KR20130132903A - 항-ccr4 항체들 및 이의 용도들 - Google Patents

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어스비트 하젬안
렘코 알버트 그리엡
허랄드 레이어센
셀게즈 미차이로빅 키프리자노브
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아피테크 리서치 에이에스
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Abstract

본 발명은 인간 CC 케모킨 수용체 4(CCR4)의 세포외 도메인내 에피토프에 결합하고, 대식세포-유도된 케모킨(MDC) 및/또는 흉선 및 활성화 조절된 케모킨(TARC)의 CCR4에 결합을 억제할 수 있는 항체를 제공한다. 또한 이러한 항체를 포함하는 면역접합체 및 조성물 그리고 이러한 항체를 의학 및 진단 분야에 특히 이용하는 이러한 항체와 관련된 용도를 또한 제공한다.

Description

항-CCR4 항체들 및 이의 용도들{Anti-CCR4 antibodies and uses thereof}
본 발명은 항체들, CCR4 생물학 및 관련 요법 분야에 일반적으로 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 CCR4에 결합하는 항체들을 제공한다. 항-CCR4 항체들은 CCR4와 연관된 질환들 및 이상에서 진단 및 치료 용도를 가지는데, 가령, 종양혈관들의 영상화, 암의 치료 및 바이러스성 및 기타 감염들, 그리고 염증성 질환들 및 면역 질환들의 치료에 진단 및 치료 용도를 가진다. 본 발명의 항체-기반 조성물들 및 방법들은 면역접합체들(immunoconjugates) 및 기타 치료 복합물의 용도, 키트, 및 방법들까지 또한 확장된다.
800개 이상의 구성요소들을 가진, G-단백질-결합된 수용체들 (GPCRs)은 신호 전달에 관련된, 인간 게놈에 의해 인코드되는 전체 유전자들의 >2%를 차지하는 세포 표면 분자들의 최대 패밀리를 나타낸다. GPCR 슈퍼패밀리의 구성요소들은 공통적인 막 배치를 공유하는데: 세포외 N-말단, 세포내 C-말단 그리고 7가지 막통과(TM) 헬릭스, 이들은 3개의 세포내 루프 및 3개의 세포외 루트에 의해 연결된다. 이들이 공유하는 배치학적 구조에 근거하여, GPCRs는 7개의 막통과 (7TM) 수용체들이라고도 불린다. 이들 수용체들은 신경전달, 내분비 및 외분비 선으로부터 호르몬 및 효소 방출, 면역 반응들, 심장- 및 평활근 수축 그리고 혈압 조정을 포함하는 주요 생리학적 기능을 관리한다. 이들의 기능이상은 가장 만연한 인간 질환들중 일부에 기여한다. 새로운 실험적 그리고 임상적 데이터들은 GPCRs가 암 진행 및 전이에 주요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 일부 GPCRs는 항-암 약물들의 적합한 표적이 될 수 있다는 가능성이 있다.
케모킨들은 암, 바이러스성 감염들, 천식 및알레르기성 질환들, 뿐만 아니라 자가면역 병리 예컨데 류마티스성 관절염 및아테롬성 동맥경화증을 포함하는 다양한 질환들 그리고 장애들에서 그중에서도 특히 면역 및 염증성 반응들에서 중요한 역할을 한다. 이들 작은, 분비된 분자들은 보존된 4개의 시스테인 모티프에 의해 특징화되는 8-14 kDa 단백질들의 커지는 슈퍼패밀리다.
연구들에 따르면 케모킨들의 작용들은 G 단백질-결합된 수용체들의 하위패밀리에 의해 중개되는데, 그 중에서도 수용체 지정된 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 4, 또는 CC 케모킨 수용체 4 (CCR4)라고 설명되고 있다. CCR4에 대한 특이적 리간드들은 케모킨들 흉선 및 활성-조절된 케모킨 (TARC) (CCL17로도 또한 알려짐) 및 대식세포-유도된 케모킨 (MDC) (CCL22로도 또한 알려짐)을 포함한다. CCR4는 RANTES, MCP-1 및 MIP-1알파에 또한 결합할 수 있고, 그리고 이들 리간드들에 반응하여 CCR4 신호생성이 또한 보고된 바 있다.
CCR4는 그 중에서도 특히 T 세포 화학주성(chemotaxis) 및 염증 부위들로 식작용(phagocytic) 세포들의 이주의 기능에 중요한 것으로 보고 있다. CCR4는 T-헬퍼 세포 유형 2 (Th2) 세포들 및 조정 T (Treg) 세포들 상에서 선호적으로 발현되며, 반면 다른 건강한 세포들 또는 조직들 상에서는 제한된 발현이 일어난다.
종양세포들, 특히 성인 T 세포 백혈병/림프종 세포들은 CCR4에 대해 양성일 수 있다. 종양 세포들에 의한 CCR4의 발현은 피부 연루와 연관된다. 특정 T-세포 악성은 전형적으로 피부에 위치한다. 예를 들면, CCR4는 피부의 T 세포 림프종 병소들에서 높은 수준으로 발견된다. 좀더 최근에, CCR4는 특정 고형 종양들에 의해 발현된다는 것이 또한 밝혀졌다(WO2009/037454). CCR4 발현은 고형 종양들의 발암, 특히 경부, 식도, 신장, 뇌, 유방, 난소, 전립선, 위 및 췌장의 암의 발암에서 초기 사건으로 보고 있다. 따라서, 혈액학적 그리고 비-혈액학적 암 세포들 모두 CCR4를 발현시킬 수 있다. 결과적으로, 항-CCR4 항체들을 이용하여 이들 암을 진단, 감시 및 치료할 수 있다.
추가로, CCR4는 정상 및 종양 면역에 중요한 역할을 갖는다. CD4+CD25+ 조정 T-세포들(Tregs)의 중요한 분획은 CCR4에 대해 양성이다(Baatar et al, 2007b). 이들 Tregs는 다양한 기전을 통하여 면역 반응들을 억제하고, 이들은 종양-특이적 면역을 억제할 수 있는 것으로 나타났다. Tregs의 증가된 숫자, 기질을 침윤(infiltrating), 종양 자체, 또는 임파절 유출은 다양한 암에서 악화된 결과와 관계있다. 마우스 모델의 연구에서 Treg 활성의 감소는 면역계에 의한 내생성 항-종양면역의 증가와 항-종양 중재의 효과 증가로 이어진다는 것을 보여준다. 결과적으로, Treg 기능의 억제는 종양들의 면역요법에서 전도유망한 전략이다. Tregs를 죽이고(고갈), 이들의 억제물질 기능을 간섭하고, 이들의 분자이동(trafficking) 패턴을 변경시키거나 또는 이들 분화를 변경시킴으로써 이러한 억제를 획득할 수 있다.
CCR4+ T-세포 백혈병/림프종을 가진 환자들의 일부에서, 종양 세포들 자체가Treg 세포들로 기능을 하여, 숙주 항종양면역 반응들에 직면하여 종양 생존에 기여한다. 다른 유형들의 암에서, MDC 및 TARC는 종양 세포들 및 종양 미환경(microenvironment)에 의해 생성되고, 그리고 CCR4+ Treg 세포들을 종양으로 끌어들이고, 여기에서 숙주 면역 반응들로부터 종양이 도망치는데 선호적인 환경이 창출된다. 다음의 암들을 가진 환자의 말초 혈액에는 더 높은 빈도의 Tregs가 보고되었다: 유방암, 결장직장암, 식도암, 위암, 간세포 암종, 폐암, 흑색종, 난소암 그리고 췌장암. Treg 세포들은 종양들이 선호하는 환경을 창출하는 것으로 보고된 바 있다. 그러므로, CCR4와 이의 리간드들 예컨데 MDC 사이에 상호작용의 차단은암, 특히 상기에서 열거된 암의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. SCID 마우스 모델에서, 인간 MDC/CCL22에 대한 항체는 인간 Treg 세포들이 이식된 인간 난소 종양들로 침윤하는 것을 차단할 수 있다고 보고된 바 있다. 인간 고형 종양들에 존재하는 Treg 세포들은 종양 성장 및 전이를 느리게 하는데 기여할 수 있는 면역 효과물질 반응들 발달을 방지하는 것으로 본다. 따라서, CCR4에 대항하여 지향된 중화 MAb(단클론 항체)를 이용하여 종양 덩어리에서 Treg 세포들의 사멸, 및/또는 Treg 세포들이 종양들 부위로 이동을 방지하면 고형 종양들을 향한 강화된 면역 반응들을 야기할 수 있고, 그리고 통상적인 세포독성 또는 항-호르몬 요법에 보조로 작용한다.
모든 인간의 사망에서 약 13%의 원인이 암이다. American Cancer Society에 따르면, 2007년 세계적으로 7백6십만명이 암으로 사망하였고, 추가적인 항-암 요법이 확실하고 시급한 대책이 필요하다.
CCR4가 염증 및 면역 장애들에서 주요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. Th2 세포들 및 호염기성세포들은 폐와 피부에서 알레르기성 반응에 주요 세포들이다. 알레르겐-공격을 받은 천식 환자의 기관지 생검에서 기도 상피 세포들 상에 CCR4를 발현시키는 T 세포들과 CCR4 리간드들 (MDC, TARC)의 수반되는 발현이 있다는 것을 설명하는 다수의 보고가 있다.(Panina-Bordignon et al, 2001). CCR4+ T 세포들은 아토피성 피부염 환자들에서 증가된 수로 또한 발견되며, 그리고 이 질환이 개선될 때 CCR4+ T 세포들의 급격한 감소가 관찰되었다. 천식의 인간화된 SCID 마우스 모델을 이용하여, 알레르겐 공격 전, 항체들로 CCR4를 차단시키면 알레르기성 기도 염증이 감소되었을 뿐만 아니라, 폐에서 Th2 사이토킨들의 수준도 감소되었다는 것을 보여주었다. 차단 항체의 폐 운반을 통하여 CCR4+ T 세포들을 고갈시키는 것이 천식 환자를 위한 적합한 치료 선택이 될 수 있다. CCR4 차단 항체를 피부로 표적 운반시키는 것 또한 아토피성 피부염에 대한 매력적인 치료가 될 수 있다.
알레르기성 천식에서, 높은 수준의 알레르겐-특이적 IgE의 존재는 일반적으로 흡입된 환경적 알레르겐들에 반응하여 비정상적인 Th2 세포 면역 반응을 반영한다. 천식은 Th2 림프세포들 및 호산구들의 침윤 및 Th2 케모킨들의 생산을 특징으로 한다. 알레르겐들은 유입되는 외부 항원들을 지속적으로 채집하는 수지 세포들 (DCs)에 의해 T 세포들로 제공된다. DCs에 의한 적절한 활성화때, 병에 걸린 기도에 존재하는 알레르겐-특이적 림프세포들은 Th2 사이토킨들 인터루킨 (IL)-4, IL-5 및 IL-13을 생산하고, 백혈구 분출(extravasation), 고블릿(goblet) 세포 과형성 그리고 기관지 과다-반응(BHR)을 더욱더 조절한다. DCs에 의해 생산된 TARC 및 MDC는 CCR4 촉발을 통하여 Th2 세포들의 선택적 이동을 유도하지만, Th1 세포들의 이동은 유도하지는 않는다(Perros et al, 2009). 천식의 뮤린 모델에서, 항-TARC 항체들을 이용한 치료는 기관지폐포 세척 (BAL) 유체에서 CD4+ T 세포들 및 호산구들의 수를 감소시키고, Th2 사이토킨들의 생산 및 알레르겐 공격 후 기도 과민 반응을 감소시켰다는 것을 보여주었다(Kawasaki et al, 2001). 대조적으로, CCR4-부족한 마우스는 기도 염증 및 BHR에 대항하여 보호를 보여주지 않았다(Chvatchko et al, 2000). 천식의 인간화된 SCID 마우스 모델을 이용하여, 알레르겐 공격전 항체들을 이용하여 CCR4를 차단시키면 알레르기성 기도 염증 뿐만 아니라 폐에서 Th2 사이토킨들의 수준들이 감소되었다는 것을 보여주었다(Perros et al, 2009). 이들 데이터는 CCR4 차단이 인간에서 알레르기성 염증을 억제하는 실현가능한 전략이라는 것을 나타낸다.
Treg 세포들은 수지상 세포들 (DCs)을 억제시킬 수 있고, 이로 인하여 질환들, 특히 감염성 질환들 및 암의 발생 및 진행을 실행시킨다. 따라서, Treg 세포들에 의한 수지상 세포들의 억압을 차단시킬 수 있는 항-CCR4 항체들은 백신에서 어쥬번트들로 유용할 수 있고, 특히 종양 백신접종 또는 감염성 질환에 대항한 백신접종에서 어쥬번트들로 유용할 수 있다. 따라서, 항-CCR4 항체는 백신의 치료 효과의 강화, 특히 백신-유도된 면역 반응을 강화시킬 수 있다.
CCR4 결합 화합물들은 뮤린 알레르기성 염증 (Purandare et al, 2007, Burdi et al. 2007)에서 효과를 보이는 것으로 보고된 바 있다. TARC에 의해 유도된 복막으로의 CCR4 의존적 백혈구의 모집이 거의 90% 억제되었기 때문에, CCR4-결합 화합물은 생체에서 상당한 효능을 가진 것으로 보고된 바 있다. Yokoyama 및 동료들은 CCR4를 표적으로 하는 퀴나졸린 유도체를 제시하였는데, 마우스 모델에서 과민성 반응의 감소에 생체내에서 효과적이라는 것을 증명하였다(Yokoyama et al, 2008b); 이 화합물의 유도체는 경구 투여시 마우스 모델의 생체내에서 유사하게 효과적이라는 것이 증명되었다(Yokoyama et al, 2009). 최근, 한 그룹의 과학자들은 가상실험적(in silico) 모델링 방식을 이용하여 다수의 CCR4 길항제들을 확인하였다 (Bayry et al, 2008; Davies et al, 2009). 모델화된 CCR4에 화합물들을 도킹시킴으로써, 저자들은 막통과 영역 내에 결합할 수 있는 분자들을 발견하였다. 16개 화합물들은 CCRF-CEM 세포들의 CCR4-매개된 이동을 억제하였다. CCR4 길항제들을 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 B형 간염 백신들과 함께 생체내에서 이들의 어쥬번트 기능을 테스트하였을 때, 세포 및 체액 면역 반응들 모두에 대해 강화된 면역원성이 관찰되었다. 관찰된 효과는 Treg 활성의 억제에 대한 것이었다(Bayry et al, 2008; Davies et al, 2009). Treg 세포들의 상당한 분획이 CCR4-양성이라는 사실은 당업계에 공지되어 있다(Baatar et al 2007b). 관찰된 효과는 감염성 질환들 (예를 들면, 바이러스, 박테리아, 미코박테리아 또는 기생생물 예컨데 원생동물이 원인이 되는)에 대항한 백신 접종 뿐만 아니라, 암 백신에서도 유용한 것으로 본다.
어쥬번트로써 이들 화합물들의 효과에 대한 원인은 CCR4 중개된 신호생성을 차단함으로써 Tregs의 억제에 근거하기 때문에, 길항적 방식으로 CCR4에 항체들 결합은 동일한 방식으로 작용할 것으로 기대하며; 소(small) 분자 약물들과 비교하여 항체들의 약리학적 장점들은 당업계에 공지되어 있다. Kyowa-Hakko의 항-CCR4 항체 KW-0761은 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 이 항체는 ADCC에서만 효과적이다; CCR4 수용체를 통한 리간드-중개된 신호생성을 막지는 못한다. 따라서, 본 발명에서 설명되는 항체들은 Tregs를 통하여 면역 반응을 조절함에 있어서 분명히 뛰어날 것으로 기대된다.
임상적으로 유용한 Tregs를 조절하는 또다른 용도는 암 치료다. Tregs는 종양-특이적 면역을 억제할 수 있고, 그리고 이들의 증가된 수는 일부 암에서 비선호적 진행 및 질환 진전과 관계있다. 마우스 모델에서 연구는 Treg 활성을 감소시키면 내생성 항-종양면역을 올리고, 그리고 활성 면역 중재의 효과를 증가시킨다는 것을 설명한다. 결과적으로, Treg 기능의 억제는 인간 암 면역요법에서 전략적으로 가치있는 생각이다(Curiel, 2008; Ruter et al, 2009). 이러한 억제는 Tregs를 조절함으로써, 또는 이들을 직접적으로 죽임으로써 모두 얻을 수 있다.
이러한 방식의 예들은 CD25와 같은 Treg의 다른 표면을 표적으로 하는 화합물들에 의해 당분야에서 설명된다. 다클리주마브(Zenapax®;Roche)) 및 바실리시마브(Simulect®;Novartis)는 자가면역 질환들, 이식 및 HTLV-1 유도된 성인 T-세포 림프종/백혈병을 포함하는 암에 사용 승인된 항-인간 CD25 항체들이다(Church, 2003). 데닐루킨 디프티톡스(Denileukin diftitox)(Ontak®, DAB389IL-2; Ligand Pharmacutical Inc.)는 인간 IL-2에 디프테리아 독소의 활성 도메인을 융합한 재조합 단백질이다. 1998년, FDA는 피부의 T 세포 백혈병/림프종을 치료하는 것으로 승인하였고(Olsen et al, 2001), 이는 보통 CD4+CD25+이다. 데닐루킨 디프티톡스는 IL-2 수용체를 표적으로 하며, 엔도사이토시스에 의해 CD25를 통하여 내화되는 것으로 제안된다. 데닐루킨 디프티톡스는 신장 세포 암을 가진 환자들에서 종양 백신의 면역원성을 개선시킨다는 증거 또한 있다(Dannull et al, 2005). 또한, 데닐루킨 디프티톡스는 Treg 수를 감소시키고, 그리고 흑색종에서 개선된 흑색종-특이적 면역으로 기능한다는 보고가 있다(Mahnke et al, 2007)
암 치료를 표적으로 하는 또는 암 백신 효과를 개선시키는 Tregs상의 다른 분자들은 GITR (글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체-관련된 유전자)를 포함하고(Levings et al, 2002), Toll-유사 수용체들 (TLR)은 인간 Tregs (Yang et al, 2004, Rutter et al, 2009) 및 세포독성 T 림프구 항원-4 (CTLA-4; CD152)을 포함하는 다양한 포유류 세포들 상에서 산재적으로 발현된다(Sutmuller et al. 2001). 현재, 항-CTLA-4 단클론 항체 요법의 상 II 및 III 임상 시험은 흑색종에서 실행되며, 그리고 상 I 및 II 시험은 다른 유형의 종양들에서 실행된다. 두 가지 인간 단클론 항체들은 연구중이다-이피리무마브(ipilimumab)(MDX-010; Bristol-Myers Squibb/Medarex) 및 트레멜리무마브(tremelimumab) (CP-675,206; Pfizer).
CCR4는 그중에서도 특히 다음의 장애들에 또한 연루되어 있다: 성인 T-세포 백혈병/림프종, 말초 T-세포 림프종, 피부의 T-세포 림프종 (CTCL), 상세불명 미만성 거대 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, B-세포 만성 임파성 백혈병, 입스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 감염, 균상식육종(Mycosis fungoides) (성숙한 T-세포 림프종), 세자리(Sezary) 증후군 (균상식육종(Mycosis fungoides)의 변이체), 알레르기성 기관지폐 아스퍼질러스증(ABPA), 천식, LPS-유도된 내독성 쇼크, 알레르기성 염증, T-세포 중개된 신경퇴행성 질환들 예컨데 다발성 경색 (MS), 자가면역 질환들 예컨데 건선, 캐슬만(Castleman)의 질환 및 류마티스성 관절염 (RA).
이들의 복합 구조들 때문에, GPCRs는 특이적 항체들을 생성시키는데 "어려운 표적"으로 간주된다. 이들은 용해된 세포들의 막 분획으로부터 용이하게 정제할 수 없고, 상이한 발현계에서 정확하게 폴드된 가용성 단백질들로 재조합적으로 생산될 수도 없다. 현재까지 발명자들이 아는 한, 파아지 디스플레이를 이용하여 항-GPCR 항체들을 만들기 위한 다른 모든 시도들은 성공하지 못하였다.
GPCRs에 대항하는 항체들을 생성하는 것과 연관된 어려움은 Hoogenboom et al., 1999에서 설명된다. 더욱이, Sui et al. (2003)는 GPCR 케모킨 수용체 CXCR4에 대한 인간 항체들을 얻고자 하는 노력과 연관된 곤란함을 설명하고, 그리고 스텝-백 선택(step-back selection)과 복합된 패스파인더(pathfinder) 방법을 이용하여도 특이적 항체들을 확인할 수 없다는 것을 보고한다. 따라서, GPCRs 분야에서, 특이적 항체들의 생성이 주요 난제로 남아있다.
인간 CCR4와 반응하는 1G1이라고 불리는 뮤린 단클론 항체는 BD Pharmingen에서 시판되는 것을 이용가능하다. 이 항체는 면역형광 착색에 이용할 수 있지만, 그러나 이 항체는 중화 항체는 아니다.
CCR4에 대한 키메라 항체, KM2760은 Ishida et al., 2006에서 공개된다. 이 항체는 CCR4가 이의 리간드들 MDC 또는 TARC에 결합하는 것을 차단하지 못한다고 이 저자들은 보고한다.
CCR4를 인지하는 추가 항체들의 확인은 치료 선택의 수를 확장시키는데 유익할 것으로 발명자들은 인지하였다. 특히, CCR4가 하나 이상의 이의 리간드들에 결합을 차단시키는 항체들은 추가 치료적 방법들을 제공할 것이다.
발명자들은 면역학적 견해로부터 더 내성있는 인간 치료를 위한 치료 물질들의 개발이 유익할 것이라고 또한 인식하였다. 이 점에 있어서, 인간 항체들은 일반적으로 인간 치료에 사용하는데 최소한 3가지 잠재적 장점들을 가진다. 첫째, 인간 면역계는 항체를 외부물질로 인지하지 않아야 한다. 둘째, 인간 순환계에서 반감기는 자연적으로 생성되는 인간 항체들과 유사하여, 더 작은 그리고 덜 빈번한 투약이 제공되는 것을 허용한다. 셋째, 효과물질 부분은 인간이기 때문에, 인간 면역계의 다른 부분들과 상호작용을 더 잘 할 것이다.
당업계는 장기 투여를 포함하는, CCR4가 관련된 장애들을 가진 환자들의 안전하고 효과적인 치료에 이용될 수 있는 항-CCR4 항체들이 여전히 부족하며, 그리고 이러한 항체들의 개발에 도전해야 한다.
특히, CCR4에 대한 인간 항체들이 필요하다. 인간 항체들은 장점들을 나타내는 것으로 일반적으로 인지되지만, 성공적인 인간 요법을 위한 후보물질이 되기 위한 충분히 높은 친화력과 적절한 기능적 성질들을 보유한 인간 항체들의 개발은 솔직히 가당치 않다고 알려져 있다. GPCRs의 경우에는 이들의 복잡함과 막통과 성질로 인하여 더욱 더 그러하다.
CCR4와 하나 이상의 이의 리간드들 예컨데 MDC 및/또는 TARC 사이에 결합을 차단시킬 수 있는 항-CCR4 항체들은 여전히 필요하다.
발명의 설명
본 발명은 종양들, 바이러스성 감염들 그리고 CCR4+ 세포들이 연관된 기타 질환들 및 이상들, 예컨데 염증성 또는 면역 장애들의 안전하고 효과적인 치료에 사용하기 위한 새로운 치료 조성물들 및 방법들을 제시함으로써, 선행기술에서의 특정 한계들을 극복한다. 본 발명은 CCR4에 결합하는, CCR4의 세포외 도메인 안에 에피토프에 선호적으로 결합하는 항체들, 특히 인간 항체들에 근거한다. 이러한 항체들은 종양들 및 바이러스성 감염들 그리고 CCR4+ 세포들이 연관된 기타 질환들 및 이상들, 예컨데 염증성 또는 면역 장애들의 치료에 효과적이다. 본 발명의 조성물들 및 방법들은 이들 특정 범주의 항체들을 이용하여 면역접합체들 및 복합들의 이용까지 또한 확장된다.
본 발명의 특정 장점은 제공되는 항체들이 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합을 억제한다는 것이다. 이는 임상 분야에서 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합을 억제하지 않는 주요 항체들과 대조적이다.
본 발명자들은 CCR4에 결합하는 CCR4-특이적 항체들을 제조하였다. 예를 들면, 이 항체들은 CCR4+ 세포들, 특히 CCR4로 형질감염된 HEK293T-세포들, CCR4로 형질감염된 DT40-세포들 그리고 자연적으로 CCR4를 발현시키는 CCRF-CEM 세포들, 뿐만 아니라 CCR4를 발현시키는 다음 세포들에 결합한다: Hut78 (피부의 T-세포 림프종, ATCC 번호 TIB-161), 786-O (인간 신장 세포 암종, ATCC 번호 CRL-1932), MCF-7 (인간 유방 선암, ATCC 번호 HTB-22), KatoIII (인간 위암, ATCC 번호 HTB-103), L-428 세포들 (비-호지킨 림프종, DSMZ 번호 ACC 197) 및 A-498 (인간 신장 세포 암종, DSMZ 번호 ACC 55)(실시예 2). 중요한 것은, 이 항체들은 CCR4- 세포들, 가령 CCR4를 발현시키지 않는 세포들에는 유의적으로 결합하지 않는다. 따라서, 여기에서 공개된 항체들은 CCR4에 특이적으로 결합하여, 여기에서 논의되는 질환들의 진단 및 치료에 적합한 후보물질로 만든다.
CCR4의 세포외 도메인 안의 에피토프에 결합하는 본 발명의 바람직한 항체 분자들 및 상보성 결정 영역들(CDRs)을 포함하는 이들의 VH 및 VL 도메인들의 아미노산 및/또는 DNA 서열들은 본 명세서에서 열거된 다양한 서열 번호로 제시된다.
따라서, 본 발명은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제시킬 수 있는 항체를 제공한다. 선호적으로, 이 항체는 단리된다. 또한 선호적으로, 이 항체는 인간이다. 선호적으로, 이 항체는 CCR4의 세포외 도메인내 에피토프에 결합한다. CCR4는 선호적으로 인간이다. 따라서, "CCR4에 결합"에 대한 임의의 언급은 CCR4의 세포외 도메인내 에피토프에 결합"의 바람직한 구체예를 포함한다.
따라서, 본 발명은 인간 CCR4의 세포외 도메인내 에피토프에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있는 단리된 인간 항체를 선호적으로 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있는 항체를 제공하는데, 이 항체는 본 명세서에서 공개된 표들에서 열거된 중쇄 CDR 서열들중 하나를 포함하는 최소한 하나의 중쇄 CDR, 및/또는 본 명세서에서 공개된 표들에서 열거된 경쇄 CDR 서열들중 하나를 포함하는 최소한 하나의 경쇄 CDR을 포함한다. 선호적으로, 이 항체는 최소한 2개, 또는 3개 중쇄 및/또는 경쇄 CDRs을 포함하고, 이들 각각은 본 명세서에서 공개된 표들에서 열거되어 있는 관련 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5 및 6; 또는 1, 2, 3, 17, 5 및 6; 또는 1, 2, 20, 22, 5 및 24; 또는 26, 27, 20, 22, 5, 24 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상, 예를 들면 최소한 2, 3, 4 또는 5, 선호적으로 6개의 CDRs을 포함한다.
한 구체예에서, 이 항체는 서열 번호: 1 또는 26의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 2 또는 27의 중쇄 CDR2 그리고 서열 번호: 3 또는 20의 중쇄 CDR3, 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열, 및/또는 서열 번호: 4, 17 또는 22의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 및/또는 서열 번호: 6 또는 24의 경쇄 CDR3, 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열을 포함한다.
따라서, 한 구체예에서 이 항체는 서열 번호: 26의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 및 서열 번호: 20의 중쇄 CDR3을 포함한다. 선호적으로, 전술한 항체는 또한 본 명세서에서 제시한 서열들로부터 선택된 경쇄 CDRs을 포함한다.
한 구체예에서, 본 명세서에서 공개된 임의의 항체들의 중쇄 CDR1은 서열 SYAXS을 보유하고, 여기에서 X는 임의의 아미노산일 수 있고(서열 번호: 119), 선호적으로 M 또는 I 이며(서열 번호: 120); 및/또는 본 명세서에서 공개된 임의의 항체들의 중쇄 CDR2는 서열 GIIPIFGTXNYAQKFQG를 보유하며, 여기에서 X는 임의의 아미노산일 수 있고(서열 번호:121), 선호적으로 V, I 또는 A이며 (서열 번호: 122); 및/또는 본 명세서에서 공개된 임의의 항체들의 중쇄 CDR3은 서열 RX1GX2X3FDY을 보유하며, 여기에서 각 X는 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있고(서열 번호:123), 선호적으로 X1은 R 또는 G이며, 및/또는 X2는 S 또는 A이며, 및/또는 X3은 Y 또는 K이고, 가장 선호적으로 X1은 R 또는 G이고, 그리고 X2는 S 또는 A이며, 그리고 X3은 Y 또는 K이고(서열 번호:124); 및/또는 본 명세서에서 공개된 임의의 항체들의 경쇄 CDR1은 서열 SGSTSNIGSHYVX를 보유하며, 여기에서 X는 임의의 아미노산이며 (서열 번호: 125), 선호적으로 F, S 또는 V이고(서열 번호:126); 및/또는 본 명세서에서 공개된 임의의 항체들의 경쇄 CDR2는 서열 번호: 5의 서열을 보유하며; 및/또는 본 명세서에서 공개된 임의의 항체들의 경쇄 CDR3은 서열 A V W D X X X X G W V을 보유하며, 여기에서 각 X는 독립적으로 임의의 아미노산이며 (서열 번호:127), 선호적으로 X1은 A 또는 D이고, 및/또는 X2는 K 또는 T이며, 및/또는 X3은 Y 또는 L이고, 및/또는 X4는 R 또는 S이며, 더욱 선호적으로 X1은 A 또는 D이고, 그리고 X2는 K 또는 T이고, 그리고 X3은 Y 또는 L이며, 그리고 X4는 R 또는 S이다(서열 번호:128).
이는 본 명세서에서 공개된 VH, VL, scFv 및 IgG 서열들에 필요한 변경을 가할 수 있다. 따라서, CDR 서열들을 포함하는 본 명세서에서 공개된 임의의 서열들은 표 1-9에서 열거된 대응하는 CDR 서열들 대신 서열 번호 119-128중 하나 이상을 선호적으로 포함한다.
한 가지 특별히 바람직한 구체예에서, 이 항체는 서열 번호: 1의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 그리고 서열 번호: 3 또는 20의 중쇄 CDR3을 포함한다. 선호적으로, 전술한 항체는 또한 서열 번호: 4, 17 또는 22의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 및/또는 서열 번호: 6 또는 24의 경쇄 CDR3, 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이 항체는 서열 번호: 26의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 27의 중쇄 CDR2 그리고 서열 번호: 20의 중쇄 CDR3을 포함한다. 선호적으로, 전술한 항체는 서열 번호: 4, 17 또는 22의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 및/또는 서열 번호: 6 또는 24의 경쇄 CDR3, 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열을 또한 포함한다.
한 구체예에서, 이 항체는 서열 번호: 4, 17 또는 22의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 그리고 서열 번호: 6 또는 24의 경쇄 CDR3을 포함한다. 선호적으로, 전술한 항체는 서열 번호: 1 또는 26의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 2 또는 27의 중쇄 CDR2 및/또는 서열 번호: 3 또는 20의 중쇄 CDR3, 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열을 또한 포함한다.
한 구체예에서, 이 항체는 서열 번호: 4 또는 17의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 그리고 서열 번호: 6의 경쇄 CDR3을 포함한다. 선호적으로, 전술한 항체는 서열 번호: 1 또는 26의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 2 또는 27의 중쇄 CDR2 및/또는 서열 번호: 3 또는 20의 중쇄 CDR3, 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열을 또한 포함한다.
한 구체예에서, 이 항체는 서열 번호: 22의 경쇄 CDR1, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 및 서열 번호: 24의 경쇄 CDR3을 포함한다. 선호적으로, 전술한 항체는 서열 번호: 1 또는 26의 중쇄 CDR1, 서열 번호: 2 또는 27의 중쇄 CDR2 및/또는 서열 번호: 3 또는 20의 중쇄 CDR3, 또는 전술한 서열 번호중 임의의 하나에 실질적으로 상동성인 서열을 또한 포함한다.
특히 바람직한 항체들은 서열 번호: 1의 중쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 3의 중쇄 CDR3 도메인을 포함하고; 그리고 서열 번호: 4의 경쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 6의 경쇄 CDR3 도메인을 포함한다.
특히 바람직한 항체들은 서열 번호: 1의 중쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 3의 중쇄 CDR3 도메인을 포함하고; 그리고 서열 번호: 17의 경쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 6의 경쇄 CDR3 도메인을 포함한다.
가장 바람직한 항체들은 서열 번호: 1의 중쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 20의 중쇄 CDR3 도메인을 포함하고; 그리고 서열 번호: 22의 경쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 24의 경쇄 CDR3 도메인을 포함한다.
특히 바람직한 항체들은 서열 번호: 26의 중쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 27의 중쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 20의 중쇄 CDR3 도메인을 포함하고; 그리고 서열 번호: 22의 경쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 24의 경쇄 CDR3 도메인을 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 3개의 CDRs을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역과 3개의 CDRs를 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하며, 여기에서 전술한 중쇄 가변 영역은 다음을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 보유하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 보유하는 VH CDR2, 그리고
(iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 보유하는 VH CDR3; 및/또는
전술한 경쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호: 4, 17 또는 22, 선호적으로 4 또는 17의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR1,
(ii) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR2, 그리고
(iii) 서열 번호: 6 또는 24, 선호적으로 6의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR3.
추가 구체예에서, 본 발명은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 3개의 CDRs을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역과 3개의 CDRs를 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하며, 여기에서 전술한 중쇄 가변 영역은 다음을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 보유하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 보유하는 VH CDR2, 그리고
(iii) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 보유하는 VH CDR3; 및/또는
여기에서 경쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호: 4, 17 또는 22, 선호적으로 22의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR1,
(ii) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR2, 그리고
(iii) 서열 번호: 6 또는 24, 선호적으로 24의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR3.
추가 구체예에서, 본 발명은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 3개의 CDRs을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역과 3개의 CDRs를 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하며, 여기에서 전술한 중쇄 가변 영역은 다음을 포함하고:
(i) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 보유하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 보유하는 VH CDR2, 그리고
(iii) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 보유하는 VH CDR3; 및/또는
여기에서 경쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
(i) 서열 번호: 4, 17 또는 22, 선호적으로 22의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR1,
(ii) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR2, 그리고
(iii) 서열 번호: 6 또는 24, 선호적으로 24의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR3.
본 발명의 특정 바람직한 구체예들은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있는 항체를 제공하는데, 이 항체는 서열 번호: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 또는 45의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하는 VH 도메인 및/또는 서열 번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 또는 46의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하는 VL 도메인을 포함한다. 선호적으로, 전술한 VH 도메인은 3개의 중쇄 CDRs을 보유하고 및/또는 전술한 VL 도메인은 3개의 경쇄 CDRs을 보유한다. 더욱 선호적으로, 최소한 1개, 최소한 2개, 선호적으로 3개의 경쇄 CDR 서열들은 본 명세서에서 공개된 경쇄 CDR 서열들로부터 선택되며 및/또는 최소한 1개, 최소한 2개, 선호적으로 3개의 중쇄 CDR 서열들은 본 명세서에서 공개된 중쇄 CDR 서열들로부터 선택된다.
따라서, 한 구체예에서, 전술한 VH 도메인은 서열 번호: 29, 31, 33 또는 35의 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하고, 그리고 서열 번호: 1의 중쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 3의 중쇄 CDR3 도메인을 포함한다.
한 구체예에서 전술한 VH 도메인은 서열 번호: 37, 39, 41 또는 43의 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하고, 그리고 서열 번호: 1의 중쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 2의 중쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 20의 중쇄 CDR3 도메인을 포함한다.
한 구체예에서 전술한 VH 도메인은 서열 번호: 45의 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하고 그리고 서열 번호: 26의 중쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 27의 중쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 20의 중쇄 CDR3 도메인을 포함한다.
한 구체예에서 전술한 VL 도메인은 서열 번호: 30 또는 34의 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하고, 그리고 서열 번호: 4의 경쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 6의 경쇄 CDR 3 도메인을 포함한다.
한 구체예에서 전술한 VL 도메인은 서열 번호: 32 또는 36의 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하고, 그리고 서열 번호: 17의 경쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 6의 경쇄 CDR 3 도메인을 포함한다.
한 구체예에서 전술한 VL 도메인은 서열 번호: 38, 40, 42, 44 또는 46의 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유하고, 그리고 서열 번호: 22의 경쇄 CDR1 도메인, 서열 번호: 5의 경쇄 CDR2 도메인, 그리고 서열 번호: 24의 경쇄 CDR 3 도메인을 포함한다.
이 항체는 상기에서 논의된 VL 및 VH 서열들의 임의의 조합을 보유할 수 있다. 다음의 조합들이 바람직하다:
서열 번호: 29의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 30의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 31의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 32의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 33의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 34의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 35의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 36의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 37의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 38의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 39의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 40의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 41의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 42의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 43의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 44의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
서열 번호: 45의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VH 도메인과 서열 번호: 46의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 보유한 VL 도메인.
추가 구체예에서, 본 발명은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있는 항체를 제공하며, 이 항체는 서열 번호: 47의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 208 scFv로 불린다), 서열 번호: 48의 아미노산 서열(전술한 항체는 또한 본 명세서에서 306 scFv로 불린다), 서열 번호: 49의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 308 scFv로 불린다), 서열 번호: 50의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 406 scFv로 불린다), 서열 번호: 51의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 501 scFv로 불린다), 서열 번호: 52의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 503 scFv로 불린다), 서열 번호: 53의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 601 scFv로 불린다), 서열 번호: 54의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 603 scFv로 불린다), 또는 서열 번호: 55의 아미노산 서열 (전술한 항체는 또한 본 명세서에서 803 scFv로 불린다)을 포함하거나, 또는 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있는 이의 임의의 단편을 포함하거나 또는 상기 서열중 임의의 것에 실질적으로 상동성인 서열을 포함한다.
본 발명은 단클론 항체 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803에 의해 구체화되는데, 이의 단일 쇄 형태는 표 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9 (각각 서열 번호: 47, 48, 49, 50, 51, 21, 53, 54 및 55)에 나타낸다. 항체 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 전장 IgG 형태들을 만들었고, 이들 서열은 표 10-18에 각각 나타낸다. 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 항체들의 CDR 도메인들, VH 및 VL 도메인들은 표 1 내지 9에 나타낸다. 이들 CDR 도메인들 및/또는 VH 및/또는 VL 도메인들 (또는 이에 실질적으로 상동성인 서열들)을 포함하는 항체들이 본 발명의 바람직한 측면들이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 서열 번호: 47을 포함하는 또는 서열 번호:47로 구성된 208 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 56에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 48을 포함하는 또는 서열 번호:48로 구성된 306 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 57에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 49를 포함하는 또는 서열 번호:49로 구성된 308 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 58에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 50을 포함하는 또는 서열 번호:50으로 구성된 406 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 59에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 51을 포함하는 또는 서열 번호:51로 구성된 501 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 60에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 52를 포함하는 또는 서열 번호:52로 구성된 503 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 61에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 53을 포함하는 또는 서열 번호:53으로 구성된 601 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 62에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 54를 포함하는 또는 서열 번호:54로 구성된 603 항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 63에 의해 선호적으로 인코드된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 55를 포함하는 또는 서열 번호:55로 구성된 803항체의 scFv 형이며, 이는 서열 번호: 64에 의해 선호적으로 인코드된다.
기타 바람직한 구체예들은 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 항체들의 IgG 형태들, 선호적으로 전장 IgG 형태들이다. 이들 임의의 항체의 IgG1 형태가 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 67 (아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 68 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 65에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 66에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 71 (아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 72 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 69에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 70에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 75 (아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 76 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 73에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 74에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 79(아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 80 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 77에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 78에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 83(아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 84 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 81에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 82에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 87(아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 88 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 85에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 86에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 91(아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 92 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 89에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 90에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다. 실질적으로 동일한 중쇄들 및 두 개의 실질적으로 동일한 경쇄들.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 95(아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 96 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 93에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 94에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 서열 번호: 99(아미노산)의 중쇄 및/또는 서열 번호: 100 (아미노산)의 경쇄를 포함하는 전장 IgG 항체다. 서열 번호: 97에 의해 인코드된 중쇄 및/또는 서열 번호: 98에 의해 인코드된 경쇄를 포함하는 IgG 항체 또한 바람직하다.
온전한 IgG 항체들은 실질적으로 동일한 두 개의 중쇄들과 실질적으로 동일한 두 개의 경쇄들을 포함할 것으로 물론 이해한다.
본 발명의 이 항체들은 KM2160, KM3060, KM2760 및 KW-0761을 포함하는 공지의 항-CCR4 패밀리에 대한 상이한 에피토프에 결합할 것으로 본다. 항체 KM2160은 CCR4의 펩티드 단편에 대항하여 생성되고, 인간 CCR4의 N-말단 아미노산의 위치 2-29 영역에 존재하는 에피토프를 인지하는 뮤린 항체다(EP1270595). KM2760은 동일한 결합 특징들을 보유하는 이 항체의 키메라 형이다(EP1270595). 항체 KM3060은 상당히 푸코실화되어 있는 것을 제외하고 KM2760와 동일하다 (Niwa et al. 2004, Cancer Research 64, 2127-2133). KW-0761은 KM2760의 인간화된 형태다(Ishida et al. Annals of Oncology 2008, vol 19, supplement 4, 513).
KM2760은 CCR4와 TARC 사이 또는 CCR4와 MDC 사이의 상호작용을 차단하지 않는 것으로 보고된 바 있는데(Ishida et al. 2006, Cancer Research 66 (11), pp 5716-5722), 이는 등가의 항체 KM3060var(KM3060에 대응하지만, 상이한 숙주에서 발현되었기 때문에 상이한 슈가 프로파일을 잠재적으로 보유한다)를 이용한 출원인의 발견과 일관된다. 대조적으로, 본 발명의 항체들은 CCR4와 MDC 사이의 상호작용과 CCR4와 TARC 사이의 상호작용을 차단시키는 것으로 밝혀졌다(실시예 3 참고). 이는 본 발명의 항체들이 KM2160, KM3060, KM2760 및 KW-0761을 포함하는 선행 기술 패밀리보다 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 강력하게 시사한다.
더욱이, 항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803은 CCR4에 결합하기 위하여 서로 경쟁한다는 것이 발견되었고, 이것은 이들 항체가 동일한, 유사한 또는 최소한 중첩되는(overlapping) 에피토프들에 결합한다는 것을 나타낸다. 이들 항체중 어느 것도 CCR4에 결합하기 위하여 KW-0761과 경쟁하지 않는데, 이는 KW-0761이 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다(실시예 4).
본 발명의 항체들은 상업적으로 이용가능한 항-CCR4 항체 1G1에 대한 상이한 에피토프에 결합할 수 있을 것으로 또한 본다. BD Pharmingen은 이 항체에 대한 기술적인 데이터 자료 상에서 이 항체는 중화 항체가 아니라는 것을 분명히 하였다. 대조적으로, 본 발명의 항체들은 CCR4에 MDC 및/또는 TARC의 결합을 차단시킬 수 있다. 이것은 본 발명의 항체들은 1G1 항체와는 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 강력히 시사한다.
실질적 상동성(homologous) 서열들의 특정 예들은 공개된 아미노산 서열들에 대해 최소한 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 보유한 서열들이다. 특정 구체예들에서, CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있는 본 발명의 항체들은 서열 번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 또는 46의 아미노산 서열에 대해 최소한 약 70%, 75%, 80% 또는 85%, 더욱 선호적으로 최소한 약 90%, 더욱 선호적으로 최소한 약 95%, 더욱 선호적으로 최소한 약 96%, 97% 또는 98% 그리고 가장 선호적으로 최소한 99% 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열 영역을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하고; 및/또는 서열 번호: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 또는 45의 아미노산 서열 영역을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구체예들에서, CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있는 본 발명의 항체들은 서열 번호: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 또는 45의 아미노산 서열에 대해 최소한 약 70%, 75%, 80% 또는 85%, 더욱 선호적으로 최소한 약 90%, 더욱 선호적으로 최소한 약 95%, 더욱 선호적으로 최소한 약 96%, 97% 또는 98% 그리고 가장 선호적으로 최소한 99% 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열 영역을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고; 서열 번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 또는 46의 아미노산 서열 영역을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
실질적으로 상동성 서열들의 기타 바람직한 예들은 공개된 아미노산 서열들의 보존적 아미노산 치환들을 함유하는 서열들이다. 선호적으로, 실질적으로 상동성 서열은 전체 VH 도메인에 걸쳐 단지 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 변경된 아미노산들을 함유하거나 및/또는 전체 VL 도메인에 걸쳐 단지 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 변경된 아미노산들을 함유한다. 일부 구체예들에서, 이러한 변경된 임의의 아미노산들이 존재한다면, 이들은 골격(framework) 영역들에서만 발견된다.
일부 구체예들에서, 실질적으로 상동성 서열은 하나 이상 공개된 FR 영역들 또는 각 FR 영역들내 단지 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 변경된 아미노산들을 함유한다. 따라서 선호적으로 실질적으로 상동성 서열은 본 명세서에서 공개된 중쇄 FR1, 중쇄 FR2, 중쇄 FR3, 중쇄 FR4, 경쇄 FR1, 경쇄 FR2, 경쇄 FR3, 및/또는 경쇄 FR4내 단지 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 변경된 아미노산들을 함유한다.
경쇄 FR1을 포함하는 본 명세서에서 공개된 임의의 서열들의 바람직한 실질적으로 상동성 서열은 경쇄 FR1의 위치 1의 아미노산 (세린)이 또다른 아미노산, 선호적으로 글루타민 (Q)으로 대체되며 및/또는 경쇄 FR1의 위치 2의 아미노산(티로신)이 또다른 아미노산, 선호적으로 세린 (S)으로 대체된 서열이다. 따라서, 서열 번호: 12, 21 또는 25에 실질적으로 상동성인 바람직한 서열들은 선호적으로 이들 치환중 하나 이상 또는 선호적으로 이들 모두를 보유하여, 따라서, 이 서열들은 가장 바람직하게 SY 대신 아미노산 QS로 시작된다. 서열 번호 12, 21 또는 25를 선호적으로 포함하는 임의의 서열들은 또한 이들 치환들중 하나 또는 둘 모두를 보유한다. 따라서, 서열 번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 또는 46, 47-55, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95 또는 99에 실질적으로 상동성인 바람직한 서열들은 FR1의 위치 1의 S 대신 또다른 아미노산, 선호적으로 Q를 보유하고, 및/또는 FR1의 위치 2의 Y 대신 또다른 아미노산, 선호적으로 S를 보유한다. 따라서, 서열 번호: 12의 바람직한 동족체(homologe)는 X1X2VLTQPPSASGTPGQSVTISC이며, 여기에서 각 X는 독립적으로 임의의 아미노산일 수 있고(서열 번호:129), 선호적으로 X1은 Q이며, 및/또는 X2는 S이다(서열 번호: 130). 서열 번호: 21의 바람직한 동족체는 X1X2VLTQQPSASGTPGQSVTISC이며, 여기에서 각 X는 독립적으로 임의의 아미노산이며(서열 번호:131), 선호적으로 X1은 Q이고, 및/또는 X2는 S이다(서열 번호:132). 이는 본 명세서에서 공개된 VL, scFv 및 IgG 서열들에 대해 필요한 변경을 적용시킨다. 따라서, FR1 서열들을 선호적으로 포함하는 본 명세서에서 공개된 임의의 서열들은 표 1-9에 열거된 대응하는 FR1 서열들을 대신하여 하나 이상의 서열 번호 129-132을 포함한다.
실질적으로 상동성 서열들의 기타 바람직한 예들은 공개된 하나 이상의 CDR 영역들에서 최대 1, 2, 3 또는 4개, 선호적으로 최대 1, 또는 2개의 변경된 아미노산들을 함유하는 서열들이다.
이러한 모든 구체예들에서, 이러한 변경들은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환들, 또는 이의 혼합일 수 있고, 그리고 바람직한 변경들은 보존적 아미노산 치환들이다. 따라서, 한 구체예에서 변경된 모든 아미노산들은 보존적 치환들이다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 또다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄들을 보유하는 아미노산 잔기들의 패밀리는 당업계에서 정의되는데, 염기성 측쇄들 (예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄들 (예를 들면, 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 극성 측쇄들 (예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄들 (예를 들면, 글리신, 시스테인, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지쇄 측쇄들 (예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 그리고 방향족 측쇄들 (예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
임의의 편리한 방법으로 상동성(Homology)을 평가할 수 있다. 그러나, 서열들 간에 상동성 정도를 판단하기 위하여, 서열들의 다중 배열을 만드는 컴퓨터 프로그램이 유용한데, 예를 들면, Clustal W (Thompson et al., 1994)이다. 바람직한 경우, Clustal W 알고리즘은 BLOSUM62 득점 매트릭스 (Henikoff and Henikoff, 1992), 갭 개방 페널티 10과 갭 연장 페널티 0.1을 함께 이용하여, 두 서열들 사이에 최대 배열 짝(highest order match)을 얻고, 이때 서열중 하나의 총 길이의 최소한 50 %가 정렬에 관련된다. 서열들을 배열시키는데 이용할 수 있는 다른 방법들은 Needleman 및 Wunsch (1970)의 배열 방법으로, 이는 Smith 및 Waterman (1981)에 의해 수정되어, 두 서열들 사이에 최대 배열 짝을 얻고, 두 서열 간에 동일한 아미노산들의 수가 결정된다. 두 아미노산 서열들 사이에 동일성 비율을 계산하는 다른 방법들은 당업계에 일반적으로 인지되어 있는데, 예를 들면, Carillo 및 Lipton (1988)에 의해 설명되는 것들과 Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects에서 설명된 것들을 포함한다.
일반적으로, 컴퓨터 프로그램을 이러한 계산에 이용할 것이다. ALIGN(Myers and Miller, 1988), FASTA (Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990) 및 gapped BLAST(Altschulet al., 1997), BLASTP, BLASTN, 또는 GCG(Devereuxet al., 1984)와 같은 서열들의 쌍을 비교하고 배열하는 프로그램이 이러한 목적에 또한 유용하다. 더욱이, European Bioinformatics institute의 Dali server는 구조 기반 단백질 서열들의 배열을 제공한다(Holm, 1993; 1995; 1998).
기준 점(reference point)를 제공함으로써, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 보유하는 본 발명에 따른 서열들, 디폴트 매개변수들과 함께 ALIGN 프로그램을 이용하여 서열 동일성 등이 결정될 수 있다(예를 들면, GENESTREAM 네트워크 서버, IGH, Montpellier, France에서 인터넷 상에 이용가능한).
용어 "실질적으로 상동성"은 본 발명의 단백질들 또는 핵산 분자들과 실질적으로 동일한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 실행하는 본 발명의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 변형들 또는 화학적 등가물을 또한 포함한다.
임의의 실질적으로 상동성 항체는 CCR4에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하고, 당해 항체에 의해 인지되는 것과 동일한 이의 에피토프에 선호적으로 결합하는 능력을 보유해야 하는데, 예를 들면, 본 발명의 CDR 도메인들 또는 본 명세서에서 설명하는 본 발명의 VH 및 VL 도메인들에 의해 인지되는 동일한 에피토프 또는 항원에 결합하는 능력을 보유해야 한다. 동일한 에피토프/항원에 결합은 당업계에 공지되어 있고, 설명된 방법들, 예를 들면 에피토프 메핑 또는 결합 분석, 예를 들면 경쟁 분석, ELISA 분석 또는 BIA코어 분석을 이용하여 용이하게 테스트될 수 있다. 따라서, 항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 각각과 동일한 결합 특이성을 가진 다른 항체들 및 항체 단편들을 확인할 수 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 것이다. 하기에서 예시되는 것과 같이, 경쟁 결합 분석을 이용하여 이러한 다른 항체들을 확인할 수 있다. 하기에서 설명되는 방법은 적합한 경쟁 분석의 한 가지 예일 뿐이다. 숙련자는 다른 적합한 방법들과 변이들을 알고 있을 것이다.
선호적으로, 임의의 실질적으로 상동성 항체는 예를 들면 명세서 도처에서 정의된 이들 항체의 기능적 능력을 보유해야만 한다. 당업계에 공지되어 있고, 설명된 방법들을 이용하여 용이하게 기능적 성질들의 보유를 테스트할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명하는 서열들과 비교하여 실질적으로 상동성 서열은 다음중 하나 이상이 부족하다:
- 해독후 변형 예컨대, 탈아미드화 및/또는 당화(glycosylation)에 민감한 서열;
- 단백질분해성 침지(digestion)에 민감한 서열; 및/또는
- 인간 MHC classII 수용체들, 가령 T 세포 에피토프들에 결합할 수 있는 서열.
예를 들면, 해독후 변형들 예컨대, 탈아미드화, 당화에 대한 이 항체 서열들의 민감성, 단백질분해성 침지에 대한 민감성, 및/또는 인간 MHC classII 수용체들에 결합을 결정하기 위하여 in silico 테스트를 실시할 수 있다. 인간 MHC classII 수용체들에 대한 결합은 인간에서 T 세포 반응을 야기시킬 수 있고, 따라서, 잠재적인 T 세포 에피토프들을 확인하는데 유용할 것이다. 해독후 변형들, 단백질분해성 침지, 또는 추정 T 세포 에피토프들에 민감한 추정 부위로 확인된 아미노산들 또는 펩티드 서열들을 변형시켜 이들의 민감성을 변경시킬 수 있다. 따라서, 실질적으로 상동성 서열들은 하나 이상의 이러한 변형들을 보유할 수 있다.
T 세포 에피토프들에 대한 in silico 테스트는 예를 들면, iTOPE™ (Antitope, Cambridge, UK)으로 명명된 프로그램이 관여할 수 있다. iTope™은 34개 MHC class II 대립형질에 펩티드 결합을 모형화하는 분자 모델링 기술이다. 각 대립형질에 대해 펩티드 결합에 대한 개별 아미노산들의 기여를 결정할 수 있고, 이것은 MHC class II 결합 홈(groove)과 상호작용하는 코어 9mer 서열들의 정확한 위치에 대한 정보를 제공한다.
대안으로 또는 추가적으로, 항체 가변 영역들에서 T 세포 에피토프들을 확인하고, 공통 모티프들을 확인하기 위한 BLAST 조사에 의해 또한 정보를 제공하게 될 수도 있는 TCED (T-세포 에피토프 데이터베이스) 프로그램 (Antitope, Cambridge, UK)을 이용하여 서열들을 분석할 수 있다.
에피토프 메핑은 표준 기술들을 이용하여 실행될 수 있다. 예를 들면, 에피토프들의 확인 및 정의를 위한 다음 방법들이 본 명세서에서 언급된다. CCR4의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 따라서 예를 들면 Pepscan 분석을 이용하여 에피토프 메핑을 위한 합성 펩티드를 이용할 수 있다. 위치 지향된 돌연변이생성(site directed mutagenesis)는 에피토프 메핑에 또한 강력한 도구이며 그리고 면역 복합체 형성에서 단일 아미노산들의 역할을 평가하는데 이용될 수 있다. 단백질 풋프린팅(footprinting)은 항체-항원 복합체로 결합될 때 에피토프를 절단으로부터 보호한다는 사실에 의존한다. 효소 연결된 면역흡착 분석 (ELISA) 및 헤마토글루티닌화(haemaglutination) 그리고 슬롯-블랏팅(slot-blotting) 또한 에피토프 메핑에 이용될 수 있다. 항원과 항체의 결정화(Crystallisation)를 이용하여 비-선형 에피토프를 메핑할 수 있다. 이러한 방법들을 실행하기 위한 프로토콜은 광범위하게 이용가능하며, 숙련자는 에피토프 메핑의 적합한 대체 방법도 알고 있을 것이다.
유동 세포분석법(flow cytometry)을 이용하여 경쟁 분석을 실행하기 전, 테스트된 항체의 일부 분량은 예를 들면 바이오티닐화(biotinylation)에 의해 라벨시켜야 한다. 바이오티닐화된 생성물의 기능성(세포-결합 성질의 보존) 및 고정된 수의 CCR4+ 세포들에 대해 준-최대(sub-maximal) 결합을 제공하는 본 발명의 바이오티닐화된 항체(Ab1)의 최저 농도를 결정한다. 기하급수적으로 성장하는 배양물로부터 총 106개의 세포들을 수거하고, 적합한 온도에서 적합한 시간 동안, 예를 들면 4℃에서 1시간 동안 다양한 농도의 항체와 함께 항온처리한다. 세포들을 세척하고, 그리고 적합한 온도에서 적합한 시간 동안, 예를 들면 4℃에서 추가 한 시간 동안 적합한 감지 항체와 함께 항온처리한다. 세척 후, 이 세포들을 유동 세포분석법으로 분석한다. 각 테스트 항체의 경우, 이 항체 농도에 대해 중앙 형광 강도(MFI)를 플롯함으로써 데이터로부터 포화 곡선을 만든다.
경쟁 분석의 경우, 상기와 같이 CCR4+ 세포들을 준비할 수 있고, 라벨된 (바이오티닐화된) 항체 (bio-Ab1)의 고정된 농도와 점증되는 농도의 라벨안된 경쟁 항체 혼합물로 이중으로 처리할 수 있다. 고정된 농도는 상기에서 결정된 것과 같이 고정된 수의 종양 세포에 대한 합당한 형광 신호를 생성하는 항체의 최저 농도다. 이상적으로, 고정된 이 농도(nM)는 평형 상태(KD)에서 처리된 항체의 친화력 아래에 있어야 한다. 이 경우, 설명된 방법은 경쟁 항체들의 친화력 평가에 이용될 수 있다(Schodin and Kranz, 1993, J Biol Chem 268:25755-7). 이 항체 혼합물은 적합한 온도에서 적합한 기간 동안, 예를 들면 4℃에서 1시간 동안 표적 세포들과 항온처리된다. 세포들을 세척하고, 바이오티닐화된 항체의 세포 결합은 FITC-라벨된 스트렙타아비딘과 함께 항온처리함으로써 드러난다. 각 테스트 시료(bio-Ab1+Ab2)에 대한 형광 판독 중앙 값으로부터 배경 형광 (PBS-5% FCS)을 뺀 후, 다음의 식에 따라 각 Ab2 농도 "c"에 대해 억제 비율을 계산한다:
억제 % = (1-MFIbio - Ab1 + Ab2 "c"/MFIbio - Ab1) x 100.
모든 구체예들에서, 실질적으로 상동성 서열들을 함유하는 이 항체들은 CCR4에 결합하는 능력 및MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합을 억제시키는 능력을 유지한다.
본 발명의 다른 구체예들은 CCR4에 결합하고, 그리고 MDC 및/또는 TARC가 CCR4에 결합하는 것을 억제할 수 있고, 그리고 본 발명의 항체, 본 발명의 VH 또는 VL 도메인, 또는 본 발명의 하나 이상의 CDRs을 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 결합 단백질들은 항체들이다.
본 발명의 바람직한 항체들은 3개의 CDRs을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역과 3개의 CDRs을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 CDRs의 예시적이고 바람직한 서열들이 본 명세서에서 설명된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 특별히 다른 언급이 없거나, 과학적 용어로부터 명백하지 않는 한, 간결한 용어 "CCR4"은 CC 케모킨 수용체 4 (CD194로도 또한 알려져있음)를 의미한다. CCR4는 유리(free) CCR4, 예를 들면 재조합 또는 정제된 CCR4일 수 있지만, 선호적으로 예를 들면 세포의 표면 상에 타고난 형태(native form)으로 존재한다.
본 발명의 항체들 또는 결합 단백질들은 CCR4의 단편들, 특히 단편들 세포외 도메인을 포함하는 또는 세포외 도메인으로 구성된 단편들에 또한 결합되거나, 또는 CCR4 또는 CCR4의 단편들을 포함하는 엔터티에 결합할 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체들의 에피토프는 CCR4의 세포외 도메인내에 위치한다.
"CCR4"은 특히 CCR4가 포유동물 종들간에 보존되기 때문에, 임의의 형태의 CCR4를 또한 지칭할 수도 있다. 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 따라서 예를 들면 인간, 원숭이 (예를 들면 게잡이원숭이(cynomolgus)), 소(소과), 마우스, 쥐, 헴스터, 흰담비, 기니아 피그 및/또는 토끼 CCR4에 결합할 수 있다. 선호적으로, 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 최소한 인간 CCR4에 결합할 것이다. 따라서, 다르게 언급되지 않는 한, "CCR4"에 대한 본 명세서에서 임의의 언급은 "인간 CCR4"을 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 특정 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 최소한 인간 및 원숭이 (예를 들면 게잡이원숭이) CCR4에 결합할 것이다. 기타 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 최소한 인간 및 마우스 CCR4에 결합할 것이다. 기타 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 최소한 인간, 원숭이 및 마우스 CCR4에 결합할 것이다. 기타 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 최소한 인간, 원숭이, 기니아 피그 및 마우스 CCR4에 결합할 것이다. 일부 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 최소한 인간 및 원숭이 CCR4에 결합할 것이지만, 뮤린 CCR4에는 결합하지 않을 것이다. 기타 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 이 항체들 또는 항체 단편들은 최소한 인간 및 원숭이 CCR4에 결합할 것이지만, 뮤린 CCR4에는 결합하지 않을 것이고, 예를 들면 인간 및 원숭이 CCR4에만 결합할 것이다.
실시예들에서 본 발명의 항체들은 인간 및 원숭이 CCR4에 결합할 수 있고, 뮤린 CCR4에 결합하는 능력 또한 보유한다는 것을 보여주었다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 본 발명의 항체들 또는 항체 단편들의 내용에서 용어 "CCR4에 결합하는" 또는 "항-CCR4"은 다음중 하나 또는 그 이상을 할 수 있는; 선호적으로, 다음중 하나 이상을 할 수 있는; 그리고 가장 선호적으로, 다음의 모든 것을 할 수 있는 항체들 또는 항체 단편들을 의미한다:
(a)예를 들면, 유동 세포분석법 또는 면역조직화학으로 평가할 때, 세포의 표면 상에 발현되는 CCR4에 결합한다;
(b) 예를 들면, 비-환원 조건들하에서 웨스턴 블랏에서 CCR4에 결합으로 평가하였을 때, 형태학적으로 의존적 (예를 들면 비-선형) CCR4 에피토프에 결합한다;
(c) 예를 들면, ELISA 분석 또는 BIA코어 분석으로 평가하였을 때, 유리 CCR4, 예를 들면, 고형 지지대 상에서 재조합적으로 발현된 CCR4에 결합한다;
(d) 최소한 인간 CCR4에 결합하는, 더욱 선호적으로 인간 및 원숭이 CCR4 또는 인간 및 마우스 CCR4에 결합하는, 가장 선호적으로 인간, 원숭이 및 마우스 CCR4 또는 인간 및 원숭이 CCR4에 결합하지만 마우스 CCR4에는 결합하지 않는다;
(e) 명세서 곳곳에서 논의된 바와 같이, 10nM 또는 미만의 결합 친화력(Kd), 선호적으로 5nM 또는 미만, 더욱 선호적으로 3nM 또는 미만 또는 2nM 또는 미만, 가장 선호적으로 1nM 또는 미만의 결합 친화력(Kd)으로 인간 CCR4에 결합한다;
(f) 명세서 곳곳에서 논의된 바와 같이, 유사한 친화력, 예를 들면 10nM 또는 미만의 Kd, 선호적으로 5nM 또는 미만의 Kd, 더욱 선호적으로 3nM 또는 미만 또는 2nM 또는 미만의 Kd, 예를 들면 1nM 또는 미만의 Kd로 인간 및 원숭이 CCR4 또는 인간 및 마우스 CCR4에 결합하는, 선호적으로 인간 및 원숭이 CCR4에는 결합하지만 마우스 CCR4에는 결합하지 않는다;
(g) 명세서 곳곳에서 논의된 바와 같이, CCR4+ 세포들의 ADCC를 유도한다;
(h) CCR4가 최소한 MDC 및/또는 TARC에 결합되는 것을 억제하는, 선호적으로 MDC 및 TARC에 결합되는 것을 억제하는, 또는 선호적으로 최소한 MDC 및/또는 TARC 그리고 RANTES, MCP-1 및 MIP-1알파로부터 선택된 하나 이상의 것에 결합을 억제한다;
(i) 생체내에서 항종양 효과들을 유도한다;
(j) 종양을 가진 동물에 투여시 종양들에 국소화된다;
(k) CCR4+ 세포들의 CDC를 유도한다;
(l) CCR4 리간드에 대한 CCR4-중개된 세포 반응들을 억제하는, 선호적으로 CCR4 리간드에 반응하여 세포내 칼슘 이온 농도의 증가를 억제한다;
(m) CCR4 리간드 예컨데 MDC 및/또는 TARC를 지향하는 CCR4+ 세포들의 화학주성을 억제한다.
CCR4+ 세포들의 결합 내용에서, 본 발명의 항체들은 CCR4+ 세포들에 결합하고, CCR4- 세포들에는 유의적으로 결합하지 않는다는 것으로 이해해야 한다(실시예2에 나타낸 것과 같음).
용어 "CCR4- 세포들에는 유의적으로 결합하지 않는다"는 CCR4- 세포들에 대한 임의의 결합이 치료 또는 진단 목적용으로 전술한 항체의 사용을 금하지 않는다는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, CCR4- 세포들에 " 미미한(insignificant) 결합"이란, CCR4- 세포들에 이 항체의 결합은 하나 이상 CCR4+ 세포들에 대한 이 항체의 결합보다는 약하다는 의미다. 정상 세포들과 일부 가교-반응이 따라서 일어날 수 있지만, 이 결합 수준은 "배경" 결합으로 간주될 수 있다. 치료 또는 진단 목적으로 주된 생각은 이 항체가 치료 또는 진단 적용하는 동안 이 항체와 접촉될 수 있는 CCR4- 세포들보다는 하나 이상의 유형의 CCR4+ 세포들에게 더 강력하게 결합해야 한다는 것이다.
본 발명의 이 항체는 "CCR4-특이적"이라고 지칭될 수 있다. 용어 "CCR-특이적"은 이 항체가 CCR4 발현시키는 세포들에 결합함으로써 치료 또는 진단 목적으로 전술한 항체의 사용을 허용하는데 충분히 특이적이라고 이해되어야 한다. 숙련자는 표적 CCR4+ 세포들에 대한 결합 강도와 하나 이상의 CCR4- 세포들, 예를 들면 야생형 (가령 CCR4로 형질변환되지 않은) HEK293T-세포들 또는 DT40-세포들에 대한 결합 강도를 비교함으로써 임의의 주어진 항체가 CCR4-특이적인지를 용이하게 결정할 수 있다.
숙련자는 예를 들면, 유동 세포분석법을 이용하여 CCR4- 세포들과 비교하여 CCR4+ 세포에 결합을 평가할 수 있고, 실시예 2에서 적합한 예를 설명한다.
당업계에 공지되어 있는 면역조직화학 기술들을 이용하여 세포들 또는 시료에 항체의 결합을 기록할 수 있다. 이러한 분석을 이용하여 특정 항체의 특이성을 테스트하거나, 또는 조직 시료내 CCR4 발현을 탐지할 수 있다. 간략하게 설명하자면, 예를 들면 양성 대조군 (CCR4-양성으로 알려진 세포들) 및 음성 대조군(CCR4-음성으로 알려진 세포들)을 포함하는 인간 조직의 고-밀도 배열 상에서 이 항체를 테스트할 수 있다. 4 단계 등급(0, 1, 2, 3)에서 시각적 관찰에 의해 막 착색 강도가 평가될 수 있다. 바람직한 항체들은 약하거나 또는 강한, 선호적으로 CCR4+ 조직에 대해 강력한 면역조직화학 득점을 보여준다.
실시예들은 CCR4-양성 세포계 CCRF-CEM에 항-CCR4-항체들의 결합은 인간 혈청의 점증 농도 존재하에서 억제되지 않음을 보여준다. 따라서, 본 발명의 항체들은 혈청 존재하에 선호적으로 CCR4에 결합할 수 있고, 이들의 결합은 혈청에 의해 유의적으로 억제되지 않는다.
실시예 2에서 테스트된 상이한 CCR4+ 세포계에 대한 본 발명의 항-CCR4-항체들의 결합 프로파일은 다른 CCR4+ 세포계와 비교하였을 때 일부 CCR4+ 세포계에 증가된 결합을 보여준다. 예를 들면, CCRF-CEM와 비교하여 L-428에 대한 결합은 감소된다. 이론에 결부되지 않고, 이것은 L-428이 CCR4-리간드 TARC를 분비하고, 본 발명의 항-CCR4 항체들은 CCR4-결합 위치에서 이 리간드와 경쟁하기 때문인 것으로 보인다(실시예 3 참고). 따라서, CCR4에 대한 결합은 CCR4 리간드를 분비하지 않은 세포들을 이용하여 가장 잘 분석된다.
본 발명의 항-CCR4-항체들의 결합 프로파일은 KW0761의 것과는 상이하다. 이론에 결부되지 않고, 이것은 이들 상체의 상이한 에피토프 결합 위치 때문인 것으로 본다(실시예 4에서 개요가 설명된 것과 같이). KW0761은 CCR4 및 TARC의 결합을 차단하지 않고, 따라서, L-428에 의해 분비되는 TARC와 경쟁하지 않는다.
또한, 세포계에 따라 변화시킴으로써 EC50 값을 결정하였고(데이터는 나타내지 않음), 이는 다양한 세포 유형들의 표면 상에서 CCR4 발현의 차이때문인 것으로 본다.
공지의 방법들, 예를 들면 인간 CCR4로 형질감염된 세포들과 또다른 종의 CCR4로 형질감염된 세포들을 이용한 유동 세포분석법으로 종들 교차-반응을 분석할 수 있다. 실시예 8에 적합한 분석이 설명되는데, 이 실시예는 본 발명의 항체들이 인간, 원숭이 및 뮤린 CCR4에 결합할 수 있음을 보여준다.
이 항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803은 CCR4가 이의 리간드들 TARC 및 MDC에 결합을 억제시킬 수 있음을 보여주었다 (실시예 3). 따라서, 선호적으로 본 발명의 항체들은 CCR4가 하나 이상의 이의 리간드들에 결합하는 것을 억제시킬 수 있다. 선호적으로, 최소한 MDC에 결합이 억제된다. 더욱 선호적으로, MDC 및 TARC에 결합이 억제된다. 일부 구체예들에서, CCR4가 TARC에 결합되는 것이 억제된다. 본 명세서에서 공개된 측면의 임의의 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 MDC 및/또는 TARC이 CCR4에 결합하는 것을 억제시킬 수 있다.
리간드가 CCR4에 "결합하는 것을 억제"한다는 것은 이 항체가 없을 때 결합과 비교하여, 이 항체가 존재할 때 리간드가 CCR4에 결합하는 것이 최소한 20, 30, 또는 40%, 더욱 선호적으로 최소한 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75%, 더더욱 선호적으로 최소한 80% 감소된 것을 의미한다. 리간드가 CCR4에 결합이 최소한 85, 90 또는 95% 감소된 구체예들 또한 고려된다. 대안으로 봤을 때, 리간드는 우선 CCR4와 접촉하고, 이 항체가 후속적으로 추가될 때, 이 리간드는 이 항체가 CCR4에 결합하는 것을 억제시킬 수 있다.
항체가 리간드의 CCR4 결합을 억제시킬 수 있는 지를 판단하는 분석은 공지되어 있고, 적합한 분석이 실시예 3에 설명된다. 간략하게 설명하자면, CCR4+ 세포들을 Alexa647-라벨된 MDC-SNAP와 함께 또는 없이 항온처리되었고, 그 다음 항체가 추가되었다. MDC 복합체 존재하에 사전-항온처리는 CCR4에 항체 결합의 감소를 초래하였다. 특히, 항체의 CCRF-CEM 세포들 (자연적으로 CCR4를 발현시키는)에 결합과 MDC (또는 적절한 MDC 복합체)와의 항온처리는 억제된다.
항체가 리간드의 CCR4에 결합을 차단시킬 수 있는 지를 결정하는 대안 분석은 라벨된 리간드, 예를 들면 방사능라벨된 리간드 또는 바이오티닐화된 리간드의 사용과 유동 세포분석법을 이용한 분석을 포함한다.
MDC에 있어서, 이 물질은 CCR4 이외의 최소한 하나의 GPCR 수용체에 높은 친화력으로 결합할 수 있음을 주지해야 한다. 예를 들면, MDC는 GPCR 수용체 D6에 결합하는 것으로 보고된 바 있으며 (Graham 2009; Locati et al. 2005), 이는 결합 분석의 결과에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 항체들은 CCR4 리간드에 대한 CCR4-중개된 세포 반응들을 선호적으로 억제시킬 수 있는데, 특히 CCR4 리간드에 반응하여 세포내 칼슘 이온 농도의 증가를 억제시킴으로써, 억제시킬 수 있다.
특히, 이 항체들는 CCRF-CEM 세포들 (ATCC CCL-119)에서 MDC-유도된 칼슘 유동 및/또는 TARC-유도된 칼슘 유동을 선호적으로 억제시킬 수 있다. 적합한 분석 방법들이 공지되어 있고, 실시예 5에서 예가 언급된다.
기타 바람직한 성질들은 본 발명의 항체들이 투여되었을 때 생체내 상당한 독성이 없고, 생체내 상당한 다른 부작용이 없음을 포함한다.
일부 구체예들에서, 이 항체들은 CCR4의 리간드 예컨데 MDC 또는 TARC를 지향하는 CCR4+ 세포들의 화학주성을 억제시킬 수 있다. 이는 실시예 6에서 설명되었다.
일부 구체예들에서, 이 항체들은 CCR4+ 세포들의 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 유도할 수 있지만, 다른 구체예들에서 이 항체들은 CDC를 유도할 수 없다. 일부 구체예들에서, 이 항체들은 CCR4+ 세포들의 자가사멸(apoptosis)을 유도할 수 있지만, 다른 구체예들에서, 이 항체들은 자가사멸을 유도할 수 없다. 일부 구체예들에서, 이 항체들은 CCR4에 결합할 때 CCR4+ 세포들에 의해 내화될 수 있지만, 다른 구체예들에서는 유의적인 내화가 일어나지 않는다.
자가사멸의 유도는 잘 알려진 표준 방법들, 예를 들면 어넥신(Annexin) V 착색을 분석하는 방법들을 이용하여 분석될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 세포들을 적합한 기간, 예를 들면 24 시간 동안 항체와 항온처리시키고, 그리고 세포를 수거한 후 효과 및 어넥신(Annexin) V 착색은 FACS 분석(예를 들면 EasyCyte를 이용)으로 측정될 수 있다.
CDC의 유도는 잘 알려진 표준 방법들, 예를 들면 산화환원 염료 예컨데 Alamar blue의 취입 및 대사에 근거하여 살아있는 세포의 상대적 수를 측정하는 방법들을 이용하여 분석될 수 있다. 적합한 분석은 H Gazzano-Santoro et al. J Immunol Methods. 1997, 28;202(2):163-71에 공개되어 있다. 숙련자는 예를 들면 유동 세포분석법에서 온도-차등 형광 라벨 또는 공촛점 현미경을 이용하여 내화를 분석하는 적합한 방법을 알 것이다. 적합한 분석의 예는 pH-민감성 염료(예컨데 CypHer5E)로 라벨된 2차 항체와 연관되며, 이 염료는 염기성 pH(세포의 외부에서 볼 수 있는)에서는 최소한의 형광이 있고, 산성 pH (세포의 내부에서 볼 수 있는)에서는 최대 형광이 된다.
화학주성의 억제는 표준 방법들, 예를 들면 트란스웰(transwell) 분석을 이용하여 분석될 수 있다. 간략하게 설명하자면, CCR4를 발현시키고, 화학주성이 가능한 세포를 한 쳄버 안에 있는 항체와 접촉시키고, CCR4의 리간드 예컨데 MDC는 제 1 쳄버와 분리된 또다른 쳄버에 위치시키는데, 이때 두 쳄버는 적합한 포어 크기를 가진 필터 막에 의해 구분된다. 리간드를 향하는 세포의 이동 (화학주성)에서 이 항체의 효과는 이 항체가 없을 때 화학 주성과 이 항체가 존재할 때 화학주성을 비교하여 결정된다. 적합한 방법은 실시예 6에 설명된다.
CCR4의 용어 "리간드"는 CCR4의 리간드 예컨데 MDC, TARC, RANTES, MCP-1 및/또는 MIP-1알파의 천연 리간드들을 포함하는데, 이들은 자연적으로 생산되거나, 실험실에서 재조합적으로 발현되거나 또는 합성된다.
"CCR4+ 세포들"은 이의 야생형에서 최소한 실질적으로 세포 표면상에 CCR4를 발현시키는 세포들을 의미한다. CCR4+ 세포들은 CCR4에 대해 천연적으로 양성일 수 있고, 또는 재조합 CCR4를 발현시키는 형질변환체일 수도 있다. CCR4+ 세포들은 그중에서도 특히 충실성 종양 세포들, 혈액학적 종양 세포들 및/또는 Tregs을 함유할 수 있다. CCR4+ 세포들의 바람직한 예들, 특히 시험관 분석용을 위한 예들은, CCRF-CEM, L-428, Hut78, 786-O, A498 및 KatoIII들이다.
본 발명의 경우, 따라서, 다양한 항-CCR4 항체들을 만들 수 있고, 본 명세서에서 논의된 임의의 장애들, 특히 암, 면역 장애들, 염증성 장애들 및 감염들의 치료를 포함하는 다양한 구체예들에서 이용될 수 있다.
전체 출원을 통하여 이용된 것과 같이, 용어 부정관사("a" 및 "an")은 언급된 성분들, 단계들의 "최소한 하나의", "최소한 처음", "하나 이상" 또는 "다수"을 의미한다는 의미로 이용되지만, 단, 그 다음 상한이 명시적으로 언급된 경우는 제외된다. 따라서, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "항체"는 "최소한 제 1 항체"를 의미한다. 임의의 단일 물질의 양과 함께, 복합의 실시가능한 한계 및 매개변수들은 본 공개 내용 분야의 통상의 지식을 가진 자들에게 자명할 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명의 최소한 하나의 항-CCR4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물들이다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 항체들 또는 이의 일부분 또는 단편들을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 핵산 분자들 또는 이에 실질적으로 상동성인 핵산 분자들은 본 발명의 추가 측면들을 형성한다. 표들에서 공개된 핵산 서열들이 바람직하다.
바람직한 핵산 분자들은 서열 번호: 47에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 56 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 서열 번호: 48에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 57 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 서열 번호: 49에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 58 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 서열 번호: 50에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 59 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 서열 번호: 51에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 60 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 서열 번호: 52에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 61 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 서열 번호: 53에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 62 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 서열 번호: 54에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 63 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열; 또는 서열 번호: 55에서 제시된 아미노산 서열(이는 서열 번호: 64 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된다)을 인코드하는 서열을 포함한다.
다른 바람직한 핵산 분자들은 서열 번호: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 또는 45의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열 (각각 서열 번호: 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 또는 117 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된)을 보유하는 중쇄 가변 영역(VH)을 인코드하는 서열들 및/또는 서열 번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 또는 46의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열 (각각 서열 번호: 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 또는 118 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 선호적으로 인코드된)을 보유하는 경쇄 가변 영역(VL)을 인코드하는 서열들을 포함한다.
다음의 복합들을 인코드하는 핵산들이 더욱 바람직하다: 서열 번호: 29 및 30; 또는 서열 번호: 31 및 32; 또는 서열 번호: 33 및 34; 또는 서열 번호 35 및 36; 또는 서열 번호 37 및 38; 또는 서열 번호 39 및 40; 또는 서열 번호 41 및 42; 또는 서열 번호 43 및 44; 또는 서열 번호 45 및 46. 다음의 복합들을 포함하는 핵산 분자들 또한 바람직하다: 서열 번호: 101 및 102; 또는 서열 번호: 103 및 104; 또는 서열 번호: 105 및 106; 또는 서열 번호: 107 및 108; 또는 서열 번호: 109 및 110; 또는 서열 번호: 111 및 112; 또는 서열 번호: 113 및 114; 또는서열 번호: 115 및 116; 또는 서열 번호: 117 및 118.
상기에서 언급한 바와 같이, 경쇄의 FR1 영역은 위치 1과 2에 잔기 QS를 보유할 수 있다. 따라서, 바람직한 핵산 서열은 위치 1과 2에 잔기 QS를 보유하고, 선호적으로 하기에 제시된 서열을 보유하는, VL503(서열 번호:40)에 실질적으로 상동성인 VL을 인코드하는 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성되는데, 이때 하기 서열에서 서열 번호:40과 비교하여 변화는 밑줄로 표시된다:
Figure pct00001
기타 바람직한 핵산 분자들은 본 발명의 항체들의 IgG 형태들, 예를 들면 실시예 1에서 설명된 것들, 또는 뮤린 키메라 형태들을 인코드하는 서열들을 포함한다.
상기에서 지적한 바와 같이, 본 발명에 의해 포괄되는 기타 핵산 분자들은 본 발명의 인간 항체들의 일부분 또는 단편들을 인코딩하는 것들, 예를 들면, 항체의 중쇄 가변 영역 (VH)을 인코딩하는 것들 또는 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)을 인코딩하는 것들이다. 기타 바람직한 핵산 분자들은 본 발명의 항체의 중쇄를 인코드하는 것들 (예를 들면, 서열 번호: 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95 또는 99을 인코드하는 것들, 예컨데 각각 서열 번호: 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93 또는 97 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열) 또는 항체의 경쇄를 인코드하는 것들 (예를 들면, 서열 번호: 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96 또는 100을 인코드하는 것들 예컨데 각각 서열 번호: 66, 70, 74, 82, 86, 90, 94 또는 98 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열)이다.
따라서, 본 명세서에서 정의된 것과 같은 본 발명의 항체들의 단편들 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열들, 또는 이러한 단편들을 인코드하는 서열들을 포함하는 핵산 분자들은 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
핵산 서열과 연관되어 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 상동성"은 공개된 아미노산 또는 핵산 서열에 최소한 70% 또는 75%, 선호적으로 최소한 80%, 그리고 더더욱 선호적으로 최소한 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 보유하는 서열들이다. 따라서 본 발명의 실질적으로 상동성 핵산 서열들은 본 발명의 서열들에 대해 하나의 또는 다수의 염기 변경들 (추가, 치환들, 삽입 또는 결실)을 포함한다.
선호적으로, IgG 항체에서 본 발명의 항체들은 CCR4에 대해 높은 결합 친화력을 보유하는데, 예를 들면 1x10-8M 또는 1x10-9 M 또는 그 미만의 범위의 Kd를 가질 수 있다. 중요한 것은, 이러한 친화력을 가진 항체들은 치료에 유용한 것으로 나타난 확립된 범위내에 있다. 선호적으로, IgG 포맷에서 본 발명의 항체들은 30 nM, 20 nM, 15 nM 또는 10 nM 미만의 Kd, 더욱 선호적으로 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5 또는 1 nM 미만의 Kd, 가장 선호적으로 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1 nM 미만의 Kd에 상응하는 CCR4에 대한 결합 친화력을 보유한다.
Kd를 측정하는 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 그러나, Kd는 예를 들면 Lineweaver-Burk 방법을 이용하여, 또는 상업적으로 이용가능한 결합 모델 소프트웨어, 예컨데 BIA코어 1000 Evaluation 소프트웨어에서 1:1 결합 모델을 이용함으로써, 표준 곡선을 확립하기 위하여 시험관에서 다양한 농도의 항원(CCR4)에 대항하여 다양한 농도의 테스트 항체를 테스트함으로써 바람직하게 결정된다. 소프트웨어 Prism (GraphPad, San Diego, CA)의 "한 부위-특이적 결합" 모델을 이용하여 CCR+ 세포들 상에서 IgG 적정(titrations)으로부터 계산될 수 있다.
Kd 값의 결정에 있어서, 표적(예를 들면 CCR4)을 발현시키는 세포들을 이용한 결합 실험들로부터 유도된 겉보기(apparent) Kd 값은 실험 조건이 겉보기 결합 친화력에 영향을 줄 수 있기 때문에 절대적인 친화력 표시로 간주되지 않을 수 있다는 것을 숙련자는 이해할 것이다. 예를 들면, CCR4의 발현 수준은 세포들이 배양되는 조건들, 뿐만 아니라 상이한 세포 유형들 간에 차이로 인하여 변화될 수 있다. 결과적으로 한 가지 설정의 실험내에서 획득된 겉보기 Kd 값을 비교하는 것이 최상이며, 그리고 하나의 설정 실험에서 획득한 Kd 값을 상이한 설정 실험들, 특히 실험 조건들이 상당히 변화된 실험들에서 획득한 Kd 값과 비교하는 것이 항상 적절한 것은 아닐 수 있다.
대안으로, CCR4-양성 세포의 표면상에 해리(off-rate) 및 항체 반감기는 세포 표면 보존 분석을 실행함으로써 측정될 수 있다(Adams et al., 1998, Prolonged in vivo tumour retention of a human diabody targeting the extracellular domain of human HER2/neu. Br J Cancer 77: 1405-12; Le Gall et al., 1999, Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding. FEBS Lett 453: 164-8). 후자의 방법은 치료 조건들 하에서 인간 환자에서 신장 상태를 더욱 적절하게 흉내내는 것을 허용한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 인간 CCR4 및 원숭이 CCR4 모두에 결합될 수 있다. 이러한 종간에 교차-반응 특히 인간과 전-임상 동물 모델에 일반적으로 이용되는 종간의 교차-반응은 전-임상 연구에서 임상 용도로의 좀더 효과적인 평행이동(translation)을 허용하기 때문에 유익할 수 있다. 예를 들면, 이용된 특정 동물 모델에 존재하는 고유의 CCR4와 교차 반응하는 항체를 보유한다는 것은 이 모델에서의 결과가 인간 환자의 상황을 좀 더 유사하게 반영한다는 것이며, 이로 인하여 예를 들면 만들어진 투약량의 좀 더 정확한 평가와 잠재적으로 관련된 또는 문제가 될 소지의 부작용을 확인하는 가능성의 증가를 허용한다. 예를 들면, 인간 CCR4 및 원숭이 CCR4 모두에 결합하는 본 발명의 항체의 능력은 이러한 항체들이 치료의 부작용을 평가하고 그리고 적정 내성 약량을 발견하는 전임상 독성 연구에서 테스트될 수 있다는 것을 의미한다.
추가로, 인간 CCR4 및 마우스 CCR4 모두에 결합하는 능력은 마우스 모델, 예를 들면 면역적격(immunocompetent) 마우스를 이용한 마우스 동계(syngeneic) 모델에서 본 발명의 이러한 항체들에 의해 보여진 결과들이 인간 대상에서 이 항체의 활성이 좀더 대표적이 될 수 있다는 것을 의미한다. 그 이유는 인간 CCR4에 결합할 수 있지만 마우스 CCR4에 결합할 수 없는 항체들은 마우스 모델에서 인간 종양 세포들에 의해 발현되는 CCR4에 결합하지만 내생성 뮤린 CCR4에는 결합할 수 없기 때문이다. 이것은 종양에 의해 발현되는 CCR4와 내생성 CCR4가 존재할 수 있는 인간 환자의 상황과는 물론 다르다.
이것은 이 항체가 뮤린 및 인간 CCR4 모두에 유사한 친화력을 보유한 경우가 특히 그러하다.
이러한 상황의 잠재적 단점은 인간 CCR4에 결합하지만, 그러나 마우스 CCR4에 결합하지 않거나 또는 상당히 더 낮은 친화력으로 결합하는 항체가 면역부적격화된(immunocompromized) 마우스 (예를 들면 누드 또는 SCID 마우스)에서 인간 종양 이종이식편(xenograft) 모델에서 잘 작용할 수 있지만, 이것이 훨씬 더 많은 CCR4이 존재하는 인간 시스템에서 유사한 능력으로 반영되지 않을 수 있다는 것이다. 환언하면, 마우스 이종이식편 시스템에서 인간 CCR4에 결합할 수 있지만 마우스 CCR4에 결합할 수 없는 항체에 의해 나타낸 항-종양 효과가 임상 현실보다 더 잘 보여질 수 있다는 점이다. 대조적으로 인간 및 마우스 CCR4 모두에 결합할 수 있는 항체로 작업할 경우, 마우스 모델계에 존재하는 모든 형태의 CCR4에 결합할 것이며, 이 항체를 인간에 넣을 경우의 상황을 좀 더 대표할 것 같다. 이는 이 항체가 뮤린 및 인간 CCR4 모두에 유사한 친화력을 보유하는 경우에 특히 그러하다.
바람직한 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 유사한 친화력, 예를 들면 10nM 또는 미만의 Kd 또는 5nM 또는 미만의 Kd, 더욱 선호적으로 3nM 또는 미만의 Kd 또는 2nM 또는 미만의 Kd, 가장 선호적으로 1nM 또는 미만의 Kd로 인간 및 원숭이 CCR4 또는 인간 및 마우스 CCR4에 결합한다.
"유사한 친화력"은 인간 CCR4에 대한 이 항체의 결합 친화력과 관심 대상의 하나 이상의 다른 종(예를 들면 원숭이 또는 마우스)에 대한 결합 친화력이 필적한다는 것, 예를 들면 고작 20의 상이한 인자라는 것을 또한 의미한다. 더욱 선호적으로 결합 친화력 간의 차이는 15 미만의 인자, 더욱 선호적으로 10 미만의 인자, 가장 선호적으로 5, 4, 3 또는 2 미만의 인자다.
그러나, 다른 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 원숭이 CCR4에 결합하지 않을 수 있고 및/또는 마우스 CCR4에 결합하지 않을 수 있다.
본 발명의 항체들은 CCR4에 결합한다. 따라서, 본 발명의 이 항체들 또는 결합 단백질들은 시험관 또는 생체내에서 CCR4, 특히 CCR4+ 세포들을 탐지하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, CCR4가 특정 종양세포들 상에서 발현되기 때문에, 본 발명의 항체들 또는 결합 단백질들은 생체내 또는 시험관에서 종양 세포들을 탐지하는데 이용될 수 있다. 추가로, CCR4+ 세포들에 국소화되는 항체들의 능력이란 본 발명의 항체들이 CCR4+ 세포들이 존재하는 신체 위치를 표적으로 하고, 이때 이 항체는 표적 위치에서 작용할 수 있다는 것을 의미한다. 특히, CCR4+ 종양세포들에 국소화되는 이 항체들의 능력이란 본 발명의 항체들이 CCR4+ 종양 세포들이 존재하는 신체 위치를 표적으로 하고, 이때 이 항체는 표적 위치에서 작용할 수 있다는 것을 의미한다.
예를 들면, 이 항체는 예를 들면 ADCC를 활성화 또는 유도함으로써, 네이키드(naked) 항체로써 항-CCR4+ 세포 효과를 유도할 수 있다. 네이키드 Ab로 작용하는 이러한 능력은 유익하다. 대안으로, 또는 추가로, 이 항체는 추가적인 치료 분자, 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 것과 같은 독소 또는 기타 항-암 분자 또는 항-염증성 물질에 접합됨(conjugated)으로써 항-CCR4+ 세포 효과를 유도할 수 있다.
본 발명의 항체들은 선호적으로 CCR4+ 세포들의 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 유도하는 능력을 보유한다. ADCC는 시험관에서 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 분석될 수 있다. 예를 들면, 인간 PBMCs 존재하에 CCR4+ 세포계 CCRF-CEM의 사멸이 분석될 수 있다. 예를 들면, 크롬-51 방출 분석이 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체들은 시험관에서 예를 들면 인간 PBMCs 존재하에 CCR4+ 세포들의 최소한 10%, 15%, 20%, 22%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 사멸을 야기할 수 있다. ADCC는 일부 용도, 특히 일부 치료 용도에 유익하다. 따라서, 바람직한 구체예들에서, 이 항체는 CCR4+ 세포들의 ADCC, 선호적으로 CCR4+ 종양세포들 및/또는 CCR4+ Th2 세포들의 ADCC를 유도할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 항체-중개된 ADCC는 PBMCs 존재하에 있지만, PBMCs 없는 구체예들에서 항체-중개된 ADCC를 또한 고려된다. CCR4+ 세포들의 ADCC를 유도하는 본 발명 항체들의 능력은 실시예 9에서 보여진다. 본 발명의 항-CCR4 항체들은 세 가지 모든 표적 세포계에서 인간 PBMCs 존재하에 ADCC를 유도할 수 있다는 것을 결과에서 분명하게 나타낸다. 이 항체 503은 CCRF-CEM 세포들에서 테스트될 때, 315 pM의 KW0761와 비교하여 5.3 pM의 EC50을 보유하는 것으로 측정되었다. 추가로, 본 발명의 항-CCR4 항체들은 단리된 Treg세포들에서 ADCC에 대해 공격할 때 필적가능한 최대 사멸 활성을 나타내었다.
본 발명의 항체들은 이러한 ADCC 수준을 획득하는데 요구되는 항체의 농도에 있어서 적절하게 효능이 있는 것으로 또한 보인다. 따라서, 시험관에서 CCR4+ 세포들, 예를 들면 CCRF-CEM세포들의 최대 세포 용해의 절반(EC50)에 요구되는 이 항체의 농도는 선호적으로 700ng/ml, 650ng/ml, 620ng/ml, 600ng/ml, 550ng/ml, 500ng/ml, 450ng/ml, 400ng/ml, 350ng/ml, 300ng/ml, 250ng/ml, 200ng/ml, 150ng/ml, 100ng/ml, 90ng/ml, 80ng/ml, 70ng/ml, 60ng/ml, 50ng/ml, 46ng/ml, 40ng/ml, 35ng/ml, 30 ng/ml, 25ng/ml, 20ng/ml, 15ng/ml, 10ng/ml, 9ng/ml, 7ng/ml, 5ng/ml, 2ng/ml, 1ng/ml, 0.5ng/ml 또는 0.25ng/ml 미만이다.
선호적으로, 상기에서 설명하는 능력은 대조군 수준과 비교하였을 때, 측정가능한 또는 상당한 수준에서 관찰되며, 그리고 더욱 선호적으로 통계학적으로 유의적인 수준에서 관찰된다.
상이한 기증자로부터 준비한 PBMC (효과물질 세포들)는 비-특이적 그리고 특이적 종양세포 용해 정도에 대해 상당히 다양한 ADCC 뿐만 아니라 EC50 값을 나타낼 수 있다는 것을 주지해야만 한다. 이 현상은 Naundorf et al, 2002에 의해 설명되었다.
인간 IgG1은 Fc 영역에 결합된 2개의 N-연결된 올리고사카라이드 쇄를 보유하는 당단백질이다. 이 올리고사카라이드들은 구조적 이질성을 야기하는 코어 푸코스, 양분되는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 말단 시알산의 존부하에 트리만노실 코어 구조로 구성된, 이중안테나(biantennary) 유형의 복합체다. 인간 혈청 IgG 및 치료 항체들은 상당히 푸코실화된 것으로 일반적으로 알려져있다. 되어 있다.
일부 경우들에서 ADCC 강화는 인간 IgG1 하위부류(subclass)에서 올리고사카라이드들의 상태를 조절함으로써 획득될 수 있다고 보고된 바 있다. 특히, 탈푸코실화(defucosylation)는 일부 항체들의 ADCC 활성의 증가를 초래한다는 것을 보여주었다(Niwa R et al, 2004). 따라서, 바람직한 구체예들에서, 특이적 당화 패턴, 특히 항체들의 치료 용도에 유익한 당화 패턴을 만들기 위하여 본 발명에 따른 항체들은 단백질의 생성/발현 동안, 및/또는 생성/발현 후 시험관에서 변형된다. 선호적으로, 전술한 특이적 당화 패턴은 푸코스-기반 당화의 감소 또는 제거이며, 이로써 ADCC를 유도하는 이 항체의 능력이 선호적으로 증가된다. 따라서, 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 특이적 당화 패턴, 선호적으로 ADCC를 유도하는 전술한 항체의 능력을 증가시키는 특이적 당화 패턴을 보유한다. 바람직하게는 본 발명의 항체들은 탈푸코실화되어 있거나 또는 푸코실화되지 않는다.
숙련자는 탈푸코실화되어 있는 또는 푸코실화되지 않는 항체들을 준비하는 적합한 방법을 알고 있다. 예를 들면, 이는 생산 동안 분자의 푸코실화의 감소를 유도하는 부류 I α-만노시다제의 선택적 억제제 키푸넨신(Kifunensine) (예를 들면 100 ng/ml) 존재하에 항체를 생산하면 획득될 수 있다. 올리고사카라이드 모이어티의 푸코실화에 요구되는 하나 이상의 단백질이 부족한 적합한 숙주 세포들, 예를 들면 푸코실트란스퍼라제가 부족한 숙주 세포들을 이용하여 탈푸코실화된 항체들을 생산할 수 있다. 적합한 숙주 세포들의 실시예들은 세포내 슈가 뉴클레오티드, GDP-푸코스의 합성과 관련된 효소의 활성 및/또는 푸코스의 1-위치는 복합체 N-글리코시드-연결된 슈가 쇄에 α-결합을 통하여 환원 단부에 있는 N-아세틸글루코사민의 6-위치에 결합된 슈가 쇄의 변형과 관련된 효소의 활성이 감소 또는 없어진 세포들이다. 이러한 효소들의 실시예들은 GMD (GDP-만노즈 4,6-데하이드라타제), Fx (GDP-케토-6-데옥시만노즈 3,5-에피머라제, 4-환원효소), GFPP (GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제)를 포함하는, GDP-푸코스의 합성에 관련된 효소들을 포함한다.
실시예 2에서 설명된 것과 같이, 항체 306, 406 및 503의 탈푸코실화된 형태는 세포 배양물에서 생성 동안 IgG의 푸코실화의 중단을 야기하는 부류 I α-만노시다제의 선택적 억제제인 키푸넨신 존재하에 생성된다.
"탈푸코실화된(defucosulated)"이란 Fc 영역에 결합된 전체 복합체 N-글리코시드-연결된 슈가 쇄의 최소한 10%, 선호적으로 최소한 20, 30, 40 50, 60, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 최소한 99%가 슈가 쇄의 환원 단부에서 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 슈가 쇄라는 것을 의미한다. "푸코실화안된(non-fucosylated)"이란 이 항체에 유의적인 수준의 푸코스가 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
일부 항체들은 이들이 결합된 세포 안으로 내화(internalized)될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체들의 일부 구체예들은 내화될 수 있다. 이 성질은 이 항체 분자에 부착된 임의의 다른 물질이 이 항체 분자와 함께 내화되어야만 하기 때문에 면역접합체들에서의 사용에 특히 유익하다. 다른 구체예들에서 유의적인 내화를 볼 수 없다.
CCR4는 혈소판에서 발현되는 것으로 알려져 있고, 그리고 이의 리간드들 MDC 및 TARC는 혈소판 응집화(aggregation)를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이것은 IgG 분자들은 2개의 리간드 결합 위치를 보유하여, CCR4를 인지할 수 있는 IgG의 두 팔 모두가 상이한 혈소판에 있는 CCR4에 결합된다면 혈소판과 교차 연결될 가능성있기 때문에 잠재적인 문제가 될 소지가 있다. 이는 생체내 블랏 응고를 유도할지도 모른다. 특히 의학적 용도에서, 항체는 임의의 유의적인 혈소판 응집화를 유도하지 않는 것이 바람직하다. 공지의 방법들을 이용하여 혈소판 응집화를 분석할 수 있다. 혈소판 응집화에 있어서 본 발명의 항체들의 효과는 실시예 11에서 설명된 것과 같이 분석되었다. 기본적으로, 이 항체들은 단리된 혈소판 단독으로 또는 응집화의 잘-설명된 유도물질인 ADP와 함께 항온처리되었다(Varon and Spectre "Antiplatelet agents" Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 267-72, 2009). 혈소판에 항-CCR4 항체들의 결합이 관찰되었지만, 이 항체들은 혈소판 응집화에 효과가 없는 것으로 나타났다. 항체들은 응집화를 유도하지 않고, 예를 들면 ADP-유도된 혈소판 응집화를 억제하지 않았다. 따라서, 이 항체들은 혈소판 응집화에 있어서 임의의 유의적인 효과를 보유하지 않는다.
상기에서 논의된 것과 같이, Tregs를 포함하는 특정 PBLs는 CCR4를 발현시키고, 따라서, 본 발명 항체의 일부 구체예들은 PBLs, 바람직하게는 Tregs 및/또는 Th2 세포들에 결합할 수 있다. 이 특징은 Treg 세포들의 고갈을 허용할 수 있기 때문에 특히 면역요법에 유익하다.
본 발명에 따른 조성물들, 면역접합체들, 약제, 복합물, 칵테일, 키트, 1차 및 2차 의학적 용도 및 모든 방법들의 다음 설명에서, 용어들 "항체" 및 "면역접합체(immunoconjugate)", 또는 이의 항원-결합 영역 또는 단편은 특별히 언급되지 않거나 또는 과학적 용어로부터 분명하지 않은 경우, 다양한 항-CCR4 항체들 뿐만 아니라 특이적 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 항체들을 지칭한다.
용어들 "항체" 및 "면역글로블린(immunoglobulin)"은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 다클론 및 단클론 항체들을 포함하는, 인간 항원 결합 도메인을 포함하는 임의의 면역학적 결합 물질 또는 분자를 광범위하게 지칭한다. 중쇄들에서 불변(constant) 도메인의 유형에 따라, 전체 항체들은 다음의 주요 5가지 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM중 하나에 해당되고, 본 발명의 항체들은 이들 부류중 임의의 하나에 속할 것이다. 이들중 몇 가지는 하위부류 또는 이소타입(isotype), 예컨데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 유사한 것들로 세분된다. 면역글로블린의 상이한 부류에 대응되는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 명명된다. 상이한 부류의 면역글로블린들의 하위단위 구조와 3차원적 배치는 공지되어 있다.
일반적으로, 본 발명에서는 항원 결합 영역들보다는 전체 항체들이 이용되어, IgG 및/또는 IgM이 바람직한데, 그 이유는 이들이 생리적 상황에서 가장 흔한 항체들이며, 실험실 환경에서 가장 용이하게 만들어지기 때문이다. 특히 IgG1 항체들이 바람직하다.
포유동물 항체들의 "경쇄들"은 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열과 이들의 가변 도메인의 골격 영역들내 일부 아미노산들에 근거하여 두 개의 명백하게 상이한 유형: 카파 (κ) 및 람다(λ)중 하나에 해당된다. 본 발명의 항체들에서 κ 및 λ 경쇄 불변 영역들의 사용에서 기본적으로 선호되는 것은 없다.
당분야의 숙련자들이 이해할 수 있는 것과 같이, 용어 "항체"에 포괄되는 면역학적 결합 시약은 전체 항체들, 이합체, 삼합체 그리고 다합체 다합체 항체들; 이중특이적 항체들; 키메라 항체들; 재조합 및 공작된 항체들, 그리고 이의 단편들을 포함하는 모든 항체들 및 이의 항원 결합 단편을 망라한다.
따라서, 용어 "항체"는 항원 결합 영역을 보유하는 임의의 항체-유사 분자를 지칭할 때도 이용되는데, 이 용어는 항원 결합 도메인 예컨데 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체들 (DABs), TandAbs 이합체, Fv, scFv (단일 쇄 Fv), dsFv, ds-scFv, Fd, 선형 항체, 미니바디(minibodies), 디아바디, 이중특이적 항체 단편들, 바이바디(bibody), 트리바디(각각 scFv-Fab 융합체, 이중특이적 또는 삼중특이적); sc-디아바디(diabody); 카파 (람다) 바디(scFv-CL융합체); 이중특이적 T-세포 Engager (BiTE) (T 세포들을 유인하는 scFv-scFv tandems); 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig (이중특이적 포맷); 작은 면역단백질 (SIP) (미니바디의 일종); SMIP ("작은 모듈식 면역약제(small modular immunopharmaceutical)" scFv-Fc 이합체; DART (탈안정화된 디아바디 "이중 친화력 재표적화(Dual Affinity ReTargeting)"); 하나 이상 CDRs를 포함하는 작은 항체 모방체 및 이와 유사한 것을 포함하는 항체 단편들을 포함한다.
다양한 항체-기반 구조체 및 단편들을 제조하고 이용하는 기술들은 당업계에 공지되어 있다(Kabat et al., 1991, 특별히 참고자료로 편입된다). 디아바디는 특히, EP 404,097 및 WO 93/11161에서 추가 설명되고 있으며; 선형 항체들은 Zapata et al. (1995)에서 추가 설명된다.
통상적인 기술들을 이용하여 항체들이 파편화될 수 있다. 예를 들면, F(ab')2 단편들은 항체를 펩신으로 처리하여 만들어질 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편을 처리하거나 이황화다리를 환원시키면 Fab' 단편들이 만들어진다. 파파인 침지로 Fab 단편들이 형성될 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, 이합체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편들 및 기타 단편들은 또한 재조합 기술에 의해 합성될 수 있고, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 항체 단편들을 만드는 기술들은 당업계에 공지되어 있고, 잘 설명되어 있다. 예를 들면, Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001; Reiter et al., 1996; 및 Young et al., 1995는 각각 효과적인 항체 단편들의 생산에 대해 추가 설명 및 가능하게한다.
이 항체들 또는 항체 단편들은 자연적으로 생성될 수 있거나 또는 완전하게 또는 부분적으로 합성에 의해 만들어질 수 있다. 따라서 이 항체는 임의의 적합한 원천, 예를 들면 재조합 원천으로부터 유래될 수 있거나 및/또는 이식유전자 동물 또는 이식유전자 식물, 또는 IgY 기술을 이용하여 알에서 만들어질 수 있다. 따라서, 이 항체 분자들은 시험관에서 또는 생체내에서 만들어질 수 있다.
선호적으로, 이 항체 또는 항체 단편은 3개의 CDR 도메인들을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역 (VL)과 3개의 CDR 도메인들을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 전술한 VL 및 VH는 일반적으로 항원 결합 위치를 형성한다.
"Fv" 단편은 완벽한 항원-인지 및 결합 위치를 보유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비-공유적 연합된 이합체를 보유한다. 이러한 배치에서, 각 가변 도메인의 3개 초가변 영역들(CDRs)은 상호작용하여 VH-VL 이합체의 표면에 항원-결합 위치를 특징짓는다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역들 (CDRs)은 이 항체의 항원-결합 특이성을 부여한다.
그러나, 항체의 경쇄 가변 도메인에서 3개의 CDRs와 중쇄 가변 도메인에서 3개의 CDRs의 존재가 항원 결합에 필수적인 것은 아니라는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 상기 전통적인 항체 단편보다 더 작은 구조체들은 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
예를 들면, 카멜리드(camelid) 항체들 (Hamers-Casterman et al., 1993; Arbabi Ghahroudi et al., 1997)은 광범위한 항원 결합 레퍼토리를 보유하지만 경쇄들이 없다. 또한, VH 도메인들을 단독으로 포함하는(Ward et al., 1989; Davies and Riechmann, 1995) 또는 VL 도메인들을 단독으로 포함하는(van den Beuckenet al., 2001)단일 도메인 항체들의 성과에서 이들 도메인들은 수용가능한 고-친화력으로 항원에 결합할 수 있음을 보여준다. 따라서, 3개의 CDRs 은 효과적으로 항원에 결합할 수 있다.
단일 CDR, 또는 두개의 CDRs가 항원에 효과적으로 결합할 수 있음이 또한 공지되어 있다. 첫 예로써, 단일 CDR을 이종기원의 단백질 안으로 삽입시킬 수 있고 이종기원의 단백질에 항원 결합 능력을 부여할 수 있는데, 이는 이종기원의 단백질, 예컨데 GFP에 삽입된 VH CDR3 영역은 이 이종기원의 단백질에 항원 결합 능력을 부여한다는 것을 보여줌으로써 예시되었다(Kiss et al., 2006; Nicaise et al., 2004).
2개의 CDRs은 항원에 효과적으로 결합할 수 있고, 부모 항체에 의해 보유되는 것보다 우위의 성질을 부여할 수 있음도 또한 공지되어 있다. 예를 들면, 부모 항체 (VH CDR1 및 VL CDR3 영역)으로부터 유래된 2개의 CDRs은 부모 분자의 항원 인지 성질을 보유하지만, 종양을 침투하는 더 우위의 능력을 보유한다는 것을 보여주었다(Qiu et al., 2007). CDRs을 고유한 부모 항체를 모방하는 방식으로 배향시키기 위하여 이들 CDR 도메인들을 적합한 링커 서열 (예를 들면, VH FR2으로부터 유래된)을 연결시키면, 훨씬 더 우수한 항원 인지를 만들었다. 따라서, 부모 항체에서 발현되는 형태를 유지시키기 위하여 적합한 골격 영역에 의해 배향된 2개의 CDR 도메인들 (선호적으로 하나는 VH 도메인으로부터 그리고 다른 하나는 VL 도메인으로부터, 더욱 선호적으로는 2개의 CDR 도메인들중 하나는 CDR3 도메인임)을 포함하는 항원 결합 항체 모방체를 작제하는 것이 가능하다는 것은 공지된 사실이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 항체들은 6개의 CDR 영역들 (3개는 경쇄로부터, 그리고 3개는 중쇄로부터)을 포함할 수 있을지라도, 6개 미만의 CDR 영역들과 하나 또는 2개와 같이 적은 수의 CDR 영역들을 가진 항체들도 본 발명에 포괄된다. 추가로, 중쇄 또는 경쇄에서만 유래된 CDRs을 가진 항체들 또한 고려된다.
CCR4에 결합하는 본 발명의 바람직한 항체들은 3개의 CDRs을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역과 3개의 CDRs을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하며, 본 명세서에서 전술한 중쇄 가변 영역은 본 명세서에서 공개된 서열들을 보유하는 중쇄 CDRs을 포함한다.
지정된 중쇄 CDR 영역들과 연합하여 이용되는 바람직한 경쇄 CDR 영역들이 명세서 도체에서 설명된다. 그러나, 본 발명의 중쇄 가변 영역들과 연합하여 이용되는 3개의 CDRs를 포함하는 기타 경쇄 가변 영역들 또한 고려된다. 본 발명의 중쇄 가변 영역들과 복합되어 이용되고, CCR4에 결합되는 항체를 만드는 적합한 경쇄 가변 영역들은 당업계 숙련자에 의해 용이하게 확인할 수 있을 것이다.
예를 들면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 단일 경쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역들의 레퍼토리와 복합될 수 있고, 생성된 항체들은 CCR4에 결합에 대해 테스트된다. 상이한 경쇄 가변 영역들을 가진 본 발명의 중쇄 가변 영역들의 이러한 합당한 수의 복합물은 CCR4에 결합하는 능력을 유지할 것으로 기대된다.
유사한 방법들을 이용하여 본 발명의 바람직한 경쇄 가변 영역들과 복합되어 이용되는 대체 중쇄 가변 영역들을 확인할 수 있다.
특정 구체예들에서, 이 항체 또는 항체 단편은 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부, 예컨데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역을 포함한다. 선호적으로, 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역, 또는 이의 일부다. 더욱이, 이 항체 또는 항체 단편은 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역의 전부 또는 일부분 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 이러한 불변 영역들의 전부 또는 일부는 자연적으로 생성되거나 또는 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 이러한 불변 영역들에 대한 적합한 서열들은 당업계에 공지되어 있고, 기록되어 있다. 중쇄 및 경쇄들의 불변 영역들의 완전한 보체가 본 발명의 항체들에 포함될 때, 이러한 항체들은 일반적으로 "전장(full length)" 항체들 또는 "전체(whole)" 항체들이라고 불린다.
Fc 영역을 함유하는 항체들이 특정 용도, 특히 생체내 치료 용도에 바람직하며, 이때 Fc 영역은 효과물질 기능 예컨데 ADCC를 조정한다.
실질적으로 상동성 핵산 서열들은 최소한 중간정도의 엄격한 혼성화 조건, 선호적으로 매우 엄격한 조건들하에서 공개된 핵산 서열들(또는 이들의 상보성 서열들)에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열들, 예를 들면, 본 발명의 하나 이상의 경쇄 또는 중쇄 CDRs, 본 발명의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역들, 또는 본 발명의 항체들 (또는 이들의 상보성 서열들에 혼성화되는)을 인코드하는 뉴클레오티드 서열들에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함한다.
본 발명의 단백질들의 실질적으로 상동성 서열들은 항체의 VH, VL 또는 CDR 도메인들에 영향을 주지 않는 변경들, 예를 들면, 상이한 링커서열이 이용된 scFV 항체들, 또는 항원의 결합에 기여하지 않는 테그(tag) 또는 다른 성분들이 추가된 항체들, 또는 항체 분자 또는 단편의 한 가지 유형 또는 포맷을 항체 분자 또는 단편의 또다른 유형 또는 포맷으로 전환시키는 변경들(예를 들면, Fab를 scFv로 전환 또는 이의 역), 또는 항체 분자를 항체 분자의 특정 부류 또는 하위 부류로 전환(예를 들면, 항체 분자를 이의 IgG 또는 이의 하위부류, 예를 들면, IgG1 또는 IgG3으로 전환)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
기타 바람직한 구체예들에서, 고유 항-CCR4 항체, 예컨데 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803과 비교하여 강화된 또는 우수한 성질들을 보유하는 2차 생성 항체들이 제공된다. 예를 들면, 2차 생성 항체들은 CCR4에 더 강력한 결합 친화력, 더 나은 교차 반응 프로파일, CCR4+ 세포들, 특히 종양세포들을 표적으로 하는 더 나은 능력, ADCC를 유도하는 개선된 능력, CDC를 유도하는 개선된 능력을 보유할 수 있고, 명세서 도처에서 논의되는 장애들의 개선된 치료를 할 수 있다.
효과적인 2차 생성 항체들을 확인하기 위한 비교는 예를 들면, 본 명세서에서 상세하게 설명된 또는 당업계에서 설명된 하나 이상의 다양한 분석을 이용하여 용이하게 실시되고 정량화된다. 가령 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 항체로 구체화된 본 발명의 항-CCR4 항체들과 비교하여 강화된 생물학적 성질 또는 최소한 약 2-배, 5-배, 10배, 20-배, 그리고 선호적으로, 최소한 약 50-배의 활성을 보유하는 2차 생성 항체들 또한 본 발명에 의해 포괄된다.
본 발명의 항체, 결합 단백질 및 핵산 분자들은 인간 또는 동물 몸 안에 원래 존재하거나 또는 인간 또는 동물 몸으로부터 유도된 조직 시료에 존재할 수 있는 임의의 성분들과는 구별되기 때문에 일반적으로 "단리된" 또는 "정제된" 분자들이다. 그러나 서열들은 인간 또는 동물 몸에서 발견되는 서열에 대응하거나 또는 실질적으로 상동성일 수 있다. 따라서, 핵산 분자들 또는 서열들 그리고 단백질들 또는 폴리펩티드들 예를 들면, 항체들과 관련하여, 본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "단리된" 또는 "정제된"이란 이들의 천연 환경으로부터 단리된, 정제된 또는 실질적으로 천연 환경이 없는 분자들(자연적으로 생성된 경우), 예를 들면, 인간 또는 동물 몸으로부터 단리된 또는 정제된 분자를 말하거나, 또는 기술적 과정 가령, 재조합 및 합성에 의해 생산된 분자들 지칭한다.
따라서, 핵산 분자와 연관되어 이용될 때, 이러한 용어들은 자연적으로 연합된 물질, 예컨데 다른 핵산/유전자 또는 폴리펩티드들이 실질적으로 없는 핵산을 지칭할 수 있다. 이들 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포성 재료 또는 배양 배지가 실질적으로 없는 핵산을 또한 지칭할 수 있고, 또는 실질적으로 화학적으로 합성되었을 때 화학 전구물질 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 핵산을 지칭할 수 있다. 단리된 또는 정제된 핵산은 이 핵산이 유도된 것으로부터 핵산에 자연적으로 측면에 위치한 서열들(가령, 핵산의 5' 및 3' 단부에 위치한 서열들)이 실질적으로 없거나, 또는 예를 들면, 유전 공학에 의해 핵산의 측면에 있도록 만들어진 서열들(예를 들면, 테그(tag) 서열들 또는 치료 가치를 보유하지 않은 기타 서열)이 실질적으로 없을 수 있다.
따라서, 단백질 또는 폴리펩티드 분자 예컨대, 본 발명의 경쇄 CDRs 1, 2 및 3, 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 경쇄 가변 영역들, 중쇄 가변 영역들, 및 결합 단백질들 또는 항체들과 연관되어 이용될 때, 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 단백질이 유도된 원천으로부터 세포성 물질 또는 기타 단백질들이 실질적으로 없는 단백질을 일반적으로 지칭한다. 일부 구체예들에서, 특히 단백질이 인간 또는 동물에 투여되는 경우, 이러한 단리된 또는 정제된 단백질들은 재조합 기술들에 의해 만들어질 경우 실질적으로 배양 배지가 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구물질들 또는 기타 화학물질이 없다. 이러한 단리된 또는 정제된 단백질들은 측면(flanking) 서열들 예컨대, 단리된 핵산 분자들을 위하여 상기에서 설명된 서열들이 없을 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 용어 "핵산 서열" 또는 "핵산 분자"는 자연적으로 생성되는 염기들, 슈가들 그리고 슈가간 (백본) 링키지로 구성된 뉴클레오시드 도는 뉴클레오티드 모노머의 서열을 말한다. 이 용어는 또한 자연적으로 생성되지 않는 모노머들 또는 이의 일부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 서열들을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열들은 데옥시리보핵산 서열들 (DNA) 또는 리보핵산 서열들 (RNA)일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 포함하는 자연적으로 생성되는 염기들을 또한 포함할 수 있다. 이 서열들은 변형된 염기들을 또한 함유한다. 이러한 변형된 염기들의 실시예들은 아자(aza) 및 데아자(deaza) 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실; 그리고 산틴 및 하이포산틴을 포함한다. 이 핵산 분자들은 이중 가닥 또는 단일 가닥(stranded)일 수 있다. 이 핵산 분자들은 전체적으로 또는 부분적으로 합성 또는 재조합될 수 있다.
바람직한 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 인간 항체들, 더욱 선호적으로 완전한 인간 항체들이다. 이점에 있어서, 인간 항체들은 인간 요법에 사용되기 위하여 일반적으로 최소한 3가지 잠재적인 장점을 보유한다. 첫째, 인간 면역계는 이 항체를 외부물질로 인지하지 않아야 한다. 둘째, 인간 순환계내 반감기는 자연적으로 생성되는 인간 항체들과 유사하여, 더 적은 양으로, 그리고 덜 빈번한 투약을 허용할 것이다. 셋째, 효과물질 부분이 인간이기 때문에, 예를 들면, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 의해 좀더 효과적으로 표적 세포들을 파괴하기 위하여, 인간 면역계의 다른 부분들과 더 잘 상호작용할 것이다.
그러나, 인간 항체들은 이들 장점들을 보여주는 것으로 일반적으로 받아들여지지만, 성공적인 인간 요법을 위한 후보물질을 만들기 위하여 충분히 높은 친화력과 적합한 기능적 성질들을 보유한 인간 항체들의 개발은 결코 확실한 것이 아니라는 것은 알려져 있다. 따라서, 당업계는 인간을 안전하고 효과적으로 치료하기 위한 항-CCR4는 부족하며, 이러한 물질들을 개발하기 위한 난제들을 가지고 있다.
항체 분자들 및 결합 단백질들과 관련하여 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "인간"은 가변 영역들 (예를 들면, VH, VL, CDR 또는 FR 영역들) 및 인간 레퍼토리로부터 단리되거나 또는 유도된 또는 인간, 예를 들면 인간 생식계 또는 체세포들에서 발견되는 서열로부터 유도된 또는 대응하는 불변 항체 영역들을 임의선택적으로 보유하는 항체 및 결합 단백질을 우선적으로 지칭한다.
208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 항체들은 이러한 인간 항체 분자들의 예가 되며, 본 명세서에서 가변 영역들은 인간 레퍼토리로부터 단리되었다.
본 발명의 "인간" 항체들 및 결합 단백질들은 인간 서열들에 의해 인코드되지 않는 아미노산 잔기들, 예를 들면, 시험관내에서 무작위 또는 위치 지향된 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들, 예를 들면 시험관에서 클로닝 또는 PCR에 의해 도입된 돌연변이들을 더 포함한다. 이러한 돌연변이들의 특정 예는 이 항체 또는 결합 단백질의 소수의 잔기에서 보존적 치환들 또는 기타 돌연변이들을 포함하는 돌연변이인데, 예를 들면, 이 항체 또는 결합 단백질의 최대 5, 4, 3, 2, 1개의 잔기에서, 선호적으로 예를 들면, 이 항체 또는 결합 단백질의 하나 이상의 CDRs을 구성하는 최대 5, 4, 3, 2, 1개의 잔기에서의 돌연변이를 포함한다. 이러한 "인간" 항체들의 특정 예들은 잠재적 면역원성 부위의 양을 감소시키기 위하여 표준 변형 기술들을 받게되는 항체들 및 가변 영역들을 포함한다.
따라서, 본 발명의 "인간" 항체들은 인간에서 발견되는 서열로부터 유도된 그리고 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계 레퍼토리내에 자연적으로 존재하지 않는 서열들을 포함한다. 추가로, 본 발명의 인간 항체들 및 결합 단백질들은 인간 서열들로부터 확인된 인간 콘센선스 서열들, 또는 인간 서열들에 대해 실질적으로 상동성인 서열들을 포함하는 단백질들을 포함한다.
추가로, 본 발명의 인간 항체들 및 결합 단백질들은 인간 항체 분자들과 복합되여 자체적으로 발견되는 VH, VL, CDR 또는 FR 영역들의 복합물에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 인간 항체들 및 결합 단백질들은 인간에서 필연적으로 자연적으로 존재하지 않는 이러한 영역들의 복합물을 포함하거나 또는 대응할 수 있다.
바람직한 구체예들에서, 인간 항체들은 완전한 인간 항체들이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "완전한(Fully) 인간" 항체들은 상기에서 정의된 바와 같이, 실질적으로 비-인간 항체 서열들 또는 임의의 비-인간 항체 서열들 없이, "인간" 가변 영역 도메인들 및/또는 CDRs를 포함하는 항체들이다. 예를 들면, "실질적으로 비-인간 항체 서열들" 없이 인간 가변 영역 도메인들 및/또는 CDRs을 포함하는 항체들은 항체들, 도메인들 및/또는 CDRs이며, 이때 단지 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산들은 인간 항체 서열들에 의해 인코드되지 않은 아미노산들이다. 따라서, "완전한 인간" 항체들은 실질적으로 비-인간 가변 영역 도메인들, 예를 들면, 마우스 가변 영역 도메인들에 근거한 "인간화된" 항체들과 구별되는데, 이때 특정 아미노산들은 인간 항체들에서 일반적으로 존재하는 아미노산들에 더 잘 대응하도록 변화되었다.
본 발명의 "완전한 인간" 항체들은 임의의 기타 실질적으로 항체 서열들없이 인간 가변 영역 도메인들 및/또는 CDRs, 예컨데 단일 쇄 항체들일 수 있다. 대안으로, 본 발명의 "완전한 인간" 항체들은 하나 이상 인간 항체 불변 영역들과 통합된 또는 실효적으로(operatively) 부착된 인간 가변 영역 도메인들 및/또는 CDRs일 수 있다. 특정 바람직한 완전한 인간 항체들은 IgG 불변 영역들의 완전한 보체를 가진 IgG 항체들이다.
다른 구체예들에서, 본 발명의 "인간" 항체들은 부분-인간 키메라 항체들일 것이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "부분(Part)-인간 키메라" 항체들은 인간이 아닌 종, 예컨데 쥐 또는 마우스의 불변 영역에 실효적으로 부착된 또는 이에 접목된(grafted) "인간" 가변 영역 도메인들 및/또는 CDRs을 포함하는 항체들이다. 이러한 부분-인간 키메라 항체들은 예를 들면, 전-임상 연구에 이용될 수 있는데, 본 명세서에서 불변 영역은 전-임상 테스트에 이용되는 동물과 동일한 종이 선호될 것이다. 이들 부분-인간 키메라 항체들은 예를 들면, 생체외(ex vivo) 진단에 이용될 수 있는데, 본 명세서에서 인간이 아닌 종의 불변 영역은 항체 감지를 위한 추가 선택권을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "단편"은 생물학적 관련 단편들, 예를 들면, 항원 결합에 기여하는, 예를 들면, 항원 결합 위치의 일부를 형성하는 단편들, 및/또는 CCR4 항원의 기능의 억제 또는 감소에 기여하는 단편들을 말한다. 바람직한 특정 단편들은 본 발명의 항체들의 중쇄 가변 영역 (VH 도메인) 및/또는 경쇄가변 영역 (VL 도메인)을 포함한다. 기타 바람직한 단편들은 본 발명의 항체들의 하나 이상의 중쇄 CDRs (또는 본 발명의 VH 도메인의) 및/또는 하나 이상의 경쇄 CDRs (또는 본 발명의 VL 도메인의)을 포함한다. 바람직한 특정 단편들은 길이가 최소한 5개의 아미노산이며, 최소한 하나의 CDR 영역, 선호적으로 CDR3 영역, 더욱 선호적으로 중쇄 CDR3 영역을 포함한다.
구체예들에서, 본 발명의 항체들이 본 명세서에서 설명된 정의된 임의의 서열들의 단편을 포함하는, 예를 들면, 본 발명의 VH 및/또는 VL 도메인들을 포함하는 항체들이거나, 또는 본 발명의 하나 이상 CDRs을 포함하는 항체들 또는 결합 단백질들이면, 이들 영역들/도메인들은 일반적으로 이 항체 또는 결합 단백질들 내에서 분리되어, 각 영역/도메인이 이의 생물학적 기능을 수행할 수 있고, 항원 결합에 대한 기여는 유지된다. 따라서, VH 및 VL 도메인들은 선호적으로 적합한 구조(scaffold) 서열들/링커 서열들에 의해 분리되고, CDRs는 적합한 골격 영역들 예컨데 자연적으로 생성되는 항체들 및/또는 효과적으로 공작된(engineered) 항체들에서 볼 수 있는 것들에 의해 선호적으로 분리된다. 따라서, 본 발명의 VH, VL 및 개별 CDR 서열들은 항원 결합이 가능하게 하도록 적합한 골격 또는 구조(scaffold)내에 선호적으로 제공되거나 또는 통합된다. 이러한 골격 서열들 또는 영역들은 적합한 구조(scaffold)를 형성하는데 적합한 자연적으로 생성되는 골격 영역들, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4에 대응할 수 있거나, 또는 예를 들면 다양한 자연적으로 생성되는 골격 영역들과 비교함으로써 확인되는 콘센선스 골격 영역들에 대응할 수 있다. 대안으로, 비-항체 구조(scaffold) 또는 골격, 예를 들면, T 세포 수용체 골격이 이용될 수 있다.
골격 영역들로 이용될 수 있는 적합한 서열들은 당업계에 공지되어 있으며, 잘 정이되어 있고, 이들중 임의의 것이 이용될 수 있다. 골격 영역들로 바람직한 서열들은 본 발명의 VH 및/또는 VL 도메인을 구성하는 하나 이상 (가령 1, 2, 3 또는 4개)의 골격 영역들인데, 가령, 표1, 2, 3 또는 4에 공개된 하나 이상의 골격 영역들, 또는 이에 실질적으로 상동성인 골격 영역들 그리고 특히 항원 특이성의 유지를 허용하는 골격 영역들, 예를 들면 이 항체의 실질적으로 동일한 또는 동일한 3D 구조를 야기하는 골격 영역들이다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 12, 13, 14 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 7, 8, 9, 10) 모두다 서열 번호: 47의 적합한, FR 영역들(표 1에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들으로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 12, 13, 14 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 7, 8, 16, 10) 모두다 서열 번호: 48의 적합한, FR 영역들(표 2에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 12, 13, 14 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 7, 8, 18, 10) 모두다 서열 번호: 49의 적합한, FR 영역들(표 3에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 12, 13, 14 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 19, 8, 9, 10) 모두다 서열 번호: 50의 적합한, FR 영역들(표 4에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 21, 13, 23 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 19, 8, 9, 10) 모두다 서열 번호: 51의 적합한, FR 영역들(표 5에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 12, 13, 23 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 19, 8, 9, 10) 모두다 서열 번호: 52의 적합한, FR 영역들(표 6에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 21, 13, 23 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 7, 8, 9, 10) 모두다 서열 번호: 53의 적합한, FR 영역들(표 7에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 25, 13, 23 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 7, 8, 9, 10) 모두다 서열 번호: 54의 적합한, FR 영역들(표 8에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
바람직한 특정 구체예들에서, 4개 가변 경쇄 (서열 번호: 12, 13, 23 및 15) 및/또는 가변 중쇄 (서열 번호: 7, 8, 28, 10) 모두다 서열 번호: 55의 적합한, FR 영역들(표 9에 또한 나타냄), 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역들로 본 발명의 항체들에서 발견된다.
따라서, 중쇄 FR1에서 위치 26은 일부 구체예에서는 선호적으로 E이지만, 다른 구체예들에서, G 이다. 중쇄 FR3에서 일부 구체예에서는 위치 22는 선호적으로 P 이지만, 다른 구체예들에서, S 이고, 위치 23은 일부 구체예에서 선호적으로 E 이지만, 다른 구체예들에서 D 이다. 경쇄 FR1에서 위치 7은 일부 구체예에서 선호적으로 P 이지만, 다른 구체예들에서, Q 이다. 경쇄 FR3에서 위치 20은 일부 구체예에서 선호적으로 S 이지만, 다른 구체예들에서, G 이다.
상기에서 언급된 바와 같이, 서열 번호: 12의 바람직한 상동체는 서열 번호: 129 또는 130이며, 서열 번호:21의 바람직한 상동체는 서열 번호: 131 또는 132이며, 따라서 상기 모든 설명은 서열 번호 129-132의 인용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
추가로, 본 발명의 바람직한 항체들은 본 발명의 VH, VL 또는 CDRs로 구성되지만, 본 발명의 항체는 본 명세서에서 약술된 본 발명의 항체들의 CCR4 결합 성질 또는 항-CCR4 성질들이 여전히 존재하기만 한다면, 본 발명의 것이 아닌 다른 VH, VL 또는 CDRs와 복합하여 본 발명의 하나 이상의 VH, VL 또는 CDRs를 또한 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "중쇄 상보성 결정 영역" ("중쇄 CDR")은 항체 분자의 중쇄 가변 영역 (VH 도메인)내 초가변성 영역들을 말한다. 중쇄 가변 영역은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단 방향으로 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3으로 명명되는 3개의 CDRs을 보유한다. 중쇄 가변 영역은 4개의 골격 영역들 (아미노 말단에서부터 카르복시 말단 방향으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 또한 보유한다. 이들 골격 영역들은 CDRs을 분리시킨다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "중쇄 가변 영역" (VH 도메인)은 항체 분자의 중쇄 가변 영역을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "경쇄 상보성 결정 영역" ("경쇄 CDR")은 항체 분자의 경쇄 가변 영역 (VL 도메인)내 초가변성 영역들을 말한다. 경쇄 가변 영역은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단 방향으로 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3으로 명명되는 3개의 CDRs을 보유한다. 경쇄 가변 영역은 4개의 골격 영역들 (아미노 말단에서부터 카르복시 말단 방향으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 또한 보유한다. 이들 골격 영역들은 CDRs을 분리시킨다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "경쇄 가변 영역" (VL 도메인)은 항체 분자의 경쇄 가변 영역을 지칭한다.
필요에 따라 CDRs의 위치를 정의하기 위하여 본 발명은 Kabat 명명법을 따른다(Kabat et al., 1991, 이는 특별히 여기에 참고자료로 편입된다).
당업계 숙련자는 본 발명의 단백질들과 폴리펩티드들, 예컨데 경쇄 및 중쇄 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 영역들, 항체들, 항체 단편들, 그리고 면역접합체들은 당업계에 공지되어 있는 그리고 잘 설명된 임의의 방법으로 제조될 수 있지만, 재조합 방법들을 이용하여 제조되는 것이 가장 선호된다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 항체들의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들을 인코드하는 핵산 단편들은 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 클로닝 또는 합성에 의해 유도되거나 만들어질 수 있다. 이러한 서열들은 예를 들면, 인간 생식 계열 유전자들로부터 적합한 서열들을 클로닝하고, 그리고 그 다음 본 발명의 서열들을 획득하기 위하여 당업계에 공지되어 있는 그리고 설명된 방법들을 이용하여 생식 계역 서열들에게 임의의 필수적인 변형들을 만들어 준비될 수 있다. 대안이 되는 그리고 좀더 효과적인 방법은 적합한 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열을 중첩되는 프라이머로 합성하고, 그리고 프라이머 연장을 이용하여 전장 서열을 얻는 것이다. 그 다음 이 전장 서열은 추가 클로닝 및 조작을 위하여, 예를 들면, 적합한 발현 벡터 안으로 클로닝시키기 위하여 적합한 제한절단 부위를 함유하는 프라이머와 함께 PCR을 통하여 증폭시킬 수 있다. 일반적으로 가변 영역 당 5 내지 7개의 중첩되는 프라이머가 충분하며, 이로 인하여 매우 효과적이고 정확한 기술이 된다.
본 발명의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들을 인코드하는 핵산 단편들이 획득되었다면, 이들 단편들은 표준 재조합 DNA 기술들에 의해 추가 조작될 수 있는데, 예를 들면 가변 영역 단편들을 적합한 불변 영역 도메인들을 가진 전장 항체 분자들로 변형시키거나, 또는 명세서 도처에서 논의된 항체 단편, 예를 들면, Fab 단편들, scFv 단편들, 등의 특정 포맷으로 변형시킬 수 있다. 전형적으로, 또는 이 추가 조작 과정의 일부로써, 본 발명의 항체 생산을 실행하기 위하여 본 발명의 항체 분자들을 인코드하는 핵산 단편들은 적합한 발현 벡터 안으로 일반적으로 통합된다.
가능한 발현 벡터들은 코스미드, 플라스미드, 또는 변형된 바이러스들(예를 들면, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연합된 바이러스)을 포함하나 벡터가 이용되는 숙주 세포와 양립되는 한, 이에 한정되지 않는다. 발현 벡터들은 "숙주 세포의 형질변환에 적합하고", 이는 발현 벡터들이 본 발명의 핵산 분자와 발현에 이용되는 숙주 세포에 근거하여 선택된 조정 서열들을 포함한다는 것을 의미하며, 이 조정 서열은 핵산 분자에 실효적으로 연결되어 있다. 실효적으로 연결된다는 것은 이 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 핵산이 조정 서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 이의 단편 및 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코드된 단백질 서열의 전사 및 해독에 필수적인 조정 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터를 고려한다.
적합한 조정 서열들은 박테리아, 곰팡이, 바이러스성, 포유동물, 또는 곤충 유전자들을 포함한 다양한 원천으로부터 유도될 수 있다(예를 들면, Goeddel, 1990에서 설명된 조정 서열들을 참고). 적합한 조정 서열들의 선택은 하기에서 논의되는 바와 같이 선택된 숙주 세포에 따라 달라지며, 당업계 숙련자들은 용이하게 성취할 수 있다. 이러한 조정 서열들의 실시예는 다음을 포함한다: 전사 프로모터 및 인헨서 또는 RNA 중합효소 결합 서열, 해독 개시 신호를 포함하는 리보좀 결합 서열. 추가적으로, 선택된 숙주 세포와 이용된 벡터에 따라, 다른 서열들, 예컨데 복제 원점, 추가적인 DNA 제한절단 부위, 인헨서, 그리고 전사 유도성을 부여하는 서열들이 발현 벡터 안에 통합될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터들은 본 발명의 재조합 분자로 형질변환된 또는 형질감염된 숙주 세포들의 선별을 용이하게 하는 선별가능한 표지 유전자들을 또한 함유할 수 있다. 선별가능한 표지 유전자들의 실시예는 단백질 예컨대, 특정 약물에 저항성을 부여하는 네오마이신 및 하이그로마이신, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제, 반딧불이 루시퍼라제, 또는 면역글로블린 또는 이의 일부분, 예컨데 면역글로블린, 선호적으로 IgG의 Fc 부분을 인코드하는 유전자들이다. 선별가능한 표지 유전자의 전사는 선별가능한 표지 단백질 예컨대, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제, 또는 반딧불이 루시퍼라제의 농도 변화로 감시된다. 선별가능한 표지 유전자가 항생제 저항성 예컨대, 네오마이신 저항성을 부여하는 단백질을 인코드한다면, 형질변환체 세포들은 G418에 의해 선별될 수 있다. 선별가능한 표지 유전자를 통합시킨 세포들은 생존할 것이며, 다른 세포들은 죽게된다. 이로써 본 발명의 재조합 발현 벡터의 발현을 눈으로 확인하고 분석하는 것이 가능하며, 그리고 특히 별현 및 표현형에서 돌연변이의 효과를 결정하는 것이 가능하게 된다. 선별가능한 표지들은 관심 핵산과는 별도의 벡터에 도입될 수 있음도 인지할 것이다.
재조합 발현 벡터들은 재조합 단백질의 증가된 발현; 재조합 단백질의 증가된 용해도; 친화력 정제에서 리간드로 작용함으로써 표적 재조합 단백질의 정제에 도움이 되는 (예를 들면 정제 및/또는 확인을 가능하게 하는, 예를 들면, His 테그 또는 myc 테그와 같은 적합한 "테그(tag)"가 존재할 수 있다) 융합 모이어티를 인코드하는 유전자들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들면, 단백질분해성 절단 위치를 표적 재조합 단백질에 추가하여 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 허용하고, 이후 융합 단백질의 정를 가능하게 한다. 전형적인 융합 발현 벡터들은 pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMal (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)을 포함하는데, 이들은 각각 글루타티온 S-트란스퍼라제(GST), 말토즈 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 재조합 단백질에 융합시킨다.
재조합 발현 벡터들은 숙주 세포들 안으로 도입되어 형질변환된 숙주 세포를 만들 수 있다. 용어 "~로 형질변환된(transformed)", "~로 형질감염된(transfected)", "형질변환" 및 "형질감염"은 당업계에 공지되어 있는 임의의 가능한 기술에 의해 핵산(가령, 벡터)을 세포안으로 도입시키는 것을 포괄한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "형질변환된 숙주 세포"은 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질변환된 당화가 가능한 세포들을 또한 의미한다. 원핵 세포들은 예를 들면, 전기천공(electroporation) 또는 염화칼슘 중개된 형질변환에 의해 핵산으로 형질변환될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 통상의 기술들 예컨대, 인산칼슘염 또는 염화칼슘 공동침전을 통하여 포유동물 세포 안으로 도입될 수 있다, DEAE-덱스트란 중개된 형질감염, 리포펙션, 전기천공 또는 현미주사를 통하여 포유동물 세포들 안으로 도입된다. 숙주 세포들을 형질변환 및 형질감염시키는 적합한 방법들은 Sambrook et al., 1989, 및 다른 실험서에서 찾아볼 수 있을 것이다.
적합한 숙주 세포들은 다양한 진핵 숙주 세포들 및 원핵 세포들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 단백질들은 효모 세포들 또는 포유동물 세포들에서 발현될 수 있다. 기타 적합한 숙주 세포들은 Goeddel, 1990에서 찾아볼 수 있다. 추가로, 본 발명의 단백질들은 원핵 세포들, 예컨데 대장균(Escherichia coli)에서 발현될 수 있다 (Zhang et al., 2004).
본 발명을 실행하기 위하여 적합한 효모 및 곰팡이 숙주 세포들은 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아(Pichia) 또는 클루베로미세스(Kluyveromyces) 속(genus) 그리고 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 다양한 종들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 효모 사카로미세스 세르비시에(S. cerevisiae)에서 발현을 위한 벡터의 예로는 pYepSec1 (Baldari.et al., 1987), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982), pJRY88 (Schultz et al., 1987), 그리고 pYES2 (Invitrogen Corporation, SanDiego,CA)를 포함한다. 효모 및 곰팡이의 형질변환을 위한 프로토콜은 당업계 숙련자에게 잘 공지되어 있다(Hinnen et al., 1978; Ito et al., 1983, and Cullen et al. 1987 참고).
본 발명을 실행하기에 적합한 포유동물 세포들은 그 중에서도 다음을 포함한다: COS (예를 들면, ATCC No. CRL1650 또는 1651),BHK(예를 들면, ATCC No. CRL6281), CHO(ATCC No. CCL61), HeLa(예를 들면, ATCC No. CCL2), 293(ATCC No. 1573), NS-1세포들, NS0(ATCC CRL-11177), 그리고 Per.C6® (Crucell, Leiden, Netherlands). 포유동물 세포들에서 발현을 지휘하는데 적합한 발현 벡터들은 프로모터(예를 들면, 바이러스성 물질 예컨데 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 그리고 원숭이 바이러스 40으로부터 유도된) 뿐만 아니라 기타 전사 및 해독 대조군 서열들을 일반적으로 포함한다. 포유동물 발현 벡터들의 예로는 pCDM8 (Seed, B.,1987) 및 pMT2PC (Kaufmanet al., 1987)을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 교시에 따라, 프로모터(promoters), 터미네이터(terminators), 그리고 적합한 유형의 벡터들의 발현을 식물, 조류 및 곤충 세포들로 도입시키는 방법들 또한 용이하게 실현될 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명의 단백질들은 식물 세포로부터 발현될 수 있다(Sinkar et al., 1987 참고, 아그로박테리움 리조겐스(Agrobacterium rhizogenes) 벡터들의 용도를 재검토함; Zambryski et al., 1984 참고, 그중에서도 PAPS2022, PAPS2023, 및 PAPS2034를 포함하는 식물 세포에 발현 벡터들의 용도를 설명한다).
본 발명을 실행하는데 적합한 곤충 세포들은 봄빅스(Bombyx), 트리코플루시아(Trichoplusia) 또는 스포도테라(Spodotera) 종의 세포들 및 세포계를 포함한다. 배양된 곤충 세포들(SF9 세포들)에서 단백질 발현에 이용가능한 베쿨로바이러스 벡터들은 pAc 시리즈(Smithet al., 1983) 및 pVL 시리즈(Luckow and Summers 1989)를 포함한다. 본 발명의 재조합 단백질의 발현에 적합한 일부 베쿨로바이러스-곤충 세포 발현계는 PCT/US/02442에서 설명된다.
대안으로, 본 발명의 단백질들은 인간이 아닌 이식유전자 동물 예컨데, 쥐, 토끼, 양 그리고 돼지에서 또한 발현될 수 있다(Hammer et al. 1985; Palmiter et al. 1983; Brinsteret al. 1985; Palmiter and Brinster 1985, 및 미국 특허No.4,736,866).
본 발명의 단백질들은 단백질 화학에서 공지된 기술들 예컨데 고형상 합성 (Merrifield (1964); Frische et al., 1996) 또는 균질 용액내 합성을 이용하여 화학적 합성에 의해 또한 제조될 수 있다.
다른 분자들, 예컨데 단백질들에 접합된 본 발명의 항체들과 단백질을 포함하는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질들은 재조합 기술들을 통하여 융합에 의해 만들어질 수 있다. 생성된 융합 단백질들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 선택된 단백질 또는 표지 단백질, 또는 테그(tag) 단백질에 융합된 본 발명의 항체 또는 단백질을 함유한다. 본 발명의 항체들 및 단백질들은 공지의 기술에 의해 다른 단백질에 또한 접합될 수 있다. 예를 들면, WO 90/10457에서 설명된 것과 같이, 이종이기능성 티올-함유 링커, N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오-프로피오네이트) 또는 N-숙시니미딜-5 티오아세테이트를 이용하여 단백질들이 결합될 수 있다. 융합 단백질들 또는 접합체(conjugates)를 만드는데 이용될 수 있는 단백질의 예로는 세포 결합 단백질들 예컨데 면역글로블린, 호르몬, 성장 인자들, 렉틴, 인슐린, 저밀도 지단백질, 글루카곤, 엔돌핀, 트란스페린, 봄베신, 아실로글리코단백질 글루타티온-S-트란스퍼라제 (GST), 헤마글루티닌 (HA), 및 절두된 myc를 포함한다.
제 1 항-CCR4 항체 핵산 분절(segment)의 제조 방범과는 무관하게, 표준 분자 생물학 기술에 의해 추가로 적합한 항체 핵산 분절들을 용이하게 만들 수 있다. 임의의 변이체를 확인하기 위하여, 본 발명에서 돌연변이체(mutant) 또는 2차 생성 항-CCR4 항체 핵산 분절이 사용하기에 적합하며, 본 발명에 따라 핵산 분절을 테스트하여 항-CCR4 항체의 발현을 확인한다. 선호적으로, 변이체, 돌연변이체 또는 2차 생성 핵산 분절을 또한 테스트하여 표준 조건, 더욱 선호적으로, 표준 엄격한 혼성화 조건하에 혼성화(hybridization)를 확인할 것이다. 예시적인 적합한 혼성화 조건은 약 50℃에서 약 7%의 황산 도데실 나트륨(SDS), 약 0.5 M NaPO4, 약 1 mM EDTA에서 혼성화; 그리고 약 42℃에서 약 1 % SDS로 세척을 포함한다.
다양한 항체들이 용이하게 준비될 수 있기 때문에, 환자에게 본 발명의 제 1 항-CCR4 항체의 생물학적 유효량을 발현시키는 최소한 제 1 핵산 분절 또는 분자를 환자 또는 동물에게 제공함으로써 본 발명의 치료 방법들이 실행될 것이다. "항-CCR4 항체를 발현시키는 핵산 분절 또는 분자"은 최소한 발현 구조체 또는 벡터의 형태가 일반적이며, 바이러스 또는 재조합 숙주 세포 내에 포함된 발현 구조체 또는 벡터의 형태가 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 유전자 요법 벡터들은 바이러스성 벡터들, 예컨데 재조합 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV), 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스 (AAV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 및 이와 유사한 것 내부에 포함된 바이러스 벡터들이 일반적일 것이다.
추가 측면은 본 발명의 하나 이상의 핵산 분절 또는 분자들을 포함하는 발현 구조체 또는 발현 벡터를 제공한다. 선호적으로 발현 구조체 또는 벡터들은 재조합체(recombinant)다. 선호적으로 전술한 구조체 또는 벡터들은 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코드된 단백질 서열의 전사 및 해독을 위한 필수적인 조정 서열들을 더 포함한다.
추가 측면은 본 발명의 하나 이상 발현 구조체 또는 발현 벡터들을 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스를 제공한다. 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자들을 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스 또한 제공된다. 본 발명의 항체를 발현시키는 숙주 세포 또는 바이러스 또한 추가 측면을 형성한다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 방법들은 다음의 단계들을 포함한다: (i) 인코드된 항체 또는 단백질의 적합한 조건들하에서 본 발명의 하나 이상의 재조합 발현 벡터들 또는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 그리고 임의선택적으로 (ii) 성장 배지/상청액으로부터 또는 숙주 세포로부터 이 항체 또는 단백질을 분리 또는 획득하는 단계. 이러한 생산 방법들은 이 항체 또는 단백질 생성물의 정제 단계 및/또는 이 항체 또는 생성물을 최소한 하나의 추가적인 성분, 예컨데 약제학적으로 수용가능한 운반체 또는 부형제를 포함하는 조성물로 제형화시키는 단계를 또한 포함할 수 있다.
구체예들에서, 본 발명의 항체 또는 단백질이 하나 이상의 폴리펩티드 쇄(예를 들면, 특정 단편들 예컨데 Fab 단편들)로 구성되고, 모든 폴리펩티드들이 숙주 세포에서 동일한 또는 상이한 발현 벡터로부터 선호적으로 발현될 때, 완벽한 단백질들, 예를 들면, 본 발명의 결합 단백질들은 숙주 세포내에서 어셈블리될 수 있고, 이로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
본 발명의 항체들은 CCR4에 결합하는 그 이상의 항체를 더 생산하는데 또한 이용될 수 있다. 이러한 용도는 예를 들면 새로운 항체를 만들기 위하여 부모 항체의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산의 추가, 결손, 치환 또는 삽입이 관련되며, 본 명세서에서 전술한 부모 항체는 명세서 도처에서 정의된 바의 본 발명의 항체들중 하나이며, CCR4에 결합하는 항체들을 확인하기 위하여 생성된 새로운 항체를 테스트한다. 이러한 방법들을 이용하여 다중의 새로운 항체들을 만들 수 있고, 이들이 CCR4에 결합하는 능력에 대해 모두 테스트된다. 선호적으로 전술한 하나 이상의 아미노산의 추가, 결손, 치환 또는 삽입은 하나 이상의 CDR 도메인들에서 일어난다.
부모 항체에 이러한 변형 또는 돌연변이는 당업계에 공지되어 있는 그리고 설명된 기술들, 예를 들면 무작위 또는 지향된 돌연변이생성 방법의 실행으로 실시될 수 있다. 지향된 돌연변이생성이 이용되면, 돌연변이생성에 적합한 잔기들을 확인하는 한 가지 전략은 항원 결합에 관여한 주요 잔기들을 확인하기 위하여, 결합 단백질-항원 복합체, 예를 들면, Ab-Ag 복합체의 결정 구조의 해리를 이용하는 것이다(Davies and Cohen, 1996). 후속적으로, 이들 잔기들이 돌연변이되어 상호작용을 강화시킬 수 있다. 대안으로, 하나 이상 아미노산 잔기들은 지향된 돌연변이생성을 위하여 단순히 표적화되고 그리고 CCR4에 결합에 대한 효과가 평가된다.
무작위 돌연변이생성은 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 실수 유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링(chain shuffling) 또는 돌연변이체 대장균(E. coli) 균주에 의해 실시될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나 이상의 VH 도메인들은 단일 VL 도메인 또는 임의의 적합한 원천의 VL 도메인들의 레퍼토리와 복합될 수 있고, CCR4에 특이적인 항체를 확인하기 위해 생성된 새로운 항체들을 테스트한다. 역으로, 본 발명의 하나 이상의 VL 도메인들은 단일 VH 도메인 또는 임의의 적합한 원천의 VH 도메인들의 레퍼토리와 복합될 수 있고, CCR4에 결합하는 항체들을 확인하기 위하여 생성된 새로운 항체들을 테스트한다.
유사하게, 본 발명의 VH 및/또는 VL 도메인들중 하나 이상, 또는 선호적으로 3개 CDRs 모두를 단일 VH 및/또는 VL 도메인 또는 VH 및/또는 VL 도메인들의 레퍼토리에 접목시킬 수 있고, CCR4에 결합하는 항체들을 확인하기 위하여 생성된 새로운 항체들을 테스트한다.
CDRs, 특히 경쇄 및/또는 중쇄들의 CDR3의 표적화된 돌연변이는 항체 친화력을 증가시키는데 효과적인 기술이며, 바람직함을 보여주었다. 선호적으로, CDR3의 3 내지 4개 아미노산 블록 또는 "핫-스팟(hot-spots)"이라고 불리는 특이적 영역들이 돌연변이생성에 표적이 된다.
"핫-스팟"은 생체내 체세포 과돌연변이가 일어나는 서열들이다(Neuberger and Milstein, 1995). 핫-스팟 서열들은 특정 코돈의 콘센선스(consensus) 뉴클레오티드 서열들로 정의될 수 있다. 콘센선스 서열은 4개 뉴클레오티드, RGYW이며, 이때 R은 A 또는 G일 수 있고, Y는 C 또는 T일 수 있고, 그리고 W는 A 또는 T일 수 있다(Neuberger and Milstein, 1995). 추가로, 뉴클레오티드 AGY에 의해 인코드되는 세린 잔기는 잠재적 핫-스팟 서열들에 대응하는 TCN에 의해 인코드되는 것들보다 가변 도메인의 CDRs 영역들에 주로 존재한다(Wagneret al., 1995).
따라서, 본 발명의 각 항체의 중쇄 및 경쇄들의 CDRs의 뉴클레오티드 서열은 핫-스팟 서열들 및 AGY 코돈의 존재에 대해 스캔될 수 있다. 경쇄 및 중쇄의 CDR 영역들의 확인된 핫-스팟은 International ImMunoGen Tics 데이터베이스 (IMGT, http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)(Davieset al., 1990)를 이용하여 중쇄 및 경쇄의 배종(germinal) 서열과 임의선택적으로 비교될 수 있다. 생식 계열에 동일한 서열은 체세포 돌연변이가 일어나지 않았음을 암시하며; 따라서 생체내에서 일어나는 체세포 사건을 모방하도록 무작위 돌연변이들을 도입시킬 수 있거나, 또는 대안으로, 예를 들면, 핫-스팟 및/또는 AGY 코돈에서 위치 지향된 돌연변이생성이 실행될 수 있다. 대조적으로, 상이한 서열은 일부 체세포 돌연변이가 이미 일어났음을 보여준다. 생체내 체세포 돌연변이가 최적이었다면 여전히 측정이 남아있게 된다.
돌연변이용 바람직한 핫-스팟은 노출된 아미노산들을 코드하는 것들과 선호적으로 항원 결합 위치의 일부를 형성하는 아미노산들을 인코드하는 것들이다. 돌연변이용 기타 바람직한 핫-스팟은 비-보존된 아미노산들을 코드하는 것들이다. CDRs내 매장된 또는 보존된 아미노산들을 코드하는 핫-스팟은 선호적으로 돌연변이되지 않는다. 이들 잔기는 전반적인 구조에 항상 중요하고, 이들은 매장되어 있기 때문에 항원과 상호작용하지 않을 것이다.
아미노산들 및 단백질 도메인들의 상기 설명된 조작을 실시하는 방법들은 당업계 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 전술한 조작들은 핵산 수준에서 유전공학적 조작에 의해 편리하게 실시될 수 있으며, 여기에서 적합한 결합 단백질들 및 이의 도메인들을 인코드하는 핵산 분자들은 변형되어, 생성된 발현된 단백질의 아미노산 서열이 차례로 적합한 방식으로 변형된다.
CCR4에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체들의 능력은 당업계에 공지되어 있고 잘 설명된 임의의 적합한 방법에 의해 테스트될 수 있다. CCR4+ 세포계는 배양 수집물로부터 획득될 수 있거나, 또는 CCR4-음성 세포들을 재조합 CCR4의 발현을 허용하는 구조체로 형질변환시킴으로써 준비될 수 있다. 이러한 세포들, 또는 고정된 CCR4를 분석 결합, 예를 들면 통상적인 방법들 예컨데 ELISA, BiaCon, 등에 용이하게 이용할 수 있을 것이다.
이들 방법에 의해 생성된 새로운 항체들은 개선된 기능적 성질들, 예를 들면, 부모 항체들보다 CCR4에 대해 더 높은 또는 강화된 친화력 (또는 최소한 등가의 친화력)을 보유할 것이며, 명세서 도처에서 설명된 것과 같이 (예를 들면, 치료용, 진단용, 조성물내에, 등) 본 발명의 항체들과 동일한 방식으로 처리되고 이용될 것이다. 대안으로, 또는 추가적으로, 새로운 항체들은 명세서 도처에서 설명된 것과 같이, 하나 이상의 개선된 기타 기능적 성질들을 보유할 것이다.
이들 방법에 의해 생산된, 획득된 또는 획득가능한 새로운 항체들은 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
본 발명은 본 발명의 최소한 하나의 인간 항체 또는 항체 단편과, 임의선택적으로 희석제를 포함하는 조성물들을 더 제공한다. 이러한 조성물들은 약제학적으로 수용가능한 조성물들 또는 실험실 연구용으로 이용되는 조성물들일 수 있다. 약제학적 조성물들에서, 조성물들은 선호적으로 장관외(parenteral), 정맥내 또는 심지어 피하 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 인간 항체들 및 항체 단편들의 다수의 방법 및 용도를 제공한다. 모든 방법들과 관련하여, 용어 단수 부정관사("a" 및 "an")는 특별히 언급된 경우를 제외하고, 명시된 방법들에서 "최소한 하나의", "최소한 제 1의", "하나 이상" 또는 "다수의" 단계들을 의미하는데 이용된다. 이것은 치료 방법들에서 투여 단계들과 특히 관련있다. 따라서, 본 발명에서 이용되는 상이한 1회분량(doses)이 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 1회분량의 상이한 횟수, 예를 들면, 주사가 이용될 수 있는데, 최대 그리고 다수의 주사를 포함하여 이용할 수 있다. 항-CCR4 치료 항체를 투여하기 전, 후 또는 투여하는 동안 복합된 치료가 이용될 수 있다.
생물학적으로 중요한 영향을 가지는 본 발명의 항체들 또는 면역접합체들의 시험관내 다양한 유용한 방법 및 용도가 제공된다. 결합 CCR4의 결합 방법 및 용도가 우선 제공되는데, 이 방법은 CCR4를 포함하는 조성물을 본 발명의 최소한 제 1 항-CCR4 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 효과적으로 접촉시키는 것을 일반적으로 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체들, 또는 이의 면역접합체들은 결합 분석에 이용될 수 있다. 적합한 유용한 결합 분석은 일반적으로 당업계에서 이용되는 것들, 예컨데 면역블랏(immunoblots) 웨스턴 블랏(Western blots) 도트 블랏(dot blots), RIAs, ELISAs, 면역조직화학, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 면역침전, 친화력 크로마토그래피, 및 유사한 것들을 포함한다.
CCR4를 탐지하는 방법 및 이에 용도가 제공되는데, CCR4/항체 복합체 형성을 허용하고, 형성된 복합체의 탐지를 허용하는데 효과적인 조건하에 CCR4를 함유하는 것으로 의심되는 또는 CCR4를 함유하는 것으로 공지된 조성물을 본 발명의 최소한 제 1 항-CCR4 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 효과적으로 접촉시키는 것을 일반적으로 포함한다. 감지 방법들 및 용도는 예를 들면, 종양 진단에서 생물학적 시료들과 연관되어 이용될 수 있으며, 그리고 이에 기반을 둔 진단 키트가 또한 제공된다.
본 발명의 항체는 피험자가 항-CCR4 요법으로부터 이익을 얻을 수 있을지를 판단하는데 또한 이용될 수 있다. 따라서, CCR4-관련된 장애를 앓고 있는 피험자의 세포, 표적 위치, 조직 또는 장기에 의해 발현되는 CCR4의 존재를 탐지하거나 또는 CCR4의 양을 측정하는데 본 발명의 항체의 용도를 제공하며, 여기에서 건강한 대조군과 비교하여 탐지된 CCR4의 존재 또는 측정된 양의 증가는 전술한 피험자가 항-CCR4 요법으로부터 이익을 얻을 수 있음을 임시한다. 대안 측면에서, 피험자가 항-CCR4 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는지를 결정하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 본 발명의 항체 유효량을 피험자에게 투여하고, 전술한 피험자의 세포, 표적 위치, 조직 또는 장기에 의해 CCR4의 존재 또는 발현되는 양을 탐지하는 것을 포함하며, 여기에서 건강한 대조군과 비교하여 탐지된 CCR4의 존재 또는 측정된 양의 증가는 전술한 피험자가 항-CCR4 요법으로부터 이익을 얻을 수 있음을 임시한다.
전술한 세포 또는 표적 위치는 선호적으로 충실성 종양(solid tumor) 또는 혈액학적 종양일 수 있다. 선호적으로, 탐지된 또는 측정된 CCR4의 존재 또는 CCR4의 양을 이용하여 CCR4-관련된 장애가 항-CCR4 물질, 선호적으로 본 발명의 항-CCR4 항체로 허용되는 치료인지를 예측한다. 선호적으로, 탐지된 또는 측정된 CCR4의 존재 또는 CCR4의 양을 이용하여 항-CCR4 물질, 선호적으로 본 발명의 항-CCR4 항체의 투여를 결정한다.
본 발명의 방법들 및 용도들은 CCR4가 생물학적 역할을 하는 CCR4 발현 또는 활성과 연관된 임의의 질환 또는 이상을 가지거나, 또는 발생 위험에 처한 동물 및 환자들에 사용하기 위함이다. 이러한 질환들 그리고 장애들은 리간드가 CCR4에 결합할 때, 장애 또는 질환을 야기하는 또는 이 질환 또는 장애에 기여하는 신호 생성 경로에 참여할 수 있는 CCR4 양성 세포들, 전형적으로 CCR4+ Th2 또는 Th17 세포들에 의해 중개되는 질환들을 포함한다. 이 질환들은 세포들 발현시키는 CCR4의 비정상적인 증식에 의해 야기되는 질환을 또한 포함한다. 이러한 비정상적으로 증식하는 세포들은 자연적으로 CCR4+이거나, 또는 CCR4을 발현시키도록 변형된/형질변환된 것들일 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, CCR4의 발현은 면역계를 회피하기 위하여 이 항원을 발현시키는 암 세포들을 도울 수 있다. 따라서, CCR4에 의해 중개된 및/또는 CCR4-양성 세포들의 비정상적 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법들이 제공된다.
대안으로 검토할 때, 다음중 하나 이상으로부터 이익을 얻는 질환의 치료를 제공한다:
(i) CCR4+ 세포들의 선택적 제거;
(ii) CCR4가 하나 이상 이의 리간드들에 결합하는 것을 억제;
(iii) CCR4 리간드에 대한 CCR4-중개된 세포성 반응들의 억제, 특히 화학주성 또는 증가된 세포내 칼슘 이온 농도(세포 활성화)의 억제.
선호적으로, CCR4 리간드는 MDC 및/또는 TARC이다.
CCR4가 광범위한 질환들 그리고 장애들에 관련되기 때문에, 임의의 수용가능한 모델계에서 효과를 보였다면, 주어진 항-CCR4 요법은 CCR4 발현과 연결된 전 범위의 질환들 그리고 장애들을 치료하는데 이용될 수 있다는 것은 당업계에 숙련자들에게 공지되어 있다.
한 구체예에서, CCR4-중개된 병은 T-헬퍼 세포 유형 2-중개된 면역 질환이다. "T-헬퍼 세포 유형 2-중개된 면역 질환"이란 알레르겐-특이적 Th2 세포들의 발달과 활성으로 인하여 면역글로블린 E (IgE) 및 비만 세포들이 관련된 질환을 의미한다.
CCR4-중개된 질환 또는 장애는 염증, 감염 및/또는 혈액학적 암과 비-혈액학적 암들을 포함하는 암과 관련된 질환 또는 병일 수 있다. 이러한 질환들 또는 장애들은 본 항체들과 조성물들로 치료 또는 예방될 수 있다. 바람직한 질환들 또는 병들에는 다음의 것들이 포함된다: (1) 알레르기성 질환들 예컨데 전신 아낙필라시스 또는 과민반응 반응들, 약물 알레르기, 알레르기성 기관지 폐 아스퍼질러스증(ABPA), 곤충 침 알레르기 및 식품 알레르기, (2) 염증성 장 질환들, 예컨데 크론(Crohn) 질환, 궤양성 결장염, 회장염 및 장염, (3) 질염, (4) 건선 및 염증성 피부병 예컨데 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기 및 소양증, (5) 맥관염, (6) 척추관절염, (7) 경피증, (8) 천식 및 호흡기 알레르기성 질환들 예컨데 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 과민반응 폐 질환들 및 이와 유사한 것들, (9) 자가면역 질환들, 예컨데 관절염(류마티스성 관절염 및 건선 관절염 포함), 다발성 경색, 전신 홍반성 낭창, 유형 I 당뇨병, 사구체신염, 및 이와 유사한 것들, (10) 이식편 거부반응 (이종이식편 거부반응 및 이식편-대-숙주 질환을 포함), 그리고 (11) 바람직하지 않은 염증성 반응들이 억제되는 기타 질환들, 예컨데 아테롬성 동맥경화증, 근염, T-세포 중개된 신경퇴행성 질환들, 다발성 경색, 뇌염, 수막염, 간염, 신장염, 폐혈증, 유육종증, 알레르기성 결막염, 이염, 캐슬만 질환, 부비강염, LPS-유도된 내독성 쇼크, 베체트 증후군(Behcet's syndrome) 및 통풍, (12) 암, 혈액학적 암 및 비-혈액학적 암, 선호적으로 유방 암, 결장직장 암, 식도 암, 위 암, 간세포 암종, 폐 암, 흑색종, 난소암, 췌장 암, 성인 T-세포 백혈병/림프종 (ATL), 말초 T-세포 림프종, 상세불명 미만성 거대 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, B-세포 만성 임파성 백혈병, CTCL, 특히 균상식육종(Mycosis fungoides), 세자리 증후군, 경부 암, 신장 암, 뇌 암, 전립선 암, 위 암, (13) 감염들 예컨데, 입스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 감염, HIV 감염 및 기타 바이러스성 감염들.
본 발명의 항체가 CCR4에 결합되면 CCR4-양성 비정상 세포들의 능력 예컨대, 숙주 면역계를 회피하는 암 세포들의 능력이 또한 손상될 수 있다. 본 발명의 항체들을 이용하여 Treg 세포들에 의한 DCs의 억제를 차단시킬 수 있고, 따라서 본 발명의 항-CCR4 항체를 백신에서 어쥬번트로의 용도가 제시된다. 백신은 선호적으로 암 또는 감염성 질환의 백신이다. 백신은 예방 백신 또는 치유 백신일 수 있다. "어쥬번트"는 항원에 대한 숙주의 면역 반응을 강화시키는 물질을 의미한다. 따라서, 본 발명의 항체들이 백신 어쥬번트들로 이용될 때, 본 발명의 항체들은 면역 반응이 유도되기를 원하는 항원과 함께 또는 복합되어 투여되는 것이 일반적이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "비정상(aberrant) 증식"은 정상적인, 적절한 또는 예상된 과정으로부터 벗어난 세포 증식을 의미한다. 예를 들면, 비정상 세포 증식은 세포들의 DNA 또는 다른 세포성 성분들이 손상된 또는 결함이 있는 세포들의 부적합한 증식을 포함할 수 있다.
비정상 세포 증식은 세포 증식에 의해 야기되는 또는 세포 증식에 의해 중개된 징후 또는 부적절하게 높은 수준의 세포 분열을 초래하거나, 부적절하게 낮은 수준의 세포사멸을 초래하거나 또는 이둘 모두를 초래하는 특징들이 연합된 세포 증식을 포함할 수 있다. 이러한 징후들은 예를 들면 양성 또는 악성의 암 또는 암이 아닌 단일 또는 다중의 국소적 세포들 또는 세포군들, 또는 조직들로 특징화될 수 있다.
명세서에서 "종양"과 관련된 임의의 언급은 "암(들)" 또는 "암종(들)"을 지칭한다. 전이성 암들은 원발성 종양으로부터 전이의 감소로 또한 치료될 수 있다. 외과수술 후 환자들에 남아 있는 소위 미세 잔존 질환 (MRD)은 항-CCR4 항체들을 이용한 면역요법에 순응적일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기에서 정의된 질환을 치료하는 방법 및 치료에 용도를 더 제공하는데, 이는 이러한 질환을 가진 동물 또는 환자들에게 본 발명의 항-CCR4 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이러한 항-CCR4 항체의 면역접합체의 치료 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 치료, 영상화 또는 진단에 사용하기 위한 조성물 또는 약물의 제조에 본 발명의 항체들 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 면역접합체의 용도를 더 제공한다.
추가 측면은 치료, 화상 진단 또는 진단에 본 발명의 항체들 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 면역접합체의 용도를 더 제공한다.
추가로, 본 발명은 하나 이상 약제학적으로 수용가능한부형제, 운반체, 희석제, 완충제 또는 안정화제와 함께 본 발명의 항체들 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 면역접합체를 포함하는 조성물들을 제공한다.
본 명세서에서 설명된 생체내 방법들은 일반적으로 포유동물에서 실시된다. 임의의 포유동물 예를 들면, 인간 및 임의의 가축, 가정용 또는 실험실 동물이 치료될 수 있다. 특이적 예로는 마우스, 쥐, 돼지, 고양이, 개, 염소, 토끼, 소 그리고 원숭이를 포함한다. 그러나 선호적으로, 포유동물은 인간이다.
따라서, 용어 "동물" 또는 "환자"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이 임의의 포유동물, 예를 들면 인간 및 임의의 가축, 가정용 또는 실험실용 동물을 포함한다. 특이적 예로는 마우스, 쥐, 돼지, 고양이, 개, 염소, 토끼, 소 그리고 원숭이를 포함한다. 그러나 선호적으로, 동물 또는 환자는 인간 피험자다.
본 발명은 접합안된 또는 네이키드 항체들 및 이의 단편들, 그리고 CCR4+ 세포, 선호적으로 CCR4+ 종양세포를 이용하여 장애들을 치료하는 방법과 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료 물질에 실효적으로 부착된 면역접합체들을 이용하는 표적화 방법 모두를 연계한다. 과학적 용어에서 특별히 다른 언급이 없거나 또는 명백하지 않을 경우, 따라서 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "항체 및 이의 단편"은 또다른 물질, 특히 치료 또는 진단 물질에 부착되지 않은 "접합안된 또는 네이키드" 항체 또는 단편을 의미한다. 이들 정의는 이 항체의 변형들, 예컨데, 이 항체 또는 이 항체와 다른 효과물질들의 복합물의 생물학적 반감기, 친화력, 열의(avidity) 또는 다른 성질들을 개선시키기 위한 변형들을 배제하지 않는다.
본 발명의 치료 방법들 및 용도는 접합안된 또는 네이키드 항체들 및 면역접합체들의 용도를 또한 포괄한다. 면역접합체-기반 치료 방법들에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 제 2 치료 물질 (항-CCR4 항체 자체가 제 1 치료 물질임)에 선호적으로 실효적으로 부착된다. 이 치료 물질은 예를 들면, 항-암 물질 또는 코르티코스테로이드 및 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAIDs)을 포함하는 항-염증성 물질이 될 수 있다.
전술한 치료 방법들 및 용도들은 약제학적으로 효과적인 조성물을 동물 또는 환자의 전신으로, 예컨데 경피, 근육내, 정맥내 주사 및 이와 유사한 것들에 의해 투여하는 것과 일반적으로 관련될 것이다. 그러나, 종양 부위 또는 부위들에 치료 물질의 국소화를 허용하는 임의의 투여 경로는 수용될 것이다. 따라서, 다른 적합한 전달 경로는 경구, 비강 또는 호흡기 및 국소를 포함한다.
"투여"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 항-CCR4 항체 치료제를 치료에 사용되도록, 예를 들면 항-종양효과를 발휘하도록 하는데 효과적인 양과 기간(들) 동안 제공 또는 전달하는 것을 의미한다. 단백질성 치료제의 수동 투여는 일반적으로 이의 단순함 및 재생성으로 인하여 부분적으로 바람직하다.
그러나, 본 명세서에서 이용된 용어 "투여"는 본 발명의 항-CCR4 항체들이 표적 위치로 전달되는 또는 다른 방법으로 전달되는 임의의 그리고 모든 수단을 지칭한다. 따라서, "투여"는 본 발명의 항-CCR4 항체를 표적 위치로 운반하는데 효과적인 방식으로 생산하는 세포의 제공을 포함한다. 이러한 구체예들에서, 이 세포들을 선택적으로 침투성인 막, 구조 또는 일반적으로 요법을 중단하기 위하여 제거시킬 수 있는 이식가능한 장치에 제형화 또는 포장하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 외생성 항-CCR4 항체가 일반적으로 바람직한데, 이는 투약량을 면멸하게 감시하고 조절할 수 있는 비-침습성 방법을 대표한다.
본 발명의 치료 방법들 및 용도는 본 발명의 항-CCR4 항체를 인코드하는 핵산을 종양에 근접하게 발현시키거나 또는 표적 위치에 이들을 국소화시키는데 효과적인 방식으로 제공하는 것까지 또한 확장된다. 임의의 유전자 요법 기술이 이용될 수 있는데, 예컨데 네이키드 DNA 운반, 재조합 유전자들 및 벡터들, 환자의 생체외 조작을 포함하는 세포-기반 운반, 및 이와 유사한 것들을 포함한다.
본 발명의 항-CCR4 항체들은 다른 치료 또는 진단 물질들을 표적 위치로 운반하는데 또한 이용될 수 있다. 이러한 구체예들에서, 다른 치료 또는 진단 물질들은 본 발명의 항-CCR4 항체들에게 일반적으로 실효적으로 부착된다.
본 발명에서 이용되는 "치료요법적으로 효과적인 양"은 표적 CCR4+ 세포들의 최소한 일부분을 특이적으로 죽이고; 표적 CCR4+ 세포들의 최소한 일부에서 특이적으로 자가사멸을 유도하고; 표적 CCR4+ 세포들의 최소한 일부에서 특이적으로 괴사를 유도하고; CCR4 리간드가 CCR4에 결합하는 것을 방해하고; CCR4 리간드에 대한 CCR4-중개된 세포성 반응들을 억제하고, 바람직하게는 CCR4 리간드에 반응하여 세포내 칼슘 이온 농도의 증가를 억제하고; 염증을 감소시키고; 및/또는 CCR4+ 종양을 가진 동물 또는 환자에게 투여시 종양 퇴행 또는 경감을 유도하는데 효과적인 본 발명의 항-CCR4 항체, 또는 이의 면역접합체들의 양이다. 한편으로 이러한 효과들은 정상의 건강한 조직의 세포들에 결합하지 않거나, 거의 결합하지 않고, 또는 이들 세포를 죽이지 않거나 거의 죽이지 않고; 그리고 동물 또는 환자의 정상의 건강한 조직에서는 무시할 수준의 또는 관리가능한 부작용을 나타내면서, 이러한 효과들이 선호적으로 획득된다.
"표적 위치"는 장애를 중재하는 또는 장애를 야기하거나 또는 장애를 악화시키게 되는 비정상적 방식으로 증식되는 CCR4+ 세포들의 위치를 의미한다. 따라서, 표적 위치는 예를 들면, 종양 또는 CCR4-중개된 염증의 위치일 수 있다. "표적 세포들"은 장애를 중재하는 또는 장애를 야기하거나 또는 장애를 악화시키게 되는 비정상적 방식으로 증식되는 CCR4+ 세포들이다. 따라서, 표적 세포들은 예를 들면 CCR4+ 종양세포들, CCR4+ Treg 세포들 및/또는 CCR4+ Th2 세포들을 포함할 수 있다.
용어 "선호적으로" 및 "특이적으로"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이 CCR4+ 세포들 예컨데 CCR4+ 종양세포들의 사멸, 자가사멸의 유도 또는 괴사의 유도와 관련하여, 또는 염증의 감소 또는 종양 퇴화 또는 경감 내용과 관련하여, 본 발명의 항-CCR4 항체 또는 이의 면역접합체들이 실질적으로 표적 위치로 제한된 CCR4+ 표적 세포 파괴, 예를 들면 종양세포 파괴 및/또는 종양괴사를 획득하고, 그리고 동물 또는 피험자의 정상적인 건강한 조직에서 파괴 및/또는 조직 괴사로 실질적으로 확장되지 않는 기능을 말한다.
본 발명의 항-CCR4 항체들 또는 치료 접합체는 하나 이상 방사능치료 물질들, 화학치료 물질들, 항-맥관생성 물질들, 자가사멸-유도 물질들, 항-투블린 약물들, 항-세포성 또는 세포독성 물질들, 사이토킨 또는 케모킨 길항제들, 사이토킨 또는 케모킨 발현의 억제제들, ATPase 억제제들, 항-염증성 물질들, 기타 항체들 (예를 들면 이중특이적 항체들과 같은) 또는 응혈제들(응고 인자들) 또는 항-염증성 물질들 예컨데 코르티코스테로이드, 선호적으로 글루코코르티코이드, 또는 비-스테로이드성 항-염증성 약물들 (NSAIDs)에 선호적으로 연결된다.
따라서, 본 발명은 항-CCR4 항체가 최소한 하나의 기타 치료 또는 진단 물질에 실효적으로 부착된 접합된 범주의 항체들 및 이의 단편들을 제공한다. 용어 "면역접합체"는 또다른 효과적인 물질과 이 항체의 실효적(operative) 연합을 특정하는데 광범위하게 이용되며, 임의의 유형의 실효적 연합만을 지칭하려는 의도는 없으며, 특히 화학 "접합(conjugation)"에 한정되지 않는다. 재조합 융합 단백질들이 특히 고려된다. 물질이 운반 또는 표적화가 표적에 결합되고, 치료 또는 진단 물질이 운반시 충분히 기능을 발휘한다면, 부착 방식은 적합한 것이 될 것이다.
항체들 상에서 탄수화물 모이어티를 통하여 물질들의 부착이 또한 고려된다. O-연결된 그리고 N-연결된 당화는 항체들에서 자연적으로 발생된다. 재조합 항체들이 변형되어 추가적인 당화 위치를 재창조하거나 또는 창조될 수 있는데 바람직한 경우, 이 항체의 1차 서열안에 적합한 아미노산 서열들 (예컨데 Asn-X-Ser, Asn-X-Thr, Ser, 또는 Thr 이때 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산임)을 조작함으로써 간단히 이루어진다. 획득된다.
본 발명의 항-CCR4 항체 또는 치료 접합체 및 관련된 방법들 그리고 용도에 사용하기 위한 현재 바람직한 물질들은 특정 유형의 장애 (예를 들면 종양 유형) 또는 환자에 대해 선택된 것들의 효과를 보완 또는 강화시키는 것들이다.
"이 항체의 효과를 보완 또는 강화시키는 치료 물질들"은 방사능치료 물질들, 화학치료 물질들, 항-맥관생성 물질들, 자가사멸-유도 물질들, 항-투블린 약물들, 항-세포성 또는 세포독성 물질들, 응혈제들, 사이토킨 또는 케모킨 길항제들, 사이토킨 또는 케모킨 발현의 억제제들, ATPase 억제제, 항-염증성 물질들 예컨데 코르티코스테로이드, 선호적으로 글루코코르티코이드, 또는 비-스테로이드성 항-염증성 약물들 (NSAIDs), 기타 항체들, (예를 들면, 이중특이적 항체들로써), 여기에서 사용에 바람직한 임의의 하나 이상 것들을 포함한다.
현재 바람직한 항-암, 특히 항-백혈병 물질들은 안트라사이클린 약물들 예컨데 다우노루비신, 독소루비신, 시타라빈, 6-티오구아닌, 미토산트론, 부술판 (Myleran®), 다사티니브 (Sprycel™), 프레드니손, 빈크리스틴 설페이트 (Oncovin®), 클로람부칠, 플루다라빈, 펜토스타틴 및 클라드리빈을 포함한다.
ATL 치료용으로 현재 바람직한 물질들은 지도부딘 (아지도티미딘) 및 CHOP 섭생을 포함한다. CHOP는 사이클로포스파미드, 히드록시다우노루비신 (아드리아마이신), 온코빈(빈크리스틴), 프레드니손/프레드니솔론을 나타낸다.
현재 바람직한 항-맥관생성 물질들은 앙지오스타틴, 엔도스타틴, 앙지오포에틴, 바스큘로스타틴, 칸스타틴 및 마스핀중 임의의 하나를 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "항-투블린 약물(들)"은 세포 유사분열에 필수적인 투블린 활성들, 선호적으로 투블린 중합화(polymerization) 또는 탈중합화(depolymerization)를 직간접적으로 선호적으로 억제함으로써 세포 유사분열을 억제하는 임의의 물질, 약물, 프로드럭 또는 이의 복합을 의미한다. 현재 바람직한 항-투블린 약물들은 콜히친, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 그리고 하나 이상의 콤브레타스타틴들을 포함한다.
현재 바람직한 NSAIDs는 COX-2 억제제들, 술폰아닐리드, 리코펠론 및 오메가-3 지방산을 포함한다.
바람직한 물질들을 본 발명의 항-CCR4 항체들에 부착 또는 연합시키면 "면역접합체들"이 제공되는데, 이러한 면역접합체들은 강화된 그리고 심지어 공조적 치료 성질들, 예를 들면 항-종양 또는 항-염증성 성질들을 흔히 가진다.
항-세포성 그리고 세포독성 물질들의 사용은 본 발명의 항-CCR4 항체 "면역독소"을 야기하고, 반면, 본 발명의 항-CCR4 항체 "응고리간드들"을 야기한다.
최소한 두 가지 치료 물질들의 사용이 또한 고려되는데, 예컨데 하나 이상 방사능치료 물질들, 화학치료 물질들, 항-맥관생성 물질들, 자가사멸-유도 물질들, 항-투블린 약물들, 항-세포성 그리고 세포독성 물질들, 사이토킨 또는 케모킨 길항제들, 사이토킨 또는 케모킨 발현의 억제제, ATPase 억제제, 항-염증성 물질들 예컨데 코르티코스테로이드, 선호적으로 글루코코르티코이드, 또는 비-스테로이드성 항-염증성 약물들 (NSAIDs), 기타 항체들, (예를 들면 이중특이적 항체들로써) 그리고 응고 인자들의 복합물의 사용이 고려된다.
특정 용도들에서, 본 발명의 항-CCR4 항체 치료들은 세포독성, 세포억제성 또는 그렇지 않다면 세포의 성장 또는 세포 분할을 약하게 하는 또는 억제하는 능력을 보유하는 항-세포성 물질들에 실효적으로 부착될 것이다. 적합한 항-세포성 물질들은 화학치료 물질들, 뿐만 아니라 세포독소 및 세포억제성 물질들을 포함한다. 세포억제성 물질들은 일반적으로 표적 세포의 자연적 세포 주기를 방해하고, 바람직하게는 세포를 세포 주기 밖으로 끌어내는 것들이다.
예시적인 화학치료 물질들은 다음을 포함한다: 호르몬, 예컨데 스테로이드; 항-대사물질들, 예컨데 시토신 아라비노시드, 플루오르우라실, 메토트렉세이트 또는 아미노프테린; 안트라사이클린; 미토마이신 C; 빈카 알카로이드; 항생제; 데메콜신; 에토포시드; 미트라마이신; 그리고 항-종양 알킬화 물질들, 예컨데 클로람부칠 또는 멜파란. 특정 바람직한 항-세포성 물질들은 DNA 합성 억제제들, 예컨데 다우노루비신, 독소루비신/아드리아마이신, 및 이와 유사한 것들이다. 전반적으로, 탁솔/파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 겜시타빈, 콤브레스타틴 및 독소루비신/아드리아마이신이 현재 바람직한 항-암 물질들이다.
V-유형 ATPase 억제제들, 예컨데 살리실리할라미드, 콘카나마이신 또는 바필로마이신이 또한 현재 바람직하고, 단백질 합성 억제제, 예컨데 심베린(psymberin), 페데린, 이리시나스타틴(irciniastatin) A 또한 바람직하다.
특정 치료 용도들에서, 독소 모이어티는 다른 잠재적 물질들과 비교하였을 때, 세포 사멸 효과를 전달하는 대부분 독소의 훨씬 뛰어난 능력으로 인하여 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명의 항-CCR4 항체 구조체들의 특정한 바람직한 항-세포 물질들은 식물-, 곰팡이- 또는 박테리아-유도된 독소들이다. 예시적인 독소들은 에피포도필로톡신; 박테리아 엔도톡신 또는 박테리아 엔도톡신의 지질 A 모이어티 ; 리보좀 비활성 단백질들, 예컨데 사포린 또는 겔로닌; a-사르신; 아스페르길린; 레스트릭토신; 리보뉴클레아제, 예컨데 태반의 리보뉴클레아제; 디프테리아 독소 및 슈도모나스 엑소톡신을 포함한다. 현재 바람직한 예로는 리친, 겔로닌, 아브리닌, 디프테리아, 슈도모나스, 백일해 독소들이다.
특정 바람직한 독소들은 A 쇄(chain) 독소, 예컨데 리친 A 쇄이다. 가장 바람직한 독소 모이어티는 흔히 "탈당화된 A 쇄" (dgA)라고 불리는 탄수화물 잔기들을 변형 또는 제거하기 위하여 처리되는 리친 A 쇄이다. 탈당화된 리친 A 쇄는 이의 극단적 능력, 더 오랜 반감기 때문에 그리고 임상적 등급 및 규모의 제작이 경제적으로 실현가능하기 때문에 바람직하다. 재조합 및/또는 절두형(truncated) 리친 A 쇄 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 항-CCR4 항체 치료제는 응고를 촉진시질 수 있는 성분, 가령, 응혈제를 포함할 수 있다. 여기에서, 표적화 항체는 응고를 직간접적으로 자극하는 인자에게 직접적으로 연결되거나 또는 간접적으로, 예를 들면, 또다른 항체를 통하여 연결될 수 있다.
이러한 용도의 바람직한 응고 인자들은 조직 인자 (TF) 및 TF 유도물질들, 예컨데 절두형 TF (tTF), 이합체, 삼합체, 다합성/다합체 TF, 및 인자 VII를 활성화시키는 능력이 결여된 돌연변이체 TF들이다. 다른 적합한 응고 인자들은 비타민 K-의존적 응혈제들, 예컨데 인자 II/IIa, 인자 VII/VIIa, 인자 IX/IXa 및 인자 X/Xa; Gla 변형이 결여된 비타민 K-의존적 응고 인자들; Russell의 독사 독 인자 X 활성물질; 혈소판-활성화 화합물들, 예컨데 트롬복산 A2 및 트롬복산 A2 합성효소; 그리고 섬유소 용해 억제제, 가령, α2-안티플라스민을 포함한다. 전반적으로, 절두형 조직 인자 (tTF)가 현재 바람직하다.
면역접합체들 및 면역독소들의 제조는 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,340,535호 참고). 다음의 각 특허들은 면역독소 생성, 정제 및 사용에 대해 현재 기술을 더 보충하기 위한 목적으로 여기에 참고자료에 편입된다: 미국 특허 제6,004,554호; 제5,855,866호; 제5,965,132호; 제5,776,427호; 제5,863,538호; 제5,660,827호 및 제6,051,230호.
다양한 화학치료제 및 기타 약리학적 물질들은 또한 본 발명의 항-CCR4 항체 치료제에 성공적으로 접합될 수 있다. 항체들에 접합된 예시적인 항신형성 물질들은 독소루비신, 다우노마이신, 메토트렉세이트 및 빈블라스틴을 포함한다. 더욱이, 다른 물질들 예컨대, 네오카르지노스타틴, 마크로마이신, 트레니몬 및 α-아마니틴의 부착에 대해 설명된 바 있다(미국 특허 제5,660,827호; 제5,855,866호; 및 제5,965,132호; 각각 참고자료에 편입됨)
응고리간드들의 제작 또한 용이하게 실행된다. 하나 이상 응고 인자들과 본 발명의 항-CCR4 항체의 실효적 연합은 직접적인 링키지일 수 있는데, 예컨데 면역독소용으로 상기에서 설명된 것들이다. 대안으로, 실효적 연합은 간접적 부착일 수 있는데, 예컨데 이 항체는 제 2 결합 영역, 선호적으로 항체 또는 이 항체의 항원 결합에 실효적으로 부착되며, 이 항체는 응고 인자에 결합된다. 이 응고 인자는 본 발명의 항-CCR4 항체의 기능적 응고 위치, 특히 공유 링키지가 분자들을 연결시키는데 이용되는 위치와는 별개의 위치에서 부착되어야만 한다.
이중특이적 또는 삼중특이적 항체들을 본 발명의 방법에 또한 이용할 수 있다. 이러한 항체들에서, 하나의 팔은 CCR4에 결합하고, 그리고 이는 본 발명의 항체다. 이중특이적 항체들을 제조하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다.
면역접합체들, 면역독소들 및 응고리간드들의 제조에서, 재조합 발현이 이용될 수 있다. 본 발명의 선택된 항-CCR4 항체, 그리고 치료 물질, 독소 또는 응혈제를 인코드하는 핵산 서열들은 발현 벡 안에서 인-프레임으로 부착된다. 따라서, 재조합 발현으로 핵산의 해독을 초래하여 원하는 면역접합체가 생산된다. 화학 교차-연결물질들 및 아비딘:바이오틴 다리를 또한 이용하여 치료 물질들을 본 발명의 항-CCR4 항체에 연결시킬 수 있다.
본 발명의 조성물들 및 방법들은 다른 치료 및 진단과 복합하여 이용될 수 있다. 생물학적 물질들의 용어, 선호적으로 진단 또는 치료 물질들의 용어에서, 본 발명에 따른 항-CCR4 항체와 "복합" 사용의 경우, 용어 "복합(in combination)"은 구체예들의 범위를 포괄하기 위하여 간단히 이용된다. "복합" 용어는 구체적으로 다른 언급이 없거나, 과학 용어로부터 분명하지 않은 경우, 결합된 조성물들, 약제, 칵테일, 키트, 방법들, 그리고 제 1 및 제 2 의학 용도 등의 다양한 포맷에 적용된다.
본 발명의 "복합된" 구체예들은 예를 들면, 본 발명의 항-CCR4는 네이키드 항체이고, 이에 실효적으로 부착되지 않은 물질 또는 치료 물질과의 복합에 이용되는 경우를 포함한다. 이러한 경우들에서, 물질 또는 치료 물질은 표적화안된 또는 표적화된 형으로 이용될 수 있다. "표적화안된 형"에서, 물질, 특히 치료 물질들은 당업계에서 이들의 표준 용도에 따라 일반적으로 이용될 것이다. "표적화된 형"에서, 이 물질은 일반적으로 이 물질 또는 치료 물질을 표적 질환 위치로 운반하는 별개의 항체 또는 표적화 영역에 실효적으로 부착될 것이다. 진단 및 치료용의 생물학적 물질들의 이러한 표적화된 형태들의 용도는 당업계에서 또한 상당히 표준화된다.
본 발명의 다른 "복합된" 구체예들에서, 본 발명의 항-CCR4 항체는 면역접합체로, 여기서 이 항체 자체가 이 물질 또는 치료 물질과 실효적으로 연합되거나 복합된다. 실효적 부착은 본 명세서에서 설명되고, 당업계에 잘 공지되어 있는 것과 같이 모든 형태들의 직접적 그리고 간접적 부착을 포함한다.
치료 물질들과 복합하여 본 발명의 항-CCR4 항체의 용어에서 특히 "복합된"의 사용은 치료 물질이 프로드럭 형태인, 복합된 조성물들, 약제, 칵테일, 키트, 방법들, 그리고 제 1 및 제 2 의학 용도를 또한 포함한다. 이러한 구체예들에서, 프로드럭을 기능을 하는 형태의 약물로 전환시킬 수 있는 활성화 성분은 다시 본 발명의 항-CCR4 항체들과 실효적으로 연합될 수 있다.
특정 바람직한 구체예들에서, 치료 조성물들, 복합물, 약제, 칵테일, 키트, 방법들, 그리고 제 1 및 제 2 의학 용도는 "프로드럭 복합물"일 것이다. 당업계 숙련자들이 인지할 수 있는 것과 같이, 용어 "프로드럭 복합물"은 다른 언급이 없는 한, 본 발명의 이 항체는 활성 약물로 전환시킬 수 있는 성분에 실효적으로 부착된 것을 의미하며, 이 항체가 프로드럭 자체에 부착된 것을 의미하는 것은 아니다. 그러나, 본 발명의 프로드럭 구체예들이 프로드럭 복합물로 사용되어야 할 필요조건은 없다. 따라서, 프로드럭들은 ADEPT 및 다른 형태들을 포함하여 당업계에서 이용되는 임의의 방식으로 이용될 수 있다.
따라서, 복합된 조성물들, 약제, 칵테일, 키트, 방법들, 그리고 제 1 및 제 2 의학 용도는 선호적으로 진단 물질들, 그리고 더욱 선호적으로 치료 물질들에 대해 설명되는데, 이 복합물은 네이키드 항체들 및 면역접합체들인 항-CCR4 항체들을 포함하며, 그리고 이때 본 발명의 생체내 구체예들의 실시는 네이키드 항체들 또는 면역접합체 및 생물학적, 진단 또는 치료 물질의 사전 투여, 동시 투여 또는 후속 투여와 연관되는데; 일부 접합된 또는 접합안된 형태에서, 이 항체의 일부 형태와 생물학적, 진단 또는 치료 물질의 일부 형태의 전반적인 제공이 이루어진다.
종양에서 본 발명의 전술한 효과 및 기타 효과의 설명은 복합된 양식의 작용, 부착된 물질(들)의 유형 및 이와 유사한 것들의 설명을 위해 간단히 제공된다. 이러한 설명적 방법은 본 발명의 항-CCR4 항체들의 유익한 성질들의 평가절하 또는 과도한 단순화로 해석되어서는 안된다. 따라서, 이러한 항체들 자체는 항-CCR4 성질들을 보유하고, 그리고 이 항체들의 면역접합체들은 이들 성질을 유지하며, 부착된 물질의 성질들과 복합될 수 있음을 이해할 것이고; 그리고 이 항체와 임의의 부착된 물질의 복합된 효과는 전형적으로 강화되거나 및/또는 확대될 것이다.
따라서, 본 발명은 임의선택적으로 최소한 제 1 조성물 또는 용기 안에 생물학적으로 효과적인 양의 최소한 본 발명의 제 1 항-CCR4 항체, 또는 이러한 항-CCR4 항체의 항원-결합 단편 또는 면역접합체; 그리고 생물학적으로 효과적인 양의 최소한 제 2 생물학적 물질, 성분 또는 시스템을 포함하는 조성물들, 약제학적 조성물들, 치료 키트 그리고 의학적 칵테일을 제공한다.
"최소한 제 2 생물학적 물질, 성분 또는 시스템"은 대개 치료 또는 진단 물질, 성분 또는 시스템일 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들면, 최소한 제 2 생물학적 물질, 성분 또는 시스템은 이 항체의 변형을 위한 성분들 및/또는 다른 물질들을 이 항체에 부착시키기 위한 성분들을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 제 2의 생물학적 물질들, 성분들 또는 시스템들은 프로드럭들 또는 프로드럭 자체를 만드는 성분들과, 이러한 프로드럭 또는 ADEPT 구체예들에서 기능을 하도록 본 발명의 항체들을 개작시키는 용도의 성분들을 포함하는, 프로드럭을 만들고 이용하는 성분들이다.
치료 또는 진단 물질들이 최소한 제 2 생물학적 물질, 성분 또는 시스템으로 포함되는 경우, 이러한 치료제 및/또는 진단제는 전형적으로 상기에서 특정한 하나 이상의 장애들의 치료 또는 진단과 연관하여 이용되는 것들이다.
따라서, 특정 구체예들에서 "최소한 제 2 치료 물질"은 치료 키트 또는 칵테일에 포함될 것이다. 용어 "최소한 제 2 치료 물질"은 제 1 치료 물질인 본 발명의 항-CCR4 항체를 참고하여 선택된다. 따라서, 본 발명의 항체들은 화학치료 물질들, 방사능치료 물질들, 사이토킨 또는 케모킨 길항제들, 사이토킨 또는 케모킨 발현의 억제제, 항-맥관생성 물질들, 자가사멸-유도 물질들 또는 항-암 면역독소들 또는 응고리간드들, 또는 코르티코스테로이드 및 NSAIDs을 포함하는 항-염증성 물질들과 복합될 수 있고, 이들중 일부 예는 본 명세서 곳곳에서 논의된다.
다른 예시적인 항-암 물질은 예를 들면, 네오마이신, 포도필로톡신(들), TNF-α, αvβ3 길항제들, 칼슘 이온투과담체(ionophores), 칼슘-유동 유도 물질들, 및 임의의 이들의 유도체 또는 프로드럭을 포함한다. 현재 바람직한 항-투블린 약물들은 콜히친, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 콤브레스타틴 또는 이의 유도체 또는 프로드럭을 포함한다.
본 발명의 조성물들, 키트 및/또는 약물에서, 치료 물질들의 복합된 효과적인 양은 단일 용기 또는 용기 매체 안에 포함될 수 있거나, 또는 별개의 용기들 또는 용기 매체 내에 포함된다. 이 칵테일은 일반적으로 복합 용도로 함께 혼합될 것이다. 정맥내 투여용으로 제형화된 물질들α이 대개 바람직할 것이다. 영상화(Imaging) 성분들이 또한 포함될 수 있다. 키트는 포함된 최소한 제 1 항체 및 하나 이상 기타 생물학적 물질들의 사용을 위한 지침을 또한 포함할 수 있다.
일반적으로 말하자면, 최소한 제 2 치료 물질은 동물 또는 환자에게 본 발명의 항-CCR4 항체와 실질적으로 동시에 투여될 수 있고; 예컨데 단일 약제학적 조성물로부터 투여되거나 또는 두 개의 약제학적 조성물들이 함께 상당히 밀접하게 투여된다.
대안으로, 최소한 제 2 치료 물질은 본 발명의 항-CCR4 항체의 투여에 순차적으로 환자 또는 동물에게 투여될 수 있다. "순차적으로"는 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 최소한 제 2 항-암 물질이 본 발명의 항-CCR4 항체 투여와 별개의 시점에 동물 또는 환자에게 투여되는, "조금씩 비껴가는(staggered)"을 의미한다. 일반적으로, 2개의 물질들은 두 물질들이 이들의 각 치료 효과를 발휘하도록 효과적으로 거리를 둔 시점에 투여되는데, 가령, 이들은 "생물학적으로 효과적인 시간 간격"을 두고 투여된다. 최소한 제 2 치료 물질은 본 발명의 항-CCR4 항체 투여 전 생물학적으로 효과적인 시기에, 또는 이러한 치료에 후속되는 생물학적으로 효과적인 시기에 동물 또는 환자에게 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음으로 구성된, 종양을 가진 동물 또는 환자를 치료하는 방법들을 제공한다:
(a) 이 동물 또는 환자에게 종양 부담(burden)을 실질적으로 감소시키는 제1 치료를 받게하고; 그리고
(b) 최소한 제 1 본 발명의 항-CCR4 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 후속적으로 투여하고; 임의선택적으로 이때 이 항체 또는 단편은 제 2 치료 물질과 실효적으로 연합된다.
바람직한 제 1 치료는 외과적 절제와 화학치료 중재를 포함한다.
다른 구체예들에서, 본 발명은 다음으로 구성된, CCR4-중개된 장애를 가진 동물 또는 환자를 치료하는 방법들을 제공한다:
(a) 이 동물 또는 환자에게 CCR4-중개된 부담 예컨데 염증을 실질적으로 감소시키는 제1 치료를 받게하고; 그리고
(b) 최소한 제 1 본 발명의 항-CCR4 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 후속적으로 투여하고; 임의선택적으로 이때 이 항체 또는 단편은 제 2 치료 물질과 실효적으로 연합된다.
특정 다른 구체예들에서, 본 발명의 이 항체들 및 면역접합체들은 하나 이상 진단 물질들, 전형적으로 상기에서 정의된 바와 같이 장애의 진단과 연관되어 이용되는 진단물질과 복합될 수 있다. 따라서, 본 발명에는 일정 범위의 진단 조성물들, 키트 및 방법들이 포함된다.
또다른 측면들은 피험자의 진단 또는 화상진찰(imaging)을 위한 방법들인데, 이 방법들은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 적합한 양의 항체 또는 기타 단백질을 피험자에게 투여하고, 그리고 피험자에게서 이 항체 또는 기타 단백질의 존재 및/또는 이의 양 및/또는 위치를 탐지하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 동물에서 CCR4 발현과 연합된 면역억제를 감소시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 동물에서 본 발명의 전술한 항체와 CCR4 사이에 복합체 형성에 효과적인 양의 이 항체, 또는 이의 면역접합체를 전술한 동물에게 투여하고, 이로 인하여 동물에서 CCR4 발현과 연합된 면역억제를 감소시키는 것을 포함한다.
상기에서 논의된 용도들 및 방법들에 따라 화상진찰 또는 진단에 적합한 질환들은 임의의 질환 및 명세서 도처에서 설명된 것과 같이, 선호적으로 임의의 암을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 동물에서 질환의 진단 또는 질환의 진행을 감시하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 전술한 동물로부터 취한 테스트 시료를 본 발명의 이 항체 또는 이의 면역접합체와 접촉시키는 단계.
추가 구체예에서, 본 발명은 동물에서 질환의 진단 또는 질환의 진행을 감시하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 전술한 동물로부터 취한 테스트 시료를 본 발명의 이 항체 또는 이의 면역접합체와 접촉시키는 단계;
(b) 테스트 시료 안에 항체-항원 복합체의 존재 및/또는 위치를 측정 또는 탐지하는 단계; 그리고, 임의선택적으로
(c) 대조군과 비교하여 테스트 시료 안에 항체-항원 복합체의 존재 및/또는 존재하는 양을 비교하는 단계.
상기 방법들에서, 전술한 접촉 단계는 항체-항원 복합체의 형성을 허용하는 조건들하에서 실시된다. 적합한 조건들은 당업계 숙련자에 의해 용이하게 특징화될 수 있다.
상기 방법들에서, 임의의 적합한 테스트 시료는 예를 들면, 질환에 영향을 받은 것으로 의심되는 생검 세포들, 조직 또는 장기들 또는 조직학적 단편이 이용될 수 있다.
상기 특정 방법들에서, 테스트 시료 안에 임의의 양의 항체-항원 복합체가 존재한다는 것은 질환이 있다는 지표일 것이다. 선호적으로, 양성 진단의 경우, 테스트 시료 안에 항체-항원 복합체의 양은 적합한 대조군 시료에서 발견되는 양보다 더 많은, 바람직하게는 상당히 더 많다. 더욱 선호적으로, 상당히 더 많은 수준은 통계학적으로 유의적인, 선호적으로는 <0.05의 가능치를 가지는 것이다. 통계학적으로 유의성을 결정하는 적합한 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고, 이들중 임의의 것이 이용될 수 있다.
질환의 진행을 감시하는 것 또한 시간을 두고 테스트 시료 안에 항체-항원 복합체의 존재 및/또는 그 양을 감시하는 것과 관련될 수 있다. 따라서, 감시는 (d) 제 1 테스트 시료 안에 항체-항원 복합체의 존재 및/또는 이의 양을 전술한 동물에서 취한 제 2 테스트 시료 안에 항체-항원 복합체의 존재 및/또는 이의 양과 비교하는 것이 관련될 수 있다. "제 1 테스트 시료"는 "제 2의 테스트 시료"를 취하기 전에 취해진 시료, 예를 들면 제 2 테스트 시료를 취하기 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일, 수주, 수개월 또는 수년에 취해진 시료다. 제 1 테스트 시료와 비교하여 제 2 테스트 시료 안에 항체-항원 복합체의 양이 감소된다는 것은 이 질환 퇴행을 나타내고, 반면 증가는 이 질환의 진행을 나타낸다.
적합한 대조군 시료는 당업계 숙련자들에 의해 용이하게 선택될 수 있는데, 예를 들면, 특정 질환의 진단 경우, 적합한 대조군은 이 질환에 걸리지 않았던 피험자의 시료일 것이다. 적합한 대조군 "값"은 당업계에 공지된 정상 피험자의 범위를 참고함으로써, 모든 테스트에서 대조군 "시료"의 운용없이 또한 용이하게 결정될 수 있다.
진단 또는 화상진찰 분야에 사용하기 위하여, 본 발명의 항체들은 탐지가능한 표지 예컨대, 방사능-불투명체 또는 방사능동위원소, 예컨데 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; 방사능활성 방출물질(예를 들면, α, β 또는 γ 방출물질); 형광 (형광단) 또는 화학발광(발색단) 화합물, 예컨데 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 효소, 예컨데 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제; 또는 영상화 물질; 또는 금속 이온; 또는 화학 모이어티 예컨대, 특이적 동질계(cognate) 탐지가능한 모이어티에 결합함으로써 탐지되는 바이오틴, 예를 들면, 라벨된 아비딘/스트렙타아비딘으로 라벨될 수 있다. 결합 단백질, 예컨데 항체 또는 항체 단편에 라벨을 부착시키는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 탐지가능한 표지들은 테스트 시료 안에 결합 단백질-항원 복합체의 존재, 존재하는 양 또는 위치의 검사를 허용한다.
생체내 사용을 위하여 바람직한 탐지가능한 표지들은 X선 탐지가능한 화합물, 예컨데 비스무트 (III), 금(III), 란탄(III) 또는 납(II); 방사능활성 이온, 예컨데 구리67, 갈륨67, 갈륨68, 인디움111, 인디움113, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 수은197, 수은203, 레늄186, 레늄188, 루비듐97, 루비듐103, 테크네튬99m 또는 이트륨90; 핵 자기 회전-공명 동위원소, 예컨데 코발트(II), 구리(II), 크롬(III), 디스프로슘(III), 에르븀(III), 가돌리늄(III), 홀뮴(III), 철(II), 철(III), 망간(II), 네오디뮴(III), 니켈(II), 사마륨(III), 테르븀(III), 바나듐(II) 또는 이테르븀(III); 또는 로다민 또는 플루오레신을 포함한다.
본 발명은 또한 탐지가능한 신호를 생성하는 라벨에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 본 발명의 항체들을 포함하는 진단 또는 화상 진찰 물질들을 포함한다. 적합한 라벨들은 명세서 도처에서 설명된다.
본 발명은 하나 이상의 이 항체들, 면역접합체들 또는 본 발명의 조성물들 또는 본 발명의 항체들을 인코드하는 하나 이상의 핵산 분자들, 또는 본 발명의 핵산 서열들을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터들, 또는 본 발명의 재조합 발견 벡터들 또는 핵산 서열들을 포함하는 하나 이상 숙주 세포들 또는 바이러스들을 포함하는 키트를 더 포함한다. 선호적으로 전술한 키트는 본 명세서에서 설명된 것과 같은 방법들 및 용도들에서 사용되는데, 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 것과 같은 치료, 진단 또는 화상진찰 방법들, 또는 본 명세서에서 설명된 것과 같은 시험관에서 분석 또는 방법들에 사용된다. 이러한 키트에서 항체는 명세서 도처에서 설명된 것과 같이, 항체 접합체가 바람직할 수 있는데, 예를 들면, 탐지가능한 모이어티에 접합되거나 또는 면역접합체일 수 있다. 선호적으로 전술한 키트는 예를 들면, 진단에서 키트 성분들의 용도에 대한 지침을 포함한다. 선호적으로 전술한 키트는 명세서 도처에서 설명된 것과 같이 질환들의 진단 또는 치료용이며, 그리고 임의선택적으로 이러한 질환들의 진단 또는 치료를 위하여 키트 성분들의 용도에 대한 지침을 포함한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 본 발명의 항체들은 시험관에서 또는 생체내 용도 및 분석용 분자 도구로 또한 이용될 수 있다. 이 항체들은 항원 결합 위치를 보유하기 때문에, 이들은 특이적 결합 쌍의 구성원으로 기능할 수 있고, 이들 분자는 특정 결합 쌍 구성원을 요구하는 임의의 분석에 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 측면들은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 본 발명의 이 항체를 포함하는 시약을 제공하고, 그리고 예를 들면 시험관에서 또는 생체내 분석에서 분자 도구로 이러한 항체들의 용도를 제공한다.
암 치료는 다음에 의해 또한 실시될 수 있다:
(a) 종양을 가진 동물 또는 환자에게 본 발명의 항-CCR4 항체에 실료적으로 부착된 진단 물질을 포함하는 최소한 제 1의 탐지가능한-라벨된 본 발명의 항-CCR4 항체의 진단용 양을 투여하고, 이로 인하여 종양의 탐지가능한 영상을 만듦으로써, 종양의 영상을 만들고; 그리고
(b) 후속적으로 동일한 동물 또는 환자에게 최소한 본 발명의 제 1의 네이키드 항-CCR4 항체 또는 이러한 항체를 이용한 치료 물질-항체 구조체의 치료요법적으로 최적화된 양을 투여하고, 이로 인하여 항-종양 효과를 야기시킨다.
서열 번호: 16과 18은 동일하고, 따라서, 본 명세서에서 공개된 임의의 구체예들에서, 서열 번호:16의 언급은 서열 번호: 18의 언급을 포함하는 것으로 이해해야 하고, 그 역도 해당된다.
본 발명은 지금부터 다음에서 설명되는 표와 도면을 참고하여 다음의 비-제한적 실시예에들에서 더욱 상세하게 설명될 것이다:
표 1은 항체 208와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 2는 항체 306과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 3은 항체 308과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 4는 항체 406과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 5는 항체 501과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 6은 항체 503과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 7은 항체 601과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 8은 항체 603과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 9는 항체 803과 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다.
표 10은 항체 208의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 11은 항체 306의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 12는 항체 308의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 13은 항체 406의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 14는 항체 501의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 15는 항체 503의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 16은 항체 601의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 17은 항체 603의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 18은 항체 803의 IgG 형태와 관련하여 본 명세서에서 공개된 일부 서열들을 나열한다. 가변 영역들은 밑줄로 표시된다.
표 19는 TARC-중개된 Ca-유동 억제로부터 유도된 계산치 IC50 값을 보여준다.
표 20은 라벨된 리간드들을 이용하여 항-CCR4 IgGs의 리간드-간섭 결합 실험으로부터 결정된 IC50 값을 보여준다(실시예 3). KW0761에 대해 측정된 값은 없었다. 피트의 질(quality of the fits)은 최소-자승(R2) 값으로 판단된다.
표 21은 리간드 중개된 Ca-유동 실험(실시예 5)에서 항-CCR4 항체들의 길항 성질들의 개요다. TARC-유도된 Ca-유동의 경우, IC50 값을 결정하였고, 피트의 질(quality of the fits)은 최소-자승( R 2 ) 값으로 판단된다. MDC-유도된 신호생성에서 억제 효과는 항-CCR4 항체들 10μg/ml에서 최대 억제로 나타내며, %로 표시된다. KW0761에 대해 측정된 값은 없었다.
표 22는 항-CCR4 항체들에 의해 리간드-유도된 이동(TARC 및 MDC)의 억제로부터 측정된 IC50 값과 유지되는 이동 %의 개요다. IC 50 값은 실시예 6에서 설명된 것과 같이 리간드들의 존재하에서 적정 곡선으로부터 유도된다. 피트의 질(quality of the fits)은 최소-자승( R 2 ) 값으로 판단된다. MDC의 억제의 경우, IgG 10 μg/ml 농도에서 최대 억제로 나타낸다.
표 23은 786-O 세포들 상에서 항-CCR4 항체 503에 의한 TARC-유도된 침투 억제로부터 측정된 IC50 값의 개요다. IC 50 값은 실시예 6에서 설명된 것과 같이 TARC(25nM 및 125nM)의 존재하에서 적정 곡선으로부터 유도된다. 피트의 질(quality of the fits)은 최소-자승(R2) 값으로 판단된다.
표 24는 실시예 9에서 설명된 것과 같이, 혈액학적 종양 세포계 CCRF-CEM 및 L-428에서 ADCC 실험으로부터 측정된 EC50 값의 개요다. 측정된 EC50 값은 GraphPad (Prism)을 이용하여 "log (항진물질) vs . 반응 모델"에 데이터를 피팅함으로써 유도되었다. 주어진 농도에서 최대 세포독성 값이 제공된다.
표 25는 신장 세포 암 종양 마이크로어래이(TMA)와 관련 대조군 조직 (태반 및 정상 신장)에 대한 IHC 실험의 득점표다. 하나의 TMA에 착색된 전체 코어수로부터 착색 양성 코어 수를 얻는다. 손상된 코어는 점수 기록을 하지 않기 때문에 각 착색에서 착색된 코어의 수는 상이하다. 0은 착색이 없음을 나타내고, 1은 중간정도의 착색을 나타내며, 그리고 2는 강한 착색을 나타낸다.
도 1. 실시예 2의 결과: CCR4를 발현시키는 표적 세포들에 항-CCR4 scFvs의 결합. ScFvs는 이합체 상태를 모방하기 위하여 항-Myc 항체(마우스)를 이용하여 교차-연결시키고, 그리고 10 μg/ml에서 시작하여 3배 희석시켰다. RPE-접합된 항-마우스 IgG를 이용하여 결합된 scFvs를 탐지하였다. a.) CCR4-양성 DT40 세포들에 결합. b.) CCR4-음성 DT40 세포들에 결합.
도 2. 실시예 2의 결과: CCR4-음성 Hek293T 세포들과 비교하여 CCR4를 발현시키는 Hek293T 세포들에 항- CCR4 scFvs 의 결합. ScFv는 이합체 상태를 모방하기 위하여 항-Myc 항체(마우스)를 이용하여 교차-연결시키고, 그리고 10 μg/ml에서 시작하여 3배 희석시켰다. RPE-접합된 항-마우스 IgG를 이용하여 결합된 scFvs를 탐지하였다.
도 3. 실시예 2의 결과: CCR4를 발현시키는 천연 표적 세포 (CCRF-CEM) 세포들에 항-CCR4 scFvs의 결합. ScFvs는 이합체 상태를 모방하기 위하여 항-Myc 항체(마우스)를 이용하여 교차-연결시키고, 그리고 20 μg/ml에서 시작하여 3배 희석시켰다. RPE-접합된 항-마우스 IgG를 이용하여 결합된 scFvs를 탐지하였다.
도 4. 실시예 3의 결과: Alexa647 - 라벨된 MDC - SNAP 를 이용한 항- CCR4 scFvs 의 리간드 -간섭 결합 실험. ScFvs는 5 μg/ml (150 nM)의 농도에서 항온처리하였고, 고정된 농도의 MDC-SNAP (50 nM) 존재하에서 12개 희석 점들에 걸쳐 3배 희석하였다.
도 5. 실시예 3의 결과: TARC 및 MDC 존재하에서 항-CCR4 scFvs의 리간드-간섭 결합 실험. ScFvs는 고정된 농도의 리간드들(1 μg/ml) 존재하에 2.5 μg/ml 마우스 항-Myc-항체 (마우스) 존재하에 0.5 μg/ml의 농도에서 항온처리하였고, 항-마우스-RPE 접합된 항체를 이용하여 착색하였다. 실시예 1에서 설명된 것과 같이 ScFvs (후보 601은 제공되지 않음). 항체-대조군 (배경)으로만 착색된 세포들 뿐만 아니라 착색안된 세포들(미착색된)과 비교하였다.
도 6. 실시예 4의 결과: 바이오티닐화된 KW0761-IgG 존재하에서 항-CCR4 항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 60, 803 및 KM3060var 사이에 경쟁 실험. 바이오티닐화된 KW0761-IgG는 PE-접합된 스트렙타아비딘을 이용하여 탐지되었다.
도 7. 실시예 5의 결과: KM3060var과 비교하여 항-CCR4 scFv 항체들에 의한 TARC-중개된 Ca-유동의 억제. TARC는 0.5 μg/ml에서 시작하여 6개의 희석 점에 걸쳐 scFv-농도를 증가시키면서 최종 농도 28.6 ng/μl (3.6nM)에서 항온처리하였다. 신호는 %로 나타내며, 여기서 100% 신호생성은 TARC-리간드가 존재하지만, scFv 항체는 없을 때 기록된 신호를 말한다.
도 8. 실시예 5의 결과: 항-CCR4 scFv 항체들에 의한 MDC-중개된 Ca-유동의 억제. MDC는 고정된 농도 10μg/ml의 scFv 존재하에서 5ng/μl (6.25nM)의 최종 농도에서 항온처리하였다. 신호는 %로 나타내며, 여기서 100% 신호생성은 MDC-리간드가 존재하지만, scFv 항체는 없을 때 기록된 신호를 말한다.
도 9. 실시예 6의 결과. 증가되는 농도의 항-CCR4 scFv 항체들 (0.36 내지 333 nM) 존재하에서 CCR4+ CCRF-CEM 세포들상에서 TARC-중개된 화학주성의 억제. TARC는 3.5nM의 고정된 농도를 가졌다. 신호는 %로 나타내며, 여기서 100% 신호생성은 TARC-리간드가 존재하지만, scFv 항체는 없을 때 세포의 이동을 지칭한다. 그래프들을 피팅하였다.
도 10. 실시예 2의 결과, 표적 세포들 발현시키는 CCR4를 발현시키는 표적 세포들에 항-CCR4 IgGs의 결합. IgGs는 정해진 농도에서 항온처리되었고, 결합된 IgGs는 RPE-접합된 항-인간IgG를 이용하여 탐지되었다. a.) CCR4-양성 CCRF-CEM 세포들에 결합. IgGs는 1 μg/ml에서 시작하여 8개 점에 걸쳐 4배 희석되었다. b.) CCR4-양성 Hut78 세포들에 결합. IgGs는 1 μg/ml에서 시작하여 8개 점에 걸쳐 4배 희석되었다. c.) CCR4-양성 L-428 세포들에 결합. IgGs는 10 μg/ml에서 시작하여 8개 점에 걸쳐 3배 희석되었다.
도 11. 실시예 2의 결과, 인간 혈청 존재하에서 CCR4를 발현시키는 표적 세포들 (CCRF-CEM)에 결합. 바이오티닐화된 시료들은 0% 인간 혈청(FACS-완충제) 또는 10 및 50% 인간 혈청내에서 10μg/ml 농도에서 항온처리되었다. 시료들은 PE-접합된-스트렙타아비딘을 통하여 탐지되었다. a.) 기록된 결합 신호들의 비교. b.) 남아있는 결합 신호들을 %로 전환.
도 12. 실시예 3의 결과, 라벨된 리간드들을 이용하여 항-CCR4 IgGs의 리간드-간섭 결합 실험들. a.) IgGs는 5 μg/ml (35 nM)의 농도에서 항온처리되었고, 그리고 고정된 농도의 Alexa647 라벨된 MDC-SNAP (50 nM) 존재하에서 8개 희석점에 걸쳐 4배 희석되었다. b.) IgGs는 2.5 μg/ml (17.5 nM)의 농도에서 항온처리되었고, 그리고 고정된 농도의 바이오티닐화된 TARC (3.12 μM) 존재하에서 8개 희석점에 걸쳐 4배 희석되었다. 남아있는 결합된 바이오티닐화된 TARC는 PE-접합된 스트렙타아비딘을 이용하여 탐지되었다.
도 13. 실시예 6의 결과: 786-O 세포들의 CCL17/TARC-중개된 침입의 억제. 세포들은 농도(μg/ml)를 증가시킨 항-CCR4 항체 503 존재 하에서 상이한 두 가지 농도의 CCL17/TARC (25 및 125 nM)에서 항온처리되었다. 이동된 세포들은 실시예 6에서 개략적으로 설명된 것과 같이 착색되고, 분석되며, %로 전환하였다. 점선 (y = 25%)은 분석하는 동안 786-O 세포들의 기초 침입 능력을 나타낸다.
도 14. 실시예 9의 결과: CCR4를 발현시키는 세포계 CCRF-CEM (a) 및 L-428 (b)에서 ADCC의 유도. 칼세인(Calcein)-라벨된 표적 세포들은 인간 PBMCs 존재하에서 실시예 1에서 설명된 것과 같이 상이한 농도의 항-CCR4 항체들에서 항온처리되었다. KW0761은 대조군으로 포함되었다. TritonX-100으로 처리한 후 100% 세포 용해된 시료의 형광 강도에 근거하여 %로 전환되었다. 약량-반응 곡선은 비-선형 회귀 분석으로 계산되었다.
도 15. 실시예 9의 결과: CCR4 를 발현시키는 단리된 T reg -세포들에서 ADCC 의 유도. Treg 세포들은 실시예 9에서 설명된 바와 같이 단리되었고, 칼세인-라벨되고, 그리고 자가 PBMCs 존재하에서 단일 농도의 항-CCR4 항체들과 함꼐 4.5 μg/ml에서 항온처리되었다. 세포독성은 Triton 존재하에서 세포들로부터 최대 칼세인 방출에 대해 표준화시켜 %로 전환시켰다. 치사 비율을 나타낸다.
도 16. 실시예 10의 결과: 성인 T-세포 림프종 백혈병 (ATLL)의 인간 이종이식편 모델에서 항-CCR4 항체들의 생체내 효과. 종양 이식(TI) 후 연구 동안 상이한 집단들의 측정된 체중을 나타낸다. 집단 A (대조군)는 큰 종양 용적으로 인하여 23일 후 희생되었다. a.) 치료 기간에 걸쳐 평균 체중(g). b.) 치료 기간에 걸쳐 상대적 체중(%).
도 17. 실시예 10의 결과: 성인 T-세포 림프종 백혈병 (ATLL)의 인간 이종이식편 모델에서 항-CCR4 항체들의 생체내 효과. 종양 이식(TI) 후 연구 동안 상이한 집단들(a-e)의 측정된 종양 체적의 비교. 개별 종양 용적(㎣)을 종양 이식(TI) 후 시간에 대해 플롯한다. 대조군(집단 A)은 큰 종양 용적으로 인하여 23일에 희생되었다.
도 18. 실시예 10의 결과: 성인 T-세포 림프종 백혈병 (ATLL)의 인간 이종이식편 모델에서 항-CCR4 항체들의 생체내 효과. a.) 상이한 실험 집단 간에 종양 평균 값. 각 집단내 살아있는 동물의 수를 나타낸다. b.) 개별적으로 처리된 집단(항체) 대(vs) 처리안된 집단(대조군)을 비교하여 계산된 생존 비율. 항-CCR4 항체 306 및 503에 대해 통계학적 유의성 값이 확인되었다. c.) 23일차에 계산된 종양 배가 시기. 항-CCR4 항체 503에 대해 통계학적 유의적 차이가 확인되었다(*로 표시됨).
도 19. 실시예 12의 결과: 신장 세포 암 (RCC) 환자들로부터 종양 마이크로어레이에 항- CCR4 항체 503의 결합. IgG 503의 결합은 파라핀-내장된 조직 단편들에서 평가되었다. 항체를 3μg/ml 농도에서 항온처리하였고, 염소 바이오틴-접합된 항-인간 항체(1:500)와 항온처리시 가시화되었으며, 기질로 3,3 디아미노벤지딘을 이용하는 벡타스타인 엘리트 ABC 키트를 이용하여 가시화되었다. 현미경 확대는 x-배로 제공된다. 착색은 비장(a.)으로부터 양성 대조군 조직에서 최적화되며, 그리고 정상적인 인간 태반 조직(b.)에서 특이성에 대해 확인되었다. RCC 환자들의 조직에 결합은 c.) 및 d.)에 제공된다.
실시예들
비교에 의한 정보
상기에서 논의된 바와 같이, 공지의 항-CCR4 항체 패밀리는 KM2160, KM3060, KM2760 및 KW-0761을 포함하고, 인간 CCR4의 N-말단 아미노산으로부터 위치 2-29 영역에 존재하는 영역에 에피토프를 인지한다(EP1270595).
본 명세서에서 보고된 일부 실험들에서, 본 발명자들은 상이한 숙주에서 발현되기 때문에 KM3060에 대응하지만, 잠재적으로 상이한 슈가를 보유하는 KM3060var (본 명세서에서 "KM3060v"으로 또한 지칭됨)를 이용하였다. 이 항체를 scFv 포맷에 이용하였다.
본 명세서에서 보고된 일부 실험들에서, 본 발명자들은 IgG 포맷에 KW0761을 이용하였다.
KM2760은 CCR4와 TARC 또는 MDC 사이의 상호작용을 차단하지 않은 것으로 보고되었다(Ishida et al. 2006, Cancer Research 66 (11), pp 5716-5722). KM3060var을 이용한 출원인의 발견은 이 보고서와 일관된다.
KM2760 또한 CCR4 신호생성을 억제하지 않는 것으로 보고되었다. KM3060var가 MDC 또는 TARC-유도된 칼슘 유동을 억제하지 않음을 출원인은 발견하였다. 출원인은 또한 KM3060var에 의한 MDC 또는 TARC-중개된 화학주성의 유의적인 억제가 없다는 것도 발견하였다.
실시예 1: 신규한 항체들
CCR4에 특이적으로 결합할 수 있는 9가지 인간 항체들이 확인되었다. 이 항체들의 단일 쇄 형태들은 c-myc 및 6xHis 테그(tag) 에피토프들을 보유하는 pHOG21 플라스미드에 클론되었다. TG1 박테리아를 형질변환시키고, 그리고 IPTG 유도시 scFv가 발현되었다. 정제된 scFv의 결합은 EasyCyte로 확인되었다(실시예 2 참고).
항체 생산 클론의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 서열들을 서열화하였다. 이 항체들은 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803으로 명명한다. 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 경쇄 및 중쇄들의 그중에서도 특히 CDR 영역들의 서열은 각각 표 1 내지 9에 나타낸다.
항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 IgG 형을 또한 만들었다. 표준 프로토콜을 이용하여 IgGs를 만들었다. 간략하게 설명하자면, 대응하는 가변 도메인들을 인코드하는 유전자들을 인간 불변 도메인들에 대한 유전자들을 포함하는 포유동물 발현 벡터 pLNO 안으로 클론시켰다(Norderhaug et al, 1997). 이 항체들은 세포 공장에서 발현되었고, 단백질 A 컬럼 상에서 제 1 수확물을 정제시키고, 크기 압출 크로마토그래피에 의해 단량체로 분류하였다. IgGs는 CCR4에 특이적으로 결합하는 이들의 능력을 유지하였다.
이들 항체의 IgG 형은 IgG1 아이소타입(isotype)이며, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함한다. 각 중쇄는 VH 도메인 (관련 표들에 나타낸 서열들), 그리고 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다. 각 경쇄는 VL 도메인 (관련 표들에 나타낸 서열들), 그리고 인간 람다경쇄 불변 영역을 포함한다. 실시예 7에서 설명된 것과 같이, IgG 항체들의 탈푸코실화된 형태를 만들었다. 본 발명의 항체들의 IgG 형을 이용하는 본 명세서에서 설명된 임의의 분석은 탈푸코실화된 형을 이용한다.
실시예 2: 표적 발현시키는 세포들에 항-CCR4 항체들의 결합
실시예 1에 설명된 이 항체들의 CCR4-특이성을 설명하기 위하여, 집단내( in-house) CCR4 형질감염된 및 형질감염안된 HEK293T-세포들, DT40-세포들 그리고 천연 CCR4+ CCRF-CEM 세포계는 scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803로 착색시키기 위한 유동 세포측정기에 이용되었다. 양성 대조군으로, 집단내 클론되고, 발현된 KM3060var scFv가 이용되었다. 항-GFPscFv-항체(녹색 형광 단백질에 대항하여 생성된)는 음성 대조군으로 이용되었다.
CCRF-CEM (급성 림프아구성 백혈병, ATCC 번호 CCL-119), HEK293T/17 (인간 신장, ATCC 번호 CRL-11268), 및 DT40 (닭 림프종, ATCC 번호 CRL-2111) 세포계는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)으로부터 구하였다.
인간 CCR4로 일시적 형질감염을 위하여, Hek293T/17 세포들을 T75(NUNC) 플라스크에 2 x 106 세포로 접종시켰다. 접종 후 48h 시점에, 이 세포들은 형질감염 물질로 Fugene(ROCHE)을 이용하여 인간 CCR4를 인코드하는 pcDNA3.1 플라스미도로 형질감염되었다. T75에 40μl Fugene와 16μg DNA가 이용되었다. 형질감염후 48시간 시점에 분석을 위하여 이 세포들이 이용되었다.
CCRF-CEM 및 DT40 세포들은 RPMI-1640 배양 배지에 유지시켰고, HEK293T 세포들은 Dulbecco's 변형된 이글 배지(Modified Eagle Medium (DMEM) 배양 배지에 유지시켰다. 모든 세포들은 태아 송아지 혈청과 함께 유지되었고, 이 농도는 DT40 및 HEK293T 세포들의 경우 10%이었고, 그리고 CCRF-CEM 세포들의 경우 20% 이었다. 모든 배지에는 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충되었다.
유동 세포분석법 실험의 경우, 이 세포들을 배양 플라스크로부터 회수하고, PBS로 2회 세척하였고, 0.2% BSA와 0.09% NaN3와 함께 PBS에 재현탁시키고, 끝으로 V-자 모양의 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)의 각 웰에 1x105 세포로 할당하였다. 세포들은 5분간 400 × g에서 원심분리시켰고, 그 다음 상이한 scFv 희석물로 60분간 4℃에서 항온처리하였다.
모든 scFv 조제물은 마우스 항-myc-항체 (9E10.2, Diatec, Oslo, Norway)으로 사전-항온처리하여 세포들에게 추가하기 전에 scFvs를 교차 연결시키고, 그리고 10μg/ml 농도에서 시작하여 3배 희석시켰다.
0.2% BSA 및 0.09% NaN3와 함께 PBS로 세척한 후, 세포들을 1μg/ml의 RPE-접합된 염소 항-마우스 IgG (AbD Serotec, Duesseldorf, Germany)로 4℃에서 30분간 착색시켰다. 착색된 세포들을 세척하였고, 0.2% BSA 및 0.09% NaN3와 함께 200ul PBS에서 재현탁시키고, 그리고 EasyCyte 유동세포 분석기(Guava Technologies, Hayward, CA, USA) 상에서 획득하기 위하여 U-자형 96-웰 플레이트(Corning, Schiphol-Rijk, The Netherlands)에 옮긴다.
수득된 결과들은 scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803이 CCR4에 특이적이라는 것을 분명히 나타낸다. CCR4-음성 DT40 세포들과 비교하여, CCR4-양성 DT40 세포들에 대한 scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 결합은 도 1에서 설명된다. CCR-HEK293T 세포들과 비교하여, CCR4+ HEK293T 세포들에 대한 scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 선택적 결합을 또한 보여주었다(도 2; 항체 208에 대한 데이터만 나타냄). CCR4를 발현시키는 CCRF-CEM 세포들에 대한 scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 결합은 도 3에 설명된다.
HEK293T/17 세포들 및 인간 CCR4를 발현시키기 위하여 형질변환된 HEK293T/17 세포들에 대한 결합과 비교하여, 탈푸코실화된 IgG1 포맷(실시예 7 참고)에서 항체들 306, 406 및 503들에 대해 CCR4 특이성이 또한 확인되었다. 유동 세포분석법을 이용하여 CCR4-양성 세포계 CCRF-CEM, L-428, Hut78, 786-O, A498, KatoIII 및 MCF-7에 결합에 대해 이들 항체들을 또한 테스트하였다.
양성 대조군으로써, 항-CCR4 항체 1G1 (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA.), 항-CCR4 항체 Ab1669(Abcam, Cambridge, UK) 뿐만 아니라 자체 생산된(in house) KW0761 IgG(상기 참고)를 이용하였다. 아편 약물 헤로인과 항-GFP-항체(녹색 형광 단백질에 대항하여 생성된)에 결합하는 아이소타입 대조군 항체들 6-MAM을 음성 대조군으로 이용하였다. 두 항체들 모두 IgG1-분자들로 자체적으로 만들었다.
인간 혈청 존재 하에서 표적 발현 세포들에 결합을 설명하기 위하여, 항-CCR4 항체들 306, 406, 503 및 KW0761은 EZ-링크 말레이미드-PEG 고형상 바이오티닐화 키트 (Thermo Fisher, Rockford, IL USA)의 매뉴얼에 따라 시스테인을 통하여 바이오티닐화되었다.
CCR4-양성 세포계 CCRF-CEM, Hut78 (피부의 T-세포 림프종, ATCC 번호 TIB-161), 786-O (인간 신장 세포 암종, ATCC 번호 CRL-1932), MCF-7 (인간 유방 선암, ATCC 번호 HTB-22), KatoIII (인간 위 암, ATCC 번호 HTB-103) 그리고 HEK293T/17 세포계들은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구하였다. L-428 세포들 (비-호지킨 림프종, DSMZ 번호 ACC 197) 및 A-498 (인간 신장 세포 암종, DSMZ 번호 ACC 55)은 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ, Braunschweig, Germany)로부터 구하였다. CCRF-CEM, L-428, Hut78, 786-O 및 KatoIII 세포들은 RPMI-1640 배양 배지에 유지시켰다. HEK293T/17 및 MCF-7세포들은 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM; PAA, cat#E15-810)) 배양 배지에 유지시켰다. A-498 세포들은 EMEM-배지에서 배양되었다. 모든 세포들은 10%의 태아 송아지 혈청(PAA cat#A15-252)과 함께 유지되었지만, 단 CCRF-CEM, L-428, Hut78 및 KatoIII는 20%의 태아 송아지 혈청에 유지되었다. 모든 배지에는 페니실린 및 스트렙토마이신(PAA cat#P11-010)이 보충되었다.
유동 세포분석법 실험의 경우, 현탁 세포계 CCRF-CEM, Hut78 및 L-428은 배양 플라스크들로부터 바로 회수하였다. 흡착 세포계 Hek293T/17, 786-O, A-498, KatoIII 및 MCF-7은 PBS로 2회 세척하였고, 제조업자의 프로토콜에 따라 실온에서 3분 동안 Accutase (PAA laboratories, Linz, Austria)와 함께 항온처리함으로써 배양 플라스크로부터 떼어내었다. 모든 세포들은 0.2% BSA 및 0.09% NaN3와 함께 PBS에 재-현탁시켰고, 그리고 최종적으로 V-자형 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)의 웰에 1x105 세포로 할당하였다. 세포들을 400 × g에서 5분간 원심분리시켰고, 그 다음 상이한 IgG 희석물과 함께 4℃에서 60분간 항온처리하였다. 인간 혈청 존재하에 결합을 위하여, CCRF-CEM 세포들은 10% 또는 50%의 인간 혈청 (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)에서 상이한 IgG-용액과 함께 37℃에서 60분간 항온처리되었다.
0.2% BSA 및 0.09% NaN3와 함께 PBS로 세척 후, 세포들은 1μg/ml의 RPE-접합된 염소 항-인간 IgG(AbD Serotec, Duesseldorf, Germany)와 함께 4℃에서 30분 동안 착색되었다. 착색된 세포들을 세척하였고, 0.2% BSA 및 0.09% NaN3와 함께 200 μl의 PBS에 재현탁시켰고, 그리고 EasyCyte(Guava Technologies, Hayward, CA, USA)에서 획득을 위하여 U-자형 96-웰 플레이트(Corning, Schiphol-Rijk, The Netherlands)로 이동시켰다.
수득된 결과로부터 IgG 항체들 306, 406 및 503은 CCR4에 특이적이라는 것이 분명하게 확인되었다. CCR4-양성 Hek293T/17 세포들에 IgGs 306, 406 및 503의 결합은 CCR4-음성 Hek293T/17 세포들에 대한 결합보다 상당히 더 높았다. 대조군 항체 1G1 또한 CCR4-양성 Hek293T/17 세포들에 결합되었지만, 더 약한 신호를 제공하였다.
혈액학적 CCR4를 발현시키는 L428 세포들 및 Hut78 세포들, 뿐만 아니라 CCRF-CEM 세포들에 대해 IgG 항체들 306, 406 및 503의 결합은 도 10에 설명된다. 786-O, A498, KatoIII 및 MCF-7에 306, 406 및 503의 결합 또한 확인되었지만, 반면 음성 대조군 항체들은 이들 세포계에 결합되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
확실하게, 세포계 CCRF-CEM와 관련하여 도 11에서 설명되는 것과 같이 농도가 증가되는 인간 혈청 존재하에서 CCR4-양성 세포들에 항-CCR4 세포들의 결합이 억제되지 않는다.
도 11은 또한 항체들 306, 406 및 503의 결합이 항체 KW0761의 결합보다 우위에 있다는 것을 보여준다. 세포계 KatoIII, MCF-7 및 A498에 대한 결합을 분석하였을 때 유사한 관찰을 하였다(데이터는 나타내지 않음).
상이한 CCR4+ 세포계에 항-CCR4-항체들 306, 406 및 503의 결합 프로파일은 다른 CCR4+ 세포계와 비교하였을 때 일부 CCR4+ 세포계에 대해 증가된 결합을 보인다. 예를 들면, L-428에 결합은 CCRF-CEM와 비교하여 감소된다. L-428은 CCR4-리간드 TARC (Ishida T et al, Leukemia Vol 20, 2006 참고)를 분비하는 것으로 알려져 있고, 항-CCR4 항체들 306, 406 및 503은 CCR4-결합 위치에 대해 TARC와 경쟁한다(실시예 3 참고).
항-CCR4-항체들 306, 406 및 503의 결합 프로파일은 KW0761의 것과는 상이하다. 예를 들면, KW0761은 L-428에 대해 증가된 결합을 보인다. 이론에 결부되지 않고, 이는 이들 항체의 상이한 에피토프 결합 위치들 때문인 것으로 보인다(실시예 4에서 개요가 제시된 바와 같이). KW0761은 CCR4 및 TARC의 결합을 차단하지 않고, 따라서 L-428에 의해 분비되는 TARC와 경쟁하지 않는다.
추가로, EC50 값은 세포계마다 다양한 값으로 측정되었고(데이터는 나타내지 않음), 이는 다양한 세포 유형들의 표면에서 CCR4 발현 차이인 것으로 보인다.
실시예 3: 리간드 결합과 항-CCR4 항체들 간섭
실시예 1의 항-CCR4 항체들이 CCR4 리간드들이 이의 수용체에 결합하는 것을 간섭하는 지를 결정하기 위하여, 경쟁 실험을 실시하였다. 이를 위하여, CCR4-양성 CCRF-CEM 표적 세포들은 증가되는 농도의 scFvs 존재하에서 고정된 농도의 MDC-SNAP에서 항온처리되었다. MDC는 SNAP-tag의 N-말단에 유전적으로 융합되어, SNAP tag는 MDC의 C-말단에 융합된다. SNAP-tag는 20 kDa DNA 복구 단백질 O6-알킬구아닌-DNA 알킬트란스퍼라제로부터 유도된다. 이 유전자는 Geneart (Regensburg, Germany)에서 주문하였고, 그리고 HEK293/T 세포들은 MDC-SNAP-융합 단백질을 인코드하는 유전자로 일시적으로 형질감염되었다. 5-6 일 후, 융합-단백질은 Ni-NTA-친화력 컬럼을 통하여 정제되었고, 이어서 크기 압출시켜, 단량체 MDC-SNAP 분획을 단리시켰다. Alexa Fluor 647 Molecular Probe 라벨링 키트(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)의 매뉴얼의 과정에 따라 MDC-SNAP에 Alexa647로 라벨이 붙여졌다. MDC-SNAP가 CCR4에 결합하는 기능은 CCRF-CEM 세포들에서 화학주성 분석으로 확인되었다(데이터는 나타내지 않음).
CCR4+ CCRF-CEM-세포들을 배양 플라스크로부터 수확하였고, RPMI-1640 배양 배지로 2회 세척한 후, V-자형 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)의 웰에 1×105 세포들을 할당하였다. 500×g에서 세포들을 5분간 원심분리하였고, 상청액은 흡출시켰다. ScFvs 208, 306, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 (시료 308은 포함되지 않았다)은 5μg/ml (150nM)에서 시작하여 8개 희석 점에 걸쳐 3-배 희석되었고, 0.2 % BSA 및 0.09% NaN3을 포함하는 PBS 내에서 140 ng/ml의 고정 농도의 MDC-SNAP (50 nM) 존재하에서 4℃에서 60분간 항온처리되었다. 0.2 % BSA 및 0.09% NaN3를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 이 세포들은 0.2% BSA 및 0.09% NaN3와 함께 200 μl PBS에 재현탁시켰고, U-자형 96-웰 플레이트(Corning, Schiphol-Rijk, The Netherlands)로 옮겨 FACS Canto II 유동 세포분석기(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용한 유동 세포분석법으로 Alexa647 라벨된 MDC-SNAP 융합 단백질의 신호를 기록하였다. 그 결과에서 scFv 농도가 증가될 때 착색 신호는 명백히 감소됨을 보여주었다(도 4). 이는 이 항체들은 리간드 결합을 간섭하고, 따라서 CCR4-차단 활성을 보유한다는 것을 나타낸다.
유사한 실험을 실시하여, 실시예 1에 설명된 scFvs가 CCR4에 TARC- 및 MDC-리간드 결합을 간섭하는 지를 테스트하였다. 따라서, CCR4+ DT40-세포들은 배양 플라스크로부터 수확하였고, RPMI-1640 배양 배지로 2회 세척한 후, V-자형 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)의 웰에 1×105 세포들을 할당하였다. 500×g에서 세포들을 5분간 원심분리하였고, 상청액은 흡출시켰고, 그 다음 RPMI-1640 배양 배지에서 0 또는 1 μg/ml의 TARC 또는 MDC (PeproTech EC, London, UK)와 함께 37℃에서 30분간 항온처리하였다. 500×g에서 5분간 원심분리 단계 후 상청액을 흡출하였고, 그리고 세포들은 0.5 μg/ml의 scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803 그리고 2.5 μg/ml의 마우스 항-cMyc (9E10.2; DIATEC Monoclonals, Oslo, Norway)과 함께 1시간 동안 4℃에서 항온처리되었다. 500×g에서 5 분 동안 세포들을 원심분리하였고, 그 다음 1 μg/ml의 RPE-접합된 염소 항-마우스 IgG (BD Pharmingen, San Diego, USA, CA)와 함께 45분 동안 4℃에서 항온처리되었다. 세포들을 0.2% BSA와 0.09% NaN3 와 함께 200μl PBS로 세척하고 재현탁시킨 후, 그리고 EasyCyte 장치(Guava Technologies, Hayward, CA, USA)를 이용하여 유동 세포분석을 하기 위하여 U-자형 96-웰 플레이트(Corning, Schiphol-Rijk, The Netherlands)로 옮겼다. 결과에서 scFvs를 TARC 및 MDC 존재하에서 항온처리하였을 때 착색 신호의 명백한 감소가 나타났다(도 5). 이는 실시예 1에서 설명된 scFvs가 리간드 결합을 간섭하고, 따라서 CCR4-차단 활성을 보유한다는 것을 나타낸다.
실질적으로 유사한 프로토콜을 이용하여 리간드 결합에서 306, 406 및 503의 IgG1 형의 효과를 테스트하였다. KW0761은 비교용으로 이용되었다. 소프트웨어 Prism (GraphPad)의 모델 "log (억제제) vs. 반응"을 이용하여 비-선형 회귀 곡선 피트에 의해 실험 데이터를 피트하였고, 표 20에 요약하였다.
결과에서 KW0761을 제외하고, IgGs의 농도를 증가시키면 라벨된 리간드들 MDC 및 TARC의 착색 신호의 명백한 감소를 보였다(도 12). 이는 306, 406 및 503의 IgG1 형은 리간드 결합을 간섭하고, 따라서 CCR4-차단 활성을 보유한다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 항-CCR4 항체들 사이에서 경쟁
KM3060var와 비교하여 항-CCR4 항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803에 의해 인지되는 에피토프를 분석하기 위하여, 유동 세포분석법을 이용한 경쟁 실험들을 실시하였다. 상이한 농도의 단일 쇄 포맷의 비-바이오티닐화된 항-CCR4 항체들(208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603, 803 및 KM3060var) 존재하에 바이오티닐화된 KW0761IgG 항체의 CCR4+CCRF-CEM 세포들에 결합이 요구되었다. CCR4+CCRF-CEM-세포들은 배양 플라스크로부터 수확하였고, RPMI-1640 배양 배지로 2회 세척한 후, V-자형 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)의 웰에 1×105 세포들을 할당하였다. 500×g에서 세포들을 5분간 원심분리하였고, 상청액은 흡출시켰다. 항체 KW0761-IgG는 표준 방법들을 이용하여 바이오티닐화된다. 5 μg/ml에서 시작하여 8개 적정 점에서 3배 희석된 항-CCR4 scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603, 803 및 KM3060var 존재하에 1 μg/ml의 고정된 농도로 4℃에서 1시간 동안 CCRF-CEM 세포들상에서 바이오티닐화된 KW0761-IgG는 항온처리되었다. 0.2 % BSA 및 0.09% NaN3와 함께 PBS로 세척한 후, 바이오티닐화된 KW0761-IgG의 감지를 위하여 세포들은 2.5μg/ml의 스트렙타아비딘-RPE(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)와 함께 4℃에서 30분 동안 착색시켰다. 착색된 세포들을 세척하고 그리고 0.2 % BSA 및 0.09% NaN3와 함께 250 μl PBS에 재현탁시키고, FACS Canto II 유동 세포분석기(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용한 획득을 위하여 U-자형 96-웰 플레이트(Corning, Schiphol-Rijk, The Netherlands)에 옮겼다.
도 6에 나타낸 결과에서 실시예 1에서 설명된 항-CCR4 항체들중 어느 것도 세포에 결합하기 위해 KW0761와 경쟁하지 않았고, 단지 항체 KW0761-IgG와 KM3060var scFv 사이의 경쟁만 관찰된다는 것을 설명한다. 이는 이 항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803은 KM3060var 또는 KW0761과 동일한 에피토프에 결합하지 않음을 나타낸다.
실질적으로 유사한 프로토콜을 이용하여 306, 406 및 503의 IgG1 형태와 KW0761의 경쟁 및 서로간의 경쟁을 분석하였다. 이 실험에서,항체들 306, 406 및 503은 서로 경쟁하지만, KW0761와는 경쟁하지 않음을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 5: 길항 활성
천연 CCR4+ CCRF-CEM 세포계에서 리간드 유도된 칼슘 유동을 감소시키는 항체들 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 능력이 평가되었다. 정규적인 조건하에서 배양된 CCRF-CEM 표적 세포들을 원심분리에 의해 침강시키고, RPMI-1640 배양 배지에서 2회 재현탁시켰다. 2.5 x 106 세포들을 포함하는 1ml을 Fluo-4-AM(Invitrogen, Carlsbad, California), Pluronic F-127(Invitrogen, Carlsbad, California) 및 Probenecid와 혼합하여 최종 농도가 차례로 1 μM, 0.02% 그리고 1 mM이 되도록 하였다. 수직 회전 휠(7rpm) 상에서 37℃, 30분 동안 세포들을 항온처리하였다. 모든 후속 단계들은 1 mM Probenecid 존재 하에서 실시되었다. 세포들을 10% FCS와 RPMI-1640에서 2회 세척하였고, 분석 완충제(145mM NaCl, 4mM KCl, 1mM NaH2PO4, 0.8mM MgCl2, 25mM Hepes, 22mM 포도당)에 1회 세척하였다. TARC 및 MDC-중개된 Ca-유동의 억제는 2개의 분석으로 나뉘었다.
scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 존재하여 TARC-중개된 Ca-유동의 억제는 PheraStarFS 고-관통 유입 판독기(high-through put reader) (BMG Labtech, Offenburg, Germany)을 이용하여 평가되었다. 이 항체 KM3060var을 음성 대조군으로 이용하였다. 세포들을 1.6x106 세포들/ml의 최종 농도로 희석하였다. 25μl 용적의 세포들을 96-웰 블랙 플레이트(Nunc, Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)로 옮기고, 암 상태에서 25μl의 scFv 항체들 존재하에 실온에서 15분간 항온처리하였다. ScFvs는 0.5μg/ml에서 출발하여 6개의 적정 점에 걸쳐 10배 적정되었다. 모든 scFvs는 3중으로 제공하였고, 시료 KM3060var는 비교용으로 포함되었다. 플레이트를 PheraStarFS 판독기로 옮겼고, 28.6 ng/μl(3.6nM)의 최종 농도에서 각 웰에 별도로 리간드들이 자동 주입되었다. 485 - 520 nm 밴드 통과 필터를 이용하여 총 16개 지점(리간드 주입전 5개 지점(범위 1); 리간드 주입 동안 1개 지점(범위 2의 시작); 그리고 리간드 주입후 10개 지점(범위 2))에 걸쳐 형광 변화를 측정하였다. 다음 식을 이용하여 활성화 %는 계산되었다:
Figure pct00002
scFvs 208, 306, 308, 406, 501, 503, 601, 603 및 803의 존재하에 MDC-중개된 Ca-유동의 억제는 FACSCanto II 유동 세포측정기(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하여 평가되었다. 세포들을 상기에서 설명한 것과 같이 착색시켰고, 1.2x106 세포들/ml의 최종 농도로 희석시켰다. scFv 항체들 또는 이 항체 없이, 동일한 용적의 세포들, 분석 완충제 그리고 리간드 (MDC)를 혼합하였다. 처음 두 성분들 (세포들과 항체들)은 리간드 추가 전에 15분간 사전-항온처리되었다. scFvs의 최종 농도는 10 μg/ml이었고, 반면 MDC는 5 ng/ml이었다. 515-545 nm 밴드 통과 필터를 이용하여 FACSCantoII 유동 세포분석기(BD Biosciences, Heidelberg, Germany) 상에서 시료들을 즉시 분석하였다. 평가를 위하여 다른 방법으로는 처리되지 않은, 착색된 세포들의 평균 신호는 모든 시료로부터 공제되었다. MDC 존재하에, 그러나 scFv 항체 부재하에 착색된 세포들로부터 기록된 신호를 100% 신호 생성으로 설정하였고, MDC 및 scF v항체들 존재하에 세포를 %로 전환시켰다.
도 7 및 8에 나타낸 결과에서 실시예 1에서 설명된 모든 scFvs는 TARC 및 MDC의 억제제로 작용한다는 것이 설명되었다. TARC 억제로부터 유도된 IC50 값은 표 19에 나타낸다.
실질적으로 유사한 프로토콜을 이용하여 KW0761와 비교하여 306, 406 및 503의 IgG1 형태에 의한 리간드-유도된 칼슘 유동에서의 효과를 분석하였다. 이 실험에서 항체들 306, 406 및 503은 리간드-유도된 칼슘 유동을 감소시키지만, KWO761은 감소시키지 않음을 확인하였다. 소프트웨어 Prism (GraphPad)의 모델 "log (억제제) vs. 반응"을 이용하여 비-선형 회귀 곡선 피트에 의해 실험 데이터를 피트하였다.
결과들로부터 본 발명의 항체들은 TARC 및 MDC 유도된 Ca-유동의 억제제로 작용함이 명백하게 설명된다. TARC 억제로부터 유도된 IC50 값은 표 21에 제공한다. 이러한 감소된 값과 상이한 실험 조건들 하에서 감소된 값의 비교가 반드시 적절하지 않다는 것을 인지해야만 한다.
실시예 6. 화학주성의 억제
실시예 1에서 scFv 항체들에 의한 화학주성의 억제는 한 개 쳄버 안에서 CCR4+세포들을 scFv 항체들과 접촉시켜 분석하였고, CCR4의 리간드 (MDC 또는 TARC)는 적합한 구멍 크기를 가진 막 또는 필터에 의해 제 1 쳄버와 분리된 또다른 쳄버에 위치시켰다. 리간드를 지향하는 세포 이동 (화학주성)에서 이 항체들의 효과는 이 항체 존재 하에 화학주성과 이 항체 없을 경우 화학주성을 비교함으로써 결정하였다. 실시예 1에서 설명된 모든 scFv 항체들은 CCR4-양성 세포들이 MDC 및 TARC로 지향되는 화학주성을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2에서 설명된 것과 같이 배양된 CCR4+CCRF-CEM 표적 세포들을 원심분리로 침강시키고, FCS 없이 RPMI-1640 배양 배지에서 2회 재현탁시켰다. 제 3 원심분리 단계에서, 1% FCS가 보충된 RPMI-1640 배양 배지에서 세포들을 재현탁시켰고, 1.6×107 세포들/ml의 최종 밀도로 조정하였다. 나란하게, TARC 또는 MDC 3.5 nM을 함유하는, 1% FCS가 보충된 150 μl의 RPMI를 Multiscreen-MIC 플레이트 96 웰의 각 하부 쳄버에 추가하였다(8 μm 구멍, Millipore, Billerica, MA, USA, MAMIC5S10). scFvs 교차-연결시키고, 이합체 IgG 포맷을 모방하기 위하여 ScFv 항체들은 마우스 항-myc-항체 (9E10.2, Diatec, Oslo, Norway) 존재하에 333 nM에서 0.36 nM로 연속적으로 희석시켰다. 이들 scFv항체들 50 μl와 50 μl의 세포들(최종 농도는 3.9x105 세포들/ml임)을 혼합하고, Multiscreen-MIC 플레이트 96 웰 플레이트의 상부 격실에 추가하였고, 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 필터를 제거하였고, 100 μl의 세포들(하부 쳄버들로부터)은 재현탁시킨 후, 96-웰 COASTAR 플레이트 (Greiner Bio-One, Frikenhausen, Germany)로 옮겼고; 추가적으로 100μl의 PBS(0.2% BSA 및 0.09% NaN3 보충된)를 이들 시료에 추가하였다. FACSCantoII 유동 세포측정기(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하여 통과된 세포들을 헤아림으로써 이동을 평가하였다.
TARC 또는 MDC 존재하에, 그러나 scFv 항체 부재하에 이동된 세포들의 수는 100% 이동으로 설정하였고, 리간드들과 scFv 항체들 존재하에 이동된 세포들의 수를 %로 전환하였다.
도 9에서 제시된 데이터는 실시예 1에서 설명된 모든 scFv 항체들이 CCRF-CEM 세포들의 TARC 유도된 화학주성을 억제하였다는 것을 설명한다. 추가로, 동일한 scFv 항체들은 MDC-중개된 화학주성을 억제하였다(데이터는 나타내지 않음).
IgG1 형태 또한 CCRF-CEM세포들의 TARC 유도된 화학주성 뿐만 아니라, CCRF-CEM세포들의 MDC 유도된 화학주성을 억제하였다는 것을 확인하기 위하여, 306, 406 및 503의 IgG1 형으로 실질적으로 유사한 실험을 실시하였다. IC50 값을 추출하기 위하여 Prism (GraphPad)을 이용한 log (억제제) vs. 반응 기능을 이용하여 데이터를 피팅함으로써 결과를 분석하였다. 측정된 IC50 값은 표 22에 요약한다.
추가 실험에서, TARC에 반응하여 충실성 종양 세포계 786-O의 이동에서 항-CCR4 항체 503 (IgG1 형)의 효과는 트란스웰(transwell) 플레이트 분석으로 분석되었다.
멀티스크린-MIC 96 웰 플레이트(8 μm 구멍, Millipore, Billerica, MA, USA, MAMIC8S10)는 1 μg/ml의 마트리겔(matrigel) 용액 50 μl(BD Matrigel, Cat.No. 356230, BD Biosciences, Heidelberg, Germany)을 피복용 구멍의 상단에 떨어뜨림으로써 준비되었다. 마트리겔은 37℃에서 1시간 동안 중합되도록 하였다. 반응안된 마트리겔은 PBS로 구멍을 세척함으로써 제거되었다. 786-O 세포는 상기에서 개요적으로 설명된 것과 같이 배양되었다. 세포들을 플라스크로부터 수확하고, PBS로 2회 세척한 후, Accutase (PAA laboratories, Linz, Austria)로 실온에서 3분간 항온처리함으로써 배양 플라스크로부터 떼어내었다. 0.1% 태아 송이지 혈청이 보충된 RPMI-1640에서 최종 세포 밀도가 8.0x105 세포가 되도록 세포들을 할당하였다. 나란하게, IgG 항체 503은 60μg/ml의 농도로 희석시키고, 0.1% FCS이 보충된 RPMI-1640에서 5개 지점을 거쳐 5배 연속 희석시켰다. 항체의 조성 완충액에 존재하는 염의 양은 일정하게 유지시켰다. FCS이 보충된 RPMI-1640에서 리간드 TARC를 1000 ng/ml 및 200 ng/ml의 최종 두 가지 농도로 희석시켰다. 항체의 조성 완충액에 존재하는 염의 양은 일정하게 유지시켰다. 150 μl의 리간드를 트란스웰(transwell) Multiscreen-MIC 플레이트 96 웰 플레이트(8 μm 구멍, Millipore, Billerica, MA, USA, MAMIC8S10)의 바닥 쳄버에 할당하였다. 동량의 50 μl 세포들을 50 μl의 이 항체 희석물과 혼합시켰다. 이 혼합물은 마트리겔 피복된 막위에 위치시키고, 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 마트리겔 피복된 막 위에 이동안된 세포들은 긁어내어 물리적으로 제거하였고, 반면 마트리겔 피복된 막을 통하여 이동된 세포들은 세포 역가 glo 발광 세포 생존력 분석 키트 (Promega, Madison, WI, USA)의 매뉴얼에 따라 착색시켰다. 착색된 시료를 96-웰 플레이트(NUNC, 바닥이 편평함, 블랙)으로 옮기고, 발광은 Tecan Infinite M200 판독기(Tecan, Maennerdorf, Switzerland)에서 분석되었다. TARC 존재하에 그러나 항체 부재하에 이동된 세포들의 수를 100% 이동으로 설명하였고, 리간드와 항체 존재하에 이동된 세포들의 수는 %로 전환시켰다. IC50 값을 추출하기 위하여 Prism (GraphPad)을 이용한 log (억제제) vs . 반응 기능을 이용하여 데이터를 피팅함으로써 결과를 분석하였다. 결과에서 항체 503는 충실성 종양 세포계 786-O의 TARC-유도된 이동을 억제하는 것을 보여준다(도 13). 측정된 IC50 값은 표 23에 요약한다.
뮤린 신장 세포 암 세포계 RENCA에서 유사한 발견을 하였는데, 항-CCR4-항체 503은 이 표적 세포들의 뮤린 TARC 유도된 이동을 차단시킬 수 있었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 7: 탈푸코실화된 항- CCR4 IgG 1 분자들의 생성
ADCC 강화는 인간 IgG1 아류에서 올리고사카라이드들의 상태를 조정함으로써 획득될 수 있다는 보고가 있었다(Niwa R et al, CanRes, Vol. 64, 2004). 푸코스의 양을 조정함으로써 ADCC에 유익한 효과를 가질 수 있음이 설명되었다. 따라서, 항체들 306, 406 및 503은 세포 배양 동안 IgG 생산의 푸코실화를 중단시키는 분류 Iα-만노시다제의 선택적 억제제인 키푸텐신 존재하에 생산되었다. 동일한 조건하에 항체 KW0761이 생산되었다.
IgGs는 키푸넨신 (100ng/ml; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) 존재하에 생산되었다. 세포 배지를 회수한 후, 단백질 A 컬럼(HiTrap, 5ml, 단백질A;GE)을 이용한 친화력 정제시에 우선 IgGs를 단리시켰다. 구연산 완충제(pH3)을 이용하여 IgGs를 용리시켰고, 1M Tris-완충제(pH9)로 이동시켰다. 제 2 정제 전, IgG시료를 상향-농축(up-concentrated)시키고, 크기 압출 크로마토그래피(HiLoad Sephadex 200, GE; 운영 완충제 20mM Na-인산염/145mM NaCl, pH7.2)상에 적하시켰다. 단량체 분획물을 수집하였고, IgGs를 두 번째로 상향-농축시켰다.
실시예 8. 종 교차-반응성
인간이외의 종의 CCR4과 교차 반응하는 능력에 대해 항체들 306, 406 및 503을 테스트하였다.
일시적인 형질감염을 위하여, Hek293T/17 세포들을 T75 (NUNC) 플라스트에 2x106 세포로 접종하였다. 접종 후 48시간에, 세포들을 Fugene(ROCHE)로 형질감염시켰다. T75에 40 μl Fugene 및 16 μg DNA를 이용하였다. 형질감염 후 48시간에 이 세포들을 분석에 이용하였다.
HEK-293T/17 세포들은 형질감염 시약으로 Fugene (Roche)를 이용하여 인간 CCR4를 인코드하는 pcDNA3.1 플라스미드, 또는 마우스 CCR4 (GeneBank CAA62372) 또는 원숭이 (Macaca mulatta) CCR4 (PubMed 수탁 번호 XP_001098807)를 인코드하는 pLNO 플라스미드 (Norderhaug et al, 1997)로 일시적으로 형질감염된다. 형질감염안된 세포(CCR4 음성)를 음성대조군으로 이용하였다. 정규 조건하에 48시간 동안 세포들을 더 배양시키고, 상기에서 설명된 것과 같이 플라스크로부터 수확하였다. 1배 105 세포들을 V-자형 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One, Frikenhausen, Germany)의 각 웰에 할당하였다. 세포들을 원심분리하고(400xg, 5 분, 4℃), 0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3을 함유하는 PBS에서 1 μg/ml 농도의 항체들 (306, 406, 503 및 아이소타입 대조군 6-MAM) 50 μl에 재현탁시키고, 4℃에서 60분간 항온처리하였다. PE-접합된 마우스 항-인간-CCR4 항체 1G1 존재하에 또는 PE-접합된 헴스터 항-마우스-CCR4 항체 2G12 (Biolgend; San Diego, CA, USA)와 함께 세포들을 항온처리함으로써 인간 및 뮤린 CCR4의 발현은 확인되었다. 시료들은 원심분리와 150 μl FACS 완충제에 재현탁시켜 2회 세척하였다. 최종적으로 세포 펠렛은 항체들 306, 406, 503 및 아이소타입 대조군 IgG 6-MAM의 감지를 위한 3 μg/ml 염소 항-인간-IgG-PE (AbDSerotec, Dusseldorf, Germany)와 함께 50μl에 재현탁시키고, 4℃에서 45분간 항온처리하였다. 시료들은 상기에서 설명된 바와 같이 2회 세척하고, FACSCantoII (BD Biosciences, San Jose, CA)에서 유동 세포분석법을 위한 U-자형 96-웰 플레이트(Corning, Schiphol-Rijk, Netherlands)로 이동시켰다.
항체들 306, 406 및 503은 인간 및 원숭이 CCR4에 모두 결합함이 확인되었고, 뮤린 CCR4에 대한 친화력이 감소됨이 탐지되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 9: 항체-의존적 세포-중개된 세포독성 (ADCC)
ADCC를 유도하는 항-CCR4 항체들 306, 406 및 503의 능력을 평가하였고, 천연 CCR4+ 세포계 CCRF-CEM, L-428 및 Hut78 상에서 KWO761과 비교하였다. 추가적으로, 항-CCR4 항체들 306, 406 및 503을 이용하여 단리된 조정 T-세포들(Treg-세포들) 상에서 ADCC 유도를 테스트하고, KW0761과 비교하였다. Treg-세포들은 암 질환 진행 과정동안 충실성 종양의 면역-탈출에 주요 역할을 한다고 입증되었다(Wolf AM et al, Clin Cancer Res Vol 9, 2003). 중요한 것은, CCR4는 종양의 기질 영역으로 회귀하는 CD4+CD25+ T 세포들 상에서 발현된다고 설명되며, 이 기질 영역에서 종양을 향하는 면역 반응을 억제한다. 이동 억제(MDC에 의해 유도됨) 또는 CCR4를 경유한 Treg-세포들에 의한 직접적인 치사(ADCC를 통하여)는 전이를 차단하거나 또는 충실성 종양의 성장을 감소시킬 수 있는 전망있는 방법이 될 수 있다.
부유(suspension) 세포들 CCRF-CEM, L-428 및 Hut78에서 ADCC를 위하여, 세포들은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 정규적인 조건들하에서 배양되었다. 세포들을 원심분리로 침강시키고, RPMI-1640 배양 배지에 재현탁시켰다. 이 단계를 1회 반복하였다. 2.5 x 106 세포들과 함께 1 ml을 칼세인-AM(Invitrogen, Carlsbad, California)과 함께 10μM의 최종 농도로 혼합시키고, 수직 회전 휠(7 rpm) 상에서 37℃, 30분간 항온처리하였다. 세포들은 10% FCS와 함께 RPMI-1640에서 3회 세척시키고, 세포 밀도는 3 x 105/ml로 조정하였다. 별도로, 통상적인 과정에 따라 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)을 준비하였고(FicollHypaque 구배 원심분리에 의해 농축시킴), 10% FCS와 함께 RPMI-1640에서 세척하고, ml당 6 x 106로 재-현탁시켰다. 각 표적 및 효과물질 세포들 50μl는 효과물질 대 표적세포들(E:T)의 비율이 20:1이 되도록 96-웰 미량적정 플레이트내 동일한 웰에 추가하였다. 이 항체들을 100 μl의 용적으로 동일한 웰에 4중 시료에 추가하여 다음과 같은 농도 범위가 되도록 하였다: CCRF-CEM의 경우 0.2 μg/ml에서 0.002 ng/ml로 감소시킴; L-428의 경우 1μg/ml에서 0.32 ng/ml로 감소시킴; Hut78의 경우 1μg/ml에서 0.1 ng/ml으로 감소시킴. 그 다음 미량적정 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 항온처리하였고, 표적 세포들의 완벽한 용해를 위하여 3시간 45분 후 웰의 일부에 20 μl의 0.9% Triton-X100을 추가하였다. 그 다음 각 시료 100 μl 상청액을 블랙 미량적정 플레이트로 이동시키고, 형광 (여기(excitation): 488 nm, 방출: 518 nm)은 TECAN Infinite M200 플레이트 판독기(Tecan, Maennerdorf, Switzerland)에서 분석하였다. 항체들이 없는 시료의 형광강도를 모든 다른 시료들로부터 공제하였다. 항체들 포함하는 시료에서 용해 비율은 TritonX-100으로 처리한 후 100% 세포 용해된 시료의 형광 강도에 근거하여 평가되었다. 약량-반응 곡선은 비-선형 회귀 분석 및 소프트웨어 Prism (GraphPad, SanDiego, CA, USA)을 이용하여 3개 매개변수 피트 모델을 이용하여 계산되었다.
Treg-세포들 상에서 ADCC 유도를 테스트하기 위하여, 다음의 프로토콜이 확립되었고, 그리고 항-CCR4 항체 (1G1, Cat. No. # 551266, BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하여 셋업이 확립되었다.
건강한 기증자 혈액내 Treg 세포들의 비율은 5 내지 10% 사이인 것으로 보고된 바 있다(Wolf AM et al, Clin Cancer Res Vol 9, 2003). 이것이 상당한 양의 단리된 Treg-세포들을 얻기 위하여 건강한 기증자 PBMCs로부터 Treg 세포들을 농축시킨 이유다. 단리는 Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T 세포 키트 (Cat.No. #113-63D, Invitrogen Corporation, SanDiego, CA, USA)의 프로토콜을 이용하여 실시되어, 3개의 상이한 집단(PBMC, CD4+ 및 T-reg)을 얻었다. 정제의 특정 단계에서, 일부 세포들을 유지시키고, 품질 대조군으로 적합하게 착색시켰다. PBMCs, CD4+ 및 Treg 세포들은 원심분리에 의해 침강시키고, 0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3이 보충된 PBS에서 1 x 106 세포로 재현탁시켰다. 각 실험을 위하여 비-분리된 2×105 PBMCs 및 단리된 CD4+ 세포들 200μl 와 100μl의 1 x 105 단리된 Treg 세포들을 96 웰 v-자형 플레이트로 이동시키고, 400xg, 4℃에서 5분간 회전시켜 가라앉혔다. 피펫을 이용하여 상청액을 버리고, 세포 펠렛은 0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3이 보충된 PBS 50μl 또는 Treg 세포들의 확인용으로 기능을 하는(Simonetta F et al, Eur J Immunol Vol 9, 2010) 50μl의 바이오티닐화된 항-CD127(Cat. No. #558633BD Biosciences, Heidelberg, Germany)에서 재현탁시키거나, 또는 50μl의 바이오티닐화된 항-CCR4항체(1G1, Cat. No. #551266, BD Biosciences, Heidelberg, Germany)에 재현탁시키고, 그리고 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 시료들을 (0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3이 보충된) PBS로 3회 세척하고, 400 x g, 4℃에서 5분간 회전시켜 가라앉혔다. 피펫을 이용하여 상청액을 버리고, 세포 펠렛은 50μl의 PBS(0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3이 보충된) 또는 바이오티닐화된 항-CCR4 (1G1, Cat. No. #551266, BD Biosciences, Heidelberg, Germany)와 함께 또는 바이오티닐화된 항-CCR4 없이, 50μl의 항-CD4-FITC와 항-CD25-APC(Cat. No.#11-0049-42 및 #17-0259-42 eBiosciences SanDiego, CA, USA) 그리고 스트렙타아비딘-PerCP(Cat. No. #554064, BD Biosciences, Heidelberg, Germany)의 혼합물에 재현탁시키고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 시료들을 (0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3이 보충된) PBS로 3회 세척하고, 400 x g, 4℃에서 5분간 회전시켜 가라앉혔다. 피펫을 이용하여 상청액을 버리고, 항-CCR4-PE와 함께 그리고 착색안된 세포 펠렛은 200μl의 PBS(0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3이 보충된)에 재현탁시키고, 96웰 u-자형 플레이트로 이동시켰다 상이한 형광색소를 이용한 비교는 FACSCantoII(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)에서 실시하였고, 시료를 분석하였다. FoxP3 착색 완충제 키트(Cat. No. #00-5523-00,eBiosciences San Diego,CA, USA)에 설명된 프로토콜에 따라, 항-Fox-P3-항체(Cat. No. #560046, BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 나머지 시료들을 착색시켰다. 세포들은 200μl의 PBS(0.2 % BSA 및 0.09 % NaN3이 보충된)에 재현탁시키고, FACSCantoII(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하여 유동 세포분석기에서 분석하기 위하여 96웰 u-자형 플레이트로 이동시켰다. 단리된Treg세포들은 항-CD4-FITC/항-CD25-APC상에서 두배(double) 양성 신호 뿐만 아니라, 항-Fox-P3-PE/항-CCR4(스트렙타아비딘-PerCp을 이용하여 바이오티닐화딘 1G1의 탐지)에서 두배 양성 신호로 순수 Treg 세포임이 판단되었다. 단리된 세포들의 대략 95%는 CD4+CD25+ 세포들이었고, 이들중 66%는 FoxP3-CCR4-양성임이 밝혀졌다.
실시예 1에 기술된 단리된 Treg세포들상에서 항 CCR4 항체들의 효과를 평가하기 위한 ADCC 실험은 설명된 것과 같이 실행되었지만, 단 E:T(이 경우 효과물질 세포들은 자가 PBMCs로부터 단리되었다; 표적세포들 = Treg세포들) 비율은 15로 하향되었고, 그 이유는 자가 PBMCs로부터 단핵 세포들의 낮은 단리 수율 때문이다. 항체들 306, 406, 503 그리고 KW0761은 3중으로 3.3nM의 단일 농도에서 항온처리되었다. 단리된 자가PBMCs가 기능적이라는 것을 확인하기 위하여 ADCC는 CCR4+CCRF-CEM 표적 세포들 상에서 나란하게 실시되었다(데이터는 나타내지 않음).
도 14에 나타낸 결과와 요약된 계산된 EC50 값(표 24 참고)에서 본 발명의 항-CCR4항체들은 3가지 모든 표적 세포계(Hut78은 나타내지 않음)에서 인간 PBMCs의 존재하에 ADCC를 유도할 수 있음이 분명하게 설명되었다. 가장 효과적인 항-CCR4항체 503은 CCRF-CEM세포들에서 테스트되었을 때, 315pM의 KW0761과 비교하여 5.3pM의 EC50을 가지는 것으로 측정되었다. L-428세포들에서 테스트되었을 때, KW0761와 비교하였을 때, 실시예 1에서 설명된 것과 같이 모든 항-CCR4 항체들의 감소된 치사 활성이 관찰되었다. 이것은 이 세포계가 CCR4-리간드 CCL17/TARC를 배출한고, 이로 인하여 CCR4에 결합에 대해 항체들이 경쟁한다는 사실로 설명될 수 있다.
추가로, 항-CCR4 항체들은 단리된 Treg 세포들 상에서 ADCC에 대해 도전을 받을 때 필적가능한 최대 치사 활성을 또한 나타내었다(도 15 참고).
실시예 10: 성인 T-세포 림프종 백혈병 (ATLL)의 생체내 모델
실시예 1에 설명된 항-CCR4 항체들 306, 406 및 503은 탈푸코실화된 IgG1 분자들을 이용하여 인간 T-세포 림프종 이종이식편 모델에서 종양 성장을 감소시키는 능력에 대해 테스트되었다. ATLL에서 생체내 효과를 가진 것으로 이미 설명된(Niwa R et al, CanRes, Vol 65, 2004) 항체에 근거된 항체 KW0761은 양성 대조군으로 포함되었다. 설명된 모든 실험들은 EPO (Berlin, Germany)에서 실시되었다.
CCR4+ 혈액학적 성인 T-세포 림프종 세포계 CCRF-CEM의 종양 편(크기가 3 x 3 x 3 mm임)을 NMRI nu/nu 마우스 (Taconic, Hudson, NY, USA)의 피하로 이식하였다. 총 5개의 상이한 집단은 다음과 같이 상이한 시료와 함께 나란하게 처리되었다: 집단 A = 대조군(실시예 2에서 기술된 바와 같은 비이클 제제 완충액), 5마리 동물로 구성됨; 집단 B = KW0761-IgG, 5마리 동물로 구성됨; 집단 C = 306-IgG, 10마리 동물로 구성됨; 집단 D = 406-IgG, 10마리 동물로 구성됨; 집단 E = 503-IgG, 10마리 동물로 구성됨. 항체 시료들은 종양들이 대략 100㎣의 만져지는 크기에 도달될 때 정맥(i.v.)으로 제공되었다. 종양체적은 다음의 식으로 계산되었다:
종양 체적(㎣)=0.5 x (최대 직경) x (최소 직경)2.
마우스들은 4주에 걸쳐 주당 2회(총 8회 처치) 20 mg/kg (마우스당 25g 의 체중으로 가정하여 마우스 한 마리당 500 μg의 IgG)의 약량으로 처치받았다. 치료를 시작한 후 총 6주에 걸쳐 동물을 감시하였고, 종양 체적과 체중을 주당 2회 측정하였다. 종양 크기가 > 1.5 ㎤을 초과할 때 동물들을 죽였다. 대조군은 큰 종양 체적으로 인하여 23일 후 죽여야만 하였다. 실험 집단 간의 수득된 데이터의 통계학적 유의성은 소프트웨어 Prism (GraphPad, SanDiego, CA, USA)을 이용하여 분석되었다. Mantel-Cox 테스트를 이용하여 처리된 집단(항체) 대 처리안된 집단(대조군)을 비교함으로써 생존 비율을 분석하였다. 분산 분석 (ANOVA) 및 쌍을 이루지 않은 t-test 분석을 통하여 종양 배가 시간(doubling times)을 분석하였다.
연구 결과를 도 16, 17 및 18에 제시하고 요약한다. 체중 감소 없는 것으로 평가될 수 있었기 때문에 이 항체들로 마우스를 치료하는 것은 잘 용인되었다(도 16). 상이한 집단의 개별 종양 체적을 비교한 것은 도 17에 제시한다. 동일 집단내 종양 체적이 높은 변화를 보이는데, 이는 아마도 종양 편으로부터 종양 모델이 접종된 것으로 인한 것이며, 지연-상(lag-phase) 이후 신속한 종양 성장을 초래한다는 것을 볼 수 있다. 대조군 A는 큰 종양 크기로 인하여 종양 이식 23일 후 죽여야만 했다. 테스트된 모든 항-CCR4 항체들의 경우에 종양 체적의 명백한 감소를 볼 수 있다. 23일자에 측정된 대조군(처리된 경우 대 대조군, %; T/C)과 비교하여 최저 평균 종양 체적은 항-CCR4 항체 503의 경우 35%, KW0761의 경우 67%, 항체 306의 경우 50%, 그리고 항체 406의 경우 62%로 측정되었다. 항-CCR4 항체 503의 경우 대조군과 비교하여 종양 배가 시간의 통계학적 유의성이 또한 측정되었다(6.28 ± 1.03 vs. 2.58 ± 0.25 일; P = 0.0273, 쌍을 이루지 않은 t- test). 종양 체적 및 종양 배가 시간의 차이는 동일한 집단 E (항-CCR4 항체 503)로부터 동물의 생존 곡선에 반영되며, 대조군 A의 평균 생존 시간 22일과 비교하여 평균 생존 시간 26일로 측정되었다 .
따라서, 실시예 1에서 기술된 3가지 모든 항-CCR4 항체들은 생체내 종양 근절 효과를 가진 것으로 설명되었다. 항체 503의 경우 통계학적 유의적 데이터가 수득되었다.
실시예 11. 혈소판에서 응집화 측정.
CCR4는 혈소판에서 발현되는 것으로 알려져 있고, 이의 리간드들 MDC 및 TARC는 혈소판 응집화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이는 IgG 분자들이 2개의 리간드 결합 위치를 보유하고, 따라서 CCR4를 인지하는 IgG는 이의 두 개 팔이 상이한 혈소판 상에서 CCR4에 결합할 수 있다면 혈소판과 가교연결될 수 있는 가능성 때문에 잠재적으로 문제가 될 소지가 있다. 이로써 생체내 혈액 응고를 야기할 수 있다. 따라서, 실시예 1에서 기술된 것과 같이 혈소판 응집화에서 항-CCR4 항체들의 효과를 검사하였다. 이 항체들은 단리된 혈소판만으로, 또는 응집화의 잘 설명된 유도물질인 ADP(Varon and Spectre "Antiplatelet agents" Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 267-72, 2009)와 함께 항온처리되었다.
총 50 ml의 새로운 기증 혈액을 구연산 나트륨을 포함하는 튜브에 수집하였다. 실온(RT), 185g에서 15분간 원심분리하여 혈소판 풍부한 혈장을 수득하였다. 혈소판을 함유하는 혈장을 새로운 튜브로 옮겼다. 기준을 정의하기 위하여 혈소판 고갈된 혈장은 혈소판이 풍부한 혈장 1 ml을 실온에서 1200g에서 5분간 원심분리하여 준비하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 혈소판이 풍부한 시료와 동일한 방식으로 처리하였다. AggRam - 응집기(Helena Laboratories, Beaumont, TX, USA)를 이용하여 교반하면서 37℃에서 응집화 측정을 실시하였다. IgGs(503, 406, 306 그리고 음성 대조군으로 항-GFP)는 FACS 완충제(PBS, pH 7.4, 0.2 % BSA, 0.09 % NaN3)에서 10μg/ml의 농도로 혈소판과 함께 항온처리되었다. ADP는 응집화에서 양성 대조군으로 기능을 하며, 5 μM의 최종 농도로 이용되었다. ADP로 수득된 신호를 100%로 설정하였고, 그리고 모든 실험 환경에서 나란하게 측정된 혈소판 고갈된 혈장에 의해 수득된 것을 기준 0으로 정의하였다.
실시예 1에서 기술된 것과 같이, 항-CCR4 항체들의 혈소판 결합을 관찰하였다(데이터는 나타내지 않음). 응집화 유도는 관찰되지 않았고, 그리고 추가로 ADP 존재하에 응집화 억제도 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 이들 결과로부터 실시예 1에서 설명된 항-CCR4 항체들은 비록 혈소판에 결합하지만, 이들은 혈소판 응집화에 효과를 가지지 않는다는 결론을 내릴 수 있다. 이들은 응집화 유도하지 않으며, 예를 들면 ADP-유도된 혈소판 응집화를 억제하지도 않는다.
실시예 12. 인간 신장 세포 암종에 결합.
CCR4는 투명 세포 신장 암 세포들의 충실성 종양 세포와 연관되고, 이들에 의해 발현되는 것으로 알려져 있다(CCRC; 특허 출원 WO2009/037454 참고). 신장 세포 암 (RCC)을 앓는 환자로부터 준비된 조직에 존재하는 CCR4에 특이적 결합을 설명하기 위한 목적으로, 면역-조직화학 실험들을 실시하였다. 설명된 모든 실험들은 Centre for Translational Oncology Institue of Cancer (Barts and the London school of Medicine and Dentistry, Queen Mary University London, Chartehouse Square)에서 실시하였다. 항-CCR4 항체 503을 이용하여 착색을 실행하고, 양성 항-CCR4 항체와 비교하였다.
단계 IV로 진단된 환자의 RCC 종양 마이크로어레이(TMA)는 Barts and the London school of Medicine and Dentistry (Queen Mary University London, Charterhouse Square, London, UK)에서 제공하며, 그리고 3가지 상이한 집단(TMA1, 2 및 3)으로 구성된다. 파라핀-내장된 단편들은 4μm 두께로 절단하였고, 왁스를 제거하고, 알코올 구배를 통하여 수화시켰다. 항원 복구는 항원 노출(unmaking) 용액에서 9분 동안 초음파를 제공하여 실행되었다(Vetorlaboratories, Burlingame, CA, USA). 단편들은 PBS에 희석된 5% 염소- 또는 20% 토끼 혈청(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)에서 실온에서 1시간 동안 차단되었다. CCR4의 감지를 위하여, TMAs는 다음의 항체들로 착색되었다: CCR4는 3μg/ml 농도의 항-CCR4 항체 503을 이용하여 탐지되었고, 그리고 염소 항-CCR4 항체 Ab1669(3μg/ml; Abcam, Cambridge, UK)와 비교되었다. 항-CCR4 항체 503의 결합 특이성을 설명하기 위하여 인간 아이소타입 대조군 항체(Cat. No 1-001-A, 3μg/ml로 이용됨; RnD systems, Minneapolis, MN USA)가 포함되었다. 항체들은 대응하는 차단 물질 (PBS에서 희석된 5% 염소 혈청내 인간 항체들; PBS내 20% 토끼 혈청안에 Ab1669)에서 하룻밤 동안 4℃에서 항온처리되었다. 다음날 PBS를 1회 세척시 30 내지 50 ml용적으로 3회 슬라이드를 세척하였다. RnD의 인간 항체들 503 및 아이소타입 대조군 항체는 1:500 희석에서 바이오틴-접합된 염소 항-인간 2차 항체를 이용하여 탐지되었다(Cat. No. AP112B, Chemicon International, a division of Millipore, Billerica, MA,USA). 항-CCR4 항체 Ab1669는 1:200 희석에서 바이오틴-접합된 토끼-항-염소 항체 (BA-1000; Vectorlaboratories, Burlingame,CA,USA)과 함께 RT에서 45분 동안 항온처리하여 탐지되었다. PBS를 1회 세척시 30 내지 50 ml용적으로 2회 슬라이드를 세척하였다. 내생 퍼옥시다제는 실온에서 20분간 30% H2O2와 혼합물에 메탄올(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)을 혼합시킴으로써 차단되었다. PBS를 1회 세척시 30 내지 50 ml용적으로 3회 슬라이드를 세척하였다. 항원은 벡타스테인 엘리트 ABC 키트(Vectorlaboratories, Burlingame, CA, USA)를 이용하여 가시화되었고, 그리고 3,3'-디아미노벤지딘(DAB; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)을 이용하여 발달되었다. CCR4를 많이 발현시키는 것으로 보고된 비장 조직상에서 항-CCR4 항체 306, 406, 503에 대하여 유사한 착색 과정을 실행하였고, 따라서 항-CCR4 항체들에 대한 양성 대조군으로 작용한다(데이터는 나타내지 않음). 나란하게, CCR4-리간드들 TARC 및 MDC의 탐지를 실시하였다. 착색 과정은 상기와 같지만, 다음의 항체들이 이용되었다. TARC는 토끼 항-인간-TARC 항체(ab9816, Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 탐지되었다. 항체는 1:50의 희석비로 이용되었고, 그리고 바이오틴-접합된 염소 항-토끼 항체는 1:200(Vectorlaboratories, Burlingame, CA, USA)의 희석비를 이용하여 탐지되었다. MDC는 토끼 항-인간-MDC 항체(500-P107, Peprotech, Princeton, NJ, USA)를 1:20의 희석비로 이용하여 탐지되었고, 바이오틴 접합된 항-토끼 항체를 이용하여 탐지되었다. Nikon Eclipse 80i 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 모든 결합 패턴을 분석하였다.
추가적으로, 정상적인 인간 태반 및 신장 조직에서 상기에서 설명된 테스트된 모든 항체들에 대해 음성 대조군 조직에 대한 결합을 평가하였다.
RCC를 앓고 있는 환자의 종양 마이크로어레이의 착색 결과에서 항-CCR4 항체 503는 IHC의 RCC 환자 조직에서 발현된 CCR4에 결합한다는 것이 설명된다(도 19). 더욱이, 항-CCR4 항체 503은 투명 세포 신장 세포 암종 영역에 결합하지만, 유두상 신장 세포 암종에는 결합하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 납득이 가도록, 결합 패턴은 항-CCR4 양성 대조군 항체 Ab1669와 중첩된다. 태반의 정상적인 인간 조직에 약한 결합이 관찰되었다. 그러나, 태반은 상당히 혈관화된 장기이기 때문에, 이들 결합 패턴은 CCR4가 발현되는 것으로 알려진 혈관에 참조될 수 있다. CCR4의 발현은 CCR4-리간드들 TARC 및 MDC의 발현 패턴과 일치하였다. IHC-실험의 결합 결과 요약은 표 25에 제시된다. 이들 데이터들에 의해 항-CCR4 항체 503이 RCC에 치료 또는 진단으로 삼을 수 있음이 제안된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Affitech Research AS et al. <120> Anti ccr4 antibodies and uses thereof <130> PIA01786GB <150> GB1020738.9 <151> 2010-12-07 <150> US61/420370 <151> 2010-12-07 <150> PCT/GB2011/052421 <151> 2011-12-07 <160> 133 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Gly Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser His Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Asn His Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Val Trp Asp Ala Lys Tyr Arg Gly Trp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys 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330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tgttctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg cgaaatacag gggttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 103 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag acctgatgac acggccgtgt attactgtgc gagacgcggt 300 gggagctact ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 104 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tgtcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg cgaaatacag gggttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 105 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag acctgatgac acggccgtgt attactgtgc gagacgcggt 300 gggagctact ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 106 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tgttctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg cgaaatacag gggttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 107 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctgaagg caccttcagc agctatgcta tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggccgtgt attactgtgc gagacgcggt 300 gggagctact ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 108 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tgtcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg cgaaatacag gggttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 109 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctgaagg caccttcagc agctatgcta tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggccgtgt attactgtgc gagacggcgc 300 ggcgctaaat ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 110 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 tcctatgtgc tgactcagca accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tggtctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcgg tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg acaccctgag tggctgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 111 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctgaagg caccttcagc agctatgcta tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggccgtgt attactgtgc gagacggcgc 300 ggcgctaaat ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 112 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tggtctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcgg tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg acaccctgag tggctgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 113 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggccgtgt attactgtgc gagacggcgc 300 ggcgctaaat ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 114 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 tcctatgtgc tgactcagca accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tggtctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcgg tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg acaccctgag tggctgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 115 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctgggcaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggccgtgt attactgtgc gagacggcgc 300 ggcgctaaat ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 116 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tggtctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcgg tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg acaccctgag tggctgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 117 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacggcgc 300 ggcgctaaat ttgactactg gggccaaggg accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 118 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tggtctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcgg tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg acaccctgag tggctgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 119 Ser Tyr Ala Xaa Ser 1 5 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be M or I <400> 120 Ser Tyr Ala Xaa Ser 1 5 <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(17) <223> X= any amino acid <400> 121 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Xaa Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 122 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(17) <223> X = V, I or A <400> 122 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Xaa Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 123 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(8) <223> each X may independently be any amino acid <400> 123 Arg Xaa Gly Xaa Xaa Phe Asp Tyr 1 5 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X=R or G <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X=S or A <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X= Y or K <400> 124 Arg Xaa Gly Xaa Xaa Phe Asp Tyr 1 5 <210> 125 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(13) <223> X = any amino acid <400> 125 Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser His Tyr Val Xaa 1 5 10 <210> 126 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(13) <223> X = F, S or Y <400> 126 Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser His Tyr Val Xaa 1 5 10 <210> 127 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(11) <223> each X may independently be any amino acid <400> 127 Ala Val Trp Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Trp Val 1 5 10 <210> 128 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X= A or D <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X= K or T <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X= Y or L <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X= R or S <400> 128 Ala Val Trp Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Trp Val 1 5 10 <210> 129 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> homologue <220> <221> VARIANT <222> (1)..(22) <223> Each X may independently be any amino acid <400> 129 Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 130 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> homologue <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223> X at position 1 = Q and/or X at position 2 = S <400> 130 Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 131 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> homologue <220> <221> VARIANT <222> (1)..(22) <223> Each X may be any amino acid <400> 131 Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Gln Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 132 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> homologue <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223> X at position 1 = Q and/or X at position 2 = S <400> 132 Xaa Xaa Val Leu Thr Gln Gln Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 133 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 caaagcgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag cgtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcacctc caacatcgga agtcattatg tggtctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgactct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcgg tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtgtgggatg acaccctgag tggctgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

Claims (23)

  1. 인간 CC 케모킨 수용체 4 (CCR4)에 결합하고, 대식세포-유도된 케모킨 (MDC) 및/또는 흉선 및 활성화 조절된 케모킨 (TARC)의 CCR4에 결합을 억제할 수 있으며, 3개의 CDRs를 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역과 3개의 CDRs를 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 있어서,
    이때 전술한 중쇄 가변 영역은
    (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 보유하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
    (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 보유하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 그리고
    (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 보유하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 전술한 항체의 전술한 경쇄 가변 영역은 다음을 포함하는, 항체:
    (iv) 서열 번호: 22, 17 또는 4의 아미노산 서열을 보유하는 가변 경쇄 (VL) CDR1;
    (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR2; 그리고
    (vi) 서열 번호: 24 또는 6의 아미노산 서열을 보유하는 VL CDR3.
  3. 청구항 1 내지 2중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 항체는 서열 번호: 39의 서열 또는 이에 최소한 70% 동일성을 보유하는 서열을 보유하는 VH 도메인 및/또는 서열 번호: 40의 서열 또는 이에 최소한 70% 동일성을 보유하는 서열을 보유하는 VL 도메인을 가지는, 항체.
  4. 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 항체는 온전한(fully) 인간 항체인, 항체.
  5. 청구항 1-4중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 항체는 IgG 항체, 선호적으로 IgG1인, 항체.
  6. 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 항체는 변경된 당화 패턴을 보유하며, 선호적으로 전술한 항체의 Fc 영역에 결합된 총 복합체 N-글리코시드-연결된 슈가 쇄의 최소한 10, 20, 30, 40 50, 60, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 최소한 99%는 푸코스가 슈가 쇄의 환원 단부에서 N-아세틸글루코사민에 결합안된 슈가 쇄인, 항체.
  7. 청구항 1-6중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 항체는 항체의 항원 결합 단편이며, 선호적으로 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체, TandAbs 이합체, Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, 선형 항체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편, 바이바디, 트리바디, sc-디아바디, 카파(람다) 바디, BiTE, DVD-Ig, SIP, SMIP, DART 또는 하나 이상의 CDR을 포함하는 작은 항체인, 항체.
  8. 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 항체는 최소한 치료 또는 진단 물질에 부착되며, 선호적으로 최소한 방사능치료 물질, 화학치료 물질, 항-맥관생성 물질, 자가사멸-유도 물질, 항-투블린 약물, 항-세포성 또는 세포독성 물질, 스테로이드, 사이토킨 길항제, 사이토킨 발현 억제제, 케모킨 길항제, 케모킨 발현 억제제, 항-염증성 코르티코스테로이드 또는 NSAIDs, 응혈제 또는 항-바이러스성 물질에 부착되며, 여기에서 전술한 항-바이러스성 물질은 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 역 전사효소 억제제, 비-뉴클레오시드 역 전사효소 억제제 및 프로테아제 억제제로 구성된 군으로부터 선호적으로 선택되는, 항체.
  9. 청구항 1-8중 임의의 한 항에 따른 최소한 한 항체를 포함하는 조성물에 있어서, 전술한 조성물은 선호적으로 약제학적으로 수용가능한 조성물 예컨데 리포좀 또는 나노입자 조성물이며, 임의선택적으로 최소한 제 2 치료 물질을 더 포함하는 조성물.
  10. 청구항 1-8중 임의의 한 항에 따른 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함하는 핵산 분자.
  11. 청구항 10에 있어서, 전술한 뉴클레오티드 서열 영역은 서열 번호: 111 및/또는 112의 뉴클레오티드 서열, 또는 임의의 전술한 서열들에 최소한 70% 동일성을 가진 서열을 보유하는, 핵산 분자.
  12. 청구항 10 또는 11의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  13. 청구항 10 또는 11의 핵산 분자 또는 청구항 12의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스.
  14. 최소한 제 1 용기 안에 다음을 포함하는 키트:
    (a) 청구항 1-8중 임의의 하나에 따른 항체8;
    (b) 청구항 9에 따른 조성물;
    (c) 청구항 10 또는 11에 따른 핵산 분자;
    (d) 청구항 12에 따른 발현 벡터; 및/또는
    (e) 청구항 13에 따른 숙주 세포 또는 바이러스.
  15. 다음을 포함하는 항체를 생산하는 방법:
    (a) 인코드된 항체를 발현시키는데 효과적인 조건하에 청구항 13에 따른 숙주 세포를 배양하고; 그리고
    (b) 전술한 숙주 세포로부터 발현된 항체를 수득한다.
  16. CCR4과 항체 사이에 복합체 형성을 허용하는데 효과적인 조건하에 청구항 1-8중 임의의 한 항에 따른 항체를 CCR4를 포함하는 것으로 알려진 시료 또는 포함하는 것으로 의심되는 시료에 접촉시키고, 형성된 복합체를 측정하는 것을 포함하는, CCR4를 탐지 또는 측정하는 시험관에서의 방법.
  17. 치료 또는 화상 진단 또는 진단용의 청구항 1-8중 임의의 한 항에 따른 항체.
  18. 청구항 17에 있어서, CCR4 발현 또는 활성과 연관된 이상의 치료 또는 화상 진단 또는 진단에 이용, 또는 동물에서 CCR4 발현과 연합된 면역억제의 감소에 이용되는, 항체.
  19. 청구항 18에 있어서, 전술한 이상은 CCR4에 의해 중개된 질환 또는 CCR4+ 세포들의 비정성적 증식, 선호적으로 암, 염증성 질환, 면역 질환 또는 감염을 특징으로 하며, 여기에서 전술한 이상은 (a) 알레르기성 질환들 예컨데 전신 아낙필라시스 또는 과민반응 반응들, 약물 알레르기, 알레르기성 기관지폐 아스퍼질러스증(ABPA), 곤충 침 알레르기 그리고 음식 알레르기, (b) 염증성 장 질환들, 예컨데 크론 질환, 궤양성 결장염, 회장염 및 장염, (c) 질염, (d) 건선 및 염증성 피부병 예컨데 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기와 소양증, (e) 맥관염, (f) 척추관절염, (g) 경피증, (h) 천식 및 호흡기 알레르기성 질환들 예컨데 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 만성 폐쇄성폐 질환 및 과민반응 폐 질환들, (i) 자가면역 질환들, 예컨데 관절염(류마티스성 그리고 건선성 포함), 다발성 경색, 전신 홍반성 낭창, 유형 I 당뇨병, 사구체신염, (j) 이식편 거부반응 (동종이식편 거부반응 및 이식편-v-숙주 질환을 포함), (k) 바람직하지 않은 염증성 반응들이 억제된 기타 질환들, 예컨데 아테롬성 동맥경화증, 근염, T-세포 중개된 신경퇴행성 질환들, 다발성 경색, 뇌염, 수막염, 간염, 신장염, 폐혈증, 유육종증, 알레르기성 결막염, 이염, 캐슬만의 질환, 부비강염, LPS-유도된 내독성 쇼크, 베체트 증후군 및 통풍, (l) 암, 선호적으로 유방 암, 결장직장 암, 식도 암, 위 암, 간세포 암종, 폐 암, 흑색종, 난소암, 신장 암, 췌장 암, 경부 암, 뇌 암, 전립선 암, 위 암, 성인 T-세포 백혈병/림프종 (ATL), 말초 T-세포 림프종, 상세불명 미만성 큰 B-세포 림프종, 호지친 림프종, B-세포 만성 임파성 백혈병, 균상식육종(Mycosis fungoides), 세자리(Sezary) 증후군 (m) 감염들 예컨데 입스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 감염, HIV 감염 및 기타 바이러스성 감염들로부터 선호적으로 선택되는, 항체.
  20. 청구항 17에 있어서, 전술한 용도는 동물에서 CCR4 발현과 연관된 질환의 진단이며, 이는 다음의 단계들을 포함하는, 항체:
    (a) 동물에 전술한 항체를 접촉시키는 단계; 그리고, 임의선택적으로
    (b) 동물에서 항체-항원 복합체의 존재 및/또는 양 및/또는 위치를 측정 또는 탐지하는 단계; 그리고, 임의선택적으로
    (c) 동물에서 항체-항원 복합체의 존재 및/또는 양을 대조군과 비교하는 단계.
  21. CCR4 발현 또는 활성과 연관된 이상을 진단하는 시험관내 방법에 있어서, 청구항 16에 따른 방법으로 CCR4를 탐지 또는 측정하고, 이 정보를 이용하여 CCR4 발현 또는 활성과 연관된 질환을 진단하는, 방법.
  22. 청구항 20에 따른 진단에서의 용도 또는 청구항 21의 방법에서의 용도에 있어서, 전술한 동물 또는 시료내 CCR4 양의 증가는 종양세포들에 대한 진단 또는 바이러스에 의해 감염된 세포들의 진단이며, 선호적으로 여기에서 전술한 바이러스에 의해 감염된 세포들은 입스타인-바르 및 HIV로부터 선택된 바이러스에 의한 감염이되는, 용도.
  23. CCR4-관련된 장애를 앓고 있는 피험자의 세포, 표적 위치, 조직 또는 장기에서 발현된 CCR4의 존재 또는 그 양의 탐지용으로 청구항 1-8중 임의의 한 항에 따른 항체의 용도에 있어서, 건강한 대조군과 비교하여 탐지된 또는 측정된 CCR4의 존재 또는 양의 증가는 전술한 피험자가 항-CCR4 요법으로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타내는, 용도.
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