CN103328513A - 抗ccr4抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开内容提供了结合人CC趋化因子受体4（CCR4）的胞外域的表位并能够抑制巨噬细胞来源的趋化因子（MDC）和/或胸腺和激活调节的趋化因子（TARC）与CCR4的结合的抗体。本发明还提供了包含这样抗体的免疫交联物和组合物，以及特别是在医药和诊断领域中，涉及这样抗体的方法和应用。

Description

抗CCR4抗体及其应用
技术领域
本发明一般涉及抗体、CCR4生物学和相关的治疗领域。更具体地，本发明提供了与CCR4结合的抗体。这样的抗CCR4抗体具有诊断和治疗与CCR4相关的疾病和状况的应用，如肿瘤血管成像、治疗癌症及治疗病毒和其它感染、和炎症及免疫疾病。本发明的基于抗体的组合物和方法同样延伸至免疫交联物和其它治疗组合物、试剂盒和方法的应用。
背景技术
G蛋白偶联受体（GPCR）有800多个成员，代表了涉及信号传输的细胞表面分子的最大家族，占人类基因组编码的全部基因的>2%。GPCR超家族的成员具有一种共同的膜拓扑结构：细胞外的N末端、细胞内的C末端和七次跨膜（TM）螺旋，其通过三个细胞内的环和三个细胞外的环连接。基于它们共同的拓扑结构，GPCR也被认为是七次跨膜（7TM）受体。这些受体控制关键的生理机能，包括神经传递、从内分泌腺和外分泌腺释放激素和酶、免疫反应、心肌和平滑肌收缩及血压调节。它们的功能紊乱与一些最流行的人类疾病有关。呈现的实验数据和临床数据显示：GPCR在癌症的进程和转移中具有至关重要的作用。因此，有一种可能：一些GPCR可能是抗癌药物的合适目标。
趋化因子在多种疾病和失调的免疫和炎症应答中起重要作用，所述疾病和失调包括癌症、病毒感染、哮喘和过敏性疾病以及自身免疫病状如风湿性关节炎和动脉硬化。这些小的、分泌的分子是逐渐增长的8-14kDa蛋白超家族，其特征是保守的四个半胱氨酸基序。
研究已经证明：趋化因子的作用通过G蛋白偶联受体的亚家族介导，其中的受体是被指定为趋化因子（C-C基序）受体4或CC趋化因子受体4（CCR4）的受体。CCR4的具体配体包括趋化因子胸腺和激活调节的趋化因子（TARC）（也被认为是CCL17）和源于巨噬细胞的趋化因子（MDC）（也被认为是CCL22）。CCR4也可以与RANTES、MCP-1和MIP-1α结合，且已经报导了响应这些配体的CCR4信号转导。
已经认为CCR4在T细胞趋化作用和吞噬细胞迁移至炎症位点中是重要的。优选地，CCR4在辅助性T细胞2型（Th2）细胞和调节性T（Treg）细胞上表达；然而在其它健康细胞或组织上仅发生有限量的表达。
肿瘤细胞，特别是成人T细胞白血病/淋巴瘤细胞，可能为CCR4阳性。肿瘤细胞表达CCR4与皮肤相关联。一些T细胞恶性肿瘤典型地定位在皮肤上。例如，在皮肤T细胞淋巴瘤病变中发现高水平的CCR4。最近，已经发现一些实体瘤同样表达CCR4（WO2009/037454）。CCR4的表达被认为是实体瘤，特别是宫颈癌、食道癌、肾癌、脑癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌癌变的早期事件。因此，血液癌细胞和非血液癌细胞都可以表达CCR4。因此，可以使用抗CCR4抗体诊断、监测和治疗这些癌症。
此外，CCR4在常规免疫和肿瘤免疫中具有重要作用。显著部分的CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）为CCR4阳性（Baatar等,2007b）。这些Treg通过多种机制抑制免疫反应，并且已经显示它们可以抑制肿瘤特异的免疫性。在多种癌症中，浸润基质、肿瘤本身或引流淋巴结的Treg的数量增加与恶化的结果相关。在小鼠模型中的研究表明：降低Treg活性导致内源抗肿瘤免疫性增加以及通过免疫系统的抗肿瘤干预的功效增强。因此，抑制Treg功能在肿瘤的免疫疗法中是有前景的方案。所述抑制可以通过杀死Treg（耗尽）、干扰它们的抑制剂作用、改变它们的通讯模式或改变它们的分化而实现。
在一组患有CCR4+T细胞白血病/淋巴瘤的患者中，所述肿瘤细胞本身作为Treg细胞，使肿瘤在面对宿主抗肿瘤免疫反应时能够存活。在其它类型的癌症中，MDC和TARC由肿瘤细胞和肿瘤微环境产生，并将CCR4+Treg细胞吸引至肿瘤，在这里它们创造了使肿瘤从宿主免疫反应中逃脱的有利环境。已经报导了在患有以下癌症的病患的外周血中具有更高频率的Treg：乳癌、结肠直肠癌、食管癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和胰腺癌。已经报导Treg细胞为肿瘤创造了一种有利的环境。因此，阻止CCR4和它的配体（如MDC）之间交互作用对治疗或预防癌症、特别是上面列出的癌症是有用的。已经报导：在SCID小鼠模型中，抗人MDC/CCL22抗体能够阻止人Treg细胞渗透至移植的人卵巢肿瘤中。据认为，存在于人实体瘤中的Treg细胞防止免疫效应物反应发展，其可能对减慢肿瘤生长和转移有作用。因此，通过使用抗CCR4的中和MAb（单克隆抗体）杀死肿瘤块中的Treg细胞和/或防止Treg细胞转移至肿瘤位点可以导致针对实体瘤的增强的免疫反应，并作为常规的细胞毒素疗法或抗激素疗法的辅助。
癌症引起大约13%的人类死亡。根据美国癌症协会的资料，在2007年，全世界有七百六十万人死于癌症，因此仍然强烈和迫切地需要更多的抗癌疗法。
CCR4已经显示在炎症和免疫失调中起作用。Th2细胞和嗜碱细胞是在肺和皮肤的过敏性反应中的关键细胞。已经有许多报导描述了表达CCR4的T细胞的存在以及伴随着CCR4配体（MDC、TARC）在过敏原激发的哮喘的支气管活组织切片中的气道上皮细胞上的表达(Panina-Bordignon等，2001)。同样在患有特应性皮炎的病患中发现数量增加的CCR4+T细胞，当疾病转好时，发现CCR4+T细胞显著减少。使用哮喘的人源化SCID小鼠模型，结果显示：在过敏原刺激之前用抗体封闭CCR4减少了过敏性气道炎症以及肺中的Th2细胞因子水平。对于哮喘病患，通过肺递送封闭抗体耗尽CCR4+T细胞可能是合适的治疗选择。对于特应性皮炎，将CCR4封闭抗体靶定递送至皮肤可能也是一种有吸引力的治疗。
在过敏性哮喘中，高水平的过敏原特异的IgE的存在反映了对普通吸入的环境过敏原的异常的Th2细胞免疫反应。哮喘的特点是Th2淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的浸润以及Th2趋化因子的产生。过敏原通过树突细胞（DC）出现在T细胞上，所述树突细胞持续地采样进入的外来抗原。基于通过DC的合适的活化作用，存在于患病气道中的过敏原特异的淋巴细胞生产Th2细胞因子白介素（IL）-4、IL-5和IL-13，它们进一步地控制白细胞溢出、杯状细胞增生和支气管过度反应性（BHR）。由DC产生的TARC和MDC通过引发CCR4诱导了Th2细胞而非Th1细胞的选择性转移（Perros等，2009）。在哮喘的鼠科动物模型中已经显示：在过敏原刺激之后，使用抗TARC抗体的治疗减少了支气管肺泡灌洗（BAL）流体中CD4+T细胞和嗜酸性粒细胞的数量、Th2细胞因子的产生和气道过度反应（Kawasaki等，2001）。相反，缺乏CCR4的小鼠显示了对气道炎症和BHR没有保护作用（Chvatchko等，2000）。使用哮喘的人源化SCID小鼠模型显示：在过敏原刺激之前用抗体封闭CCR4减少了过敏性气道炎症以及降低了肺中Th2细胞因子水平（Perros等，2009）。这些数据显示封闭CCR4对于抑制人类中的过敏性炎症是一种可行的策略。
Treg细胞可以抑制树突细胞（DC），因此推动了疾病（特别是传染病和癌症）的发展和进程。能够阻止Treg细胞对树突细胞的抑制的抗CCR4抗体可能因此用作疫苗中的佐剂，特别是作为肿瘤接种疫苗或抗传染病的疫苗中的佐剂。因此，抗CCR4抗体可以提高疫苗的治疗效果，特别是提高疫苗诱导的免疫反应。
结合CCR4的化合物已经被报导在鼠科过敏性炎症中显示出功效（Purandare等，2007；Burdi等，2007）。已经有报导称CCR4结合化合物在体内具有合理的潜能，因为TARC诱导的CCR4依赖的白细胞补充物募集到腹膜被抑制了差不多90%。Yokoyama和其同事提供了一种靶定CCR4的喹唑啉衍生物，其被证明在体内对减少小鼠模型的超敏反应有作用（Yokoyama等，2008b）；该化合物的一种衍生物被证明是基于经口给药在相似的体内小鼠模型中有作用（Yokoyama等，2009）。最近，一组科学家使用电脑模拟（in silico）建模方法已经鉴定了一些CCR4拮抗剂（Bayry等，2008;Davies等，2009）。通过将化合物引入（docking）至建模的CCR4中，作者发现分子能够在跨膜区域内结合。16种化合物抑制了CCR4介导的CCRF-CEM细胞的转移。当在体内用结核分支杆菌和乙肝疫苗检测CCR4拮抗剂的佐剂功能时，观察到细胞和体液的免疫反应都提高的免疫原性。该观察到的效果归因于Treg活性的抑制（Bayry等，2008；Davies等，2009）。本领域公知：Treg细胞的一种明显部分为CCR4阳性（Baatar等，2007b）。据认为，所述观察到的效果不仅对抗传染性疾病（如，由病毒、细菌、分支杆菌或如原生动物的寄生虫引起）的疫苗有用，对癌症疫苗也有作用。
由于这些化合物作为佐剂功效的原因是基于通过阻止CCR4介导的信号转导抑制Treg，期望以拮抗剂方式结合CCR4的抗体可以以相同的方式起作用；与小分子药物相比的抗体的药理学优势是本领域已知的。由Kyowa-Hakko开发的抗CCR4抗体KW-0761是本领域已知的。但是该抗体仅对ADCC有效；它不阻止经由CCR4受体的配体介导的信号转导。因此，期望本发明描述的抗体在通过Treg调节免疫反应方面有明显优势。
调节Treg对临床有用的另一种应用是癌症治疗。Treg可以抑制肿瘤特异的免疫性，并且在一些癌症中它们的数量增加与不利的预后和疾病进程相关。在小鼠模型中的研究证明降低Treg活性推进了内源抗肿瘤免疫性并增加了积极免疫干涉的功效。因此，抑制Treg作用是在人类癌症免疫疗法中值得考虑的一种策略（Curiel,2008;Ruter等,2009）。该抑制作用可以通过调节Treg或通过直接杀死它们而实现。
该方法的例子在本领域中通过靶定Treg其它表面（如CD25）的化合物而描述。DaclizumabRoche))和巴利昔单抗Novartis)是被批准用于自身免疫疾病、移植和癌症（包括HTLV-1诱导的成人T细胞淋巴瘤/白血病）的抗人CD25抗体（Church，2003）。Denileukin diftitox
Figure BDA00003566730700033
DAB389IL-2;LigandPharmaceuticalsInc.)是一种将白喉毒素的活性区域与人IL-2融合的重组蛋白。在1998年，FDA已经批准将它用于治疗皮肤T细胞白血病/淋巴瘤（Olsen等,2001），其通常是CD4+CD25+。Denileukin diftitox靶定IL-2受体并被提议是通过内吞作用经由CD25而被内在化。同样有证据表明Denileukindiftitox提高了肿瘤疫苗在患有肾细胞癌的病患中的免疫原性（Dannull等,2005）。此外，一份报导显示：denileukin diftitox减少了黑色素瘤中Treg的数量和作用，具有改进的黑色素瘤特异的免疫性（Mahnke等,2007）。
Treg上的用于靶定癌症治疗或提高癌症疫苗效果的其它分子包括GITR（糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关的基因）（Levings等，2002）；Toll样受体（TLR）在多种哺乳动物细胞上随处表达，包括人Treg（Yang等,2004；Rutter等,2009）和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4；CD152）（Sutmuller等，2001）。目前，抗CTLA-4单克隆抗体疗法的II期和III期临床试验在黑色素瘤中进行，I期和II期试验在其它肿瘤类型中进行。两种人单克隆抗体-易普利姆玛(MDX-010;Bristol-Myers Squibb/Medarex)和tremelimumab(CP-675,206;Pfizer)-正在研究中。
在下面的紊乱中同样已经涉及了CCR4：成人T细胞白血病/淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、非特异弥漫性大B细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染、蕈状真菌病(一种成熟的T细胞淋巴瘤)、塞扎里综合征(蕈状真菌病的一种变异)、过敏性支气管肺曲霉病(ABPA)、哮喘、LPS-诱导的内毒素休克、过敏性炎症、T细胞调节的神经变性疾病如多发性硬化(MS)、自身免疫疾病如牛皮癣、卡斯托曼病和风湿性关节炎(RA)。
由于它们复杂的结构，GPCR被认为对于开发特异抗体是“艰难的目标”。它们既不能容易地从溶解细胞的膜片段中纯化，也不能在不同的表达系统中作为正确折叠的可溶性蛋白重组产生。根据发明人的知识，迄今为止，使用噬菌体展示以产生抗GPCR抗体的其它人所有已知的尝试都已经被证明是不成功的。
与产生抗GPCR抗体相关的难点已经在Hoogenboom等，1999中列出。此外，Sui等（2003）解释了与尝试获得抗GPCR趋化因子受体CXCR4人抗体相关的难点，并报导了即使使用结合有逐步后退选择的开创方法，也不能鉴定特异抗体。因此，在GPCR领域，生产特异抗体仍然是一个主要问题。
被称为1G1的鼠单克隆抗体可以从BD Pharmingen中购得，所述1G1与人CCR4反应。该抗体可以用于免疫荧光染色，但该抗体不是中和抗体。
Ishida等在2006公开了一种被指定为KM2760的抗CCR4的嵌合抗体。作者们报导了该抗体不阻止CCR4和它的配体MDC或TARC结合。
本发明人意识到，鉴定识别CCR4的额外的抗体有益于扩大治疗选择的数量。特别是，阻止CCR4与一种或多种它的配体结合的抗体可以提供更多的治疗方法。
本发明人还意识到，发展从免疫学角度更能承受的用于人类治疗的治疗剂是有利的。就这点而言，人抗体通常具有至少三个用于人类治疗应用的潜在优势。第一，所述人免疫系统不会识别该抗体为外来物。第二，在人循环中的半衰期将与天然存在的人类抗体相似，使得可以给予较少和较小频率的剂量。第三，由于效应器部分是人，它将与人免疫系统的其它部分互相作用地更好。
因此，本领域仍然缺少可以在安全和有效治疗具有涉及CCR4的紊乱的病患中应用，包括长期施用的抗CCR4抗体，并且提出开发这样抗体的挑战。
具体地，需要抗CCR4的人抗体。尽管人抗体通常被认为是展示优势，但是本领域已知：开发具有高的足够的亲和力和适当功能性质以使它们成功用于人类治疗的候选物绝不是简单的。由于GPCR的复杂性和跨膜性质，与GPCR相关的例子更是如此。
仍然强烈地需要可以阻止CCR4与一种或多种它的配体（如MDC和/或TARC）结合的抗CCR4抗体。
发明内容
本发明克服现有技术的一些局限，提供用于安全或有效治疗肿瘤、病毒感染和涉及CCR4+细胞的其它疾病和状况（如炎症或免疫紊乱）的新的治疗组合物和方法。本发明基于结合CCR4的抗体，更优选地结合CCR4的胞外域内的表位的抗体，更具体地是人抗体。这样的抗体有效治疗肿瘤和病毒感染以及涉及CCR4+细胞的其它疾病和状况，如炎症或免疫紊乱。本发明的组合物和方法同样扩展至使用该具体种类抗体的免疫交联物和组合物的应用。
本发明的一种具体的优势是提供的抗体能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合。这与临床领域的主要抗体形成对比，这些主要抗体不抑制MDC和/或TARC与CCR4结合。
本申请发明人已经制备了结合CCR4的CCR4特异抗体。例如，所述抗体结合CCR4+细胞，具体地，所述CCR4+细胞是转染CCR4的HEK293T细胞、转染CCR4的DT40细胞和天然表达CCR4的CCRF-CEM细胞，以及表达CCR4的以下细胞：Hut78（皮肤T细胞淋巴瘤，ATCC号T1B-161）、786-O（人肾细胞癌，ATCC号CRL-1932）、MCF-7（人乳腺腺癌，ATCC号HTB-22）、KatoIII（人胃癌，ATCC号HTB-103）、L-428细胞（非霍奇金淋巴瘤，DSMZ号ACC197）和A-498（人肾细胞癌，DSMZ号ACC55）（见实施例2）。重要地，所述抗体不明显地结合CCR4-细胞，即不表达CCR4的细胞。因此，本发明公开的抗体特异地结合CCR4，使它们成为诊断和治疗本文讨论的状况的合适候选物。
与CCR4的胞外域中的表位、包括互补决定区（CDR）的它们的VH和VL域结合的本发明的优选抗体分子的氨基酸和/或DNA序列在本文列出的多个SEQ ID NO.中展示。
因此，本发明提供一种与CCR4结合并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的抗体。优选地，所述抗体是分离抗体。同样优选地，所述抗体是人抗体。优选地，所述抗体结合CCR4的胞外域中的表位。所述CCR4优选是人CCR4。因此，任何涉及“结合CCR4”包括“结合CCR4的胞外域中的表位”的优选实施方式。
因此，本发明优选地提供一种分离的人抗体，所述人抗体结合人CCR4的胞外域中的表位并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合。
在一种实施方式中，本发明提供一种能够结合CCR4并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的抗体，所述抗体包括至少一个重链CDR，所述重链CDR包括一条本文公开的表中所列出的重链CDR序列，和/或至少一个轻链CDR，所述轻链CDR包括一条本文公开的表中所列出的轻链CDR序列。优选地，所述抗体包括至少2个或3个重链和/或轻链CDR，每一个包括本文公开的表中列出的相应序列。
在一种实施方式中，本发明的抗体包括一个或多个，例如，至少2、3、4或5个，优选6个CDR，所述CDR选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；或者1、2、3、17、5和6；或者1、2、20、22、5和24；或者26、27、20、22、5、24；或者与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列。
在一种实施方式中，所述抗体包括SEQ ID NO:1或26的重链CDR1，SEQ ID NO:2或27的重链CDR2和SEQ ID NO:3或20的重链CDR3，或与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列，和/或SEQ ID NO:4、17或22的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和/或SEQID NO:6或24的轻链CDR3，或与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列。
因此，在一种实施方式中，所述抗体包括SEQ ID NO:26的重链CDR1、SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ ID NO:20的重链CDR3。优选地，所述抗体还包括选自本文所列出的序列的轻链CDR。
在一种实施方式中，本文公开的任何抗体的重链CDR1具有序列SYAXS，其中X可以是任何氨基酸(SEQ ID NO:119)，优选地是M或I(SEQ ID NO:120)；和/或本文公开的任何抗体的重链CDR2具有序列GIIPIFGTXNYAQKFQG，其中X可以是任何氨基酸(SEQ IDNO:121)，优选地是V、I或A(SEQ ID NO:122)；和/或本文公开的任何抗体的重链CDR3具有序列RX1GX2X3FDY，其中每一X可以独立地是任何氨基酸(SEQ ID NO:123)，优选地X1是R或G，和/或X2是S或A，和/或X3是Y或K，最优选地X1是R或G，和X2是S或A，和X3是Y或K(SEQ ID NO:124)；和/或本文公开的任何抗体的轻链CDR1具有序列SGSTSNIGSHYVX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:125)，优选地是F、S或V(SEQID NO:126)；和/或本文公开的任何抗体的轻链CDR2具有SEQ ID NO:5的序列；和/或本文公开的任何抗体的轻链CDR3具有序列AVWDXXXXGWV，其中每一X可以独立地是任何氨基酸(SEQ ID NO:127)，优选地X1是A或D，和/或X2是K或T，和/或X3是Y或L，和/或X4是R或S，更优选地，X1是A或D，以及X2是K或T，以及X3是Y或L，以及X4是R或S(SEQ ID NO:128)。
这对本文公开的VH、VL、scFV和IgG序列已做必要修正。因此，本文公开的包括CDR序列的任何序列优选地包括SEQ ID NO:119～128中的一条或多条，来取代表1～9中所列出的对应CDR序列。
在一种特别优选的实施方式中，所述抗体包括SEQ ID NO:1的重链CDR1，SEQ IDNO:2的重链CDR2和SEQ ID NO:3或20的重链CDR3。优选地，所述抗体还包括SEQ IDNO:4、17或22的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和/或SEQ ID NO:6或24的轻链CDR3，或与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列。
在一种实施方式中，所述抗体包括SEQ ID NO:26的重链CDR1，SEQ ID NO:27的重链CDR2和SEQ ID NO:20的重链CDR3。优选地，所述抗体还包括SEQ ID NO:4、17或22的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和/或SEQ ID NO:6或24的轻链CDR3，或与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列。
在一种实施方式中，所述抗体包括SEQ ID NO:4、17或22的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6或24的轻链CDR3。优选地，所述抗体还包括SEQ ID NO:1或26的重链CDR1，SEQ ID NO:2或27的重链CDR2和/或SEQ ID NO:3或20的重链CDR3，或与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列。
在一种实施方式中，所述抗体包括SEQ ID NO:4或17的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR3。优选地，所述抗体还包括SEQ ID NO:1或26的重链CDR1，SEQ ID NO:2或27的重链CDR2和/或SEQ ID NO:3或20的重链CDR3，或与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列。
在一种实施方式中，所述抗体包括SEQ ID NO:22的轻链CDR1，SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:24的轻链CDR3。优选地，所述抗体还包括SEQ ID NO:1或26的重链CDR1，SEQ ID NO:2或27的重链CDR2和/或SEQ ID NO:3或20的重链CDR3，或与上述任意SEQ ID NO基本同源的序列。
一些特别优选的抗体包括SEQ ID NO:1的重链CDR1域，SEQ ID NO:2的重链CDR2域和SEQ ID NO:3的重链CDR3域；并包括SEQ ID NO:4的轻链CDR1域，SEQ ID NO:5的轻链CDR2域和SEQ ID NO:6的轻链CDR3域。
一些特别优选的抗体包括SEQ ID NO:1的重链CDR1域，SEQ ID NO:2的重链CDR2域和SEQ ID NO:3的重链CDR3域；并包括SEQ ID NO:17的轻链CDR1域，SEQ ID NO:5的轻链CDR2域和SEQ ID NO:6的轻链CDR3域。
一些特别优选的抗体包括SEQ ID NO:1的重链CDR1域，SEQ ID NO:2的重链CDR2域和SEQ ID NO:20的重链CDR3域；并包括SEQ ID NO:22的轻链CDR1域，SEQ ID NO:5的轻链CDR2域和SEQ ID NO:24的轻链CDR3域。
一些特别优选的抗体包括SEQ ID NO:26的重链CDR1域，SEQ ID NO:27的重链CDR2域和SEQ ID NO:20的重链CDR3域；并包括SEQ ID NO:22的轻链CDR1域，SEQ ID NO:5的轻链CDR2域和SEQ ID NO:24的轻链CDR3域。
在另一种实施方式中，本发明提供一种抗体，所述抗体结合CCR4并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4的结合，且所述抗体包括至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
（i）具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变重链（VH）CDR1；
（ii）具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH CDR2；和
（iii）具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
所述轻链可变区包括：
（i）具有SEQ ID NO:4、17或22，优选地SEQ ID NO:4或17的氨基酸序列的VL CDR1；
（ii）具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL CDR2；和
（iii）具有SEQ ID NO:6或24，优选地SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一种实施方式中，本发明提供一种抗体，所述抗体结合CCR4并能够抑制MDC与CCR4的结合，且所述抗体包括至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
（i）具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变重链（VH）CDR1；
（ii）具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH CDR2；和
（iii）具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
所述轻链可变区包括：
（i）具有SEQ ID NO:4、17或22，优选地SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL CDR1；
（ii）具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL CDR2；和
（iii）具有SEQ ID NO:6或24，优选地SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一种实施方式中，本发明提供一种抗体，所述抗体结合CCR4并能够抑制MDC与CCR4的结合，且所述抗体包括至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
（i）具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的可变重链（VH）CDR1；
（ii）具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH CDR2；和
（iii）具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR3；和/或
所述轻链可变区包括：
（i）具有SEQ ID NO:4、17和22，优选地SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL CDR1；
（ii）具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL CDR2；和
（iii）具有SEQ ID NO:6或24，优选地SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL CDR3。
本发明的一些优选实施方式提供了一种结合CCR4并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的抗体，所述抗体包括具有SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39、41、43或45的氨基酸序列或与上述序列基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO:30、32、34、36、38、40、42、44或46的氨基酸序列或与上述序列基本同源的序列的VL域。
优选地，所述VH域具有3个重链CDR和/或所述VL域具有3个轻链CDR。更优选地，至少1个、至少2个、优选地3个轻链CDR序列选自本文公开的轻链CDR序列和/或至少1个、至少2个、优选地3个重链CDR序列选自本文公开的重链CDR序列。
因此，在一种实施方式中，所述VH域具有SEQ ID NO:29、31、33或35的序列或与上述序列基本同源的序列并包括SEQ ID NO:1的重链CDR1域、SEQ ID NO:2的重链CDR2域和SEQ ID NO:3的重链CDR3域。
在一种实施方式中，所述VH域具有SEQ ID NO:37、39、41或43的序列或与上述序列基本同源的序列并包括SEQ ID NO:1的重链CDR1域、SEQ ID NO:2的重链CDR2域和SEQ ID NO:20的重链CDR3域。
在一种实施方式中，所述VH域具有SEQ ID NO:45的序列或与该序列基本同源的序列并包括SEQ ID NO:26的重链CDR1域、SEQ ID NO:27的重链CDR2域和SEQ ID NO:20的重链CDR3域。
在一种实施方式中，所述VL域具有SEQ ID NO:30或34的序列或与上述序列基本同源的序列并包括SEQ ID NO:4的轻链CDR1域、SEQ ID NO:5的轻链CDR2域和SEQ IDNO:6的轻链CDR3域。
在一种实施方式中，所述VL域具有SEQ ID NO:32或36的序列或与上述序列基本同源的序列并包括SEQ ID NO:17的轻链CDR1域、SEQ ID NO:5的轻链CDR2域和SEQ IDNO:6的轻链CDR3域。
在一种实施方式中，所述VL域具有SEQ ID NO:38、40、42、44或46的序列或与上述序列基本同源的序列并包括SEQ ID NO:22的轻链CDR1域、SEQ ID NO:5的轻链CDR2域和SEQ ID NO:24的轻链CDR3域。
所述抗体可以具有本文讨论的VL和VH序列的任意组合。以下组合是优选的：
具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:30的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:32的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:34的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:36的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:38的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:40的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:42的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:44的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VH域和具有SEQID NO:46的氨基酸序列或与所述序列基本同源的序列的VL域。
在另一种实施方式中，本发明提供一种结合CCR4并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的抗体，所述抗体包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:47（在本文中所述抗体也被指定为208scFv）、SEQ ID NO:48（在本文中所述抗体也被指定为306scFv）、SEQ ID NO:49（在本文中所述抗体也被指定为308scFv）、SEQ ID NO:50（在本文中所述抗体也被指定为406scFv）、SEQ ID NO:51（在本文中所述抗体也被指定为501scFv）、SEQ ID NO:52（在本文中所述抗体也被指定为503scFv）、SEQ ID NO:53（在本文中所述抗体也被指定为601scFv）、SEQ ID NO:54（在本文中所述抗体也被指定为603scFv）或者SEQ IDNO:55（在本文中所述抗体也被指定为803scFv），或者包括结合CCR4并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的任何抗体的片段，或者与上述任意序列基本同源的序列。
本发明通过单克隆抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803例示，它们的单链形式在表1、2、3、4、5、6、7、8和9中示出（SEQ ID NO分别为:47、48、49、50、51、21、53、54和55）。已经制备了抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803的全长IgG形式，它们的序列分别在表10-18中示出。208、306、308、406、501、503、601、603和803抗体的CDR域、VH和VL域在表1～9中示出。包括这些CDR域和/或VH域和/或VL域（或与其基本同源的序列）的抗体是本发明的优选方面。
本发明的一个优选实施方案是scFv形式的208抗体，包括SEQ ID NO:47或由SEQ IDNO:47组成，优选地由SEQ ID NO:56编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的306抗体，包括SEQ ID NO:48或由SEQ ID NO:48组成，优选地由SEQ ID NO:57编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的308抗体，包括SEQ ID NO:49或由SEQ IDNO:49组成，优选地由SEQ ID NO:58编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的406抗体，包括SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成，优选地由SEQ ID NO:59编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的501抗体，包括SEQ ID NO:51或由SEQ IDNO:51组成，优选地由SEQ ID NO:60编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的503抗体，包括SEQ ID NO:52或由SEQ ID NO:52组成，优选地由SEQ ID NO:61编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的601抗体，包括SEQ ID NO:53或由SEQ IDNO:53组成，优选地由SEQ ID NO:62编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的603抗体，包括SEQ ID NO:54或由SEQ ID NO:54组成，优选地由SEQ ID NO:63编码。本发明的另一个优选实施方案是scFv形式的803抗体，包括SEQ ID NO:55或由SEQ IDNO:55组成，优选地由SEQ ID NO:64编码。
其它优选的实施方案是208、306、308、406、501、503、601、603和803抗体的IgG形式，优选地全长IgG形式。任意一个这些抗体的IgG1形式是最优选的。
因此，本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:67（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:68（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ ID NO:65编码的重链和/或由SEQ ID NO:66编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:71（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:72（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ IDNO:69编码的重链和/或由SEQ ID NO:70编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:75（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:76（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ IDNO:73编码的重链和/或由SEQ ID NO:74编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:79（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:80（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ IDNO:77编码的重链和/或由SEQ ID NO:78编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:83（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:84（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ IDNO:81编码的重链和/或由SEQ ID NO:82编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:87（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:88（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ IDNO:85编码的重链和/或由SEQ ID NO:86编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:91（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:92（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ IDNO:89编码的重链和/或由SEQ ID NO:90编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:95（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:96（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQ IDNO:93编码的重链和/或由SEQ ID NO:94编码的轻链。
本发明的另一个优选的实施方案是一种全长IgG抗体，包括SEQ ID NO:99（氨基酸）的重链和/或SEQ ID NO:100（氨基酸）的轻链。同样优选的是一种IgG抗体，包括由SEQID NO:97编码的重链和/或由SEQ ID NO:98编码的轻链。
应当理解，所述全长IgG抗体将包括两条基本一样的重链和两条基本一样的轻链。
可以相信，本发明的抗体可以结合与已知的抗CCR4抗体家族结合的表位不同的表位，所述抗CCR4抗体家族包括KM2160、KM3060、KM2760和KW-0761。抗体KM2160是鼠抗体，抗CCR4的肽片段，识别在人CCR4的N-末端氨基酸的2-29位的区域中存在的表位（EP1270595）。KM2760是具有相同结合性质的嵌合形式的抗体（EP1270595）。抗体KM3060与KM2760一样，除了它是高度岩藻糖化的（Niwa等，2004,Cancer Research64,2127-2133）。KW-0761是KM2760的人源化形式（Ishida等，Annals of Oncology2008,第19卷,supplement4,513）。
已经报导KM2760不阻止CCR4和TARC或MDC的交互作用(Ishida等，2006,CancerResearch66(11),5716-5722页)，这与本发明人使用等效的抗体KM3060var（与KM3060相应，但是潜在地具有不同的糖性质，因为它是在不同的宿主中表达）所得到的发现一致。相反，发现本发明的抗体能够阻止CCR4与MDC的交互作用和CCR4与TARC的交互作用（见实施例3）。这强烈地暗示了本发明的抗体与现有技术的包括KM2160、KM3060、KM2760和KW-0761的家族相比结合不同的表位。
此外，发现抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803对于结合CCR4彼此竞争，表示它们结合相同、相似或至少重叠的表位。对结合CCR4，这些抗体与KM-0761都不竞争，表明KM-0761结合不同的表位（实施例4）。
同样相信，本发明的抗体可以结合与商业可获得的抗CCR4抗体1G1识别的表位不同的表位。BD Pharmingen将该抗体在技术数据表上阐述清楚，该抗体不是中和抗体。相反，本发明的抗体能够阻止MDC和/或TARC与CCR4结合。这强烈地暗示本发明的抗体与1G1抗体结合不同的表位。
基本同源序列的一些例子是与公开的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的序列。在一些实施方式中，结合CCR4并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的本发明的抗体包括至少一个轻链可变区和/或至少一个重链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:30、32、34、36、38、40、42、44或46的氨基酸序列有至少大约70%、75%、80%或85%，更优选地至少大约90%，更优选地至少大约95%、更优选地至少大约96%、97%或98%以及最优选地至少99%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39、41、43或45的氨基酸序列区。
在一些实施方式中，结合CCR4并能够抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的本发明的抗体包括至少一个重链可变区和/或至少一个轻链可变区，所述重链可变区包括与SEQ IDNO:29、31、33、35、37、39、41、43或45的氨基酸序列有至少大约70%、75%、80%或85%，更优选地至少大约90%，更优选地至少大约95%、更优选地至少大约96%、97%或98%以及最优选地至少99%的氨基酸序列一致性的氨基酸序列区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:30、32、34、36、38、40、42、44或46的氨基酸序列区。
基本同源序列的其它优选的例子是在公开的氨基酸序列中包含保守氨基酸取代的序列。优选地，所述基本同源序列包含在整个VH域不超过30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸和/或整个VL域不超过30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸。在一些实施方式中，任何这样的改变的氨基酸（如果存在）仅在框架区中发现。
在一些实施方式中，所述基本同源序列包含在公开的一个或多个或每一个FR区中不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸。因此，优选地，所述基本同源序列包含在本文公开的重链FR1、重链FR2、重链FR3、重链FR4、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和/或轻链FR4中的不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸。
包含轻链FR1的本文公开的任何一条序列的一种优选的基本同源序列是这样的序列：所述轻链FR1的位置1处的氨基酸（丝氨酸）被另一种氨基酸，优选地谷氨酰胺（Q）取代和/或所述轻链FR1的位置2处的氨基酸（酪氨酸）被另一种氨基酸，优选地丝氨酸（S）取代。因此，与SEQ ID NO:12、21或25基本同源的优选序列优选地具有这些取代中的一种或多种、优选地两种，因此，它们最优选地由氨基酸QS取代SY起始。包含SEQ ID NO:12、21或25的任何序列同样优选地具有一种或两种这些取代。因此，与SEQ ID NO:30、32、34、36、38、40、42、44或46、47-55、67、71、75、79、83、87、91、95或99基本同源的优选序列以另一种氨基酸、优选地Q取代FR1的位置1处的S和/或以另一种氨基酸、优选地S取代FR1的位置2处的Y。因此，SEQ ID NO:12的一种优选的同源物是X1X2VLTQPPSASGTPGQSVTISC，其中每一个X可以独立地是任何氨基酸（SEQ ID NO:129），优选地，X1是Q，和/或X2是S（SEQ ID NO:130）。SEQ ID NO:21的一种优选的同源物是X1X2VLTQQPSASGTPGQSVTISC，其中每一个X可以独立地是任何氨基酸（SEQ IDNO:131），优选地X1是Q，和/或X2是S（SEQ ID NO:132）。
这已做必要修正应用于本文公开的VL、scFv和IgG序列。因此，本文公开的包括FR1序列的任何一条序列优选地包括SEQ ID NO129-132中的一条或多条来取代表1-9中列出的对应的FR1序列。
基本同源序列的其它优选例子是在本文公开的一个或多个CDR区域中包含达到1、2、3或4个，优选地达到1或2个改变的氨基酸的序列。
在所有的这些实施方式中，这样的改变可以是保守或非保守氨基酸取代，或它们的组合，优选的改变是保守氨基酸取代。因此，在一种实施方式中，所有改变的氨基酸是保守取代。
本文中使用的“保守氨基酸取代”是指所述氨基酸残基被具有相似侧链的另一种氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（如天冬氨酸、谷氨酸）、无电荷的极性侧链（如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β-分支侧链（如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芬芳侧链（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。
可以用任何合适的方法评估同源性。但是，对于确定序列之间的同源性程度，使序列进行多重比对的计算机程序（如Clustal W，（Thompson等,1994））是有用的。如果需要，所述Clustal W运算法则可以与BLOSUM62得分矩阵（Henikoff和Henikoff,1992）和10分的缺口打开处罚和0.1分的缺口延伸处罚一起使用，使得在两条序列之间获得最高的顺序匹配，其中，所述比对包括一条序列的至少50%的总长度。可以用于比对序列的其它方法是Needleman和Wunsch(1970)提出的比对方法，并由Smith和Waterman(1981)修订，使得在两条序列之间获得最高的顺序匹配并确定两条序列之间相同氨基酸的数量。计算两条氨基酸序列之间百分比一致性的其它方法是本领域公认的，包括例如Carillo和Lipton(1988)描述的那些，和在Computational Molecular Biology,Lesk,e.d.牛津大学出版社（纽约,1988）Biocomputing:Informatics and Genomics Projects中所描述的那些。
通常，计算机程序可以用于这样的计算。比较和比对序列对的程序，如ALIGN(Myers和Miller,1988)、FASTA(Pearson和Lipman,1988;Pearson,1990)和缺口的（gapped）BLAST(Altschul等,1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux等,1984)也可以用于这个目的。此外，欧洲生物信息研究所的Dali服务器提供基于结构的蛋白序列比对（Holm,1993;1995;1998）。
通过提供参考点，可以使用具有默认参数（如在GENESTREAM网络服务器，IGH，蒙彼利埃，法国的互联网上可以利用的）的ALIGN程序测定根据本发明的具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或序列一致性等的序列。
术语“基本同源”同样包括本发明的氨基酸序列和核苷酸序列的变异体或化学等价物，所述变异体或化学等价物以基本相同的方式实现与本发明的蛋白或核酸分子基本相同的功能。
任何基本同源的抗体应当保持特异结合CCR4的能力，优选地保持结合由所讨论的抗体识别的相同表位（例如，由本文公开的本发明的CDR域或本发明的VH和VL域识别的相同表位或抗原）的能力。通过本领域公知和描述的方法，如使用表位绘制或结合分析（如竞争分析、ELISA分析或BIAcore分析）可以容易地检测与相同表位/抗原的结合。因此，本领域技术人员将意识到，所述结合分析可以用于鉴定与抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803分别具有相同结合特异性的其它抗体或抗体片段。如下面所例举的，竞争结合分析可以用于鉴定这样的其它抗体。下面描述的方法仅是合适的竞争分析的一个例子。本领域技术人员将知道其它方法和变化。
优选地，任何基本同源抗体需要保持如在本文其它地方所定义的抗体功能性能力。可以通过本领域公知和描述的方法容易地检测功能性质的保持力。
在一些实施方式中，与本文公开的序列相比，所述基本同源序列缺失一种或多种以下位点：
—易受转译后修饰（如去酰胺化作用和/或糖基化）的序列；
—易受蛋白水解消化的序列；和/或
—能够结合人MHC II类受体，如T细胞表位的序列。
可以使用例如电脑模拟测试检测所述抗体序列对转译后修饰（如去酰胺化作用、糖基化）、蛋白水解消化和/或与人MHC II类受体的结合的敏感性。与人MHC II类受体结合能够在人体中引起T细胞反应，因此它可以用于鉴定潜在的T细胞表位。被鉴定为对转译后修饰、蛋白水解消化或假定的T细胞表位敏感的推定位点的氨基酸或肽序列然后可以被修饰以改变它们的敏感性。因此，所述基本同源序列可以包含一种或多种这样的修饰。
用于T细胞表位的电脑模拟测试例如可以包括定义为iTOPETM（Antitope，剑桥，英国）的程序。iTOPETM是一种分子模拟技术，其模拟肽与34MHC II类等位基因结合。可以对每一个等位基因测定个别氨基酸对肽结合的贡献，并且这提供了与MHC II类结合沟相互作用的中心9mer序列的精确位置的信息。
可选地或另外地，可以使用TCED（T细胞表位数据库）程序（Antitope，剑桥，英国）分析序列，它鉴定了抗体可变区中的T细胞表位且还可以被BLAST检索询问以鉴定共同基序。
可以使用标准技术实施表位绘制。例如，本文提到了用于鉴定和定义表位的以下方法。CCR4的氨基酸序列是已知的，因此，例如使用Pepscan分析，合成肽可以用于表位绘制。定点突变也是表位绘制的有力工具，并可以用于评估单个氨基酸在免疫复合体形成中的作用。蛋白质足迹法依赖于这样的事实：当表位结合为抗体-抗原复合体时，所述表位被保护以免于分解。酶联免疫吸附测定（ELISA）和凝集实验和狭线印迹法可以用于表位绘制。抗原和抗体的结晶可以用于绘制非线性表位。用于实现这样方法的方案是广泛可用的，并且本领域技术人员将知道表位绘制的合适的可选择的方法。
在使用流式细胞仪进行竞争分析之前，需要例如通过生物素化标记一定量的被测抗体。测量生物素化的产物的功能性（细胞结合的性质的保持力）和针对固定数量的CCR4+细胞提供次于最大量结合水平的本发明的生物素化的抗体（Ab1）的最小浓度。从指数生长培养物中收获总共106个细胞，并将这些细胞与多种抗体浓度在合适的温度下孵育合适的时间期间，例如在4℃下孵育1小时。清洗这些细胞并将细胞与合适的检测抗体在合适的温度下孵育合适的时间期间，例如在4℃下另孵育1小时。清洗之后，通过流式细胞仪分析细胞。对于每一种检测的抗体，利用通过绘制针对抗体浓度的中值荧光强度（MFI）的数据生成饱和曲线。
对于竞争分析，可以如上述制备CCR4+细胞并用固定浓度的标记（生物素化的）抗体（bio-Ab1）和逐渐增加浓度的非标记的竞争性抗体的混合物一式两份处理CCR4+细胞。所述固定浓度是如上测定的对固定数量的肿瘤细胞产生合理的荧光信号的抗体最小浓度。理想地，所述以nM计的固定浓度应当低于平衡状态时（KD）处理抗体的亲和力。在这种情况下，上述方法可以用于估计竞争性抗体的亲和力（Schodin和Kranz，1993，J Biol Chem268:25755-7）。在合适温度下将所述抗体混合物与靶细胞孵育合适的时间，如4℃下1小时。清洗所述细胞并通过与FITC标记的链亲和素孵育来显示生物素化的抗体的细胞结合。从对于每一个测试样品（bio-Ab1+Ab2）读取的中值荧光值中减去背景荧光（PBS-5%FCS）后，根据以下公式计算每一个Ab2浓度“c”的百分比抑制：
%抑制=(1-MFI bio-Ab1+Ab2"c"/MFI bio-Ab1)×100。
在所有的实施方式中，包含基本同源序列的抗体保持结合CCR4的能力和抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的能力。
本发明的其它实施方式提供结合蛋白，所述结合蛋白结合CCR4且具有抑制MDC和/或TARC与CCR4结合的能力且包括本发明的抗体、本发明的VH或VL域、或本发明的一个或多个CDR。在一种优选的实施方式中，这样的结合蛋白是抗体。
本发明的优选的抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区。这些CDR的例示的和优选的序列在本文中描述。
如本文中所使用的，除非有其它明确的说明或以科学术语解释，简写术语“CCR4”意味着CC趋化因子受体4（也被认为是CD194）。CCR4可以是自由CCR4，如重组或纯化的CCR4，但优选地，它以自然形式存在，如位于细胞表面上。
本发明的抗体或结合蛋白也可以结合CCR4的片段，特别是包括胞外域或由胞外域组成的片段，或可以结合包括CCR4或CCR4片段的实体。当然，本发明的抗体的表位位于CCR4的胞外域中。
“CCR4”也可以指任何形式的CCR4，具体是由于CCR4在哺乳动物种类中保守。因此，本发明的抗体或抗体片段可以结合例如人、猴子（如食蟹猴）、母牛（牛）、小鼠、大鼠、仓鼠、雪貂、豚鼠和/或兔的CCR4。优选地，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人CCR4。因此，除非另有说明，本文中任何涉及“CCR4”可以被认为是“人CCR4”。在一些优选的实施方式中，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人和猴子（如食蟹猴）CCR4。在其它优选的实施方式中，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人和小鼠CCR4。在其它优选的实施方式中，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人、猴子和小鼠CCR4。在其它优选的实施方式中，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人、猴子、豚鼠和小鼠CCR4。在一些优选的实施方式中，本发明的抗体或抗体片段将至少结合人和猴子CCR4，但不结合鼠CCR4。在其它优选的实施方式中，本发明的抗体或抗体片段将结合人和猴子CCR4，但不结合鼠CCR4，如，仅结合人和猴子CCR4。
这些实施例已经显示了本发明的抗体能够结合人和猴子CCR4，且它们同样具有结合鼠CCR4的能力。
如本文中所使用的，在本发明的抗体或抗体片段的内容中的术语“结合CCR4”或“抗CCR4”意味着能够实施以下一种或多种、优选地以下多于一种、以及最优选地以下全部情形的抗体或抗体片段：
（a）结合在细胞表面上表达的CCR4，如通过流式细胞术或免疫组织化学法所确定的；
（b）结合构象依赖的（如非线性的）CCR4表位，如通过在非还原条件下在蛋白质印迹中结合CCR4所确定的；
（c）结合固相基质上的自由CCR4，如重组表达的CCR4，如通过ELISA分析或BIAcore分析所确定的；
（d）至少结合人CCR4，更优选地结合人和猴子CCR4或结合人和小鼠CCR4，最优选地结合人、猴子和小鼠CCR4或结合人和猴子CCR4而不结合小鼠CCR4；
（e）如在本文其它地方所讨论的以10nM或更少、优选地5nM或更少、更优选地3nM或更少或2nM或更少、最优选地1nM或更少的结合亲和力（Kd）结合人CCR4；
（f）如在本文其它地方所讨论的以相似的亲和力，如以10nM或更少、优选地5nM或更少、更优选地3nM或更少或2nM或更少、如1nM或更少的Kd结合人和猴子CCR4或结合人和小鼠CCR4，优选地结合人和猴子CCR4而不结合小鼠CCR4；
（g）如在本文其它地方描述的诱导CCR4+细胞的ADCC；
（h）抑制CCR4与至少MDC和/或TARC、优选地MDC和TARC、或优选地至少MDC和/或TARC和选自RANTES、MCP-1和MIP-1α中的一个或多个的结合；
（i）诱导体内抗肿瘤效果；
（j）当对患有肿瘤的动物给药时定位于肿瘤；
（k）诱导CCR4+细胞的CDC；
（l）抑制对CCR4配体的CCR4介导的细胞应答，优选地，抑制对CCR4配体的应答中胞内钙离子浓度的增加；
（m）抑制CCR4+细胞对CCR4配体如MDC和/或TARC的趋化作用。
在结合CCR4+细胞的内容中，应当理解，本发明的抗体结合CCR4+细胞且不明显地结合CCR4-细胞（如在实施例2中所显示的）。
术语“不明显地结合CCR4-细胞”应当被理解为所述抗体与CCR4-细胞的任何结合都不阻止所述抗体出于治疗或诊断目的的应用。因此，“不明显”结合CCR4-细胞意味着所述抗体与CCR4-细胞的结合比它与一种或多种CCR4+细胞的结合弱。因此可能与正常细胞发生一些交叉反应，但是该结合水平可以被认为是“背景”结合。出于治疗或诊断的目的，主要的考虑是所述抗体与一种或多种类型的CCR4+细胞的结合必须比与任何CCR4-细胞的结合更强，在治疗或诊断应用中，所述抗体可能与CCR4-细胞接触。
本发明的抗体可以被指定为“CCR4特异的”。所述术语“CCR特异的”应当被解释为所述抗体与表达CCR4的细胞的结合是足够特异的以使得所述抗体用于治疗或诊断目的。本领域技术人员可以容易地通过比较与靶定CCR4+细胞的结合力和与一种或多种类型的CCR4-细胞（如野生型、即未转染CCR4的HEK293T细胞或DT40细胞）的结合力以确定任何给定的抗体是否是CCR4特异的。
本领域技术人员将知道如使用流式细胞术评估与CCR4+细胞的结合相比较于与CCR4-细胞的结合，且实施例2中描述了一种合适的实施例。
本领域公知的免疫组织化学技术将被用于评价抗体与细胞或样品的结合。这样的分析将被用于检测具体抗体的特异性，或检测组织样品中CCR4表达。简要地，所述抗体可以例如在包括阳性对照（已知是CCR4阳性的细胞）和阴性对照（已知是CCR4阴性的细胞）的人组织的高密度阵列上被检测。可以通过四步等级（0、1、2、3）的视觉检查评估膜染色强度。优选的抗体对CCR4+组织显示弱的或强的免疫组织化学得分，优选地为强的免疫组织化学得分。
所述实施例显示，在存在逐渐增加浓度的人血清时，抗CCR4抗体与CCR4阳性细胞系CCRF-CEM的结合不被抑制。因此，当存在血清时，本发明的抗体能够优选地结合CCR4，它们的结合不被血清明显抑制。
在实施例2中检测的本发明的抗CCR4抗体与不同CCR4+细胞系的结合概图显示与其它CCR4+细胞系相比，与一些CCR4+细胞系的增加的结合。例如，与CCRF-CEM相比，与L-428的结合减少。不期望被理论限制，相信这是由于L-428分泌CCR4配体TARC，且本发明的抗CCR4抗体与所述配体竞争CCR4结合位点（见实施例3）。因此，最好使用不分泌CCR4配体的细胞分析与CCR4的结合。
本发明的抗CCR4抗体的结合概图与KW0761的结合概图不同。不期望被理论限制，相信这是由于这些抗体的不同表位结合位点（如在实施例4中概述的）。KW0761并不阻止CCR4和TARC的结合，因此，它不与L-428分泌的TARC竞争。
此外，测定EC50值（数据没有显示）在不同细胞系中具有不同值，这被认为是由于在不同细胞类型的表面上CCR4表达的差异。
可以使用已知方法分析物种交叉反应性，所述方法例如通过使用分别转染有人CCR4和来自于另一物种的CCR4的细胞的流式细胞术。实施例8中描述了一种合适的分析，其显示了本发明的抗体能够结合人、猴子和鼠的CCR4。
已经显示抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803能够抑制CCR4和它的配体TARC和MDC的结合（实施例3）。因此，优选地，本发明的抗体能够抑制CCR4与一种或多种它的配体结合。优选地，至少抑制与MDC的结合。更优选地，抑制与MDC和TARC的结合。在一些实施方式中，抑制CCR4与TARC的结合。在本文公开的任何方面的实施方式中，本发明的抗体能够抑制MDC和/或TARC与CCR4的结合。
“抑制配体与CCR4的结合”意思是与不存在所述抗体时的结合相比，存在所述抗体时，配体与CCR4的结合减少了至少20%、30%或40%，更优选地至少45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%，甚至更优选地至少80%。同样期望配体与CCR4的结合减少了至少85%、90%或95%的实施方式。换一种方式看，当所述配体首先与CCR4接触，随后添加所述抗体时，所述配体可以抑制抗体与CCR4结合。
确定抗体是否可以抑制配体与CCR4结合的分析是公知的，并且在实施例3中描述了一种合适的分析。简要地，CCR4+细胞与或不与Alexa647标记的MDC-SNAP孵育，然后加入抗体。当存在MDC复合体时，预孵育导致抗体结合CCR4减少。具体地，抑制了抗体与用MDC（或合适的MDC复合体）预孵育的CCRF-CEM细胞（天然表达CCR4）的结合。
用于确定抗体是否能够阻止配体与CCR4结合的可选择的分析包括使用标记的配体，如放射性同位素标记的配体或生物素化的配体，以及用流式细胞术分析。
关于MDC，应当注意，该制剂能够以高的亲和力结合除了CCR4的至少一种GPCR受体。例如，已经报道MDC结合GPCR受体D6（Graham2009;Locati等2005），并且这可能影响结合分析的结果。
本发明的抗体优选地能够抑制对CCR4配体的CCR4介导的细胞反应，具体地，通过抑制响应CCR4配体的胞内钙离子浓度的增加。
具体地，所述抗体优选地能够抑制CCRF-CEM细胞（ATCC CCL-119）中MDC诱导的钙离子流和/或TARC诱导的钙离子流。合适的分析方法是已知的，且实施例5中公开了一个实例。
其它优选的性质包括当施用本发明的抗体时在体内不存在有意义的毒性且在体内不存在明显的其它副作用。
在一些实施方式中，所述抗体可以抑制CCR4+细胞向CCR4配体（如MDC或TARC）的趋化性。这已经在实施例6中证明。
在一些实施方式中，所述抗体可以诱导CCR4+细胞的补体依赖细胞毒性（CDC），但是在其它实施方式中，所述抗体不能够诱导CDC。在一些实施方式中，所述抗体可以诱导CCR4+细胞的细胞凋亡，但是在其它实施方式中，所述抗体不能够诱导细胞凋亡。在一些实施方式中，通过结合CCR4所述抗体可以被CCR4+细胞内在化，但是在其它实施方式中，没有发生有意义的内在化。
可以使用公知的标准方法评估细胞凋亡的诱导，例如使用分析膜联蛋白V染色的方法。简要地，可以用抗体孵育细胞合适的时间，如24小时，并在收获细胞和膜联蛋白V染色之后，通过FACS分析（如使用EasyCyte）测量所述效果。
可以使用公知的标准方法分析CDC的诱导，如基于吸收和代谢氧化还原染料如Alamar蓝来测量活细胞的相对数量的方法。合适的分析在H Gazzano-Santoro等，J ImmunolMethods.1997,28;202(2):163-71中公开。
本领域技术人员将知道分析内在化的合适方法，例如在流式细胞术或共聚焦显微方法中使用温差荧光标记。合适的分析的例子包括标记有pH敏感染料（如CypHer5E）的二级抗体，其在碱性pH值时有最低限度的荧光（如在细胞外所发现的）和在酸性pH值时有最大限度的荧光（如在细胞内所发现的）。
可以使用标准方法分析趋化作用的抑制，如使用transwell分析。简要地，在一个小室中将能够进行趋化作用并表达CCR4的细胞与抗体接触，将CCR4配体（如MDC）放置于另一个小室中，另一个小室与第一个小室通过具有合适孔大小的过滤器膜分开。通过比较存在抗体时的趋化作用和不存在抗体时的趋化作用，确定所述抗体对细胞向配体迁移（趋化作用）的作用。实施例6中描述了一种合适的方法。
术语CCR4的“配体”包括CCR4的天然配体，如MDC、TARC、RANTES、MCP-1和/或MIP-1α，这些配体可以是天然产生的、重组表达的或在实验室中合成的。
“CCR4+细胞”意味着在它们表面表达CCR4的细胞，优选地至少基本处于它的野生构型。CCR4+细胞可以天然地表达CCR4，或者它们可以是表达重组CCR4的转化体。CCR4+细胞可以包括实体肿瘤细胞、血液肿瘤细胞和/或Treg。CCR4+细胞的优选例子（特别是用于体外实验）是CCRF-CEM、L-428、Hut78、786-O、A498和KatoIII。
因此，根据本发明，在多种实施方式中可以制备并应用一系列抗CCR4抗体，所述实施方式包括治疗在本文其它地方描述的任何紊乱，具体地是癌症、免疫紊乱、炎症紊乱和传染。
如在贯穿整个申请文件中使用的，术语“一个（种）”在这种意义下使用：它们意味着“至少一个（种）”、“至少第一个（种）”、“一个（种）或多个（种）”或“多个（种）”提及的成分或步骤，除非在那之后具体陈述了上限。因此，如在本文中使用的，“抗体”意味着“至少第一种抗体”。根据本发明的公开内容，本领域普通技术人员将知道组合物的可操作的限定和参数，如同任何单一试剂的量。
本发明的优选实施方式是包括至少一种本发明的抗CCR4抗体或其抗原结合片段的组合物。
包含编码如本文定义的本发明的抗体或它们的部分或片段的核苷酸序列的核酸分子、或与其基本同源的核酸分子构成了本发明的其它方面。在各表中公开的核酸序列是优选的。
优选的核酸分子包括编码以下列出的氨基酸序列的序列：SEQ ID NO:47（优选地由SEQ ID NO:56或与其基本同源的序列编码），SEQ ID NO:48（优选地由SEQ ID NO:57或与其基本同源的序列编码），SEQ ID NO:49（优选地由SEQ ID NO:58或与其基本同源的序列编码），SEQ ID NO:50（优选地由SEQ ID NO:59或与其基本同源的序列编码），SEQID NO:51（优选地由SEQ ID NO:60或与其基本同源的序列编码），SEQ ID NO:52（优选地由SEQ ID NO:61或与其基本同源的序列编码），SEQ ID NO:53（优选地由SEQ ID NO:62或与其基本同源的序列编码），SEQ ID NO:54（优选地由SEQ ID NO:63或与其基本同源的序列编码）或SEQ ID NO:55（优选地由SEQ ID NO:64或与其基本同源的序列编码）。
其它优选的核酸分子包括编码重链可变区（VH）的序列和/或包括编码轻链可变区（VL）的序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39、41、43或45的氨基酸序列或与其基本同源的序列（优选地分别由SEQ ID NO:101、103、105、107、109、111、113、115或117或与其基本同源的序列编码），所述轻链可变区具有SEQ ID NO:30、32、34、36、38、40、42、44或46的氨基酸序列或与其基本同源的序列（优选地分别由SEQ IDNO:102、104、106、108、110、112、114、116或118或与其基本同源的序列编码）。
更优选的序列是编码以下组合的核酸：SEQ ID NO:29和30，或者SEQ ID NO:31和32，或者SEQ ID NO:33和34，或者SEQ ID NO35和36，或者SEQ ID NO37和38，或者SEQ ID NO39和40，或者SEQ ID NO41和42，或者SEQ ID NO43和44，或者SEQ IDNO45和46。同样优选的是包括以下组合的核酸分子：SEQ ID NO:101和102，或者SEQID NO:103和104，或者SEQ ID NO:105和106，或者SEQ ID NO:107和108，或者SEQID NO:109和110，或者SEQ ID NO:111和112，或者SEQ ID NO:113和114，或者SEQ IDNO:115和116，或者SEQ ID NO:117和118。
如上面所提及的，所述轻链的FR1区域可以在位置1和2处具有残基QS。因此，一种优选的核酸序列是包括以下序列或由以下序列组成：所述序列编码与VL503（SEQ IDNO:40）基本同源、在位置1和2处具有残基QS的VL，优选地，所述序列具有以下序列，其中与SEQ ID NO:40相比的差异以下划线示出：
CAAAGCGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGCGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCACCTCCAACATCGGAAGTCATTATGTGGTCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAGACTCCTCATCTATAGGAATCATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGACTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCGGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGTGTGGGATGACACCCTGAGTGGCTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA(SEQ ID NO:133)。
其它优选的核酸分子包括编码IgG形式的本发明的抗体（例如，在实施例1中所描述的那些）或鼠嵌合形式的本发明的抗体的序列。
如上所显示的，本发明包括的其它核酸分子是编码本发明的人抗体的部分或片段的那些，如编码抗体的重链可变区（VH）的那些或编码抗体的轻链可变区（VL）的那些。其它优选的核酸分子是编码本发明的抗体的重链的那些（如，编码SEQ ID NO:67、71、75、79、83、87、91、95或99的那些，分别如SEQ ID NO:65、69、73、77、81、85、89、93或97或与其基本同源的序列）或者编码抗体的轻链的那些（如编码SEQ ID NO:68、72、76、80、84、88、92、96或100的那些，分别如SEQ ID NO:66、70、74、82、86、90、94或98或与其基本同源的序列）。
因此，如本文所定义的抗体的片段、或与其基本同源的序列、或包含编码这些片段的序列的核酸分子形成了本发明的其它方面。
本文使用的与核酸序列相关的术语“基本同源”包括与本文公开的氨基酸或核酸序列具有至少70%或75%、优选地至少80%、以及甚至更优选地至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。因此，本发明的基本同源核酸序列包括本发明的序列的单一或多个碱基改变（添加、取代、插入或缺失）。
优选地，当以IgG形式时，本发明的抗体具有高的结合CCR4的亲和力，即Kd值的范围是1×10-8M或1×10-9M或更少。重要地，具有这样亲和力的抗体处于已经显示用于治疗的确定的范围。优选地，当以IgG形式时，本发明的抗体结合CCR4的亲和力相应于Kd小于30nM、20nM、15nM或10nM，更优选地小于10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1nM，最优选地小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM。
可以使用任何合适的测定Kd的方法。但是，优选地通过以下方法测定Kd：在体外实验中检测抗多种浓度抗原（CCR4）的测试抗体的不同浓度以构建饱和曲线，如使用Lineweaver-Burk方法；或通过使用商业可购的结合模型软件，如BIAcore1000评估软件中的1:1结合模型。可以使用“一个位点特异结合”模型f软件Prism（GraphPad,圣地亚哥,CA）从IgG在CCR+细胞上的滴定计算Kd值。
关于Kd值的测定，本领域技术人员将意识到来自使用表达目标物（如CCR4）的细胞的结合实验的表观Kd值不能被认为是亲和力的绝对指示，因为实验条件将影响表观结合亲和力。例如，CCR4的表达水平可能依赖于培养细胞的条件而变化以及在不同细胞类型之间有区别。因此最好是比较从一组实验中获得的表观Kd值，并且将从一组实验获得的Kd值和从其它组实验获得的Kd值进行比较并不总是合适的，特别是如果实验条件变化得特别明显。
可选地，可以通过进行细胞表面保持力分析来测定CCR4阳性细胞表面的分离率和抗体半衰期，Adams等,1998,Prolonged in vivo tumour retention of a human diabody targetingthe extracellular domain of human HER2/neu.Br J Cancer77:1405-12;Le Gall等,1999,Di-,tri-and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19:effect of valency oncell binding.FEBS Lett453:164-8。后一种方法更适于模拟人类病患在治疗状况下的真实情形。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以结合人CCR4和猴子CCR4。在物种之间，特别是人和通常被用作临床前动物模型的物种之间的这样交叉反应可能是有利的，因为它使得从临床前研究到临床应用的转换更有效。例如，具有与在使用的具体动物模型中存在的天然CCR4交叉反应的抗体意味着这个模型中的结果更接近于反映人类病患的情形，因此对例如使用的剂量产生更精确的估计并增加鉴定任何潜在相关或有问题的副作用可能性。
例如，本发明的抗体结合人CCR4和猴子CCR4的能力意味着可以在临床前毒性研究中检测这样的抗体以得知治疗的副作用并发现合适的耐受剂量。
此外，结合人CCR4和小鼠CCR4的能力意味着由在小鼠模型（如使用免疫活性小鼠的小鼠同源模型）中的本发明抗体显示的结果更接近于代表抗体在人类受试者中的活性。这个的原因是结合人CCR4但不结合小鼠CCR4的抗体将结合由小鼠模型中的人肿瘤细胞表达的CCR4而不能结合内源鼠CCR4。这当然与人类病患的情形不同，其中存在肿瘤表达CCR4和内源CCR4。
这特别是抗体对鼠CCR4和人CCR4有相似亲和力的情况。
这种情形的潜在缺点是结合人CCR4但不结合鼠CCR4或对鼠CCR4具有明显较低亲和力的抗体可能在免疫系统受损的小鼠（如裸鼠或SCID小鼠）的人肿瘤移植物模型中良好地实现功能，但是这可能不能由在存在更多CCR4的人系统中进行相似的功能实现而反映。换句话说，在具有结合人CCR4但不结合小鼠CCR4的抗体的小鼠移植物系统中看到的抗肿瘤效果可能比临床实际情况看上去更好。相反，当与结合人CCR4和小鼠CCR4的抗体一起处理时，这将与小鼠模型系统中存在的所有形式的CCR4都结合，并且可能更接近于表示当抗体被投放于人体中时的情形。这特别是抗体对鼠CCR4和人CCR4有相似亲和力的情况。
在优选的实施方式中，本发明的抗体以相似的亲和力结合人CCR4和猴子CCR4，或结合人CCR4和小鼠CCR4，所述亲和力例如是Kd值为10nM或更少或5nM或更少，更优选地为3nM或更少或2nM或更少，最优选地是1nM或更少。
“相似的亲和力”意思是所述抗体与人CCR4的结合亲和力和所述抗体与一种或多种感兴趣的其它物种（如猴子或小鼠）的结合亲和力是可比的，如不多于20倍的差异。更优选地，结合亲和力之间的所述差异少于15倍，更优选地少于10倍，最优选地少于5、4、3或2倍。
但是，在其它实施方式中，本发明的抗体可能不结合猴子CCR4和/或它们可能不结合小鼠CCR4。
本发明的抗体结合CCR4。因此，本发明的抗体或结合蛋白可以用于在体内或体外探测CCR4，特别是探测CCR4+细胞。例如，由于一些肿瘤细胞上表达CCR4，本发明的抗体或结合蛋白可以用于在体内或体外探测肿瘤细胞。此外，所述抗体定位于CCR4+细胞的能力意味着本发明的抗体可以靶定存在CCR4+细胞的身体位点，其中所述抗体可以在所述靶位点上起作用。具体地，所述抗体定位于CCR4+肿瘤细胞的能力意味着本发明的抗体能够靶定存在CCR4+肿瘤细胞的身体位点，其中所述抗体可以在所述靶位点上起作用。
例如，所述抗体可以如通过激活或诱导ADCC来诱导它本身的抗CCR4+细胞作用，即作为裸露的抗体。作为裸露Ab的能力是有益的。可选地或另外地，通过与另一种治疗分子（如本文中所描述的毒素或其它抗癌分子或抗炎试剂）连接，所述抗体可以诱导抗CCR4+细胞作用。
优选地，本发明的抗体具有诱导CCR4+细胞的抗体依赖的细胞毒性（ADCC）的能力。可以使用本领域已知的方法在体外测定ADCC。例如，可以分析当存在人PBMC时杀死CCR4+细胞系CCRF-CEM。例如，可以使用铬51释放试验。因此，在体外如存在人PBMC时，本发明的抗体可以引起杀死至少10%、15%、20%、22%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的CCR4+细胞。ADCC对于一些应用是有益的，特别是一些治疗应用。因此，在优选的实施方式中，所述抗体能够诱导CCR4+细胞的ADCC，优选地，诱导CCR4+肿瘤细胞和/或CCR4+Th2细胞的ADCC。在一些实施方式中，所述抗体介导的ADCC存在PBMC，但是同样预期抗体介导的ADCC缺少PBMC的实施方式。本发明的抗体诱导CCR4+细胞的ADCC的能力在实施例9中示出。所述结果清楚地证明了，在存在人PBMC时，本发明的抗CCR4抗体能够在三个靶细胞系上诱导ADCC。当在CCRF-CEM细胞上检测时，测定抗体503的EC50是5.3pM，而KW0761是315pM。此外，当在分离的Treg细胞上比较ADCC时，本发明的抗CCR4抗体同样展示出可比较的最大的杀死性。
在需要的抗体浓度以达到这样的ADCC水平方面，优选地，本发明的抗体同样地显示出合适的效力。因此，在体外，CCR4+细胞（如CCRF-CEM细胞）的半数最大量细胞溶解所需要的抗体浓度（EC50）优选地小于700ng/ml、650ng/ml、620ng/ml、600ng/ml、550ng/ml、500ng/ml、450ng/ml、400ng/ml、350ng/ml、300ng/ml、250ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、60ng/ml、50ng/ml、46ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、7ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml或0.25ng/ml。
当与合适的对照水平比较时，优选地，上述能力是在可测量的或有意义的水平上观察到的，更优选地，在统计学有意义的水平上观察到的。
应当注意，关于非特异和特异肿瘤细胞溶解的程度以及EC50值，由不同供体制备的PBMC（效应细胞）可能展示明显不同的ADCC。该现象已经由Naundorf等,2002描述。
人IgG1是一种糖蛋白，具有两条连接至Fc域的N连接的寡聚糖链。所述寡聚糖是复合的双触角型，包括三甘露糖核心结构，存在或不存在核心岩藻糖、二等分的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、半乳糖和末端唾液酸，引起了结构多种多样。人血清IgG和治疗抗体已知都是典型地严重岩藻糖化。
已经报导，在一些实例中，可以通过操纵人IgG1亚家族上的寡聚糖状态以实现ADCC的增强。具体地，已经显示去岩藻糖化能够引起一些抗体的ADCC活性增加（Niwa R等,2004）。因此，在优选实施方式中，在生产/表达蛋白过程中、和/或体外生产/表达蛋白之后修饰根据本发明的抗体以产生特异的糖基化形式，特别是对抗体的治疗应用有益的糖基化形式。优选地，所述特异的糖基化形式是减少或缺失基于岩藻糖的糖基化，其优选地增加了抗体诱导ADCC的能力。因此，在优选实施方式中，本发明的抗体具有特异的糖基化形式，优选地增加所述抗体诱导ADCC的特异的糖基化形式。优选地，本发明的抗体是去岩藻糖化的或非岩藻糖化的。
本领域技术人员知道制备去岩藻糖化或非岩藻糖化的抗体的合适方法。例如，这可以通过在存在Kifunensine（例如100ng/ml）时生产抗体而完成，所述Kifunensine是I型α-甘露糖苷酶的选择性抑制剂，导致在生产过程中所述分子的岩藻糖基化减少。缺失一种或多种对于寡聚糖基质的岩藻糖基化所需的蛋白的合适宿主细胞可以用于制备去岩藻糖基化的抗体，如岩藻糖基转移酶缺失的宿主细胞。合适的宿主细胞的例子是这样的细胞：其中与胞内糖核苷——GFP-岩藻糖的合成相关的酶活性和/或与糖链修饰相关的酶活性是减少的或缺失的，所述糖链修饰中岩藻糖的第一位与N-乙酰氨基葡萄糖的第六位在还原末端通过复合的N-糖苷连接的糖链中的α键连接。这样的酶的例子包括与GDP-岩藻糖合成相关的酶，包括GMD（GDP-甘露糖4,6-脱水酶）、Fx（GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶、4-还原酶）、GFPP（GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶）。
如在实施例2中所描述的，在存在Kifunensine时生产去岩藻糖化形式的抗体306、406和503，所述Kifunensine是I型α-甘露糖苷酶的选择性抑制剂，导致在细胞培养中在生产过程中IgG的岩藻糖基化停止。
“去岩藻糖化”的意思是结合至Fc区的总复合的N-糖苷连接的糖链中至少10%，优选地至少20%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%是岩藻糖没有结合至糖链的还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的糖链。“非岩藻糖化”的意思是抗体中不存在明显水平的岩藻糖。
一些抗体能够被它们结合的细胞内在化。因此，在本发明的一些实施方式中，所述抗体能够被内在化。这个性质特别有利于用在免疫交联物中，因为与所述抗体分子连接的任何其它试剂应当与抗体分子一起被内在化。在其它实施方式中，没有看见明显的内在化。
已知CCR4在血小板上表达，并且它的配体MDC和TARC诱导血小板凝聚。这可能有潜在的问题，因为IgG分子具有两个配体结合位点，因此有这样的可能：如果IgG的两条臂能够结合不同血小板上的CCR4，能够识别CCR4的IgG可能能够交叉连接血小板。这可能导致体内点凝结。具体对于医药应用，期望的是所述抗体没有诱导任何明显的血小板凝聚。可以用已知方法测定血小板凝聚。如在实施例11中所描述的测定本发明的抗体对血小板凝聚的作用。基本上，所述抗体与分离的血小板单独孵育或与血小板和ADP的组合孵育，所述ADP是一种充分描述的凝聚诱导物（Varon和Spectre"Antiplatelet agents"Hematology Am Soc Hematol Educ Program.267-72,2009）。观察抗CCR4抗体与血小板的结合，但是所述抗体显示出对于血小板凝聚没有任何作用。它们不诱导凝聚，也不抑制如ADP诱导的血小板凝聚。因此，所述抗体对血小板凝聚没有任何明显作用。
如上述讨论的，一些PBL（包括Treg）表达CCR4，因此，在本发明的一些实施方式中，所述抗体可以结合PBL，优选地结合Treg和/或Th2细胞。这个性质是有利的，特别是在免疫治疗中，因为它可能耗尽Treg细胞。
在下面的关于本发明的组合物、免疫交联物、医药品、复合物、鸡尾酒、试剂盒、第一和第二医药应用和所有方法的描述中，除非另有明确的说明或以科技术语解释，术语“抗体”和“免疫交联物”、或它们的抗原结合区或片段指一系列的抗CCR4抗体以及具体的208、306、308、406、501、503、601、603和803抗体。
如在本文中使用的“抗体”和“免疫球蛋白”广泛地指包括人抗原结合域的任何免疫学结合试剂或分子，包括多克隆抗体和单克隆抗体。根据重链恒定区的类型，所有抗体都被指定为五个主要类型之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且本发明的抗体可能是这些类型中的任何一个。这些类型中的几个被进一步分为亚类或同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等。对应于不同免疫球蛋白家族的重链恒定区被分别定义为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构造是已知的。
通常，当本发明中使用全抗体而不是抗原结合区域时，IgG和/或IgM是优选的，因为它们在生理情形中是最常见的抗体且因为它们在实验室装置中最容易制备。特别优选的是IgG1抗体。
基于它们恒定域的氨基酸序列和可变域的框架区的一些氨基酸，哺乳动物抗体的“轻链”被指定为两种明显不同类型之一：卡帕（κ）和拉姆达（λ）。本发明的抗体对使用κ或λ轻链恒定区基本没有偏好。
如本领域技术人员所理解的，由术语“抗体”所包括的免疫学结合试剂扩展至所有抗体和它们的抗原结合片段，包括全抗体、二聚抗体、三聚抗体和多聚抗体、双特异抗体、嵌合抗体、重组抗体和工程抗体，以及它们的片段。
因此，术语“抗体”用于表示具有抗原结合区的任何抗体样分子，且该术语包括包含抗原结合域的抗体片段，如Fab’、Fab、F(ab’)2、单域抗体(DAB)、TandAb二聚物、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、小体（minibodies）、双价抗体、双特异抗体片段、双靶向抗体（bibody）、三靶向抗体（tribody）(分别指scFv-Fab融合物、双特异的或三特异的)、sc-双价抗体、κ(λ)抗体(scFv-CL融合物)、双特异T细胞联合体（Engager）(BiTE)(scFv-scFv串联体以吸引T细胞)、双可变域（DVD）Ig(双特异形式)、小免疫蛋白(SIP)(小体类型)、SMIP（“小模块化免疫治疗物”）、scFv-Fc二聚物、DART(ds-稳定的双价抗体“双重亲和力重复靶定”)、包括一个或多个CDR的小抗体类似物等。
制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域已知的（见Kabat等，1991，通过引用的方式特别结合至本文）。具体地，双价抗体在EP404,097和WO93/11161中进一步描述，而线性抗体在Zapata等(1995)中进一步描述。
可以使用常规技术将抗体分成片段。例如，可以通过用胃蛋白酶处理所述抗体而产生F(ab’)2片段。可以处理得到的F(ab’)2片段以减少二硫键桥以产生Fab’片段。木瓜蛋白酶的消化可以导致形成Fab片段。同样可以通过重组技术合成或化学合成Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAb、TandAb、ds-scFv、二聚物、小体、双价抗体、双特异性抗体片段和其它片段。本领域中已知并描述了生产抗体片段的技术。例如，Beckman等,2006；Holliger&Hudson,2005；Le Gall等,2004；Reff&Heard,2001；Reiter等,1996和Young等,1995都进一步描述和实施了有效抗体片段的生产。
所述抗体或抗体片段可以天然产生或完全合成或部分合成产生。因此所述抗体可以来自任何合适来源、如重组来源和/或在转基因动物或转基因植物中、如在使用IgY技术的卵中产生。因此，所述抗体分子可以在体内或体外生产。
优选地，所述抗体或抗体片段包括包含三个CDR域的抗体轻链可变区（VL）和包含三个CDR域的重链可变区（VH）。所述VL和VH通常来自于抗原结合位点。
“Fv”片段是包含全部的抗原识别位点和结合位点的最小抗体片段。该区具有紧密而非共价连接的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚物。在这个结构中，每个可变域的三个超变区（CDR）互相作用以限定VH-VL二聚物表面的抗原结合位点。共同地，六个超变区（CDR）赋予了抗体抗原结合特异性。
但是，在本领域中有明确的记载：抗体存在轻链可变域的三个CDR和重链可变域的三个CDR对于抗原结合并不是必须的，因此，小于上述典型抗体片段的结构已知是有效的。
例如，骆驼（camelid）抗体（Hamers-Casterman等,1993；Arbabi Ghahroudi等,1997）具有广泛的抗原结合性质但是缺少轻链。同样，仅包括VH域（Ward等,1989；Davies和Riechmann,1995）或仅包括VL域（van den Beucken等,2001）的单域抗体的结果显示这些域可以以可接受的高亲和力结合抗原。因此，三个CDR能够有效地结合抗原。
同样已知单一CDR或两个CDR可以有效地结合抗原。作为第一种例子，单一CDR可以插入至异种蛋白并赋予所述异种蛋白以抗原结合能力，如通过插入至异种蛋白（如GFP）的VH CDR3区赋予所述异种蛋白以抗原结合能力所例示的（Kiss等,2006；Nicaise等,2004）。
进一步已知两个CDR可以有效结合抗原，甚至赋予比亲本抗体所具有的性质更好的性质。例如，已经显示（Qiu等,2007），来自亲本抗体的两个CDR（VH CDR1区和VL CDR3区）保持了亲本分子的抗原识别性质，但是具有更好的渗透肿瘤的能力。使用合适的连接序列（如来自于VH FR2）以类似于天然亲本抗体的方式将这些CDR域连接起来以调整CDR产生了更好的抗原识别。因此，本领域已知，以合适的框架区的方式构建包括两个CDR域（优选地一个来自VH域且一个来自VL域，更优选地，两个CDR域的一个是CDR3域）的结合抗原的抗体类似物以保持在亲本抗体中发现的构造是可能的。
因此，尽管本发明的优选抗体可能包括六个CDR区（三个来自于轻链，三个来自于重链），本发明也包括具有少于六个CDR区的抗体和少至一个或两个CDR区的抗体。此外，同样预期具有仅来自重链或轻链的CDR的抗体。
结合CCR4的本发明的优选抗体包括至少一个包括三个CDR的重链可变区和至少一个包括三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括具有本文公开的序列的重链CDR。
用于与具体的重链CDR区连接的优选的轻链CDR区在本文其它地方描述。但是，同样期待包括三个CDR的用于与本发明的重链可变区连接的其它轻链可变区。本领域技术人员可以容易地鉴定与本发明的重链可变区组合并产生结合CCR4的抗体的合适的轻链可变区。
例如，本发明的重链可变区可以与单一的轻链可变区或所有的轻链可变区组合，得到的抗体经检测与CCR4结合。将期望的是合理数量的这种本发明的重链可变区与不同的轻链可变区的组合将保持结合CCR4的能力。
相似的方法将用于鉴定与本发明的优选轻链可变区组合的可选的重链可变区。
在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括全部或一部分重链恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，所述重链恒定区是IgG1重链恒定区，或其一部分。此外，所述抗体或抗体片段可以包括全部或一部分κ轻链恒定区或λ轻链恒定区，或其一部分。所有或部分这样的恒定区可以天然产生或可以全部或部分地合成。这样恒定区的合适序列是已知的并在本领域中有文献记载。当本发明的抗体包括来自重链和轻链的全部恒定区时，这样的抗体在本文中典型地被定义为“全长”抗体或“完全”抗体。
包含Fc区的抗体优选用于一些应用，特别是体内治疗应用，其中Fc区调节了效应器作用，如ADCC。
基本同源的核酸序列也包括与本文公开的核酸序列（或它们的互补序列）杂交的核苷酸序列，如在至少适度严格杂交条件下（优选地，高度严格条件下）与编码本发明的一个或多个轻链或重链的CDR、本发明的轻链可变区或重链可变区或本发明的抗体的核苷酸序列杂交（或与它们的互补序列杂交）的核苷酸序列。
本发明蛋白的基本同源序列包括，但不限于，不影响抗体的VH、VL或CDR域的变化，例如包括使用不同连接序列的scFv抗体或添加有对结合抗原没有影响的标签序列或其它成分的抗体；或将一种类型或形式的抗体分子或片段转换成另一种类型或形式的抗体分子或片段（如从Fab转化成scFv，反之亦然）；或将一种抗体分子转化成一种具体类型或亚类的抗体分子（如将一种抗体分子转化成IgG或其亚类如IgG1或IgG3）。
在其它优选的实施方式中，提供比初始抗CCR4抗体（如208、306、308、406、501、503、601、603和803）相比具有改进或更优越性质的二代抗体。例如，所述二代抗体具有更强的结合CCR4的亲和力、更好的交叉反应性、更好的靶定CCR4+细胞（特别是肿瘤细胞）的能力、改进的诱导ADCC的能力、改进的诱导CDC的能力、改进的对本文其它地方描述的紊乱的治疗能力。
例如，使用如本文或本领域详细描述的一种或多种分析法可以容易地进行和量化用于鉴定有效的二代抗体的比较。本发明包括与本发明的抗CCR4抗体（如所例举的208、306、308、406、501、503、601、603和803抗体）相比，具有至少约2倍、5倍、10倍、20倍和优选地至少约50倍的增强的生物学性质或活性的二代抗体。
本发明的抗体、结合蛋白和核酸分子通常是“分离的”或“纯化的”分子，在这种情况下，它们与在人和动物体或源自人或动物体的组织样品中原位存在的任何这样的成分不同。但是，所述序列可以与在人或动物体中发现的序列相应或基本同源。因此，本文使用的涉及核酸分子或序列和蛋白或多肽（如抗体）的术语“分离的”或“纯化的”表示从它们的天然环境中分离、纯化或基本游离的分子，如从人或动物体分离或纯化的分子（如果真正地，它们天然存在），或表示由技术方法产生的分子，即包括重组体和合成产生的分子。
因此，当与核酸分子联合使用时，这样的术语可以表示基本上没有材料的核酸，所述材料天然地与其它核酸/基因或多肽联合。这些术语也可以表示当由重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或培养基的核酸，或当化学合成时基本上没有化学前体或其它化学物质的核酸。分离的或纯化的核酸也可以是基本上没有在源自的核酸中与所述核酸天然侧翼连接的序列（即位于所述核酸的5’或3’末端的序列）或由例如基因工程方法连接至核酸侧翼的序列（如标签序列或没有治疗价值的其它序列）。
因此，当与本发明的蛋白或多肽分子如轻链CDR1、2和3、重链CDR1、2和3、轻链可变区、重链可变区和结合蛋白或抗体（包括全长抗体）联合使用时，术语“分离的”或“纯化的”典型地指基本上没有它所源自的来源的细胞物质或其它蛋白的蛋白。在一些实施方式中，特别是当所述蛋白应用于人或动物时，当由重组技术产生时，这样的分离的或纯化的蛋白基本上没有培养基；或者当化学合成时，这样的分离的或纯化的蛋白基本上没有化学前体或其它化学物质。这样的分离的或纯化的蛋白也可以是无侧翼序列的，如上述关于分离的核酸分子所描述的那些。
本文使用的术语“核酸序列”或“核酸分子”指由天然存在的碱基、糖和糖之间（骨架）连接键组成的核苷酸或核苷酸单体序列。该术语同样包括含有非天然存在的单体的修饰的或取代的序列或它们的一部分。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列（DNA）或核糖核酸序列（RNA）且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。这些序列也可以包含修饰的碱基。这样修饰的碱基的例子包括氮杂和脱氮杂腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及黄嘌呤和次黄嘌呤。所述核酸分子可以是双链或单链的。所述核酸分子可以是全部地或部分地合成或重组。
在优选实施方式中，本发明的抗体是人抗体，更优选地是完全人抗体。在这点上，人抗体对于人类治疗通常具有至少三个潜在优势。第一，人免疫系统不会将所述抗体识别为外来物质。第二，在人体循环中的半衰期将与天然存在的人抗体的半衰期相似，使得可以给予较小的和更少频率的剂量。第三，由于所述效应器是人，它将与人免疫系统的其它部分更好地相互作用，例如通过补体依赖的细胞毒性（CDC）或抗体依赖的细胞毒性（ADCC）更有效地破坏靶细胞。
但是，尽管人抗体通常被认为表现这些优势，已知开发具有足够亲和力和合适功能性质以使得它们作为成功的人类治疗的候选物的人类抗体绝不是简单的。因此本领域仍然缺乏用于人类安全和有效治疗的抗CCR4抗体，并提出开发这样的试剂的挑战。
本文中与抗体分子和结合蛋白联合使用的术语“人”首先指具有可变区（如VH、VL、CDR或FR区）和可选的抗体恒定区、分离自或源自人类部分或源自或相应于在人中（如在人生殖细胞或体细胞中）发现的序列的抗体和结合蛋白。
208、306、308、406、501、503、601、603和803抗体是这样的人抗体分子的例子，其中所述可变区已经分离自人部分。
本发明的“人”抗体和结合蛋白进一步包括不是由人序列编码的氨基酸残基，如体外随机引入的突变或定点突变，例如通过体外克隆或PCR引入的突变。这样突变的具体例子是在所述抗体或结合蛋白的小数量残基中，如在所述抗体或结合蛋白的多至5、4、3、2或1个残基中，优选在构成所述抗体或结合蛋白的一个或多个CDR的多至5、4、3、2或1个残基中包括保守取代或其它突变的突变。一些这样的“人”抗体的例子包括已经进行过标准的修饰技术以减少潜在的免疫原性位点的数量的抗体和可变区。
因此，本发明的“人”抗体包括源自人的序列和涉及在人中发现的序列，但是可能没有天然存在于体内人抗体种系部分。此外，本发明的人抗体和结合蛋白包括含有从人序列中鉴定的人共同序列或与人序列基本同源的序列的蛋白。
此外，本发明的人抗体和结合蛋白不限于VH、VL、CDR或FR区的组合，已发现所述VH、VL、CDR或FR区在人抗体分子中是组合的。因此，本发明的人抗体和结合蛋白可以包括或对应于这些区的组合，所述组合并不需要在人类中天然存在。
在优选实施方式中，所述人抗体是完全人抗体。如本文中使用的，“完全人”抗体是包括如上所定义的“人”可变区域和/或CDR的抗体，基本上没有非人抗体序列或没有任何非人抗体序列。例如，包括人可变区域和/或CDR、“基本上没有非人抗体序列”的抗体是其中仅多至5、4、3、2或1个氨基酸是不是由人类抗体序列编码的氨基酸的抗体、域和/或CDR。因此，“完全人”抗体不同于“人源化”抗体，所述“人源化”抗体基本上基于非人可变区域，如小鼠可变区域，其中一些氨基酸已经变化以更好地与一般在人抗体中存在的氨基酸保持一致。
本发明的“完全人”抗体可以是没有任何其它实质抗体序列的人可变区域和/或CDR，如可以是单链抗体。可选地，本发明的“完全人”抗体可以是与一个或多个人类抗体恒定区整合或可操作连接的人类可变区域和/或CDR。一些优选的完全人抗体是具有IgG恒定区的全部互补物的IgG抗体。
在其它实施方式中，本发明的“人”抗体将是部分的人嵌合抗体。如本文中所使用的，“部分的人嵌合”抗体是包括可操作地连接至或接枝至非人类（如大鼠或小鼠）的恒定区的“人”可变区域和/或CDR的抗体。这样的部分人嵌合抗体可以用在例如临床前研究中，其中所述恒定区将优选地是与在临床前检测中使用的相同种类动物的恒定区。这些部分人嵌合抗体也可以用在例如离体诊断中，其中所述非人类物种的恒定区可以提供抗体探测的额外选择。
本文使用的术语“片段”指生物学相关的片段，如对抗原结合有作用的片段，例如形成部分的抗原结合位点，和/或对抑制或减少CCR4抗原的功能有作用的片段。一些优选的片段包括本发明抗体的重链可变区（VH域）和/或轻链可变区（VL域）。其它优选的片段包括本发明的抗体的一个或多个重链CDR（或本发明的VH域）或本发明的抗体的一个或多个轻链CDR（或本发明的VL域）。一些优选片段的长度是至少5个氨基酸并包括至少一个CDR区、优选地CDR3区、更优选地重链CDR3区。
在一些实施方式中，其中本发明的抗体包括本文公开的任何定义序列的片段，如是包括本发明的VH和/或VL域的抗体，或是包括本发明的一个或多个CDR的抗体或结合蛋白，这些区/域通常在所述抗体或结合蛋白中分离，使得每一个区/域实施它的生物学功能并因此保留结合抗原的作用。因此，所述VH和VL域优选地由合适的支架（scaffold）序列/连接片段序列分开，CDR优选地由合适的框架区分开，所述框架区如在天然存在的抗体和/或有效构建的抗体中所发现的那些。因此，本发明的VH、VL和个别的CDR序列优选地位于合适的框架或支架内或与合适的框架或支架合并以使得抗原结合。这样的框架序列或区可以对应于天然存在的框架区、FR1、FR2、FR3和/或FR4，以在适当的情况下形成合适的支架；或可以对应于如通过比较多个天然存在的框架区所鉴定的共有框架区。可选地，可以使用非抗体支架或框架，如T细胞受体框架。
可以用于框架区的合适序列在本领域是公知的并有文献记载的，且可以使用它们中的任意一种。用于框架区的优选序列是构成本发明的VH和/或VL域的一个或多个（即1、2、3或4个）框架区，即一个或多个在表1、2、3或4中公开的框架区，或与其基本同源的框架区，特别是能够保持抗原特异性的框架区，例如导致与所述抗体基本上一样或一样的3D结构的框架区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:12、13、14和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:7、8、9和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:47（同样在表1中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:12、13、14和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:7、8、16和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:48（同样在表2中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:12、13、14、15）和/或可变重链（SEQ ID NO:7、8、18和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:49（同样在表3中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:12、13、14和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:19、8、9和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:50（同样在表4中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:21、13、23和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:19、8、9和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:51（同样在表5中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，在本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:12、13、23和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:19、8、9和10），以及在适当的情况下，存在SEQ ID NO:52（同样在表6中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:21、13、23和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:7、8、9和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:53（同样在表7中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:25、13、23和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:7、8、9和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:54（同样在表8中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
在一些优选实施方式中，本发明的抗体中存在全部四个可变轻链（SEQ ID NO:12、13、23和15）和/或可变重链（SEQ ID NO:7、8、28和10），以及在适当的情况下，存在SEQ IDNO:55（同样在表9中显示）的FR区或与其基本同源的FR区。
因此，所述重链FR1的位置26在一些实施方式中优选地是E，但在其它实施方式中是G。所述重链FR3的位置22在一些实施方式中优选地是P，但在其它实施方式中是S，以及位置23在一些实施方式中优选地是E，但在其它实施方式中是D。所述轻链FR1的位置7在一些实施方式中优选是P，但在其它实施方式中是Q。所述轻链FR3的位置20在一些实施方式中优选地是S，但在其它实施方式中是G。
如上所述，SEQ ID NO:12的一种优选的同源物是SEQ ID NO:129或130，以及SEQ IDNO:21的一种优选的同源物是SEQ ID NO:131或132，因此，以上所有情形应当被理解为包括SEQ ID NO129-132。
此外，尽管本发明的优选抗体由本发明的VH、VL或CDR构成，应当注意，本发明的抗体同样包括一个或多个本发明的VH、VL或CDR和非本发明的其它VH、VL或CDR的组合，条件是仍然存在本文所列出的本发明抗体的结合CCR4的性质或抗CCR4的性质。
本文使用的术语“重链互补决定区”（“重链CDR”）指抗体分子中重链可变区（VH域）内的超可变区。所述重链可变区从氨基端到羧基端有三个CDR，定义为重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。所述重链可变区同样具有四个框架区（从氨基端到羧基端为FR1、FR2、FR3和FR4）。这些框架区分开了CDR。
本文使用的术语“重链可变区”（VH域）指抗体分子的重链可变区。
本文使用的术语“轻链互补决定区”（“轻链CDR”）指抗体分子中轻链可变区（VL域）内的超可变区。所述轻链可变区从氨基端到羧基端有三个CDR，定义为轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。所述轻链可变区同样具有四个框架区（从氨基端到羧基端为FR1、FR2、FR3和FR4）。这些框架区分开了CDR。
本文使用的术语“轻链可变区”（VL域）指抗体分子的轻链可变区。
应当注意的是，在必要时，本文服从Kabat命名法，以定义CDR的位置（Kabat等,1991,通过参考的方式明确地结合至本文）。
本领域技术人员将知道，本发明的蛋白和多肽，如轻链CDR和重链CDR、轻链可变区和重链可变区、抗体、抗体片段和免疫交联物可以以本领域已知和描述的几种方法的任何一种进行制备，但是最优选地是使用重组方法制备。
编码本发明抗体的轻链可变区和重链可变区的核酸片段可以源自或产生自任何合适的方法，如通过克隆或合成。可以使用本领域公知和描述的方法来制备这样的序列，例如通过从如人种系基因中克隆合适的序列然后对这些种系序列进行任何必要的修饰来制备以获得本发明的序列。一种可选择的且更有效的方法可以是合成合适的轻链可变区序列或重链可变区序列作为重叠引物，然后使用引物延伸以获得全长序列。然后可以通过PCR使用引物扩增所述全长序列，所述引物包含用于进一步克隆和处理（如克隆至合适的表达载体中）的合适的酶切位点。每个可变区5-7条重叠引物通常是足够的，从而使得该技术非常有效和精确。
一旦已经获得了编码本发明抗体的轻链可变区和重链可变区的核酸片段，这些片段可以进一步通过标准重组DNA技术的处理，例如以将可变区片段转换成具有合适恒定区域的全长抗体分子，或转换成本文其它地方描述的具体形式的抗体片段，如Fab片段、scFv片段等。典型地，或作为该进一步处理过程的一部分，所述编码本发明抗体分子的核酸片段通常合并在合适的表达载体中以促进本发明抗体的产生。
可能的表达载体包括但不限于，粘粒、质粒或修饰的病毒（如复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒），只要所述载体能够与使用的宿主细胞适合。所述表达载体“适于宿主细胞的转化”，意思是所述表达载体包含本发明的核酸分子和基于用于表达的宿主细胞所选择的调节序列，所述调节序列与所述核酸分子可操作地连接。可操作地连接意味着表示所述核酸以允许核酸表达的方式与调节序列连接。
本发明因此预期一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的核酸分子或其片段，和用于转录和翻译由本发明的核酸分子编码的蛋白序列所必需的调节序列。
合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫的基因（如，见Goeddel,1990中描述的调节序列）。合适的调节序列的选择取决于下面描述的选择的宿主细胞，且本领域普通技术人员可以容易地完成。这样的调节序列的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，包括翻译起始信号的核糖体结合序列。此外，取决于所选择的宿主细胞和使用的载体，可以将其它序列如复制起点、额外的DNA限制酶切位点、增强子和赋予转录可诱导性的序列合并在所述表达载体中。
本发明的重组表达载体也可以包含促进选择转化或转染有本发明的重组分子的宿主细胞的选择性标记物基因。所述选择性标记物基因的例子是编码以下蛋白的基因：赋予对一些药物具有抗性的新霉素和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶、或免疫球蛋白或其部分，如免疫球蛋白（优选地IgG）的Fc部分。选择性标记物基因的转录由选择性标记物蛋白的浓度变化监测，所述选择性标记物蛋白是如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶。如果选择性标记物基因编码赋予抗生素抗性（如新霉素抗性）的蛋白，可以用G418选择转化株细胞。已经合并了选择性标记物基因的细胞将存活，而其它细胞死亡。这使得可以看见并分析本发明的重组表达载体的表达，特别是测定突变对表达和表型的作用。将意识到，可以将所述选择性标记物引入至与目标核酸不同的载体上。
所述重组表达载体也可以包含编码融合基团的基因，所述融合基团增加了所述重组蛋白的表达，增加了重组蛋白的可溶性，并通过在亲合纯化中作为配体（例如，可以存在使得进行纯化和/或鉴定的适当的“标签”，如组氨酸标签或myc标签）有助于目标重组蛋白的纯化。例如，可以将蛋白水解的分解位点添加至目标重组蛋白以使得在纯化所述融合蛋白之后将所述重组蛋白从融合基团中分离。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.,墨尔本,澳大利亚)、pMal(新英格兰生物实验室,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,皮斯卡塔韦,NJ)，它们分别将谷胱甘肽S转移酶（GST）、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至重组蛋白中。
可以将重组表达载体引入至宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“转化有”、“转染有”、“转化”和“转染”意味着包括通过本领域已知的多种可能的技术之一将核酸（如载体）引入至细胞中。本文使用的术语“转化的宿主细胞”意味着同样包括已经转化有本发明的重组表达载体的能够糖基化的细胞。可以通过如电穿孔或氯化钙介导的转化将核酸转化至原核细胞。例如，可以通过常规技术，如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂质转染法、电穿孔或显微注射法将核酸引入至哺乳动物细胞中。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等,1989和其它实验室教科书中找到。
合适的宿主细胞包括广泛多种的真核宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的蛋白可以在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞可以在Goeddel,1990中找到。此外，本发明的蛋白可以在原核细胞如大肠杆菌中表达（Zhang等，2004）。
适于完成本发明的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于：啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、毕赤酵母属（Pichia）或克鲁维酵母属（Kluyveromyces）和曲霉属（Aspergillus）的多个种。在酵母菌啤酒酵母（S.cerevisiae）中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari.等,1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,1982)、pJRY88(Schultz等,1987)和pYES2(InvitrogenCorporation,San Diego,CA)。用于转化酵母和真菌的方案是本领域普通技术人员公知的（见Hinnen等,1978；Ito等,1983,和Cullen等，1987）。
适于完成本发明的哺乳动物细胞包括：COS(如ATCC No.CRL1650或1651)、BHK(如ATCC No.CRL6281)、CHO(ATCC No.CCL61)、HeLa(如ATCC No.CCL2)、293(ATCC No.1573)、NS-1细胞、NS0(ATCC CRL-11177)和
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(Crucell,莱顿,荷兰)。引导在哺乳动物细胞中表达的合适的表达载体通常包括启动子（如来自于病毒物质，如多瘤病毒、腺病毒2、细胞巨化病毒和猿病毒40），以及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed,B.,1987)和pMT2PC(Kaufman等,1987)。
根据本文提供的教导，同样可以容易地实现用于将合适类型的表达载体引入至植物、鸟和昆虫细胞中的启动子、终止子和方法。例如，在一个实施方式中，本发明的蛋白可以从植物细胞中表达（见Sinkar等,1987，其综述了毛根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）载体的应用；同样见Zambryski等,1984，其描述了用于植物细胞表达载体的应用，所述载体包括PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034等）。
适于实现本发明的昆虫细胞包括来自家蚕、Trichoplusia或Spodotera种的细胞和细胞系。适于在培养的昆虫细胞（SF9细胞）中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列（Smith等,1983）和pVL系列（Luckow和Summers1989）。PCT/US/02442中描述了一些适于表达本发明的重组蛋白的杆状病毒-昆虫细胞表达系统。
可选地，同样可以在非人类的转基因动物如大鼠、兔子、绵羊和猪中表达本发明的蛋白（Hammer等，1985；Palmiter等，1983；Brinster等，1985；Palmiter和Brinster1985，以及美国专利号4,736,866）。
同样可以使用蛋白质化学领域内公知的技术通过化学合成法制备本发明的蛋白，如固相合成法（Merrifield(1964);Frische等;1996）或在均质溶液中合成。
可以利用重组技术通过融合制备N-末端或C-末端融合蛋白，所述融合蛋白包括与其它分子如蛋白结合的本发明抗体和蛋白。得到的融合蛋白包含本发明的抗体或蛋白，所述抗体或蛋白与选择的蛋白或标记物蛋白或本文描述的标签蛋白融合。同样可以通过公知技术将本发明的抗体和蛋白与其它蛋白结合。例如，可以使用如在WO90/10457中所描述的包含双异官能硫醇的连接体、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代-丙酸酯)或N-琥珀酰亚胺基-5硫代乙酸酯将所述蛋白偶联。可以用于制备融合蛋白或结合物的蛋白质的实例包括细胞结合蛋白如免疫球蛋白、激素、生长因子、植物血凝素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、内啡肽、铁传递蛋白、蛙皮素、唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、红血球凝聚素（HA）和截短型的myc。
不考虑制备第一个抗CCR4抗体核酸片段的方式，可以通过标准的分子生物学技术容易地制备更多的合适的抗体核酸片段。为了确认任何变异体、突变体或二代抗CCR4抗体核酸片段适于在本发明中使用，将检测核酸片段以确认根据本发明的抗CCR4抗体的表达。优选地将在标准的、更优选地标准严格杂交条件下检测所述变异体、突变体或二代核酸片段以确认杂交。例示的合适的杂交条件包括在大约50℃、大约7%十二烷基硫酸钠(SDS)、大约0.5M NaPO4、大约1mM EDTA条件下杂交，并在42℃下用大约1%SDS清洗。
由于可以容易地制备多种抗体，可以通过对动物或病患提供至少第一个核酸片段或分子以实行本发明的治疗方法，所述第一个核酸片段或分子在病患体内表达生物学有效量的至少第一个本发明的抗CCR4抗体。所述“表达抗CCR4抗体的核酸片段或分子”通常将是以至少一种表达构建体或载体的形式，并且可以是以包含在病毒或包含在重组宿主细胞内的表达构建体或载体的形式。本发明的优选基因治疗载体通常将是病毒载体，如重组逆转录病毒、单纯疱疹病毒（HSV）、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、细胞巨化病毒（CMV）等等。
另一方面提供一种包含一种或多种本发明的核酸片段或分子的表达构建体或表达载体。优选地，所述表达构建体或载体是重组的。优选地，所述构建体或载体进一步包括用于转录和翻译由本发明的核酸分子编码的蛋白序列的必需的调节序列。
另一方面提供一种包含一种或多种本发明的表达构建体或表达载体的宿主细胞或病毒。同样还提供包含一种或多种本发明的核酸分子的宿主细胞或病毒。表达本发明抗体的宿主细胞或病毒构成了另一方面。
本发明的另一方面提供一种生产本发明抗体的方法，所述方法包括培养本发明宿主细胞的步骤。优选的方法包括步骤：（i）在适于表达编码的抗体或蛋白的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种本发明的重组表达载体或一种或多种本发明的核酸序列；以及可选地（ii）从宿主细胞或生长培养基/上清液中分离或获得所述抗体或蛋白。这样的生产方法同样可以包括纯化所述抗体或蛋白产物的步骤和/或将所述抗体或产物配制在包括至少一种其它成分（如药物学可接受的载体或赋形剂）的组合物中。
在本发明的抗体或蛋白由多于一种多肽链（例如Fab片段的一些片段）组成的实施方式中，所有的多肽优选地在宿主细胞中（从相同或不同的表达载体）表达，因此所述完整蛋白（如本发明的结合蛋白）可以在所述宿主细胞中聚集并从宿主细胞中分离或纯化。
本发明的抗体同样可以用于生产结合CCR4的其它抗体。这样的应用包括例如在亲本抗体的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸以形成新的抗体，其中所述亲本抗体是如在本文其它地方描述的本发明的一种抗体，并检测得到的新抗体以鉴定结合CCR4的抗体。这样的方法可以用于形成多种新抗体，可以检测所有抗体结合CCR4的能力。优选地，所述添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸发生在一个或多个CDR域中。
可以使用本领域公知和文献记载的技术以任何合适的方式实现对亲本抗体的这样的修饰或突变，例如通过随机突变或定向突变的方法完成。如果使用定向突变，则鉴定用于突变形成的合适残基的一种方式利用结合蛋白-抗原复合物（如Ab-Ag复合物）的结晶结构的分辨力（resolution）以鉴定涉及抗原结合的关键残基（Davies和Cohen，1996）。然后，突变这些残基以提高交互作用。可选地，可以简单地靶定用于定向突变的一个或多个氨基酸残基并评估结合CCR4的效果。
可以以任何合适方式实现随机突变，例如，通过易错PCR、链改组或突变体大肠杆菌菌株实现。
因此，本发明的一个或多个VH域可以与来自任何合适来源的单一的VL域或全部的VL域结合，并检测得到的新抗体以鉴定特异于CCR4的抗体。相反地，本发明的一个或多个VL域可以与来自任何合适来源的单一的VH域或全部的VH域结合，并检测得到的新抗体以鉴定结合CCR4的抗体。
相似地，在适当情况下，本发明VH和/或VL域的一个或多个或优选地全部三个CDR可以接枝于单一VH和/或VL域或全部的VH和/或VL域，并检测得到的新抗体以鉴定结合CCR4的抗体。
已经显示，CDR，特别是轻链和/或重链的CDR3的定向突变是增加抗体亲和力的有效技术，并且是优选的。优选地，封闭CDR3或被称为“热点”的特异区的3-4个氨基酸作为突变形成的目标。
“热点”是体内发生体细胞高度突变的序列（Neuberger和Milstein,1995）。所述热点序列可以被定义为一些密码子中的共同核苷酸序列。所述共同序列是四核苷酸RGYW，其中R可以是A或G，Y可以是C或T，W可以是A或T（Neuberger和Milstein,1995）。此外，相比于由对应于潜在热点序列的TCN编码的丝氨酸，由核苷酸AGY编码的丝氨酸残基主要地存在于可变区的CDR域（Wagner等，1995）。
因此，可以扫描本发明每一个抗体的重链CDR和轻链CDR的核苷酸序列是否存在热点序列和AGY密码子。然后可以可选地使用国际ImMunoGen Tics数据库(IMGT，http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)将轻链CDR域和重链CDR域的鉴定的热点与重链和轻链的原始序列进行比较(Davies等,1990)。与种系相同的序列暗示没有发生体细胞突变。因此，可以模拟体内发生的体细胞事件引入随机突变或可选地，在热点和/或AGY密码子处发生定点突变。相反，一种不同序列显示已经发生体细胞突变。仍然需要确定体内体细胞突变是否是最佳的。
用于突变的优选热点是编码暴露的氨基酸的那些，且优选地编码形成部分抗原结合位点的氨基酸的那些。用于突变的其它优选热点是编码非保守氨基酸的那些。优选地，不突变编码CDR内的包埋氨基酸或保守氨基酸的热点。这些残基对于整体结构通常是关键地，且由于它们是包埋的，它们不太可能与抗原相互作用。
实现上述氨基酸和蛋白质域操作的方法是本领域技术人员熟知的。例如，上述操作可以在核酸水平通过遗传工程便利地实现，其中编码合适结合蛋白和它们的域的核酸分子被修饰以使得得到的表达蛋白的氨基酸序列以合适的方式顺次被修饰。
检测一种或多种抗体特异结合CCR4的能力可以通过任何合适的方法实现，这些方法在本领域是公知的并有描述。可以从培养收集物中获得CCR4+细胞系，或可以通过用使得重组CCR4表达的构建体转化CCR4阴性细胞制备CCR4+细胞系。这些细胞或固定的CCR4可以通过常规方法如ELISA、BiaCon等容易地用于分析结合。
由这些方法生产的新抗体将优选地具有提高的功能性质，如对于CCR4比亲本抗体具有更高或改进的亲和力（或至少相当的亲和力），并可以以与本文其它地方描述的本发明抗体相同的方式治疗和使用（例如，用于治疗、诊断、组合物中等）。可选地或其它地，所述新抗体将具有一种或多种在本文其它地方描述的其它提高的功能性质。
由这些方法产生、获得或可获得的新抗体形成本发明的另一方面。
本发明进一步提供包含至少一种本发明的人类抗体或抗体片段的组合物，可选地包括一种稀释剂。这样的组合物可以是药物学可接受的组合物或用于实验室研究的组合物。在药物组合物这方面，它们可以优选地被配制成肠胃外、静脉内或甚至皮下给药。
本发明提供本发明的人类抗体和抗体片段的一些方法和应用。关于所有方法，除非另有明确的说明，术语“一个（种）”用于表示所述方法中“至少一个（种）”、“至少第一个（种）”、“一个（种）或多个（种）”或“多个（种）”步骤。这与治疗方法中的给药步骤特别相关。因此，不仅仅可以使用本发明的不同剂量，也可以使用例如注射的不同剂量数，达到和包括多种注射。在施用抗CCR4治疗抗体之前、之后或期间可以使用组合的治疗。
提供具有重要的生物学暗示的本发明抗体或免疫交联物的多种体外有用的方法和应用。首先提供的是结合CCR4的方法和在结合CCR4中的应用，所述方法通常包括用本发明的至少第一种抗CCR4抗体或其抗原结合片段有效地接触包含CCR4的组合物。本发明的抗体或其免疫交联物可以因此用于结合分析中。合适地有用的结合分析包括本领域中一般使用的那些，如免疫印迹技术、蛋白质印迹、斑点印迹、RIA、ELISA、免疫组织化学法、荧光激活细胞分离技术（FACS）、免疫沉淀反应、亲和色谱法等。
提供检测CCR4的方法和在检测CCR4中的应用，所述方法或应用通常包括在有效允许CCR4/抗体复合物形成的条件下用本发明的至少第一种抗体或免疫交联物或它们的抗原结合片段接触怀疑含有CCR4或已知含有CCR4的组合物，并检测形成的复合物。所述检测方法和应用可以与生物学样品联合使用，如诊断肿瘤；还提供基于此的诊断试剂盒。
本发明的抗体同样可以用于检测个体是否可以从抗CCR4治疗受益。因此，本发明提供本发明的抗体的应用，用于检测患有CCR4相关的疾病的个体的细胞、靶位点、组织或器官表达的CCR4的存在或测量所述CCR4的量，其中与健康对照相比，检测的CCR4的存在的增加或测量的CCR4的量的增加表示所述个体可能受益于抗CCR4治疗。换个角度看，本发明提供一种检测个体是否受益于抗CCR4治疗的方法，包括对个体施用有效量的本发明抗体并检测由所述个体的细胞、靶位点、组织或器官表达的CCR4的存在或测量所述CCR4的量，其中与健康对照相比，检测的CCR4的存在的增加或测量的CCR4的量的增加表示所述个体可能受益于抗CCR4治疗。
所述细胞或靶位点可能优选地是实体肿瘤或血液学肿瘤。优选地，检测或测量的CCR4的存在或量用于预测CCR4相关的紊乱是否易受用本发明的抗CCR4制剂、优选地抗CCR4抗体的治疗的作用。优选地，检测的或测量的CCR4的存在或量用于决定施用本发明的抗CCR4制剂，优选地抗CCR4抗体。
本发明的方法和应用特别计划用于患有疾病或状况或处于疾病或状况发展的风险的动物和病患，所述疾病或状况与CCR4表达或活性相关或其中CCR4具有生物学作用。这样的疾病和状况包括由CCR4阳性细胞（典型地CCR4+、Th2或Th17细胞）介导的疾病，在结合CCR4配体后，所述细胞可以参与将引起紊乱或疾病或对紊乱或疾病有作用的信号转导途径。它们也包括由表达CCR4细胞的异常增殖引起的疾病。这样异常增殖的细胞可以是自然的CCR4+，或者它们可以是已经被突变或转化以表达CCR4。如上描述的，CCR4的表达可以帮助癌症细胞表达该抗原以躲避免疫系统。因此，本发明提供了治疗由CCR4介导的和/或由CCR4阳性细胞的异常增殖所表征的疾病或紊乱的方法。
从另一方面看，本发明提供了状况的治疗，其可以获益于以下的一种或多种：
（i）选择性消除CCR4+细胞；
（ii）抑制CCR4与一个或多个它的配体结合；
（iii）抑制CCR4介导的对CCR4配体的细胞反应，特别是抑制趋化作用或增加的细胞内钙离子浓度（细胞活化）。
优选地，所述CCR4配体是MDC和/或TARC。
本领域普通技术人员公知，由于CCR4涉及在广泛范围的疾病和紊乱中，一旦显示提供的抗CCR4治疗对任何可接受的模型系统有效，则该抗CCR4治疗可以用于治疗与CCR4表达相关的全部范围的疾病和紊乱。
在一种实施方式中，所述CCR4介导的状况是2型T辅助细胞介导的免疫疾病。“2型T辅助细胞介导的免疫疾病”的意思是涉及由于过敏原特异的Th2细胞的显现和激活的免疫球蛋白E（IgE）和肥大细胞的疾病。
CCR4介导的疾病或紊乱可以是与炎症、感染和/或癌症（包括血液癌和非血液癌）相关的疾病或状况。这样的疾病或紊乱可以用本发明的抗体和组合物治疗或预防。优选的疾病或状况包括：（1）过敏性疾病，如全身过敏或超敏反应、药物过敏症、过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）、虫刺过敏症和食物过敏症；（2）炎性肠疾病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎；（3）阴道炎；（4）牛皮癣和炎症性皮肤病，如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触皮炎、风疹和瘙痒症；（5）血管炎；（6）脊柱关节病；（7）硬皮病；（8）哮喘和呼吸过敏性疾病，如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、超敏肺疾病等等；（9）自身免疫疾病，如关节炎（包括风湿性的和牛皮癣的）、多发性硬化、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、肾小球性肾炎等等；（10）移植排斥（包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病）和（11）其中不期望的炎症反应需要被抑制的其它疾病，如动脉硬化、肌炎、T细胞介导的神经变性疾病、多发性硬化、脑炎、脑膜炎、肝炎、肾炎、脓毒病、结节病、过敏性结膜炎、耳炎、卡斯托曼病、窦炎、LPS诱导的内毒素休克、白塞病和痛风；（12）癌症，血液癌症和非血液癌症，优选地乳癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、外周T细胞淋巴瘤、非特异的弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、CTCL、独特地蕈状真菌病、塞扎里综合征、宫颈癌、肾癌、脑癌、前列腺癌、胃癌；（13）传染病，如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染、HIV感染和其它病毒感染。
本发明的抗体与CCR4的结合同样可以削弱CCR4阳性异常细胞（如癌细胞）的能力以躲避宿主免疫系统。本发明的抗体可以用于阻止由Treg细胞引起的DC抑制，因此提供本发明的抗CCR4抗体作为疫苗中的佐剂的应用。所述疫苗优选地是适用于癌症或传染性疾病的疫苗。所述疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗。“佐剂”的意思是提高宿主对抗原的免疫反应的试剂。当用作疫苗佐剂时，本发明的抗体因此典型地与抗原联合或共同给药，期望抗所述抗原能够引起免疫反应。
如在本文中使用的，术语“异常增殖”意思是偏离正常的、正确的或期望的过程的细胞增殖。例如，异常细胞增殖可以包括细胞不适当的增殖，所述细胞的DNA或其它细胞成分已经被破坏或有缺陷。
异常细胞增殖可以包括细胞增殖，所述细胞增殖的特征与由不适当的高水平细胞分裂、不适当的低水平细胞凋亡或二者所引起、介导或导致的迹象相关。这样的迹象的特征是例如癌的或非癌的，良性的或恶性的细胞、细胞群或组织的单一或多样的局部异常增殖。
本文中任何提及“肿瘤”同样指“癌症”或“癌”。同样可以治疗转移性癌，以及可以减少原发性肿瘤的转移。采用抗CCR4抗体的免疫疗法可能治疗在手术后期病患中留下的被称为微小残留疾病（MRD）。
因此本发明进一步提供治疗上述疾病的方法和在治疗上述疾病的方法中的应用，包括对患有这样疾病的动物或病患施用治疗有效量的本发明的抗CCR4抗体，或这样的抗CCR4抗体的抗原结合片段或免疫交联物。
本发明的另一方面提供了本发明的抗体或这样的抗体的抗原结合片段或免疫交联物在制备用于治疗、成像或诊断的组合物或药物中的应用。
本发明的另一方面提供了在治疗、诊断或成像中应用的本发明的抗体或这样的抗体的抗原结合片段或免疫交联物。
此外，本发明提供组合物，所述组合物包含本发明的抗体或这样的抗体的抗原结合片段或免疫交联物和一种或多种制药学可接受的赋形剂、载体、稀释剂、缓冲液或稳定剂。
本文描述的体内方法通常在哺乳动物中实现。可以处理任何哺乳动物，例如人和任何家畜、家养动物或实验动物。具体例子包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔子、母牛和猴子。但是优选地，所述哺乳动物是人。
因此，本文使用的术语“动物”或“病患”包括任何哺乳动物，例如人和任何家畜、家养动物或实验动物。具体例子包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔子、母牛和猴子。但是优选地，所述动物或病患是人受试者。
本发明联系了使用非结合的或裸露抗体和其片段治疗如上定义的紊乱和CCR4+细胞（优选地CCR4+肿瘤细胞）的方法，所述目标方法使用免疫交联物，其中本发明的抗体或抗原结合片段可操作地连接至治疗试剂。除非另有明确说明或者以科技术语解释，本文中使用的术语“抗体和其片段”因此意味着没有连接至另一种试剂的“未结合或裸露的”抗体或片段，所述试剂优选地是治疗或诊断试剂。这些定义并不排除所述抗体的修饰，如，仅作为示例，所述修饰是提高所述抗体或抗体与其它效应物的组合物的生物半衰期、亲和力、亲合力或其它性质。
本发明的方法和应用同样包括未结合的或裸露的抗体和免疫交联物的应用。在基于免疫交联物的治疗方法中，本发明的抗体或抗原结合片段优选地可操作地连接至第二种治疗试剂（抗CCR4抗体本身是第一种治疗试剂）。所述治疗试剂可以是例如抗癌症试剂或抗炎症试剂，包括皮质类固醇和非类固醇抗炎症药物（NSAID）。
前述的治疗方法和应用将通常包括对动物或病患系统地施用制药学有效的组合物，如通过经皮吸收、肌肉内注射、静脉注射等等。但是，可以接受使得治疗试剂定位在肿瘤位点的任何给药途径。因此，递送的其它合适途径包括口服、经鼻或呼吸和局部的。
本文使用的“给药（或施用）”指以有效发挥治疗效果（如抗肿瘤效果）的量和时间提供或递送抗CCR4抗体治疗。部分地，由于简单和可重复性，蛋白质治疗的被动给药通常是优选的。
但是，术语“给药（或施用）”在本文中用于表示将本发明的抗CCR4抗体递送或以其它方式提供至靶位点的任意和全部方式。因此，“给药（或施用）”包括以有效递送至靶位点的方式提供产生本发明的抗CCR4抗体的细胞。在这样的实施方式中，可以期望在选择性的可渗透膜、结构或通常是可以被移除以终止治疗的可植入的装置中配制或包裹所述细胞。外源的本发明的抗CCR4抗体通常也将是优选的，因为这代表了一种可以严密监视和控制剂量的非侵入性方法。
本发明的治疗方法和应用同样延及提供编码本发明的抗CCR4抗体的核酸，其有效导致所述核酸在肿瘤附近表达或导致所述核酸在靶位点定位。可以使用任何基因治疗技术，如裸露的DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送、包括离体处理病患细胞等等。
本发明的抗CCR4抗体同样可以用于将其它治疗或诊断试剂递送至靶位点。在这样的实施方式中，所述其它治疗或诊断试剂通常可操作地连接至本发明的抗CCR4抗体。
用在本发明的“治疗有效量”是指本发明的抗CCR4抗体或其免疫交联物的量，在对患有CCR4+肿瘤的动物或病患给药的基础上，所述量可以有效地特异杀死至少一部分靶CCR4+细胞，特异地诱导至少一部分靶CCR4+细胞的细胞凋亡，特异地诱导至少一部分靶CCR4+细胞坏死，抑制CCR4配体与CCR4结合，抑制CCR4介导的对CCR4配体的细胞应答、优选地抑制应答CCR4配体时细胞内钙离子浓度的增加，减少炎症，和/或诱导肿瘤衰退或好转。优选地，当在正常、健康组织中表现出很少结合和不结合、或很少杀死或不杀死细胞，以及对动物或病患的正常、健康组织发挥出可以忽略的或可以处理的副作用时实现这些效果。
“靶位点”是指介导紊乱或以引起或加剧紊乱的异常方式增殖的CCR4+细胞的位置。所述靶位点因此可以例如是肿瘤或CCR4介导的炎症的位点。“靶细胞”是介导紊乱或以引起或加剧紊乱的异常方式增殖的CCR4+细胞。因此，靶细胞可以例如包括CCR4+肿瘤细胞、CCR4+Treg细胞和/或CCR4+Th2细胞。
在本文中涉及的将CCR4+细胞如CCR4+肿瘤细胞杀死或诱导细胞凋亡或诱导细胞坏死或减少炎症或诱导肿瘤衰退或好转的内容中使用的术语“优选地”和“特异地”意思是实现CCR4+靶细胞破坏（如肿瘤细胞破坏和/或肿瘤坏死）的本发明抗CCR4抗体或其免疫交联物，其实际上被限制在靶位点上，且基本上不扩展引起动物或受试者的正常的、健康的组织破坏和/或组织坏死。
本发明的抗CCR4抗体或治疗结合物优选地连接至一种或多种放射疗法试剂、化学疗法试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞或细胞毒性试剂、细胞因子或趋化因子拮抗剂、细胞因子或趋化因子表达抑制剂、ATP酶抑制剂、抗炎症试剂、其它抗体（如双特异性抗体）或凝结剂（凝结因子）或抗炎症试剂如皮质类固醇、优选地糖皮质激素或非类固醇抗炎症药物（NSAID）。
因此本发明提供一系列连接的抗体和其片段，其中所述抗CCR4抗体可操作地连接至至少一种其它的治疗或诊断试剂。术语“免疫交联物”广泛地用于定义所述抗体与另一种有效试剂的可操作的联系，且不意味着单独表示任何类型的可操作的联系，特别是不限于化学“结合”。特别期待的是重组融合蛋白。只要递送或靶定试剂能够与所述目标结合，且在递送的基础上，所述治疗或诊断试剂充分起作用，则连接的模式将是合适的。
同样期待通过抗体上的糖基团连接试剂。O-连接和N-连接的糖基化都是在抗体中天然存在的。如果需要，可以对重组抗体进行修饰以重新产生或产生额外的糖基化位点，这可以通过将合适的氨基酸序列（如天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、丝氨酸或苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）加工至所述抗体的原始序列中而简单实现。
目前用于本发明的抗CCR4抗体或治疗结合物和相关方法和应用的优选试剂是补充或提高所述抗体的效果的那些试剂和/或选择用于具体类型紊乱（如肿瘤类型）或病患的那些试剂。
“补充或提高所述抗体的效果的治疗试剂”包括放射疗法试剂、化学疗法试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞或细胞毒性试剂、凝结剂、细胞因子或趋化因子拮抗剂、细胞因子或趋化因子表达抑制剂、ATP酶抑制剂、抗炎症试剂如皮质类固醇、优选地糖皮质激素或非类固醇抗炎症药物（NSAID）、其它抗体（如双特异性抗体），优选地它们中的一种或多种可以在此使用。
目前优选的抗癌症、特别是抗白血病试剂包括蒽环霉素药物，如道诺霉素、阿霉素、阿糖胞苷、6-硫鸟嘌呤、米托蒽醌、白消安
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、达沙替尼(SprycelTM)、强的松、硫酸长春新碱
Figure BDA00003566730700382
苯丁酸氮芥、氟达拉滨、喷司他丁和克拉屈滨。
目前治疗ATL的优选试剂包括齐多夫定（叠氮胸苷）和CHOP方式。CHOP代表环磷酰胺、羟基道诺霉素（阿霉素）、长春新碱（Oncovin）（长春新碱）、强的松/氢化波尼松。
目前优选的抗血管新生试剂包括血管抑素、内皮抑素、任何一种促血管生成素、血管抑制素、人血管生成抑制素和maspin。
本文使用的“抗微管蛋白药物”意思是抑制细胞有丝分裂的任何试剂、药物、前药或其组合物，优选地通过直接或间接抑制细胞有丝分裂所必需的微管蛋白活性（优选地，微管蛋白的聚合或解聚）。目前优选的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺和一种或多种的考步他汀（combretastatin）。
目前优选的NSAID包括COX-2抑制剂、磺酰苯胺、利克飞龙（licofelone）和ω-3脂肪酸。
所述优选试剂与本发明的抗CCR4抗体的连接或联系给出了“免疫交联物”，其中这样的免疫交联物通常具有提高的和甚至协同的治疗性质，如抗肿瘤或抗炎症性质。
抗细胞和细胞毒性试剂的应用导致了本发明的抗CCR4抗体“免疫毒素”，然而凝结因子的应用导致本发明的抗CCR4抗体“凝结配体（coaguligand）”。
同样期待至少两种治疗试剂的应用，如一种或多种放射疗法试剂、化学疗法试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞和细胞毒性试剂、细胞因子或趋化因子拮抗剂、细胞因子或趋化因子表达抑制剂、ATP酶抑制剂、抗炎症试剂如皮质类固醇、优选地糖皮质激素、或非类固醇抗炎症药物（NSAID）、其它抗体（如双特异性抗体）和凝结剂因子的组合。
在一些应用中，本发明的抗CCR4抗体治疗剂将可操作地连接至能够杀死细胞或抑制细胞生长或细胞分裂的细胞毒性试剂、抑制细胞生长试剂或其它的抗细胞试剂。合适的抗细胞试剂包括化学疗法试剂，以及细胞毒素和细胞生长抑制剂。细胞生长抑制剂通常打乱了靶细胞的自然细胞循环，优选地使得所述细胞从细胞循环中去除。
示例性的化学治疗试剂包括：激素，如类固醇；抗代谢物，如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或氨蝶呤；蒽环霉素；丝裂霉素C；长春花生物碱；抗生素；秋水酰胺；依托泊苷；光神霉素；和抗肿瘤烷化剂，如苯丁酸氮芥或美法仑。一些优选的抗细胞试剂是DNA合成抑制剂，如道诺霉素、阿霉素/亚德里亚霉素等等。大体上，目前优选的抗癌试剂是紫杉酚/紫杉醇、多烯紫杉醇、顺铂、吉西他滨、考步他汀和阿霉素/亚德里亚霉素。
V型ATP酶抑制剂目前同样是优选的，例如水扬酰胺（salicylihalamide）、刀球航霉素或巴弗洛霉素，同样优选的是蛋白合成抑制剂，如psymberin、青腰虫素、irciniastatin A。
由于与其它潜在的试剂相比，大多数毒素具有更强的递送细胞杀伤效应的能力，故在一些治疗应用中，毒素部分将是优选的。因此，用于本发明的抗CCR4抗体构建体的一些优选抗细胞试剂是来源于植物、真菌或细菌的毒素。示例性的毒素包括表鬼臼毒素；细菌内毒素或细菌内毒素的脂质A部分；核糖体失活蛋白，如皂草素或白树毒素；a-八叠球菌；曲霉素；局限曲霉素；核糖核酸酶，如胚胎核糖核酸酶；白喉毒素和假单胞菌外毒素。目前优选的例子是蓖麻毒素、白树毒素、红豆因、白喉、假单胞菌和百日咳毒素。
一些优选的毒素是A链毒素，如蓖麻毒素A链。最优选的毒素基团是已经过修饰或去除糖基残基的蓖麻毒素A链，被称为“去糖基化A链”（dgA）。去糖基化蓖麻毒素A链是优选的，因为它具有极强的潜力、更长的半衰期，且因为制造临床等级和规模的去糖基化蓖麻毒素A链是经济上可行的。同样可以使用重组和/或截短的蓖麻毒素A链。
本发明的抗CCR4抗体治疗剂同样可以包括能够促进凝结的成分，即凝结剂。这里，所述靶定抗体可以直接地或间接地（如通过另一种抗体）连接至一种直接或间接刺激凝结的因子。
用于这种应用的优选凝结因子是组织因子（TF）和TF衍生物，如截短的TF（tTF）、二聚体、三聚体、聚合体/多聚体TF和缺乏激活因子VII能力的突变体TF。其它合适的凝结因子包括依赖维生素K的凝结剂，如因子II/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa；缺乏Gla修饰的依赖维生素K的凝结因子；拉塞尔毒蛇蛇毒因子X活化剂；激活血小板化合物，如凝血噁烷A2和凝血噁烷A2合酶；和纤维蛋白溶解抑制剂，如α2-抗纤维蛋白溶酶。总体而言，目前优选的是截短的组织因子（tTF）。
免疫交联物和免疫毒素的制备是本领域公知的（见，如美国专利号4,340,535）。出于更进一步补充涉及免疫毒素的生产、纯化和应用的教导，通过引用的方式将下述每一项专利进一步结合至本文：美国专利号：6,004,554、5,855,866、5,965,132、5,776,427、5,863,538、5,660,827和6,051,230。
多种化学疗法试剂和其它药理学试剂同样可以成功地连接至本发明的抗CCR4抗体治疗剂。已经连接至抗体的示例性抗肿瘤试剂包括阿霉素、道诺霉素、氨甲蝶呤和长春碱。此外，已经描述了其它试剂如新制癌菌素、大分子霉素、三亚胺醌和α-蝇蕈素的连接（见美国专利号5,660,827、5,855,866和5,965,132，每一篇都结合至本文）。
同样可以容易地实现凝结配体的制备。一种或多种凝结因子与本发明的抗CCR4抗体的可操作的联系可以是直接联接，如上面对于免疫毒素所描述的那些。可选地，所述可操作地联系也可以是非直接的连接，如所述抗体可操作地连接至结合凝结因子的第二个结合区，所述第二个结合区优选地是抗体或抗体的抗原结合片段。所述凝结因子应当在与它的功能性凝结位点不同的位置与本发明的抗CCR4抗体连接，特别是使用共价键结合所述分子。
同样可以在本发明的方法中使用双特异性或三特异性抗体。在这样的抗体中，一条臂结合CCR4且是本发明的抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域公知并有描述的。
在制备免疫交联物、免疫毒素和凝聚配体中，可以使用重组表达。编码选择的本发明的抗CCR4抗体、治疗试剂、毒素或凝结剂的核酸分子序列在表达载体中框内连接。因此，重组表达导致核酸翻译以产生期望的免疫交联物。化学交联剂和抗生物素蛋白：生物素桥同样可以将治疗试剂和本发明的抗CCR4抗体连接。
本发明的组合物和方法可以与其它治疗剂和诊断剂联合使用。在生物试剂方面，优选地诊断试剂或治疗试剂，与本发明的抗CCR4抗体“结合”使用，术语“结合”简洁地用于包括一系列实施方式。除非另有明确的说明或以科学术语解释，“结合”术语应用于多种形式的组合的组合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一及第二医药用途。
本发明的“结合的”实施方式因此包括，例如其中本发明的抗CCR4抗体是裸露的抗体且与一种不与其可操作地连接的试剂或治疗试剂联合使用。在这样的例子中，所述试剂或治疗试剂可以以非靶定的或靶定的形式使用。在“非靶定的形式”中，所述试剂，特别是治疗试剂，将通常根据本领域的常规应用而使用。在“靶定的形式”中，所述试剂将通常可操作地连接至不同的抗体或靶定区，所述抗体或靶定区将试剂或治疗试剂递送至目标疾病位点。这样靶定形式的生物试剂（诊断剂和治疗剂）的应用在本领域中同样是非常标准的。
在本发明其它的“结合的”实施方式中，本发明的抗CCR4抗体是免疫交联物，其中所述抗体是与所述试剂或治疗试剂可操作地连接或结合的它本身。所述可操作的连接包括如本文中所述的和本领域已知的所有形式的直接和间接的连接。
所述“结合的”应用，特别是涉及本发明的抗CCR4抗体与治疗试剂结合同样包括组合的组合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一及第二医药用途，其中所述治疗试剂是前药形式。在这样的实施方式中，所述能够将前药转换成功能性形式的药物的激活成分可以再一次可操作地与本发明的抗CCR4抗体连接。
在一些优选的实施方式中，所述治疗组合物、混合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一及第二医药用途将是“前药组合物”。如本领域普通技术人员所理解的，除非有明确说明，术语“前药组合物”意思是本发明的抗体与能够将所述前药转换成活性药物的成分可操作地连接，而不是将抗体与前药本身连接。但是，没有要求本发明的前药实施方式必须用作前药组合物。因此，前药可以以本领域使用的任何方式所使用，包括ADEPT和其它形式。
因此，当描述组合的组合物、医药品、鸡尾酒、试剂盒、方法和第一及第二医药用途时，优选地以诊断试剂形式，更优选地以治疗试剂形式，所述组合物包括是裸露抗体的抗CCR4抗体和免疫交联物，且其中本发明的体内实施方式的实践包括在前、同时或在后施用裸露的抗体或免疫交联物和生物试剂、诊断试剂或治疗试剂；只要在一些结合的或未结合的形式中，实现提供全面提供一些形式的抗体和一些形式的生物试剂、诊断试剂或治疗试剂。
简单地解释了本发明关于肿瘤的上述和其它效果以解释组合模式的操作、连接试剂的类型等等。该描述的方法不应当被解释为本发明的抗CCR4抗体的有益性质的保守的陈述或过度简化。因此，应当理解为这样的抗体本身具有抗CCR4性质且这样抗体的免疫交联物将保留这些性质并将这些性质与连接试剂的性质结合；此外，所述抗体和任何连接试剂的结合效果将典型地被提高和/或放大。
因此，本发明提供组合物、药物组合物、治疗试剂盒和医学鸡尾酒，可选地在至少第一种组合物或容器中包括生物学有效量的至少第一种本发明的抗CCR4抗体或这样的抗CCR4抗体的抗原结合片段或免疫交联物；和生物学有效量的至少第二种生物学试剂、成分或系统。
所述“至少第二种生物学试剂、成分或系统”通常将是治疗或诊断试剂、成分或系统，但不需要一定是。例如，所述至少第二种生物学试剂、成分或系统可以包括用于修饰所述抗体和/或用于将其它试剂连接至所述抗体的成分。一些优选的第二种生物学试剂、成分或系统是用于制备和使用前药的前药或成分，包括用于制备前药本身的成分和配合本发明的抗体在这样的前药或ADEPT实施方式中起作用的成分。
当包括治疗试剂或诊断试剂作为至少第二种生物学试剂、成分或系统时，这样的治疗剂和/或诊断剂将典型地是在治疗或诊断一种或多种上述紊乱中使用的那些。
因此，在一些实施方式中，“至少第二种治疗试剂”将包括在治疗试剂盒或鸡尾酒中。术语“至少第二种治疗试剂”是针对本发明的抗CCR4抗体是第一种治疗试剂而言的。因此，本发明的抗体可以和化学疗法试剂、放射疗法试剂、细胞因子或趋化因子拮抗剂、细胞因子或趋化因子表达抑制剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂或抗癌免疫毒素或凝聚配体、或包括皮质类固醇和NSAID的抗炎症试剂结合，这些试剂的一些例子在本文的其它地方描述。
其它示例性的抗癌试剂包括如新霉素、鬼臼毒素、TNF-α、αvβ3拮抗剂、钙离子载体、钙流诱导试剂、以及它们的任意衍生物或前药。目前优选的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱、紫杉酚、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、考布他汀或它们的衍生物或前药。
在本发明的组合物、试剂盒和/或药物方面，所述治疗试剂的组合的有效量可以是包括在单一容器或容器装置中，或包括在不同容器或容器装置中。所述鸡尾酒通常将被混合在一起以组合使用。通常优选的是配制成静脉内给药的试剂。同样可以包括成像成分。所述试剂盒同样可以包括使用所述至少第一种抗体和所包括的一种或多种其它生物学试剂的说明书。
通常而言，所述至少第二种治疗试剂可以与本发明的抗CCR4抗体基本同时施用于动物或病患；所述第二种治疗试剂和本发明的抗CCR4抗体来自单一的药物组合物或来自紧密共同施用的两种药物组合物。
可选地，可以在施用本发明的抗CCR4抗体相续的时间内对动物或病患施用所述至少第二种治疗试剂。本文使用的“相续的时间”意思是“交错的”，使得在不同于施用本发明的抗CCR4抗体的时间对所述动物或病患施用至少第二种抗癌试剂。通常，在有效分隔开的时间内施用两种试剂以使得两种试剂发挥各自的治疗效果，即，在“生物学有效时间间隔”施用它们。可以在本发明的抗CCR4抗体之前的生物学有效时间或在所述治疗之后的生物学有效时间对所述动物或病患施用所述至少第二种治疗试剂。
因此，本发明提供治疗患有肿瘤的动物或病患的方法，包括：
（a）对所述动物或病患进行充分减少所述肿瘤负担的第一种治疗；和
（b）随后施用至少第一种本发明的抗CCR4抗体或其抗原结合片段；可选地其中所述抗体或片段可操作地与第二种治疗试剂连接。
优选的第一种治疗包括外科切除和化学疗法干涉。
在其它实施方式中，本发明提供治疗患有CCR4介导的紊乱的动物或病患，包括：
（a）对所述动物或病患进行充分减少所述CCR4介导的负担如炎症的第一种治疗；和
（b）随后施用至少第一种本发明的抗CCR4抗体或其抗原结合片段；可选地其中所述抗体或片段可操作地与第二种治疗试剂连接。
在一些其它实施方式中，本发明的抗体和免疫交联物可以与一种或多种诊断试剂结合，典型的诊断试剂是在诊断如上所述的紊乱中所使用的。因此本发明包括一系列的诊断组合物、试剂盒和方法。
更多方面是诊断或成像受试者的方法，包括对受试者施用合适量的如本文所定义的本发明的抗体或其它蛋白并检测受试者中所述的本发明抗体或其它蛋白的存在和/或量和/或位置。
在一种实施方式中，本发明提供一种减少动物中与CCR4表达相关的免疫抑制的方法，包括对所述动物施用有效量的本发明的抗体或它的免疫交联物，以在所述动物中形成所述抗体和CCR4的复合物，从而减少动物中与CCR4表达相关的免疫抑制。
根据上述应用和方法成像或诊断的合适疾病包括任何疾病，优选地是在本文其它地方描述的任何癌症。
在一种实施方式中，本发明提供一种在动物中诊断疾病或监测疾病进程的方法，包括步骤：
（a）用本发明的抗体或其免疫交联物接触取自所述动物的检测样品。
在另一种实施方式中，本发明提供一种在动物中诊断疾病或监测疾病进程的方法，包括步骤：
（a）用本发明的抗体或其免疫交联物接触取自所述动物的检测样品；
（b）测量或检测所述检测样品中抗体-抗原复合物的存在和/或量和/或位置；以及可选地
（c）将检测样品中抗体-抗原复合物的存在和/或量与对照样品进行比较。
在上面的方法中，在允许形成抗体-抗原复合物的条件下完成所述接触步骤。本领域技术人员可以容易地决定合适的条件。
在上述方法中，可以使用任何合适的检测样品，如怀疑感染疾病的活检细胞、组织或器官或组织切片。
在上述方法中，在检测样品中存在任何量的抗体-抗原复合物将预示着存在疾病。优选地，对于阳性诊断，所述检测样品中抗体-抗原复合物的量大于、优选地明显大于在合适的对照样品中发现的量。更优选地，所述明显更大的水平是统计学显著，优选地概率值<0.05。测量统计显著性的合适方法是本领域公知的并有文献记载的，且可以使用这些中任一种。
监测疾病的进程同样可以包括随时间监测检测样品中抗体-抗原复合物的存在和/或量。因此，监测可以包括（d）将取自所述动物的第一种检测样品中抗体-抗原复合物的存在和/或量与取自所述动物的第二种检测样品中抗体-抗原复合物的存在和/或量进行比较。“第一种检测样品”的意思是在取出“第二种检测样品”之前取出的样品，例如在取出第二种检测样品之前的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天、周、月或年取出的样品。与第一种检测样品相比，在第二种检测样品中抗体-抗原复合物的量的减少表示疾病好转，而增加表示疾病恶化。
本领域技术人员可以容易地选择合适的对照样品，例如，在诊断具体疾病情况下，合适的对照可以是取自不患有疾病的受试者的样品。同样可以容易地测定合适的对照“值”而不需要在每一次检测中运行对照“样品”，例如，通过参考本领域已知的正常受试者的范围。
对于在诊断或成像应用中使用，本发明的抗体可以用可检测的标记物标记，所述标记物如不透射线物或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；放射性发射体（如α、β或γ发射体）；荧光（荧光团）或化学发光（发色团）化合物，如异硫氰酸荧光素、若丹明或萤光素；酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子；或化学基团如生物素，其可以通过结合特异的同类可检测基团（如标记的抗生物素蛋白/链霉亲和素）而被检测。将标记物连接至结合蛋白（如抗体或抗体片段）的方法是本领域已知的。这样的可检测标记物可以检测所述检测样品中结合蛋白-抗原复合物的存在、量或位置。
在体内使用的优选的可检测的标记物包括X-射线可检测的化合物，如铋(III)、金(III)、镧(III)或铅(II)；放射性离子，如铜67、镓67、镓68、铟111、铟113、碘123、碘125、碘131、汞197、汞203、铼186、铼188、铷97、铷103、锝99m或钇90；核磁自旋共振同位素，如钴(II)、铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒(III)、钆(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、锰(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或镱(III)；或若丹明或荧光素。
本发明同样包括包含本发明抗体的诊断或成像试剂，所述本发明抗体连接至直接或间接产生可检测的信号的标记物。合适的标记物在本文其它地方描述。
本发明进一步提供试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种本发明的抗体、免疫交联物或组合物或一种或多种编码本发明抗体的核酸分子、或一种或多种包括本发明的核酸序列的重组表达载体、或一种或多种包括本发明的重组表达载体或核酸序列的宿主细胞或病毒。优选地，所述试剂盒用于本文描述的方法和应用中，如本文描述的治疗、诊断或成像方法，或用在本文描述的体外分析或方法中。在这样试剂盒中的抗体优选地是本文其它地方描述的抗体结合物，如可以连接至可检测基团或可以是免疫交联物。优选地，所述试剂盒包括说明所述试剂盒成分如在诊断中使用的说明书。优选地，所述试剂盒用于诊断或治疗本文其它地方描述的疾病，且可选地包括说明所述试剂盒成分在诊断或治疗这样疾病中应用的说明书。
本文定义的本发明的抗体同样可以用作体外或体内应用和分析的分子工具。由于所述抗体具有抗原结合位点，这些可以作为特异结合对的成员而起作用且这些分子可以用在需要特异结合对成员的任何分析中。
因此，本发明的其它方面提供包含本文定义的本发明抗体的试剂，以及这样抗体用作如体外或体内分析中的分子工具的应用。
可以通过以下方式完成癌症治疗：
（a）通过对患有肿瘤的动物或病患施用诊断量的至少第一种可检测的-标记的本发明的抗CCR4抗体、包括可操作地连接至本发明的抗CCR4抗体的诊断试剂形成肿瘤图像，从而形成肿瘤的可检测图像；以及
（b）随后对同样的动物或病患施用治疗最优化量的本发明的至少第一种裸露的抗CCR4抗体或使用同样抗体的治疗剂-抗体构建体，从而引起抗肿瘤效果。
SEQ ID NO:16和18是一样的，因此在本文公开的任何实施方式中，提及SEQ ID NO:16的情况应当被理解为包括提及SEQ ID NO:18的情况，反之亦然。
现在，将参考所述表和图在以下非限定性实施例中更详细地描述本发明，其中，
表1列出了本文公开的涉及抗体208的一些序列。
表2列出了本文公开的涉及抗体306的一些序列。
表3列出了本文公开的涉及抗体308的一些序列。
表4列出了本文公开的涉及抗体406的一些序列。
表5列出了本文公开的涉及抗体501的一些序列。
表6列出了本文公开的涉及抗体503的一些序列。
表7列出了本文公开的涉及抗体601的一些序列。
表8列出了本文公开的涉及抗体603的一些序列。
表9列出了本文公开的涉及抗体803的一些序列。
表10列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体208的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表11列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体306的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表12列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体308的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表13列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体406的一些序列。所述可变区用下划线表示
表14列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体501的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表15列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体503的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表16列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体601的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表17列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体603的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表18列出了本文公开的涉及IgG形式的抗体803的一些序列。所述可变区用下划线表示。
表19显示了源自TARC介导的钙流抑制的计算的IC50值。
表20显示了从使用标记的配体的抗CCR4IgG的配体干涉结合实验测定的IC50值（实施例3）。没有对KW0761进行检测。通过最小平方（R2）值判断拟合质量。
表21是抗CCR4抗体在配体介导的钙流实验（实施例5）中的拮抗特性的总览。在TARC诱导的钙流情况中，测量IC50值并通过最小平方（R2）判断拟合质量。当抗CCR4抗体为10μg/ml时，抗CCR4抗体对MDC诱导的信号转导的抑制效果最大，表示为%。没有对KW0761进行检测。
表22是由抗CCR4抗体抑制的配体诱导的迁移（TARC和MDC）中测量的IC50值和保留的迁移（以%表示）的总览。当存在如实施例6中描述的配体时，从滴定曲线获得IC50值。通过最小平方（R2）判断拟合质量。在抑制MDC的情况中，最大抑制存在于IgG浓度是10μg/ml时。
表23是从由抗CCR4抗体503对786-O细胞的TARC诱导的侵入的抑制所测量的IC50值的总览。如实施例6中所描述的，IC50值来自存在TARC（25和125nM）时的滴定曲线。通过最小平方（R2）判断拟合质量。
表24是从如在实施例9中描述的对血液肿瘤细胞系CCRF-CEM和L-428的ADCC实验所测量的EC50值的总览。通过使用GraphPad（Prism）将数据拟合成“log（拮抗剂）vs反应模型”而获得测量的EC50值。在给定的浓度时存在最大的细胞毒性值。
表25是来自用于肾细胞癌肿瘤微阵列（TMA）和相应对照组织（胎盘和正常肾）的IHC实验的得分表。给出在一个TMA上着色的全部核心数量中着色为阳性的核心数量。由于被损坏的核心不计算，着色的核心的数量对于每一种着色不同。零表示没有着色，1表示中间着色，2表示强烈着色。
图1.实施例2的结果：抗CCR4的scFv与表达CCR4的靶细胞的结合。使用抗Myc抗体（小鼠）交联scFv以模拟二聚情形，并且将scFv从10μg/ml开始3倍稀释。使用RPE-结合的抗小鼠IgG检测结合的scFv。a）与CCR4阳性DT40细胞结合。b）与CCR4阴性DT40细胞结合。
图2.实施例2的结果：抗CCR4的scFv208与表达CCR4的Hek293T细胞的结合和 其与CCR4阴性的Hek293T细胞的结合的比较。使用抗Myc抗体（小鼠）交联scFv以模拟二聚情形，并且将scFv从10μg/ml开始3倍稀释。使用RPE-结合的抗小鼠IgG检测结合的scFv。
图3.实施例2的结果：抗CCR4的scFv与表达CCR4的天然靶细胞（CCRF-CEM） 的结合。使用抗Myc抗体（小鼠）交联scFv以模拟二聚情形，并且将scFv从20μg/ml开始3倍稀释。使用RPE-结合的抗小鼠IgG检测结合的scFv。
图4.实施例3的结果：使用Alexa647标记的MDC-SNAP的抗CCR4的scFv的配体 干扰的结合实验。ScFv在5μg/ml(150nM)的浓度下孵育并在存在固定浓度的MDC-SNAP（50nM）时在12个稀释点上3倍稀释。
图5.实施例3的结果：存在TARC和MDC时抗CCR4的scFv的配体干扰的结合实 验。在存在2.5μg/ml的小鼠抗Myc抗体（小鼠）和固定浓度的配体（1μg/ml）时，以0.5μg/ml的浓度孵育scFv，并使用抗小鼠RPE结合的抗体染色。ScFv如在实施例1中所描述的（不存在候选物601）。比较仅用抗体对照染色的细胞（背景）的信号和未染色的细胞（未染色）的信号。
图6.实施例4的结果：存在生物素化的KW0761-IgG时，抗CCR4抗体208、306、 308、406、501、503、601、603、803和KM3060var之间的竞争实验。使用PE结合的链霉亲和素检测生物素化的KW0761-IgG。
图7.实施例5的结果：抗CCR4scFv抗体与KM3060var对TARC介导的钙流的抑制 的比较。在存在递增的scFv浓度时，以终浓度28.6ng/μl(3.6nM)孵育TARC，所述scFv被滴定为6个稀释点，从0.5μg/ml开始。所述信号表示为%，其中100%信号转导表示存在TARC配体、但不存在scFv抗体的记录信号。
图8.实施例5的结果：抗CCR4scFv抗体对MDC介导的Ca流的抑制。在存在10μg/ml的固定scFv浓度的情况下，以终浓度为5ng/μl（6.25nM）孵育MDC。所述信号表示为%，其中100%信号转导表示存在MDC配体、但不存在scFv抗体的记录信号。
图9.实施例6的结果：存在递增浓度的抗CCR4scFv抗体（0.36至333nM）时，对 CCR4+CCRF-CEM细胞的TARC介导的趋化作用的抑制。TARC具有3.5nM的固定浓度。所述信号表示为%，其中100%表示存在TARC配体、但不存在scFv抗体时的细胞迁移。所述图按尺寸制作。
图10.实施例2的结果，抗CCR4IgG与表达CCR4的靶细胞的结合。在定义的浓度下孵育IgG并使用RPE结合的抗人IgG检测结合的IgG。a）与CCR4阳性CCRF-CEM细胞结合。IgG在8个点上从1μg/ml开始4倍稀释。b）与CCR4阳性Hut78细胞结合。IgG在8个点上从1μg/ml开始4倍稀释。c）与CCR4阳性L-428细胞结合。IgG在8个点上从10μg/ml开始3倍稀释。
图11.实施例2的结果，在存在人血清时，与表达CCR4的靶细胞（CCRF-CEM）结 合。在0%人血清（FACS缓冲液）或10%和50%人血清时以10μg/ml孵育生物素化的样品。通过PE-结合的链霉亲和素检测样品。a）记录的结合信号的比较。b）转换成%的保留的结合信号。
图12.实施例3的结果，使用标记的配体的抗CCR4IgG的配体干扰的结合实验。a）在存在固定浓度的Alexa647标记的MDC-SNAP（50nM）时，在5μg/ml（35nM）的浓度下孵育IgG，并在8个稀释点上4倍稀释IgG。b）在存在固定浓度的生物素化的TARC（3.12μM）时，在2.5μg/ml（17.5nM）的浓度下孵育IgG，并在8个稀释点上4倍稀释IgG。使用PE结合的链霉亲和素检测保留的结合的生物素化的TARC。
图13.实施例6的结果：785-O细胞的CCL17/TARC介导的侵入的抑制。在存在递增浓度的抗CCR4抗体503（μg/ml）时，在两种不同浓度的CCL17/TARC（25和125nM）下孵育细胞。如在实施例6中所描述的，染色并分析迁移的细胞，并将其转换成%。点线（y=25%）表示在分析过程中786-O细胞的基本侵入能力。
图14.实施例9的结果：ADCC对表达CCR4的细胞系CCRF-CEM（a）和L-428（b） 的诱导。在存在人PBMC时，在如实施例1中描述的不同浓度的抗CCR4抗体下孵育钙黄绿素标记的靶细胞。KW0761作为对照。ADCC的诱导被转换为%基于样品的荧光强度，所述样品在用TritonX-100处理后有100%细胞溶解。通过非线性回归分析计算剂量响应曲线。
图15.实施例9的结果：ADCC对表达CCR4的分离的T reg 细胞的诱导。如实施例9所描述的分离Treg细胞，用钙黄绿素标记，并在存在自体同源的PBMC时与单浓度（4.5μg/ml）的抗CCR4抗体一起孵育。通过在存在Triton时标准化为钙黄绿素从细胞的最大释放量将细胞毒性转换成%。显示了杀死的百分率。
图16.实施例10的结果：抗CCR4抗体在成人T细胞淋巴瘤白血病（ATLL）的人异 种移植物模型中的体内功效。呈现的是在研究过程中在肿瘤移植（TI）之后所测量的不同组的体重。由于大的肿瘤体积，组A（对照组）在23天后处死。a）治疗过程中的平均体重（g）。b）治疗过程中的相对体重（以%）。
图17.实施例10的结果：抗CCR4抗体在成人T细胞淋巴瘤白血病（ATLL）的人异 种移植物模型中的体内功效。在研究期间在肿瘤移植（TI）之后，不同组（a-e）的测量的肿瘤体积的比较。将个体肿瘤体积（以mm3测量）按照肿瘤移植（TI）后的时间划分。由于大的肿瘤体积，所述对照组（组A）在第23天时处死。
图18.实施例10的结果：抗CCR4抗体在成人T细胞淋巴瘤白血病（ATLL）的人异 种移植物模型中的体内功效。a）在不同实验组之间的肿瘤平均值。显示出每组中存活动物的数量。b）存活比例，通过比较个别处理组（抗体）vs未处理（对照）组而计算。对于抗CCR4抗体306和503确定为统计学显著值。c）在第23天计算的肿瘤倍增时间。对于抗CCR4抗体503确定为统计学显著差异（标记为*）。
图19.实施例12的结果：抗CCR4抗体503与来自肾细胞癌（RCC）病患的肿瘤微阵 列的结合。在石蜡包埋的组织切片上评估IgG503的结合。在3μg/ml浓度下孵育抗体并用山羊生物素结合的抗人抗体（1:500）孵育以显像，用vectastain elite ABC试剂盒以二氨基联苯作为底物显像。显微镜的放大倍率以X-倍给出。所述染色在来自脾的阳性对照组织（a）上被最优化并在正常人胎盘组织（b）上被证实特异性。与来自RCC病患的组织的结合在c）和d）中呈现。
实施例
比较信息
如上面所讨论的，已知的抗CCR4抗体家族包括KM2160、KM3060、KM2760和KW-0761，其识别在人CCR4的N末端氨基酸的位置2-29区域中存在的抗原表位（EP1270595）。
在本文报道的一些实验中，本发明的发明人已经使用KM3060var（在本文中也被称为“KM3060v”），其对应于KM3060，但是可能具有不同的糖模式，因为它在不同宿主中表达。该抗体以scFv形式使用。
在本文报道的一些实验中，本发明的发明人已经使用IgG形式的KW0761。
KM2760已经被报道不阻断CCR4和TARC或MDC之间的交互作用(Ishida等2006,Cancer Research66(11)，5716-5722页)。本申请人的使用KM3060var的发现与该报道一致。
KM2760已经被报道不抑制CCR4信号转导。本申请人已经发现KM3060var不抑制MDC或TARC诱导的钙流。本申请人同样已经发现KM3060var不产生明显的对MDC或TARC介导的趋化作用的抑制。
实施例1：新抗体
已经鉴定了九个能够特异结合CCR4的人类抗体。将单链形式的抗体克隆至pHOG21质粒中，所述质粒包含c-myc和6个组氨酸标签表位。转染TG1细菌，用IPTG诱导scFv表达。通过EasyCyte确认纯化的scFv的结合（见实施例2）。
对产生克隆的抗体的重链和轻链的核苷酸序列测序。所述抗体被指定为208、306、308、406、501、503、601、603和803。208、306、308、406、501、503、601、603和803的轻链和重链的CDR区等序列分别在表1-9中示出。
同样制备IgG形式的抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803。使用标准方案制备IgG。简要地，将编码相对应的可变域的基因克隆至哺乳动物表达载体pLNO中，所述表达载体包含人恒定域基因(Norderhaug等,1997)。所述抗体在细胞工厂中表达，收获的第一拨产品通过蛋白A柱纯化并通过尺寸排阻色谱法分馏成单体。所述IgG保留了它们特异结合CCR4的能力。
这些抗体的IgG形式是IgG1同种型，并包括两条重链和两条轻链。每一重链包括一个VH域（在相应的表中显示的序列）和人IgG1恒定区。每一轻链包括一个VL域（在相应的表中显示的序列），和人拉姆达轻链恒定区。如在实施例7中所解释的，制备去岩藻糖化的形式的IgG抗体。本文描述的任何使用本发明的IgG形式的抗体的实验使用去岩藻糖化的形式。
实施例2：抗CCR4抗体与表达目标的细胞的结合
为证明实施例1中公开的抗体的CCR4特异性，用scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803在流式细胞计数中对内部转染有CCR4和未转染CCR4的HEK293T细胞、DT40细胞和天然的CCR4+CCRF-CEM细胞系染色。使用内部克隆的并表达KM3060var scFv作为阳性对照。抗GFP scFv抗体（针对绿色荧光蛋白所产生）用作阴性对照。
CCRF-CEM(急性淋巴细胞性白血病，ATCC号CCL-119)、HEK293T/17(人肾，ATCC号CRL-11268)，和DT40(鸡淋巴瘤，ATCC号CRL-2111)细胞系从美国模式培养物保藏所(ATCC,洛克维尔,MD)获得。
对于用人CCR4瞬时转染，将Hek293T/17细胞在T75（NUNC）瓶中播种为2×106个细胞。播种48小时后，使用Fugene（ROCHE）作为转染试剂，用pcDNA3.1质粒转染所述细胞，所述质粒编码人CCR4。每个T75使用40μl Fugene和16μg DNA。转染后48小时，将所述细胞用于分析。
CCRF-CEM细胞和DT40细胞在RPMI-1640培养基中培养，HEK293T细胞在Dulbecco'sModified Eagle Medium(DMEM)培养基中培养。所有的细胞用胎牛血清培养，对于DT40细胞和HEK293T细胞，其浓度是10%；对于CCRF-CEM细胞，其浓度是20%。所有的培养基都补充有青霉素和链霉素。
对于流式细胞计数实验，从培养瓶中收获细胞，用PBS清洗两次，用含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS重悬，最后等分成至V型96孔板(Greiner Bio-One,福利根豪森,德国)中，每孔1×105个细胞。将细胞在400×g下离心5分钟并在4℃下用不同scFv稀释度孵育60分钟。
所有的scFv制品都在添加至细胞之前用小鼠抗myc抗体（9E10.2，Diatec,奥斯陆，挪威）预孵育以交联scFv，并从10μg/ml的浓度起始三倍稀释。
在用含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS清洗之后，4℃下，所述细胞用1μg/ml的RPE连接的山羊抗小鼠IgG（AbDSerotec,杜塞尔多夫,德国）染色30分钟。清洗所述染色的细胞，用200μl的含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS重悬并转移至U型96孔板(Corning,Schiphol-Rijk,荷兰)中用于在EasyCyte流式细胞仪（Guava Technologies,Hayward,CA,美国）中获得结果。
获得的结果清楚地表明scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803特异于CCR4。scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803同CCR4阳性DT40细胞的结合与它们同CCR4阴性DT40细胞的结合比较在图1中例示。同样显示了与CCR-HEK293T细胞相比，scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803同CCR4+HEK293T细胞的选择性结合（图2；仅显示对于抗体208的数据）。scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803与表达CCR4的CCRF-CEM细胞的结合在图3中例示。
通过与结合HEK293T/17细胞和转化的以表达人CCR4的HEK293T/17细胞进行比较，同样确认了在去岩藻糖化的IgG1形式下的抗体306、406和503的CCR4特异性（见实施例7）。使用流式细胞仪同样检测了这些抗体与CCR4阳性细胞系CCRF-CEM、L-428、Hut78、786-O、A498、KatoIII和MCF-7的结合。
使用抗CCR4抗体1G1（BD Pharmingen,Franklin Lakes,NJ,美国）、抗CCR4抗体Ab1669（Abcam,剑桥，英国）以及体内产生的KW0761IgG（见上文）作为阳性对照。结合类鸦片样药物海洛因的同种型对照抗体6-MAM和抗GFP抗体（针对绿色荧光蛋白所产生）用作阴性对照。体内产生的两种抗体都是IgG1分子。
为证明在存在人血清时结合表达目标的细胞，根据EZ-连接马来酰亚胺-PEG固相生物素化试剂盒（Thermo Fisher，Rockford，IL，美国）的手册，通过半胱氨酸对抗CCR4抗体306、406、503和KW0761进行生物素化。
CCR4阳性细胞系CCRF-CEM、Hut78(皮肤T细胞淋巴瘤，ATCC号TIB-161)、786-O(人肾细胞癌，ATCC号CRL-1932)、MCF-7(人乳腺癌，ATCC号HTB-22)、KatoIII(人胃癌，ATCC号HTB-103)和HEK293T/17细胞系从美国模式培养物保藏所(ATCC,洛克维尔,MD，美国)获得。L-428细胞(非霍奇金淋巴瘤,DSMZ号ACC197)和A-498(人肾细胞癌,DSMZ号ACC55)获自“德国微生物菌种保藏中心”(DSMZ,布伦瑞克，德国)。CCRF-CEM、L-428、Hut78、786-O和KatoIII细胞在RPMI-1640培养基中培养。HEK293T/17和MCF-7细胞在Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM；来自PAA，目录号E15-810)培养基中培养。A-498细胞在EMEM培养基中培养。所有细胞都用10%的胎牛血清培养（来自PAA目录号A15-252），但是CCRF-CEM、L-428、Hut78和KatoIII用20%的胎牛血清培养。所有的培养基都补充有青霉素和链霉素(来自PAA，目录号P11-010)。
对于流式细胞术实验，从培养瓶直接收获悬浮细胞系CCRF-CEM、Hut78和L-428。贴壁细胞系Hek293T/17、786-O、A-498、KatoIII和MCF-7用PBS清洗两次，并根据生产商的方案在室温下通过用Accutase(PAA实验室，林茨，奥地利)孵育3分钟以与培养瓶分离。用含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS重悬所有细胞并最终等分至V型96孔板(GreinerBio-One，福利根豪森，德国)中，使得每孔1×105细胞。将细胞在400×g下离心5分钟，然后用不同的IgG稀释度在4℃下孵育60分钟。对于在存在人血清时的结合，在37℃下在10%或50%人血清(Sigma Aldrich，圣路易斯，MO，美国)中用不同的IgG溶液孵育CCRF-CEM细胞60分钟。
在用含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS清洗之后，在4℃下用1μg/ml的RPE结合的山羊抗人IgG(AbD Serotec，杜塞尔多夫，德国)对细胞染色30分钟。清洗染色的细胞，用200μl含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS重悬细胞并将细胞转移至U型96孔板(Corning,Schiphol-Rijk，荷兰)用于EasyCyte(Guava Technologies，Hayward，CA，美国)。
获得的结果清楚地确认了IgG抗体306、406和503特异于CCR4。IgG306、406和503与CCR4阳性Hek293T/17细胞的结合明显高于它们与CCR4阴性Hek293T/17细胞的结合。对照抗体1G1同样结合CCR4阳性Hek293T/17细胞，但信号强度较弱。
图10例示了IgG抗体306、406和503与表达血液CCR4的L428细胞和Hut78细胞以及CCRF-CEM细胞的结合。同样确认了306、406和503与786-O、A498、KatoIII和MCF-7的结合，但是阴性对照抗体与这些细胞系不结合（数据未显示）。
再次确实地，如在涉及细胞系CCRF-CEM的图11中所例示的，在存在递增浓度的人血清时，没有抑制抗CCR4抗体与CCR4阳性细胞的结合。
图11还显示了抗体306、406和503的结合优于抗体KW0761的结合。当分析与细胞系KatoIII、MCF-7和A498的结合时，有相似的观察结果（数据未显示）。
抗CCR4抗体306、406和503与不同CCR4+细胞系的结合性质显示一些CCR4+细胞系与其它CCR4+细胞系相比的增加的结合。例如，与CCRF-CEM相比，与L-428的结合减少。已知L-428分泌CCR4配体TARC（见Ishida T等，Leukemia卷20，2006），且抗CCR4抗体306、406和503与TARC竞争CCR4结合位点（见实施例3）。
抗CCR4抗体306、406和503的结合性质与KW0761的结合性质不同。例如，KW0761显示与L-428增加的结合。不期望被任何理论限制，认为这是由于这些抗体的不同的抗原表位结合位点（如在实施例4中概述的）。KW0761不抑制CCR4和TARC的结合，因此它不与L-428分泌的TARC竞争。
此外，测量的EC50值在细胞系与细胞系间有不同的值（数据未显示），这被认为是由于CCR4在不同细胞类型的表面上表达的差异。
实施例3：抗CCR4抗体干扰配体结合
为确定来自实施例1的抗CCR4抗体是否干扰CCR4配体和受体结合，进行竞争实验。为此，在存在递增浓度的scFv中，在固定浓度的MDC-SNAP孵育CCR4阳性CCRF-CEM目标细胞。将MDC遗传性地融合至SNAP标签的N末端，使得所述SNAP标签融合至MDC的C末端。所述SNAP标签源自20kDa的DNA修复蛋白O6烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。在Geneart（雷根斯堡，德国）定制编码MDC-SNAP融合蛋白的基因并用所述基因瞬时转染HEK293/T细胞。5-6天后，通过Ni-NTA亲和柱纯化所述融合蛋白，随后通过空间排阻分离单节MDC-SNAP片段。根据Alexa Fluor647分子探针标记试剂盒(InvitrogenCorporation，圣地亚哥，加拿大)的手册中的程序，用Alexa647标记MDC-SNAP。MDC-SNAP结合CCR4的功能性在关于CCRF-CEM细胞的趋化性分析中确认（数据未显示）。
从培养瓶中收获CCR4+CCRF-CEM细胞，用RPMI-1640培养基清洗两次，并等分至V型96孔板(Greiner Bio-One，福利根豪森，德国)中，使得每孔1×105个细胞。将细胞在500×g下离心5分钟，吸取上清液。ScFv208、306、406、501、503、601、603和803（不包括样品308）在8个稀释点上以5μg/ml(150nM)起始3倍稀释，并在4℃下，在存在固定浓度的140ng/ml MDC-SNAP（50nM）的含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS时在细胞上孵育60分钟。在用含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS清洗三次后，将细胞重悬在200μl的含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS中并转移至U型96孔板（Corning，Schiphol-Rijk，荷兰）用于使用FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences，海德堡，德国）的流式细胞术以记录Alexa647标记的MDC-SNAP融合蛋白的信号。所述结果显示了随着递增的scFv浓度，染色信号明显下降（图4）。这表示所述抗体干扰配体结合并因此具有CCR4阻断活性。
进行相似的实验以检验实施例1中描述的scFv是否干扰TARC配体和MCD配体与CCR4结合。因此，从培养瓶中收获CCR4+DT40细胞，用RPMI-1640培养基清洗两次并等分至V型96孔板(Greiner Bio-One，福利根豪森，德国)中，使得每孔1×105个细胞。将细胞在500×g下离心5分钟，吸取上清液，然后在37℃下用含有0或1μg/ml的TARC或MDC(PeproTech EC，伦敦，英国)的RPMI-1640培养基孵育30分钟。在500×g下离心5分钟后，吸取上清液，在4℃下用0.5μg/ml的scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803以及2.5μg/ml的小鼠抗cMyc抗体(9E10.2;DIATEC Monoclonals,奥斯陆，挪威)与细胞孵育1小时。将细胞在500×g下离心5分钟，然后在4℃下用1μg/ml的RPE结合的山羊抗小鼠IgG(BD Pharmingen,圣地亚哥，美国，CA)孵育45分钟。清洗细胞，将细胞重悬在200μl含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS中，然后转移至U型96孔板（Corning，Schiphol-Rijk，荷兰）用于使用EasyCyte装置（Guava Technologies，Hayward，CA，美国）的流式细胞术。在存在TARC和MDC孵育scFv时，所述结果显示染色信号明显减少（图5）。这表明实施例1中描述的scFv干扰配体结合并因此具有CCR4阻断活性。
使用基本相似方案以检测IgG1形式的306、406和503对配体结合的作用。KW0761用于对照。使用软件Prism（GraphPad）的模型“log(抑制剂)vs.反应”通过非线性回归曲线拟合而拟合所述实验数据，并总结在表20中。
所述结果显示，随着IgG浓度递增（除了KW0761），标记的配体MDC和TARC的染色信号均明显下降（图12）。这表明IgG1形式的306、406和503干扰配体结合并因此具有CCR4阻断活性。
实施例4：抗CCR4抗体之间的竞争
为分析抗CCR4抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803与KW3060var相比所识别的抗原表位，使用流式细胞仪进行竞争实验。在存在不同浓度的单链形式的非生物素化的抗CCR4抗体（208、306、308、406、501、503、601、603、803和KW3060var）分析生物素化的KW0761IgG抗体与CCR4+CCRF-CEM细胞的结合。从培养瓶中收获CCR4+CCRF-CEM细胞，用RPMI-1640培养基清洗两次，并等分成至V型96孔板(GreinerBio-One,福利根豪森,德国)中，每孔1×105个细胞。将细胞在500×g下离心5分钟并吸取上清液。使用标准方法生物素化抗体KW0761-IgG。在4℃，在1μg/ml的固定浓度的抗CCR4scFv208、306、308、406、501、503、601、603、803和KW3060var存在下，将生物素化的KW0761-IgG与CCRF-CEM细胞孵育1小时，所述抗CCR4scFv208、306、308、406、501、503、601、603、803和KW3060var在8个滴定点上三倍稀释，起始是5μg/ml。用含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS清洗之后，在4℃下，用2.5μg/ml的链霉素-RPE（BDPharmingen，圣地亚哥，CA，美国）对细胞染色30分钟，以检测生物素化的KW0761-IgG。清洗被染色的细胞，将细胞重悬在250μl的含有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS中，并转移至U型96孔板（Corning，Schiphol-Rijk，荷兰）用于使用FACS Canto II流式细胞仪（BDBiosciences，海德堡，德国）获得数据。
在图6中显示的结果表明，实施例1中描述的抗CCR4抗体都不与KW0761竞争结合细胞，仅观察到抗体KW0761-IgG和KM3060var scFv之间的竞争。这表明，抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803同KM3060var或KW0761不结合相同的抗原表位。
使用基本相似的方案分析IgG1形式的306、406和503与KW0761以及它们彼此之间的竞争。该实验证实了抗体306、406和503彼此竞争，但不与KW0761竞争（数据未显示）。
实施例5：拮抗活性
分析了抗体208、306、308、406、501、503、601、603和803在天然CCR4+CCRF-CEM细胞系中减少配体诱导钙流的能力。通过离心沉淀在常规条件下培养的CCRF-CEM目标细胞并将细胞在RPMI-1640培养基中重悬两次。将1ml的2.5×106个细胞与Fluo-4-AM(Invitrogen,Carlsbad,加利福尼亚)、Pluronic F-127(Invitrogen,Carlsbad,加利福尼亚)和丙磺舒混合至终浓度分别为1μM、0.02%和1mM。将细胞在37℃下在垂直旋转轮（7rpm）上孵育30分钟。随后的所有步骤都在存在1mM丙磺舒的条件下进行。在含有10%FCS的RPMI-1640中清洗细胞两次，在检测缓冲液（145mM NaCl、4mM KCl、1mM NaH2PO4、0.8mM MgCl2、25mM Hepes、22mM葡萄糖）中清洗一次。将TARC和MDC介导的钙流的抑制分成两种检测。
使用PheraStarFS高通量输入读数仪（BMG Labtech,奥芬堡,德国）评估存在scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803时TARC介导的钙流的抑制。抗体KW3060var用作阴性对照。将所述细胞稀释至终浓度为1.6×106个细胞/ml。25μl体积的细胞转移至黑色96孔板（Nunc,Thermo Fisher Scientific,Rochester,NY,美国）并在黑暗中在存在25μl的scFv抗体时在室温下孵育15分钟。在6个滴定点上十倍滴定scFv，起始浓度是0.5μg/ml。所有scFv一式三份进行，样品KM3060var用作对照。将所述板转移到PheraStarFS读数仪，分别向每一孔中自动注射配体至终浓度为28.6ng/μl（nM）。使用485-520nm的带通滤波器在一共16个点上测量荧光的变化，5个点是在注射配体前（系列1），1个点是在注射配体过程中（系列2的起始），10个点是在注射配体之后（系列2）。使用下面的式子计算活性的%：
[系列2未加工数据的总和–(11×系列2的起始)]IgG-[系列2未加工数据的总和–(11x系列2的起始)]缓冲液
[系列2未加工数据的总和–(11×系列2的起始)]配体
使用FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences，海德堡，德国）评估在存在scFv208、306、308、406、501、503、601、603和803时MDC介导的钙流的抑制。如上所述对细胞染色并稀释至终浓度为1.2x106个细胞/ml。将等体积的细胞、含有或不含有scFv抗体的检测缓冲液和配体（MDC）混合。在加入配体之前，将首先的两种成分（细胞和抗体）预孵育15分钟。ScFv的终浓度是10μg/ml而MDC是5ng/ml。立即使用515-545nm带通滤波器在FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences，海德堡，德国）上分析样品。对于评估，从所有样品中扣除染色（否则未处理的除外）细胞的平均信号。从存在MDC但没有scFv抗体的染色细胞中记录的信号被设为用于100%信号转导基础，而从存在MDC和scFv抗体的细胞中记录的信号转换为%。
在图7和8中显示的结果清楚地证明在实施例1中描述的全部scFv作为TARC和MDC的抑制剂。来自TARC抑制的IC50值在表19中列出。
使用基本相似的方案检验IgG1形式的306、406和503相比于KW0761对配体诱导的钙流的作用。该实验确认抗体306、406和503，而不是KW0761减少配体诱导的钙流。使用软件Prism（GraphPad）的模型“log(抑制剂)vs.反应”通过非线性回归曲线拟合而拟合所述实验数据。
所述结果清楚地证明了本发明的抗体用作TARC和MDC诱导的钙流的抑制剂。来自TARC抑制的IC50值在表21中列出。应当理解，这些推导值与在不同实验条件下推导出来的值的比较不是必然合适的。
实施例6：趋化性的抑制
通过下面方式检验实施1中的scFv抗体对趋化性的抑制：将能够趋化的CCR4+细胞和scFv抗体在一个室中接触，而将CCR4配体（MDC或TARC）放置在与第一室分开的另一室中，两个室通过具有合适孔大小的膜或过滤器分开。通过比较存在抗体时的趋化性和不存在抗体时的趋化性测量所述抗体对细胞向配体迁移（趋化性）的作用。发现在实施例1中描述的全部scFv抗体都抑制CCR4阳性细胞向MDC和TARC的趋化性。
通过离心沉淀如在实施例2中所描述的培养的CCR4+CCRF-CEM目标细胞，并在不含有FCS的RPMI-1640培养基中重悬两次。在第三步离心步骤中，在补充有1%FCS的RPMI-1640培养基中重悬细胞，并调整至终密度为1.6×107个细胞/ml。平行地，将150μl的补充有1%FCS、包含3.5nM TARC或MDC的RPMI添加至Multiscreen-MIC板96孔(8μmpores,Millipore,Billerica,MA,美国,MAMIC5S10)的下面室中。将scFv抗体系列减浓度稀释，从333nM稀释至0.36nM，包括小鼠抗myc抗体(9E10.2,Diatec,奥斯陆,挪威)以交联scFv和模拟二聚体IgG形式。将50μl的scFv抗体与50μl的细胞（终浓度是3.9x105个细胞/ml）混合并加入至Multiscreen-MIC96室板的上面室中，在37℃下孵育3小时。移除过滤器，在重悬之后将100μl的细胞（来自下面室）转移至96孔COASTAR板(Greiner Bio-One,福利根豪森,德国)中，向样品中加入额外体积的100μl的PBS（补充有0.2%BSA和0.09%NaN3）。通过使用FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences，海德堡，德国）计数通过的细胞评估迁移。
存在TARC或MDC，但不存在scFv抗体时的迁移细胞的数量设置为100%迁移，存在配体和scFv抗体时的迁移细胞的数量转换成%。
在图9中展示的数据证明在实施例1中描述的全部scFv抗体均抑制TARC诱导的CCRF-CEM细胞的趋化性。此外，相同的scFv抗体抑制MDC介导的趋化性（数据未显示）。
用IgG1形式的306、406和503进行了基本相似的实验，证实了IgG1形式同样抑制TARC诱导的CCRF-CEM细胞的趋化性，以及MDC诱导的CCRF-CEM细胞的趋化性。通过使用log(抑制剂)vs.反应函数使用GraphPad Prism以提取IC50值拟合数据来分析所述结果。测量的IC50值总结在表22中。
在另一种实验中，使用侵袭小室（transwell）板实验分析抗CCR4抗体503（IgG1形式）对实体肿瘤细胞系786-O应答TARC的迁移的作用。
通过将50μl的1μg/ml的基质胶溶液(BD Matrigel,目录号356230,BD Biosciences,海德堡,德国)平分在孔的顶部用于覆盖以准备multiscreen-MIC96孔板(8μm孔,Millipore,Billerica,MA,美国,MAMIC8S10)。在37℃下使基质胶聚合1小时。通过用PBS清洗孔移除未反应的基质胶。如上所述培养786-O细胞。用PBS清洗两次之后并通过在室温下用Accutase(PAA实验室,林茨,奥地利)孵育3分钟从培养瓶中分离所述细胞从瓶中收获细胞。将细胞平分至补充有0.1%胎牛血清的RPMI-1640中，使得终细胞密度为8.0×105个细胞/ml。平行地，将IgG抗体503稀释至浓度为60μg/ml并在补充有0.1%FCS的RPMI-1640中在五个点上5倍系列稀释。使存在于抗体的配制缓冲液中的盐的量保持恒定。将配体TARC在补充有0.1%FCS的RPMI-1640中稀释至两种终浓度，1000ng/ml和200ng/ml。使存在于抗体的配制缓冲液中的盐的量保持恒定。将150μl体积的配体平分在侵袭小室Multiscreen-MIC板96孔板(8μm孔,Millipore,Billerica,MA,美国,MAMIC8S10)的底部室中。等体积的50μl的细胞与50μl体积的抗体稀释物混合。将所述混合物置于基质胶覆盖的膜的顶部上并在37℃时孵育3小时。通过刮擦机械移除基质胶覆盖的膜的顶部上的未迁移的细胞，根据细胞滴度GLO发光细胞活力检测试剂盒(Promega,Madison,WI,美国)的手册对穿过基质胶覆盖的膜而迁移的细胞进行染色。将染色的样品转移至96孔板(NUNC,平底,黑色)并在Tecan Infinite M200读数仪(Tecan,Maennerdorf,瑞士)上分析荧光。存在TARC，但不存在抗体时的迁移细胞的数量设置为基础100%迁移，存在配体和抗体时的迁移细胞的数量转换成%。通过使用log(抑制剂)vs.反应函数使用GraphPad Prism以提取IC50值拟合数据来分析所述结果。所述结果显示抗体503抑制TARC诱导的实体肿瘤细胞系786-O的迁移（图13）。测量的IC50值总结在表23中。
在鼠肾细胞癌细胞系RENCA中获得了相似的发现，其中抗CCR4抗体503能够阻止鼠TARC诱导的目标细胞的迁移（数据未显示）。
实施例7：去岩藻糖化的抗CCR4IgG 1 分子的产生
已经报导，可以通过操作寡聚糖对人IgG1亚类的状态提高ADCC（Niwa R等,CanRes,64卷,2004）。已经证明修改岩藻糖的量对ADCC具有有益效果。因此，在存在Kifunensine时生产抗体306、406和503，所述Kifunensine是一种I型α-甘露糖苷酶的选择性抑制剂，引起在细胞培养生产中IgG的岩藻糖化的停止。在相同的条件下生产抗体KW0761。
在存在Kifunensine（100ng/ml；Sigma Aldrich,圣路易斯,MO,美国）时生产IgG。在收获细胞培养物之后，首先基于亲和力纯化使用蛋白A柱（HiTrap,5ml,蛋白A;GE）分离IgG。使用柠檬酸盐缓冲液（pH3）洗提IgG并转移至1M Tris缓冲液（pH9）中。在第二次纯化之前，浓缩IgG样品并装填用于尺寸排阻色谱法（HiLoad Sephadex200,GE；运行缓冲液20mM Na-磷酸盐/145mM NaCl,pH7.2）。收集单体部分并第二次浓缩IgG。
实施例8：种类交叉反应
检测抗体306、406和503与来自非人类物种的CCR4的交叉反应的能力。
对于瞬时转染，在T75（NUNC）培养瓶中，将Hek293T/17细胞以2×106个细胞的起始量培养。48小时后，用Fugene（ROCHE）转染所述细胞。每个T75使用40μl的Fugene和16μg的DNA。转染后48小时分析所述细胞。
用编码人CCR4的pcDNA3.1质粒或编码小鼠CCR4（GeneBank CAA62372）或猴子（猕猴）CCR4（PubMed登录号XP_001098807）的pLNO质粒（Norderhaug等,1997）瞬时转染HEK-293T/17细胞，使用Fugene（Roche）作为转染试剂。非转染（CCR4阴性）的细胞用作阴性对照。在常规条件下，继续培养所述细胞48小时并如上所述从培养瓶中收获细胞。将细胞等分成至V型96孔板(Greiner Bio-One,福利根豪森,德国)中，每孔1×105个细胞。离心细胞（400×g、5分钟、4℃）并在50μl的含有0.2%BSA和0.09%NaN3和1μg/ml的抗体（306、406、503和同种型对照6-MAM）的PBS中重悬，并在4℃下孵育60分钟。通过在存在PE结合的小鼠抗人CCR4抗体1G1或PE结合的仓鼠抗小鼠CCR4抗体2G12（Biolgend;圣地亚哥,CA,美国）时孵育所述细胞而确认人和鼠CCR4的表达。通过离心和在150μl的FACS缓冲液中重悬将所述样品清洗两次。所述细胞球最终在50μl含有3μg/ml的山羊抗人IgG-PE（AbDSerotec,杜塞尔多夫,德国）中重悬以检测抗体306、406、503和同种型对照IgG6-MAM，并在4℃下孵育45分钟。如上所述将所述样品清洗两次并在250μl的FACS缓冲液中重悬，随后转移至至U型96孔板（Corning,Schiphol-Rijk,荷兰）用于基于FACS Canto II(BD Biosciences，San Jose,CA)的流式细胞计数。
发现抗体306、406和503结合人和猴子CCR4，而检测到对鼠CCR4的亲和力降低（数据未显示）。
实施例9：抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）
在天然CCR4+细胞系CCRF-CEM、L-428和Hut78上检测抗CCR4抗体306、406和503与KW0761相比较的诱导ADCC的能力。此外，在分离的调控T细胞（Treg细胞）上检测使用抗CCR4抗体306、406和503与KW0761相比较的ADCC的诱导。明确确证了在癌症疾病进展中Treg细胞在实体肿瘤的免疫逃逸中起重要作用（见Wolf AM等，ClinCancer Res第9卷，2003）。重要地，已经描述CCR4在CD4+CD25+T细胞上表达，所述细胞定位于肿瘤间质区，这里它们抑制朝向肿瘤的免疫反应。通过CCR4抑制这些Treg细胞迁移（由MDC诱导）或通过CCR4直接杀死（通过ADCC）这些Treg细胞可能是阻止转移或减少实体肿瘤的生长的有希望的途径。
对于悬浮细胞CCRF-CEM、L-428和Hut78上的ADCC，在如实施例2描述的常规条件下培养细胞。通过离心沉淀细胞，并将细胞在RPMI-1640培养基中重悬。该步骤重复一次。将1ml的2.5×106个细胞与钙黄绿素-AM（Invitrogen,Carlsbad,加利福尼亚）混合至终浓度为10μM，然后在37℃下在垂直旋转轮上（7rpm）孵育30分钟。将细胞在含有10%FCS的RPMI-1640中清洗三次，并调整细胞密度为3×105个/ml。分别地，根据常规方法制备外周血单核细胞（PBMC）（通过Ficoll-Hypaque梯度离心富集），在含有10%FCS的RPMI-1640中清洗，并重悬至6×106个每毫升。将50μl的目标细胞和50μl的效应器细胞添加至96孔微滴定板的相同孔中，效应器细胞与目标细胞的比例（E:T）是20:1。将抗体以100μl体积加入至四份样品中加入相同孔中，导致浓度范围如下：在CCRF-CEM情况下，从0.2μg/ml下降至0.002ng/ml；在L-428情况下，从1μg/ml下降至0.32ng/ml；在Hut78情况下，从1μg/ml下降到0.1ng/ml。然后在37℃下，将微滴定板孵育4小时，3小时45分钟后向一些孔中加入20μl0.9%Triton-X100以使得目标细胞完全溶解。将每种样品的100μl的上清液转移至黑色微滴定板，并在TECAN Infinite M200板读数仪(Tecan,Maennerdorf,瑞士)分析荧光值(激发：488nm，发射：518nm)。从所有其它样品的强度中扣除没有抗体的样品的荧光强度。在用TritonX-100处理后，基于具有100%细胞溶解的样品的荧光强度评估含有抗体的样品中的溶解百分率。通过非线性回归分析和使用软件Prism（GraphPad,圣地亚哥,CA,美国）的三参数拟合模型计算剂量-反应曲线。
为检验Treg细胞上的ADCC的诱导，设置以下方案并使用抗CCR4抗体（1G1,目录号551266,BD Biosciences,海德堡,德国）制定方案。
所报道的在健康供体血液中的Treg细胞的百分比是在5%至10%之间（见Wolf AM等，Clin Cancer Res第9卷，2003）。这就是不得不从健康供体PBMC富集Treg细胞的原因，以得到合适量的分离的Treg细胞。根据来自于Dynabeads常规CD4+CD25+T细胞试剂盒(目录号113-63D,Invitrogen Corporation,圣地亚哥,CA,美国)的方案实施分离，得到三种不同的群（PBMC、CD4+和T-reg）。在纯化的具体阶段，保留一些细胞并适当染色作为质量对照。通过离心沉淀PBMC、CD4+和Treg细胞，并将细胞在补充有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS中重悬至1x106个细胞/ml。对于每一项实验，将200μl的未分离的2×105个PBMC和分离的CD4+细胞和100μl的1×105个分离的Treg转移至96孔V型板中，并在4℃下以400×g进行5分钟旋转下来。使用移液管清除上清液，将细胞球重悬在50μl的补充有0.2%BSA和0.09%NaN3的PBS中，50μl的生物素化的抗CD127抗体(目录号558633BDBiosciences,海德堡,德国)（其用于鉴定Treg细胞(见Simonetta F等，Eur J Immunol第9卷，2010)或者50μl的生物素化的抗CCR4抗体(1G1,目录号551266,BD Biosciences,海德堡,德国)，并在4℃下孵育1小时。用PBS（补充有0.2%BSA和0.09%NaN3）将样品清洗3次，在4℃下以400×g旋转5分钟。使用移液管清除上清液，将细胞球重悬在50μl的PBS(补充有0.2%BSA和0.09%NaN3)中或50μl的抗-CD4-FITC抗体和抗-CD25-APC抗体(目录号11-0049-42和17-0259-42eBiosciences圣地亚哥，CA,美国)和链霉素-PerCP(目录号554064,BD Biosciences,海德堡,德国)以及有或没有生物素化的抗CCR4抗体(1G1,Cat.No.#551266,BD Biosciences,海德堡,德国)的混合物中，并在4℃下孵育1小时。用PBS（补充有0.2%BSA和0.09%NaN3）将样品清洗3次，在4℃下以400×g旋转5分钟。使用移液管清除上清液，含有抗CCR4-PE抗体且未染色的细胞球在200μl的(补充有0.2%BSA和0.09%NaN3)的PBS重悬并转移至96孔U型板。在FACSCanto II(BDBiosciences,海德堡,德国)上进行使用不同荧光染料的代偿并分析所述样品。根据在FoxP3染色缓冲液试剂盒(目录号00-5523-00,eBiosciences，圣地亚哥,CA,美国USA)中描述的方案用抗FoxP3抗体(目录号560046,BD Biosciences,海德堡,德国)对保留的样品染色。将细胞重悬在200μl的PBS(补充有0.2%BSA和0.09%NaN3)中并转移至96孔U型板用于使用FACSCantoII(BD Biosciences,海德堡,德国)在流式细胞仪中进行分析。通过抗CD4-FITC/抗CD25-APC抗体上的双阳性信号以及通过抗FoxP3-PE/抗CCR4抗体上的双阳性信号(使用链霉亲合素-PerCp检验生物素化的1G1)将分离的Treg细胞鉴定为纯的Treg细胞。发现几乎95%的分离的细胞是CD4+CD25+细胞以及66%的细胞是FoxP3-CCR4阳性。
因为来自自体同源PBMC的单核细胞的低分离产率，除了E:T（在该情况下效应器细胞分离自自体同源PBMC，目标细胞=Treg细胞）比例降低至15，如上所述进行ADCC实验以评估在实施例1中描述的抗CCR4抗体对分离的Treg细胞的作用。抗体306、406、503和KW0761以3.3nM的单一浓度孵育，一式三份。为确认分离的自体同源PBMC是有功能的，平行地在CCR4+CCRF-CEM目标细胞上进行ADCC（数据未显示）。
在图14显示的结果和总结计算的EC50值（见表24）清楚地证明了本发明的抗CCR4抗体在存在人PBMC时在所有三种目标细胞系上能够诱导ADCC（Hut78未显示）。当在CCRF-CEM细胞上检测时，测得最有效的抗CCR4抗体503的EC50值为5.3pM，相比与KW0761的值是315pM。当在L-428细胞上检测时，相比于KW0761，观察到在实施例1中描述的所有抗CCR4抗体的降低的杀死活性。这可以通过以下事实解释：该细胞系显示为分泌CCR4配体CCL17/TARC，从而与抗体竞争结合CCR4。
此外，当比较分离的Treg细胞上的ADCC时，抗CCR4抗体展现出可比较的最大的杀死活性（见图15）。
实施例10：成人T细胞淋巴瘤白血病（ATLL）的体内模型
使用去岩藻糖化的IgG1分子在人T细胞淋巴瘤异种移植物模型中检测实施例1中描述的抗CCR4抗体306、406和503的减少肿瘤生长的能力。基于之前证明在ATLL具有体内功效的抗体(Niwa R等,CanRes,第65卷,2004)的抗体KW0761作为阳性对照。所有描述的实验在EPO（柏林，德国）进行。
CCR4+血液成人T细胞淋巴瘤细胞系CCRF-CEM的肿瘤块（大小是3x3x3mm）皮下移植至NMRI nu/nu小鼠（Taconic,Hudson,NY,美国）。总计，平行地，用以下的不同样品处理5个不同组别：组A=对照组（如在实施例2中描述的载体制剂缓冲液），由5只动物组成；组B=KW0761-IgG，由5只动物组成；组C=306-IgG，由10只动物组成；组D=406-IgG，由10只动物组成；组E=503-IgG，由10只动物组成。当肿瘤达到大约100mm3的明显大小时，将抗体样品静脉注射（i.v.）使用。使用以下式子计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)=0.5×(大直径)×(小直径)2。
小鼠每周处理两次，一共4周（一共处理8次），剂量是20mg/kg（假定平均重量是25g/小鼠，每只小鼠500μg的IgG）。在处理开始后，对小鼠进行监测，一共6周，每周两次测量肿瘤体积和体重。当肿瘤体积超过1.5cm3的大小时，处死动物。由于大的肿瘤体积，对照组已经在23天后处死。使用软件Prism（GraphPad,圣地亚哥,CA,美国）分析实验组之间获得的数据的统计学显著性。使用Mantel-Cox检测通过比较处理组（抗体）相对于未处理组（对照）分析存活比例。通过方差分析（ANOVA）和未配对的t检验分析对肿瘤加倍时间进行分析。
所述研究的结果在图16、17和18中呈现和总结。小鼠对用抗体的处理良好耐受，这可以通过没有体重减少进行评估（图16）。不同组别的个别肿瘤体积的比较显示在图17中。可以看到，一个组内的肿瘤体积显示出高度变异，很可能是由于肿瘤模型从肿瘤块接种得到，这可能导致在停滞期后肿瘤快速生长。由于大的肿瘤体积，对照组A已经在肿瘤培植后的23天处死。对于所有检测的抗CCR4抗体，可以看到肿瘤体积的明显减少。与对照组相比（处理的vs.对照，以%；T/C），在23天时测量的最低平均肿瘤体积分别是：检测的抗CCR4抗体503的值是35%，KW0761的值是67%，306的值是50%。，406的值是62%。同样测量了抗CCR4抗体503与对照组相比较的肿瘤加倍时间的统计学显著差异（6.28±1.03vs.2.58±0.25天；P=0.0273，未配对的t检验）。肿瘤体积和肿瘤加倍时间的这个差异在来自同一组E（抗CCR4抗体503）的动物的存活曲线中得以反映，其中测量的中值存活时间是26天，而相比较，对照组A的时间是22天。
因此，实施例1中描述的全部三个抗CCR4抗体均被证明具有体内肿瘤消除功效。对于503获得统计学显著数据。
实施例11：血小板的凝聚测量
已知CCR4在血小板上表达，且它的配体MDC和TARC诱导血小板凝聚。这可能有潜在的问题，因为IgG分子具有两个配体结合位点，因此有这样的可能：如果IgG的两条臂能够结合不同血小板上的CCR4，能够识别CCR4的IgG可能能够交叉连接血小板。这可能导致体内凝块（blot clotting）。因此，检测实施例1中描述的抗CCR4抗体对血小板凝聚的作用。抗体与分离的血小板单独孵育或与ADP结合孵育，ADP是一种充分描述的凝聚诱导物（Varon和Spectre"Antiplatelet agents"Hematology Am Soc Hematol Educ Program.267-72,2009）。
将一共50ml的新鲜的捐献血液收集到含有柠檬酸钠的管中。在室温（RT）下185g离心15分钟获得富含血小板的血浆。将含有血小板的血浆转移至新的管子中。为定义基准，通过在RT下将1ml富含血小板的血浆在1200g下5分钟离心制备无血小板的血浆，将上清液转移至新的管子中并以下述与富含血小板的样品相同的方式处理。在37℃下通过搅拌使用AggRam聚集度计（(Helena Laboratories,Beaumont,TX,美国）测量凝聚。在FACS缓冲液（PBS，pH7.4，0.2%BSA，0.09%NaN3）中用浓度为10μg/ml的血小板孵育IgG（503、406、306和抗GFP作为阴性对照）。ADP作为凝聚的阳性对照，其使用的终浓度是5μM。将用ADP获得的信号设为100%，基线0由无血小板的血清定义，在所有的实验设定中都平行地测量无血小板的血清。
观察到实施例1中描述的抗CCR4抗体与血小板的结合（数据未显示）。没有观察到凝聚的诱导，也没有观察到在存在ADP时凝聚的抑制（数据未显示）。从这些结果可以总结出，尽管实施例1描述的抗CCR4抗体结合血小板，它们对于血小板凝聚没有作用。它们不诱导凝聚，也不抑制如ADP诱导的血小板凝聚。
实施例12：结合人肾细胞癌
已知实体肿瘤细胞系的透明细胞肾癌细胞（CCRC；见专利申请WO2009/037454）包括CCR4并由其表达。为证明与在从患有肾细胞癌（RCC）的病患制备的组织中存在的CCR4特异结合，进行免疫组织学实验。所有的实验都在癌症转化肿瘤学研究所中心（巴兹和伦敦医学牙科学院，玛丽皇后学院，伦敦，Charterhouse Square）中进行。使用抗CCR4抗体503进行染色并与阳性抗CCR4抗体比较。
来自第四诊断期的病患的RCC肿瘤微阵列（TMA）由牙医学院（玛丽皇后学院，Charterhouse Square，伦敦，英国）提供，并包括一组三种不同的群体（TMA1、2和3）。以4μm厚度切下石蜡包埋的切片，去蜡并通过醇梯度水合。通过在抗原修复溶液中微波加热至沸点9分钟实施抗原修复（Vectorlaboratories,Burlingame,CA,美国）。然后在室温下将切片在用PBS稀释的5%山羊血清或20%的兔血清（Sigma Aldrich,圣路易斯,MO,美国）封闭1个小时。对于CCR4的检测，使用以下抗体对TMA染色：使用抗CCR4抗体503以3μg/ml的浓度检测CCR4并与山羊抗CCR4抗体Ab1669（3μg/ml;Abcam,剑桥,英国）进行比较。人同种型对照抗体（目录号1-001-A，以3μg/ml使用；RnD systems,Minneapolis,MN美国）用于证明抗CCR4抗体503的结合特异性。在4℃下在对应的封闭试剂中过夜孵育抗体（人抗体在PBS稀释的5%山羊血清中，Ab1669在PBS稀释的20%兔血清中）。在第二天用PBS将载片清洗三次，每次清洗使用30至50ml的体积。使用生物素结合的山羊抗人二抗（目录号AP112B,Chemicon International,Millipore的一个部门,Billerica,MA,美国）以1:500稀释度检测人抗体503和来自RnD的同种型对照抗体。在室温下用1:200稀释度的生物素结合的兔抗山羊抗体（BA-1000;Vectorlaboratories,Burlingame,CA,美国）将抗CCR4抗体Ab1669孵育45分钟，然后检测所述抗体。使用PBS将载片清洗两次，每次清洗使用30至50ml。在室温下通过在含有30%H2O2的混合物中混合甲醇（Sigma Aldrich,圣路易斯,MO,美国）封闭内源过氧化物酶。使用PBS将载片清洗3次，每次清洗使用30至50ml。使用vectastain精华ABC试剂盒(Vectorlaboratories,Burlingame,CA,美国)使抗原显影，使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB;Sigma Aldrich,圣路易斯,MO,美国)使抗原显色。对脾组织（已经报道该组织具有高表达的CCR4）上的抗CCR4抗体306、406和503进行相似的染色方案，并因此作为抗CCR4抗体的阳性对照（数据未显示）。平行地，检测CCR4配体TARC和MDC。如上所述的进行染色方案，但是使用以下抗体。使用兔抗人TARC抗体（ab9816,Abcam,剑桥,英国）检测TARC。以1:50的稀释度使用抗体，并使用1:200稀释度的生物素结合的山羊抗兔抗体（Vectorlaboratories,Burlingame,CA,美国）检测抗体。使用1:20稀释度的兔抗人MDC抗体（500-P107,Peprotech,普林斯顿,NJ,美国）检测MDC并使用生物素结合的抗兔抗体检测。使用尼康Eclipse80i显微镜(尼康，东京，日本)分析所有的结合模式。
此外，评估了所有如上描述的在正常人胎盘和肾组织上的检测抗体与阴性对照组织的结合。
来自患有RCC的病患的肿瘤微阵列的染色结果证明抗CCR4抗体503结合CCR4，所述CCR4在IHC的RCC病患组织中表达（图19）。此外，抗CCR4抗体503已经显示结合透明细胞肾细胞癌的区域，但是不结合乳头状肾细胞癌（数据未显示）。令人信服地，所述结合模式与抗CCR4阳性对照抗体Ab1669重叠。观察到与来自胎盘的正常人组织的轻度结合。但是，由于胎盘是高度脉管性器官，这些结合模式可以认为是已知CCR4表达的血管。CCR4的表达与CCR4配体TARC和MDC的表达模式相匹配。来自IHC实验的结合结果的总结在表25中列出。这些数据表明抗CCR4抗体503可以用作RCC的治疗剂或诊断剂。
表1
Figure BDA00003566730700601
Figure BDA00003566730700611
表1续
Figure BDA00003566730700621
表2
Figure BDA00003566730700622
表3
Figure BDA00003566730700641
Figure BDA00003566730700651
表4
Figure BDA00003566730700652
Figure BDA00003566730700661
Figure BDA00003566730700671
表5
Figure BDA00003566730700672
Figure BDA00003566730700681
表6
Figure BDA00003566730700682
Figure BDA00003566730700691
Figure BDA00003566730700701
表7
Figure BDA00003566730700711
Figure BDA00003566730700721
表8
Figure BDA00003566730700722
Figure BDA00003566730700741
表9
Figure BDA00003566730700742
Figure BDA00003566730700751
表10
Figure BDA00003566730700761
Figure BDA00003566730700771
表11
Figure BDA00003566730700772
Figure BDA00003566730700781
表12
Figure BDA00003566730700782
Figure BDA00003566730700791
表13
Figure BDA00003566730700802
表14
Figure BDA00003566730700812
Figure BDA00003566730700821
Figure BDA00003566730700831
表15
Figure BDA00003566730700832
Figure BDA00003566730700841
表16
Figure BDA00003566730700842
Figure BDA00003566730700851
Figure BDA00003566730700861
表17
Figure BDA00003566730700862
Figure BDA00003566730700871
表18
Figure BDA00003566730700872
Figure BDA00003566730700881
表19.源自TARC介导的钙流抑制的计算的IC50值
Figure BDA00003566730700892
表20从使用标记的配体的抗CCR4IgG抗体的干扰配体结合实验中测量的IC50值
IC50(nM) 306 406 503
MDC 0.28 0.27 0.11
R2 0.98 0.99 0.97
TARC 0.51 0.94 0.87
R2 0.96 0.97 0.95
表21抗CCR4抗体在配体介导的钙流实验中的拮抗特性的总览
Figure BDA00003566730700893
*n.d.=未检测的
表22由抗CCR4抗体抑制的配体诱导的迁移（CCL17/TARC和CCL22/MDC）中测量的IC50值和保留的迁移（以%表示）的总览
CCLl7/TARC的抑制CCL22/MDC的抑制
样品 IC50(pM) R2 迁移的阻断，以%表示
306 158 0.97 50％
406 178 0.98 49％
503 39 0.99 39％
KWO761 n.d. n.d. n.d.
*n.d.=未检测的
表23从由抗CCR4抗体503对786-O细胞的CCL17/TARC诱导的侵入的抑制所测量的IC50值的总览
CCL17/TARC(125nM) CCL17/TARC(25nM)
IC50(cg/ml) 1.33 0.12
R2 0.97 0.77
表24从对血液肿瘤细胞系CCRF-CEM和L-428的ADCC实验所测量的EC50值的总览
Figure BDA00003566730700901
表25来自用于肾细胞癌肿瘤微阵列（TMA）和相应对照组织（胎盘和正常肾）的IHC实验的得分表
Figure BDA00003566730700902
参考文献
以下文献对本文阐述的内容提供了可仿效的程序或其它详细的补充，通过引用的方式将它们特别地合并至本文。
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Claims (23)

1.一种结合人CC趋化因子受体4（CCR4）并能够抑制巨噬细胞来源的趋化因子（MDC）和/或胸腺和激活调节的趋化因子（TARC）与CCR4的结合的抗体，所述抗体包括至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
（i）具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变重链（VH）CDR1；
（ii）具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变重链（VH）CDR2；和
（iii）具有SEQ ID NO:20或3的氨基酸序列的可变重链（VH）CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的所述轻链可变区包括：
（iv）具有SEQ ID NO:22、17或4的氨基酸序列的可变轻链（VL）CDR1；
（v）具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL CDR2；和
（vi）具有SEQ ID NO:24或6的氨基酸序列的VL CDR3。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有VH域和/或VL域，所述VH域具有SEQ ID NO:39的序列或与其有至少70%一致性的序列，所述VL域具有SEQ ID NO:40的序列或与其有至少70%一致性的序列。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是完全人抗体。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是IgG抗体，优选地是IgG1。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有改变的糖基化形式，优选地，与所述抗体的Fc区结合的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的总复合的N-糖苷连接的糖链是岩藻糖没有结合至糖链的还原末端的N-乙酰葡萄糖胺的糖链。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是抗体的抗原结合片段，优选地是Fab’、Fab、F(ab’)2、单域抗体、TandAb二聚物、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、小体、双价抗体、双特异抗体片段、双靶向抗体、三靶向抗体、sc-双价抗体、κ(λ)抗体、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或包括一个或多个CDR的小抗体类似物。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体与至少一种治疗或诊断试剂连接，优选地与至少一种放射疗法试剂、化学疗法试剂、抗血管新生试剂、诱导细胞凋亡试剂、抗微管蛋白药物、抗细胞或细胞毒性试剂、类固醇、细胞因子拮抗剂、细胞因子表达抑制剂、趋化因子拮抗剂、趋化因子表达抑制剂、抗炎症皮质类固醇或NSAID、凝结剂或抗病毒试剂连接，其中所述抗病毒试剂优选地选自核苷、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。
9.一种组合物，包括至少一种根据权利要求1-8任意一项所述的抗体，其特征在于，所述组合物优选地是制药学可接受的组合物，如脂质体或纳米粒子组合物，以及可选地进一步包括至少一种第二种治疗试剂。
10.一种核酸分子，包括编码权利要求1-8任意一项的抗体的核苷酸序列区。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列区具有SEQ IDNO:111和/或112的核苷酸序列，或与任何一条所述序列具有至少70%一致性的序列。
12.一种表达载体，包括权利要求10或11所述的核酸分子。
13.一种宿主细胞或病毒，包括权利要求10或11所述的核酸分子或权利要求12所述的表达载体。
14.一种试剂盒，在至少第一容器中包括：
（a）权利要求1-8任意一项所述的抗体；
（b）权利要求9所述的组合物；
（c）权利要求10或11所述的核酸分子；
（d）权利要求12所述的表达载体；和/或
（e）权利要求13所述的宿主细胞或病毒。
15.一种生产抗体的方法，包括：
（a）在有效表达所编码的抗体的条件下培养权利要求13的宿主细胞；和
（b）从所述宿主细胞获得表达的抗体。
16.一种体外检测或测量CCR4的方法，包括在有效形成所述CCR4和所述抗体的复合物的条件下，用权利要求1-8任意一项所述的抗体接触已知含有CCR4或疑似含有CCR4的样品，并检测或测量所形成的复合物。
17.根据权利要求1-8任意一项所述的抗体用于治疗、显影或诊断。
18.根据权利要求17的抗体用于动物中与CCR4表达或活性相关的状况中的治疗、显影或诊断，或用于减少动物中与CCR4表达相关的免疫抑制。
19.根据权利要求18的抗体用于根据权利要求18的应用，其特征在于，所述状况是由CCR4介导的疾病或特征是CCR4+细胞的异常增殖的疾病，优选地是癌症、炎症疾病、免疫疾病或传染病，其中所述状况优选地选自：(a)过敏性疾病，如全身过敏或超敏反应、药物过敏症、过敏性支气管肺曲霉病(ABPA)、虫刺过敏症和食物过敏症；(b)炎性肠疾病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎；(c)阴道炎；(d)牛皮癣和炎症性皮肤病，如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触皮炎、风疹和瘙痒症；(e)血管炎；(f)脊柱关节病；(g)硬皮病；(h)哮喘和呼吸过敏性疾病，如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病和超敏肺疾病；(i)自身免疫疾病，如关节炎(包括风湿性的和牛皮癣的)、多发性硬化、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、肾小球性肾炎；(j)移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病)和(k)不期望的炎症反应需要被抑制的其它疾病，如动脉硬化、肌炎、T细胞介导的神经变性疾病、多发性硬化、脑炎、脑膜炎、肝炎、肾炎、脓毒病、结节病、过敏性结膜炎、耳炎、卡斯托曼病、窦炎、LPS诱导的内毒素休克、白塞病和痛风；(I)癌症，优选地乳癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、胃癌、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、外周T细胞淋巴瘤、非特异的弥漫性大B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、蕈状真菌病、塞扎里综合征；(m)传染病，如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染、HIV感染和其它病毒感染。
20.根据权利要求17的抗体用于根据权利要求17的应用，其特征在于，所述应用是诊断动物中与CCR4表达相关的疾病，包括步骤：
（a）用所述抗体接触动物；和，可选地
（b）测量或检测所述动物中抗体-抗原复合物的存在和/或量和/或位置；以及，可选地，
（c）将所述动物中抗体-抗原复合物的存在和/或量与对照进行比较。
21.一种体外诊断与CCR4表达或活性相关的状况的方法，包括根据权利要求16检测或测量CCR4，并使用该信息诊断与CCR4表达或活性相关的状况。
22.根据权利要求20的抗体用于根据权利要求20的诊断中的应用，或根据权利要求21的方法，其特征在于，所述动物或样品中有增加量的CCR4为诊断出肿瘤细胞或病毒感染的细胞，优选地，所述病毒感染的细胞感染有选自爱泼斯坦-巴尔病毒和HIV的病毒。
23.根据权利要求1-8任意一项的抗体在检测CCR4的存在或测量CCR4的量中的应用，所述CCR4由患有CCR4相关的紊乱的个体的细胞、目标位点、组织或器官表达，其特征在于，与健康对照相比，检测到CCR4增加的存在或测量到CCR4的量增加表示所述个体可能受益于抗CCR4治疗。
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