CN103282016A

CN103282016A - 用于递送使用过乙酸的脱毛剂产品底物的含水稳定组合物

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Publication number: CN103282016A
Application number: CN2011800614968A
Authority: CN
Inventors: X.蒋; T.M.格鲁伯尔; P.E.鲁维耶
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-09-04
Also published as: CN103260597A; WO2012087968A3; AU2011349449A1; RU2013133845A; JP2014505046A; CA2822499A1; WO2012087975A2; EP2654697A2; US20120317732A1; WO2012087968A2; CA2822271A1; WO2012087975A3; BR112013015457A2; EP2654696A4; EP2654696A2; AU2011349453A1; EP2654690A2; KR20130128442A; US20120317731A1; JP2014501760A

Abstract

本文所公开的是用于递送利用酶促生成的过酸的脱毛剂产品底物的组合物和方法。更具体地，提供了pH稳定的双组分系统，其包含(a)包含过氧化氢和至少一种羧酸酯底物的第一含水组合物；其中所述第一含水组合物的pH为4.0或更小，以及(b)包含具有过水解活性的酶催化剂和缓冲液的第二含水组分，其中所述第二含水组合物的pH为至少5.0；其中所述第一和第二含水组合物在使用前保持分离。所述过水解酶催化剂可为融合蛋白的形式，所述为融合蛋白包含通过任选的肽接头联接到对毛发具有亲和力的肽组分的过水解酶。

Description

用于递送使用过乙酸的脱毛剂产品底物的含水稳定组合物

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求2010年12月20日提交的美国临时专利申请61/424,847的优先权，该专利全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及包含用作毛发护理有益剂的至少一种酶促产生的过酸的个人护理产品领域。具体地，提供了包含双组分过酸生成体系的毛发护理产品，其中所述第一组分是pH4.0或更低的含水组合物，其包含羧酸酯和过氧化氢的混合物，并且所述第二组分是包含具有过水解活性的酶和缓冲液的含水组合物，其中所述第二组分的pH具有至少5.0的pH。将两种组分混合以生成过酸有益剂。过水解酶可为融合蛋白的形式，其经工程化以包含对毛发具有亲和力的至少一种肽组分。

背景技术

过氧羧酸(“过酸”)是有效的抗微生物剂。针对不希望有的微生物生长使硬质表面、食物产品、活植物组织和医疗器材清洁、消毒和/或卫生处理的方法已得到描述(例如美国专利6,545,047；美国专利6,183,807；美国专利6,518,307；美国专利5,683,724；和美国专利申请公布2003-0026846A1)。也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3,974,082；美国专利5,296,161；和美国专利5,364,554)。

也已经报道了过酸可氧化角质材料如毛发、皮肤和指/趾甲。例如，授予Alexander，P.等人的英国公布的专利说明书GB692,478(A)描述了在低于100℃的温度下，使用不超过4个碳原子的饱和过脂肪酸的水溶液将角质材料的二硫键氧化成巯基或磺酸，使得被氧化材料易于溶解在稀碱中的方法。Lillie等人(J.Histochem.Cytochem.，(1954)95-102)公开了角质结构氧化诱导的嗜碱性。授予Van Dyke等人的美国专利公开6,270,791公开了从包含角蛋白的来源如毛发中获取水溶性肽的方法，包括在水溶液中氧化包含角蛋白的材料以形成水溶性肽。氧化剂可包括过乙酸。

已经报道了描述过酸用途的毛发护理组合物和方法。授予Zheng，Y.的中国专利申请公布CN101440575A公开了用过乙酸和过氧化氢酶处理毛发，随后用蛋白酶处理毛发的方法。授予Dias等人的US2002-0053110A1；U.S.6,022,381；U.S.6,004,355；WO97/24106；和WO97/24108描述了毛发着色组合物，其包含过氧酸氧化剂和氧化性毛发着色剂。授予Brown，F.的U.S.3,679,347描述了用过氧化合物和反应性染料对人毛发的染色。授予Clark等人的英国专利公开GB1560399A描述了用于毛发处理的组合物，其包含有机过酸组分和含有有机表面活性剂与C10-C21脂肪酸酰胺的含水发泡溶液。授予Till等人的德国专利公开申请公布DE19733841A1公开了用于氧化处理人的毛发的制剂，其包含单过氧邻苯二甲酸镁。

Hahn，F.(Leder(1967)18(8)：184-192)公开了通过用过乙酸、Na₂O₂和或ClO₂氧化毛发角蛋白；随后用碱溶解氧化后毛发的去毛发方法。授予Hahn等人的US3,479,127公开了去除皮肤(小牛皮、山羊皮、羊皮)和牛皮上的毛发的方法，该方法使用过酸(用pH2至5.5，0.5至5重量％的过乙酸处理3小时)处理，随后用作为盐或碱的中性盐或弱碱或强碱处理。

在身体护理产品中包含具有过水解活性的特定枯草菌溶素(subtilisinCarlsberg)蛋白酶变体在授予Wieland等人的美国专利公开7,510,859中公开。除特定蛋白酶变体之外的过水解酶未被描述，也没有任何有效的例子展示酶促产生过酸作为个人护理有益剂。

授予DiCosimo等人的美国专利公开申请公布2008-0176783A1；2008-0176299A1；2009-0005590A1；2010-0087529A1；和2010-0041752A1公开了结构上归类为糖酯酶CE-7家族的成员的酶(即，先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[AXE])，它们的特征在于将羧酸酯底物转化成浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂的过氧羧酸的显著过水解活性。

共有的和共同未决的专利申请，名称为“ENZYMATIC PERACIDGENERATION FOR USE IN HAIR CARE PRODUCTS”(代理人档案号CL5175)，公开了使用过酸作为毛发护理产品中的有益剂的用途。基于过酸的有益剂用于提供益处如毛发去除、毛发弱化、毛发漂白、毛发定型、毛发卷曲、毛发调理、在施用非基于过酸的有益剂之前的毛发预处理、以及它们的组合。

当酶促生成过酸时反应组分通常需要(a)过水解酶，(b)适宜的羧酸酯，和(3)过氧源，其中一种或多种组分在使用前保持分离。同样地，需要多组分生成系统使得反应组分具有储存稳定性，还可在适宜反应条件下混合时快速生成有效浓度的过酸。设计一些生成系统使得酶组分被贮存在基本上非含水羧酸酯中，然后与包含过氧化氢的含水组分混合以生成过酸。然而，一些毛发护理应用和产品可能需要其中酶催化剂不是贮存在羧酸酯底物中，而是贮存在含水环境中的生成系统。

需解决的问题是提供酶生成系统，其适于某些毛发护理应用，例如毛发脱毛剂，它的酶和底物在使用前是长期储存稳定的。

过酸是强氧化剂，它可与多种物质发生反应，包含不是靶向期望的益处的物质。同样地，某些个人护理应用可得益于通过在期望的靶向身体表面上或其附近的局部过酸生产将过酸有益剂靶向/集中在期望身体表面的能力。酶促过酸生产可通过将过水解酶定向于身体表面产生益处。

靶向身体表面的化妆品有益剂的较短的、生物淘选的肽的用途已经有所描述(美国专利公开U.S.7,220,405；7,309,482；7,285,264和7,807,141；美国专利公开申请公布2005-0226839A1；2007-0196305A1；2006-0199206A1；2007-0065387A1；2008-0107614A1；2007-0110686A1；2006-0073111A1；2010-0158846；2010-0158847；和2010-0247589；以及公布的PCT专利申请WO2008/054746；WO2004/048399和WO2008/073368)。对毛发具有亲和力以联接活性过水解酶(即，“靶向过水解酶”)以用于生产过酸有益剂的肽材料的用途尚未有所描述。

同样地，需解决的一个附加问题是提供储存稳定的含水毛发护理组合物，其与靶向酶递送体系相容。

发明内容

提供了使用毛发护理产品和方法用于酶促制备过酸有益剂，其可用于诸如毛发去除(脱毛剂)、降低毛发拉伸强度、用于增强其它脱毛剂产品的毛发预处理(诸如基于硫基乙醇酸盐的毛发去除产品)、毛发漂白、毛发染料预处理(氧化毛发染料)、毛发卷曲和毛发调理的应用中。

毛发护理产品由双组分系统构成，其包含(1)包含所述羧酸酯底物和过氧化氢的第一含水组合物，其中所述第一含水组合物的pH为4.0或更小，和(2)包含所述过水解酶和至少一种缓冲液的第二含水组合物，其中所述第二含水组合物具有至少5.0的pH，其中所述第一含水组合物和所述第二含水组合物在使用之前保持分离，并且其中酶促生成的过酸在将所述第一含水组合物和所述第二含水组合物混合时产生。

在一个实施例中，提供了毛发护理产品，其包括：

a)第一含水组合物，所述第一含水组合物包含下列物质的混合物：

1)至少一种选自下列的底物：

i)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中对于R₆＝C2-C7，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基，或不超过一个酯基或羧酸基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

M为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有下列结构的甘油酯：

其中R₁＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

iii)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；和

iv)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

和

2)过氧化氢；其中所述第一含水组合物的pH为4.0或更小；和

b)第二含水组合物，所述第二含水组合物包含：

1)具有过水解活性的酶催化剂；

2)至少一种缓冲液；其中所述第二含水组合物的pH为至少5.0；其中所述第一含水组合物和所述第二含水组合物在使用之前保持分离，并且其中酶促生成的过酸在将所述第一含水组合物和所述第二含水组合物混合时产生。

在一个实施例中，所述酶催化剂为融合蛋白的形式，所述融合蛋白包含：

a)包含具有过水解活性的酶的第一部分；和

b)具有对毛发具有亲和力的肽组分的第二部分。

在一个实施例中，所述融合蛋白包含下列通式结构：

PAH-[L]_y-HSBD

或

HSBD-[L]_y-PAH

其中

PAH为具有过水解活性的酶；

HSBD为对毛发具有亲和力的肽组分；

L为任选的长度在1至100个氨基酸的范围内的肽接头；并且

y为0或1。

向毛发提供基于过酸的益处的方法，包括：

a)提供至少一种本发明的毛发护理产品；

b)使毛发与所述酶促生成的过酸接触，所述过酸在将所述第一含水组合物和所述第二含水组合物混合时产生；从而所述毛发收到基于过酸的益处，所述益处选自毛发去除、毛发弱化、毛发漂白、毛发定型、毛发卷曲、毛发调理、在施用非基于过酸的有益剂之前的毛发预处理、以及它们的组合。

在另一个实施例中，也提供了至少一种本发明毛发护理产品向人的毛发提供基于过酸的益处的用途。

生物序列简述

下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for PatentApplications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(WorldIntellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(2009)以及European Patent Convention(EPC)和Patent Cooperation Treaty(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

SEQ ID NO：1是编码来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

31954^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：2是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

31954^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是编码来自枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)菌株168的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：4是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)菌株168的先锋霉素C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是编码来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)

6633^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：6是来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)

6633^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是编码来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)14580^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：8是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)

14580^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是编码来自短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：10是来自短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是编码来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)

27405^TM的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：12是来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)27405^TM乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是编码来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：14是来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是编码来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：16是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是编码来自热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacteriumsp.)JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：18是来自热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL YS485乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。应该指出的是，编码来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列在登录号ZP_01168674中据报告似乎会编码在N端增加的15个氨基酸，根据与其它先锋霉素C脱乙酰酶的序列比对，以及根据报告长度(340个氨基酸)与其它CAH酶的观测长度(通常长度为318至325个氨基酸；参见美国专利公开申请公布US-2010-0087528-A1；其以引用方式并入本文)，这可能是不正确的。同样地，本文报告的核酸序列编码来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶的序列，该序列无以

登录号ZP_01168674报告的N-末端的15个氨基酸。

SEQ ID NO：20是来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列，其由核酸序列SEQ I DNO：19编码。

SEQ ID NO：21是编码来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：22是来自耐盐嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：23是编码来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：24是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：25是编码来自Bacillus subtilis

29233^TM先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)的核酸序列。

SEQ ID NO：26是枯草芽孢杆菌

29233^TM先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：27是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布2010-0087529(其全文以引用方式并入本文)，其中在位置277处的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：28是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布2010-0087529，其中在位置277处的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：29是莱廷格热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布2010-0087529，其中在位置277处的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：30是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布2010-0087529，其中在位置277处的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：31是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来源于“RQ2(a)”，其来自美国专利公开申请公布2010-0087529，其中在位置277处的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：32是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来源于“RQ2(b)”，其来自美国专利公开申请公布2010-0087529，其中在位置278处的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：33是莱廷格热袍菌(Thermotoga lettingae)乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：34是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：35是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2第一种乙酰木聚糖酯酶(本文称为“RQ2(a)”)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：36是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2第二种乙酰木聚糖酯酶(本文称为“RQ2(b)”)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：37是编码解糖热厌氧杆菌(Thermoanearobacteriumsaccharolyticum)先锋霉素C脱乙酰酶的经密码子优化的核酸序列。

SEQ ID NO：38是解糖热厌氧杆菌(Thermoanearobacteriumsaccharolyticum)先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：39是编码来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(

登录号EU255910)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：40是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(

登录号ABX75634.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：41是编码来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)(

登录号NC_002678.2)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：42是来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)(

登录号BAB53179.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43是编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(

登录号AF038547.2)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：44是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(

登录号AAF70202.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：45是编码乙酰木聚糖酯酶变体(a.k.a.变体“A3”)的核酸序列，所述变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(F24I/S35T/Q179L/N275D/C277S/S308G/F317S)。

SEQ ID NO：46是“A3”乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：47是编码N275D/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序列。

SEQ ID NO：48是N275D/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：49是编码C277S/F317S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序列。

SEQ ID NO：50是C277S/F317S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：51是编码S35T/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序列。

SEQ ID NO：52是S35T/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：53是编码Q179L/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序列。

SEQ ID NO：54是Q179L/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：55是编码乙酰木聚糖酯酶变体843H9的核酸序列，所述变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(L8R/L125Q/Q176L/V183D/F247I/C277S/P292L)。

SEQ ID NO：56是843H9乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：57是编码乙酰木聚糖酯酶变体843F12的核酸序列，所述变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：K77E/A266E/C277S。

SEQ ID NO：58是843F12乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59是编码乙酰木聚糖酯酶变体843C12的核酸序列，所述变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：F27Y/I149V/A266V/C277S/I295T/N302S。

SEQ ID NO：60是843C12乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61是编码乙酰木聚糖酯酶变体842H3的核酸序列，所述变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：L195Q/C277S。

SEQ ID NO：62是842H3乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：63是编码乙酰木聚糖酯酶变体841A7的核酸序列，所述变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：Y110F/C277S。

SEQ ID NO：64是841A7乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65-221、271、290和291是对毛发具有亲和力的肽的氨基酸序列的非限制性列表。

SEQ ID NO：217-269是对皮肤具有亲和力的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：270-271是对指/趾甲具有亲和力的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：272-285是肽接头/间隔区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：286是编码融合肽C277S-HC263的核酸序列。

SEQ ID NO：287是编码融合构建体C277S-HC1010的核酸序列。

SEQ ID ON：288是融合肽C277S-HC263的氨基酸序列。

SEQ ID NO：289是融合肽C277S-HC1010的氨基酸序列。

SEQ ID ON：290是毛发结合域HC263的氨基酸。

SEQ ID NO：291是毛发结合域HC1010的氨基酸序列。

SEQ ID ON：292是表达质粒pLD001的核酸序列。

SEQ ID NO：293是海栖热袍菌(T.maritima)变体C277S的氨基酸序列。

SEQ ID NO：294是融合肽C277S-HC263的氨基酸序列，其还包含一个D128G取代(“CPAH-HC263”)。

SEQ ID NO：295是融合肽C277S-HC1010的氨基酸序列，其还包含一个D128G取代(“CPAH-HC1010”)。

SEQ ID NO：296是编码乙酰木聚糖酯酶变体006A10(美国临时专利申请61/425561；以引用方式并入本文)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(F268S/C277T)。

SEQ ID NO：297是006A10乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：298是编码乙酰木聚糖酯酶变体006E10(美国临时专利申请61/425561)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(R218C/C277T/F317L)。

SEQ ID NO：299是006E10乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：300是编码乙酰木聚糖酯酶变体006E12(美国临时专利申请61/425561)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(H227L/T233A/C277T/A290V)。

SEQ ID NO：301是006E12乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：302是编码乙酰木聚糖酯酶变体006G11(美国临时专利申请61/425561)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(D254G/C277T)。

SEQ ID NO：303是006G11乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：304是编码乙酰木聚糖酯酶变体006F12(美国临时专利申请61/425561)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(R261S/I264F/C277T)。

SEQ ID NO：305是006F12乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：306是编码乙酰木聚糖酯酶变体006B12(美国临时专利申请61/425561)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotogamaritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(W28C/F104S/C277T)。

SEQ ID NO：307是006B12乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：308是编码乙酰木聚糖酯酶变体874B4(美国临时专利申请61/425561；以引用方式并入本文)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(A266P/C277S)。

SEQ ID NO：309是873B4乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：310是编码乙酰木聚糖酯酶变体006D10(美国临时专利申请61/425561；以引用方式并入本文)的核酸序列，其相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸序列具有下列取代：(W28C/L32P/D151E/C277T)。

SEQ ID NO：311是006D10乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：312是毛发结合域“HC263KtoR”的氨基酸序列，它是毛发结合域“HC263”(SEQ ID NO：290)的一个变体，其中10个赖氨酸残基已经被10个精氨酸残基取代。

SEQ ID NO：313是带电荷肽(GK)₅-H6的氨基酸序列。

SEQ ID NO：314是来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的芳基酯酶S54V变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：315是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：316是编码来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的乙酰木聚糖酯酶的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：317是来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：318是编码来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的乙酰木聚糖酯酶的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：319是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：320是编码来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)的乙酰木聚糖酯酶的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：321是来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：322是编码来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的芳基酯酶S54V变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：323是来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的芳基酯酶S54V变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：324是编码来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的芳基酯酶S54V变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263KtoR融合。

SEQ ID NO：325是来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的芳基酯酶S54V变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263KtoR融合。

SEQ ID NO：326是编码来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的芳基酯酶S54V变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC1010(SEQ ID NO：291)融合。

SEQ ID NO：327是来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的芳基酯酶S54V变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC1010融合。

SEQ ID NO：328是编码来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的芳基酯酶S54V变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与带电荷肽(GK)₅-His6融合。

SEQ ID NO：329是来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的芳基酯酶S54V变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与带电荷肽(GK)₅-His6融合。

SEQ ID NO：330是编码来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：331是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263融合。

SEQ ID NO：332是编码来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263KtoR融合。

SEQ ID NO：333是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC263FtoR融合。

SEQ ID NO：334是编码来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC1010(SEQ ID NO：291)融合。

SEQ ID NO：335是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与毛发结合域HC1010融合。

SEQ ID NO：336是编码来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的合成基因的核苷酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与带电荷肽(GK)₅-His6融合。

SEQ ID NO：337是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的水解酶L29P变体的氨基酸序列，它在其C-末端经由柔性接头与带电荷肽(GK)₅-His6融合。

SEQ ID NO：338是野生型耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)芳基酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：339是野生型荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)酯酶的氨基酸序列。

具体实施方式

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。除非另外特别说明，下述定义适用。

如本文所用，涉及元素或组分实例(即出现的事物)的数目在本发明元素或组分前的冠词“一个”、“一种”及“所述”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或多种其它特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由...组成”和“由...组成”涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由...组成”旨在包括由术语“由...组成”涵盖的实施例。

如本文所用，用术语“约”修饰成分或反应物的数量时是指数值量的变化，它们可能发生在例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。

当存在时，所有范围是包括端值在内的和可以组合的。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。

如本文所用，“接触”是指使组合物与目标身体表面接触一段足以达到期望结果(结合目标表面、基于过酸的效应等)的时间。在一个实施例中，“接触”可以指使包含(或能够制备)有效浓度过酸的组合物与目标身体表面接触一段足以达到期望结果的时间。在另一个实施例中，“接触”也可以指使个人护理组合物的至少一种组分如一种或多种反应组分(用于酶促过水解)与目标身体表面接触。接触包括通过喷洒、处理、浸入、冲洗、倾注、混合、组合、涂抹、涂覆、施加、粘附以及其它方式，使包含有效浓度的过酸的过酸溶液或组合物、形成有效浓度过酸的溶液或组合物或形成有效浓度过酸的组合物组分与身体表面相连。

如本文所用，术语“底物”、“合适底物”和“羧酸酯底物”可互换地具体指：

(a)一种或多种具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基；

R₆为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中对于R₆为C2-C7，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅为任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基，或不超过一个酯基或羧酸基，并且其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

M为1至R₅中碳原子数量，

在25℃下，所述一种或多种酯具有至少5ppm的水中溶解度；或

(b)一种或多种具有下列结构的甘油酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或

(c)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；或

(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或

(e)(a)至(d)的任何组合。

如本文所用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸(percarboxylicacid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并且与过氧乙酸、乙过氧酸以及CAS登记号79-21-0的所有其它同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油单醋酸酯和单醋酸甘油酯同义。

如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯；甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其它同义词同义。

如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯；三乙酸甘油酯；甘油三醋酸酯，1，2，3-三乙酰氧基丙烷；1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其它同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其它同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其它同义词同义。

如本文所用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化多糖”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。例子包括但不限于葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。

如本文所用，术语“烃基”和“烃基基团”指直链、支化或环状碳原子排列，碳原子通过碳-碳单键、双键或三键和/或醚键连接，并且相应地被氢原子取代。此类烃基基团可为脂族和/或芳族。烃基基团的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优选的实施例中，烃基部分是直链、支化或环状碳原子排列，碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接，并且相应地被氢原子取代。

如本文所用，术语1，2-乙二醇；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇；1，3-丁二醇；2，3-丁二醇；1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，5-戊二醇；1，6-戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇；以及它们的混合物的“单酯”和“二酯”是指包含式RC(O)O的至少一个酯基的所述化合物，其中R是C1-C7线性烃基部分。在一个实施例中，羧酸酯底物选自丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二醋酸酯(EDGA)、以及它们的混合物。

如本文所用，术语“丙二醇二乙酸酯(propylene glycol diacetate)”与1，2-二乙酰氧基丙烷(1，2-diacetoxypropane)、丙二醇二乙酸酯(propylenediacetate)、1，2-丙二醇二乙酸酯(1，2-propanediol diacetate)、以及CAS登记号623-84-7的所有其它同义词同义。

如本文所用，术语“乙二醇二醋酸酯(ethylene glycol diacetate)”与1，2-乙酰氧基乙烷(1，2-diacetoxyethane)、乙二醇二乙酸酯(ethylenediacetate)、乙二醇二乙酸酯(glycol diacetate)、以及CAS登记号111-55-7的所有其它同义词同义。

如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位生成过酸的组分”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”、“反应混合物”和“生成过酸的组分”是指反应物和过水解酶催化剂在其中发生接触的材料和水。在一个实施例中，生成过酸的组分将包含至少一种过水解酶(优选为包含对身体表面如毛发具有亲和力的结合域的融合蛋白的形式)、至少一种适宜的羧酸酯底物、过氧源和水。在一个优选的方面，所述过水解酶是CE-7过水解酶，优选地为靶向身体表面如毛发的融合蛋白的形式。

如本文所用，术语“过水解”定义为所选底物与过氧化物形成过酸的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过氧羧酸。如本文所用，术语“化学过水解”包括其中底物(过氧羧酸前体)与过氧化氢源组合的过水解反应，其中过氧羧酸在不存在酶催化剂的情况下形成。如本文所用，术语“酶促过水解”包括过水解反应，其中羧酸酯底物(过酸前体)与过氧化氢源和水反应，从而酶催化剂催化过酸的形成。

如本文所用，术语“过水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)的蛋白、细胞干重或固定化催化剂重量的催化剂活性。

如本文所用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度每分钟产生1μmol过氧羧酸产物所需的过水解酶活性的量。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶的催化剂，并且可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。酶催化剂也可被化学改性(如通过聚乙二醇化或通过与交联试剂的反应)。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将过水解酶固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰木聚糖以及其它乙酰化糖的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXE)。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰水解酶”是指催化先锋霉素如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，(1995)，Appl.Env.Microbiol.61(6)：2224-2229)。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌

31954^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为

31954^TM。来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)

31954^TM的具有显著过水解酶活性的酶以SEQ ID NO：2(参见美国专利公开申请公布2010-0041752)提供。分离的酶的氨基酸序列与由

登记号BAA01729.1提供的头孢菌素C脱乙酰酶具有100％的氨基酸同一性(MITSUSHIMA等人，同上)。

如本文所用，术语“海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8”是指据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(

NP_227893.1；参见美国专利公开申请公布2008-0176299)。具有过水解酶活性的酶来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：16。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸：

例如，在本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码蛋白的功能特性)的基因改变是常见的。为了本发明目的，将取代定义为在下列五组中的一组内的互换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和

5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。

因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变蛋白的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。

如本文所用，术语“特征基序”和“诊断基序”是指具有给定活性的酶家族中共有的保守结构。可使用特征基序定义和/或鉴定对给定底物家族具有相似酶活性的结构相关的酶家族。特征基序可为单个邻接氨基酸序列或不邻接的保守基序的集合，它们一起形成特征基序。保守基序通常用氨基酸序列表示。在一个实施例中，过水解酶包含CE-7糖酯酶特征基序。

如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序软件包(WisconsinPackage Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI53715USA)、CLUSTALW(例如1.83版；Thompson等人，Nucleic AcidsResearch，22(22)：4673-4680(1994))、以及包含Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20.Editor：Suhai，Sandor.Publisher：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的、由软件制造商设置的任何值或参数集。

如本文所用，术语“身体表面”是指可用作有益剂如过酸有益剂目标的任何人体表面。典型的身体表面包括但不限于毛发、皮肤、指/趾甲、牙齿和牙龈。本发明方法和组合物涉及毛发护理用途和产品。同样地，身体表面包括毛发。在一个实施例中，身体表面是人的毛发。

如本文所用，“个人护理产品”是指在毛发、皮肤、头皮和牙齿的清洁、漂白和/或消毒中使用的产品，包括但不限于洗发剂、爽身水、沐浴凝胶、局部保湿剂、牙膏、牙胶、漱口剂、漱口水、抗牙斑漱口液和/或其它局部清洁剂。在一些尤其优选的实施例中，这些产品用于人体，而在其它实施例中，这些产品用于除人之外的动物(例如兽医方面的用途)。在一个优选的实施例中，术语“个人护理产品”是指毛发护理产品或皮肤护理产品。

如本文所用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时能够提供约1mM或更高浓度过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐、以及过碳酸盐。本发明的毛发护理组合物和方法具体涉及使用包含至少一种羧酸酯底物和过氧化氢的混合物的第一含水组合物，所述第一含水组合物在使用之前具有4.0或更小的pH。所述第二含水组合物包含具有过水解活性的酶催化剂和至少一种缓冲液，其中所述第二含水混合物的pH为至少pH5.0。将两种组合物混合以酶促生成期望的过酸。在一个实施例中，当将反应组分混合时提供的过氧化氢所得浓度为初始至少0.1mM、0.5mM、1mM、10mM、100mM、200mM或500mM或更高。含水反应制剂中过氧化氢与酶底物(如甘油三酯)的摩尔比(H₂O₂∶底物)可为约0.002至20、优选约0.1至10、以及最优选约0.5至5。

本发明的毛发护理产品设计包括(1)包含羧酸酯底物和过氧化氢的第一组合物，其中所述第一组合物的pH在贮存期间保持在4.0或更小以稳定所述第一组合物，以及(2)包含所述过水解酶催化剂和缓冲液的第二含水组合物，其中所述第二含水组合物pH在贮存期间为至少5.0以稳定所述第二含水组合物。

在一个实施例中，如果设计生成体系使得所述酶在水溶液(例如不含显著浓度羧酸酯底物的溶液，所述底物能够在储存期间被所述酶水解)中稳定，可将过水解酶贮存在水溶液中。将所述过水解酶贮存在包含一种或多种缓冲液的所述第二含水组合物中，所述缓冲液能够提供所述酶贮存稳定性的期望pH(例如下列钠盐和/或钾盐：碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甘氨酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐)。在一个优选的方面，所述缓冲液能够向包含所述酶催化剂的所述第二含水组合物提供并保持5.0或更高的pH(在储存期间)。

在另一个实施例中，可将酶稳定剂加到制剂中以进一步提高贮存期间的酶稳定性。酶稳定剂可包括但不限于牛血清白蛋白、多糖、低聚糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘油、非离子表面活性剂如聚氧乙烯-聚环氧丙烷嵌段共聚物、多元醇、聚亚烷基二醇如聚乙二醇。

具有过水解活性的酶

具有过水解活性的酶可包括一些归类为脂肪酶、蛋白酶、酯酶、酰基转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合的酶，只要所述酶对一种或多种本发明底物具有过水解活性即可。例子可包括但不限于过水解蛋白酶(枯草菌溶素(subtilisin Carlsberg)变体；美国专利公开7,510,859)、过水解芳基酯酶(荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；SEQ ID NO：315[L29P变体]和SEQ ID NO：339[野生型]；美国专利公开7,384,787)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的过水解芳基酯酶/酰基转移酶(SEQ ID NO：314[S54V变体]和SEQ ID NO：338[野生型]；美国专利公开7,754,460；WO2005/056782；和EP1689859B1)和过水解糖酯酶。在一个实施例中，过水解酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与作为SEQ ID NO：314提供的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)S54V芳基酯酶具有至少95％的同一性。在一个优选的方面，过水解糖酯酶是CE-7糖酯酶。

在一个实施例中，合适的过水解酶可包括包含与本文报道的编码具有过水解活性的酶的任何氨基酸序列具有至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性的氨基酸序列的酶。

在另一个实施例中，合适的过水解酶可包括包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、299、301、303、305、307、309、311、314、315、338和339具有至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性的氨基酸序列的酶。

在一个实施例中，适宜的过水解酶可包括包含与SEQ ID NO：314、315、338和339具有至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性的氨基酸序列的酶。

在另一个实施例中，基本上类似的过水解酶可包括由多核苷酸序列编码的那些，所述序列在高度严格的杂交条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃并用2X SSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1X SSC，0.1％SDS在65℃下最后洗涤)杂交到编码任何本发明过水解酶的多核苷酸序列上。

在一个优选的实施例中，过水解酶可为融合蛋白的形式，其具有至少一个对至少一个身体表面具有亲和力的肽组分。在一个实施例中，用于确定靶向过水解酶(融合蛋白)是否包含与本文所述的任何过水解酶基本上相似的序列的所有比对基于所述过水解酶的氨基酸序列进行，所述过水解酶无对身体表面具有亲和力的肽组分。

CE-7过水解酶

在一个优选的实施例中，本发明的毛发护理组合物和方法包括具有过水解活性的酶，其结构上归类为糖酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymes：an integrateddatabase approach”，Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat and B.Svensson eds.，(1999)The RoyalSociety of Chemistry，Cambridge，第3-12页)。当与过氧源组合时，已证实酶的CE-7家族尤其能有效地由多种羧酸酯底物制备过氧羧酸(WO2007/070609和美国专利公开申请公布2008-0176299、2008-176783、2009-0005590、2010-0041752和2010-0087529，以及授予DiCosimo等人的美国专利公开申请12/571702和美国临时专利申请61/318016；它们每个均以引用方式并入本文)。

CE-7家族的成员包括头孢菌素C脱乙酰酶(CAH；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE；3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共享保守的特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。包含CE-7特征基序(“CE-7过水解酶”)和/或基本上类似结构的过水解酶适用于本文所述的组合物和方法。用于鉴定基本上类似的生物分子的装置在本领域为人们所熟知(如序列比对方案、核酸杂交和/或保守特征基序的存在)。在一个方面，过水解酶包括包含CE-7特征基序的酶，并与本文提供的序列之一具有至少20％、优选至少30％、更优选至少33％、更优选至少40％、甚至更优选至少42％、甚至更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、以及最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性。

如本文所用，短语“酶在结构上归类为CE-7”、“CE-7过水解酶”、或“在结构上归类为糖酯酶家族7的酶”将用于指代具有过水解活性并在结构上归类为CE-7糖酯酶的酶。该酶家族可通过特征基序的存在而定义(Vincent等人，上文)。CE-7酯酶的特征基序包含三个保守基序(相对于参考序列SEQ ID NO：2的残基位置编号；所述CE-7过水解酶来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)31954^TM)：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；以及

c)His298-Glu299。

在氨基酸残基位置180处的Xaa通常是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的两个用粗体表示。在一个实施例中，在氨基酸残基位置180处的Xaa选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中保守基序的进一步分析表明存在额外的保守基序(在SEQ ID NO：2第267-269氨基酸位置的LXD)，该保守基序可用于进一步定义属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶。在另一个实施例中，上文定义的特征基序可包括附加的(第四)保守基序，其定义为：

Leu267-Xaa268-Asp269。

在氨基酸残基位置268处的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四基序包括属于催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸残基(粗体)。

CE-7过水解酶可为融合蛋白的形式，其具有至少一个对至少一个身体表面具有亲和力的肽组分。在一个实施例中，用于确定靶向过水解酶(融合蛋白)是否包含CE-7特征基序的所有比对将基于所述过水解酶的氨基酸序列进行，所述过水解酶无对身体表面具有亲和力的肽组分。

许多熟知的全局比对算法(即序列分析软件)可用于比对两个或更多个代表具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列，以确定酶是否包含本发明的特征基序。将比对的序列与参考序列(SEQ ID NO：2)进行比较，以确定特征基序的存在。在一个实施例中，将利用参考氨基酸序列(如本文所用的得自枯草芽孢杆菌

31954^TM的过水解酶序列(SEQ ID NO：2))的CLUSTAL比对(例如CLUSTALW)用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过水解酶。保守氨基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号，用以说明在比对序列内的小插入或缺失(例如通常少于五个氨基酸)。

可用于鉴定包含本发明特征基序(当与参考序列进行比较时)的序列的其它合适算法的例子包括但不限于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；全局比对工具)和Smith-Waterman(J.Mol.Biol.147：195-197(1981)；局部比对工具)。在一个实施例中，采用默认参数进行Smith-Waterman比对。合适的默认参数的例子包括使用BLOSUM62计分矩阵，其中GAP open penalty＝10并且GAP extension penalty＝0.5。

比较过水解酶间的总同一性百分比指示与SEQ ID NO：2具有低至大约30％的氨基酸同一性的酶(同时保留特征基序)表现出显著的过水解酶活性并在结构上归类为CE-7碳水化合物酯酶。在一个实施例中，合适的过水解酶包括包含CE-7特征基序并与SEQ ID NO：2具有至少20％，优选至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性的酶。

具有过水解活性的合适CE-7糖酯酶的例子包括但不限于具有氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、299、301、303、305、307、309和311的酶。在一个实施例中，所述酶包含选自14、16、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、46、48、50、52、54、56、58、60、62和64的氨基酸序列。在另一个优选的实施例中，CE-7糖酯酶来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)CE-7糖酯酶(SEQ ID NO：16)。

如本文所用，术语“CE-7变体”、“过水解酶变体”或“变体”将指具有基因修饰的CE-7过水解酶，在与变体来源的对应酶(通常野生型酶)进行比较时所述修饰引起至少一个氨基酸的添加、缺失和/或取代；只要保留了CE-7特征基序和相关联的过水解活性即可。CE-7过水解酶变体也可在本发明组合物和方法中使用。CE-7变体的例子以SEQ ID NO：27、28、29、30、31、32、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、299、301、303、305、307、309和311提供。在一个实施例中，所述变体可包括SEQ ID NO：27、28、50、52、54、56、58、60、62和64。

技术人员认识到基本上类似的CE-7过水解酶序列(保留特征基序)也可用于本发明的组合物和方法。在一个实施例中，基本上类似的序列通过它们在高严格条件下杂交到与本文例示的序列相关联的核酸分子上的能力进行定义。在另一个实施例中，可基于与本文提供的DNA或氨基酸序列的百分比同一性，使用序列对比算法定义基本上类似的酶。

如本文所用，当第一个分子的单链能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其它分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)中。温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的分子(例如来自远缘生物的同源序列)到高度相似的分子(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2XSSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用更高的温度，其中洗涤步骤与上述步骤相同，不同的是将最后两次用0.2X SSC、0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到了60℃。另一组优选的高度严格的杂交条件为：用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下处理，然后用2X SSC、0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按下列顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(Sambrook和Russell，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位点变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度是至少约15个核苷酸，更优选至少约20个核苷酸，甚至更优选至少30个核苷酸，甚至更优选至少300个核苷酸，最优选至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于下列中所述的方法：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)OxfordUniversity Press，NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic Press，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.与Griffin，H.G.编辑)HumanaPress，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，ed.)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.)Stockton Press，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可使用LASERGENE生物信息学计算套件中的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open SoftwareSuite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics16，(6)：276-277(2000))进行。序列的多重比对可使用CLUSTAL比对法(例如CLUSTALW；如1.83版)使用默认参数进行(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res31(13)：3497-500(2003))，可通过European Bioinformatics Institute得自EuropeanMolecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAPExistence penalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)、protein ENDGAP＝-1、protein GAPDIST＝4、以及KTUPLE＝1。在一个实施例中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。作为另外一种选择，可将使用CLUSTALW法(例如1.83版)的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAP extension＝1、matrix＝BLOSUM(如BLOSUM64)、WINDOW＝5、以及TOPDIAGONALSSAVED＝5。

在一个方面，合适的分离型核酸分子编码下述多肽，其具有的氨基酸序列至少约20％，优选至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％与本文报道的氨基酸序列相同。在另一方面，合适的分离型核酸分子编码下述多肽，其具有的氨基酸序列至少约20％，优选至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％与本文报道的氨基酸序列相同；条件是所述多肽保留CE-7特征基序。合适的核酸分子不仅具有上述同源性，而且通常编码长度为约210个至340个氨基酸，约300个至约340个氨基酸，优选地约310个至约330个氨基酸，并且最优选地约318至约325个氨基酸的多肽，其中每个多肽特征在于具有过水解活性。

靶向过水解酶

如本文所用，术语“靶向过水解酶”和“具有过水解活性的靶向酶”将指包含至少一种融合到/联接到至少一个肽组分上的过水解酶(野生型或其变体)的融合蛋白，所述肽组分对目标表面，优选靶向身体表面具有亲和力。在靶向过水解酶内的过水解酶可为任何过水解酶并且可包括脂肪酶、蛋白酶、酯酶、酰基转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合，只要所述酶对一种或多种本发明底物具有过水解活性即可。例子可包括但不限于过水解蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)变体；美国专利公开7,510,859)、过水解酯酶(荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；美国专利公开7,384,787；SEQ ID NO：315[L29P变体]和SEQ ID NO：339[野生型])、过水解芳基酯酶(耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)；美国专利公开7,754,460；WO2005/056782；和EP1689859B1；SEQ ID NO：314[S54V变体]和338[野生型])。

如本文所用，术语“对毛发具有亲和力的至少一个结合域”、“对身体表面具有亲和力的肽组分”、“对毛发具有亲和力的肽组分”和“HSBD”将指融合蛋白肽组分，其不是包含通过肽键接合的两种或更多种氨基酸的至少一种聚合物的过水解酶部分；其中所述组分对毛发，优选地人的毛发具有亲和力。

在一个实施例中，对身体表面具有亲和力的肽组分可为抗体、抗体片段、单链Fab可变片段(scFv)抗体、骆驼科(Camelidae)抗体(Muyldermans，S.，Rev.Mol.Biotechnol.”，(2001)74：277-302)、非抗体支架展示蛋白(Hosse等人，Prot.Sci.(2006)15(1)：14-27和Binz，H.等人(2005)Nature Biotechnology23，1257-1268，多种支架辅助方法回顾)或缺乏免疫球蛋白折叠的单链多肽。在另一方面，对身体表面具有亲和力的肽组分是缺乏免疫球蛋白折叠的单链肽(即，身体表面结合肽或包含至少一个对毛发具有亲和力的身体表面结合肽的身体表面结合域)。在一个优选的实施例中，所述肽组分是缺乏免疫球蛋白折叠的单链肽，所述单链肽包含一种或多种对毛发具有亲和力的身体表面结合肽。

对毛发具有亲和力的肽组分可通过任选的肽接头分离自过水解酶。某些肽接头/间隔区的长度为1至100或1至50个氨基酸。在一些实施例中，肽间隔区的长度为约1至约25个，3至约40个，或3至约30个氨基酸。在其它实施例中间隔区的长度为约5至约20个氨基酸。

在一个实施例中，对毛发具有亲和力的肽组分可包含一个或多个毛发结合肽，它们各自任选地和独立地被长度为1至100个氨基酸的肽间隔区分开。毛发结合肽和/或包含毛发结合肽的毛发结合域的例子可包括但不限于SEQ ID NO：65-221、271、290、291、312和313。肽接头/间隔区的例子可包括但不限于SEQ ID NO：272至285。

以前鉴定为对一个身体表面具有亲和力的肽也可对毛发具有亲和力。同样地，融合肽可包括至少一个以前报道对另一个身体表面如皮肤(SEQID NO：217-269)或指/趾甲(SEQ ID NO：270-271)具有亲和力的肽。在另一个实施例中，融合肽可包括设计对目标身体表面具有静电吸引的任何身体表面结合肽(例如经工程化以静电结合到目标身体表面上的身体表面结合肽)。

在一个实施例中，靶向过水解酶的例子可包括SEQ ID NO：288、289、294、295、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335和337中的一个或多个。在一个优选的实施例中，靶向过水解酶的例子可包括SEQ ID NO：288、289、294、295、317、319、321、323、325、327和329中的一个或多个。

靶向CE-7过水解酶

在一个优选的实施例中，“靶向过水解酶”是具有过水解活性的靶向CE-7糖酯酶。如本文所用，术语“靶向CE-7过水解酶”和“靶向CE-7糖酯酶”将指包含至少一种融合到/联接到至少一个肽组分上的CE-7过水解酶(野生型过水解酶或其变体)的融合蛋白，所述肽组分对目标表面，优选毛发具有亲和力。对身体表面具有亲和力的肽组分可为上述那些肽组分中的任何一种。在一个优选的方面，在靶向CE-7过水解酶中的肽组分是缺乏免疫球蛋白折叠的单链肽(即，身体表面结合肽或包含至少一个对毛发具有亲和力的身体表面结合肽的身体表面结合域)。在一个优选的实施例中，所述肽组分是缺乏免疫球蛋白折叠的单链肽，所述单链肽包含一种或多种对毛发具有亲和力的身体表面结合肽。

对毛发/毛发表面具有亲和力的肽组分可通过任选的肽接头分离自CE-7过水解酶。某些肽接头/间隔区的长度为1至100或1至50个氨基酸。在一些实施例中，肽间隔区的长度为约1至约25个，3至约40个，或3至约30个氨基酸。在其它实施例中间隔区的长度为约5至约20个氨基酸。

同样地，靶向CE-7过水解酶的例子可包括但不限于具有选自SEQ IDNO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、301、303、305、307、309和311的氨基酸序列的任何CE-7过水解酶，所述氨基酸序列联接到对毛发具有亲和力的肽组分上。在一个优选的实施例中，靶向过水解酶的例子可包括但不限于具有选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、301、303、305、307、309和311的氨基酸序列的任何CE-7过水解酶，所述氨基酸序列联接到对毛发具有亲和力的一个或多个身体表面结合肽上(任选地通过肽间隔区)。

融合肽可包括至少一个以前报道对另一个身体表面如皮肤(SEQ IDNO：217-269)或指/趾甲(SEQ ID NO：270-271)具有亲和力的肽。在一个实施例中，CE-7融合肽包含至少一种毛发结合肽，其选自SEQ ID NO：65-221、271、290和291。在另一个实施例中，CE-7过水解酶融合肽可包含设计对目标身体表面具有静电吸引的任何身体表面结合肽(例如经工程化以静电结合到目标身体表面上的身体表面结合肽)。

在另一个实施例中，靶向CE-7过水解酶的例子可包括但不限于SEQID NO288、289、294、295、317、319和321。

对身体表面具有亲和力的肽

缺乏免疫球蛋白折叠的单链肽能够结合到至少一个身体表面上，它称为“身体表面结合肽”(BSBP)并且可包括例如结合到毛发、皮肤、或指/趾甲上的肽。已经确认结合到至少人的毛发上的肽也称为“毛发结合肽(HBP)。”已经确认结合到至少人的皮肤上的肽也称为“皮肤结合肽(SBP)。”已经确认结合到至少人的指/趾甲上的肽也称为“指/趾甲结合肽(NBP)。”短单链身体表面结合肽可根据经验生成(例如带正电荷的多肽靶向带负电荷的表面)或使用对靶向身体表面的生物淘选生成。

已经报道了对多个身体表面具有强亲和力的短肽(美国专利公开7,220,405；7,309,482；7,285,264和7,807,141；美国专利公开申请公布2005-0226839；2007-0196305；2006-0199206；2007-0065387；2008-0107614；2007-0110686；2006-0073111；2010-0158846和2010-0158847；以及公布的PCT专利申请WO2008/054746；WO2004/048399和WO2008/073368)。已经使用身体表面结合肽构建基于肽的制剂，其能够将有益剂与靶向身体表面结合。然而，尚未描述过使用这些肽联接活性过水解酶到靶向身体表面(即，“靶向过水解酶”)上以制备过酸有益剂的用途。

本文提供了对至少一个身体表面具有亲和力的身体表面结合肽的非限制性列表，其包括那些对毛发具有亲和力的肽(毛发结合肽，其具有选自SEQ ID NO：65-221、271、290和291的氨基酸序列)、对皮肤具有亲和力的肽(皮肤结合肽，其包含选自SEQ ID NO：217-269的氨基酸序列)和对指/趾甲具有亲和力的肽(指/趾甲结合肽，其包含选自SEQ ID NO：270-271的氨基酸序列)。在一些实施例中，身体表面结合域由身体表面结合肽构成，其长度为至多约60个氨基酸。在一个实施例中，身体表面结合肽的长度为5至60个氨基酸。在其它实施例中，身体结合肽的长度为7至50个氨基酸或7至30个氨基酸。在其它实施例中，那些身体表面结合肽的长度为7至27个氨基酸。

虽然包含身体表面结合肽(其包括毛发、皮肤、指/趾甲结合肽)的融合肽是本发明的某些实施例，在本发明的其它实施例中，使用多个身体表面结合肽可为有利的。包含多个，即，两个或更多个身体表面结合肽能够提供例如比包含单个身体表面结合肽的那些结合元件甚至更持久的肽组分。在一些实施例中，身体表面结合域包含2至约50个或2至约25个身体表面结合肽。其它实施例包括那些包含2个至约10个或2个至5个身体表面结合肽的身体表面结合域。

多个结合元件(即，身体表面结合肽或身体表面结合域)可直接连接在一起，或者它们能够使用肽间隔区连接在一起。某些肽间隔区的长度为1至100或1至50个氨基酸。在一些实施例中，肽间隔区的长度为约1至约25个，3至约40个，或3至约30个氨基酸。在其它实施例中间隔区的长度为约5至约20个氨基酸。

身体表面结合域和构成它们的较短的身体表面结合肽能够使用本领域技术人员已知的任意数量的方法进行鉴定，包括例如任何已知的生物淘选技术如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示、以及它们的组合。通常随机或基本上随机(如果偏差存在)的肽库对目标身体表面进行生物淘选以鉴定库中对目标身体表面具有亲和力的肽。

生成肽随机库的方法是熟知的并且可通过多种技术完成，包括细菌展示(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(7)：4520-4524(1981)，和Helfman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1)：31-35，(1983))、酵母展示(Chien等人，Proc Natl Acad Sci USA88(21)：9578-82(1991))、联合固相肽合成(美国专利公开5,449,754、美国专利公开5,480,971、美国专利公开5,585,275、美国专利公开5,639,603)和噬菌体展示技术(美国专利公开5,223,409、美国专利公开5,403,484、美国专利公开5,571,698、美国专利公开5,837,500)；核糖体展示(美国专利公开5,643,768；美国专利公开5,658,754；和美国专利公开7,074,557)、以及mRNA展示技术(PROFUSION^TM；参见美国专利公开6,258,558；6,518,018；6,281,344；6,214,553；6,261,804；6,207,446；6,846,655；6,312,927；6,602,685；6,416,950；6,429,300；7,078,197；和6,436,665)。

结合亲和力

对身体表面具有亲和力的肽组分包含10^-5摩尔(M)或更小的人的毛发、皮肤、或指/趾甲结合亲和力。在某些实施例中，肽组分是一个或多个身体表面结合肽和/或结合域，它们对人的毛发、皮肤、或指/趾甲具有10^-5摩尔(M)或更小的结合亲和力。在一些实施例中，结合肽或域在至少约50-500mM盐存在的情况下将具有10^-5M或更小的结合亲和力值。术语“结合亲和力”是指结合肽与它的相应底物相互作用的强度，在这种情况下为人的毛发、皮肤、或指/趾甲。结合亲和力可根据结合肽的解离常数(“K_D”)、或“MB₅₀”进行定义或测量。

“K_D”对应于目标上的一半结合位点被占据时的肽浓度，即，此时具有肽结合(结合目标材料)的目标浓度等于无肽结合的目标浓度。解离常数越小，肽结合得越牢固。例如，具有纳摩尔(nM)解离常数的肽比具有微摩尔(μM)解离常数的肽结合得更牢。本发明的某些实施例将具有的KD值为10^-5或更小。

“MB₅₀”是指结合肽的浓度提供的信号为在基于ELISA的结合测定法中获得的最大信号的50％。参见例如美国专利公开申请公布2005/022683的例子3；其以引用方式并入本文。MB₅₀指示络合物组分的结合相互作用或亲和力的强度。MB₅₀值越低，肽与其对应底物的相互作用越强，即“越好”。例如，具有纳摩尔(nM)MB50的肽比具有微摩尔(μM)MB50的肽结合得更牢。本发明的某些实施例将具有的MB50值为10^-5M或更小。

在一些实施例中，对身体表面具有亲和力的肽组分可具有结合亲和力，其通过K_D或MB₅₀值进行测量，该值小于或等于约10^-5M，小于或等于约10^-6M，小于或等于约10^-7M，小于或等于约10^-8M，小于或等于约10^- ⁹M，或小于或等于约10^-10M。

在一些实施例中，身体表面结合肽和/或身体表面结合域可具有结合亲和力，其通过K_D或MB₅₀值进行测量，该值小于或等于约10^-5M，小于或等于约10^-6M，小于或等于约10^-7M，小于或等于约10^-8M，小于或等于约10^- ⁹M，或小于或等于约10^-10M。

如本文所用，术语“强亲和力”将指具有的K_D或MB₅₀值小于或等于约10^-5M，优选地小于或等于约10^-6M，更优选地小于或等于约10^-7M，更优选地小于或等于约10^-8M，小于或等于约10^-9M，或者最优选地小于或等于约10^-10M的结合亲和力。

多组分过氧羧酸生成系统

用于使多种活性组分分开与混合的系统和装置的设计一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多重活性流体(液体-液体)系统一般使用多室分配瓶或二相系统(例如美国专利公开申请公布2005-0139608；美国专利公开5,398,846；美国专利公开5,624,634；美国专利公开6,391,840；E.P.专利0807156B1；美国专利公开申请公布2005-0008526；和PCT公开WO00/61713)，例如在其中所需漂白剂在使反应性流体混合后产生的某些漂白应用中发现的。用于生成过氧羧酸的其它形式的多组分系统可以包括但不限于，设计用于一种或多种固体成分或固体液体成分组合的那些，例如粉剂(例如，例如美国专利5,116,575)、多层片(例如美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(例如美国专利6,995,125)和在水添加后反应的固体凝聚物(例如美国专利6,319,888)。各组分应操作安全并长期稳定(即，用混合后制备的过氧羧酸的浓度进行衡量)。在一个实施例中，多组分酶催化法过氧羧酸生成系统的贮存稳定性可以用酶催化剂的稳定性衡量。在另一个实施例中，多组分系统的贮存稳定性根据酶催化剂稳定性和底物(例如羧酸酯)稳定性进行测量。

本文提供包含多组分过氧羧酸生成制剂的个人护理产品，其使用酶催化剂以快速制备具有期望过氧羧酸浓度的过酸水溶液。可以在临近使用前和/或在应用场所(原位)进行混合。在一个实施例中，个人护理产品制剂将由至少两种组分构成，它们在使用前保持分离。通过混合各组分将快速地形成过酸水溶液。设计每种组分使得所得过酸水溶液包含适于预期最终用途的有效过酸浓度(例如基于过酸的脱毛、基于过酸的毛发拉伸强度降低、过酸增强使用其它脱毛剂产品的毛发去除(例如基于硫基乙醇酸盐的毛发去除产品)、毛发漂白、毛发染料预处理(氧化毛发染料)、毛发卷曲、毛发调理、皮肤美白、皮肤漂白、皮肤调理、减少皮肤皱纹外观、皮肤嫩化、减少表皮粘连、减少或除去体味、指/趾甲漂白、或指/趾甲消毒。各组分的组成应被设计为：(1)可提供长期的贮存稳定性，和/或(2)能够促进由过氧羧酸构成的合适含水反应制剂的形成。

该多组分制剂由至少两种基本上为液体的组分构成。在一个实施例中，该多组分制剂可为包含第一液体组分和第二液体组分的双组分制剂。术语“第一”或“第二”液体组分的使用是相对而言的，前提条件是包含指定成分的两种不同液体组分在使用前保持分离。至少，多组分过氧羧酸制剂包含(1)至少一种具有过水解活性的酶催化剂，(2)羧酸酯底物，以及(3)过氧源(例如过氧化氢)和水，其中当将组分混合后所述制剂酶促产生期望的过酸。

已经公开了用于改善和/或催化剂稳定性的酶促过酸生成体系的性能和/或催化剂稳定性的多种方法。美国专利公开申请公布2010-0048448、2010-0086534和2010-0086535。

应仔细选择和平衡在双组分制剂中使用的不同成分的类型和量以提供(1)每种组分的贮存稳定性，包括酶催化剂的过水解活性和每种底物的稳定性/反应性，和(2)提高溶解度的物理特性和/或有效形成期望过氧羧酸水溶液的能力(例如，提高底物和酶催化剂活性的条件、提高酯底物在含水反应混合物中的溶解度的成分和/或改变至少一种液体组分的粘度和/浓度的成分[即，至少一种助溶剂，其不对酶的过水解活性具有显著的不利影响])。

本发明的毛发护理组合物和方法可使用助溶剂。在一个实施例中，包含羧酸酯底物的组分包含Log P值小于约2的有机溶剂，其中将Log P定义为物质在辛醇与水之间的分配系数的对数，表示为P＝[溶质]_辛醇/[溶质]_水。描述了对酶活性无显著不良影响的log P值为2或更小的若干种共溶剂。在另一个实施例中，共溶剂在包含羧酸酯底物的反应组分中的含量为约20重量％至约70重量％。

包含羧酸酯底物和过氧化氢的组分可包括一种或多种缓冲液(例如下列钠盐和/或钾盐：碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甘氨酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐)，只要反应组分在与包含具有过水解活性的酶催化剂的组分混合之前具有4.0或更小的pH即可。保持低于4.0的pH稳定羧酸酯和过氧化氢的混合物，使其不会显著地化学过水解和水解所述酯。

包含所述酶的含水组分包括一种或多种缓冲液(例如下列钠盐和/或钾盐：碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甘氨酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐)，只要包含所述酶的含水组分在与包含羧酸酯和过氧化氢的混合物的组分混合之前具有5.0或更大的pH即可。

本发明的毛发护理产品包含两种含水组合物，它们在使用前保持分离。所述第一组合物是含水组合物所述含水组合物包含下列物质的混合物：

1)至少一种选自下列的底物：

i)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基或羧酸基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

M为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有下列结构的甘油酯：

iii)一种或多种下式的酯：

iv)选自下列的乙酰化糖：乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖；和

2)过氧化氢；其中所述第一含水组合物的pH为4.0或更小。

所述第二含水组合物包含

1)具有过水解活性的酶催化剂；

2)至少一种缓冲液；

其中所述第二含水组合物的pH为至少5.0。

所述第一和第二组合物在使用之前保持分离，其中酶促生成的过酸在将所述组合物混合时产生。

选择加入含水组合物的缓冲液的类型和量，使得第一含水组合物的pH(在使用之前)保持在4或更小的pH，而第二含水组合物的pH值在使用之前为至少5.0(即，在储存期间)。选择反应组分使得在将第一含水组合物和第二含水组合物混合时得到的反应混合物包含其中酶催化剂具有过水解活性的pH，并且从而产生至少一种过酸。

在本文所述的两种组合物中的组分构成表现出酶催化剂(根据在开始反应时观察到的酶活性进行测量)和底物(羧酸酯和过氧源在贮藏期间不显著分解)的贮存稳定性。

如本文所用，“基本上稳定的”或“稳定的”或“储存稳定的”是指在储存期间(即，在使用之前)所考虑的组分的贮存稳定性保持活性(例如酶催化剂活性)或在组合物中不显著改变(例如底物浓度在储存期间基本上不改变)。在一个实施例中，储存条件包括在25℃储存组合物(在由非反应性材料制成的封闭容器中)至少14天；其中至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，甚至更优选地至少99％，并且最优选地约100％的初始活性(例如酶催化剂活性)和初始底物浓度(例如羧酸酯底物)相对于在产生所述组合物时所得活性/浓度被保留。本文描述了测量催化剂稳定性和底物稳定性的方法。

用于通过酶催化从羧酸酯和过氧化氢制备过酸的合适反应条件

具有过水解活性的一种或多种酶可用于在本发明的个人护理组合物和方法中生成有效浓度的期望过酸。在具有过水解活性的酶催化剂存在的情况下，期望的过氧羧酸可通过羧酸酯与过氧源的反应进行制备。

在靶向过水解酶内的过水解酶可为任何过水解酶并且可包括脂肪酶、蛋白酶、酯酶、酰基转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合，只要所述酶对一种或多种本发明底物具有过水解活性即可。例子可包括但不限于过水解蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)变体；美国专利公开7,510,859)、过水解酯酶(荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；美国专利公开7,384,787；SEQ ID NO：315[L29P变体]和SEQ ID NO：339[野生型])、过水解芳基酯酶(耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)；美国专利公开7,754,460；WO2005/056782；和EP1689859B1；SEQ ID NO：314[S54V变体]和338[野生型])。在一个实施例中，过水解酶催化剂包含芳基酯酶，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：314具有至少95％的同一性。

在一个实施例中，酶催化剂包含至少一种具有过水解酶活性的酶，其中所述酶在结构上归类为CE-7糖酯酶家族的成员(CE-7；参见Coutinho，P.M.和Henrissat，B.，上文)。在另一个实施例中，将过水解酶催化剂从结构上归类为先锋霉素C脱乙酰酶。在另一个实施例中，将过水解酶催化剂从结构上归类为乙酰木聚糖酯酶。

在一个实施例中，过水解酶催化剂包含具有过水解活性和CE-7特征基序的酶，所述特征基序包括：

a)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基118-120比对的RGQ基序；

b)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基179-183比对的GXSQG基序；和

c)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基298-299比对的HE基序；

在一个优选的实施例中，与参考序列SEQ ID NO：2的比对使用CLUSTALW进行。

在另一个实施例中，该CE-7特征基序还可包含附加的(即，第四)基序，其被定义为当用CLUSTALW比对参考序列SEQ ID NO：2时在第267-269氨基酸残基位置的LXD基序。

在另一个实施例中，过水解酶催化剂包含具有过水解活性的酶，所述酶具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、299、301、303、305、307、309、311、314、315、338和339。

在另一个实施例中，过水解酶催化剂包含具有过水解活性的酶，所述酶具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、299、301、303、305、307、309和311，其中所述酶可具有一个或多个增加、缺失、或取代，只要保留特征基序并保持过水解酶活性即可。

如上所述，CE-7过水解酶可为融合蛋白，其具有包含CE-7过水解酶的第一部分和包含肽组分的第二部分，所述肽组分对目标身体表面具有亲和力，使得所述过水解酶“靶向”期望的身体表面。在一个实施例中，任何CE-7过水解酶(通过存在的CE-7特征基序定义)可结合到能够使所述酶靶向身体表面的任何肽组分/结合元件上。在一个方面，对毛发具有亲和力的肽组分可包括抗体、抗体片段(F_ab)、以及单链可变片段(scFv；免疫球蛋白的重链(V_H)和轻链(V_L)的融合可变区)、单域骆驼抗体、支架展示蛋白和缺乏免疫球蛋白折叠的单链亲和肽。包含抗体、抗体片段和其它免疫球蛋白来源的结合元件、以及大支架展示蛋白的组合物常常是不经济的。同样地，并且在一个优选的方面，肽组分/结合元件是缺乏免疫球蛋白折叠和/或免疫球蛋白域的单链亲和肽。短单链身体表面结合肽可根据经验生成(例如带正电荷的多肽靶向带负电荷的表面)或使用对靶向身体表面的生物淘选生成。使用任意数量的展示技术(例如噬菌体展示、酵母展示、细菌展示、核糖体展示和mRNA展示)鉴定/获取亲和肽的方法是本领域为人们所熟知的。单个毛发结合肽可经由任选的间隔区/接头联接到一起以形成大的结合“域”(本文也称为结合“手”)，从而促进过水解酶附接/定位于毛发。

融合蛋白也可包含一个或多个肽接头/间隔区，其分开CE-7过水解酶和毛发结合域和/或介于不同的毛发结合肽之间(例如当多个毛发结合肽联接在一起形成较大的靶向毛发表面结合域时)。提供了示例性肽间隔区的非限制性列表，它们是氨基酸序列SEQ ID NO：290、291、312和313。

上文描述了对毛发具有亲和力的合适的肽。使用任何上述“展示”技术鉴定附加的毛发结合肽的方法是为人们所熟知的，并且可用于鉴定附加的毛发结合肽。

合适的羧酸酯底物可以包含具有下式的酯：

(a)一种或多种具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基；

M为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数，

在25℃下，所述一种或多种酯具有至少5ppm的水中溶解度；或

(b)一种或多种具有下列结构的甘油酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄分别为H或R₁C(O)；或

(c)一种或多种下式的酯：

(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或

(e)(a)至(d)的任何组合。

适合的底物还可以包含一种或多种选自酰化的单糖、二塘和多糖的酰化的糖类。在另一个实施例中，酰化的糖类选自乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)；乙酰化葡萄糖(例如α-D-葡糖五乙酸酯；β-D-葡糖五乙酸酯；1-硫代-β-D-葡萄糖-2，3，4，6-四乙酸酯)；β-D-半乳糖五乙酸酯；山梨醇六乙酸酯；蔗糖辛乙酸酯；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；β-D-呋喃核糖-1，2，3，4-四乙酸酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖；β-D-呋喃木糖四乙酸酯、α-D-吡喃葡萄糖五乙酸酯；β-D-吡喃葡萄糖-1，2，3，4-四乙酸酯；β-D-吡喃葡萄糖-2，3，4，6-四乙酸酯；2-乙酰氨基-2-脱氧-1，3，4，6-四乙酰-β-D-吡喃葡萄糖；2-乙酰氨基-2-脱氧-3，4，6-三乙酰-1-氯-α-D-吡喃葡萄糖；α-D-吡喃甘露糖五乙酸酯和乙酰化纤维素。在一个优选的实施例中，乙酰化糖类选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖；蔗糖辛乙酸酯；以及乙酰化纤维素。

在另一个实施例中，附加的合适底物也可包含5-乙酰氧甲基-2-呋喃甲醛；3，4-二乙酰氧基-1-丁烯；4-乙酰氧基苯甲酸；乙酰香草醛；丙二醇甲醚乙酸酯；乳酸甲酯；乳酸乙酯；乙醇酸甲酯；乙醇酸乙酯；甲氧基乙酸甲酯；甲氧基乙酸乙酯；3-羟基丁酸甲酯；3-羟基丁酸乙酯；和2-乙酰柠檬酸三乙酯。

在另一个实施例中，合适的底物选自甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；三乙酰甘油酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖；1，2-乙二醇的单酯或二酯；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇；1，3-丁二醇；2，3-丁二醇；1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，5-戊二醇；1，6-戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇；以及它们的混合物。在另一个实施例中，所述底物为包含一个或多个酯基的C1-C6多元醇。在一个优选的实施例中，在C1-C6多元醇上的一个或多个羟基被一个或多个乙酰氧基(例如1，3-丙二醇二乙酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯；1，4-丁二醇二乙酸酯；1，5-戊二醇二乙酸酯等)取代。在另一个实施例中，所述底物为丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二乙酸酯(EGDA)、或它们的混合物。

在另一个实施例中，合适的底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯和甘油三丁酸酯。在又一方面，所述底物选自甘油二乙酸酯和甘油三乙酸酯。在最优选的实施例中，适合的底物包含甘油三乙酸酯。

在一个优选的实施例中，羧酸酯为选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和它们的组合(即混合物)的液体底物。羧酸酯在反应制剂中存在的浓度当酶催化过水解时足以产生期望浓度的过氧羧酸。羧酸酯不需要在反应制剂中完全溶解，但是其溶解度足以通过过水解酶催化剂将酯转化成相应的过氧羧酸。羧酸酯在反应制剂中的浓度为0.05重量％至40重量％，优选地为0.1重量％至20重量％，更优选地为0.5重量％至10重量％。

过氧源为过氧化氢。反应制剂中的过氧化合物的浓度可介于0.0033重量％至约50重量％，优选地0.033重量％至约40重量％，更优选地0.1重量％至约30重量％的范围内。

过氧源(即，过氧化氢)也可使用能够产生有效量过氧化氢的酶酶促生成。例如，可在本发明组合物和方法中使用多种氧化酶以制备有效量的过氧化氢，所述酶包括但不限于葡萄糖氧化酶、乳糖氧化酶、碳水化合物氧化酶、醇氧化酶、乙二醇氧化酶、甘油氧化酶和氨基酸氧化酶。

已经报道多种过水解酶催化剂(全细胞、透化的全细胞、以及部分纯化的全细胞提取物)具有过氧化氢酶活性(EC1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。在一个方面，过氧化氢解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一方面，可将过氧化氢酶抑制剂加到反应制剂中。本领域的技术人员能够按需调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度通常在约0.1mM至约1M的范围内；优选地在约1mM至约50mM的范围内；更优选地在约1mM至约20mM的范围内。

在另一个实施例中，酶催化剂缺乏明显的过氧化氢酶活性，或可被工程化以降低或消除过氧化氢酶活性。宿主细胞中的过氧化氢酶活性能够通过使用熟知的技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变和随机诱变，破坏负责过氧化氢酶活性的基因而被下调或消除。在一个优选的实施例中，编码内源过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即，敲除)。如本文所用，“被破坏的”基因是其中不再存在由改性基因编码的蛋白的活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，包括但不限于插入、去除、或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在另一个优选的实施例中，生产宿主是大肠杆菌生产宿主，其包含破坏的过氧化氢酶基因，该基因选自katG和katE(参见美国专利公开申请公布2008-0176299)。在另一个实施例中，生产宿主是大肠杆菌菌株，它包含下调和/或破坏的katG和katE过氧化氢酶基因。

含水反应制剂中的催化剂浓度取决于催化剂的催化比活性，并且经选择以获取期望的反应速率。过水解反应中的催化剂的重量通常在每mL总反应体积0.0001mg至10mg，优选地每mL总反应体积0.001mg至2.0mg的范围内。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将催化剂固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂可为下列形式：全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的或纯化的酶、以及它们的混合物。

在一个方面，通过羧酸酯的化学法过水解和酶催化法过水解相结合生成的过氧羧酸浓度足以提供用于所选个人护理应用的过氧羧酸有效浓度。在另一方面，本发明的方法提供酶和酶底物的组合以生产期望有效浓度的过氧羧酸，其中在不加入酶的情况下，产生的过氧羧酸浓度显著更低。虽然在一些情况下通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应可基本上化学过水解酶底物，但生成的过氧羧酸浓度可能不足以在期望应用中提供有效的过氧羧酸浓度，并且加入合适的过水解酶催化剂到反应制剂中显著提高总过氧羧酸浓度。

在10分钟内，优选地在5分钟内通过过水解至少一种羧酸酯生成的过氧羧酸(例如过乙酸)的浓度为至少约0.1ppm，优选地至少0.5ppm，1ppm，5ppm，10ppm，20ppm，100ppm，200ppm，300ppm，500ppm，700ppm，1000ppm，2000ppm，5000ppm或10,000ppm的过酸，用于启动过水解反应。包含过氧羧酸的产物制剂可任选地用水或主要包含水的溶液稀释以制备基于目标应用具有期望的较低浓度过氧羧酸的制剂。明显地，本领域的技术人员能够调节反应组分和/或稀释量以获得期望的过酸浓度，用于选择的个人护理产品。

根据本文所述方法形成的过酸用于个人护理产品/应用，其中所述过酸与目标身体表面接触以提供基于过酸的益处，例如毛发去除(过酸脱毛剂)、降低毛发拉伸强度、用于增强其它脱毛剂产品的毛发预处理(诸如基于硫基乙醇酸盐的毛发去除产品)、毛发漂白、毛发染料预处理(氧化毛发染料)、毛发卷曲和毛发调理。在一个实施例中，用于为毛发如人的毛发制备过酸的方法原位进行。

可对反应温度进行选择，以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。明显地，对于某些个人护理应用，目标身体表面的温度可为反应温度。反应温度范围可以从仅高于反应制剂的凝固点(约0℃)至约95℃，优选的范围为5℃至约75℃，更优选的反应温度范围为约5℃至约55℃。

包含过氧羧酸的最终反应制剂的pH值为约5至约10，优选约5至约9，更优选约5.5至约8，甚至更优选约6至约8，甚至更优选约6.0至约7.5。使用缓冲液时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选1mM至1M，优选10mM至1M，最优选10mM至100mM。

在另一方面，酶促过水解反应制剂可含有有机溶剂。此类溶剂可包括但不限于丙二醇甲醚、丙酮、环己酮、二乙二醇丁醚、三丙二醇甲醚、二乙二醇单甲醚、丙二醇丁醚、二丙二醇甲醚、环己醇、苄醇、异丙醇、乙醇、丙二醇、以及它们的混合物。

单步骤对多步骤施用方法

通常用于酶促制备过酸有益剂的反应组分的最小组将包含(1)至少一种具有如本文所述的过水解活性的酶，例如CE-7过水解酶(任选地为靶向融合蛋白的形式)，(2)至少一种合适的羧酸酯底物，和(3)过氧源(例如过氧化氢)。

个人护理(即，毛发护理)组合物的过酸生成反应组分可在使用前保持分离。在一个实施例中，将过酸生成组分混合，然后与目标身体表面接触，从而使所得基于过酸的有益剂提供对身体表面的益处。可混合所述组分，然后与目标身体表面接触，或者可在目标身体表面上混合。在一个实施例中，将过酸生成组分混合，使得过酸原位产生。

也可使用多步骤施用。过酸生成体系组合物的一个或两个单组分(即，在身体表面上依次施用三种基础反应组分中的至少一种)可在施用酶促制备过酸所需的剩余组分之前与毛发表面接触。在一个实施例中，包含过水解酶和缓冲液(具有至少5.0的pH)的含水组合物在与毛发接触之前与包含羧酸酯底物和过氧化氢的第二含水组合物接触，其中第二含水组合物在4.0或更小的pH下稳定(即，“两步施用”)。如果在施用后将第一含水组合物冲掉，应将合适的缓冲液加到第二含水组合物中，所述缓冲液可为第一含水组合物中的相同缓冲液，或保持与第一含水组合物中的pH相似pH的任何缓冲液。在将所述第一和第二组合物混合时，或者在将所述第二组合物和合适的缓冲液混合时，如果所述第一组合物被冲掉，所得反应混合物提供其中所述酶催化剂是活性的并产生有效浓度过酸的pH。通常所得反应混合物的pH将为至少5.0，优选地至少5.5，更优选地至少6.0，并且最优选地约6.0至约9.0。在一个实施例中，具有过水解活性的酶是靶向过水解酶，将其施用到毛发，随后混合酶促制备过酸所需的剩余组分。

在一个优选的实施例中，具有过水解活性的酶是“靶向CE-7过水解酶”(即，CE-7融合蛋白)，将其施用到毛发，随后混合酶促制备过酸所需的剩余组分(即，两步施用方法)。靶向过水解酶在合适条件下与毛发表面接触以促进融合蛋白非共价结合到毛发表面上。可使用任选的冲洗步骤以除去过多的和/或未结合的融合蛋白，随后混合剩余的反应组分。

在另一个实施例中，在施用包含过水解酶(任选地为靶向毛发的融合蛋白的形式)的含水组合物之前将包含羧酸酯底物和过氧化氢的含水组合物施用到毛发上。

在另一个实施例中，将第一含水组合物和第二含水组合物同时施用到身体表面(毛发)。

在另一方面，混合第一和第二含水组合物以形成反应混合物，然后将该混合物施用到身体表面(毛发)。

在另一个实施例中，可将本文所述的任何组合物或方法组合形成试剂盒，用于实施本发明。所述试剂盒可包含有利于酶促产生过酸的材料和试剂。示例性试剂盒包括第一容器或隔室，其包含(1)包含羧酸酯底物和任选地一种或多种有机助溶剂、以及过氧化氢的含水组合物，其中所述组合物在pH4.0或更小pH下是pH稳定的，和(2)具有第二含水组合物(在pH5.0或更高pH下是pH稳定的)的第二容器或隔室，所述组合物包含具有过水解活性的酶催化剂和至少一种缓冲液(即，选择所述缓冲液以能够在储存期间保持pH在5.0或更高)，其中所述酶催化剂可任选地靶向毛发或包括毛发的身体表面。其它试剂盒组件可无限制地包含下列一种或多种：样品管、固体载体、说明书材料、以及用于酶促制备过酸的其它溶液或其它化学试剂，例如可接受的组分或载体。

皮肤病学可接受的组分/载体/介质

如本文所述的组合物和方法还可包含已知或换句话讲有效用于毛发护理或其它个人护理产品的一种或多种皮肤病学或美容上可接受的组分，前提条件是所述任选组分与本文所述的基本组分在物理上和化学上相容，或不会另外不当地损害产品的稳定性、美观或性能。此类任选组分的非限制性例子公开于International Cosmetic Ingredient Dictionary，第九版，2002，和CTFACosmetic Ingredient Handbook，第十版，2004。

在一个实施例中，皮肤病学可接受的载体可包含约10重量％至约99.9重量％，或者约50重量％至约95重量％，或者约75重量％至约95重量％的皮肤病学可接受的载体。适用于同组合物一起使用的载体可包括例如用在发胶、摩丝、滋补剂、凝胶、皮肤保湿剂、洗剂和免洗型调理剂的制剂中的那些。所述载体可包括水；有机油；硅氧烷如挥发性硅氧烷、氨基或非氨基硅氧烷树胶或油、以及它们的混合物；矿物油；植物油如橄榄油、蓖麻油、油菜籽油、椰子油、小麦胚芽油、甜杏仁油、鳄梨油、澳洲坚果油、杏仁油、红花油、桐树油、亚麻荠油、琼崖海棠油、柠檬油、以及它们的混合物；蜡；和有机化合物如C₂-C₁₀烷烃、丙酮、甲基乙基酮、挥发性有机C₁-C₁₂醇、C₁-C₂₀酸和C₁-C₈醇的酯(根据条件可取决于酯是否可用作过水解酶的羧酸酯底物进行选择)如乙酸甲酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯、二甲氧基乙烷、二乙氧基乙烷、C₁₀-C₃₀脂肪醇如月桂醇、十六烷基醇、硬脂醇和二十二醇；C₁₀-C₃₀脂肪酸如月桂酸和硬脂酸；C₁₀-C₃₀脂肪酰胺如月桂酸二乙醇酰胺；C₁₀-C₃₀脂肪烷基酯如C₁₀-C₃₀脂肪烷基苯甲酸酯；羟丙基纤维素、以及它们的混合物。在一个实施例中，载体包含水、脂肪醇、挥发性有机醇、以及它们的混合物。

本发明的组合物还可以包含约0.1％至约10％，或者约0.2％至约5.0％的胶凝剂以帮助向组合物提供所需的粘度。合适的任选胶凝剂的非限制性例子包括交联羧酸聚合物；未中和的交联羧酸聚合物；未中和的改性交联羧酸聚合物；交联乙烯/马来酸酐共聚物；未中和的交联乙烯/马来酸酐共聚物(例如，EMA81，可从Monsanto商购获得)；未中和的交联烯丙基醚/丙烯酸酯共聚物(例如，SALCARE^TMSC90，可从Allied Colloids商购获得)；聚丙烯酸钠、矿物油和PEG-1十三烷醇聚醚-6的未中和的交联共聚物(例如，SALCARE^TMSC91，可从Allied Colloids商购获得)；乙烯基甲醚与马来酸酐的未中和的交联共聚物(例如，STABILEZE^TMQM-PVM/MA共聚物，可从International Specialty Products商购获得)；疏水改性的非离子纤维素聚合物；疏水改性的乙氧基氨基甲酸酯聚合物(例如，UCARE^TMPolyphobe碱性可溶胀聚合物系列，可从Union Carbide商购获得)；以及它们的组合。在该上下文中，术语“未中和的”是指任选聚合物和共聚物胶凝剂材料包含未中和的酸单体。优选的胶凝剂包括水溶性未中和的交联乙烯/马来酸酐共聚物、水溶性未中和的交联甲酸聚合物、水溶性疏水改性的非离子纤维素聚合物和表面活性剂/脂肪醇凝胶网络，如适用于毛发调理产品的那些。

毛发护理组合物/产品

可将过酸生成组分加入毛发护理组合物和产品以产生有效浓度的至少一种过酸。用于生成所需量过酸的过水解酶可以融合蛋白的形式使用，其中所述融合蛋白的第一部分包含过水解酶，并且所述第二部分对毛发具有亲和力。

产生的过酸提供对毛发的益处(即，“基于过酸的有益剂”)。过酸可用作脱毛剂、用于减少毛发拉伸强度的毛发处理剂、用于增强其它脱毛剂产品性能的毛发预处理剂(例如基于硫基乙醇酸盐的毛发去除产品)、毛发漂白剂、毛发染料预处理剂、毛发卷曲/定型剂、以及作为毛发调理产品的组分。

除了基于过酸的有益剂外，毛发护理产品和制剂还可包含通常存在于毛发护理产品中的任意数量的附加组分。附加组分可有助于改善毛发的外观、质感、颜色和光泽，以及提高发量感或柔顺。

毛发调理剂是本领域熟知的，参见例如Green等人(WO0107009)，并且可商业上购自多种来源。毛发调理剂的合适例子包括但不限于阳离子聚合物如阳离子瓜尔胶、二烯丙基季铵盐/丙烯酰胺共聚物、季铵化聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物和多种聚季铵盐化合物；阳离子表面活性剂如司拉氯铵、西曲氯铵和sapamin盐酸盐；脂肪醇如二十二醇；脂肪胺如硬脂基胺；蜡；酯；非离子聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚乙二醇；硅氧烷；硅氧烷如十甲基环五硅氧烷；聚合物乳液如氨基封端的二甲硅油；以及纳米颗粒如二氧化硅纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。

毛发护理产品也可包含通常存在于美容上可接受的介质中的附加组分。此类组分的非限制性例子公开于International Cosmetic Ingredient Dictionary，第九版，2002，和CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，第十版，2004。用于毛发护理的美容上可接受的介质中常包含的组分的非限制性列表也在Philippe等人的美国专利公开6,280,747和Omura等人的美国专利公开6,139,851以及Cannell等人的美国专利公开6,013,250中有所描述，这些专利均以引用方式并入本文。例如，毛发护理组合物可为含水的、醇的或水-醇溶液，所述醇优选地为乙醇或异丙醇，相对于水-醇溶液的总重为按重量计约1至约75％。此外，毛发护理组合物可包含一种或多种常规化妆品或护肤添加剂或辅剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、芳香剂、增稠剂、胶凝剂、润湿剂和阴离子、非离子或两性聚合物、以及染料或颜料。

毛发护理组合物和方法也可包括至少一种着色剂如任何染料、色淀、颜料等，它们可用于改变毛发、皮肤、或指/趾甲的颜色。毛发着色剂是本领域熟知的(参见例如Green等人同上，CFTA International ColorHandbook，第2版，Micelle Press，England(1992)和CosmeticHandbook，US Food and Drug Administration，FDA/IAS Booklet(1992))，并且可商购自多种来源(例如Bayer，Pittsburgh，PA；Ciba-Geigy，Tarrytown，NY；ICI，Bridgewater，NJ；Sandoz，Vienna，Austria；BASF，Mount Olive，NJ；和Hoechst，Frankfurt，Germany)。合适的毛发着色剂包括但不限于染料如4-羟丙氨基-3-硝基苯酚、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚、2-硝基-对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚、指甲花、HC Blue1、HC Blue2、HC Yellow4、HCRed3、HC Red5、分散紫4、分散黑9、HC Blue7、HC Blue12、HCYellow2、HC Yellow6、HC Yellow8、HC Yellow12、HC Brown2、D&CYellow1、D&C Yellow3、D&C Blue1、分散蓝3、分散紫1、伊红衍生物如D&C Red No.21和卤代荧光素衍生物如D&C Red No.27、D&C RedOrange No.5与D&C Red No.21和D&C Orange No.10的组合；以及颜料如D&C Red No.36和D&C Orange No.17、D&C Red Nos.7、11、31和34的钙盐色淀、D&C Red No.12的钡盐色淀、D&C Red No.13的锶盐色淀、FD&C Yellow No.5、FD&C Yellow No.6、D&C Red No.27、D&C Red No.21和FD&C Blue No.1的铝盐色淀、氧化铁、锰紫、三氧化二铬、二氧化钛、二氧化钛纳米颗粒、氧化锌、氧化钡、群青蓝、柠檬酸铋和炭黑颗粒。在一个实施例中，毛发着色剂是D&C Yellow1和3、HC Yellow6和8、D&C Blue1、HC Blue1、HC Brown2、HC Red5、2-硝基-对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚和炭黑。金属和半导体纳米颗粒也可用作毛发着色剂，这是由于它们的强发光性(授予Vic等人的美国专利公开申请公布2004-0010864)。

毛发护理组合物可包括但不限于洗发剂、调理剂、洗剂、气溶胶、凝胶、摩丝和毛发染料。

在一个实施例中，提供了毛发护理产品，其包括：

1)至少一种选自下列的底物：

i)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

M为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有下列结构的甘油酯：

iii)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；以及

2)过氧化氢；其中所述第一含水组合物的pH为4.0或更小；和

b)第二含水组合物，所述第二含水组合物包含：

1)具有过水解活性的酶催化剂；

2)至少一种缓冲液；

其中所述第二含水组合物的pH为至少5.0；

其中所述第一含水组合物和所述第二含水组合物在使用之前保持分离，并且其中酶促生成的过酸在将所述第一含水组合物和所述第二含水组合物混合时产生。

在一个实施例中，过水解活性的酶是融合蛋白的形式，所述融合蛋白包含：

a)包含具有过水解活性的酶的第一部分；和

b)具有对毛发具有亲和力的肽组分的第二部分。

在另一个实施例中，对毛发具有亲和力的组分是单链肽，所述单链肽包含至少一种毛发结合肽。

在另一个实施例中，所述至少一种毛发结合肽长度在5至60个氨基酸的范围内。

在另一个实施例中，上述毛发护理产品为下列的形式：多隔室小袋、多隔室瓶、至少两个单独容器、以及它们的组合。

在另一个实施例中，第一含水组合物和第二含水组合物各自在25℃下是至少28天储存稳定的。

在另一个实施例中，第一含水组合物的pH在1.0至4.0的范围内。

在另一个实施例中，第二含水组合物的pH在5.0至8.5的范围内。

在另一个实施例中，毛发护理产品包含至少一种缓冲液，其能够在使用之前将第二含水反应混合物保持在pH5.0下或更高，并且选自乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甘氨酸、碳酸氢盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐。

在另一个实施例中，毛发护理产品的第一含水组合物、第二含水组合物、或第一和第二含水组合物两者为水包油乳液。

在另一个实施例中，毛发护理产品还包含美容上可接受的载体介质。

在另一个实施例中，在毛发护理产品中具有过水解活性的酶催化剂包括至少一种具有过水解活性的酶，所述酶选自脂肪酶、酯酶、糖酯酶、蛋白酶、酰基转移酶、芳基酯酶、以及它们的组合。

在一个优选的方面，毛发护理产品包含过水解芳基酯酶，所述过水解芳基酯酶包含SEQ ID NO：314具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

在另一个优选的实施例中，在上述毛发护理产品中使用的糖酯酶为使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基序的CE-7糖酯酶，所述特征基序包括：

a)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ基序；

b)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的GXSQG基序；

和

c)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基序。

在一个优选的方面，毛发护理产品包含融合蛋白，其中所述融合蛋白包含下列通式结构：

PAH-[L]_y-HSBD

或

HSBD-[L]_y-PAH

其中

PAH为具有过水解活性的酶；

HSBD为对毛发具有亲和力的肽组分；

L为任选的长度在1至100个氨基酸的范围内的肽接头；并且

y为0或1。

在另一个实施例中，上述毛发护理产品包含具有净正电荷的毛发结合肽。

在一个实施例中，任选的有机助溶剂是丙二醇、双丙二醇、三乙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇、己二醇、或它们的任何组合。

在一个实施例中，所述缓冲液选自乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甘氨酸、碳酸氢盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、以及它们的组合。

在一个实施例中，在混合第一和第二含水组合物时由毛发护理产品形成的过酸是过乙酸。毛发护理产品的组分可在使用前保持分离。在一个实施例中，将过酸生成组分混合，然后与毛发表面接触，从而所得的基于过酸的有益剂提供选自下列的益处：毛发去除、毛发弱化(根据毛发拉伸强度的降低进行测量)、毛发漂白、毛发染料预处理(氧化毛发染料)、毛发卷曲和毛发调理(即，一步施用方法)。在另一个实施例中，将过酸生成组分混合，使得过酸原位产生。毛发护理组合物中成分的相对量可根据期望效应而不同。

在一个优选的实施例中，上述基于过酸的毛发护理方法用于去除毛发和/或减弱毛发的拉伸强度。涉及毛发去除或拉伸强度降低的毛发护理产品可任选地包含还原剂如硫基乙醇酸盐以增强毛发的弱化和/或从表面上去除的效果，所述表面包括需要去除毛发的表面。

在另一个实施例中，上述毛发脱毛方法可用作随后施用商业毛发去除产品的预处理，所述产品包含至少一种还原剂如基于硫基乙醇酸盐的毛发去除产品。同样地，上述方法可包括接触过酸处理过的毛发与还原剂的步骤。优选地所述还原剂是硫基乙醇酸盐如硫基乙醇酸钠或硫基乙醇酸钾(例如常用于毛发去除产品如

的活性成分)。

在另一个实施例中，在毛发护理产品中具有过水解活性的酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、299、301、303、305、307、309、311、314、315、338和339具有至少95％的同一性。

在另一个实施例中，过水解酶是具有过水解活性的CE-7糖酯酶，每个酶具有使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基序，所述特征基序包括：

a)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ基序；

b)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的GXSQG基序；

和

c)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基序。

也提供了施用基于过酸的益处于毛发的方法，包括：

a)提供至少一种本发明的毛发护理产品；

在一个优选的方面，非基于过酸的有益剂是脱毛剂、毛发染料、毛发调理剂、以及它们的组合。

在另一个优选的方面，所述方法产生有效量的过酸，所述有效量范围是0.001重量％至4重量％。优选地，所述过酸是过乙酸。

重组微生物的表达

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中生产。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可为表达本发明核酸分子的合适宿主。过水解酶可在细胞内、细胞外、或细胞内和细胞外组合表达，其中细胞外表达细胞外表达比细胞内表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的例子包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施例中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个优选的实施例中，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

大规模的微生物生长和功能基因表达可使用广范围的简单或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃如甲烷或二氧化碳(在光合或化学自养宿主情况下)、不同形式和量的氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量营养素，包括小无机离子。可通过加入或不加入特定调节分子到培养物中调节生长速率，并且通常不认为该调节分子是营养物质或能源。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源和/或对生产宿主是天然的基因，尽管此类控制区域不需要是类似来源的。

可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。实际上能够驱动这些基因的任何启动子都适用于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、araB、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子，和多种用于在芽孢杆菌属中表达的噬菌体启动子。

终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施例中，包含的终止控制区是任选的。在另一个实施例中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。

工业生产

多种培养方法可用来生产过水解酶催化剂。例如，从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方法进行。分批和分批补料培养方法是常见的和本领域熟知的，例子可见于Thomas D.Brock的Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)和Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227-234(1992)。

期望过水解酶催化剂的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由天然材料和/或合成材料组成。

从分批发酵、分批补料发酵、或连续培养中回收期望的过水解酶催化剂可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内生产酶催化剂时，通过离心或膜过滤将细胞浆液与培养基分离，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其匀化，生产出包含期望酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地滤过合适的助滤剂如硅藻土或二氧化硅以在热处理步骤前除去细胞碎片，所述热处理步骤用于从酶催化剂溶液中沉淀非期望的蛋白。然后通过膜过滤或离心将包含所需酶催化剂的溶液与沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过额外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生包含所需酶催化剂的固体粉末。

当数量、浓度或其它数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。除非另行指出，凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围旨在包含其端点以及位于该范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，不希望范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

提供下列实例以展示本发明的优选方面。本领域的技术人员应理解的是实例中公开的技术遵循能够有效实施本发明的实践的技术，因此可将这些技术视为适合其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据本发明理解的是，在不背离本发明所公开的方法和实例的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实例进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。

所有试剂和材料得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，TCI America(Portland，OR)，Roche DiagnosticsCorporation(Indianapolis，IN)或Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)获得，除非另外指明。

本说明书中的下列缩写对应于量度、技术、特性、或化合物的单位如下：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分之一或几，“wt”指重量，“wt％”指重量百分比，“g”指克，“mg”指毫克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“gf”指最大克力，“den”指旦尼尔，“N”指牛顿，“tex”指以每码质量/每1000米长度纤维的克重数表示的基本特克斯(tex)单位，“HPLC”指高效液相色谱，“dd H₂O”指蒸馏并去离子水，“dcw”指干细胞重量，“ATCC”或

指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，“U”指过水解酶活性单位，“rpm”指每分钟转数，“Tg”指玻璃化转变温度，“Ten.”指韧度，“TS”指拉伸强度，并且“EDTA”指乙二胺四乙酸。

表达载体pLD001

质粒pLD001(SEQ ID NO：292)以前已经报道为大肠杆菌的适宜表达载体(参见授予Wang等人的美国专利公开申请公布2010-0158823A1；其以引用方式并入本文)。

载体pLD001来源于可商购获得的载体pDEST17(Invitrogen，Carlsbad，CA)。它包括来源于可商购获得的载体pET31b(Novagen，Madison，WI)的序列，该序列编码酮类固醇异构酶的片段(KSI)。以融合伴侣的形式包含KSI片段以促进分开的肽进入大肠杆菌中的不溶解包含体中。使用标准诱变方法修改来自pET31b的编码序列(QuickChange II，Stratagene，La Jolla，CA)以包含除存在于野生型序列中的一个半胱氨酸密码子之外的三个附加的半胱氨酸密码子。此外，编码序列中的所有Asp密码子被Glu密码子取代。使用本领域的技术人员熟知的标准重组DNA方法构建以SEQ ID NO：292提供的质粒pLD001。

由BamHI和AscI位点限定的编码序列可使用标准重组DNA方法在pLD001中的BamHI和AscI位点之间连接。所得基因融合产生目的肽从酮类固醇异构酶(KSI(C4)E)的改性片段下游融合，所述片段用于驱动所述肽到大肠杆菌中的不溶解包含体内(参见美国专利公开申请公布2009-0029420A1；其以引用方式并入本文)。

构建靶向毛发的融合过水解酶

下文描述了用于经由毛发结合序列生产靶向毛发的过水解酶表达系统的设计。

设计编码将具有过水解活性的酶(“过水解酶”)融合到毛发结合域(SEQ ID NO：290和SEQ ID NO：291)上的基因(SEQ ID NO：286和SEQID NO：287)以具有海栖热袍菌(Thermotoga maritima)过水解酶的C277S变体多核苷酸序列(SEQ ID NO：293)，其在编码柔性接头的核苷酸序列3’-末端融合；它自身还融合到毛发结合域HC263或HC1010(分别是SEQID NO：290和SEQ ID NO：291)上。基因经密码子优化以在大肠杆菌中表达，并且通过DNA2.0(Menlo Park，California)合成。将基因克隆在表达载体pLD001(SEQ ID NO：292)中的T7启动子之后，介于NdeI和AscI限制性位点之间，分别产生质粒pLR1021和pLR1022。为了表达融合蛋白，将质粒转移到大肠杆菌菌株BL21AI(Invitrogen，Carlsbad，California)中，生成菌株LR3311(与HC263融合的过水解酶；SEQ ID NO：288)和LR3312(与HC1010融合的过水解酶；SEQ ID NO：289)。

海栖热袍菌(Thermotoga maritima)过水解酶的非靶向C277S变体相似地进行克隆。海栖热袍菌(Thermotoga maritima)C277S变体的制备和重组表达以前已经由DiCosimo等人在美国专利公开申请公布2010-0087529中报道；其以引用方式并入本文。

HPLC Karst测定方法

下列测定方法由U.Karst等人Anal.Chem.1997，69(17)：3623-3627报道的方法修改而成。

测定方法

1.将300μL dd H₂O(400μL用于无样品的空白)加到2.0-mL HPLC带螺帽的小瓶(Agilent-5182-0715)中。每个样品制备一个小瓶。

2.使用250-μL的气密性注射器将100μL20mM MTS(对甲基硫甲苯；Aldrich7596-25g；fw138.23；纯度为99％)/乙腈溶液加到每个小瓶中并涡旋混合。

3.将100μL稀释H3PO4和淬灭样品加到每个小瓶中并涡旋混合。

4.将小瓶置于不透光的盒中并使测定反应在黑暗中进行10分钟，不进行搅拌。

5.从不透光的盒中移出小瓶，加入400μL乙腈到每个小瓶中，并涡旋混合。

6.使用250-μL的气密性注射器将100μL120mM TPP(三苯基膦，Aldrich T84409-25g；FW262.29；纯度为99％)/乙腈溶液加到每个顶盖小瓶(Agilent-5182-0723)中。涡旋混合。

7.将小瓶置于不透光的盒中并使测定在黑暗中继续进行30分钟，不进行搅拌。

8.从不透光的盒中移出小瓶，使用250-μL的气密性注射器将100μL2.5mM DEET(N，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺，Aldrich-D100951-100g；FW-191.27；纯度为97％)/乙腈溶液(用作HPLC外标)加到每个小瓶中，并立即注入HPLC进行分析。(测定溶液的总体积为1100μL)

HPLC分析

使用下列HPLC条件：具有Supelguard Discovery C8 Supelguard套的Supelco Discovery C8柱(15cm×4.0mm，5um；Supelco#59353-U40)。

移动相：41-100％乙腈/59-0％蒸馏水，1mL/min梯度。注射体积，15μL；分析时间，10分钟。检测器-225nm的UV吸光度。

使用CH₃CN(Sigma-34851-1L)和dd H₂O的梯度程序：

毛发束拉伸强度测试方法

开发这一对包含多个毛发纤维的毛发束的拉伸强度测试方法，并且结果将反映对多个毛发纤维的平均处理效应。将大约30-70mg毛发的所述毛发样品切成4cm长，2mm宽的发束，将其束在一起形成1mm厚，5mm长的胶条。使用快干型胶(如

硝基纤维素家用粘固剂)进一步胶粘这一发束的5mm自由端。在干燥所述胶后，切除任何松散的毛发缕并称重样品。

张力检验器95-VD(Com-Ten Industries，Pinellas Park，FL)配有100磅(～45.4kg)的负荷传感器，用其进行拉伸测试。为了减少样品滑移，将5mm宽的工业级(Velcro USA，Manchester，NH)条附接到夹具的内边缘上。在测试前将CALIBRATION设为“off”，将FORCE UNITS设为“grams”并将夹具间距调节至3cm。将测试样品浸泡在水中30秒。通过在纸巾上轻吸除去过多的水分，在毛发中留下足够的水分使其适用于100％湿度水平。将测试样品的胶粘边缘夹在夹具的“上部”和“下部”，用此种方式使

条将毛发正好保持在胶下方。通过调节速度控制旋钮将检验器速度设为～2.5英寸。利用RUN模式下的Force计量器，将TARE设为ZERO以将起始PEAK FORCE设为0。为了开始测试，将DIRECTION触发开关按下至UP位点。在测试结束时，当样品失败时，DIRECTION开关移至STOP并记录峰值力。沿着夹具的边缘切除在夹具“上部”和“下部”的毛发。打开夹具并移出残留物，风干并称重。初始样品重量和残留物组合重量的差值是经历拉伸伸长的毛发重量，并且使用这一重量计算拉伸强度。

为处理后的样品比较目的，如下定义拉伸强度：

拉伸强度(N/mg毛发)＝峰值力(牛顿)/(初始样品重量-残留物重量)

在用可商购获得的脱毛剂产品，具有可可油的

Lotion(基于碱/硫基乙醇酸钾的毛发去除产品，得自Church and Dwight Co.，Inc.，Princeton，New Jersey)，处理后，通过测量毛发束的拉伸强度(毛发弱化)完成基准测试。根据

产品说明书，推荐的处理时间为5-10分钟。因此，用

处理过5分钟至10分钟的毛发样品的拉伸强度用于测定目标水平。测试毛发样品由大约50mg毛发的发束构成，发束长度为4cm，束在一起形成1mm厚，2mm宽并且5mm长的胶条。将测试样品置于玻璃板上。用戴手套的手指将大约1mL

洗剂施用到发束。将洗剂轻柔涂抹在发束上并挤入发束以覆盖所有毛发纤维。在室温下处理期望的时间后，用自来水彻底冲洗发束以除去所有痕量洗剂。风干样品并测试它的拉伸强度。

对于这些处理时间，发现发束的拉伸强度(润湿发束，100％湿度)介于处理10分钟的～0.2N/mg毛发之间以及介于处理5分钟的0.7-1.4N/mg毛发之间。数据在表1中提供。考虑到拉伸强度的变化，毛发弱化功效的期望水平目标为1.5N/mgH，以

处理5分钟作为基准测试。

表1：拉伸测定基准测试结果

实验	样品	毛发状态	湿度	处理时间，分钟	TS，N/mgH**
						1	1	润湿	100％	5	0.74
2	2	润湿	100％	5	1.00
						3	3	润湿	100％	5	1.18
4	4	润湿	100％	5	1.42
						5	5	干燥	10-20％	5	2.53
6	6	润湿	100％	10	0.17
						7	7	润湿	100％	10	0.18
8	8	润湿	100％	10	0.18
						9	8	润湿	100％	10	0.24
10	10	干燥	10-20％	10	1.15

**TS是平均(2个样品)拉伸强度，用牛顿每毫克毛发(N/mgH)表示。

毛发颜色测量方法

风干毛发束并使用具有4mm端口的

SP64分光光度计(X-Rite，Grandville，MI)测量颜色。根据CIELAB76在D65/10°根据反射率测量颜色值。将毛发束(所有平行测定)置于具有打孔的卡片纸下，确定背景是不可见的。分光光度计的端口孔中心位于孔上以扫描下方的毛发样品。翻转毛发束并置于卡片下发，进行附加的测量。记录平均L*、a*、b*(根据CIELAB76的颜色)值。

ΔE颜色损耗根据下式进行计算：

ΔE＝((L*-L*_ref)²+(a*-a*_ref)²+(b*-b*_ref)²)^0.5

其中，

L*、a*和b*是处理后的样品束的L*、a*和b*值，

L_ref*、a_ref*和b_ref*是未处理的毛发的L*、a*和b*值

实例1

制备融合蛋白

这个实例描述了经由毛发结合域靶向毛发的过水解酶的表达和纯化。

菌株LR3311和菌株LR3312在包含50mg/L奇放线菌素的1升自动诱导培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，50mMNa₂HPO₄，50mM KH₂PO₄，25mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄，0.75％甘油，0.075％葡萄糖和0.05％阿拉伯糖)中，在200rpm搅拌、37℃下生长20小时。未靶向的过水解酶的生产以前已经在授予DiCosimo等人的美国专利公开申请公布2010-0087529中进行了描述。

通过在4℃，在8000rpm下离心来收获细胞，并且通过使用组织匀化器(Brinkman Homogenizer model PCU11；Brinkmann Instruments，Mississauga，Canada)以3500rpm将细胞沉淀物重悬在300mL的冰冻溶解缓冲液(50mM Tris pH7.5，5mM EDTA，100mM氯化钠)中进行洗涤，随后进行离心(8000rpm，4℃)。通过使用组织匀化器在冰冻缓冲液中重悬来溶解细胞，所述缓冲液包含75mg的鸡蛋白溶菌酶(Sigma)。使细胞悬浮液静置在冰上3小时以通过溶菌酶消化细胞壁，并用组织匀化器定期均化。在这个阶段，仔细操作以避免任何提取物起泡现象。分流提取物(每个500-mL瓶分流150mL)并在-20℃下冷冻。在室温(～22℃)下解冻冷冻的细胞提取物，用组织匀化器均化并使用配有5mm探针的超声波破碎仪(Branson Ultrasonics Corporation，Danbury，CT；Sonifier model450)以20％的最大输出进行超声裂解，以每秒2次脉冲裂解1分钟。将溶解的细胞提取物转移到4×50-mL锥形聚丙烯离心管中，随后在4℃以10,000rpm离心10分钟。冷冻包含细胞碎片以及未破碎细胞的沉淀物。将溶解产物的等分试样转移到15-mL锥形聚丙烯管(12×5-mL)中并加热至80℃保持15分钟，在冰上冷却，并注入4×50-mL的锥形聚丙烯离心管中。包含热稳定酶的可溶性级份和沉淀的大肠杆菌蛋白通过在4℃下以10,000rpm离心10分钟进行分离。如果在超声处理步骤后细胞破碎不完全，再次解冻冷冻的沉淀物并进行第二轮超声处理、离心和热处理。这个纯化方案的输出通常产生2-4mg蛋白/mL，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析估计融合过水解酶的纯度介于90％和75％蛋白之间。通过二喹啉甲酸(BCA)测定法(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)，使用牛血清白蛋白溶液作为标准品定量总蛋白。

实例2

将毛发靶向融合过水解酶结合到毛发上

这个实例展示了过水解酶以依赖毛发结合序列融合到过水解酶上的方式结合到毛发上。

对于毛发结合实验，使用棕色毛发束(International Hair Importers andProducts，Glensdale NY)。用2％SLES洗涤毛发，用去离子水彻底冲洗毛发并风干。

将大约20mg1cm的棕色毛发片段加到1.8-mL微量离心管中。将水解酶测定缓冲液(1.2mL)加到毛发中，随后将过水解酶加入溶液。在AdamsNutator(1105型，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上使所述酶在缓慢搅拌(24rpm)条件下结合毛发30分钟。在结合实验中包括无酶的对照(具有毛发和不具有毛发)以说明pNPA水解酶制剂的非酶促水解。在结合步骤后，将1.0-mL结合缓冲液的等分试样转移到新管中以测定未结合酶的量。移出附加的结合缓冲液并用1mL在水解酶缓冲液中的1％

洗涤毛发片段4次，随后用1mL在水解酶缓冲液中的每种缓冲液洗涤2次。然后将毛发片段重悬在1mL水解酶测定液中并测量保持与毛发结合的水解酶活性。使用海栖热袍菌(Thermotoga maritima)过水解酶的C277S变体(SEQ ID NO：293)作为非靶向过水解酶的对照。结果提供于表2中。

表2：保持在毛发上的过水解酶。

a＝在毛发上保留的过水解酶通过它的水解酶活性进行检测。100％活性是加到管中的水解酶活性，其包含～20mg毛发但是不经受洗涤。对于每种酶，100％活性是：非靶向的PAH，148μmol/min；C277S-HC263，53μmol/min；以及C277S-HC1010，125μmol/min。

表2中的数据表明靶向毛发的融合过水解酶在1％

中彻底洗涤后保留在毛发上，然而非靶向的过水解酶则不保留在毛发上。

实例3

其它靶向毛发的过水解酶的构建和生产

下列实例描述了用于靶向毛发的附加过水解酶生产的表达系统设计。表3提供了构建体的概述。

简而言之，设计多核苷酸序列(SEQ ID NO：9、39和41)以编码来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)的木聚糖酯酶(SEQ ID NO10、40和42)与18个氨基酸的柔性接头(GPGSGGAGSPGSAGGPGS；SEQ IDNO：285)的融合；它自身融合到毛发结合域HC263(SEQ ID NO290)上。这些酶属于CE-7家族的糖酯酶，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)过水解酶也是如此。

设计多核苷酸序列(SEQ ID NO：322、324、326和328)以编码来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(SEQ ID NO：314)的芳基酯酶S54V变体与18个氨基酸的柔性接头(SEQ ID NO：285)的融合；它自身融合到毛发结合域HC263(SEQ ID NO290)上。来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的芳基酯酶属于与海栖热袍菌(Thermotogamaritima)过水解酶不同类别的水解酶。

设计多核苷酸序列(SEQ ID NO：330、332、334和336)以编码来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(SEQ ID NO：315)的水解酶L29P变体与18个氨基酸的柔性接头(SEQ ID NO：285)的融合；它自身融合到毛发结合域毛发结合域HC263(SEQ ID NO：290)上。来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的酯酶属于与海栖热袍菌(Thermotogamaritima)过水解酶或耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)不同类别的水解酶。

基因经密码子优化以在大肠杆菌中表达，并且通过DNA2.0(MenloPark，California)合成。以与实例1所述方式相似的方式在质粒中克隆编码序列，它在T7启动子或pBAD启动子之后。将质粒转移到适宜的表达宿主中：在T7启动子控制下的构建体的大肠杆菌菌株BL21AI(Invitrogen，Carlsbad，California)或在pBAD启动子控制下的构建体的大肠杆菌MG1655的AraBAD衍生物。

表3：融合到与毛发具有亲和力的靶向序列上的多种水解酶/过水解酶的描述

实例4

制备包含备选酯酶/过水解酶和毛发结合域的融合蛋白

这个实例描述了如实例3所述靶向毛发的多种备选酯酶/过水解酶的表达和纯化。

在实例3的表3中表达编码融合到过水解酶上的基因的菌株在包含50mg/L奇放线菌素的1L自动诱导培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，50mM Na₂HPO₄，50mM KH₂PO₄，25mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄，0.75％甘油，0.075％葡萄糖和0.05％阿拉伯糖)中，在200rpm搅拌、37℃下生长20小时。所有融合蛋白在大肠杆菌中表达良好。通过在4℃，在8000rpm下离心来收获细胞，并且通过使用组织匀化器(Brinkman Homogenizer model PCU11)以3500rpm将细胞沉淀物重悬在300mL的冰冻溶解缓冲液(50mM Tris pH 7.5，100mM氯化钠)中进行洗涤，随后进行离心(8000rpm，4℃)。细胞通过16,000psi(～110.32MPa)的French压机两次以进行裂解。然后将裂解细胞提取物溶液转移到4×50-mL锥形聚丙烯离心管中，并在4℃下以10,000rpm离心10分钟。将包含酶的上清液转移到新管中。在每种提取物中的融合蛋白的近似量通过在考马斯染色的PAGE凝胶上与牛血清白蛋白标准物条带进行比较来估计。

因为融合过水解酶不是嗜热的，它们使用它们的C-末端His6，通过利用Co-NTA琼脂糖的金属螯合色谱(HisPur Cobalt Resin，ThermoScientific)进行纯化。通常将细胞提取物加载到5至10mL的Co-NTA琼脂糖柱上，该柱子用4倍体积的平衡缓冲液(10mM Tris HCl pH 7.5，10％甘油，1mM咪唑和150mM氯化钠)平衡。调节加载到所述柱上的每种提取物的量以含有5至10mg的融合过水解酶/mL Co-NTA琼脂糖小珠。用两倍床体积的平衡缓冲液洗涤树脂并用两倍体积的洗脱缓冲液(10mM Tris HCl pH7.5，10％甘油，150mM咪唑，500mM氯化钠)洗脱。收集片段并通过PAGE检测纯化蛋白的存在。通过PAGE分析洗脱的蛋白。所有这些蛋白可通过亲和色谱进行纯化。事实证明融合蛋白以全长形式产生。

这个实例表明了制备来自不同家族的、具有多个对毛发具有亲和力的结合域的融合水解酶/过水解酶的可行性。

实例5

融合到毛发结合域上的备选过水解酶的过水解酶活性

下列实例展示了靶向毛发的备选过水解酶的活性。

如实例4所述制备的具有多个靶向域的靶向毛发的过水解酶活性使用ABTS测定法进行测量。结果在表4中报道并示出CE-7(糖酯酶家族7)以及非CE-7过水解酶具有过水解活性

表4：多种靶向水解酶的过水解酶活性。

注：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)水解酶融合的过水解酶活性使用pH5.5的1M乙酸钠而不是pH7.5的甘油三乙酸酯进行测定，以乙酸盐作为底物的靶向过水解酶HC1121(C277S-HC263；SEQ ID NO：288)无可检出的过水解酶活性。

这个实例表明来自CE-7家族或其它家族的水解酶的其它毛发靶向融合显示过水解活性，并且可直接用于毛发或在酶处理后施用。

实例6

靶向毛发的其它过水解酶的毛发结合

下列实例展示多种靶向过水解酶(不是CE-7海栖热袍菌(Thermotogamaritima)过水解酶)可结合到毛发上。

将靶向过水解酶HC1121(C277S-HC263；SEQ ID NO：288)、HC1169(ArE-HC263；SEQ ID NO：323)和荧光假单胞菌(P.fluorescens)过水解酶变体(SEQ ID NO：331)在调节至pH6.0的100mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的5％PEG-80脱水山梨糖醇月桂酸酯溶液中稀释到50μg/mL。将10mg人的毛发加到2mL上述制剂中并在轻柔搅拌条件下在室温孵育5分钟以使酶结合到毛发上。也包括无酶对照样品。在结合后，通过抽提移出结合溶液并用在50mM pH7.2的磷酸钾缓冲液中的2mL1％

洗涤毛发。从管中移出毛发，用纸巾吸干，并转移到一组新管中。用在50mM pH7.2的磷酸钾缓冲液中的1％

冲洗毛发两次，然后用50mM pH7.2的磷酸钾缓冲液冲洗两次。结合到毛发上的酶保留量通过将毛发切成3mm的片段的SDS-PAGE分析进行测定。将片段置于500μL聚丙烯微量离心管中并用80μL凝胶加样缓冲液(20μL NuPAGE LDS样品缓冲液(InvitrogenNP0007)，8μL500mM DTT，和52μL50mM pH7.2的磷酸钾)覆盖。将毛发样品加热至90℃保持10分钟，然后冷却至4度。

将上清液(25μL)加载到NuPAGE4-12％Bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen NP0322)上并在150v运行40分钟。用水洗涤所述凝胶3次并在15mL SIMPLYBLUE^TMSafestain(Invitrogen，Carlsbad，CA；LC6060)中染色1小时，冲洗3次，然后在水中脱色3小时。将结果报道为在凝胶上的酶条带的相对强度并在表5中提供。

表5：不同融合过水解酶在毛发上的相对结合。

数据表明来自不同水解酶家族的各种不同的过水解酶可靶向毛发以及毛发结合序列在融合到除栖热袍菌(Thermotoga)过水解酶之外的过水解酶上的情况下具有功能。

实例7

低pH下共配制的底物原液的稳定性

这个实例的目的是为了示出两种反应性底物甘油三乙酸酯(TA)和H₂O₂的共制剂在低pH下的稳定性。

如表6所示，制备底物浓度在一定范围内的2X共配制的底物原液，所述制备通过加入适量的甘油三乙酸酯(食品级，Tessenderlo Fine chemicalsStaffordshire，UK；分子量218.21；99+％纯度，密度1.2)和30％H₂O₂(EMD HX0635-2，MW-34.01)到去离子(DI)水中进行，并且加入多滴5mM磷酸以调节pH至约pH4。

这些底物原液的活性通过混合一体积的2X底物原液与一相同体积的20μg/mL过水解酶溶液进行测试，所述过水解酶溶液由5mg/mL的储备原液在室温下稀释而得。反应在旋转器上进行1小时，随后通过用5mM H₃PO₄酸化10倍来淬灭反应。淬灭的样品使用

MF离心装置(30KMolecular Weight Cutoff(MWCO)，Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI，P/N OD030C35)，通过以12,000rpm离心6分钟进行过滤。滤液通过HPLCKarst测定法(同上)一式两份地进行测定，从而测定在1小时反应时间中生成的过乙酸(PAA)量。经过4周后重复测试以测定这些共配制的底物原液的稳定性。在这些测试中使用靶向过水解酶(HC1121，SEQ ID NO：288)和非靶向过水解酶(C277S，SEQ ID NO：293)。结果根据1小时中生成的平均PAA和与四周测试周期的平行测试的标准偏差在表7中概述。对于所有含酶样品，共配制的底物原液在第4周末期与初始的PAA产量相比保持至少90％的PAA产量。

本文所示pH4的共配制底物原液的稳定性与在pH7下配制的底物原液稳定性相比具有巨大改善。在一个以前的实验中，其中将100mM甘油三乙酸酯和250mM H₂O₂一起贮存或分开贮存在pH7，50mM焦磷酸盐缓冲的自制皮肤保湿剂中，在3周中的不同时间点进行三次测试：1)将50μg/mLHC1121(SEQ ID NO：288)加到pH7的甘油三乙酸酯/H₂O₂共原液中反应5分钟，2)将新制的250mM H₂O₂和50μg/mL HC1121(SEQ ID NO：288)加到pH7的100mM甘油三乙酸酯原液中反应5分钟，并且3)将新制的100mM甘油三乙酸酯和50μg/mL HC1121(SEQ ID NO：288)加到pH7的250mM H₂O₂原液中反应5分钟。这三次测试在不同天数在5分钟内生成的PAA量在表8中概述。结果表明用pH7的甘油三乙酸酯和H₂O₂共配制液生成的PAA量在3周的测试周期内降至初始量的17％，而用分开贮存的甘油三乙酸酯和H₂O₂生成的PAA量是相对稳定的。它说明在pH7下共配制底物的不稳定性主要由这两种底物在pH7下的非酶反应引起，而如上所示在这两种底物之间的非酶反应在较低pH(pH4)下受到显著抑制。

表8：共配制底物或分开配制底物在pH7下的过乙酸生成稳定性测试。

实例8

以一步施用法使用具有低PH共配制底物原液的过水解酶的毛发弱化功效

这个实例的目的是为了示出使用低pH共配制底物原液与在较高pH缓冲液中的过水解酶生成的PAA量能够有效地弱化毛发。

在pH6.6的200mM磷酸盐缓冲液中制备2X酶原液溶液、20μg/mLHC1121(SEQ ID NO：288)和20μg/mL C277S(SEQ ID NO：293)。如表9所示，在实例7中制备的低pH的共配制底物原液以不同的底物浓度组合用HC1121和C277S对毛发进行测试。对于每种测试条件，使用一式三份的毛发束。毛发束为来自International Hair Importers and Products(GlensdaleNY)的中褐色毛发。每个毛发束在一端胶粘，并且被切成5mm宽和4cm长(不包括胶粘部分)，具有100+/-20mg的净毛发重量。将每个毛发束置于清洁的塑料称重托盘(VWR，Cat.#12577-053)中。将大约0.5mL2X酶原液溶液施用到毛发束，并且用施用装置将其擦入毛发束中。然后将0.5mL2X底物原液施用到并擦入毛发束。所述毛发束在这个反应混合物中保持1小时，随后取出置于干燥盘中。将毛发束风干23小时，随后用1mL1％SLES(月桂基醚硫酸钠)(ES2K”，得自Rhodia Inc.，Cranbury，New Jersey)洗涤，然后用自来水冲洗并用纸巾干燥。这就完成了一个24小时的处理循环。重复所述处理循环10次。在处理期间毛发束颜色变淡并被弱化。在最后的冲洗和风干后，对每个毛发束进行如上文一般方法所述的拉伸强度测试以定量毛发弱化。表10所示的拉伸强度测试结果表明所有测试毛发束具有显著低于1.5N/mg毛发的强度(用

霜膏处理5分钟的毛发基准强度)。

测试条件中的底物浓度越高，处理后的毛发束的强度越低，因此毛发弱化功效越高。甚至使用最低测试底物浓度(250mM甘油三乙酸酯和50mM H₂O₂)，处理毛发束的平均强度为0.78N/mg毛发，比

处理5分钟的基准强度低得多。靶向过水解酶HC1121显示比非靶向过水解酶C277S略好的功效。

此外，每个毛发样品进行L*、a*、b*颜色测量以定量毛发颜色损耗，并且也对未处理的毛发进行L*、a*、b*颜色测量作为ΔE色差计算的基准。以标准方式计算ΔE：ΔE＝((L*-L*_ref)²+(a*-a*_ref)²+(b*-b*_ref)²)^0.5。表11所示的结果所有处理毛发样品的强效毛发淡化(漂白效应)。

表11：毛发颜色损耗结果。

实例9

使用低pH的共配制底物原液和缓冲过水解酶原液的双隔室脱毛剂产品

该实例的目的是为了示出在一个隔室上具有低pH的共配制底物原液并且在第二隔室中具有缓冲过水解酶原液的双隔室产品原型的稳定性和脱毛功效。

使用如实例7所述的相同方法制备具有500mM甘油三乙酸酯和100mM H₂O₂的2X底物原液。将底物原液的pH调节至pH3并贮存在一个管中。在200mM，pH6.6的磷酸盐缓冲液中制备具有20μg/mL HC1121(SEQ ID NO：288)的2X过水解酶原液并贮存在另一个管中。为了测试这一双隔室产品原型的稳定性，从它们的储存管中分别取出一体积的2X底物原液和一相同体积的2X过水解酶原液并混合在一起反应1小时，随后用100mM H₃PO₄酸化10倍来淬灭反应。淬灭的样品使用

离心装置(30K Molecular Weight Cutoff(MWCO)，Pall Life Sciences，AnnArbor，MI，P/N OD030C35)，通过以12,000rpm离心6分钟进行过滤。滤液通过HPLC Karst测定法(同上)一式两份地进行测定，从而测定在1小时反应时间中生成的过乙酸(PAA)量。经4周时间重复这一测试以测定这一双隔室产品原型的稳定性。

如上所述制备的样品称为“老化酶样品”。进行下列相同测试：1)无酶对照，其中用相同体积的200mM，pH6.6的磷酸盐缓冲液取代2X酶原液与2X底物原液混合，以及2)新制酶样品，其中通过将5mg/mL HC1121原液稀释到200mM，pH6.6的磷酸盐缓冲液中每日制备20μg/mL溶液。表12中示出的结果表明与第1天相比，在第29天时三分之二量的PAA由这一双隔室产品生成(对于老化酶样品和新制酶样品两者是如此)，而由无酶对照样品非酶生成的PAA保持相同。它说明低pH的共配制底物原液在室温下稳定至少4周，并且新制的酶样品和老化的酶样品显示随时间的相似稳定性，但是新制酶显示出比老化酶样品20％更高的过水解活性。老化酶样品的较低活性可由较高的去折叠概率以及由此带来的在稀释溶液中长期存在的较低酶稳定性引起。在室温下，在缓冲液中的低浓度酶的稳定性和活性可通过加入非反应性的惰性蛋白或本领域已知的其它添加剂如牛血清白蛋白(BSA)、糖、甘油和多元醇而得到进一步改善。作为另外一种选择，可以较高浓度贮存所述酶并当与底物原液混合时以较低的体积比使用。

表12：使用低pH共配制底物原液和低缓冲过水解酶原液的双隔室脱毛剂产品的PAA生成稳定性测试结果。

对毛发束(5mm宽，4cm长，在一端胶粘，具有100+/-20mg的净毛发重量)如下进行利用这种双隔室产品原型的毛发处理：在管中混合相同体积的2X底物原液和2X过水解酶原液，随后将0.5mL的反应混合物转移到静置在清洁塑料托盘上的一个毛发束上。用施用装置将反应混合物擦入毛发束中。所述毛发在托盘上保持24小时，然后风干，随后用1mL1％SLES洗涤，然后用自来水冲洗并用纸巾干燥。对每个毛发束重复24小时的处理周期14次，随后进行拉伸强度测试和颜色测量。进行下列相同毛发处理：1)无酶对照，其中用相同体积的200mM，pH6.6的磷酸盐缓冲液取代2X酶原液与2X底物原液混合；以及2)新制酶样品，其中通过将5mg/mL HC1121原液稀释到200mM，pH6.6的磷酸盐缓冲液中每日制备20μg/mL溶液。对于每种测试条件，使用一式三份的毛发束。拉伸强度测试结果和颜色损耗测试在表13和14中概述。与每个样品的PAA生成量一致，无酶样品不显著弱化毛发，但是将毛发淡化至与包含双酶的样品相似的程度，而新制酶样品和老化酶样品弱化毛发的程度比

处理5分钟的基准高得多。用新制酶样品处理的毛发强度值为用老化酶样品处理的毛发强度值的一半，因为在新制酶样品中生成20％更多的PAA。

表13：毛发弱化功效：双隔室脱毛剂产品原型的拉伸强度测试结果。

表14：毛发颜色损耗结果。

处理条件	平均ΔE	stdev
			新制酶样品	19.0	1.4
老化酶样品	16.7	1.4
			无酶对照	17.9	0.7

实例10

在皮肤保湿剂中使用低pH共配制底物原液和缓冲过水解酶原液的双隔室脱毛剂产品

该实例的目的是为了示出在一个隔室上具有低pH的共配制底物原液并且在第二隔室中具有缓冲过水解酶/皮肤保湿剂原液的双隔室产品原型的稳定性和脱毛功效。

不同于实例9，将2X过水解酶原液制成在缓冲液中的20％

Daily Moisture Lotion用于敏感干性至中性皮肤(在本专利申请全文中称为)。20％

通过将10mL洗剂加入40mL pH6.6磷酸盐缓冲液中，随后涡旋处理以制备均匀洗剂稀释液进行制备。如表15所示以两种不同的过水解酶浓度水平和两种不同的缓冲液浓度水平制备四种这些2X过水解酶原液并贮存在单个管中。使用如实例9所述的相同方法制备具有500mM甘油三乙酸酯和100mM H₂O₂的2X底物原液。将底物原液的pH调节至pH3并贮存在一个管中。根据1小时内生成的PAA量，如实例9所述的相同稳定性测试程序进行4周以监测这些双隔室脱毛剂洗剂样品的稳定性，并且在表16中概述结果。在第3周末期，PAA产量保持在所有样品77-95％的初始水平。在第4周末期，PAA产量下降至三个样品60％的初始水平，并且保持在具有较高过水解酶浓度(20μg/mL HC1121；SEQ ID NO：288)和较高缓冲液浓度(100mM缓冲液)的样品的82％的初始水平。与实例7的结果相比，具有以较低pH贮存的底物原液的这个双隔室脱毛剂洗剂产品原型的稳定性远高于在中性pH(pH7)下贮存的底物的稳定性，但是比结合新制过水解酶的相似产品更低，所述新制过水解酶在第4周末期生成90％的PAA。因此可通过加入非反应性的惰性蛋白或本领域已知的其它添加剂如牛血清白蛋白(BSA)、糖、甘油和多元醇来提高较低浓度下的过水解酶稳定性，从而进一步改善这个双隔室脱毛剂洗剂产品的稳定性。

对毛发束(5mm宽，4cm长，在一端胶粘，具有100+/-20mg的净毛发重量)如下进行利用这种双隔室脱毛剂洗剂产品原型的毛发处理：在管中混合相同体积的2X底物原液和2X过水解酶原液，随后将1mL的反应混合物转移到在清洁塑料托盘上的一个毛发束上。用施用装置将反应混合物擦入毛发束中。所述毛发在托盘上保持3小时至16小时，然后风干，随后用1mL1％SLES洗涤，然后用自来水冲洗并用纸巾干燥。对每个毛发束重复这一处理周期15次，随后进行拉伸强度测试和颜色测量。拉伸强度测试结果和颜色损耗测试在表17和18中概述。而且，无酶样品显著淡化毛发但是不显著地弱化毛发。对于所有含酶样品，反应中的酶工作浓度(20μg/mL对10μg/mL))和缓冲液浓度(100mM对50mM磷酸盐)越高，毛发淡化并弱化程度越高。最弱的条件，在50mM缓冲液中的10μg/mL HC1121洗剂弱化毛发的程度与

处理5分钟弱化毛发的程度相似：将毛发强度较低至1.5N/mg毛发。最强的条件，在10mM缓冲液中的20μg/mL HC1121洗剂显著弱化毛发：将毛发强度降低至0.2N/mg。因此，双隔室脱毛剂洗剂展示稳定性和功效，并且脱毛剂功效可与过水解酶含量和缓冲液浓度相协调。

表18：毛发颜色损耗结果。

样本ID	平均ΔE	stdev
			50mM缓冲液，10μg/mL HC1121	13.6	1.1
50mM缓冲液，20μg/mL HC1121	13.3	0.9
			100mM缓冲液，10μg/mL HC1121	22.2	1.8
100mM缓冲液，20μg/mL HC1121	25.1	1.6
			100mM缓冲液，无酶	12.4	1.2

实例11

使用不同过水解酶和不同底物生成过乙酸

这个实例的目的是为了展示PAA可利用不同过水解酶和不同底物生成。

HC1121是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的CE-7类糖酯酶(C277S-HC263；SEQ ID NO：288)，并且HC1169是来自耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的酰基酯酶(ArE-HC263；SEQ ID NO：323)。用底物甘油三乙酸酯或丙二醇二乙酸酯(PGDA，Aldrich528072)以及过氧化氢在pH5至pH7.2条件下测试两种酶的过水解活性。酶、底物和缓冲液的浓度、以及反应时间在表19中列出。对于一些反应条件也进行非酶反应以测定非酶生成的过乙酸。在反应末期，通过用100mM H₃PO₄酸化10或25倍来淬灭反应。淬灭的样品使用

MF离心装置(30K MolecularWeight Cutoff(MWCO)，Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI，P/NOD030C35)，通过以12,000rpm离心6分钟进行过滤。滤液通过HPLCKarst测定法(同上)一式两份地进行测定，从而测定在那些反应条件下生成的过乙酸(PAA)量。

在无酶的第一组测试(在不同缓冲液中使用的100mM甘油三乙酸酯和200mM H₂O₂)中，甘油三乙酸酯和过氧化氢在5分钟内生成非常少量的PAA(110ppm PAA或更少)；而加入50μg/mL HC1121后，取决于pH在5分钟内生成约277ppm至4832ppm的PAA。pH越高，生成的PAA越多。在无酶的第二组测试(250mM甘油三乙酸酯和100mM H₂O₂在溶于100mM，pH7.2磷酸盐缓冲液中的20％

洗剂中使用)中，甘油三乙酸酯和过氧化氢在60分钟内生成332ppm的PAA，而加入10μg/mL HC1169后在60分钟内生成3433ppm的PAA，并且加入10μg/mL HC1121后在60分钟内生成4451ppm的PAA。在第三组测试(250mM甘油三乙酸酯和100mM H₂O₂在不同缓冲液中使用)中，20μg/mL的HC1169在30分钟内生成3680ppm至4812ppm的PAA，显示出对pH的低依赖性。在第四组测试(250mM PGDA和100mM H₂O₂在不同缓冲液中使用)中，10μg/mL和20μg/mL的HC1169在30分钟内生成4140ppm-4726ppm的PAA，再次显示出对pH的低依赖性。此外，10μg/mL HC1169已经与提供的底物一起使反应饱和，并且20μg/mL HC1169不显示附加的PAA产量增益。

实例12

低pH底物原液共配制成的水包油乳液的稳定性和功效

这个实例的目的是为了展示可将甘油三乙酸酯和过氧化氢底物原液共配制成基于水包油(o/w)乳液的皮肤保湿剂，并且这种包含底物的皮肤保湿剂原液可有效地与过水解酶反应以产生PAA。

在总计100g的皮肤保湿制剂标度，所有油相组分在玻璃广口瓶中称重，随后在表20中示出数量级和重量。加热混合物至50℃以增溶固体组分。将水相组分混合在一起并且还加热到与油相相同的温度。然后将水相加到油相中，使用

T25数显匀化器以21000-22000rpm匀化5分钟使它们匀化成乳液。最后将用作防腐剂的(1g)加到乳液中。将这一乳液用作2X底物原液。

在各个测试时间点，一体积的这一乳液与一相同体积的200mM，pH6柠檬酸盐缓冲液混合用作无酶对照。对于含酶样品，一体积的这一乳液与一相同体积的在200mM，pH6柠檬酸盐缓冲液中的20μg/mL HC1169工作浓度水平的酶溶液混合。反应在旋转器上进行1小时，随后通过用100mMH₃PO₄酸化10倍来淬灭反应。淬灭的样品使用

MF离心装置(30K Molecular Weight Cutoff(MWCO)，Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI，P/N OD030C35)，通过以12,000rpm离心6分钟进行过滤。滤液通过HPLC Karst测定法(同上)一式两份地进行测定，从而测定在1小时反应时间中生成的过乙酸(PAA)量。经4周后重复这一测试以测定这些共配制的底物原液的稳定性，并且将稳定性结果在表21中概述。在储存一个月后，PAA产量保持在初始水平的＞70％。

如实例10所述，稳定性测试的反应混合物也用于处理毛发束：将0.7mL反应混合物转移到静置在清洁塑料托盘的一个毛发束上。用施用装置将反应混合物擦入毛发束中。所述毛发静置在托盘上3-16小时进行风干，随后用1mL1％SLES洗涤，然后用自来水冲洗并用纸巾干燥。对每个毛发束重复这一处理周期10次，随后进行拉伸强度测试和颜色测量。在表22中显示的拉伸强度测试结果和颜色损耗结果表明20μg/mL HC1169将毛发显著弱化到0.23N/mg的毛发拉伸强度水平，并且产生25ΔE的颜色损耗，而用无酶对照处理的毛发仍具有2.8N/mg的毛发拉伸强度，并且仅产生6ΔE的颜色损耗。这些结果表明低pH的共配制底物/皮肤保湿剂原液当与缓冲过水解酶溶液一起作用时的显著毛发弱化功效和显著毛发淡化功效。

表20：包含2X甘油三乙酸酯和过氧化氢的水包油皮肤保湿剂的配方。

表21：在皮肤保湿剂制剂中低pH下的共配制底物原液的PAA生成稳定性测试结果：200mM甘油三乙酸酯，100mM H ₂ O ₂ 工作浓度，60分钟反应时间。

Claims

1.毛发护理产品，包括：

1)至少一种选自下列的底物：

i)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化或环状烃基部分，其中对R₆＝C2-C7，R₆任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有下列结构的甘油酯：

iii)一种或多种下式的酯：

2)过氧化氢；其中所述第一含水组合物的pH为4.0或更小；和

b)第二含水组合物，所述第二含水组合物包含：

1)具有过水解活性的酶催化剂；和

2)至少一种缓冲液；其中所述第二含水组合物的pH为至少5.0；并且

其中所述第一含水组合物和所述第二含水组合物在使用之前保持分离，并且其中酶促生成的过酸在将所述第一含水组合物和第二含水组合物混合时产生。

2.根据权利要求1所述的毛发护理产品，其中所述具有过水解活性的酶为融合蛋白的形式，所述融合蛋白包含：

c)包含所述具有过水解活性的酶的第一部分；和

d)具有对毛发具有亲和力的肽组分的第二部分。

3.根据权利要求2所述的毛发护理产品，其中所述第二部分为单链肽，所述单链肽包含至少一种毛发结合肽。

4.根据权利要求3所述的毛发护理产品，其中所述至少一种毛发结合肽的长度在5至60个氨基酸的范围内。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的毛发护理产品，其中所述毛发护理产品为下列的形式：多隔室小袋、多隔室瓶、至少两个单独容器、以及它们的组合。

6.根据权利要求1所述的毛发护理产品，其中所述第一含水组合物和所述第二含水组合物各自在25℃下是至少28天储存稳定的。

7.根据权利要求1所述的毛发护理产品，其中所述第一含水组合物的pH在1.0至4.0的范围内。

8.根据权利要求1或权利要求7所述的毛发护理产品，其中所述第二含水组合物的pH在5.0至8.5的范围内。

9.根据权利要求1所述的毛发护理产品，其中所述至少一种缓冲液能够在使用之前将所述第二含水反应混合物保持在pH5.0下或更高，并且选自乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甘氨酸、碳酸氢盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐。

10.根据权利要求9所述的毛发护理产品，其中所述第二含水反应混合物中的缓冲液浓度为10mM至1M。

11.根据权利要求1所述的毛发护理产品，其中所述第一含水组合物、所述第二含水组合物、或所述第一和所述第二含水组合物两者为水包油乳液。

12.根据权利要求1或权利要求2所述的毛发护理产品，还包括美容上可接受的载体介质。

13.根据权利要求1或权利要求2所述的毛发护理产品，其中所述具有过水解活性的酶催化剂包含至少一种具有过水解活性的酶，所述具有过水解活性的酶选自脂肪酶、酯酶、糖酯酶、蛋白酶、酰基转移酶、芳基酯酶、以及它们的组合。

14.根据权利要求13所述的毛发护理产品，其中所述芳基酯酶包含与SEQID NO：314具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

15.根据权利要求11所述的毛发护理产品，其中所述具有过水解活性的酶包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、293、297、299、301、303、305、307、309、311、314、315、338和339中的任一个具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

16.根据权利要求13所述的毛发护理产品，其中所述糖酯酶为具有使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基序的CE-7糖酯酶，所述特征基序包括：

a)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ基序；

b)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的GXSQG基序；

和

c)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基序。

17.根据权利要求2所述的毛发护理产品，其中所述融合蛋白包含下列通式结构：

PAH-[L]_y-HSBD

或

HSBD-[L]_y-PAH

其中

PAH为具有过水解活性的酶；

HSBD为对毛发具有亲和力的肽组分；

L为任选的长度在1至100个氨基酸的范围内的肽接头；并且

y为0或1。

18.根据权利要求17所述的毛发护理产品，其中所述对毛发具有亲和力的肽组分为抗体、F_ab抗体片段、单链可变片段(scFv)抗体、骆驼科(Camelidae)抗体、支架展示蛋白或缺乏免疫球蛋白折叠的单链多肽。

19.根据权利要求18所述的毛发护理产品，其中所述对毛发具有亲和力的肽组分包含对人的毛发的10^-5M或更小的K_D值或MB₅₀值。

20.根据权利要求18所述的毛发护理产品，其中所述缺乏免疫球蛋白折叠的单链多肽包含2至50个毛发结合肽，其中所述毛发结合肽独立地并且任选地被长度在1至100个氨基酸的范围内的多肽间隔区分开。

21.根据权利要求17、权利要求18、权利要求19或权利要求20所述的毛发护理产品，其中所述毛发结合肽包含净正电荷。

22.根据权利要求1或权利要求2所述的毛发护理产品，其中通过将所述第一含水组合物和所述第二含水组合物混合形成的所得反应混合物包含所述过水解酶催化所述过酸的产生的pH。

23.向毛发提供基于过酸的益处的方法，包括：

a)提供权利要求1或权利要求2的毛发护理产品；

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述非基于过酸的有益剂为脱毛剂、毛发染料、毛发调理剂、以及它们的组合。

25.根据权利要求23所述的方法，其中生成有效量的过酸，所述有效量在0.001重量％至4重量％的范围内。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述过酸为过乙酸。

27.根据权利要求23所述的方法，其中将所述第一含水组合物和所述第二含水组合物在接触人的毛发之前混合。

28.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一含水组合物和所述第二含水组合物同时施用到人的毛发。

29.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一含水组合物和所述第二含水组合物依次施用到人的毛发。

30.根据权利要求29所述的方法，其中将所述第一含水组合物施用到人的毛发，然后将所述第二含水组合物施用到所述人的毛发。

31.根据权利要求30所述的方法，其中将所述第二含水组合物施用到人的毛发，然后将所述第一含水组合物施用到所述人的毛发。

32.权利要求1或权利要求2的毛发护理产品向人的毛发提供基于过酸的益处的用途。