉시키는 단계;

2) 임의로, 모발을 수용액으로 헹구어, 미결합 융합 펩티드를 제거하는 단계; 및

3) 결합된 융합 펩티드를 포함하는 모발을

a) i) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

ii) 구조

iii) 화학식

iii) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질; 및

b) 과산소원과 접촉시키는 단계; 이에 의해, 융합 펩티드와 기질 및 과산소원의 배합시에, 과산이 생성되며; 생성된 과산은 제모, 모발 약화, 모발 탈색, 모발 염료 사전처리, 모발 컬링 및 모발 컨디셔닝으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이익을 제공한다 - 를 포함하는 방법이 제공된다.

바람직한 실시형태에서, 상기 과산계 모발 관리 방법을 사용하여 모발을 제거하고/거나 모발의 인장 강도를 약화시킨다. 제모 또는 인장 강도 감소에 대한 모발 관리 방법은 임의로 환원제, 예를 들어, 티오글리콜산염을 포함하여, 제거에 대해 표적화된 모발을 포함하는 표면으로부터 모발의 약화 및/또는 제거를 증진시킬 수 있다.

추가의 실시형태에서, 상기 제모 방법은 티오글리콜산염계 제모 제품과 같은 적어도 하나의 환원제를 포함하는 시판용 제모 제품의 이후의 적용을 위한 사전-처리로 사용될 수 있다. 이와 같이, 상기 방법은 과산 처리된 모발을 환원제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 환원제는 티오글리콜산염, 예를 들어, 티오글리콜산나트륨 또는 티오글리콜산칼륨(예를 들어, 제모 제품, 예를 들어, 나이르(NAIR)(등록 상표)에 종종 사용되는 활성 성분)이다.

재배합 미생물 발현

본 발명의 서열의 유전자 및 유전자 산물은 이종 숙주 세포, 특히 미생물 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 본 발명의 유전자 및 핵산 분자의 발현에 바람직한 이종 숙주 세포는 진균 또는 박테리아 패밀리에서 관찰될 수 있고, 넓은 범위의 온도, pH 값 및 용매 용인성에 걸쳐 성장하는 미생물 숙주이다. 예를 들어, 박테리아, 효모 및 사상 진균 중 임의의 것이 본 발명의 핵산 분자의 발현에 적절한 숙주일 수 있는 것으로 고려된다. 과가수분해효소는 세포내, 세포외 또는 세포내와 세포외 둘 모두의 조합에서 발현될 수 있으며, 여기서, 세포외 발현은 발효 생성물로부터의 원하는 단백질의 회수가, 세포내 발현에 의해 생성되는 단백질의 회수 방법보다 더 용이하게 한다. 전사, 번역 및 단백질 생합성 장치는 세포 바이오매스를 생성하는데 사용되는 세포 공급원료에 비하여 변함 없이 유지되며; 기능적 유전자는 관련 없이 발현될 것이다. 숙주 균주의 예에는 박테리아, 진균 또는 효모 종, 예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 파피아(Phaffia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 아키네토박터(Acinetobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 에리트로박터(Erythrobacter), 클로로븀(Chlorobium), 크로마튬(Chromatium), 플라보박테리움(Flavobacterium), 사이토파가(Cytophaga), 로도박터(Rhodobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리아(Corynebacteria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 데이노코커스(Deinococcus), 에스케리키아(Escherichia), 에르위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메틸로시스티스(Methylocystis), 알칼리게네스(Alcaligenes), 시네코시스티스(Synechocystis), 시네코코커스(Synechococcus), 아나바에나(Anabaena), 티오바실러스(Thiobacillus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 클레브시엘라(Klebsiella) 및 마익소코커스(Myxococcus)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 박테리아 숙주 균주에는 에스케리키아, 바실러스, 클루이베로마이세스 및 슈도모나스가 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 바실러스 서브틸리스 또는 에스케리키아 콜라이이다.대규모 미생물 성장 및 기능적 유전자 발현은 매우 다양한 단순 또는 복합 탄수화물, 유기산 및 알코올 또는 포화 탄화수소, 예를 들어, 메탄 또는 광합성 숙주 또는 화학자가영양(chemoautotrophic) 숙주의 경우에 이산화탄소, 소정의 형태 및 양의 질소, 인, 황, 산소, 탄소, 또는 작은 무기 이온을 포함하는 임의의 미량의 미량영양소를 사용할 수 있다. 성장 속도의 조절은 특정 조절 분자의 배양물로의 첨가 또는 무첨가에 의해 영향을 받을 수 있으며, 통상 영양분 또는 에너지원을 고려하지 않는다.

적절한 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트가 당업계에 널리 알려져 있다. 전형적으로, 벡터 또는 카세트는 관련 유전자의 전사 및 번역을 유도하는 서열, 선별가능한 마커, 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 포함한다. 적절한 벡터는 전사 개시 제어부를 품고 있는 유전자의 5'의 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3'의 영역을 포함한다. 둘 모두의 제어 영역이 형질전환된 숙주 세포에 대하여 동종의 및/또는 생성 숙주에 대해 천연의 유전자로부터 유래되는 경우가 가장 바람직하지만, 그러한 제어 영역이 그렇게 유래될 필요는 없다.

바람직한 숙주 세포에서 본 발명의 세팔로스포린 C 데아세틸라제 암호화 영역의 발현을 작동시키기에 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 사실상, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피키아에서의 발현에 유용함); 및 lac, araB, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac 및 trc (에스케리키아 콜라이에서의 발현에 유용함)뿐 아니라 amy, apr, npr 프로모터 및 바실러스에서의 발현에 유용한 다양한 파지 프로모터를 포함하나 이들에 한정되지 않는 이들 유전자를 작동시킬 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적절하다.

종결 제어 영역은 또한 바람직한 숙주 세포의 다양한 천연의 유전자로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 종결 제어 영역의 포함은 선택적이다. 다른 실시형태에서, 키메라 유전자는 바람직한 숙주 세포 유래의 종결 제어 영역을 포함한다.

산업적 생성

다양한 배양 방법을 적용하여, 과가수분해효소 촉매를 생성할 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물 숙주로부터 과발현되는 특정 유전자 산물의 대규모 생성은 배치식(batch), 유가식(fed-batch) 및 연속식(continuous) 배양 방법에 의해 생성될 수 있다. 배치식 및 유가식 배양 방법은 통상적이며, 해당 분야에 널리 알려져 있으며, 예는 문헌[Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)] 및 문헌[Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227-234 (1992)]에서 찾을 수 있다.

또한, 목적 과가수분해효소 촉매의 상업적 생성은 연속식 배양으로 달성될 수 있다. 연속식 배양은 정의된 배양 배지를 생물반응기에 연속 첨가함과 동시에, 동량의 조절된 배지를 처리를 위해 제거하는 개방형 시스템이다. 연속식 배양은 일반적으로 세포를 고정된 높은 액상 밀도로 유지시키며, 여기서, 세포는 주로 대수기 성장으로 존재한다. 대안적으로, 연속식 배양은 고정화된 세포로 실시될 수 있고, 여기서, 탄소 및 영양분을 지속적으로 공급하고, 가치있는 생성물, 부산물 또는 폐기물을 세포 매스로부터 지속적으로 제거한다. 세포 고정화는 천연 및/또는 합성 재료로 이루어진 매우 다양한 고체 지지체를 사용하여 수행할 수 있다.

배치식 발효, 유가식 발효 또는 연속식 배양으로부터의 목적 과가수분해효소 촉매의 회수는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 효소 촉매가 세포 내에서 생성되는 경우, 세포 페이스트(paste)를 원심분리 또는 막 여과에 의해 배양 배지로부터 분리하고, 임의로, 물 또는 원하는 pH의 수성 완충제로 세정한 다음, 원하는 pH에서의 수성 완충제 중의 세포 페이스트의 현탁액을 균질화시켜, 원하는 효소 촉매를 함유하는 세포 추출물을 생성한다. 효소 촉매 용액으로부터 원치않는 단백질을 침전시키기 위한 열-처리 단계 전에, 세포 추출물을 임의로, 적절한 여과 조제, 예를 들어 셀라이트 또는 실리카를 통해 여과하여, 세포 데브리스를 제거할 수 있다. 이어서, 원하는 효소 촉매를 함유하는 용액을 막 여과 또는 원심분리에 의하여 침전된 세포 데브리스 및 단백질로부터 분리할 수 있으며, 얻은 부분-정제된 효소 촉매 용액을 추가의 막 여과에 의해 농축시킨 다음, 임의로 적절한 담체(예를 들어, 말토덱스트린, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 그들의 혼합물)와 혼합하고, 분무 건조시켜, 원하는 효소 촉매를 함유하는 고체 분말을 생성할 수 있다.

양, 농도, 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위 또는 바람직한 상한값 및 바람직한 하한값의 목록으로서 주어지는 경우, 범위가 별도로 개시되는 지에 상관없이 임의의 상한 범위 또는 바람직한 값 및 임의의 하한 범위 또는 바람직한 값의 임의의 쌍으로부터 형성된 모든 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 값의 범위가 본 명세서에서 언급될 경우, 달리 기술되지 않는다면, 그 범위는 그 종점 및 그 범위 내의 모든 정수와 분수를 포함하고자 하는 것이다. 범위를 정의할 때 열거된 특정 값으로 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다.

일반 방법

본 발명의 바람직한 태양을 보여주기 위해 하기 실시예가 제공된다. 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 기술을 따르며, 이에 따라, 그의 바람직한 실시 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 본 개시내용의 견지에서, 당업자는 개시된 특정 실시형태에서 많은 변경이 이루어질 수 있으며, 여전히 본 명세서에 개시된 방법 및 실시예의 목적 및 범주로부터 벗어남 없이, 비슷하거나 유사한 결과가 수득되는 것을 인식해야 한다.

모든 시약 및 재료는 달리 특정하지 않는 한, 디프코 래보러터리즈(DIFCO Laboratories)(미국 미시간주 디트로이트 소재), GIBCO/BRL(미국 메릴랜드주 개더스버그 소재), 티씨아이 아메리카(TCI America)(미국 오리건주 포틀랜드 소재), 로슈 디아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation)(미국 인디애나주 인디애나폴리스) 또는 시그마/알드리치 케미컬 컴퍼니(Sigma/Aldrich Chemical Company)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 수득하였다.

설명에서 하기의 약어는 후술되는 바와 같은 측정 유닛, 기술, 특성 또는 화합물에 해당한다: "sec" 또는 "s"는 초를 의미하며, "min"은 분을 의미하고, "h" 또는 "hr"은 시간을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터를 의미하고, "㎖"은 밀리리터를 의미하며, "ℓ"은 리터를 의미하고, "mM"은 밀리몰을 의미하며, "M"은 몰을 의미하고, "mmol"은 밀리몰을 의미하며, "ppm"은 백만분율을 의미하고, "wt"는 중량을 의미하며, "wt%"는 중량%를 의미하고, "g"는 그램을 의미하며, "mg"은 밀리그램을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램을 의미하며, "ng"은 나노그램을 의미하고, "g"는 중력을 의미하며, "gf" 최대 그램 힘을 의미하고, "den"은 데니어를 의미하며, "N"은 뉴턴을 의미하고, "tex"는 1000 미터 길이당 그램 단위의 섬유/야드의 질량의 기본 텍스(tex) 단위를 의미하며, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하고, "dd H₂O"는 증류수 및 탈이온수를 의미하며, "dcw"는 건조 세포 중량을 의미하고, "ATCC" 또는 "ATCC(등록 상표)"는 미국 버지니아주 머내서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)을 의미하며, "U"는 과가수분해효소 활성 유닛을 의미하고, "rpm"은 분당 회전수를 의미하며, "Tg"는 유리 전이 온도를 의미하고, "Ten."은 인성을 의미하며, "TS"는 인장 강도를 의미하고, "EDTA"는 에틸렌다이아민테트라아세트산을 의미한다.

발현 벡터 pLD001

플라스미드 pLD001(서열 번호 292)은 이전에 에스케리키아 콜라이에 대한 적절한 발현 벡터로 보고된 적이 있다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010-0158823 A1호(Wang et al.) 참조).

벡터 pLD001은 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 pDEST17(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 유래의 것이었다. 이는 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 pET31b(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐(Novagen)) 유래의 서열을 포함하며, 효소 케토스테로이드 아이소머라제(KSI)의 단편을 암호화한다. KSI 단편은 에스케리키아 콜라이에서 펩티드의 불용성 봉입체로의 분배를 증진시키기 위한 융합 파트너로 포함시켰다. pET31b로부터의 KSI-암호화 서열을 표준 돌연변이유발 절차(퀵체인지(QuickChange) II, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene))를 사용하여 야생형 KSI 서열에서 관찰되는 하나의 Cys 코돈에 더하여 3개의 추가의 Cys 코돈을 포함하도록 변형시켰다. 또한, 암호화 서열 내의 모든 Asp 코돈을 Glu 코돈으로 대체하였다. 서열 번호 292로 제공되는 플라스미드 pLD001을 당업자에게 널리 공지되어 있는 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 구축하였다.

BamHI 및 AscI 부위에 의해 결합되는 암호화 서열은 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 pLD001 내의 BamHI 및 AscI 부위 사이에 라이게이션될 수 있다. 대상 펩티드를 야기하는 생성된 유전자 융합은 에스케리키아 콜라이에서 펩티드를 불용성 봉입체로 만드는데 소용되는 케토스테로이드 아이소머라제의 변형된 단편(KSI(C4)E)으로부터 다운스트림에 융합시켰다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009-0029420A1호 참조).

모발- 표적화된 과가수분해효소 융합의 구축

하기에는 모발-결합 서열을 통하여 모발에 표적화된 과가수분해효소의 생성을 위한 발현 시스템의 고안이 기재되어 있다.

과가수분해 활성을 갖는 효소("과가수분해효소")의 모발-결합 도메인(서열 번호 290 및 서열 번호 291)으로의 융합을 암호화하는 유전자(서열 번호 286 및 서열 번호 287)를 3' 말단에서 가요성 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 융합되고; 그 자체가 모발-결합 도메인 HC263 또는 HC1010(각각 서열 번호 290 및 서열 번호 291)에 추가로 융합되는 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 C277S 변이체의 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 293)을 갖도록 고안하였다. 유전자를 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시키고, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성하였다. 유전자를 발현 벡터 pLD001(서열 번호 292) 내에서 NdeI 및 AscI 제한 부위 사이에 T7 프로모터 뒤에 클로닝하여, 각각 플라스미드 pLR1021 및 pLR1022를 제공하였다. 융합 단백질을 발현하기 위하여, 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 균주 BL21AI(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)로 전달하여, 균주 LR3311(HC263으로의 가수분해효소 융합; 서열 번호 288) 및 LR3312(HC1010으로의 가수분해효소 융합; 서열 번호 289)를 생성하였다.

써모토가 마리티마 과가수분해효소의 비-표적화된 C277S 변이체를 유사하게 클로닝하였다. 써모토가 마리티마 C277S 변이체의 제작 및 재조합 발현은 이전에 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(디코시모 등)에서 기재되었다.

HPLC 카르스트( Karst ) 검정법 절차

하기의 검정법 절차를 문헌[U. Karst et al. Anal . Chem. 1997, 69(17):3623-3627]에 의해 보고된 절차로부터 채용하였다.

검정법 절차

1. 300 ㎕ dd H₂O (시료가 없는 블랭크(blank)에 대하여 400 ㎕)를 2.0-㎖ HPLC 스크류 캡 바이얼(아질런트-5182-0715)에 첨가한다. 각 시료에 대하여 하나의 바이얼을 준비한다.

2. 250-㎕ 기밀 주사기를 사용하여 100 ㎕의 20 mM MTS(메틸 p-톨릴 설피드; 알드리치 7596-25g; fw 138.23; 99% 순도)/아세토니트릴 용액을 각 바이얼에 첨가하고, 스월링시켜 혼합한다.

3. 100 ㎕의 H3PO4로 희석되고 켄칭된 시료를 각 바이얼에 첨가하고, 스월링시켜 혼합한다.

4. 바이얼을 차광 박스에 배치하고, 검정 반응이 교반 없이 암 중에 10분 동안 처리되게 한다.

5. 차광 박스로부터 바이얼을 제거하고, 400 ㎕의 아세토니트릴을 각 바이얼에 첨가하고, 스월링시켜 혼합한다.

6. 250-㎕ 기밀 주사기를 사용하여 100 ㎕의 120 mM TPP(트라이페닐 포스핀, 알드리치 T84409-25g; FW 262.29; 99% 순도)/아세토니트릴 용액을 각 바이얼에 첨가하고, 바이얼(아질런트-5182-0723)을 캡핑시킨다. 와류시켜 혼합한다.

7. 바이얼을 차광 박스에 배치하고, 검정법이 교반 없이 암 중에 30분 동안 계속되게 한다.

8. 차광 박스로부터 바이얼을 제거하고, 250-㎕ 기밀 주사기를 사용하여 100 ㎕의 2.5 mM DEET(N,N-다이에틸-m-톨루아미드, 알드리치-D100951-100g; FW-191.27; 97% 순도)/아세토니트릴 용액(HPLC 외부 표준물질로 사용)을 각 바이얼에 첨가하고, 분석을 위해 HPLC 상에 즉시 주입한다 (검정 용액의 총 부피는 1100 ㎕이다).

HPLC 분석

하기의 HPLC 조건을 사용하였다: 수펠가드 디스커버리(Supelguard Discovery) C8 수펠가드 카트리지와 함께 수펠코 디스커버리 C8 컬럼(15 ㎝ × 4.0 mm, 5um; 수펠코 # 59353-U40).

이동상: 41 내지 100 % 아세토니트릴/ 59 내지 0% 증류수, 1 ㎖/분 구배. 주입 부피, 15 ㎕; 분석 시간, 10분. 검출기 - 225 nm에서의 UV 흡광도.

머릿단 인장 강도 시험 절차

다수의 모발 섬유를 함유하는 모발 번들에 대한 이러한 인장 강도 시험 절차를 개발하고, 결과는 다수의 모발 섬유에 대하여 평균을 낸 처리 효과를 반영할 것이다. 모발 시료를 4 ㎝ 길이, 2 ㎜ 폭의 대략 30 내지 70 mg 모발의 모발 번들로 자르고, 1 ㎜ 두께 및 5 ㎜ 길이의 접착제 스트립(glue strip)으로 함께 고정하였다. 이러한 머릿단의 5 ㎜의 자유단을 신속하게 건조하는 접착제(예를 들어, 두코(Duco)(등록 상표), 시멘트(Cement)(등록 상표), 니트로 셀룰로스 가정용 시멘트)를 사용하여 추가로 접착시켰다. 접착제를 건조시킨 후에, 임의의 느슨한 모발 가닥을 절단하고, 시료의 무게를 재었다.

444.8 뉴턴(100 lb) 로드-셀(load-cell)이 장착된 컴-텐(Com-Ten)(등록 상표) 인장 시험기 95-VD(미국 플로리다주 파이넬러스 파크 소재의 컴-텐 인더스트리즈(Com-Ten Industries))를 인장 시험을 위해 사용하였다. 시료의 불이행을 줄이기 위하여, 5 ㎜ 폭의 산업 등급 벨크로(Velcro)(등록 상표)(미국 뉴햄프셔주 맨체스터 소재의 벨크로 유에스에이(Velcro USA))의 스트립을 클램프의 내측 모서리에 부착시켰다. 시험 전에, 보정(CALIBRATION)을 "오프(off)"로 설정하고, 힘 단위(FORCE UNITS )를 "그램"으로 설정하고, 클램프 간의 거리를 3 ㎝로 조정하였다. 시험 시료를 30초 동안 물에 침지시켰다. 과잉의 수분을 페이퍼 타월 상에서의 온건한 흡수에 의해 제거하여, 100% 습도 수준으로 존재하는 바와 같은 자격을 제공하도록 모발에 충분한 수분을 남겼다. 접착된 시험 시료의 모서리를 벨크로(등록 상표) 스트립이 접착제 바로 아래의 모발을 고정시키는 방식으로, 상위 및 하위 클램프 둘 모두에서 클램핑하였다. 시험기 속도를 속도 제어 손잡이를 조정함으로써 약 6.4 ㎝(2.5 인치)로 설정하였다. 시행(RUN) 모드에서 힘 측정기를 사용하여, 용기 무게(TARE)를 0(ZERO)으로 설정하여, 출발 피크 힘(PEAK FORCE)을 0으로 설정하였다. 시험을 시작하기 위하여, 토글 스위치 방향(DIRECTION)을 상향(UP) 위치로 눌렀다. 시험의 결말에, 시료가 실패한 경우, 스위치 방향을 정지(STOP)으로 옮기고, 피크 힘을 기록하였다. 모발을 하위 및 상위 클램프 둘 모두에서 클램프의 모서리를 따라 절단하였다. 클램프를 열고, 남은 부분(stub)을 제거하고, 공기 중에 건조시키고 칭량하였다. 원래의 시료 중량과 남은 부분의 합한 중량의 차이는 인장 신율(tensile elongation)을 겪는 모발의 중량이었으며, 이러한 양을 사용하여, 인장 강도를 계산하였다.

처리 후의 시료의 비교의 목적을 위하여, 인장 강도를 하기와 같이 정의하였다:

인장 강도(N/mg(모발)) = 피크 힘(뉴턴)/(초기 시료 중량 - 남은 부분의 중량)

상업적으로 입수할 수 있는 제모 제품, 코코아 버터가 있는 나이르(등록 상표) 로션(미국 뉴저지주 프린세톤 소재의 처치 앤드 드와이트 컴퍼니, 인코포레이티드)으로의 처리 후에 머릿단의 인장-강도(모발-약화)를 측정함으로써 검정법의 벤치마킹을 달성하였다. 나이르(등록 상표) 제품 설명서에 기초하여, 권고되는 처리 시간은 5 내지 10분이다. 따라서, 나이르(등록 상표)로 5분 내지 10분 처리한 모발 시료의 인장 강도를 사용하여, 표적 수준을 결정하였다. 4 ㎝ 길이의 대략 50 mg의 모발의 모발 번들로 이루어진 시험 모발 시료를 1 ㎜ 두께, 2 ㎜ 폭 및 5 ㎜ 길이의 접착제 스트립으로 함께 고정하였다. 시험-시료를 유리 플레이트 상에 배치하였다. 대략 1 ㎖의 나이르(등록 상표) 로션을 장갑을 낀 손으로 머릿단에 적용하였다. 로션을 머릿단 상에 조심히 스프레딩하고 머릿단으로 눌러, 모든 모발 섬유를 덮게 하였다. 실온에서 원하는 처리 시간 후에, 머릿단을 수돗물로 완전히 헹구어내어, 모든 로션의 자취를 없앴다. 시료를 자연 건조시키고, 그의 인장 강도에 대하여 시험하였다.

이들 처리 시간 동안, 머릿단의 인장 강도(젖은 머릿단, 100% 습도)는 10분 동안 약 0.2 N/mg(모발)이고, 5분 동안 0.7 내지 1.4 N/mg(모발)인 것으로 관찰되었다. 데이터는 표 1에 제공되어 있다. 인장 강도의 변이를 고려해 볼 때, 원하는 수준의 모발 약화 효능을 나이르(등록 상표) 5분 처리 벤치마크로서 1.5 N/mgH에 대하여표적화하였다.

모발 색상 측정 절차

머릿단을 대기 건조시키고, 4 ㎜ 포트(port)가 구비된 X-RITE(등록 상표) SP64 분광광도계(미국 미시건주 그랜드빌 소재의 엑스-라이트(X-Rite))를 사용하여 색상 측정을 행하였다. 색상 번호를 CIELAB76에 따라, 반사율로부터 D65/10^o에서 측정하였다. 머릿단(모든 반복검증)을 홀(hole)을 뚫은 종이 카드 하에 배치하여, 백그라운드가 눈에 보이지 않게 하였다. 분광광도계의 포트-홀이 홀 상에 중심을 두게 하여, 아래에 있는 모발 시료를 스캐닝하였다. 머릿단-번들을 뒤집고, 카드 아래에 두고, 추가의 측정을 행하였다. 평균 L*, a*, b*(CIELAB76에 따른 색상) 값을 기록하였다.

색상 소실의 ΔE를 하기의 식에 따라, 계산하였다:

ΔE = ((L*-L*_ref)² + (a*-a*_ref)² + (b*-b*_ref)²)^0.5

여기서,

L*, a* 및 b*는 처리 후의 시료 머릿단에 대한 L*, a* 및 b* 값이다.

L_ref*, a_ref* 및 b_ref*는 미처리 모발에 대한 L*, a* 및 b* 값이다.

실시예 1

융합 단백질의 생성

이러한 실시예에는 모발-결합 도메인을 통하여 모발에 표적화된 과가수분해효소의 발현 및 정제가 기재되어 있다.

균주 LR3311 및 균주 LR3312를 50 mg/ℓ의 스펙티노마이신을 함유하는 1 리터의 자가유도(autoinduction) 배지(10 g/ℓ의 트립톤, 5 g/ℓ의 효모 추출물, 5 g/ℓ의 NaCl, 50 mM Na₂HPO₄, 50 mM KH₂PO₄, 25 mM (NH₄)₂SO₄, 3 mM MgSO₄, 0.75% 글리세롤, 0.075% 글루코스 및 0.05% 아라비노스)에서 200 rpm 진탕 하에 37℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 비표적화된 과가수분해효소의 생성은 이전에 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(디코시모 등)에서 기재되었다.

세포를 8000 rpm 및 4℃에서의 원심분리에 의해 수집하고, 조직 호모지나이저(브린크만 호모지나이저 모델 PCU11; 캐나다 미시소가 소재의 브린크만 인스트루먼츠(Brinkmann Instruments))를 사용하여 3500 rpm에서 세포 펠렛을 얼음으로 냉각된 용해 완충제(50 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl) 300 ㎖에 재현탁화시킨 다음 원심분리(8000 rpm, 4℃)에 의해 세정하였다. 이어서, 세포를 조직 호모지나이저를 사용하여 75 mg의 달걀 흰자 라이소자임(시그마)을 함유하는 냉각된 용해 완충제에서의 재현탁화에 의해 용해시켰다. 세포 현탁액을 조직 호모지나이저를 사용한 주기적인 균질화와 함께, 얼음 위에 3시간 동안 정치되게 하여, 라이소자임에 의한 세포벽의 분해를 가능하게 하였다. 이 단계에서, 추출물의 어떠한 거품 형성도 피하도록 주의하였다. 추출물을 나누고(500-㎖ 병당 150 ㎖), - 20℃에서 동결시켰다. 동결된 세포 추출물을 실온(약 22℃)에서 해동시키고, 조직 호모지나이저를 사용하여 균질화시키고, 20% 최대 출력, 1분 동안 2 펄스/초를 사용하여, 5 ㎜ 프로브가 장착된 초음파분해기(미국 코네티컷주 댄버리 소재의 브란슨 울트라소닉스 코포레이션(Branson Ultrasonics Corporation); 소니파이어(Sonifier) 모델 450)를 사용하는 초음파분해에 의해 파괴하였다. 용해된 세포 추출물을 4 × 50-㎖ 코니컬(conical) 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 옮긴 다음, 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 세포 데브리스(debris)뿐 아니라 파괴되지 않은 세포를 포함하는 펠렛을 동결시켰다. 용해물의 분취액을 15-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 튜브(12 × 5-㎖)로 옮기고, 15분 동안 80℃로 가열하고, 얼음 위에서 냉각시키고, 4 × 50-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 모았다. 내열성 효소를 함유하는 가용성 분획 및 침전된 에스케리키아 콜라이 단백질을 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서의 원심분리에 의해 분리하였다. 세포 파괴가 초음파분해 단계 후에 불완전하였다면, 동결된 펠렛을 다시 해동시키고, 2차의 초음파분해, 원심분리 및 열 처리를 가하였다. 이러한 정제 프로토콜의 산출량은 통상 ㎖당 2 내지 4 mg의 단백질을 제공하며, 융합 과가수분해효소의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석에 의해 추정시 90% 내지 75%의 단백질이었다. 표준물질로서 소 혈청 알부민의 용액을 사용하여 총 단백질을 BCA(비신코닌산(bicinchoninic acid)) 검정법(미국 일리노이주 록퍼드 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 의해 정량화하였다.

실시예 2

모발- 표적화된 과가수분해효소 융합의 모발에 대한 결합

이러한 실시예에는 모발-결합 서열의 과가수분해효소로의 융합에 의존적인 방식의, 과가수분해효소의 모발로의 결합이 입증되어 있다.

모발 결합 실험을 위하여, 갈색 머릿단(hair tresses)(미국 뉴욕주 글렌스데일 소재의 인터내셔널 헤어 임포터즈 앤드 프로덕츠(International Hair Importers and Products))을 사용하였다. 모발을 2% SLES로 세정하고, 탈이온수로 광범위하게 헹구고, 자연 건조시켰다.

1 ㎝ 갈색 모발 단편 대략 20 mg을 1.8-㎖ 원심분리용 튜브에 첨가하였다. 가수분해 검정 완충제(1.2 ㎖)를 모발에 첨가한 다음, 과가수분해효소를 이 용액에 첨가하였다. 효소를 아담스 뉴테이터(Adams Nutator)(모델 1105, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡턴 디킨슨(Becton Dickinson))에서 온건하게 진탕시키면서(24 rpm) 30분 동안 모발에 결합되게 하였다. 모발과 함께 또는 모발 없이, 효소 부재 대조군을 pNPA 가수분해효소 시약의 비-효소적 가수분해를 설명하기 위한 결합 실험에 포함시켰다. 결합 단계 후에, 결합 완충제 1.0-㎖ 분취액을 새로운 튜브로 옮겨, 미결합 효소의 양을 정량화하였다. 추가의 결합 완충제를 제거하고, 모발 단편을 가수분해효소 완충제 중의 1% 트윈(등록 상표)-20, 1 ㎖로 4회 세정하고, 각각 가수분해효소 완충제 중에서 1 ㎖의 2회의 세정으로 이어졌다. 이어서, 모발 단편을 1 ㎖의 가수분해효소 검정법에서 재현탁화시키고, 모발에 계속 결합되는 가수분해효소 활성을 측정하였다. 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 C277S 변이체(서열 번호 293)를 비-표적화된 과가수분해효소를 위한 대조군으로 사용하였다. 결과는 표 2에 제공되어 있다.

표 2의 데이터에 의해, 모발에 표적화된 과가수분해효소 융합이 1% 트윈(등록 상표)-20에서의 과도한 세정 후에 모발 상에 유지되는 한편, 비표적화된 과가수분해효소는 그렇지 않음이 입증되었다.

실시예 3

모발에 표적화된 다른 과가수분해효소의 구축 및 생성

하기의 실시예에 의해 모발에 대해 표적화된 추가의 과가수분해효소의 생성을 위한 발현 시스템의 고안이 기재된다. 구축물의 요약은 표 3에 제공된다.

약술하면, 폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 9, 39 및 41)을 바실러스 푸밀러스, 락토코커스 락티스 및 메소리조비움 로티로부터의 자일란 에스테라제(서열 번호 10, 40 및 42)의 18개 아미노산 가요성 링커(GPGSGGAGSPGSAGGPGS; 서열 번호 285)(그 자체가 모발 결합 도메인 HC263(서열 번호290)에 융합된다)로의 융합을 암호화하도록 고안하였다. 이들 효소는 써모토가 마리티마 과가수분해효소가 그러한 것처럼, 탄수화물 에스테라제의 CE-7 패밀리에 속한다.

폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 322, 324, 326 및 328)을 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체(서열 번호 314)의 18개 아미노산 가요성 링커서열 번호285 그 자체가 모발 결합 도메인 HC263서열 번호 290 에 융합된다 로의 융합을 암호화하도록 고안하였다. 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제는 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 분류와는 상이한 분류의 가수분해 효소에 속한다.

폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 330, 332, 334 및 336)을 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체(서열 번호 315)의 18개 아미노산 가요성 링커(서열 번호 285)(그 자체가 모발 결합 도메인 HC263(서열 번호 290)에 융합된다)로의 융합을 암호화하도록 고안하였다. 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 에스테라제는 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 분류 또는 마이코박테리움 스메그마티스의 분류와는 상이한 분류의 가수분해 효소에 속한다.

유전자를 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시키고, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성하였다. 암호화 서열을 플라스미드에서, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로, T7 프로모터 또는 pBAD 프로모터 뒤에 클로닝하였다. 플라스미드를 적절한 발현 숙주에 전달하였다: T7 프로모터 하의 구축물을 위한 에스케리키아 콜라이 균주 BL21AI(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐) 또는 pBAD 프로모터 하의 구축물을 위한 에스케리키아 콜라이 MG1655의 AraBAD 유도균주.

실시예 4

대안적인 에스테라제/과가수분해효소 및 모발-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질의 생성

이러한 실시예에는 실시예 3에 기재된 바와 같이, 모발에 표적화된 다양한 대안적인 에스테라제/과가수분해효소의 발현 및 정제가 기재되어 있다.

실시예 3의 표 3에서 과가수분해효소에 대한 융합을 암호화하는 유전자를 발현하는 균주를 200 rpm 진탕 하에서 37℃에서 20시간 동안 50 mg/ℓ의 스펙티노마이신을 함유하는 1 ℓ의 자가유도 배지(10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, 50 mM Na₂HPO₄, 50 mM KH₂PO₄, 25 mM (NH₄)₂SO₄, 3 mM MgSO₄, 0.75% 글리세롤, 0.075% 글루코스 및 0.05% 아라비노스)에서 성장시켰다. 모든 단백질 융합은 에스케리키아 콜라이에서 잘 발현되었다. 세포를 8000 rpm 및 4℃에서의 원심분리에 의해 수집하고, 조직 호모지나이저(브린크만 호모지나이저 모델 PCU11)를 사용하여 3500 rpm에서 세포 펠렛을 얼음으로 냉각된 용해 완충제(50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl) 300 ㎖에 재현탁화시킨 다음 원심분리(8000 rpm, 4℃)에 의해 세정하였다. 세포를 110.32 MPa(약 16,000 psi)에서 프렌치 압력 셀(French pressure cell)을 통한 2회 통과에 의해 파괴하였다. 용해된 세포 추출물을 4 × 50-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 옮기고, 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 효소를 함유하는 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 각 추출물 중의 적절한 양의 융합 단백질을 쿠마시(Coomassie) 염색된 PAGE 겔 상의 소 혈청 알부민 표준물질의 밴드와의 비교에 의해 추정하였다.

과가수분해효소 융합이 호열성이 아니기 때문에, 그들을 Co-NTA 아가로스(히스푸르 코발트 레진(HisPur Cobalt Resin), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하는 금속 킬레이트화 크로마토그래피에 의해 그들의 C-말단 His6을 사용하여 정제하였다. 전형적으로, 세포 추출물을 4 부피의 평형화 완충제(10 mM Tris HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 1 mM 이미다졸 및 150 mM NaCl)으로 평형화된 Co-NTA 아가로스의 5 내지 10 ㎖ 컬럼에 로딩하였다. 컬럼 상에 로딩된 각 추출물의 양을 Co-NTA 아가로스 비드 ㎖당 5 내지 10 mg의 과가수분해효소 융합을 함유하도록 조정하였다. 레진을 2 충진 부피의 평형화 완충제로 세정하고, 2 부피의 용리 완충제(10 mM Tris HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 150 mM 이미다졸, 500 mM NaCl)로 용리시켰다. 분획을 수집하고, 정제된 단백질의 존재를 PAGE에 의해 검출하였다. 용리된 단백질을 PAGE에 의해 분석하였다. 모든 이들 단백질을 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있었다. 상기의 사실은 융합 단백질이 전장 형태로 생성되었음을 나타낸다.

이러한 실시예에 의해, 모발에 대하여 친화성을 갖는 다양한 결합 도메인을 갖는 상이한 패밀리로부터의 융합 가수분해효소/과가수분해효소의 생성의 실행가능성이 입증된다.

실시예 5

모발-결합 도메인에 융합된 대안적인 과가수분해효소의 과가수분해효소 활성

하기의 실시예에는 모발에 표적화된 대안적인 과가수분해효소의 활성이 입증된다.

실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 생성되는 다양한 표적화 도메인을 갖는 모발에 표적화된 효소의 과가수분해효소 활성을 ABTS 검정법으로 측정하였다. 결과는 표 4에 보고되어 있으며, CE-7(탄수화물 에스테라제 패밀리 7)뿐 아니라 비-CE-7 가수분해효소가 과가수분해 활성을 갖는 것을 보여준다.

본 실시예에 의해, CE-7 패밀리 또는 다른 패밀리로부터의 가수분해효소의 다른 모발-표적화 융합에 의해, 과가수분해효소 활성이 나타났으며, 모발 적용에서 직접 또는 효소 발생 후에 사용될 수 있었음이 입증된다.

실시예 6

모발에 대하여 표적화된 다른 과가수분해효소의 모발 결합

하기의 실시예에 의해, 다양한 표적화된 과가수분해효소(CE-7 써모토가 마리티마 과가수분해효소 이외의)가 모발에 결합될 수 있음이 입증된다.

표적화된 과가수분해효소 HC1121(C277S-HC263; 서열 번호 288), HC1169(ArE-HC263; 서열 번호 323) 및 슈도모나스 플루오레슨스 과가수분해효소의 변이체(서열 번호 331)를 pH 6.0으로 조정된 100 mM 시트레이트-포스페이트 완충제 중의 5% PEG-80 소르비탄 라우레이트의 용액 중에서 50 ㎍/㎖로 희석하였다. 10 mg의 인간 모발을 2 ㎖의 상기 제형에 첨가하고, 온건하게 진탕시키면서 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켜, 효소가 모발에 결합되게 하였다. 또한, 비-효소 대조군 시료를 포함시켰다. 결합 후에, 결합 용액을 흡입에 의해 제거하고, 모발을 50 mM pH 7.2 인산칼륨 완충제 중의 1% 트윈(등록 상표)-20, 2 ㎖로 세정하였다. 모발을 튜브로부터 제거하고, 페이퍼 타월로 닦아내어 건조시키고, 새로운 튜브 세트로 옮겼다. 모발을 50 mM pH 7.2 인산칼륨 완충제 중의 1% 트윈(등록 상표)-20으로 2번 헹군 다음, 50 mM pH 7.2 인산칼륨 완충제로 2번 헹구었다. 모발에 결합되어 유지되는 효소의 양을 모발을 3 ㎜ 단편으로 절단함으로써 SDS-PAGE 분석에 의해 결정하였다. 단편을 500 ㎕ 폴리프로필렌 원심분리기용 튜브에 넣고, 80 ㎕의 겔 로딩 완충제(20 ㎕ NuPAGE LDS 시료 완충제(인비트로겐 NP0007), 8 ㎕ 의 500 mM DTT 및 52 ㎕ 50 mM pH 7.2 인산칼륨)로 덮었다. 모발 시료를 10분 동안 90℃로 가열시킨 다음, 4도로 냉각시켰다.

상층액(25 ㎕)을 NuPAGE 4-12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐 NP0322)에 로딩하고, 150 v에서 40분 동안 전개시켰다. 겔을 물로 3회 세정하고, 15 ㎖ 심플리블루(Simplyblue)(상표명) 세이프스테인(Safestain)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐; LC6060)에서 1시간 동안 염색하고, 3회 헹군 다음, 3시간 동안 수 중에서 탈염시켰다. 결과를 겔 상의 효소 밴드의 상대적 세기로 기록하고, 표 5에 제공하였다.

데이터에 의해, 상이한 가수분해효소 패밀리로부터의 다양한 과가수분해효소가 모발에 표적화될 수 있으며, 모발 결합 서열이 써모토가 과가수분해효소 이외의 과가수분해효소에 대한 융합의 맥락에서 작용성임이 나타났다.

실시예 7

과아세트산(PAA)을 생성하기 위한 과가수분해효소를 위한 기질 스톡으로서의 과탄산염 / 트라이아세틴 현탁액의 제조

본 실시예의 목적은 과탄산염 및 트라이아세틴이 공동-제형화된 기질 스톡으로서 비-수성 환경에서 함께 저장될 수 있음을 입증하려는 것이다.

과탄산나트륨(Na₂CO₃.1.5 H₂O₂, 분자량 157.01; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)은 백색 고체 펠렛이었으며, 이를 막자사발을 사용하여 분말로 분쇄하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 상이한 양의 과탄산나트륨을 유리 바이얼에 칭량해 넣고, 10% 고형물이 있는 현탁액을 제조하기 위한 용매로서 트라이아세틴 및 프로필렌 글리콜의 첨가로 이어졌으며, 이는 과가수분해효소 함유 완충액으로 희석되는 경우 원하는 농도 수준으로 기질을 공급할 것이다. 교반 막대를 바이얼에 첨가하여, 교반을 유지하고, 과탄산염 분말이 잘 현탁화되게 하였다.

기질 현탁액 스톡을 제조한 후에, 적절한 부피의 잘-혼합된 현탁액 스톡을 표 7에 도시된 바와 같은 pH 6.6, 50 mM 포스페이트 완충제 및 1 mg/㎖ HC1121(C277S-링커-HC263; 서열 번호 288) 스톡과 혼합하여, 10 ㎍/㎖ HC1121 작용 농도 및 계획된 기질 작용 농도(트라이아세틴에 대하여 250 mM 또는 500 mM 및 방출된 H₂O₂에 대하여 250 mM 또는 500 mM)를 갖는 1 ㎖ 반응 혼합물을 제조하였다. 반응을 60분 동안 진행한 후에, 반응 혼합물의 pH를 측정한 다음, 100 ㎕의 액체 시료를 취하고, 900 ㎕ 5 mM H₃PO₄에 첨가함으로써 반응물을 켄칭하였다. 켄칭된 시료를 12,000 rpm에서 6분 동안 원심분리함으로써 나노세프(Nanosep)(등록 상표) MF 원심분리 장치(300K 분자량 컷오프(Cutoff) (MWCO), 미국 미시간주 앤 아버 소재의 폴 라이프 사이언스즈(Pall Life Sciences))를 사용하여 여과하였다. 여액을 2벌로 HPLC 카스트 검정법에 의해 검정하여, 그 반응 조건에 생성된 과아세트산(PAA)의 양을 결정하였다. 현탁액 스톡을 제조하고 1일 및 6일 후에, 시험을 행하였으며, 둘 모두의 날에 60분 반응 시간에서의 PAA 생성의 결과는 표 7에 제공되어 있다. 결과에 의해, 과산소원으로서 과탄산염을 사용하여 PAA가 60분 내에 생성되었음이 나타났다. 6일의 저장 후에, 이들 기질 현탁액 스톡은 여전히 60분 반응 시간에 약 4000 내지 9600 ppm PAA를 생성할 수 있었으며, 이는 1일에 측정한 PAA 생성 활성의 70 내지 85%를 보여준다.

참조 시료를 도 8에 나타낸 과탄산염 시료로서 동일한 시료 조성물 중의 동일한 농도의 액체 H₂O₂를 사용하여 행하였으나, 60분 반응 후에 오직 약 절반의 양의 PAA만이 생성되었다(약 2700 ppm 내지 4000 ppm). 액체 H₂O₂ 시료에 대한 pH는 50 mM 포스페이트 완충제에 의해 주도되며, 60분 반응 후에 측정된 pH는 pH 5.2 내지 pH 5.5 범위였다. 과탄산나트륨 시료에 대한 pH는 수성 용액의 혼합 시에 방출되는 탄산나트륨에 의해 주도되며, 60분 반응 후에 측정된 pH는 pH 8.4 내지 pH 9.9 범위였다. 본 실시예에 사용된 과가수분해효소 HC1121(서열 번호 288)은 표 9에 나타낸 바와 같이 더 높은 pH에서 더 높은 활성을 가졌다.

실시예 8

과탄산염 / 트라이아세틴 현탁액 스톡으로부터의 PAA 생성의 조절

본 실시예의 목적은 과탄산염/트라이아세틴 현탁액 스톡의 PAA 생성 수준 및 반응 PH가 적절한 완충제로 조절될 수 있음을 입증하려는 것이다.

3가지 상이한 완충제: (a) pH 6.6, 100 mM 포스페이트 완충제, (b) pH 6.0, 100 mM 포스페이트 완충제, 및 (3) pH 6.0, 200 mM 포스페이트 완충제를 사용하여, 4가지 상이한 농도 수준으로 과탄산나트륨을 제조하였다(50 mM 내지 200 mM 당량의 H₂O₂ 농도). 각 용액의 pH를 측정하고 표 10에 나타내었다. pH 6.0, 200 mM 포스페이트 완충제는 과탄산염 용액의 pH를 개인 관리, 특히 피부 관리 제품에 적절한 것으로 보이는 pH 범위인 pH 6.5 내지 pH 8의 시험 농도 범위로 조정할 수 있었다.

공동-제형화된 기질 스톡으로서 과탄산나트륨/트라이아세틴을 제조하기 위하여, 표 11에 나타낸 바와 같이, 상이한 양의 과탄산나트륨을 유리 바이얼에 칭량해 넣고, 필요에 따라 5 내지 10% 고형물이 있는 현탁액을 제조하기 위한 용매로서 트라이아세틴 및 프로필렌 글리콜의 첨가로 이어졌으며, 이는 과가수분해효소 함유 완충액으로 희석되는 경우 원하는 농도 수준으로 기질을 공급할 것이다. 교반 막대를 바이얼에 첨가하여, 교반을 유지하고, 과탄산염 분말이 잘 현탁화되게 하였다.

기질 현탁액 스톡을 제조한 후에, 적절한 부피의 잘-혼합된 현탁액 스톡을 표 12에 도시된 바와 같은 pH 6, 200 mM 포스페이트 완충제, 및 1 mg/㎖ HC1121(서열 번호 288) 스톡 또는 1 mg/㎖ C277S 스톡(서열 번호 293)과 혼합하여, 10 ㎍/㎖ HC1121(서열 번호 288) 또는 10 ㎍/㎖ C277S(비표적화; 서열 번호 293) 작용 농도 및 계획된 기질 작용 농도(트라이아세틴에 대하여 약 250 mM 또는 500 mM, 및 방출된 H₂O₂에 대하여 50 mM 내지 200 mM)를 갖는 1 ㎖ 반응 혼합물을 제조하였다. HC1121(서열 번호 288)은 C-말단 18개 아미노산 가요성 펩티드 링커(서열 번호 285)를 통해 모발 결합 도메인 HC263(서열 번호 290)에 결합된 C277S 변이체 과가수분해효소(서열 번호 293)를 포함하는 표적화된 과가수분해효소이다. C277S는 비표적화된 써모토가 마리티마 변이체 과가수분해효소(서열 번호 293)이다. 반응을 60분 동안 진행한 후에, 반응 혼합물의 pH를 측정하였다. 100 ㎕의 액체 시료를 취하고, 900 ㎕의 100 mM H₃PO₄에 첨가함으로써 반응물을 켄칭하였다. 켄칭된 시료를 12,000 rpm에서 6분 동안 원심분리함으로써 나노세프(등록 상표) MF 원심분리 장치(300K 분자량 컷오프(MWCO), 폴 라이프 사이언스즈)를 사용하여 여과하였다. 여액을 2벌로 HPLC 카르스트 검정법에 의해 검정하여, 생성된 과아세트산(PAA)의 양을 결정하였다. 60분 반응 시간 후에 생성된 PAA의 양 및 pH 값 둘 모두는 표 12에 제공되어 있다. pH 6.7 내지 pH 7.7이 pH 6.0, 200 mM 인산염 완충된 반응 혼합물에 대하여 관찰되었으며, 기질 농도에 따라 약 1700 ppm 내지 6000 ppm PAA가 60분 후에 생성되었다. 기질 농도가 증가할수록, 생성되는 PAA의 양이 증가하였다. 표적화된 과가수분해효소 HC1121(서열 번호 288) 및 비표적화된 과가수분해효소 C277S(서열 번호 293)는 유사한 활성을 보였다.

실시예 9

과탄산염 / 트라이아세틴 현탁액 스톡과 함께 과가수분해효소를 사용한 모발 약화 및 탈색( 라이트닝 ) 효능

본 실시예의 목적은 표적화된 과가수분해효소 HC1121(C277S-링커-HC263; 서열 번호 288) 및 비표적화된 과가수분해효소 C277S(서열 번호 293) 둘 모두와 함께 과탄산염/트라이아세틴 현탁액 스톡을 사용하여 모발 약화 효능을 입증하려는 것이다.

실시예 8에서 제조된 4가지 기질 현탁액 스톡을 선택하고(291-42-1S; 291-42-4S; 291-42-7S; 및 291-42-8S), 24시간 처리 사이클을 사용하여 모발 시료 상에서 표적화된 과가수분해효소 HC1121 및 비표적화된 과가수분해효소 C277S 둘 모두를 사용하여 시험하였다. 각 시험 조건을 위하여 3벌의 머릿단을 사용하였다. 머릿단은 미국 뉴욕주 글렌스데일 소재의 인터내셔널 헤어 임포터즈 앤드 프로덕츠로부터의 중간 갈색 모발이었다. 각 머릿단을 일단에서 접착시키고, 5 mm 폭 및 4 ㎝ 길이(접착된 부분 제외)로 절단하였으며, 모발 순중량은 100 +/- 20 mg이었다. 각 머릿단을 깨끗한 플라스틱 칭량 트레이(VWR, 카탈로그 번호 12577-053)에 두었다. 적절한 부피의 잘 혼합된 과탄산염/트라이아세틴 현탁액 스톡을 5 mg/㎖ 스톡으로부터 각 사이클에 pH 6.0, 200 mM 인산염 완충제 중에서 신선하게 제조된 3.5 ㎖의 10 ㎍/㎖ 효소 용액에 첨가하여, 50 mM 또는 100 mM 등가의 H₂O₂ 작용 농도 및 250 mM 또는 500 mM 트라이아세틴 작용 농도에 첨가함으로써 각 모발 처리 용액을 표 13에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 이어서, 1 ㎖의 반응 혼합물을 각 머릿단에 첨가하고, 적용기를 사용하여 머릿단으로 문질렀다. 마른 접시로 가져가기 전 1시간 동안 머릿단을 이러한 반응 혼합물에 놔두었다. 머릿단을 23시간 동안 대기 건조되게 한 다음, 1 ㎖ 1% 소듐 라우릴 에테르 설페이트(SLES, 미국 ,뉴저지주 크랜버리 소재의 로디아 인코포레이티드(Rhodia Inc)의 로다펙스(RHODAPEX) ES 2K")로 세정하고, 수돗물 헹굼 및 페이퍼 타월 건조로 이어졌다. 이에 의해 24시간 처리 사이클을 완료하였다. 처리 사이클을 모발 손상의 가시적인 상태에 따라 8 내지 12회 반복하였다.

머릿단은 처리 동안 더 밝은 색이 되고 약화되었다. 최종 헹굼 및 대기 건조 후에, L*, a*, b* 색상 측정을 각 모발 시료에 대하여 취하여, 모발 색상 소실의 양을 정하였고, 또한, ΔE 색상 차이 계산에 대한 기준으로서 L*, a*, b* 색상 측정을 미처리 모발에 대하여 취하였다.

ΔE는 하기와 같이 계산하였다:

ΔE = ((L*-L*_ref)² + (a*-a*_ref)² + (b*-b*_ref)²)^0.5.

일반 방법에서 상기에 기재된 바와 같은 인장 강도 시험을 각 머릿단에서 행하여, 모발 약화의 양을 정하였다.

선택된 처리 사이클에, 100 ㎕의 반응 혼합물을 취하고, 이를 900 ㎕의 100 mM H₃PO₄에 첨가하여 반응을 켄칭함으로써 각 머릿단이 침지되어 있는 반응 혼합물을 시료추출하였다(1시간 침지 기간의 마지막 후에). 켄칭된 시료를 12,000 rpm에서 6분 동안 원심분리함으로써 나노세프(등록 상표) MF 원심분리 장치(300K 분자량 컷오프(MWCO), 폴 라이프 사이언스즈)를 사용하여 여과하였다. 여액을 2벌로 HPLC 카르스트 검정법(상기)에 의해 검정하여, 생성된 과아세트산(PAA)의 양을 결정하였다. PAA 농도는 표 14에 요약되어 있다. 모발 부재 참조물질(대조군; 모발 없이 1시간 내에 생성된 PAA는 약 1700 ppm 내지 3000 ppm이었다)에 비하여, 1시간 모발 처리 후의 반응 혼합물 중의 PAA 수준은 약 500ppm 내지 1800 ppm 범위였으며, 이는 1시간 내에 생성되는 PAA의 40 내지 80%가 모발 처리 동안 소모되는 것으로 보이는 것을 나타낸다.

표 15의 결과는 모든 처리된 모발이 1.5 N/mg(모발) 인장 강도의 나이르(등록 상표) 5분 처리 벤치마크보다 훨씬 더 낮은 0.5 N/mg(모발) 미만의 모발 인장 강도로 유의미하게 약화되었음을 보여준다. 기질 농도가 높을수록, 약화 효과가 더욱 강력하고, 모발 색상 소실이 더 컸다. 동일한 기질 농도 수준에서, 비록 유사한 수준의 PAA 생성이 둘 모두의 효소에서 검출되었을 지라도(표 12 및 표 14), 표적화된 과가수분해효소 HC1121(서열 번호 288)은 더욱 강력한 모발 약화 및 모발 라이트닝 효능을 보였다.

실시예 10

과탄산염/트라이아세틴 현탁액 스톡 및 완충된 과가수분해효소 스톡을 사용한 2-구획 제모 제품

본 실시예의 목적은 하나의 구획 상의 과탄산염/트라이아세틴 현탁액 스톡 및 제2 구획에서의 완충된 과가수분해효소 스톡이 있는 2-구획 제품 프로토타입의 제모 효능을 보여주는 것이다.

실시예 8과 유사하게, 공동-제형화된 기질 스톡으로서의 과탄산나트륨/트라이아세틴 현탁액을 표 16의 레시피에 따라 제조하였다: 과탄산나트륨 분말을 유리 바이얼에 칭량해 넣고, 5% 고형물이 있는 현탁액을 제조하기 위한 용매로서 트라이아세틴 및 프로필렌 글리콜의 첨가로 이어졌으며, 이는 과가수분해효소 함유 완충액으로 희석되는 경우 250 mM 트라이아세틴 및 100 mM H₂O₂로 기질을 공급할 것이다. 교반 막대를 바이얼에 첨가하여, 교반을 유지하고 과탄산염 분말이 잘 현탁화되게 하였다.

이어서, 5 mg/㎖ 스톡을 pH 6, 200 mM 포스페이트 완충제로 희석함으로써 HC1121의 11 ㎍/㎖ 용액을 제조하였다. HC1121 용액을 완충된 과가수분해효소 스톡으로 사용하였다. 매일, 1819 ㎕의 이러한 과가수분해효소 스톡을 181 ㎕의 잘-혼합된 과탄산염/트라이아세틴 현탁액 스톡과 혼합하여, 2-㎖ 반응 혼합물을 제조하였다. 이어서, 0.5 ㎖의 2-㎖ 반응 혼합물을 3벌의 머릿단 중 하나로 옮기고, 적용기를 사용하여 모발에 문질렀다. 머릿단은 인터내셔널 헤어 임포터즈로부터의 중간 갈색 모발이었다. 각 머릿단을 일단에서 접착시키고, 5 ㎜ 폭 및 4 ㎝ 길이(접착된 부분 제외)로 절단하였으며, 모발 순중량은 100 +/- 20 mg이었다. 모발을 24시간 동안 대기 건조시킨 다음, 1 ㎖ 1% SLES로 세정하고, 수돗물 헹굼 및 페이퍼 타월 건조로 이어졌다. 이러한 처리 사이클을 인장 강도 시험의 측정 및 색상 측정의 수행 전에 각 머릿단에서 14 사이클 동안 반복하였다. 동일한 시험을 효소-부재 대조군을 사용하여 수행하였으며, 여기서, 1819 ㎕의 pH 6, 200 mM 포스페이트 완충제(과가수분해효소 스톡 대신에 사용)를 181 ㎕의 과탄산염/트라이아세틴 현탁액과 혼합하였다. 반응 조건, 인장 시험 결과 및 모발 색상 소실 결과는 표 17에 요약되어 있다. 효소 부재 대조군은 기질 스톡으로서 과탄산염/트라이아세틴 현탁액의 사용 시에 모발을 HC1121 함유 시료와 유사한 정도로 밝아지게 하였으나, 그와 동일하게 모발을 약화시키지 않았다. 10 ㎍/㎖(작용 농도)에서 표적화된 과가수분해효소 HC1121은 1.5 N/mg 나이르(등록 상표) 처리된 모발 벤치마크보다 훨씬 더 낮게 약 0.6 N/mg(모발)의 인장 강도로 모발을 약화시켰다.

SEQUENCE LISTING <110> E.I. duPont de Nemours and Company Inc. Jiang, Xueping Rouviere, Pierre Gruber, Tanja <120> A NON-AQUEOUS STABLE COMPOSITION FOR DELIVERING SUBSTRATES FOR A DEPILATORY PRODUCT USING PERACIDS <130> CL5529 PCT <150> US 61/424,847 <151> 2010-12-20 <160> 339 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(960) <400> 1 atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat tta cag ccg gtt gac 144 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc aca tat aaa agc ttc 192 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc 240 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp 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20 25 30 Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp 35 40 45 Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp 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cttactacta cagacgagtc 480 ttcacggacg ctgtcagagc cgttgaagct gctgcttctt ttcctcaggt agatcaagaa 540 agaatcgtga tagctggagg cagtcagggt ggcggaatag cccttgcggt gagcgctctc 600 tcaaagaaag caaaggctct tctgtgcgat gtgccgtttc tgtgtcactt cagaagagca 660 gtacagcttg tggatacgca tccatacgcg gagatcacga actttctaaa gacccacaga 720 gacaaggaag aaatcgtgtt caggactctt tcctatttcg atggagtgaa cttcgcagcc 780 agagcgaaga tccctgcgct gttttctgtg ggtctcatgg acaacatttg tcctccttca 840 acggttttcg ctgcctacaa ttactacgct ggaccgaagg aaatcagaat ctatccgtac 900 aacaaccacg agggaggagg ctctttccaa gcggttgaac aggtgaaatt cttgaaaaaa 960 ctatttgaga aaggctaa 978 <210> 16 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 16 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 17 <211> 963 <212> DNA <213> Thermoanaerobacterium sp. <400> 17 atgggacttt tcgacatgcc attacaaaaa cttagagaat acactggtac aaatccatgc 60 cctgaagatt tcgatgagta ttggaatagg gctttagatg agatgaggtc agttgatcct 120 aaaattgaat tgaaagaaag tagctttcaa gtatcctttg cagaatgcta tgacttgtac 180 tttacaggtg ttcgtggtgc cagaattcat gcaaagtata taaaacctaa gacagaaggg 240 aaacatccag cgttgataag atttcatgga tattcgtcaa attcaggcga ctggaacgac 300 aaattaaatt acgtggcggc aggcttcacc gttgtggcta tggatgtaag aggtcaagga 360 gggcagtctc aagatgttgg cggtgtaact gggaatactt taaatgggca tattataaga 420 gggctagacg atgatgctga taatatgctt ttcaggcata ttttcttaga cactgcccaa 480 ttggctggaa tagttatgaa catgccagaa gttgatgaag atagagtggg agtcatggga 540 ccttctcaag gcggagggct gtcgttggcg tgtgctgcat tggagccaag ggtacgcaaa 600 gtagtatctg aatatccttt tttatctgac tacaagagag tttgggactt agaccttgca 660 aaaaacgcct atcaagagat tacggactat ttcaggcttt ttgacccaag gcatgaaagg 720 gagaatgagg tatttacaaa gcttggatat atagacgtta aaaaccttgc gaaaaggata 780 aaaggcgatg tcttaatgtg cgttgggctt atggaccaag tatgtccgcc atcaactgtt 840 tttgcagcct acaacaacat acagtcaaaa aaagatataa aagtgtatcc tgattatgga 900 catgaaccta tgagaggatt tggagattta gcgatgcagt ttatgttgga actatattca 960 taa 963 <210> 18 <211> 320 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium sp. <400> 18 Met Gly Leu Phe Asp Met Pro Leu Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Thr Asn Pro Cys Pro Glu Asp Phe Asp Glu Tyr Trp Asn Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Glu Met Arg Ser Val Asp Pro Lys Ile Glu Leu Lys Glu Ser Ser 35 40 45 Phe Gln Val Ser Phe Ala Glu Cys Tyr Asp Leu Tyr Phe Thr Gly Val 50 55 60 Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Ile Lys Pro Lys Thr Glu Gly 65 70 75 80 Lys His Pro Ala Leu Ile Arg Phe His Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Gly 85 90 95 Asp Trp Asn Asp Lys Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Thr Val Val 100 105 110 Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Gln Ser Gln Asp Val Gly Gly 115 120 125 Val Thr Gly Asn Thr Leu Asn Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Asp 130 135 140 Asp Ala Asp Asn Met Leu Phe Arg His Ile Phe Leu Asp Thr Ala Gln 145 150 155 160 Leu Ala Gly Ile Val Met Asn Met Pro Glu Val Asp Glu Asp Arg Val 165 170 175 Gly Val Met Gly Pro Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ser Leu Ala Cys Ala 180 185 190 Ala Leu Glu Pro Arg Val Arg Lys Val Val Ser Glu Tyr Pro Phe Leu 195 200 205 Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Asp Leu Asp Leu Ala Lys Asn Ala Tyr 210 215 220 Gln Glu Ile Thr Asp Tyr Phe Arg Leu Phe Asp Pro Arg His Glu Arg 225 230 235 240 Glu Asn Glu Val Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Val Lys Asn Leu 245 250 255 Ala Lys Arg Ile Lys Gly Asp Val Leu Met Cys Val Gly Leu Met Asp 260 265 270 Gln Val Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Asn Ile Gln 275 280 285 Ser Lys Lys Asp Ile Lys Val Tyr Pro Asp Tyr Gly His Glu Pro Met 290 295 300 Arg Gly Phe Gly Asp Leu Ala Met Gln Phe Met Leu Glu Leu Tyr Ser 305 310 315 320 <210> 19 <211> 978 <212> DNA <213> Bacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(978) <400> 19 atg aac ctt ttt gat atg ccc ctt gag gag ctg cag cat tac aag cct 48 Met Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro 1 5 10 15 gcc cag acc agg cag gat gat ttt gag tca ttc tgg aaa aag cgg att 96 Ala Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile 20 25 30 gag gag aac agt caa tat ccg ctg aat ata gaa gta atg gag cgg gtt 144 Glu Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val 35 40 45 tat ccg gtt ccg gga gtg aga gta tat gat att tat ttt gac ggg ttc 192 Tyr Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe 50 55 60 cgg aat tcc cgc atc cat ggg gtg tat gtt act cca gaa act ccg gga 240 Arg Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly 65 70 75 80 gcg gac act cct gcg gca gtg att ttt cac ggc tat aac tgg aac acg 288 Ala Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr 85 90 95 ctg cag ccg cat tac agc ttc aag cac gtg att cag ggg att cct gta 336 Leu Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val 100 105 110 ctg atg gtg gag gtg cgg gga caa aat ctc ttg tct cca gat aga aat 384 Leu Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn 115 120 125 cat tat ggg aat gga ggt ccg gga ggc tgg atg aca ctc ggc gtg atg 432 His Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met 130 135 140 gat ccc gat caa tat tat tac agc ctg gta tat atg gac tgc ttc cgc 480 Asp Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg 145 150 155 160 agc att gat gct gtc agg gaa ctg tcg agg aag aga agt gtg ttt gtg 528 Ser Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val 165 170 175 gaa ggc gga agc cag gga ggt gca ctg gcg att gcc gca gcc gcc ctg 576 Glu Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu 180 185 190 cag gat gac atc ctg ctt gca ctc gcc gac atc cct ttt ctc acc cat 624 Gln Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His 195 200 205 ttc aag cgt tcc gtg gag ctt tcc tcg gat gga ccg tat cag gag att 672 Phe Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile 210 215 220 tcc cac tac ttc aaa gtt cat gat cct ctt cat caa acg gaa gag cag 720 Ser His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln 225 230 235 240 gta tat cag acg ctc agc tat gtg gac tgc atg aac atg gcc agc atg 768 Val Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met 245 250 255 gtt gaa tgt cca gtc ctt ctt tca gcc ggt ctg gaa gac atc gtt tgt 816 Val Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys 260 265 270 ccc ccg tcc agt gca ttt gca ctg ttc aac cat ctc ggc ggg cca aaa 864 Pro Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys 275 280 285 gaa ata cgg gcc tat ccg gaa tac gcc cat gaa gta ccg gct gtc cat 912 Glu Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His 290 295 300 gaa gag gaa aag ctg aag ttt ata tct tca agg cta aaa aat aga gaa 960 Glu Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu 305 310 315 320 aag agg tgc cgg cca tga 978 Lys Arg Cys Arg Pro 325 <210> 20 <211> 325 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 20 Met Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Ala Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile 20 25 30 Glu Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val 35 40 45 Tyr Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe 50 55 60 Arg Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly 65 70 75 80 Ala Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr 85 90 95 Leu Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val 100 105 110 Leu Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn 115 120 125 His Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met 130 135 140 Asp Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg 145 150 155 160 Ser Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val 165 170 175 Glu Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu 180 185 190 Gln Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His 195 200 205 Phe Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile 210 215 220 Ser His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln 225 230 235 240 Val Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met 245 250 255 Val Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys 260 265 270 Pro Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys 275 280 285 Glu Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His 290 295 300 Glu Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu 305 310 315 320 Lys Arg Cys Arg Pro 325 <210> 21 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus halodurans <400> 21 ttagagatca gataaaaatt gaaaaatccg atcacgatgg cctggcaaat cttcgtgagc 60 aaagtctgga tataactcga tactttttgt cgtcgtgagt ttgttataca tggcaaattg 120 tgtagacggc gggcaaaccg tatccattaa cccaacagca agtaagactt ctccctttac 180 gagtggagca agatgctgaa tatcaatata gcctagcttc gtaaagattt cagcctcacg 240 tcggtgctgt ggatcaaagc gacgaaaata cgtttgcaat tcgtcataag ctttctcggc 300 taaatccatc tcccatacgc gttggtaatc gctaaggaaa ggataaacag gagctacctt 360 tttaattttc ggttccaaag ccgcacaagc aatcgctaag gcccctcctt gtgaccaacc 420 tgtcactgcc acgcgctctt catcgacttc aggaaggttc atcacaatgt tggcaagctg 480 agccgtatca agaaacacat gacggaacaa taattgatca gcattatcat cgagtccgcg 540 tattatatga ccggaatgag tattcccctt cacgcctcct gtgtcttcag acaagcctcc 600 ttgcccgcga acgtccattg caagaacaga atatccgagg gctgcgtaat gaagtaaacc 660 cgtccattcc cccgcattca tcgtatatcc gtgaaaatga ataaccgccg ggtgtgtccc 720 gctcgtgtgt cttgggcgca cgtattttgc gtgaattcta gcacccctaa cccctgtaaa 780 atataggtgg aagcattctg catacgtggt ttgaaaatca ctcggtatga gctctacgtt 840 tggatttacc tttctcatct cttgtaaagc acgatcccaa tactcagtaa agtcatctgg 900 ctttggatta cgtcccatgt actcttttaa ttcggttaac ggcatgtcta ttagtggcat 960 <210> 22 <211> 319 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 22 Met Pro Leu Ile Asp Met Pro Leu Thr Glu Leu Lys Glu Tyr Met Gly 1 5 10 15 Arg Asn Pro Lys Pro Asp Asp Phe Thr Glu Tyr Trp Asp Arg Ala Leu 20 25 30 Gln Glu Met Arg Lys Val Asn Pro Asn Val Glu Leu Ile Pro Ser Asp 35 40 45 Phe Gln Thr Thr Tyr Ala Glu Cys Phe His Leu Tyr Phe Thr Gly Val 50 55 60 Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Val Arg Pro Arg His Thr Ser 65 70 75 80 Gly Thr His Pro Ala Val Ile His Phe His Gly Tyr Thr Met Asn Ala 85 90 95 Gly Glu Trp Thr Gly Leu Leu His Tyr Ala Ala Leu Gly Tyr Ser Val 100 105 110 Leu Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ser Glu Asp Thr Gly 115 120 125 Gly Val Lys Gly Asn Thr His Ser Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp 130 135 140 Asp Asn Ala Asp Gln Leu Leu Phe Arg His Val Phe Leu Asp Thr Ala 145 150 155 160 Gln Leu Ala Asn Ile Val Met Asn Leu Pro Glu Val Asp Glu Glu Arg 165 170 175 Val Ala Val Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Cys 180 185 190 Ala Ala Leu Glu Pro Lys Ile Lys Lys Val Ala Pro Val Tyr Pro Phe 195 200 205 Leu Ser Asp Tyr Gln Arg Val Trp Glu Met Asp Leu Ala Glu Lys Ala 210 215 220 Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Tyr Phe Arg Arg Phe Asp Pro Gln His Arg 225 230 235 240 Arg Glu Ala Glu Ile Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Ile Gln His 245 250 255 Leu Ala Pro Leu Val Lys Gly Glu Val Leu Leu Ala Val Gly Leu Met 260 265 270 Asp Thr Val Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Met Tyr Asn Lys Leu 275 280 285 Thr Thr Thr Lys Ser Ile Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Glu Asp 290 295 300 Leu Pro Gly His Arg Asp Arg Ile Phe Gln Phe Leu Ser Asp Leu 305 310 315 <210> 23 <211> 954 <212> DNA <213> Bacillus clausii <400> 23 atgccattag tcgatatgcc gttgcgcgag ttgttagctt atgaaggaat aaaccctaaa 60 ccagcagatt ttgaccaata ctggaaccgg gccaaaacgg aaattgaagc gattgatccc 120 gaagtcactc tagtcgaatc ttctttccag tgttcgtttg caaactgtta ccatttctat 180 tatcgaagcg ctggaaatgc aaaaatccat gcgaaatacg tacagccaaa agcaggggag 240 aagacgccag cagtttttat gttccatggg tatggggggc gttcagccga atggagcagc 300 ttgttaaatt atgtagcggc gggtttttct gttttctata tggacgtgcg tggacaaggt 360 ggaacttcag aggatcctgg gggcgtaagg gggaatacat ataggggcca cattattcgc 420 ggcctcgatg ccgggccaga cgcacttttt taccgcagcg ttttcttgga caccgtccaa 480 ttggttcgtg ctgctaaaac attgcctcac atcgataaaa cacggcttat ggccacaggg 540 tggtcgcaag ggggcgcctt aacgcttgcc tgtgctgccc ttgttcctga aatcaagcgt 600 cttgctccag tatacccgtt tttaagcgat tacaagcgag tgtggcaaat ggatttagcg 660 gttcgttcgt ataaagaatt ggctgattat ttccgttcat acgatccgca acataaacgc 720 catggcgaaa tttttgaacg ccttggctac atcgatgtcc agcatcttgc tgaccggatt 780 caaggagatg tcctaatggg agttggttta atggatacag aatgcccgcc gtctacccaa 840 tttgctgctt ataataaaat aaaggctaaa aaatcgtatg agctctatcc tgattttggc 900 catgagcacc ttccaggaat gaacgatcat atttttcgct ttttcactag ttga 954 <210> 24 <211> 317 <212> PRT <213> Bacillus clausii <400> 24 Met Pro Leu Val Asp Met Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ala Tyr Glu Gly 1 5 10 15 Ile Asn Pro Lys Pro Ala Asp Phe Asp Gln Tyr Trp Asn Arg Ala Lys 20 25 30 Thr Glu Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Val Thr Leu Val Glu Ser Ser 35 40 45 Phe Gln Cys Ser Phe Ala Asn Cys Tyr His Phe Tyr Tyr Arg Ser Ala 50 55 60 Gly Asn Ala Lys Ile His Ala Lys Tyr Val Gln Pro Lys Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Thr Pro Ala 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Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca 336 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att 384 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 tca ccg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att ctt gat 432 Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg 480 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala 145 150 155 160 ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt 528 Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly 165 170 175 gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg 576 Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc 624 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa 672 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag 720 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga 768 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg 816 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 ccg cca tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa 864 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt 912 Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe 290 295 300 caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa 960 Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly 305 310 315 <210> 26 <211> 318 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 26 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly 65 70 75 80 Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala 145 150 155 160 Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly 165 170 175 Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe 290 295 300 Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly 305 310 315 <210> 27 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 27 Met Ala Phe Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Arg Glu Thr Leu 20 25 30 Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp 35 40 45 Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Val Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Thr Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Glu Gly 325 <210> 28 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 28 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 29 <211> 326 <212> PRT <213> Thermotoga lettingae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 29 Met Val Tyr Phe Asp Met Pro Leu Glu Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Asp Phe Trp Lys Gln Thr Ile 20 25 30 His Glu Thr Arg Gly Tyr Phe Gln Glu Pro Ile Leu Lys Lys Val Asp 35 40 45 Phe Tyr Leu Gln Asn Val Glu Thr Phe Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Lys Ile Lys Gly Trp Leu Ile Leu Pro Lys Phe Arg Asn 65 70 75 80 Gly Lys Leu Pro Cys Val Val Glu Phe Val Gly Tyr Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro Tyr Asp Trp Leu Leu Trp Ser Ala Ala Gly Tyr Ala His 100 105 110 Phe Ile Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Asn Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Glu Asp Asn Pro Ser Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Leu Thr Lys Gly Val Leu Asn Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Met Asp Ala Phe Met Ala Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Glu Gln 165 170 175 Ile Asp Ser Gln Thr Ile Ile Leu Ser Gly Ala Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Ser Lys Val Met Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Tyr Lys Arg Ala Val Gln Ile Thr 210 215 220 Asp Ser Met Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Arg Tyr Cys Lys Thr His Ile 225 230 235 240 Asp Lys Ile Gln Thr Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Cys Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asp Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Glu Lys Asp Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe His Thr Leu Glu Lys Leu Lys Phe Val Lys Lys 305 310 315 320 Thr Ile Ser Met Arg Glu 325 <210> 30 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga petrophilia <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 30 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Gly Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Asn Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Met Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 31 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga sp. RQ2a <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 31 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 32 <211> 329 <212> PRT <213> Thermotoga sp. RQ2b <220> <221> MISC_FEATURE <222> (278)..(278) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 32 Met Ala Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Lys Leu Arg Ser Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Asp Arg Tyr Glu Glu Glu Asp Phe Asp Leu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Lys Phe Pro Leu Asp Pro Ile Phe Glu Arg Val Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Glu Asn Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Ala Trp Leu Ile Leu Pro Val Val Lys Lys 65 70 75 80 Glu Glu Arg Leu Pro Cys Ile Val Glu Phe Ile Gly Tyr Arg Gly Gly 85 90 95 Arg Gly Phe Pro Phe Asp Trp Leu Phe Trp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala 100 105 110 His Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Thr Ser Arg Val Lys Gly 115 120 125 Asp Thr Pro Asp Tyr Cys Asp Glu Pro Ile Asn Pro Gln Phe Pro Gly 130 135 140 Phe Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg 145 150 155 160 Val Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Thr Ala Ser Ser Phe Pro 165 170 175 Gly Ile Asp Pro Glu Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Ser Gln Gly Gly 180 185 190 Gly Ile Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ser Glu Ile Pro Lys Ala Leu 195 200 205 Val Ser Asn Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Ile 210 215 220 Thr Asp Asn Ala Pro Tyr Ser Glu Ile Val Asn Tyr Leu Lys Val His 225 230 235 240 Arg Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly 245 250 255 Val Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Ala 260 265 270 Leu Met Asp Lys Thr Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn 275 280 285 His Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Lys Val Tyr Pro Phe Asn Glu His 290 295 300 Glu Gly Gly Glu Ser Phe Gln Arg Met Glu Glu Leu Arg Phe Met Lys 305 310 315 320 Arg Ile Leu Lys Gly Glu Phe Lys Ala 325 <210> 33 <211> 326 <212> PRT <213> Thermotoga lettingae <400> 33 Met Val Tyr Phe Asp Met Pro Leu Glu Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Asp Phe Trp Lys Gln Thr Ile 20 25 30 His Glu Thr Arg Gly Tyr Phe Gln Glu Pro Ile Leu Lys Lys Val Asp 35 40 45 Phe Tyr Leu Gln Asn Val Glu Thr Phe Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Lys Ile Lys Gly Trp Leu Ile Leu Pro Lys Phe Arg Asn 65 70 75 80 Gly Lys Leu Pro Cys Val Val Glu Phe Val Gly Tyr Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro Tyr Asp Trp Leu Leu Trp Ser Ala Ala Gly Tyr Ala His 100 105 110 Phe Ile Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Asn Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Glu Asp Asn Pro Ser Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Leu Thr Lys Gly Val Leu Asn Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Met Asp Ala Phe Met Ala Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Glu Gln 165 170 175 Ile Asp Ser Gln Thr Ile Ile Leu Ser Gly Ala Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Ser Lys Val Met Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Tyr Lys Arg Ala Val Gln Ile Thr 210 215 220 Asp Ser Met Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Arg Tyr Cys Lys Thr His Ile 225 230 235 240 Asp Lys Ile Gln Thr Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Cys Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asp Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Glu Lys Asp Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe His Thr Leu Glu Lys Leu Lys Phe Val Lys Lys 305 310 315 320 Thr Ile Ser Met Arg Glu 325 <210> 34 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga petrophilia <400> 34 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Gly Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Asn Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Met Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 35 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga sp. RQ2a <400> 35 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 36 <211> 329 <212> PRT <213> Thermotoga sp. RQ2b <400> 36 Met Ala Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Lys Leu Arg Ser Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Asp Arg Tyr Glu Glu Glu Asp Phe Asp Leu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Lys Phe Pro Leu Asp Pro Ile Phe Glu Arg Val Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Glu Asn Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Ala Trp Leu Ile Leu Pro Val Val Lys Lys 65 70 75 80 Glu Glu Arg Leu Pro Cys Ile Val Glu Phe Ile Gly Tyr Arg Gly Gly 85 90 95 Arg Gly Phe Pro Phe Asp Trp Leu Phe Trp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala 100 105 110 His Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Thr Ser Arg Val Lys Gly 115 120 125 Asp Thr Pro Asp Tyr Cys Asp Glu Pro Ile Asn Pro Gln Phe Pro Gly 130 135 140 Phe Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg 145 150 155 160 Val Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Thr Ala Ser Ser Phe Pro 165 170 175 Gly Ile Asp Pro Glu Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Ser Gln Gly Gly 180 185 190 Gly Ile Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ser Glu Ile Pro Lys Ala Leu 195 200 205 Val Ser 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300 aagctgaact acgttgcggc tggttttacc gtagtagcga tggacgctcg tggccagggt 360 ggccaatctc aggacgtcgg cggtgttaat ggcaacaccc tgaacggtca catcatccgt 420 ggcctggacg atgatgcaga taacatgctg ttccgtcata ttttcctgga caccgcgcag 480 ctggctggta tcgttatgaa catgccggaa atcgatgagg accgcgtagc tgttatgggt 540 ccgtcccagg gcggcggtct gtccctggcg tgtgcggctc tggaacctaa aatccgtaaa 600 gtagtgtccg aatatccgtt cctgagcgac tacaagcgtg tgtgggatct ggatctggcc 660 aaaaatgcgt accaagaaat cactgactat ttccgtctgt tcgacccacg ccacgaacgt 720 gagaacgagg tttttactaa actgggttac attgacgtaa agaacctggc gaaacgtatc 780 aaaggtgatg ttctgatgtg cgtgggcctg atggatcagg tctgcccgcc gagcaccgta 840 tttgcagcat acaacaacat ccagtccaag aaggacatca aagtctaccc ggactatggt 900 cacgaaccga tgcgtggctt cggtgacctg gctatgcagt tcatgctgga actgtattct 960 <210> 38 <211> 320 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium saccharolyticum <400> 38 Met Gly Leu Phe Asp Met Pro Leu Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Thr Asn Pro Cys Pro Glu Asp Phe Asp Glu Tyr Trp Asp Arg Ala Leu 20 25 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attttatccg agtttgattt tgttgatgaa acaaatataa gtgcacaagg tgcttctcaa 540 ggtggagcgc ttgccgttgc ttgcgccgca ctttctcctc ttataaaaaa ggtgactgcc 600 acttacccct ttctttcaga ttatcgcaaa gcttatgagc ttggtgccga ggaatctgct 660 ttcgaagaac ttccatattg gtttcagttt aaagatccac ttcatctaag agaagactgg 720 ttttttaatc agttggaata cattgatatt caaaatttag caccaagaat taaggctgag 780 gtcatttgga tcctaggcgg caaagatact gttgttcctc cgattacgca aatggcggct 840 tacaataaaa tacaaagtaa aaaatctctc tatgtcttac ctgaatacgg ccatgaatat 900 cttcctaaaa ttagcgactg gttaagagag aatcaataa 939 <210> 40 <211> 312 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 40 Met Thr Lys Ile Asn Asn Trp Gln Asp Tyr Gln Gly Ser Ser Leu Lys 1 5 10 15 Pro Glu Asp Phe Asp Lys Phe Trp Asp Glu Lys Ile Asn Leu Val Ser 20 25 30 Asn His Gln Phe Glu Phe Glu Leu Ile Glu Lys Asn Leu Ser Ser Lys 35 40 45 Val Val Asn Phe Tyr His Leu Trp Phe Thr Ala Ile Asp Gly Ala Lys 50 55 60 Ile His Ala Gln Leu Ile Val Pro Lys Asn Leu Lys Glu Lys Tyr Pro 65 70 75 80 Ala Ile Leu Gln Phe His Gly Tyr 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gctcaactat ttcgactgcg tcaacttcgc ccggcggtcc 780 aaggcgccgg cgctgttttc ggtggccctg atggacgaag tctgcccgcc ctctaccgtg 840 tatggcgcat tcaatgccta tgcaggcgaa aagaccatca cagagtacga attcaacaat 900 catgaaggcg ggcaaggcta tcaagagcgc caacagatga cgtggctcag caggctgttc 960 ggtgtcggct ga 972 <210> 42 <211> 323 <212> PRT <213> Mesorhizobium loit <400> 42 Met Pro Phe Pro Asp Leu Ile Gln Pro Glu Leu Gly Ala Tyr Val Ser 1 5 10 15 Ser Val Gly Met Pro Asp Asp Phe Ala Gln Phe Trp Thr Ser Thr Ile 20 25 30 Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly Gly Glu Val Ser Ile Val Gln Ala Gln 35 40 45 Thr Thr Leu Lys Ala Val Gln Ser Phe Asp Val Thr Phe Pro Gly Tyr 50 55 60 Gly Gly His Pro Ile Lys Gly Trp Leu Ile Leu Pro Thr His His Lys 65 70 75 80 Gly Arg Leu Pro Leu Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Leu Ala His Glu Gln Leu His Trp Ala Ala Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 110 Phe Arg Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Asp Trp Ser Val Gly Glu 115 120 125 Thr Ala Asp Pro Val Gly Ser Thr Ser Ser Ile Pro Gly Phe Met Thr 130 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gaagccggct 60 gattttgctg acttttggag tcgagcgttg gaggaattat ctgcccaatc gttgcattat 120 gagctgattc cggcaacatt tcaaacgaca gtggcgagtt gctaccattt gtatttcacg 180 ggagtcggcg gggctagagt ccattgtcag ttagtaaaac cgagagagca gaagcagaaa 240 ggcccggggt tggtatggtt tcatggctac catacgaata gcggcgattg ggtcgataaa 300 ctggcatatg ctgcggcagg ttttactgta ttggcgatgg attgccgcgg ccaaggagga 360 aaatcagagg ataatttgca agtgaaaggc ccaacattga agggccatat tattcgcgga 420 attgaggatc caaatcctca tcatctttat tatcgaaatg tttttttaga tacagttcag 480 gcggtaagaa ttttatgctc tatggatcat attgatcgtg aacgaattgg tgtatatggc 540 gcttcccaag gaggagcgtt ggcattagcg tgtgctgctc tggaaccatc ggtggtgaaa 600 aaagcggttg tgctctatcc atttttatcg gattataagc gggcgcaaga gttggatatg 660 aaaaataccg cgtatgagga aattcattat tattttcgat ttttagatcc cacacatgag 720 cgggaagaag aagtatttta caaactaggc tatattgata ttcaactctt agccgatcgg 780 atttgtgccg atgttttatg ggctgttgcg ctagaagacc atatttgtcc cccgtccaca 840 caatttgctg tttataataa aattaagtca aaaaaagaca tggttttgtt ttacgagtat 900 ggtcatgagt atttaccgac tatgggagac cgtgcttatc tgtttttttg cccgatcttc 960 tttccaatcc aaaagagaaa cgttaagtaa 990 <210> 44 <211> 329 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 44 Met Phe Asp Met Pro Leu Ala Gln Leu Gln Lys Tyr Met Gly Thr Asn 1 5 10 15 Pro Lys Pro Ala Asp Phe Ala Asp Phe Trp Ser Arg Ala Leu Glu Glu 20 25 30 Leu Ser Ala Gln Ser Leu His Tyr Glu Leu Ile Pro Ala Thr Phe Gln 35 40 45 Thr Thr Val Ala Ser Cys Tyr His Leu Tyr Phe Thr Gly Val Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Val His Cys Gln Leu Val Lys Pro Arg Glu Gln Lys Gln Lys 65 70 75 80 Gly Pro Gly Leu Val Trp Phe His Gly Tyr His Thr Asn Ser Gly Asp 85 90 95 Trp Val Asp Lys Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Phe Thr Val Leu Ala 100 105 110 Met Asp Cys Arg Gly Gln Gly Gly Lys Ser Glu Asp Asn Leu Gln Val 115 120 125 Lys Gly Pro Thr Leu Lys Gly His Ile Ile Arg Gly Ile Glu Asp Pro 130 135 140 Asn Pro His His Leu Tyr Tyr Arg Asn Val Phe Leu Asp Thr Val Gln 145 150 155 160 Ala Val Arg Ile Leu Cys Ser Met Asp His Ile Asp Arg Glu Arg Ile 165 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ggaatctcac ctgaaaaccg tggaggcata tgacgttact 180 ttttctggtt accgtggcca gcgtatcaaa ggctggctgc tggttccgaa actggaggaa 240 gaaaaactgc cgtgcgtagt tcagtacatc ggttacaacg gtggccgtgg ctttccgcac 300 gattggctgt tctggccgtc tatgggctac atttgcttcg tcatggatac tcgtggtcag 360 ggttccggct ggctgaaagg cgatactccg gattatccgg agggcccggt agacccgcag 420 taccctggct tcatgacgcg tggtattctg gatccgcgta cctattacta tcgccgcgtt 480 tttaccgatg cagttcgtgc cgtagaggcc gcggcttctt tccctcaggt tgacctggag 540 cgtattgtta tcgctggtgg ctcccagggt ggcggcatcg ccctggcggt atctgcgctg 600 agcaagaaag ctaaggcact gctgtgtgac gtcccgttcc tgtgtcactt ccgtcgcgct 660 gttcagctgg tagataccca tccgtacgcg gagattacta acttcctgaa aactcaccgc 720 gacaaagaag aaatcgtttt ccgcaccctg tcctatttcg acggcgttaa cttcgcggct 780 cgtgcaaaaa ttccggcact gttctctgtt ggtctgatgg acgacatcag ccctccttct 840 accgttttcg cggcatataa ctattatgcg ggtccgaaag aaatccgtat ctatccgtac 900 aacaaccacg aaggcggtgg tggctttcag gctgttgaac aagtgaaatc cctgaagaaa 960 ctgtttgaga agggctaa 978 <210> 46 <211> 325 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construct <400> 182 Ser Thr Leu His Lys Tyr Lys Ser Gln Asp Pro Thr Pro His His 1 5 10 15 <210> 183 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic hair-binding peptide <400> 183 Gly Met Pro Ala Met His Trp Ile His Pro Phe Ala 1 5 10 <210> 184 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic hair-binding peptide <400> 184 His Asp His Lys Asn Gln Lys Glu Thr His Gln Arg His Ala Ala 1 5 10 15 <210> 185 <211> 20 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 185 His Asn His Met Gln Glu Arg Tyr Thr Asp Pro Gln His Ser Pro Ser 1 5 10 15 Val Asn Gly Leu 20 <210> 186 <211> 20 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic hair-binding peptide <400> 186 Thr Ala Glu Ile Gln Ser Ser Lys Asn Pro Asn Pro His Pro Gln Arg 1 5 10 15 Ser Trp Thr Asn 20 <210> 187 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Dyed-hair-bindg peptide <400> 187 Ser Ser Ala Asp Phe Ala Ser Phe Gly Phe Phe Gly Phe Ser Ala Ala 1 5 10 15 Ser 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acggcgtcaa tttcgcagcg 780 cgtgcgaaga ttccagcgtt gttcagcgtt ggtctgatgg ataacatttc cccgccttct 840 accgttttcg cggcctacaa ctactacgca ggcccgaaag agattcgcat ctacccatat 900 aacaaccatg agggtggcgg tagcttccag gcagttgagc aagttaagtt cctgaagaag 960 ctgttcgaaa agggtggtcc gggttcgggt ggtgcgggca gcccgggtag cgccggtggc 1020 cctggatccc ctagcgcaca aagccaactg ccggacaagc atagcggcct gcacgaacgt 1080 gctccgcagc gttacggtcc ggaaccggaa ccggaaccgg agccgatccc agaaccgccg 1140 aaagaggccc cagttgttat tgaaaagccg aagccgaaac cgaagccgaa gccgaagccg 1200 cctgcgcatg atcataagaa tcagaaggaa acccatcagc gtcacgccgc tggttcgggc 1260 ggtggtggta gcccgcacca tcaccaccac cac 1293 <210> 287 <211> 1305 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 287 atggcattct tcgacctgcc actggaggag ctgaagaaat atcgtcctga gcgctatgaa 60 gaaaaggatt ttgatgagtt ctgggaggaa actctggcag aaagcgagaa attcccgctg 120 gacccggtgt ttgaacgtat ggagagccat ttgaaaaccg tggaagccta cgatgtgacc 180 tttagcggct atcgtggtca acgcattaaa ggttggctgc tggtgcctaa gctggaagaa 240 gagaagttgc cttgcgtggt gcaatacatt ggttacaacg gtggtcgtgg ttttccgcac 300 gattggttgt tctggccgag catgggttac atttgctttg tgatggatac ccgcggtcaa 360 ggtagcggtt ggctgaaagg cgacaccccg gattacccgg agggtccagt cgacccacag 420 tacccgggtt ttatgacccg tggtatcctt gacccgcgta cctactacta ccgtcgtgtg 480 ttcaccgacg cggtacgtgc agttgaggca gccgcgtcct tcccacaggt tgaccaggaa 540 cgcatcgtga ttgcgggtgg ctcgcaaggt ggtggtatcg cattggcggt tagcgctctg 600 tccaagaaag caaaagcact gctgtgcgac gtgccgtttc tgtgtcactt ccgtcgtgca 660 gttcagctgg ttgatacgca cccttacgcc gaaattacca actttctgaa aacgcaccgc 720 gataaggaag aaatcgtgtt ccgcaccctg agctattttg acggcgtcaa tttcgcagcg 780 cgtgcgaaga ttccagcgtt gttcagcgtt ggtctgatgg ataacatttc cccgccttct 840 accgttttcg cggcctacaa ctactacgca ggcccgaaag agattcgcat ctacccatat 900 aacaaccatg agggtggcgg tagcttccag gcagttgagc aagttaagtt cctgaagaag 960 ctgttcgaaa agggtggtcc gggttcgggt ggtgcgggca gcccgggtag cgccggtggc 1020 cctggatccg cgcaaagcca actgccggac aaacatagcg gtctgcacga gcgtgcgccg 1080 cagcgttacg gtagcggtac ggcggaaatt caatccagca agaacccgaa cccgcacccg 1140 cagcgcagct ggaccaatgg cagcggtcat aatcacatgc aagagcgtta cacggacccg 1200 cagcacagcc cgagcgttaa tggtttgggt agcggccacg accataagaa tcagaaagaa 1260 acccatcaac gccacgcggc gtccagccac caccaccatc accac 1305 <210> 288 <211> 431 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 288 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp 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aaagcggtcg gacagtgctc cgagaacggg tgcgcataga 1140 aattgcatca acgcatatag cgctagcagc acgccatagt gactggcgat gctgtcggaa 1200 tggacgatat cccgcaagag gcccggcagt accggcataa ccaagcctat gcctacagca 1260 tccagggtga cggtgccgag gatgacgatg agcgcattgt tagatttcat acacggtgcc 1320 tgactgcgtt agcaatttaa ctgtgataaa ctaccgcatt aaagcttgca gtggcggttt 1380 tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc 1440 aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc 1500 agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat 1560 cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg 1620 ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt 1680 tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc 1740 ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca 1800 ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg 1860 gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg 1920 atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg 1980 cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct 2040 taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt 2100 tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg 2160 actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctagacagg 2220 cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 2280 tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt 2340 caagcttatc gatgataagc tgtcaaacat gagaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg 2400 atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 2460 acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 2520 atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 2580 agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 2640 cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 2700 gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 2760 cccgaagaac gttttccaat 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cggaaccgga accggaaccg 1080 gagccgatcc cagaaccgcc gaaagaggcc ccagttgtta ttgaaaagcc gaagccgaaa 1140 ccgaagccga agccgaagcc gcctgcgcat gatcataaga atcagaagga aacccatcag 1200 cgtcacgccg ctggttcggg cggtggtggt agcccgcacc atcaccacca ccac 1254 <210> 319 <211> 418 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 319 Met Thr Lys Ile Asn Asn Trp Gln Asp Tyr Gln Gly Ser Ser Leu Lys 1 5 10 15 Pro Glu Asp Phe Asp Lys Phe Trp Asp Glu Lys Ile Asn Leu Val Ser 20 25 30 Asn His Gln Phe Glu Phe Glu Leu Ile Glu Lys Asn Leu Ser Ser Lys 35 40 45 Val Val Asn Phe Tyr His Leu Trp Phe Thr Ala Ile Asp Gly Ala Lys 50 55 60 Ile His Ala Gln Leu Ile Val Pro Lys Asn Leu Lys Glu Lys Tyr Pro 65 70 75 80 Ala Ile Leu Gln Phe His Gly Tyr His Cys Asp Ser Gly Asp Trp Val 85 90 95 Asp Lys Ile Gly Ile Val Ala Glu Gly Asn Val Val Leu Ala Leu Asp 100 105 110 Cys Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ser Gln Asp Asn Ile Gln Thr Met Gly 115 120 125 Met Thr Met Lys Gly Leu Ile Val Arg Gly Ile Asp Glu Gly Tyr Glu 130 135 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tctgaacggc gcaagctatt tgccgagctg tctggcgacc 240 cacctgccgc tggatctggt gattatcatg ttgggcacca atgataccaa agcttatttc 300 cgccgcaccc cgctggacat cgcgctgggc atgagcgtct tggtgacgca ggttctgact 360 agcgctggcg gtgtcggtac tacgtaccct gcgccgaaag tcctggtggt tagcccgcca 420 ccgctggcgc cgatgccgca cccgtggttc caactgattt ttgaaggcgg tgagcaaaag 480 acgaccgagt tggcccgtgt ttacagcgcg ttggcgagct ttatgaaagt tccgtttttc 540 gacgcgggca gcgttattag caccgatggc gtggacggta tccatttcac cgaagcaaat 600 aaccgtgacc tgggtgtggc cctggctgaa caagtgcgca gcctgctggg tccgggctcc 660 ggtggtgccg gttcgccggg tagcgcaggc ggtcctggat ccggcaaagg caagggtaag 720 ggtaaaggta aacatcatca ccaccaccac 750 <210> 329 <211> 250 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 329 Met Ala Lys Arg Ile Leu Cys Phe Gly Asp Ser Leu Thr Trp Gly Trp 1 5 10 15 Val Pro Val Glu Asp Gly Ala Pro Thr Glu Arg Phe Ala Pro Asp Val 20 25 30 Arg Trp Thr Gly Val Leu Ala Gln Gln Leu Gly Ala Asp Phe Glu Val 35 40 45 Ile Glu Glu Gly Leu Val Ala Arg Thr 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tggcgcaggc 840 agcccgggta gcgcaggtgg tccgggatcc ccgagcgccc aaagccagct gcctgataag 900 cacagcggtc tgcatgagcg tgctcctcaa cgttatggtc cggagccgga accggaacca 960 gagccgatcc cggaaccgcc gaaggaagcc ccggtcgtga ttgaaaaacc gaaaccgaag 1020 ccgaaaccaa agccgaagcc gccagcgcat gaccacaaga atcagaaaga aacgcaccaa 1080 cgtcacgccg ctggctctgg cggtggcggt tcgccgcatc atcaccacca ccat 1134 <210> 331 <211> 378 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 331 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Pro Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 45 Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro 50 55 60 Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser Pro Ser Ala Gln Ser Gln Leu Pro Asp Lys His Ser Gly Leu 290 295 300 His Glu Arg Ala Pro Gln Arg Tyr Gly Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 305 310 315 320 Glu Pro Ile Pro Glu Pro Pro Lys Glu Ala Pro Val Val Ile Glu Lys 325 330 335 Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Pro Ala His Asp His 340 345 350 Lys Asn Gln Lys Glu Thr His Gln Arg His Ala Ala Gly Ser Gly Gly 355 360 365 Gly Gly Ser Pro His His His His His His 370 375 <210> 332 <211> 1134 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 332 atgtccacct tcgttgcgaa agatggcacc cagatttact ttaaagactg gggcagcggc 60 aagccggttc tgtttagcca cggctggccg ctggacgcgg atatgtggga gtatcagatg 120 gagtacctga gcagccgtgg ttaccgtacc atcgccttcg atcgccgtgg ttttggtcgc 180 agcgatcaac cgtggaccgg caatgattat gacacgttcg cagatgacat tgcccagctg 240 atcgagcacc tggacctgaa agaggttacc ctggtcggtt tcagcatggg cggtggtgac 300 gtcgcgcgct acattgcgcg tcatggttcc gctcgtgtgg cgggtctggt cctgctgggt 360 gctgtaacgc cactgtttgg tcaaaagccg gattatccgc agggtgtgcc gttggatgtg 420 tttgcgcgct tcaaaaccga gttgctgaaa gaccgtgcgc aattcatcag cgacttcaac 480 gcaccgtttt acggtatcaa caaaggccaa gttgtcagcc agggcgttca aacgcagacg 540 ctgcagattg cgctgctggc aagcctgaag gcgaccgttg actgcgtgac ggcttttgcg 600 gaaactgatt ttcgtccgga catggcgaag attgatgttc cgaccttggt gattcacggt 660 gacggcgatc agatcgtgcc gttcgaaacc accggtaagg ttgcggccga gctgatcaaa 720 ggtgcggagc tgaaagtgta caaggacgcg cctcacggct tcgcagtcac tcatgcacag 780 caactgaacg aggacttgct ggccttcttg aaacgcggtc cgggctccgg tggcgcaggc 840 agcccgggta gcgcaggtgg tccgggatcc ccgagcgcgc aatcccagtt gccggatcgc 900 cacagcggtc tgcatgagcg tgccccgcaa cgttacggtc cagagccgga gccggaaccg 960 gagccgattc cggaaccacc gcgcgaggct ccggtggtta tcgaacgtcc acgtccacgc 1020 ccgcgcccgc gtccgcgtcc accggcgcac gaccaccgta atcaacgtga aacccaccag 1080 cgccacgcag ccggcagcgg tggtggtggt agcccgcatc atcaccatca tcac 1134 <210> 333 <211> 378 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 333 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Pro Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 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Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser Pro Ser Ala Gln Ser Gln Leu Pro Asp Arg His Ser Gly Leu 290 295 300 His Glu Arg Ala Pro Gln Arg Tyr Gly Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 305 310 315 320 Glu Pro Ile Pro Glu Pro Pro Arg Glu Ala Pro Val Val Ile Glu Arg 325 330 335 Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Pro Ala His Asp His 340 345 350 Arg Asn Gln Arg Glu Thr His Gln Arg His Ala Ala Gly Ser Gly Gly 355 360 365 Gly Gly Ser Pro His His His His His His 370 375 <210> 334 <211> 1146 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 334 atgtccacct tcgttgcgaa agatggcacc cagatttact ttaaagactg gggcagcggc 60 aagccggttc tgtttagcca cggctggccg ctggacgcgg atatgtggga gtatcagatg 120 gagtacctga gcagccgtgg ttaccgtacc atcgccttcg atcgccgtgg ttttggtcgc 180 agcgatcaac cgtggaccgg caatgattat gacacgttcg cagatgacat tgcccagctg 240 atcgagcacc tggacctgaa agaggttacc ctggtcggtt tcagcatggg cggtggtgac 300 gtcgcgcgct acattgcgcg tcatggttcc gctcgtgtgg cgggtctggt cctgctgggt 360 gctgtaacgc cactgtttgg tcaaaagccg gattatccgc agggtgtgcc gttggatgtg 420 tttgcgcgct tcaaaaccga gttgctgaaa gaccgtgcgc aattcatcag cgacttcaac 480 gcaccgtttt acggtatcaa caaaggccaa gttgtcagcc agggcgttca aacgcagacg 540 ctgcagattg cgctgctggc aagcctgaag gcgaccgttg actgcgtgac ggcttttgcg 600 gaaactgatt ttcgtccgga catggcgaag attgatgttc cgaccttggt gattcacggt 660 gacggcgatc agatcgtgcc gttcgaaacc accggtaagg ttgcggccga gctgatcaaa 720 ggtgcggagc tgaaagtgta caaggacgcg cctcacggct tcgcagtcac tcatgcacag 780 caactgaacg aggacttgct ggccttcttg aaacgcggtc cgggctccgg tggcgcaggc 840 agcccgggta gcgcaggtgg tccgggatcc gcgcaaagcc aactgccgga caaacatagc 900 ggtctgcacg agcgtgcgcc gcagcgttac ggtagcggta cggcggaaat tcaatccagc 960 aagaacccga acccgcaccc gcagcgcagc tggaccaatg gcagcggtca taatcacatg 1020 caagagcgtt acacggaccc gcagcacagc ccgagcgtta atggtttggg tagcggccac 1080 gaccataaga atcagaaaga aacccatcaa cgccacgcgg cgtccagcca ccaccaccat 1140 caccac 1146 <210> 335 <211> 382 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 335 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Pro Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 45 Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro 50 55 60 Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser Ala Gln Ser Gln Leu Pro Asp Lys His Ser Gly Leu His Glu 290 295 300 Arg Ala Pro Gln Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Ala Glu Ile Gln Ser Ser 305 310 315 320 Lys Asn Pro Asn Pro His Pro Gln Arg Ser Trp Thr Asn Gly Ser Gly 325 330 335 His Asn His Met Gln Glu Arg Tyr Thr Asp Pro Gln His Ser Pro Ser 340 345 350 Val Asn Gly Leu Gly Ser Gly His Asp His Lys Asn Gln Lys Glu Thr 355 360 365 His Gln Arg His Ala Ala Ser Ser His His His His His His 370 375 380 <210> 336 <211> 918 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 336 atgtccacct tcgttgcgaa agatggcacc cagatttact ttaaagactg gggcagcggc 60 aagccggttc tgtttagcca cggctggccg ctggacgcgg atatgtggga gtatcagatg 120 gagtacctga gcagccgtgg ttaccgtacc atcgccttcg atcgccgtgg ttttggtcgc 180 agcgatcaac cgtggaccgg caatgattat gacacgttcg cagatgacat tgcccagctg 240 atcgagcacc tggacctgaa agaggttacc ctggtcggtt tcagcatggg cggtggtgac 300 gtcgcgcgct acattgcgcg tcatggttcc gctcgtgtgg cgggtctggt cctgctgggt 360 gctgtaacgc cactgtttgg tcaaaagccg gattatccgc agggtgtgcc gttggatgtg 420 tttgcgcgct tcaaaaccga gttgctgaaa gaccgtgcgc aattcatcag cgacttcaac 480 gcaccgtttt acggtatcaa caaaggccaa gttgtcagcc agggcgttca aacgcagacg 540 ctgcagattg cgctgctggc aagcctgaag gcgaccgttg actgcgtgac ggcttttgcg 600 gaaactgatt ttcgtccgga catggcgaag attgatgttc cgaccttggt gattcacggt 660 gacggcgatc agatcgtgcc gttcgaaacc accggtaagg ttgcggccga gctgatcaaa 720 ggtgcggagc tgaaagtgta caaggacgcg cctcacggct tcgcagtcac tcatgcacag 780 caactgaacg aggacttgct ggccttcttg aaacgcggtc cgggctccgg tggcgcaggc 840 agcccgggta gcgcaggtgg tccgggatcc ggcaaaggca agggtaaggg taaaggtaaa 900 catcatcacc accaccac 918 <210> 337 <211> 306 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 337 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Pro Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 45 Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro 50 55 60 Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys His His His His 290 295 300 His His 305 <210> 338 <211> 216 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 338 Met Ala Lys Arg Ile Leu Cys Phe Gly Asp Ser Leu Thr Trp Gly Trp 1 5 10 15 Val Pro Val Glu Asp Gly Ala Pro Thr Glu Arg Phe Ala Pro Asp Val 20 25 30 Arg Trp Thr Gly Val Leu Ala Gln Gln Leu Gly Ala Asp Phe Glu Val 35 40 45 Ile Glu Glu Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Asn Ile Asp Asp Pro Thr 50 55 60 Asp Pro Arg Leu Asn Gly Ala Ser Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Ala Thr 65 70 75 80 His Leu Pro Leu Asp Leu Val Ile Ile Met Leu Gly Thr Asn Asp Thr 85 90 95 Lys Ala Tyr Phe Arg Arg Thr Pro Leu Asp Ile Ala Leu Gly Met Ser 100 105 110 Val Leu Val Thr Gln Val Leu Thr Ser Ala Gly Gly Val Gly Thr Thr 115 120 125 Tyr Pro Ala Pro Lys Val Leu Val Val Ser Pro Pro Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Met Pro His Pro Trp Phe Gln Leu Ile Phe Glu Gly Gly Glu Gln Lys 145 150 155 160 Thr Thr Glu Leu Ala Arg Val Tyr Ser Ala Leu Ala Ser Phe Met Lys 165 170 175 Val Pro Phe Phe Asp Ala Gly Ser Val Ile Ser Thr Asp Gly Val Asp 180 185 190 Gly Ile His Phe Thr Glu Ala Asn Asn Arg Asp Leu Gly Val Ala Leu 195 200 205 Ala Glu Gln Val Arg Ser Leu Leu 210 215 <210> 339 <211> 272 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 339 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Leu Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 45 Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro 50 55 60 Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270

Claims

a) 1) i) 구조
[X]_mR₅
(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,
R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며;
R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₃ 및 R₄는 각각 H 또는 R₁C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
2) 고체 과산소원, 예를 들어, 과붕산염, 과탄산염 또는 그들의 조합; 및
3) 임의의 유기 공용매의 혼합물을 포함하는 비-수성 조성물; 및
b) 1) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매; 및
2) 적어도 하나의 완충제를 포함하는 수성 조성물 - 여기서, 수성 조성물은 적어도 4의 pH로 이루어진다 - 을 포함하는 모발 관리 제품으로서,
비-수성 조성물 및 수성 조성물이 사용 전에 분리되어 유지되고, 효소에 의해 생성되는 과산이 비-수성 및 수성 조성물의 배합 시에 생성되는 모발 관리 제품.
제1항에 있어서, 완충제가 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 글리신, 바이카르보네이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 말레에이트 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모발 관리 제품.
제1항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가
a) 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 제1 부분; 및
b) 인간 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 갖는 제2 부분을 포함하는 융합 단백질의 형태인 모발 관리 제품.
제3항에 있어서, 제2 부분이 적어도 하나의 모발-결합 펩티드를 포함하는 단쇄 펩티드인 모발 관리 제품.
제4항에 있어서, 적어도 하나의 모발-결합 펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산 범위인 모발 관리 제품.
제3항에 있어서, 모발 관리 제품이 다중-구획 패킷(multi-compartment packet), 다중-구획 병(bottle), 적어도 2개의 개별 용기(container) 및 그들의 조합의 형태인 모발 관리 제품.
제1항에 있어서, 비-수성 조성물 및 수성 조성물이 각각 25℃에서 적어도 14일 동안 실질적으로 안정한 모발 관리 제품.
제1항에 있어서, 비-수성 조성물이 건조제(desiccant)를 추가로 포함하는 모발 관리 제품.
제1항에 있어서, 수성 조성물 중의 완충제가 10 mM 내지 1.0 M의 농도로 존재하는 모발 관리 제품.
제1항에 있어서, 미용상 허용가능한 담체 매질을 추가로 포함하는 모발 관리 제품.
제3항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매가 리파제, 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 프로테아제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 효소를 포함하는 모발 관리 제품.
제11항에 있어서, 아릴 에스테라제가 서열 번호 314에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 모발 관리 제품.
제11항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 293, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 314, 315, 338 및 339 중 어느 하나에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 모발 관리 제품.
제11항에 있어서, 탄수화물 에스테라제가 클러스털더블유(CLUSTALW)를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제이며, 상기 시그니처 모티프가
a) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
b) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
c) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하는 모발 관리 제품.
제3항에 있어서, 융합 단백질이 하기의 일반 구조를 포함하는 모발 관리 제품:
PAH-[L]_y-HSBD
또는
HSBD-[L]_y-PAH
상기 식에서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
HSBD는 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 링커이며;
y는 0 또는 1이다.
제15항에 있어서, 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 항체, F_ab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대(Camelidae) 항체, 스캐폴드(scaffold) 디스플레이 단백질 또는 면역글로불린 폴드(fold)가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 모발 관리 제품.
제16항에 있어서, 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 인간 모발에 대하여 10^-5 M 이하의 K_D 값 또는 MB₅₀ 값을 포함하는 모발 관리 제품.
제16항에 있어서, 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드가 2 내지 50개 모발-결합 펩티드를 포함하며, 모발-결합 펩티드는 독립적으로 그리고 임의로, 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 폴리펩티드 스페이서(spacer)에 의해 분리되는 모발 관리 제품.
제16항에 있어서, 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 순 양전하(net positive charge)를 포함하는 모발 관리 제품.
제1항에 있어서, 유기 공용매가 프로필렌 글리콜, 다이프로필렌 글리콜, 트라이에틸렌 글리콜, 1,3-프로판다이올, 1,3-부탄다이올, 헥실렌 글리콜 및 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모발 관리 제품.
a) 제1항 또는 제3항의 모발 관리 제품을 제공하는 단계; 및
b) 수성 조성물 및 비-수성 조성물이 배합되는 경우 생성되는, 효소에 의해 생성되는 과산과 모발을 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 모발에 제모, 모발 약화, 모발 탈색, 모발 스타일링(styling), 모발 컬링(curling), 모발 컨디셔닝(conditioning), 비-과산계 유익제의 적용 전의 모발 사전처리 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 모발에 대한 과산 기반의 이익의 제공 방법.
제21항에 있어서, 비-과산계 유익제가 제모제, 모발 염모제(dye), 모발 컨디셔닝제 및 그들의 조합인 방법.
제22항에 있어서, 유효량의 과산이 생성되며, 상기 유효량이 0.001 wt% 내지 4 wt% 범위인 방법.
제23항에 있어서, 과산이 과아세트산인 방법.
제21에 있어서, 비-수성 조성물 및 수성 조성물이 인간 모발과의 접촉 전에 배합되는 방법.
제21항에 있어서, 비-수성 조성물 및 수성 조성물이 인간 모발에 동시에 적용되는 방법.
제19항에 있어서, 비-수성 조성물 및 수성 조성물이 인간 모발에 순차적으로 적용되는 방법.
제27항에 있어서, 비-수성 조성물이 인간 모발에 적용된 다음, 수성 조성물이 인간 모발에 적용되는 방법.
제27항에 있어서, 수성 조성물이 인간 모발에 적용된 다음, 비-수성 조성물이 인간 모발에 적용되는 방법.
인간 모발에 과산 기반의 이익을 제공하기 위한 제1항의 모발 관리 제품의 용도.