KR20130099193A - 점막에 관련된 질병의 치료 및 예방을 위한 물질 - Google Patents
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Abstract
점막에 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방에 이용하기 위한, 상이한 평균 분자량 및 상이한 유동성, 유리성, 조직 스캐폴드(scaffold) 및 분해성을 갖는 HA 혼합물을 포함하는 히알루론산(HA) 조성물이 제공된다. 이 조성물로부터 만들어지는 제제는 결막염, 이염, 알레르기성 비염, 치은염, 구강 궤양, 기관지염, 역류성 식도염(GRED), 식도염, 위염, 장염, 소화성 궤양, 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군(IBS), 요도염, 방광염 및 질염을 포함하는 점막에 관련된 장애 또는 질병의 치료 및 예방에 있어, 고착(adhesion), 조직 스캐폴드와 치료 시간 사이에 최적의 균형상태를 보여준다.
Description
본 발명은, 그 증상이 궤양, 염증, 알레르기 반응 및 출혈을 포함하는 점막에 관련된 장애 또는 질병의 치료 및 예방을 위한 히알루론산(hyaluronic acid)의 조성물을 제공한다.
히알루로난(hyaluronan), 히알루론산염(hyaluronate) 및 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate)으로도 알려진 히알루론산은 일반적으로 HA라고 불리며, 얼터너티브 β-1,3 및 β-1,4 글리코시딕 결합으로 연결된 얼터너티브 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산으로 구성된 이당류를 포함하는 천연 글리코사미노글리칸 고분자이다. 50,000 Da 내지 수백만 Da의 분자량(Mw)을 갖는 천연의 HA는 일반적으로 높은 점성을 갖는다.
천연의 HA는 탄성을 가진 유체로서, 주로 세포의 보호 및 윤활, 조절 T 세포의 수송을 위한 플랫폼(platform)의 제공, 및 콜라겐 네트워크의 안정 및 물리적인 손상으로부터 콜라겐 네트워크의 보호를 위하여, 세포와 콜라겐 섬유 사이를 채우고 몇몇 상피 조직 위를 덮는다. HA는 또한 그것의 윤활 특성 및 고도의 충격 흡수체(shock absorber)로서의 작용 때문에 건(tendon) 내와 건초(tendon sheath) 내 및 활막 표면상의 주요 윤활제이고, 또한 HA는 조직의 유동 메커니즘, 운동, 세포 증식에 유용하며(Delpech, B. et al ., 1997, Hyaluronan: fundamental principles and applications in cancer. J. Intern . Med . 242, 41-48 참조), 또한 특히 CD44의 주요 수용체로서 몇몇 세포 표면상에서 수용체 상호작용(receptor interaction)에 참여한다. CD44는 활성화된 림프구의 마커(marker)로서 널리 허용되고 있다(Teder P, et al ., 2002, Resolution of lung inflammation by CD44. Science, 296:155-158 참조).
최근, HA는 주로 눈, 피부, 정형술, 수술, 관절염, 동맥 치료 및 성형 분야에서 나트륨염의 형태로 임상치료에 이용된다. 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온(예를 들면 마그네슘 이온), 알루미늄 이온, 암모늄 이온, 및 암모늄 이온 대체물의 염 형태와 결합한 HA는 약물 흡수를 돕기 위한 수송체가 될 수 있다(벨기에 특허 904,547 참조). HA의 중금속염 중에 은 염은 마이코시드(mycocide)로 사용되고, 금 염은 류마티스 관절염의 치료를 위해 사용된다(WO 87/05517 참조).
미국 특허 5,888,986은 방광염 치료를 위해 치료학적 유효량으로 HA를 이용하는 방법 및 관련된 구조를 개시하며, 여기서 HA의 평균 분자량은 200,000 Da을 초과한다. 이러한 특정 분자량을 갖는 오직 한 종류의 HA가 그 실시예에 사용되었다. 예를 들면, 방광염을 치료하기 위해 평균 분자량이 650 kDa 또는 1,900 kDa인 HA가 이용되었다; 그러나, 이러한 특정 평균 분자량을 갖는 HA 단일종은 즉각적인 치료 및 지속적인 효과 어느 쪽을 위해서도 이용될 수 없었다. 미국 특허출원 2005/0080037은 급성 및 과사용 염좌 그리고 그 반응의 치료를 위한 HA의 이용을 개시하며, 여기서 HA의 평균 분자량은 단지 900 kDa 내지 1,200 kDa이나, 이러한 특정 평균 분자량을 갖는 HA 단일종은 즉각적인 치료 또는 연장된 작용의 어느 쪽도 수행할 수 없었다.
미국 특허 7,345,910은 분자량이 600 kDa 내지 1,200 kDa인 히알루론산 및 히알루론산염이 염증성장질환(IBD)의 치료에 적용될 수 있다는 점을 개시한다. 그러나 단지 하나의 평균 분자량을 갖는 히알루론산 및 히알루론산염은 환자에게 주사된 후 그 치료효과에 있어 즉각적인 작용 또는 지속적인 작용의 어느 쪽도 수행할 수 없었고, 따라서 그것은 임상적으로 환자를 위해 매우 불편하다.
유럽 특허 1369119는 분자량이 0.6 MDa 내지 3 MDa인 HA로 자가면역질환을 치료하기 위한 HA의 용도를 개시한다. 그러나, 이 특허는 이러한 평균 분자량을 갖는 오직 한 종류의 HA만을 이용하며, 즉각적인 효과 또는 지속적인 효과의 어느 쪽도 결여되어 있다.
점막은 주로 내배엽에서 발생한 내벽이고, 상피에 덮여있으며, 또한 흡수(위장관)와 분비(위장관 및 호흡기)에 관계되어 있다. 점막은 다음의 몇몇 신체 부위에서 외부 환경 및 내부 장기에 노출되고 피부와 인접하는 공동(空洞)의 내벽을 이룬다: 콧구멍, 입, 입술, 눈꺼풀, 귀, 음부, 및 항문. 점막과 분비선에서 분비되는 끈적끈적하고 진한 유체를 점액이라고 칭한다. 점막이라는 용어는 신체 내에서 점액이 발견되는 장소를 의미하며, 모든 점막이 점액을 분비하는 것은 아니다.
눈
결막염은 결막(안구의 가장 바깥쪽 층 및 눈꺼풀의 안쪽 표면)의 염증을 의미한다. 이것은 가장 일반적으로 감염 또는 알레르기 반응 때문에 발생한다(Richards A, 2010. 5. "Conjunctivitis". Pediatr Rev 31 (5): 196-208 참조).
귀
이염은 인간 및 다른 동물들 모두에서 귀의 염증 또는 감염을 일컫는 일반적인 용어이다. 이염은 다음과 같이 세분된다: 외이 및 외이도와 관련된 외이염; 중이와 관련된 중이염; 내이와 관련된 내이염.
알레르기성 비염
비염은 비강막의 염증으로 정의되고, 다음 증상의 임의의 조합으로 구성된 복합 증상을 특징으로 한다: 재채기, 비충혈, 코의 소양증, 및 비루(鼻漏). 눈, 귀, 부비강, 및 인후 역시 관련될 수 있다. 알레르기성 비염은 비염의 가장 일반적인 원인이고 대략 인구의 20%에서 발생한다. 알레르기성 비염은 생명을 위협하는 질환은 아니지만, 합병증이 발생할 수 있고 그 상태는 삶의 질을 상당히 악화시킬 수 있으며, 그것은 많은 간접비용으로 이어진다(Bousquet J et al. Allergic rhinitis management pocket reference 2008. Allergy 2008. 8; 63 (8):990-996 참조). 미국 특허출원 2005/0107330은 적어도 하나의 산성 글리코사미노글리칸을 포함하는, 비염의 국부 치료를 위한 약학적 조성물을 개시한다. 그러나, 이 조성물은 또한 국부 적용에 적합하고 점막에서 혈관수축 작용 또는 종창감퇴 작용을 갖는 하나 이상의 교감신경흥분제 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 포함한다. 따라서 이 특허문헌은 두 가지 상이한 평균 분자량을 갖는 HA의 결합을 개시하거나 교시하지 않았다.
입
구강 점막은 입의 점막 상피이다. 구강 궤양은 입 내부의 아물지 않은 상처, 또는, 드물게는, 점막 또는 입술 위나 입 주변 상피의 손상이다. 궤양의 유형은 다양하고, 이와 연관된 다수의 원인은 다음을 포함한다.: 물리적 찰과상, 산성 과일, 감염, 다른 질병, 약물, 및 악성이고 비특이적인 과정. 일단 형성되면, 궤양은 염증 및/또는 2차 감염에 의해 유지될 수 있다. 두 가지 일반적인 유형은 혓바늘(aphthous ulcer)("canker sores") 및 구순포진(cold sore)(단순포진, 구강 헤르페스)이다. 입술 주변의 구순포진은 바이러스에 기인한다(J.M. Casiglia, et al., 2006. 10. "Aphthous stomatitis". Emedecine (website) 참조).
기관지염
기관지염은 기류를 기관(氣管)으로부터 폐 내로 운반하는 기도인 기관지의 점막의 염증이다. 기관지염은 급성 및 만성의 두 카테고리로 나뉠 수 있고, 각각은 독특한 병인, 병리, 및 치료법을 갖는다. 급성 기관지염은 흔히 보통 감기(common cold) 또는 유행성 감기(influenza)와 같은 급성 바이러스 감염의 과정 중에 발생한다. 만성 기관지염은 가장 흔하게는, 흡입된 자극물에 기인하여 기도에 재발하는 손상 때문에 발생한다. 흡연은 가장 일반적인 원인이고, 대기오염 및 자극물에 대한 직업적인 노출이 그 뒤를 잇는다(Cohen, Jonathan and William Powderly. Infectious Diseases. 2nd ed. Mosby (Elsevier), 2004. "Chapter 33: Bronchitis, Bronchiectasis, and Cystic Fibrosis"). 미국 특허출원 2003/0171332는 CD44와 결합할 수 있는 다당류에 의한 호흡기 질환의 치료 방법을 개시한다. 그러나, 오직 하나의 HA 단일종만이 관여할 수 있다.
위장 점막
점막은 내강을 둘러싼 위장 벽의 가장 안쪽 층, 또는 관(tube) 내의 열린 공간이다. 이 층은 음식 덩어리와 직접 접촉하고, 소화에서 중요한 과정인 흡수, 소화, 및 분비를 담당한다.
점막은 위장관의 각각의 기관에서 고도로 특화되어 있기 때문에, 위 내에서는 낮은 pH에 직면하고, 소장 내에서는 다수의 상이한 물질을 흡수하며, 및 또한 대장 내에서는 물의 특정한 양을 흡수한다. 이들 기관들의 다양한 요구를 반영하여, 점막의 구조는 분비선(예를 들면, 위소와(胃小窩))이 함입될 수 있고, 또는 표면적을 증가시키기 위하여 접힐 수 있다.
위장 점막은, 신체와 내강 환경 사이에, 영양소를 함유하는 것뿐만 아니라 잠재적으로 적성(敵性)을 가진 미생물과 독소가 풍부한 장벽을 형성한다. 동물체 내로의 유해한 분자 및 유기체의 통과를 엄격하게 배제하면서 상피를 가로질러 영양소의 효율적인 수송을 가능케 하는 것이 과제이다. 위 및 장 점막의 배타적인 성질은 “위장 장벽(gastrointestinal barrier)"으로 불린다. 일반적으로, 상피세포의 단일 막을 파괴할 수 있는 독소 및 미생물은 체순환에 제한 없이 접근한다.
역류성 식도염(GERD)은 만성적인 증상 또는 위로부터 식도 내로 올라오는 위산에 기인하는 점막의 손상이다. 전형적인 증상은 속쓰림(heartburn)이다. 역류성 식도염은 일반적으로, 정상적으로는 위의 상부를 폐쇄된 상태로 유지하는 하부식도괄약근의 비정상적인 이완; 식도로부터의 역류된 위산의 비정상적인 방출, 또는 열공 탈장(hiatal hernia)을 포함하는, 위장과 식도 사이에 있는 장벽의 변화에 의해 발생한다. 이들 변화는 영구적이거나 또는 일시적일 수 있다(DeVault KR, 1999. "Updated guidelines for the diagnosis and treatment of gastroesophageal reflux disease. The Practice Parameters Committee of the American College of Gastroenterology". Am J Gastroenterol 94 (6): 1434-42 참조).
소화성 궤양
일반적으로는 소화성 궤양으로 알려져 있고 또한 PUD 또는 펩틱 위 궤양(peptic ulcer disease)으로 알려진 소화성 궤양은, 일반적으로 산성이고 따라서 극심한 통증을 발생시키는, 위장관의 한 부분의 궤양(0.5cm 이상의 점막 침식으로 정의됨)이다. 거의 70-90%의 궤양이 위의 산성 환경에 존재하는 나선형 박테리아인 헬리코박터 파일로리균(Helicobacter pylori)과 관련되어 있다. 궤양은 또한 아스피린, 플라빅스(클로피도그렐), 이부프로펜, 및 다른 NSAID(비-스테로이드 항염증약)와 같은 약물에 의해 야기 또는 악화된다.
일반적인 믿음과는 반대로, 소화성 궤양은 위에서보다 십이지장(소장의 첫 부분, 위의 바로 다음)에서 더 많이 발생한다. 약 4%의 위 궤양이 악성 종양에 의해 야기되고, 따라서 암을 배제하기 위해서 다중 생체검사가 요구된다. 십이지장 궤양은 일반적으로 양성이다. 부위 또는 위치에 의한 소화성 궤양은 다음을 포함하여 분류할 수 있다: 위(위 궤양으로 부름), 십이지장(십이지장 궤양으로 부름), 식도(식도 궤양으로 부름); 멕켈게실(Meckel's Diverticulum)(멕켈게실 궤양으로 부름).
상기 실시예는 모두 점막에 관련된 장애 또는 질병을 나타내지만, 전술한 것으로 제한되지는 않는다. 개시된 장애 또는 질병은 다양한 약물 또는 치료법에 의해 어느 정도까지는 치료될 수 있을 것이다. 그러나, 그러한 치료는 대부분 고도로 전문화된 제조과정을 거쳐 복잡한 조성을 갖는 약물에 의해 이루어지고, 간단하고 안전한 치료가 아니다. 본 발명의 발명자 외에는 어떤 선행기술도 1.5 MDa 차이나는 두 가지의 상이한 평균 분자량을 갖는 HA 두 종류(LMWHA와 HMWHA)의 결합을 교시하거나 예상하지 못했는데, 이것은 당업자가 어떤 다른 선행기술들을 결합함으로써 상기 혼합물의 개념을 추론해낼 수 없다는 것을 의미한다.
전술한 문제점을 극복하기 위해서, 본 발명은 전술한 문제를 완화하거나 방지하기 위하여 적어도 두 가지의 히알루론산 조성물을 포함하는 히알루론산 혼합물을 치료학적 유효량으로, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 점막에 관련된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 점막에 관련된 장애 또는 질병의 치료를 위하여, 적어도 두 종류 이상의 상이한 평균 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염의 생물학적 활성을 이용하는 것이다.
저분자 히알루론산(low average molecular weight hyaluronic acid, LMWHA)과 고분자 히알루론산(high average molecular weight hyaluronic acid, HMWHA)은 상이한 점성, 절연 기능 및 분해율을 갖는다. 평균 분자량이 1.5 MDa 미만인 히알루론산은 LMWHA로 분류되고, 평균 분자량이 1.5 MDa 초과인 히알루론산은 HMWHA로 분류된다. 따라서 LMWHA와 HMWHA의 혼합물은, LMWHA는 점막에 관련된 장애 또는 질병(예를 들면, 결막염, 이염, 알레르기성 비염, 치은염, 구강 궤양, 기관지염, 역류성 식도염(GRED), 식도염, 위염, 장염, 소화성 궤양, 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군(IBS), 요도염, 방광염 또는 질염)의 치료 및 예방을 위해서 신속하게 염증성 표면을 덮을 수 있고, HMWHA는 더 장기적인 효과 기간(effective period)을 얻기 위해서 분해를 연장시킬 수 있는, 훌륭한 조성물을 형성할 수 있다. 따라서, 신속한 치료와 지속적인 방출 효과를 달성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 점막과 관련된 장애 또는 질병의 치료 및 예방에 있어 포유동물 또는 인간용의 다음 성분을 포함하는 조성물을 제공한다:
저분자 히알루론산(LMWHA)의 평균 분자량이 50 kDa 내지 1,500 kDa이고, 고분자 히알루론산(HMWHA)의 평균 분자량이 1,500 kDa 내지 5,000 kDa인, 그리고 LMWHA의 평균 분자량이 HMWHA의 평균 분자량으로부터 500 kDa 이상 차이나며, 또한 LMWHA:HMWHA의 혼합비가 중량 기준으로 20:80 내지 80:20의 범위인, LMWHA와 HMWHA를 포함하는 히알루론산 혼합물(HA 혼합물)의 치료학적 유효량.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 새로운 특징은, 첨부된 도면과 결부하여 이하의 상세한 설명에 의해 더욱 명백해질 것이다.
본 발명의 시나리오는 히알루로니다아제(hyaluronidase, HAase)에 의한 히알루론산 분해의 발단에서 도입된다. 선형(linear) 히알루론산(LMWHA) 또는 구형(globular) 히알루론산(HMWHA)은 작은 조각으로 분해되지만, 한편 작용시간을 연장함으로써 치료 효과에 기여하기 위하여 구형 히알루론산이 선형 히알루론산을 보충할 수 있다. 아래에 요약된 바와 같이 히알루로니다아제의 활성이 염증의 표지(marker)로 사용될 수 있다는 것이 잘 알려져 왔다. 따라서, LMWHA와 HMWHA의 조합은 장기 작용(long-term effect)이 동반된 치료 효과를 지속하기 위해서 이용된다. 따라서, 더 짧은 HA의 손실은 지속적으로 보충될 수 있고, 그 결과 계속적인 상처 치유 또는 보호된 조직을 손상으로부터 격리하기 위한 연성 장벽의 제공을 야기할 수 있다. 후술하는 것은 본 시나리오의 상세한 설명이 될 것이다.
도 1은 히알루론산의 일반적인 화학 구조를 나타낸다;
도 2는 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타내며, 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 HAase를 함유한 용액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다;
도 3은 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타내며, 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 인공 위액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다.
도 4는 정상적인 결장 조직 및 손상된 결장 조직에서 HA의 친화력을 형광 지표에 의해 나타낸다;
도 5A는 실험 1일에서 9일까지 동안, 쥐의 평균 체중에 의해 인식되는, 대장염 치료에 대한 두 카테고리의 HA의 효과를 나타낸다;
도 5B는 실험 1일에서 14일까지 동안, 쥐의 평균 체중에 의해 인식되는, 대장염 치료에 대한 두 카테고리의 HA의 효과를 나타낸다; 그리고
도 6은 28일(D28)에 그룹 HA와 대조군 사이에서 유의적인 차이가 관찰되었음을 입증함으로써, 쥐에서 난백알부민(10 ㎍/10 ㎕/콧구멍)에 의해 유발되는 코 문지르기에 대한 HA 샘플의 효과를 나타낸다(*p<0.05).
바람직한 실시예의 상세한 설명
실시예 1: 1U/ ml HAase 내에서 HA 의 분해
절차:
1. 0.25 g의 고분자 히알루론산 나트륨 분말(HHA; 분자량: 2 MDa; Freda) 및 0.25 g의 저분자 히알루론산 나트륨 분말(LHA; 분자량: 0.35 MDa; Freda)을 50 ml의 PBS 완충액(Phosphate buffered saline)에 각각 첨가하여 0.5% 용액을 형성한 다음, 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
2. 0.05 g의 LHA 분말 및 0.2 g의 HHA 분말 (비율 2:8, 중분자량 히알루론산 나트륨 분말, MHA)를 50 ml의 PBS 완충액에 첨가한 다음, 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
3. 다음과 같이, GPC(겔 투과 크로마토그래피) 시스템의 이동상 용액을 제조하였다: (1) 35.49 g의 Na2HPO4 분말을 450 ml의 탈이온증류수(dd water)에 첨가하고 상온에서 30분 동안 교반하여 0.5 M의 Na2HPO4 용액을 형성하였다; 또한 (2) 18 g의 NaH2PO4 분말을 250 ml의 탈이온증류수에 첨가하고 상온에서 30분 동안 교반하여 NaH2PO4 용액을 형성하였다.
4. 4℃에서 HAase 분말을 PBS 완충액에 용해시킴으로써 1U/ml HAase를 제조하였다.
5. 2 ml의 HA 샘플, 1 ml의 10U/ml HAaes 및 7ml의 PBS 완충액을 15 ml 유리관에서 볼텍싱(vortexing)하여 3분 동안 혼합하였다.
6. 상기 관을 중탕 수조에서 50 rpm으로 진탕하였다. 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120분 후에 1 ml의 용액을 취한 다음, 그 때마다 1 ml의 HAase를 공급하였다. 모든 1 ml 용액을 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 20 ㎕ 용액을 GPC 시스템에 주입한 다음 다이어그램을 기록하였다.
7. 상기 GPC 시스템의 환경은 (1) 컬럼: 2x GMPWxl (TSK-gel); (2) 이동상의 유속: 1 ml/min; (3) 온도: 30℃ 이었다.
8. 표의 모든 값은 n 개의 관찰의 평균으로 나타내었다. 조직학적 지표는 스튜던트 T 검정으로 분석하였다.
결과:
도 2는 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타낸다. 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 HAase를 함유한 용액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다. 수평 점선은, 위부터 아래로 각각 2 MDa, 1 MDa, 350 KDa 및 17 KDa의 HA의 체류시간을 의미한다. 체류시간은 명백히 증가하였고, 세 가지 HA 모두 분해시간도 증가하였다. 15분의 분해 후에, HHA 및 MHA의 평균 분자량이 약 1 MDa로 감소하였다. 37분의 분해 후에, HHA 및 MHA의 평균 분자량이 약 350 KDa로 감소하였다. 90분의 분해 후에, HHA, MHA 및 LHA는 그들 간에 평균 분자량의 분명한 차이를 보이지 않았고, 평균분자량은 모두 17 KDa을 초과하였다.
실시예 2: 0.1 N HCL 내에서 HA 의 분해
절차:
1. 실시예 1에서와 같이 LHA, MHA 및 HHA를 제조하였다.
2. 실시예 1에서와 같이 GPC 시스템의 이동상 용액을 제조하였다.
3. 5.72 ml의 17.5 N HCl 및 90 ml의 탈이온증류수를 혼합함으로써 인공 위액(0.1 N HCl)을 제조하였고, 10분 동안 교반하였다.
4. HHA, MHA 및 LHA 2 ml를 각각 15 ml의 유리관에서 볼텍싱하여 3분 동안 8 ml의 인공 위액과 혼합하였다.
5. 상기 관을 37 ℃의 중탕 수조에서 50 rpm으로 진탕하였다. 6, 12, 24, 48 시간 후에 1 ml의 용액을 취한 다음, 그 때마다 1 ml의 인공 위액을 공급하였다. 모든 1 ml 용액을 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 20 ㎕ 용액을 GPC 시스템에 주입한 다음 다이어그램을 기록하였다.
6. 표의 모든 값은 n 개의 관찰의 평균으로 나타내었다. 조직학적 지표는 스튜던트 T 검정으로 분석하였다.
결과:
도 3은 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타낸다. 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 인공 위액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다. 수평 점선은, 위부터 아래로 각각 2 MDa, 1 MDa, 350 KDa 및 17 KDa의 HA의 체류시간을 의미한다. 체류시간은 서서히 증가하였고, 세 가지 HA 모두 분해시간도 증가하였다. 7시간의 분해 후에, HHA 및 MHA의 평균 분자량이 약 1 MDa로 감소하였다. 31시간의 분해 후에, MHA의 평균 분자량이 약 350 KDa로 감소하였다. 35시간의 분해 후에, HHA의 평균 분자량이 약 350 KDa로 감소하였다. 6시간의 분해 후에 HHA 및 MHA의 평균 분자량은 1 MDa을 초과하고, 24시간의 분해 후에 HHA 및 MHA의 평균 분자량은 350 KDa를 초과하지만, 전술한 데이터들은 모두 HA가 인공 위액 내에서 서서히 분해되었다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 결장 조직 내에서 HA 의 고착( adhesion ) ( IVIS 이미지 시스템-비전 3)
절차:
1. 실시예 1에서와 같이 LHA 및 HHA를 제조하였다. MHA(MHA; 분자량: 1 MDa, Freda)를 50 ml의 PBS 완충액에 첨가하였고, 그 후 분말이 완전히 용해되고 다음 단계에 사용하기 위한 준비가 될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
2. (1) 0.39 g의 MES-비함유 산(2-(N-모폴리노) 에탄술폰산, Calbiochem)에 의하여 형광성 HA(HA-f)를 제조하였고, 이를 100 ml의 탈이온증류수에 용해시켰다. (2) 용액 A: 65 mg의 형광에나민 분말(이성질체 I, Fluka)을 9 ml의 95% 에탄올 용액에 용해시킨 다음 빛이 차단된 조건 하에 10분 동안 교반하였다. (3) 용액 B: 359 mg의 EDC 분말(N-(3-디메틸아미노 프로필)-N-에틸 카르보디이미드 하이드로클로라이드, Sigma)을 9 ml의 MES 완충액에 용해시킨 다음 10분 동안 교반하였다. (4) 용액 C: 216 mg의 NHS 분말(N-하이드록시숙신이미드, Sigma)을 9 ml의 MES 완충액에 용해시킨 다음 10분 동안 교반하였다. (5) 3 ml의 용액 A를 50 ml의 0.5% HA 용액에 서서히 떨어뜨린 다음 빛이 차단된 조건 하에 10분 동안 교반하였다. (6) 3 ml의 용액 B 및 5 ml의 용액 C를 각기 단계 (5)의 용액에 떨어뜨린 다음 빛이 차단된 조건 하에 10분 동안 교반하였다. (7) 0.02 M의 MES 완충액을 단계 (6)의 용액에 부피가 100 ml에 이를 때까지 서서히 첨가한 다음, 빛이 차단된 조건 하에 상온에서 24시간 동안 교반하였다. (8) 반응 후의 생성물을, 투석 용액으로서 5 L의 탈이온증류수 내에서 투석관(분자량: 12,000~14,000)으로 흘려보낸 다음, 투석 용액이 형광을 띠지 않을 때까지 투석 용액을 매 12시간 마다 교체하면서 빛이 차단된 조건 하에 4 ℃에서 5일 동안 투석 용액을 교반하였다. (9) 투석 후의 액체를, 50 ml의 플라스틱 원심분리관에 분배한 다음 -20 ℃의 냉각장치에서 하룻밤 동안 유지하였고, 뒤이어 빛이 차단된 조건 하에 냉동 건조기에서 건조하였다. (10) 상기 건조된 HA-f 분말을 -20 ℃의 냉각장치에서 유지하였다. (11) 50 mg의 HA-f 분말을 10 ml의 PBS 완충액에 서서히 첨가한 다음, 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
3. 7-8주 된 SD-쥐(Sprague-Dawley Rat)의 결장 조직을 메스로 자른 다음 PBS 완충액으로 세척하였고, 뒤이어, 최종적으로 PBS 완충액에 담가 3-4 cm의 길이로 잘랐다.
4. 칫솔을 사용해 길이방향으로 20회 솔질을 한 다음 PBS 완충액에 담금으로써 손상된 결장 조직을 준비하였다.
5. 정상적인 결장 조직 및 손상된 결장 조직을 12-홈 플레이트에 넣은 다음, 1 ml의 0.5% HA-f 용액을 각 홈에 첨가하고 상온에서 2시간 동안 진탕하였다. 2시간 후에 팁(tip)으로 과잉의 HA-f 용액을 뽑아낸 다음, 10분 동안 PBS 완충액에 담그고, 뒤이어 3회 반복하여 PBS 완충액을 제거하였다.
6. 세척된 결장 조직을 내벽 조직을 위쪽으로 하여 12-홈 플레이트에 넣은 다음, IVIS(생체조건(in vivo)에서의 이미지 시스템, XENOGEN)의 독(dock) 위에 두었다. 매개변수의 초기설정을 GFP(녹색 형광 단백질)로 설정하였고, 여기파장은 465 nm, 방출파장은 500 nm이었으며, 그 후 소프트웨어로 이미지를 캡처하였다.
7. 표의 모든 값은 n 개의 관찰의 평균으로 나타내었다. 조직학적 지표는 스튜던트 T 검정으로 분석하였다.
결과:
도 4에서와 같이 형광 지표를 정량화하고 정렬하였다. 정상적인 결장 조직의 형광 지표는 1로 정의하였다. 다른 결장 조직 실험은 정의된 값에 의해 보정(calibration)하였다. 결과는 동일한 평균 분자량을 갖는 HA가 정상적인 결장조직에서보다 손상된 결장 조직에서 명백히 더 높게 흡수되는 것으로 나타났다(P<0.01). 손상된 결장 조직 내에서 흡수된 세 가지 상이한 평균 분자량을 갖는 HA 간의 차이를 비교할 때, 손상된 결장 조직에 의한 350 KDa HA의 흡수를 나타내는 형광 지표가 다른 두 가지 평균 분자량(2 MDa 및 1 MDa)을 갖는 HA보다 명백히 더 높았다. 나아가, 손상된 결장 조직 또는 심지어 정상적인 결장 조직에 의한 1 MDa HA의 흡수를 나타내는 형광 지표조차도 2 MDa HA보다 더 높았다.
실시예 4: 대장염을 목표한 HA 의 투여 또는 비투여에 따른 쥐의 체중 변화
절차:
1. 실험 목적: 중량비가 상이한 두 종류의 혼합 HA를 통한 대장염의 치료 또는 예방 효과를 평가하기 위하여, SPF 등급 SD-쥐에서 TNBS로 대장염을 유발하는 것.
2. 실험 대상: LMWHA 및 HMWHA를 포함하는 IBD98로서, HMWHA가 2 MDa이고 LMWHA가 350 kDa 이며, 중량 기준으로 8:2 및 1:1의 비율로 혼합하여 각각 그룹 A 및 그룹 B로 분류하고 PBS 용액 내에서 용해시켜 0.125%(w/v)의 농도를 형성한 것.
3. 방법: (1) 테스트 타겟: 8주 된 쥐를 선택하였고, 세 개의 그룹으로 분류하였다: 그룹 A는 8:2의 혼합비에 해당하였고; 그룹 B는 1:1의 혼합비에 해당하였으며; 그룹 C는 HA 대신 PBS로 처리되었다. (2) 동물실험: 실험군의 모든 쥐들을 이틀 동안 단식시켰다; 실험 1일에, 직장을 통해 TNBS (50 mg/mL) 1 ml를 투여하여 쥐들을 마취하였다; 실험 4일에서 14일까지, 그룹 A 및 B에 직장을 통해 두 카테고리의 IBD98 1ml를 투여하였다; 실험 9일에, 그룹 A 및 B 내 절반의 쥐의 체중 변화를 관찰하였다. 또한 다른 절반의 쥐의 체중 변화는 14일에 관찰하였다. 대조군의 모든 쥐들을 이틀 동안 단식시켰다; 실험 1일에, 직장을 통해 TNBS (50 mg/mL) 1 ml를 투여하여 쥐들을 마취하였다; 실험 4일에서 14일까지, 직장을 통해 PBS 1ml를 투여하였다; 실험 9일에, 그룹 C의 절반의 쥐의 체중 변화를 관찰하였다. 또한 다른 절반의 쥐의 체중 변화는 14일에 관찰하였다.
결과:
1. 염증 지표: 본 발명은 대장염(IBD) 개선을 관찰하기 위한 지표로 평균 체중의 변화를 사용하였다. 체중의 변화는 치료 결과를 확인하기 위한 간편하고 직접적인 지표이다.
2. 1일에서 14일까지, 그 역시 IBD를 의미하는 대장염에 대하여 그룹 A 및 B 모두 경감 효과를 가지는 경향이 나타났다(도 5A 및 5B). 대조군과 HA 사이의 평균 체중 변화에서, 대장염의 치료 효과는, 전체 실험 기간 동안, 심지어 실험 14일까지도, HA가 투여된 그룹의 평균 체중이 대조군의 그것보다 더 높게 유지되었다(도 5B).
실시예 5: 알레르기 질병에서 HA 의 효과
절차:
1. 실험 목적: SPF 등급 SD-쥐에서, 알레르기 질병(본 명세서에서는 비염)을 유발하는 것.
2. 실험 대상: LMWHA 및 HMWHA를 포함하는 IBD98로서, HMWHA의 평균 분자량이 2 MDa이고 LMWHA의 평균 분자량이 350 kDa 이며, 중량 기준으로 1:1의 비율로 혼합하고 PBS 용액 내에서 용해시켜 0.125%(w/v) 농도의 HA 용액을 형성한 것.
3. 방법: (1) 테스트 타겟: 9마리의 8주 된 쥐를 선택하였고, 임의로 두 개의 그룹으로 분류하였다: 대조군(PBS)은 4마리의 쥐로 구성되었고, 실험군(HA)은 5마리의 쥐로 구성되었다. (2) 동물실험: 실험 1일에서 7일까지 동안, 매일 쥐에게 난백알부민(1 mg) 및 백반(10 mg)을 포함하는 생리식염수를 복강내(IP) 주사하였다; 실험 8일에서 13일까지 오직 관찰만 하였다; 실험 14일에서 27일까지 동안, 식염수 내 난백알부민(10 ㎍/10 ㎕/콧구멍)을 양 비강 내에 마이크로피펫으로 적하(滴下)하였다. 쥐에서 항원 시험 후 코의 증상에 대한 HA의 효과는 일반적인 감작(sensitization) 후 실험 28일(D28) 및 30일(D30)에 증가했다. 난백알부민 주입 1시간 전에, HA 용액 또는 PBS(25 ㎕/콧구멍)를 쥐에게 적하(滴下)하였다. 식염수 내 난백알부민(10 ㎍/10 ㎕/콧구멍)을 양 비강 내로 비강 주입한 후에, 쥐들을 관찰 우리에 두고(1 마리/우리), 30분 동안 코 문지르기 횟수를 측정했다. 코 문지르기 빈도는 30분 당 코 문지르기 횟수로 계산하였다.
결과:
1. 알레르기 개선 지표: 본 발명은 알레르기 개선의 지표로 코 문지르기 빈도를 사용하였다.
2. 항원에 의해 유발된 코의 증상에 대한 HA 샘플의 효과를 도 6에 나타내었다. 난백알부민에 의해 유도된 평균 코 문지르기 빈도는 28일(D28)에 56.25±16.1 회/ 30분 이었고, 30일(D30)에 70.0±41.3 회/ 30분 이었다. 대조군과 비교하여, 코 문지르기는 HA 용액에 의해 28일에 상당히 감소하였고, 30일에 명백히 감소하였다.
도 2는 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타내며, 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 HAase를 함유한 용액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다;
도 3은 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타내며, 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 인공 위액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다.
도 4는 정상적인 결장 조직 및 손상된 결장 조직에서 HA의 친화력을 형광 지표에 의해 나타낸다;
도 5A는 실험 1일에서 9일까지 동안, 쥐의 평균 체중에 의해 인식되는, 대장염 치료에 대한 두 카테고리의 HA의 효과를 나타낸다;
도 5B는 실험 1일에서 14일까지 동안, 쥐의 평균 체중에 의해 인식되는, 대장염 치료에 대한 두 카테고리의 HA의 효과를 나타낸다; 그리고
도 6은 28일(D28)에 그룹 HA와 대조군 사이에서 유의적인 차이가 관찰되었음을 입증함으로써, 쥐에서 난백알부민(10 ㎍/10 ㎕/콧구멍)에 의해 유발되는 코 문지르기에 대한 HA 샘플의 효과를 나타낸다(*p<0.05).
바람직한 실시예의 상세한 설명
실시예 1: 1U/ ml HAase 내에서 HA 의 분해
절차:
1. 0.25 g의 고분자 히알루론산 나트륨 분말(HHA; 분자량: 2 MDa; Freda) 및 0.25 g의 저분자 히알루론산 나트륨 분말(LHA; 분자량: 0.35 MDa; Freda)을 50 ml의 PBS 완충액(Phosphate buffered saline)에 각각 첨가하여 0.5% 용액을 형성한 다음, 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
2. 0.05 g의 LHA 분말 및 0.2 g의 HHA 분말 (비율 2:8, 중분자량 히알루론산 나트륨 분말, MHA)를 50 ml의 PBS 완충액에 첨가한 다음, 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
3. 다음과 같이, GPC(겔 투과 크로마토그래피) 시스템의 이동상 용액을 제조하였다: (1) 35.49 g의 Na2HPO4 분말을 450 ml의 탈이온증류수(dd water)에 첨가하고 상온에서 30분 동안 교반하여 0.5 M의 Na2HPO4 용액을 형성하였다; 또한 (2) 18 g의 NaH2PO4 분말을 250 ml의 탈이온증류수에 첨가하고 상온에서 30분 동안 교반하여 NaH2PO4 용액을 형성하였다.
4. 4℃에서 HAase 분말을 PBS 완충액에 용해시킴으로써 1U/ml HAase를 제조하였다.
5. 2 ml의 HA 샘플, 1 ml의 10U/ml HAaes 및 7ml의 PBS 완충액을 15 ml 유리관에서 볼텍싱(vortexing)하여 3분 동안 혼합하였다.
6. 상기 관을 중탕 수조에서 50 rpm으로 진탕하였다. 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120분 후에 1 ml의 용액을 취한 다음, 그 때마다 1 ml의 HAase를 공급하였다. 모든 1 ml 용액을 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 20 ㎕ 용액을 GPC 시스템에 주입한 다음 다이어그램을 기록하였다.
7. 상기 GPC 시스템의 환경은 (1) 컬럼: 2x GMPWxl (TSK-gel); (2) 이동상의 유속: 1 ml/min; (3) 온도: 30℃ 이었다.
8. 표의 모든 값은 n 개의 관찰의 평균으로 나타내었다. 조직학적 지표는 스튜던트 T 검정으로 분석하였다.
결과:
도 2는 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타낸다. 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 HAase를 함유한 용액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다. 수평 점선은, 위부터 아래로 각각 2 MDa, 1 MDa, 350 KDa 및 17 KDa의 HA의 체류시간을 의미한다. 체류시간은 명백히 증가하였고, 세 가지 HA 모두 분해시간도 증가하였다. 15분의 분해 후에, HHA 및 MHA의 평균 분자량이 약 1 MDa로 감소하였다. 37분의 분해 후에, HHA 및 MHA의 평균 분자량이 약 350 KDa로 감소하였다. 90분의 분해 후에, HHA, MHA 및 LHA는 그들 간에 평균 분자량의 분명한 차이를 보이지 않았고, 평균분자량은 모두 17 KDa을 초과하였다.
실시예 2: 0.1 N HCL 내에서 HA 의 분해
절차:
1. 실시예 1에서와 같이 LHA, MHA 및 HHA를 제조하였다.
2. 실시예 1에서와 같이 GPC 시스템의 이동상 용액을 제조하였다.
3. 5.72 ml의 17.5 N HCl 및 90 ml의 탈이온증류수를 혼합함으로써 인공 위액(0.1 N HCl)을 제조하였고, 10분 동안 교반하였다.
4. HHA, MHA 및 LHA 2 ml를 각각 15 ml의 유리관에서 볼텍싱하여 3분 동안 8 ml의 인공 위액과 혼합하였다.
5. 상기 관을 37 ℃의 중탕 수조에서 50 rpm으로 진탕하였다. 6, 12, 24, 48 시간 후에 1 ml의 용액을 취한 다음, 그 때마다 1 ml의 인공 위액을 공급하였다. 모든 1 ml 용액을 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 20 ㎕ 용액을 GPC 시스템에 주입한 다음 다이어그램을 기록하였다.
6. 표의 모든 값은 n 개의 관찰의 평균으로 나타내었다. 조직학적 지표는 스튜던트 T 검정으로 분석하였다.
결과:
도 3은 GPC 다이아그램에 의한 HA의 체류시간을 나타낸다. 수직축은 GPC에서 체류시간을 의미하고, 수평축은 인공 위액 내에서 HA의 분해시간을 의미한다. 수평 점선은, 위부터 아래로 각각 2 MDa, 1 MDa, 350 KDa 및 17 KDa의 HA의 체류시간을 의미한다. 체류시간은 서서히 증가하였고, 세 가지 HA 모두 분해시간도 증가하였다. 7시간의 분해 후에, HHA 및 MHA의 평균 분자량이 약 1 MDa로 감소하였다. 31시간의 분해 후에, MHA의 평균 분자량이 약 350 KDa로 감소하였다. 35시간의 분해 후에, HHA의 평균 분자량이 약 350 KDa로 감소하였다. 6시간의 분해 후에 HHA 및 MHA의 평균 분자량은 1 MDa을 초과하고, 24시간의 분해 후에 HHA 및 MHA의 평균 분자량은 350 KDa를 초과하지만, 전술한 데이터들은 모두 HA가 인공 위액 내에서 서서히 분해되었다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 결장 조직 내에서 HA 의 고착( adhesion ) ( IVIS 이미지 시스템-비전 3)
절차:
1. 실시예 1에서와 같이 LHA 및 HHA를 제조하였다. MHA(MHA; 분자량: 1 MDa, Freda)를 50 ml의 PBS 완충액에 첨가하였고, 그 후 분말이 완전히 용해되고 다음 단계에 사용하기 위한 준비가 될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
2. (1) 0.39 g의 MES-비함유 산(2-(N-모폴리노) 에탄술폰산, Calbiochem)에 의하여 형광성 HA(HA-f)를 제조하였고, 이를 100 ml의 탈이온증류수에 용해시켰다. (2) 용액 A: 65 mg의 형광에나민 분말(이성질체 I, Fluka)을 9 ml의 95% 에탄올 용액에 용해시킨 다음 빛이 차단된 조건 하에 10분 동안 교반하였다. (3) 용액 B: 359 mg의 EDC 분말(N-(3-디메틸아미노 프로필)-N-에틸 카르보디이미드 하이드로클로라이드, Sigma)을 9 ml의 MES 완충액에 용해시킨 다음 10분 동안 교반하였다. (4) 용액 C: 216 mg의 NHS 분말(N-하이드록시숙신이미드, Sigma)을 9 ml의 MES 완충액에 용해시킨 다음 10분 동안 교반하였다. (5) 3 ml의 용액 A를 50 ml의 0.5% HA 용액에 서서히 떨어뜨린 다음 빛이 차단된 조건 하에 10분 동안 교반하였다. (6) 3 ml의 용액 B 및 5 ml의 용액 C를 각기 단계 (5)의 용액에 떨어뜨린 다음 빛이 차단된 조건 하에 10분 동안 교반하였다. (7) 0.02 M의 MES 완충액을 단계 (6)의 용액에 부피가 100 ml에 이를 때까지 서서히 첨가한 다음, 빛이 차단된 조건 하에 상온에서 24시간 동안 교반하였다. (8) 반응 후의 생성물을, 투석 용액으로서 5 L의 탈이온증류수 내에서 투석관(분자량: 12,000~14,000)으로 흘려보낸 다음, 투석 용액이 형광을 띠지 않을 때까지 투석 용액을 매 12시간 마다 교체하면서 빛이 차단된 조건 하에 4 ℃에서 5일 동안 투석 용액을 교반하였다. (9) 투석 후의 액체를, 50 ml의 플라스틱 원심분리관에 분배한 다음 -20 ℃의 냉각장치에서 하룻밤 동안 유지하였고, 뒤이어 빛이 차단된 조건 하에 냉동 건조기에서 건조하였다. (10) 상기 건조된 HA-f 분말을 -20 ℃의 냉각장치에서 유지하였다. (11) 50 mg의 HA-f 분말을 10 ml의 PBS 완충액에 서서히 첨가한 다음, 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 동안 교반하였다.
3. 7-8주 된 SD-쥐(Sprague-Dawley Rat)의 결장 조직을 메스로 자른 다음 PBS 완충액으로 세척하였고, 뒤이어, 최종적으로 PBS 완충액에 담가 3-4 cm의 길이로 잘랐다.
4. 칫솔을 사용해 길이방향으로 20회 솔질을 한 다음 PBS 완충액에 담금으로써 손상된 결장 조직을 준비하였다.
5. 정상적인 결장 조직 및 손상된 결장 조직을 12-홈 플레이트에 넣은 다음, 1 ml의 0.5% HA-f 용액을 각 홈에 첨가하고 상온에서 2시간 동안 진탕하였다. 2시간 후에 팁(tip)으로 과잉의 HA-f 용액을 뽑아낸 다음, 10분 동안 PBS 완충액에 담그고, 뒤이어 3회 반복하여 PBS 완충액을 제거하였다.
6. 세척된 결장 조직을 내벽 조직을 위쪽으로 하여 12-홈 플레이트에 넣은 다음, IVIS(생체조건(in vivo)에서의 이미지 시스템, XENOGEN)의 독(dock) 위에 두었다. 매개변수의 초기설정을 GFP(녹색 형광 단백질)로 설정하였고, 여기파장은 465 nm, 방출파장은 500 nm이었으며, 그 후 소프트웨어로 이미지를 캡처하였다.
7. 표의 모든 값은 n 개의 관찰의 평균으로 나타내었다. 조직학적 지표는 스튜던트 T 검정으로 분석하였다.
결과:
도 4에서와 같이 형광 지표를 정량화하고 정렬하였다. 정상적인 결장 조직의 형광 지표는 1로 정의하였다. 다른 결장 조직 실험은 정의된 값에 의해 보정(calibration)하였다. 결과는 동일한 평균 분자량을 갖는 HA가 정상적인 결장조직에서보다 손상된 결장 조직에서 명백히 더 높게 흡수되는 것으로 나타났다(P<0.01). 손상된 결장 조직 내에서 흡수된 세 가지 상이한 평균 분자량을 갖는 HA 간의 차이를 비교할 때, 손상된 결장 조직에 의한 350 KDa HA의 흡수를 나타내는 형광 지표가 다른 두 가지 평균 분자량(2 MDa 및 1 MDa)을 갖는 HA보다 명백히 더 높았다. 나아가, 손상된 결장 조직 또는 심지어 정상적인 결장 조직에 의한 1 MDa HA의 흡수를 나타내는 형광 지표조차도 2 MDa HA보다 더 높았다.
실시예 4: 대장염을 목표한 HA 의 투여 또는 비투여에 따른 쥐의 체중 변화
절차:
1. 실험 목적: 중량비가 상이한 두 종류의 혼합 HA를 통한 대장염의 치료 또는 예방 효과를 평가하기 위하여, SPF 등급 SD-쥐에서 TNBS로 대장염을 유발하는 것.
2. 실험 대상: LMWHA 및 HMWHA를 포함하는 IBD98로서, HMWHA가 2 MDa이고 LMWHA가 350 kDa 이며, 중량 기준으로 8:2 및 1:1의 비율로 혼합하여 각각 그룹 A 및 그룹 B로 분류하고 PBS 용액 내에서 용해시켜 0.125%(w/v)의 농도를 형성한 것.
3. 방법: (1) 테스트 타겟: 8주 된 쥐를 선택하였고, 세 개의 그룹으로 분류하였다: 그룹 A는 8:2의 혼합비에 해당하였고; 그룹 B는 1:1의 혼합비에 해당하였으며; 그룹 C는 HA 대신 PBS로 처리되었다. (2) 동물실험: 실험군의 모든 쥐들을 이틀 동안 단식시켰다; 실험 1일에, 직장을 통해 TNBS (50 mg/mL) 1 ml를 투여하여 쥐들을 마취하였다; 실험 4일에서 14일까지, 그룹 A 및 B에 직장을 통해 두 카테고리의 IBD98 1ml를 투여하였다; 실험 9일에, 그룹 A 및 B 내 절반의 쥐의 체중 변화를 관찰하였다. 또한 다른 절반의 쥐의 체중 변화는 14일에 관찰하였다. 대조군의 모든 쥐들을 이틀 동안 단식시켰다; 실험 1일에, 직장을 통해 TNBS (50 mg/mL) 1 ml를 투여하여 쥐들을 마취하였다; 실험 4일에서 14일까지, 직장을 통해 PBS 1ml를 투여하였다; 실험 9일에, 그룹 C의 절반의 쥐의 체중 변화를 관찰하였다. 또한 다른 절반의 쥐의 체중 변화는 14일에 관찰하였다.
결과:
1. 염증 지표: 본 발명은 대장염(IBD) 개선을 관찰하기 위한 지표로 평균 체중의 변화를 사용하였다. 체중의 변화는 치료 결과를 확인하기 위한 간편하고 직접적인 지표이다.
2. 1일에서 14일까지, 그 역시 IBD를 의미하는 대장염에 대하여 그룹 A 및 B 모두 경감 효과를 가지는 경향이 나타났다(도 5A 및 5B). 대조군과 HA 사이의 평균 체중 변화에서, 대장염의 치료 효과는, 전체 실험 기간 동안, 심지어 실험 14일까지도, HA가 투여된 그룹의 평균 체중이 대조군의 그것보다 더 높게 유지되었다(도 5B).
실시예 5: 알레르기 질병에서 HA 의 효과
절차:
1. 실험 목적: SPF 등급 SD-쥐에서, 알레르기 질병(본 명세서에서는 비염)을 유발하는 것.
2. 실험 대상: LMWHA 및 HMWHA를 포함하는 IBD98로서, HMWHA의 평균 분자량이 2 MDa이고 LMWHA의 평균 분자량이 350 kDa 이며, 중량 기준으로 1:1의 비율로 혼합하고 PBS 용액 내에서 용해시켜 0.125%(w/v) 농도의 HA 용액을 형성한 것.
3. 방법: (1) 테스트 타겟: 9마리의 8주 된 쥐를 선택하였고, 임의로 두 개의 그룹으로 분류하였다: 대조군(PBS)은 4마리의 쥐로 구성되었고, 실험군(HA)은 5마리의 쥐로 구성되었다. (2) 동물실험: 실험 1일에서 7일까지 동안, 매일 쥐에게 난백알부민(1 mg) 및 백반(10 mg)을 포함하는 생리식염수를 복강내(IP) 주사하였다; 실험 8일에서 13일까지 오직 관찰만 하였다; 실험 14일에서 27일까지 동안, 식염수 내 난백알부민(10 ㎍/10 ㎕/콧구멍)을 양 비강 내에 마이크로피펫으로 적하(滴下)하였다. 쥐에서 항원 시험 후 코의 증상에 대한 HA의 효과는 일반적인 감작(sensitization) 후 실험 28일(D28) 및 30일(D30)에 증가했다. 난백알부민 주입 1시간 전에, HA 용액 또는 PBS(25 ㎕/콧구멍)를 쥐에게 적하(滴下)하였다. 식염수 내 난백알부민(10 ㎍/10 ㎕/콧구멍)을 양 비강 내로 비강 주입한 후에, 쥐들을 관찰 우리에 두고(1 마리/우리), 30분 동안 코 문지르기 횟수를 측정했다. 코 문지르기 빈도는 30분 당 코 문지르기 횟수로 계산하였다.
결과:
1. 알레르기 개선 지표: 본 발명은 알레르기 개선의 지표로 코 문지르기 빈도를 사용하였다.
2. 항원에 의해 유발된 코의 증상에 대한 HA 샘플의 효과를 도 6에 나타내었다. 난백알부민에 의해 유도된 평균 코 문지르기 빈도는 28일(D28)에 56.25±16.1 회/ 30분 이었고, 30일(D30)에 70.0±41.3 회/ 30분 이었다. 대조군과 비교하여, 코 문지르기는 HA 용액에 의해 28일에 상당히 감소하였고, 30일에 명백히 감소하였다.
점막에 관련된 장애 또는 질병을 치료 및 예방하기 위해 이용되는 본 발명에 따른 조성물은, 저분자 히알루론산(LMWHA)과 고분자 히알루론산(HMWHA)을 포함하는 HA 혼합물을 치료학적 유효량으로 사용하는 것을 제공한다. LMWHA는 선형 구조(도 1)를 형성하기 위하여 그것의 반복되는 이당체 단위에 기초하고 있다; 그러나, HMWHA에서는, 히알루론산과 아민의 반응에 의해서, 선형 히알루론산 고분자의 카르복실기가 디/트리/폴리 아민과 반응하여 아미드 결합의 형성 및 분자간 결합(intermolecural bridge) 또는 분자내 결합(intramolecular bridge)을 형성하는 것으로 생각된다. 이 반응 때문에, 출발물질인 코일형의 히알루론산 구조가 구형의 둥근 나노입자로 변형된다(미국 특허 7,879,818). 분자량이 상이하면 유동성, 고착성, 조직 스캐폴드(scaffold)의 기능 및 용액 내에서의 분해성이 상이하고, 또한 따라서, 히알루론산 혼합물은 적절하고 지속적인 치료 효과를 획득할 뿐 아니라 점막에 관련된 장애 또는 질병의 치료 및 예방을 위하여 약효와 분해율의 균형을 이룰 수 있다.
Tranchepain F et al.은 HA가 그것의 몰 질량(molar mass)에 따라 상이한 생물학적 기능을 가진다는 점을 개시한다. 물리화학적으로, 소 고환의 HAase에 의해 촉매된 천연 HA의 가수분해에 대한 연구는 동력학적 파라미터(kinetic parameter)가 HA 사슬의 길이에 의존함을 시사한다. HAase에 의해 촉매된 HA 가수분해는 서로 상이한 몰 질량을 갖는 HA 조각들을 얻기 위한 새로운 방법에서 이용되었다(Tranchepain F et al ., A complete set of hyaluronan fragments obtained from hydrolysis catalyzed by hyaluronidase: Application to studies of hyaluronan mass distribution by simple HPLC devices. Anal Biochem. 2006. 1. 15.; 348(2): 232-42.). 유사하게, 동일한 연구 그룹은 또한 HA가 그 사슬의 길이에 강력하게 의존하는 다양한 생물학적 기능을 가진다는 점을 개시한다. HAase에 의해 촉매된 HA 가수분해는 긴 HA 사슬과 짧은 HA 사슬 간 균형의 조절에 관계된 것으로 여겨진다. 더 짧은 HA 사슬은 안정적인 복합체를 형성하기에는 너무 짧은 것으로 보이고, 더 긴 HA 사슬은 또한, 아마도 입체 장해(steric hindrance) 때문에, 복합체 형성의 어려움에 직면한다.
몇몇 보고는 HAase가 염증에 관계되어 있다고 설명한다. 관절 활액(synovial fluid, SF) HAase의 활성은 활액염(synovial inflammation)의 표지로 사용될 수 있었다(Nagaya H et al ., Examination of synovial fluid and serum HAase activity as a joint marker in rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Ann Rheum Dis ., 1999, 58(3): 186-8). HA는 구조적 및 기능적 완전성에 기여하는, 치근막(periodontal ligament, PDL) 세포외 기질(extracellular matrix)의 주요 요소이다. HA는 저작하는 동안 PDL의 완충 효과에 기여하고, 그들은 또한 염증 및 상처 치유에 중요하다. 상기 연구는 PDL 섬유아세포가, 정상적인 또는 염증성 환경에서 세포외 HA 대사에 필수적인, HAase를 발현시키고 HAase 활성을 일으킨다는 점을 시사한다(Ohno S et al ., Expression and activity of hyaluronidase in human periodontal ligament fibroblasts. J Periodontol., 2002, 73(11): 1331-7). HAase에 의해 촉매된 짧은 HA 조각들은 염증 과정 및 혈관형성에 관여할 수 있으나, 반면 천연의 HA는 그렇지 않다.(Tranchepain F et al.,Supra).
본 발명에 의하면, 평균 분자량이 1.5 MDa 미만인 HA는 LMWHA로 분류되며, 평균 분자량의 바람직한 범위는 50 kDa 내지 1.5 MDa이고, 평균 분자량의 더 바람직한 범위는 0.1 MDa 내지 1.5 MDa이며, 평균 분자량의 가장 바람직한 범위는 0.1 MDa 내지 0.5 MDa이다. 평균 분자량이 1.5 MDa을 초과하는 HA는 HMWHA로 분류되며, 평균 분자량의 바람직한 범위는 1.5 MDa 내지 5 MDa이고, 평균 분자량의 가장 바람직한 범위는 1.5 MDa 내지 2.5 MDa이다. LMWHA와 HMWHA의 혼합물을 포함하는 조성물이 그것을 필요로 하는 환자에게 투여되면, LMWHA는 점막에 관련된 장애 또는 질병의 치료 및 예방을 위해 즉각적으로 염증 부위를 덮고, 한편 HMWHA는 LMWHA의 치료 효과를 연장시킨다. 따라서, 치료는 즉각적으로 이루어지고, 방출 효과는 지속된다. HA의 일반적인 화학 구조는 도 1에서와 같이 표현될 수 있다.
HA의 종류는 분자량으로서뿐만 아니라 Mark-Houwink-Sakurada(MHS) 방정식([η] = KMα)을 통해 중합체의 분자량과 직접적으로 관련된 고유의 점성(η)으로도 나타낼 수 있다. 히알루론산의 경우에, 다음의 조건에서 K는 0.00057이고 지수 α는 0.75이다: 인산염 완충액 내 0.15 M 염화나트륨, pH 7.5, 20℃(“Standard Guide for Characterization and Testing of Hyaluronan as Starting Materials Intended for Use in Biomedical and Tissue Engineered Medical Product Applications”, ASTM Designation: F 2347-03).
본 발명은 HAase(도 2) 또는 인공 위액(도 3)의 작용 하에서도 HMWHA가 LMWHA를 보충할 수 있음을 나타내는 결과를 제공한다. 상기 결과는 장기적인 효과를 유지하기 위해 HAase의 존재 또는 위장 환경 내의 상태에서 HA가 보충될 수 있음을 나타낸다. HAase 하에서는 모든 세 가지 HA의 증가된 분해와 함께 체류시간이 두드러지게 증가했다(도 2). 산성 환경 하에서는 모든 세 가지 HA의 증가된 분해와 함께 체류시간이 서서히 증가했다(도 3). 실험적인 파라미터를 처리하기 위해 모의 생리적 상황이 사용되었으나, 실제의 생리적 환경이 더 복잡하기 때문에 다소 다른 결과를 야기할 수 있다. 그러나, HMWHA가 LMWHA를 보충할 수 있는 그것의 고유한 분자적 특성 때문에 HA 분해의 경향은 변화하지 않을 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 또 다른 바람직한 실시예는, 제한되지는 않지만, HA의 염 형태에서 중량 기준으로 LMWHA:HMWHA의 1:1 (w/w) 혼합물을 포함하며, LMWHA:HMWHA의 비율의 더 바람직한 실시예는 임상적인 목적에 따라 중량 기준으로 20:80 내지 80:20에서 조절될 수 있다. HMWHA에 대해 LMWHA의 비율이 더 높은 HA 혼합물은 치료 속도를 높이는 데 더 유용할 수 있고; 반면, LMWHA에 대해 HMWHA의 비율이 더 높으면 더 긴 분해 시간을 제공하여 전체적인 치료 효과를 연장할 수 있다.
본 명세서에서 점막이라는 용어는, 제한되지는 않지만, 눈의 점막, 귀의 점막, 코의 점막, 입 점막, 호흡기의 점막, 위장관의 점막, 요로의 점막 및 생식관의 점막을 포함하는 의미로 사용되고, 한편 본 발명에서 점막에 관련된 장애 또는 질병은 궤양, 염증, 알레르기 반응 또는 출혈의 증상을 포함한다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 점막에 관련된 장애 또는 질병의 예는, 제한되지는 않지만, 결막염, 이염, 알레르기성 비염, 치은염, 구강 궤양, 기관지염, 역류성 식도염(GRED), 식도염, 위염, 장염, 소화성 궤양, 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군(IBS), 요도염, 방광염 및 질염을 포함한다. 장염의 더 구체적인 예는, 제한되지는 않지만, 급성 장염, 만성 장염, 전염성 장염, 허혈성 장염, 방사성 장염(radioenteritis) 및 약물 유발성 장염을 포함한다. 소화성 궤양의 더 구체적인 예는, 제한되지는 않지만, 위 궤양, 십이지장 궤양, 식도 궤양, 멕켈게실 궤양(Meckel's Diverticulum ulcer)을 포함한다. 염증성 장질환(IBD)의 더 구체적인 예는, 제한되지는 않지만, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함한다. 과민성 대장 증후군(IBS)의 더 구체적인 예는, 제한되지는 않지만, 만성 소화 장애증, 과당 흡수장애(fructose malabsorption), 가벼운 감염, 편모충증(giardiasis) 같은 기생충 감염, 기능성 만성 변비, 만성 기능성 복부통증을 포함한다.
본 발명의 결과는 동일한 평균 분자량을 갖는 HA가 정상적인 결장 조직 내에서보다 손상된 결장 조직 내에서 명백히 더 많이 흡수된다는 점을 보여준다다(P<0.01, 도 4). 손상된 결장 조직 내에서 흡수된 세 가지 상이한 평균 분자량을 갖는 HA 간의 차이를 비교할 때, 손상된 결장 조직에 의한 350 kDa HA의 흡수를 나타내는 형광 지표가 다른 두 가지 평균 분자량(2,000 kDa 및 1,000 kDa)을 갖는 HA보다 명백히 더 높았다. 나아가, 손상된 결장 조직 또는 심지어 정상적인 결장 조직에 의한 1 MDa HA의 흡수를 나타내는 형광 지표조차도 2,000 kDa HA보다 더 높았다. 이러한 결과는 즉각적인 상처 치유 및 추가적인 손상으로부터 조직의 보호기능을 제공하는 LMWHA의 신속한 분산 및 커버링(covering) 효과를 설명한다. 전술한 데이터들을 결합하여 볼 때, 본 발명은 점막에 관련된 장애 또는 질병의 신속하고 지속적인 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물의 또 다른 바람직한 실시예는 눈, 귀, 입, 코, 호흡기, 위장관 또는 국부 사용을 위한 투여 제형을 제조하기 위하여 부형제(excipient)를 추가로 포함한다. 구강 사용을 위한 투여 제형의 더 바람직한 예는, 고체 투여 제형, 제한되지는 않지만 현탁액을 포함하는 액제, 제한되지는 않지만 방출 조절 정제를 포함하는 정제, 제한되지는 않지만 장용제피 캡슐을 포함하는 캡슐로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 고체 투여 제형의 가장 바람직한 예는 하루에 50 mg 내지 1,000 mg의 복용량을 경구투여하는 것이다. 위장관 사용을 위한 투여 제형의 더 바람직한 예는, 고체 제형, 관류, 관장, 좌약, 및 제한되지는 않지만 현탁액을 포함하는 액제로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 국부 사용을 위한 투여 제형의 더 바람직한 예는, 관류, 관장, 좌약, 분무, 흡입, 및 적하(滴下)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
알레르기성 비염 또는 기관지염 치료의 바람직한 실시예는, 본 발명의 조성물을, 항히스타민제, 항알레르기제, 항충혈제, 스테로이드제 또는 천식치료제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다. 장염 치료의 바람직한 실시예는, 본 발명의 혼합물을, 항생제 또는 진경제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다. 소화성 궤양 치료의 바람직한 실시예는, 본 발명의 혼합물을, 지혈제, 항생제, 제산제, H2 차단제(H2 blocker), 수소칼륨 이온 펌프 차단제(potassium hydrogen ion pump blocker, PPI), 세포보호제 또는 점막보호제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다. 염증성 장질환(IBD) 치료의 바람직한 실시예는, 본 발명의 혼합물을, 스테로이드제, 면역억제제, 항생제, 5-ASA(5-아미노살리실산) 및 유도체, 또는 항염증제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행될 수 있다.
본 발명은, 상이한 중량 혼합비를 갖는 HA에 의해 치료된 염증성 장질환(IBD)을 제시하며, 이는 평균 체중 변화에 의해 나타난다. 도 5A 및 도 5B에서, 그룹 A는 혼합비가 중량 기준으로 8:2인 HMWHA와 LMWHA의 혼합물을 나타내고, 한편 그룹 B는 혼합비가 중량 기준으로 1:1인 HMWHA와 LMWHA의 혼합물을 나타낸다. 그룹 C는 HA가 PBS 완충액(PBS buffer)으로 대체된 대조군을 나타낸다. 비록 통계적인 유의성은 단지 5일 및 6일에서만 나타났으나, 이 도면의 중요성은 1일부터 14일까지의 각 그룹의 경향에 있다. 시간이 경과함에 따라, 그 역시 IBD에 속하는 대장염에 대하여 그룹 A 및 그룹 B 모두 경감 효과를 가졌다는 경향이 나타난다.
대조군(그룹 C)과 HA(그룹 A 및 B) 사이의 평균 체중 변화에서, 대장염의 치료 효과는, 전체 실험 기간 동안, 심지어 실험 14일까지도, HA가 투여된 그룹의 평균 체중을 대조군보다 더 높게 유지시켰다(도 5A). 흥미롭게도, 또한 그룹 A보다 그룹 B가 일반적으로 더 양호한 치료효과를 갖는 경향이 나타나고, 이것은 LMWHA의 비율이 더 높은 경우에 더 효과적인 치료 효과를 가진다는 것을 의미한다. 이것은, 효과를 연장하기 위해, LMWHA를 보충하는 HMWHA를 이용하는 본 발명의 기술적인 특징을 뒷받침할 수 있다.
본 발명은 알레르기 증상의 인식 및 코 문지르기의 횟수가 감소할 때 증상이 완화된 것으로 인식하기 위한 간편한 지표로서 코 문지르기를 사용한다. 결과는 28일(D28)에 대조군(오직 PBS만을 투여함)과 그룹 HA 사이에서 상당한 차이를 나타내는데, 이것은 알레르기 증상이 성공적으로 유도되었음을 의미한다(도 6). 비록 30일(D30)의 결과는 통계상으로 유의적인 차이를 갖지는 않지만, 알레르기 증상이 대조군과 그룹 HA 사이에서 여전히 명백하게 감소하였다. 따라서, 알레르기 증상의 완화 경향은 본 발명에 따른 HA 혼합물의 투여 결과에 의해 확실하게 입증되었다(도 6).
결과는 다양한 실험에서 다소 다를 수 있다; 그러나, 본 발명의 전반(全般)에서 그 경향은, 본 발명에 따른 조성물이 알레르기 증상을 포함하는 점막에 관련된 장애 또는 질병을 개선하는 기능을 갖는 것으로 추론될 수 있다. 결과를 정확히 나타내기 위하여, 본 발명은 실험 시간이 더 짧은 몇몇 관련된 실험에 의해 입증되었다; 그러나, 본 발명이 목표로 하는 포유동물에 대한 실제 적용에서는 실험에서보다 더 긴 기간이 소요될 것이다. 따라서, 이론 및 본 발명의 결과에 근거하여, 본 발명의 HMWHA는 체내에서 LMWHA의 즉각적인 치료 효과에 대한 장기간의 보조 및/또는 보충을 수행하는 데 충분할 것이다.
과민성 대장 증후군(IBS) 치료의 바람직한 실시예는 본 발명의 혼합물을, 항알레르기제, 진경제, 지사제, 신경파괴제, 신경안정제, 마약성 진통제, 항우울제 또는 세로토닌 길항제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 달성될 수 있다.
구강 제형의 바람직한 실시예에서(예를 들면 장용성 정제), 장용성 코팅은 위에서의 용해 및 분해에 대한 더 큰 저항을 제공하며, 또한 소장 및 결장에 도달한 후에, 염증 부위의 치료를 가속화하고 또한 긴 분해 시간에 의해 치료 효과를 연장하고자 염증이 일어난 결장(위쪽으로 상승한 부위 또는 횡행결장)에서 보호막을 형성하기 위하여, 장용성 코팅은 용해되고 그 내부의 HA 혼합물은 방출될 것이다.
좌약 제형의 바람직한 실시예에서, 그 내부에 HA 혼합물을 함유하는 좌약은 항문으로 주입될 수 있으며, 염증 부위의 치료를 가속화하고 또한 지속적인 방출 효과를 달성하고자 염증이 일어난 결장에서 보호막을 형성하기 위하여, 혼합물은 직장에서 방출되고 결장의 다른 부위(예를 들면 하행 부위)로 확산될 것이다.
관류 제형의 바람직한 실시예에서(예를 들면 관장제), 그 내부의 HA 혼합물은 부형제(예를 들면 인산 완충 식염수(PBS 용액 또는 현탁액 제형))와 혼합된 주요한 활성 성분으로, 직접 사용되거나 또는 상기 HA 혼합물을 장 내에 주입하기 위한 유연한 관을 통해 주입된다. 염증 부위의 치료를 가속화하고 또한 지속적인 방출 효과를 달성하고자 염증이 일어난 결장에서 보호막을 형성하기 위하여, HA 혼합물은 결장에 가득 채워지고 결장의 다른 부위(예를 들면 하행 부위)로 확산될 것이다.
본 명세서에서 사용된 혼합물에 의하여 치료되는 개체의 더 바람직한 예는 포유동물이다. 개체의 가장 바람직한 예는 인간이다.
상기 설명에 따르면, 신속하게 상처 또는 염증성 표면을 덮고 치료 기간을 단축하며 커버링(covering) 기간을 연장하고자 분해를 지연하기 위하여, 상이한 분자량을 갖는 히알루론산의 약학적으로 허용가능한 염의 최소한 두 가지 종류가 혼합된다. 따라서, 더 빠른 치료 및 지속적인 방출 효과가 달성된다. 본 발명은 전술한 장애 또는 질병을 치료하기 위한 더 간편하고 안전한 방법, 및 또한 관련된 환자들에게 더 나은 대안을 제공함으로써 그들을 돕는, 비용이 덜 드는 방법을 제공한다.
본 발명이 특정한 최선의 실시예와 결부하여 기재되었으나, 전술한 기재에 비추어, 당 업자에게는 수많은 대안, 수정, 및 변형이 명백한 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 청구항의 사상 및 범위 내에 속하는 모든 그러한 대안, 수정, 및 변형을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 기재되거나 또는 첨부된 도면에 도시된 모든 사항들은 예시적이며 비제한적인 의미로 해석되어야 한다.
Claims (25)
- 점막에 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 조성물로서,
저분자 히알루론산(LMWHA) 및 고분자 히알루론산(HMWHA)을 포함하는 히알루론산 혼합물을 치료학정 유효량으로 포함하며, LMWHA의 평균 분자량은 50 kDa 내지 1.5 MDa이고 HMWHA의 평균 분자량은 1.5 MDa 내지 5MDa이며, LMWHA의 평균 분자량이 HMWHA의 평균 분자량으로부터 적어도 0.5 MDa 이상 차이를 보이고, LMWHA:HMWHA의 혼합비가 중량 기준으로 20:80 내지 80:20인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 LMWHA의 평균 분자량이 0.1 MDa 내지 1.5 MDa인, 조성물. - 제 2항에 있어서,
상기 LMWHA의 평균 분자량이 0.1 MDa 내지 0.5 MDa인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 HMWHA의 평균 분자량이 1.5 MDa 내지 3.5 MDa인, 조성물. - 제 4항에 있어서,
상기 HMWHA의 평균 분자량이 1.5 MDa 내지 2.5 MDa인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 LMWHA:HMWHA의 혼합비가 중량 기준으로 1:1인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 치료학적 유효량이 0.05 mg/ml 내지 50 mg/ml인, 조성물. - 제 7항에 있어서,
상기 치료학적 유효량이 0.05 mg/ml 내지 5 mg/ml인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 점막에 관련된 장애 또는 질병이 궤양, 염증, 알레르기 반응 또는 출혈의 증상을 포함하는, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 점막이 눈의 점막, 귀의 점막, 코의 점막, 입의 점막, 호흡기의 점막, 위장관의 점막, 요로의 점막 또는 생식관의 점막인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 점막에 관련된 장애 또는 질병이 결막염, 이염, 알레르기성 비염, 치은염, 구강 궤양, 기관지염, 역류성 식도염(GRED), 식도염, 위염, 장염, 소화성 궤양, 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군(IBS), 요도염, 방광염 또는 질염인, 조성물. - 제 11항에 있어서,
상기 장염이 급성 장염, 만성 장염, 전염성 장염, 허혈성 장염, 방사성 장염(radioenteritis) 또는 약물 유발성 장염인, 조성물. - 제 11항에 있어서,
상기 소화성 궤양이 위 궤양, 십이지장 궤양, 식도 궤양 또는 멕켈게실 궤양(Meckel's Diverticulum ulcer)인, 조성물. - 제 11항에 있어서,
상기 염증성 장질환(IBD)이 크론병 또는 궤양성 대장염인, 조성물. - 제 11항에 있어서,
상기 과민성 대장 증후군(IBS)이 만성 소화 장애증, 과당 흡수장애(fructose malabsorption), 가벼운 감염, 편모충증(giardiasis) 같은 기생충 감염, 기능성 만성 변비, 설사 또는 만성 기능성 복부통증인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물을 눈, 귀, 구강, 코, 호흡기, 위장관 또는 국부 사용을 위한 투여 제형으로 제조하기 위하여 부형제(excipient)를 추가로 포함하는, 조성물. - 제 16항에 있어서,
상기 구강 사용을 위한 투여 제형이 고체 제형, 액제, 방출 조절 정제를 포함하는 정제, 및 캡슐로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조성물. - 제 16항에 있어서,
상기 위장관 사용을 위한 투여 제형이 고체 제형, 관류, 관장, 좌약, 및 현탁액을 포함하는 액제로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조성물. - 제 16항에 있어서,
상기 국부 사용을 위한 투여 제형이 관류, 관장, 좌약, 분무, 흡입, 및 적하(滴下)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 히알루론산 조성물이 고체 제형이고, 상기 히알루론산 조성물의 치료학적 유효량이 일(日) 당 50 mg 내지 1,000 mg의 히알루론산인, 조성물. - 제 11항에 있어서,
알레르기성 비염 또는 기관지염이 항히스타민제, 항알레르기제, 항충혈제, 스테로이드제, 또는 천식치료제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서의 상기 조성물에 의해 치료될 수 있는, 조성물. - 제 12항에 있어서,
장염이 항생제 또는 진경제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서의 상기 조성물에 의해 치료될 수 있는, 조성물. - 제 13항에 있어서,
소화성 궤양이 지혈제, 항생제, 제산제, H2 차단제, 수소칼륨 이온 펌프 차단제(PPI), 세포보호제, 또는 점막보호제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서의 상기 조성물에 의해 치료될 수 있는, 조성물. - 제 14항에 있어서,
염증성 장질환(IBD)이 스테로이드제, 면역억제제, 항생제, 5-아미노살리실산(5-ASA) 및 유도체, 또는 항염증제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서의 상기 조성물에 의해 치료될 수 있는, 조성물. - 제 15항에 있어서,
과민성 대장 증후군(IBS)이 항알레르기제, 진경제, 지사제, 신경파괴제, 신경안정제, 마약성 진통제, 항우울제 또는 세로토닌 길항제와 함께 결합하여 사용되는 보조제로서의 상기 조성물에 의해 치료될 수 있는, 조성물.
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Legal Events
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| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal |