KR20130097789A - 내분비, 위장관 또는 자가면역 장애 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

내분비, 위장관 또는 자가면역 장애 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

포유동물 숙주에서 질환 또는 장애, 예컨대 내분비, 위장관 또는 자가면역 장애를 직접적으로 또는 간접적으로 치료하기 위한 단리된, 조작된 재조합 세포의 용도와 관련된 재조합 세포 및 방법을 제공한다. 신호 서열은 숙주에서의 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절할 수 있거나 또는 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절할 수 있으며, 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것이고, 표적 핵산은 숙주에서 생리학적 과정의 정상적인 작용을 촉진시키거나 또는 숙주에서 비-감염성 질환의 발병, 확립 또는 확산을 예방하는 데 효과적인 것인, 신호 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 재조합 세포를 숙주에게 투여하여 상기 질환 또는 장애를 치료한다.

Description

내분비, 위장관 또는 자가면역 장애 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING ENDOCRINE, GASTROINTESTINAL OR AUTOIMMUNE DISORDERS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2010년 10월 15일 출원된, 동시-계류 중인 미국 가특허 출원 일련 번호 61/393,618, 및 2011년 9월 26일 출원된 일련 번호 61/539,121의 우선권 및 이점을 주장하며, 이들 가출원 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 언급
적용되지 않음
1. 기술 분야
본 발명은 일반적으로 내분비, 위장관 또는 자가면역 장애 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
2. 본 발명의 배경
당뇨병은 고혈당증; 지질, 탄수화물 및 단백질 대사의 변경; 및 혈관 질환으로부터 유발되는 합병증 위험의 증가를 특징으로 하는 질환이다. 당뇨병은 고령화 및 비만, 둘 모두와 관련이 있는 바, 공중 위생 문제로서 증가하고 있다.
당뇨병에는 2가지 주요 유형이 있다: 1) 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)으로도 알려져 있는 I형 당뇨병, 및 2) 인슐린 독립성 또는 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM)으로도 알려져 있는 II형 당뇨병. 상기 2가지 유형의 당뇨병 모두 순환 인슐린 양의 부족 및 인슐린에 대한 말초 조직의 반응 감소에 기인하는 것이다.
I형 당뇨병은 신체 세포를 "잠금 해제"시켜 글루코스가 상기 세포 내로 진입하여 그에 연료를 공급할 수 있도록 하는 호르몬인 인슐린을 생산하지 못하는 신체의 기능상실로부터 일어난다. I형 당뇨병의 합병증으로는 심장 질환 및 뇌졸중; 망막병증 (눈 질환); 신장 질환 (신장병증); 신경병증 (신경 손상); 뿐만 아니라, 우수한 피부, 발 및 구강 건강 유지를 포함한다.
II형 당뇨병은 충분한 인슐린을 생산해 내지 못하는 신체의 무능력함, 또는 신체에 의해 천연적으로 생산된 인슐린을 사용하지 못하는 세포의 무능력함으로부터 일어난다. 신체가 인슐린을 최적으로 사용하지 못하는 경우의 병증을 인슐린 저항성이라 명명한다. II형 당뇨병은 대개 고혈압을 동반하며, 이는 심장 질환의 원인이 될 수 있다. II형 당뇨병 환자에서는, 스트레스, 감염, 및 예컨대, 코티코스테로이드와 같은 약물 처치 또한 혈당 수준을 심각하게 상승시킬 수 있다. 탈수를 동반하는 혈당 수준의 극심한 상승은 II형 당뇨병 환자에서 혈중 오스몰 농도를 증가시킬 수 있다 (고삼투압 상태). 이러한 병증은 혼수를 일으킬 수 있다.
인슐린은 근육 및 지방 조직에 의한 글루코스의 흡수와 대사를 자극시킴으로써 혈중 글루코스의 농도를 저하시킨다. 인슐린은 글루코스를 간에서는 글리코겐으로서, 및 지방 조직에는 트리글리세리드로서 보관하는 것을 자극시킨다. 인슐린은 또한 글루코스가 근육에서 에너지 목적으로 이용될 수 있도록 하는 것을 촉진시킨다. 따라서, 혈중 인슐린 수준이 부족하거나, 또는 인슐린에 대한 감수성이 감소하게 되면 혈중 글루코스 및 트리글리세리드 수준은 과도하게 높아지게 된다.
치료하지 않은 상태의 당뇨병의 조기 증상은 혈당 수준 상승, 및 뇨 중 글루코스의 손실과 관련이 있다. 뇨 중 다량의 글루코스는 소변 배설량을 증가시킬 수 있고, 탈수를 일으킬 수 있다. 탈수는 갈증 및 물 섭취량을 증가시킨다. 식욕이 증가했음에도 불구하고, 글루코스 에너지를 이용할 수 없음으로 인해 결국에는 체중이 감소된다. 일부의 치료받지 않은 당뇨병 환자는 또한 피로감, 오심, 및 구토를 호소한다. 당뇨병 환자는 방광, 피부, 및 질 부위에서 감염이 발생되기 쉽다. 혈중 글루코스 수준의 변동이 흐린 시력을 일으킬 수 있다. 극도로 상승된 글루코스 수준은 기면 및 혼수 (당뇨병 혼수)를 일으킬 수 있다.
글루코스 수준이 정상과 당뇨병 사이에 있는 사람은 내당능장애 (IGT)가 있는 사람이다. 상기 병증은 또한 당뇨병전기 또는 인슐린 저항성 증후군으로도 불린다. IGT가 있는 사람은 당뇨병을 앓는 것은 아니지만, 오히려 그의 혈중 글루코스 수준은 정상보다는 높으나, 당뇨병으로 진단할 만큼 충분히 높지는 않다. 그의 신체에서는 점점 더 많은 인슐린이 생산되지만, 조직이 그에 대해 반응하지 못하기 때문에, 그의 신체는 당을 적절히 이용할 수 없다. IGT 그 자체가 심장 질환 발병의 위험 인자가 될 수 있다는 것이 최근 연구를 통해 밝혀졌다. 당뇨병전기인 사람은 혈중 글루코스가 정상인 사람과 비교하여 심혈관 질환의 위험이 1.5배되는 것으로 추정된다. 당뇨병인 사람은 심혈관 질환의 위험이 2 내지 4배 증가되어 있다.
혈중 글루코스 및 트리글리세리드의 수준이 높으면 모세혈관 기저막이 비후화되고, 이로 인해 혈관의 관내강이 점진적으로 협착된다. 혈관상의 병적 이상은 예컨대, 당뇨병성 망막병증과 같은 병증을 일으키는데, 이는 실명, 관상 동맥 심장 질환, 모세관간 사구체경화증, 신경병증, 및 사지 궤양 및 괴저를 유발할 수 있다.
과도한 혈장 글루코스 수준의 독성 효과로는 세포 및 조직의 당화를 포함한다. 당화된 생성물은 조직에 축적되고, 결국에는 가교 결합된 단백질을 형성할 수 있는데, 이 가교 결합된 단백질은 진행 당화 최종 생성물로 명명된다. 비효소적 당화가 혈관 기질의 확장 및 당뇨병의 혈관 합병증에 대한 직접적인 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐이 당화되면 가교 결합이 과도하게 일어나고, 이를 통해 죽상경화성 혈관이 형성된다. 또한, 대식세포에 의한 당화된 단백질 흡수는 상기 세포에 의한 염증유발 시토카인의 분비를 자극한다. 시토카인은 중간엽 세포 및 내피 세포에서 각각 분해성 및 증식성 캐스케이드를 활성화시키거나 유도한다.
헤모글로빈의 당화는 통합 혈당 상태 지수를 측정할 수 있는 편리한 방법을 제공한다. 당화된 단백질 수준이 일정 기간 동안에 걸친 글루코스 수준을 반영하고, 이는 헤모글로빈 A1 (HbA1c) 검정법으로서 지칭되는 검정법의 기초가 된다.
HbA1c는 지난 120일 동안의 혈중 글루코스 수준의 가중 평균을 반영하는데; 지난 30일 동안의 혈장 글루코스가 HbA1c 검정에서 최종 결과에 대해 약 50% 정도로 기여한다. (HbA1c, 글리코헤모글로빈 또는 당화 헤모글로빈으로도 또한 알려져 있는) A1c에 대한 시험은 지난 수개월 동안에 걸쳐 당뇨병이 얼마나 잘 조절되었는지를 나타낸다. A1c가 6%에 가까울수록 당뇨병 조절이 더욱더 잘 이루어진 것이다. A1c 혈중 글루코스가 매 30 mg/dl씩 증가할 경우, A1c는 1%씩 증가하고, 합병증의 위험도 증가한다.
고혈당증의 독성 효과에 대한 또 다른 설명으로는 소르비톨 형성을 포함한다. 세포내 글루코스는 효소 알도스 리덕타제에 의해 그의 상응하는 당 알콜인 소르비톨로 환원되며; 소르비톨 생산 속도는 주변 글루코스 농도에 의해 측정된다. 따라서, 조직, 예컨대, 수정체, 망막, 동맥벽 및 말초 신경의 슈반 세포는 고농도의 소르비톨을 가진다.
고혈당증은 또한, 글루코스가 미오이노시톨과 경쟁함으로써 세포 농도를 감소시키고, 그 결과 신경 기능을 변경시키고, 신경병증을 일으키는 바, 신경 조직의 기능을 손상시킨다.
트리글리세리드 수준 증가는 또한 인슐린 결핍증의 결과이다. 고수준의 트리글리세리드는 또한 혈관 질환과도 관련이 있다.
따라서, 혈중 글루코스 및 트리글리세리드 수준을 조절하는 것이 치료학상 바람직한 목적이 된다. 경구용 항고혈당제 다수가 알려져 있다. 췌장에 의한 인슐린 생산량을 증가시키는 약물로는 술포닐우레아 (클로르프로파미드 [오리네이스(Orinase)®], 톨부타미드 [톨리네이스(Tolinase)®], 글리부리드 [마이크로네이스(Micronase)®], 글리피지드 [글루코트롤(Glucotrol)®], 및 글리메피리드 [아마릴(Amaryl)®] 포함) 및 메글리티니드 (레파글리니드 [프란딘(Prandin)®] 및 나테글리니드 [스타릭스(Starlix)®] 포함)를 포함한다. 간에 의해 생산된 글루코스의 양을 감소시키는 약물로는 비구아니드 (메트포르민 [글루코파지(Glucophage)®] 포함)를 포함한다. 인슐린에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 약물로는 타졸리딘디온 (트로글리타존 [레줄린(Resulin)®], 피오글리타존 [액토스(Actos)®] 및 로시글리타존 [아반디아(Avandia)®] 포함)을 포함한다. 장으로부터의 탄수화물 흡수를 감소시키는 약물로는 알파 글루코시다제 억제제 (아카보스 [프레코스(Precose)®] 및 미글리톨 [글리셋(Glyset)®] 포함)를 포함한다. 피오글리타존 및 로시글리타존이 당뇨병에서 콜레스테롤 패턴을 변화시킬 수 있다. HDL (또는 좋은 콜레스테롤)은 상기 약물 상에서 증가한다. 아카보스는 장에 대해 작용하는데; 그의 효과는 다른 부위에 작용하는 당뇨병 약물, 예컨대, 술포닐우레아에 부가된다. ACE 억제제는 고혈압 또는 당뇨병이 있는 사람에서 고혈압을 조절하는 데, 심장 기능상실을 치료하는 데, 및 심장 손상을 예방하는 데 사용될 수 있다. ACE 억제제 또는 ACE 억제제와 이뇨제, 예컨대, 히드로클로로타지드의 조합 제품이 시판되고 있다. 그러나, 그러나 상기 치료법들은 많은 부작용과 함께 단기 치료법이라는 것을 제기하는 바, 그 중 어느 치료법도 이상적이지는 않다.
혈압을 조절하면 심혈관 질환 (예를 들어, 심근경색증 및 뇌졸중)을 대략 33% 내지 50% 만큼 감소시킬 수 있고, 미세혈관 질환 (눈, 신장, 및 신경 질환)을 대략 33% 만큼 감소시킬 수 있다. 질병 관리 센터(Center for Disease Control)는, 수축기 혈압이 매 수은 10 밀리미터 (10 mm Hg)씩 감소할 때마다, 당뇨병과 관련된 임의의 합병증에 걸릴 위험은 12% 만큼 감소한다는 것을 발견하게 되었다. 콜레스테롤 및 지질 (예를 들어, HDL, LDL, 및 트리글리세리드) 조절이 개선되면 심혈관 합병증은 20% 내지 50% 만큼 감소될 수 있다.
건강한 인간에서, 총 콜레스테롤은 200 mg/dl 미만이어야 한다. 고밀도 지질단백질 (HDL 또는 "좋은" 콜레스테롤)에 대한 표적 수준은 남성의 경우, 45 mg/dl 초과이고, 여성의 경우, 55 mg/dl 초과인 반면, 저밀도 지질단백질 (LDL 또는 "나쁜" 콜레스테롤)은 100 mg/dl 미만으로 유지되어야 한다. 여성 및 남성에 대한 표적 트리글리세리드 수준은 150 mg/dl 미만이다.
당뇨병 환자 중 대략 50%에서는 당뇨병을 앓은지 10년 정도가 되면 어느 정도의 당뇨병성 망막병증이 발병되고, 당뇨병 중 80%에서는 15년 후 망막병증이 생긴다.
미국 국립 당뇨병, 소화기병, 신장병 연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases: NIDDK)에 의해 수행된 연구 (DCCT 연구)를 통해, 혈중 글루코스 수준을 가능한 정상 수준에 가깝게 유지시켜 주는 것이 당뇨병에 의해 유발된 눈, 신장, 및 신경 질환의 발병 및 진행을 저속화시킨다는 것이 밝혀졌다.
당뇨병 예방 프로그램(Diabetes Prevention Program: DPP) 임상 시험에서, 2형 당뇨병을 연구하였다. 3년간 진행된 DPP 연구를 통해, 다이어트 및 운동이, IGT가 있는 사람에서 당뇨병이 발병될 수 있는 기회를 급격히 감소시켰다는 것이 밝혀졌다. 비록 극적인 감소는 덜 하기는 하지만, 메트포르민 (글루코파지®) 투여 또한 위험을 감소시켰다.
DCCT 연구를 통해 HbA1c와 평균 혈중 글루코스 사이의 상관관계가 밝혀졌다. DPP 연구를 통해 HbA1c가 유해한 결과 위험과 강력한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
미국 심장 협회의 예방 학회 VI(American Heart Association's Prevention Conference VI) 보고서 시리즈: {Diabetes and Cardiovascular Disease}에는, 당뇨병이 있는 사람 중 약 ⅔는 결국 심장 또는 혈관 질환으로 사망한다고 보고되어 있다. 당뇨병과 관련된 심혈관 질환의 위험 증가는 개별 위험 인자, 예컨대, 비만, 고 콜레스테롤, 및 고혈압 조절을 통해 감소될 수 있다는 것도 연구에 의해 밝혀졌다.
당뇨병을 앓는 사람에 있어서 합병증, 예컨대, 심혈관 질환, 망막병증, 신장병증, 및 신경병증의 위험을 감소시키는 것이 중요하다. 당뇨병에 있어서 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 감소시켜 심혈관 합병증을 감소시키는 것 또한 중요하다. IGT (당뇨병전기)를 앓는 사람에 있어서 상기와 같은 가능성을 지닌 합병증의 위험을 감소시키는 것 또한 중요하다.
따라서, 혈중 글루코스 수준이 조절될 수 있다면, 합병증, 예컨대, 심혈관 질환, 망막병증, 신장병증, 및 신경병증의 위험이 감소될 수 있거나, 그의 발병은 지연될 수 있다. 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준이 감소될 수 있다면, 이때 심혈관 합병증은 감소될 수 있다.
본 출원의 섹션 2, 또는 임의의 다른 섹션에서 임의의 참고 문헌을 인용하거나, 밝힌 것은 상기 참고 문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용될 수 있다는 것을 인정하는 것으로서 간주되서는 안된다.
3. 본 발명의 개요
재조합 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 재조합 세포는 신호 서열 및 프로모터를 포함하며, 여기서,
a. 신호 서열은 숙주에서의 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하고;
b. 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것이고;
c. 신호 서열은 GLP-2, 그의 단편, 또는 그의 유사체, 또는 그의 조합이다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 신호 서열 및 프로모터를 포함하며, 여기서,
a. 신호 서열은 숙주에서의 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하고,
b. 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것이고,
c. 표적 핵산은 숙주의 제1 세포를 제2 세포로 리프로그래밍할 수 있는 포유동물 인자를 코딩한다.
또 다른 실시양태에서, 숙주는 포유동물이다.
또 다른 실시양태에서, 제2 세포는 β-유사 세포, 갑상선 세포, 간세포 또는 면역반응성 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 숙주의 제1 세포는 장 상피 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 제2 세포는 글루코스 반응성 인슐린 분비 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절한다.
또 다른 실시양태에서, 프로모터는 글루코스-반응성 프로모터이다.
또 다른 실시양태에서, 프로모터는 당업계에 공지된 임의의 유도성 또는 구성적 프로모터일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 GLP-1, GIP, PDX-1, 하나 이상의 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 GLP-1, PDX-1, GIP, GLP-2, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관작용성 장 폴리펩티드, 트레포일 인자, 세포 및 조직 복구 인자, 형질전환 성장 인자 β, 각질세포 성장 인자, 역평행 4α 나선형 다발 구조를 취하는 구조상 1군 시토카인, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, IFNα/β, 구조상 2군 시토카인, TNF-패밀리 시토카인, TNFα, TNFβ, CD40, CD27, FAS 리간드, IL-1-패밀리 시토카인, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 p, 신경 성장 인자, 단쇄 α/β 분자를 포함하는 구조상 3군 시토카인, 표피 성장 인자-패밀리 시토카인, C-C 또는 C-X-C 케모카인, 인슐린-관련 시토카인, 구조상 4군 시토카인, 헤레귤린, 뉴레귤린, EGF, 면역글로불린-유사 도메인, 크링글 도메인, 하나 이상의 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 신호 서열 및 프로모터는 재조합 세포 중 플라스미드 상에서 코딩된다.
또 다른 실시양태에서, 세포는 프로바이오틱 박테리아로부터 유래된 것이다.
또 다른 실시양태에서, 세포는 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 박테로이데스(Bacteroides), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 프로테우스(Proteus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 및 코리네박테리움(Corynebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아이다.
또 다른 실시양태에서, 표적 핵산은 숙주에서 생리학적 과정의 원하는 작용을 촉진시킬 수 있거나 또는 숙주에서 비-감염성 질환을 치료할 수 있는 포유동물 인자를 코딩한다.
또 다른 실시양태에서, 비-감염성 질환은 자가면역 질환, 암, 내분비 질환, 위장관, 암 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 비-감염성 질환은 당뇨병이다.
또 다른 실시양태에서, 당뇨병은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 또는 대사 증후군이다.
또 다른 실시양태에서, 비-감염성 질환은 크론병, 비만, 페닐케톤뇨증, 단풍당뇨병증, 히스티딘혈증, 고혈당증, 당뇨병성 망막병증, 관상 동맥 심장 질환, 모세관간 사구체경화증, 신장병증, 신경병증, 사지 궤양 또는 괴저, 아테롬성동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 고단백혈증, 단백뇨증, 골다공증, 빈혈, 과지질단백질혈증, 케톤산증, 고트리글리세리드혈증, 락트산혈증, 심근병증, 윌슨병, 백질이영양증, 푸코시드축적증, 암, 화학요법-유도성 설사, 염증성 장 질환, 심실 및 심방 세동, 수술 후 기관 기능상실, 과민성 장 증후군, 간질성 방광염/방광 통증 증후군, 단장 증후군, 궤양성 대장염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 암은 위장관 암, 위암, 담낭암, 위장관 기질 종양, 간암, 췌장암, 또는 결장암이다.
또 다른 실시양태에서, 포유동물 인자는 장 손상 또는 수술 후 생리학적 과정의 원하는 작용을 촉진시킨다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 숙주의 체순환 내로 흡수되지 않고 장 융모에 도달할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 프로모터는 유도성 또는 구성적 프로모터이다.
또 다른 실시양태에서, 프로모터는 fliC 프로모터이다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 분비 태그를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 분비 태그는 fliC 분비 태그이다.
또 다른 실시양태에서, 분비 태그는 알파-헤몰리신 (HlyA) 분비 태그이다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 세포-투과 펩티드 (CPP) 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 신호 서열을, 신호 서열에 의해 코딩되는 신호 및 세포 투과 펩티드 서열에 의해 코딩되는 세포-투과 펩티드를 포함하는 것인 융합 단백질로서 발현한다.
숙주에게 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 세포는 신호 서열 및 프로모터를 포함하며, 여기서
a. 신호 서열은 숙주에서의 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하고,
b. 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것이고,
c. 표적 핵산은 숙주의 제1 세포를 제2 세포로 리프로그래밍할 수 있는 포유동물 인자를 코딩하는 것인, 숙주에서 당뇨병은 치료하는 방법 또한 제공한다.
한 실시양태에서, 표적 신호 서열은 질환-예방 인자의 발현을 자극시키거나 또는 당뇨병 유발 인자의 발현을 억제시킨다.
또 다른 실시양태에서, 당뇨병은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 또는 대사 증후군이다.
또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절한다.
또 다른 실시양태에서, 환경 자극은 글루코스이다.
또 다른 실시양태에서, 질환-예방 인자는 인슐린을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 표적 핵산은 숙주에서 혈중 글루코스 수준 감소를 촉진시키는 포유동물 인자를 코딩한다.
또 다른 실시양태에서, 표적 핵산은 숙주에서 혈중 인슐린 수준 증가를 촉진시키는 포유동물 인자를 코딩한다.
포유동물 숙주에게 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 세포는 신호 서열 및 프로모터를 포함하며, 여기서
a. 신호 서열은 숙주에서의 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하고,
b. 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것이고,
c. 표적 핵산은 숙주의 제1 세포를 제2 세포로 리프로그래밍할 수 있는 포유동물 인자를 코딩하는 것인, 포유동물 숙주에서 장 세포를 또 다른 세포 유형으로 분화시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 또 다른 세포 유형은 β-유사 세포, 갑상선 세포, 간세포 또는 면역반응성 세포이다.
또 다른 실시양태에서, β-유사 세포는 글루코스-반응성 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 유효량의 재조합 세포가 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포의 유효량은 약 104 CFU/kg 이상이다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 시너지 효과를 가지는 화합물과 함께 조합되어 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 시너지 효과를 가지는 화합물은 DPP-4 억제제, GLP-2, GLP-1 효능제, 디메틸 술폭시드, 인슐린, 알파-글루코시다제 억제제, 프람린티드, 메글리티니드, 레파글리니드, 나테글리니드, 클로르프로파미드, 메트포르민, 술포닐우레아, 글리피지드, 글리부리드, 글리메피리드, 티아졸리딘디온, 그의 유사체, 그의 단편, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 GLP-1, PDX-1, GIP, GLP-2, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관작용성 장 폴리펩티드, 트레포일 인자, 세포 및 조직 복구 인자, 형질전환 성장 인자 β, 각질세포 성장 인자, 역평행 4α 나선형 다발 구조를 취하는 구조상 1군 시토카인, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EP0, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, IFNα/β, 구조상 2군 시토카인, TNF-패밀리 시토카인, TNFα, TNFβ, CD40, CD27, FAS 리간드, IL-1-패밀리 시토카인, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 p, 신경 성장 인자, 단쇄 α/β 분자를 포함하는 구조상 3군 시토카인, 표피 성장 인자-패밀리 시토카인, C-C 또는 C-X-C 케모카인, 인슐린-관련 시토카인, 구조상 4군 시토카인, 헤레귤린, 뉴레귤린, EGF, 면역글로불린-유사 도메인, 크링글 도메인, 하나 이상의 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 GIP, GLP-1, GLP-2, PDX-1, 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합이다.
신호 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 신호 서열은 GLP-1, GIP, PDX-1, 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 숙주에서 장 세포를 글루코스-반응성 인슐린 분비 세포로 리프로그래밍하는 방법 또한 제공한다.
한 실시양태에서, 숙주는 고혈당이고, 그에 의해 재조합 세포를 고혈당 숙주에게 투여하는 것이 외인성 인슐린을 숙주 내로 치료적 투여하여야 하는 필요성을 감소시키거나 제거한다.
4. 도면의 간단한 설명
본 발명은 본원에서 첨부되는 도면을 참고로 하여 기술되는데, 도면에서 유사한 참조 부호는 여러 도면 전역에 걸쳐 유사한 요소를 표시하는 것이다. 일부 경우에서, 본 발명의 다양한 측면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 과장되거나, 확대되어 제시될 수 있음을 이해하여야 한다.
도 1은 본 연구를 위해 제조된 플라스미드를 도시한 것이다. 이. 콜라이(E. coli) DH5α로부터의 P0/P1 프로모터를 연구하기 위해, 두 플라스미드 (pFD1 및 pFD2)를 제조하였다. pFD1은 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 발현을 유도하는 전체 P0/P1 영역을 코딩하였다. pFD2는 EGFP로부터 상류쪽의 프로모터 중 P0 영역만을 코딩하였다. Caco-2 세포에서의 인슐린 분비 자극을 위한 재조합 박테리아로부터의 인슐린자극 단백질 분비율을 시험하기 위해, 플라스미드 pFD-PDX, pFD-GLP, 및 pFD-20을 구축하였다.
도 2는 글루코스에 대한 P0 및 P0/P1 반응을 도시한 것이다. 상이한 배지 조건에 대한 P0 및/또는 P1 프로모터의 반응을 측정하기 위하여 EGFP 발현을 사용하였다. P0=P0만; P0+P1=P0 플러스 P1 측면 영역; DH5α=lac 오페론 대조군.
도 3은 이. 콜라이 니슬에 의한 재조합 인슐린자극 단백질의 분비를 도시한 것이다.
도 4A는 GLP-1 (G), PDX-1-CPP (P), GLP-1 및 PDX-1-CPP, 둘 모두 (GP), 또는 대조군 플라스미드 ("20"으로 표시된 샘플)를 발현하는 이. 콜라이 니슬의 밤새도록 배양된 배양물로부터의 무세포 배지 (CFM)와 함께, 또는 합성된 GLP-1 (아미노산 1 내지 37; "37"로 표시된 샘플)과 함께 배양된 후, 글루코스 ("g") 또는 글리세롤로 자극을 받은 Caco-2 세포의 역전사-PCR을 도시한 것이다.
도 4B는 자극을 받은 Caco-2 세포에 의한 인슐린 분비에 관하여 실시된 효소-결합 면역흡착 검정법을 도시한 것이다. 오차 막대는 3회 이상 실시된 실험에 대한 1 표준 편차를 나타낸다. p 값은 스튜던트 t 검정 (n=3)으로부터의 것이다.
도 5는 fliC 프로모터 및 분비 태그를 이용하여 GLP-1을 분비하도록 조작된 니슬로부터의 GLP-1의 분비와, 같은 서열을 포함하나 pKD3 염색체 삽입 카세트는 없는 플라스미드 포함 균주로부터의 GLP-1의 분비와의 비교를 도시한 것이다.
도 6은 같은 서열을 포함하나, pKD3 염색체 삽입 카세트는 없는 플라스미드 포함 균주로부터의 분비에 대한, fliC 프로모터 및 분비 태그를 이용하여 GLP-1을 분비하도록 조작된 니슬로 처리된 마우스들 간의 글루코스 수준에 대한 생체내 시험을 도시한 것이다.
도 7은 1형 당뇨병의 뮤린 모델에서 혈중 글루코스 수준의 감소를 도시한 것이다.
도 8A-B는 인슐린을 제시하는 마우스 장 절편에 대한 면역조직화학법 결과를 도시한 것이다. GLP-1을 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 (A) 및 무작위 펩티드를 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 (B)를 공급받은 당뇨병 마우스를 섹션 6.5, 실시예 5에 기술되어 있는 실험 종결시 희생시켰다. 장 절편은 인슐린 존재시 (적색으로) 염색되었다. A에서 고농도의 인슐린은 화살표로 표시되어 있다.
도 9A-E는 니슬-GLP-1, 니슬로 처리한 후의 마우스, 또는 어떤 처리도 하지 않는 마우스에서의 측정 결과를 도시한 것이다. β 세포 질량을 측정하였다 (A). 마우스 무작위 글루코스 수준 (B) 및 체중 (C)을 80일 동안에 걸쳐 모니터링하였다. 글루코스 주사 후 1.5시간 동안 매 30분마다 혈중 인슐린을 측정하고 (D), 글루코스 주사 후 1.5시간 동안 매 30분마다 혈중 글루코스를 측정하였다 (E).
도 10A-F는 마우스 장 중 인슐린 함유 세포의 포켓의 상대적인 빈도를 도시한 것이다. 마우스 장의 면역염색을 통해 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서는 인슐린 함유 세포가 나타났지만 (A), 니슬을 공급받은 마우스 또는 대조군 마우스에서는 나타나지 않았다 (B). 세포를 4가지 유형의 세포 각각으로부터의 대표적인 단백질: 파네트 세포의 경우, NOD-2 (C), 배상 세포의 경우, 뮤신-2 (MUC-2) (D), 흡수성 세포의 경우, 수크로스 이소말타제 (SI) (E), 및 장내분비 세포의 경우, 크로모그래닌 A (Chr-A) (F)인 것에 대한 항체와 함께 청색으로 공동으로 염색하였다. 4가지 유형의 장 세포 각각으로부터의 대표적인 단백질에 대한 항체와 함께 공동으로 염색함으로써 상기 세포 계통이 장내분비 세포와 관련이 있다는 것이 제안되었다.
도 11A는 니슬 및 니슬 GLP-1도 또한 공급받은 건강한 마우스 (STZ로 처리되지 않음)의 시간 경과에 따른 혈중 글루코스 수준을 도시한 것이다.
도 11B는 니슬 및 니슬 GLP-1도 또한 공급받은 건강한 마우스 (STZ로 처리되지 않음)의 시간 경과에 따른 체중 변화를 도시한 것이다.
도 12는 니슬, 플라스미드로부터 GLP-1을 발현하는 니슬 또는 니슬-GLP-1을 공급받은 계통의 마우스의 대변 중 니슬의 생존 가능성을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 13은 모의 플라스미드를 포함하는 니슬, 같은 플라스미드로부터의 GLP-1(1-37)을 포함하는 니슬로 니슬 처리한 후의, 또는 어떤 처리도 하지 않은 경우 또는 STZ로도 처리하지 않는 경우 (대조군)의 무작위 혈중 글루코스 수준을 도시한 것이다.
도 14는 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스에게 니슬, 염색체에 의해 GLP-1(1-37)을 발현하는 니슬 또는 어떤 처리도 되지 않은 것을 1일 2회에 걸쳐 공급한 후의 NOD 마우스 공복 혈중 글루코스 수준을 도시한 것이다. 혈중 글루코스를 측정하기 바로 전 4시간 동안 마우스를 금식시켰다. 시간은 처리 개시 후 경과일수를 나타낸 것이다.
도 15는 가능성이 있는, 재조합 세포의 작동 방법을 도시한 것이다. 좌측: 점막 (M) 내부 및 그 상부의 관내강 (B) 중 박테리아를 포함하는 정상적인 장 움. 장내분비 세포 (E)는 고유판 (LP) 및 혈관계 (V) 내로 호르몬을 분비한다. 우측: 본원의 실시양태의 재조합 세포 (EB)는 GLP-1 (EB로부터 출현한 도트로 표시됨)을 움으로 분비하여 조기에 장내분비 세포를 인슐린-분비 세포 (RE)로 리프로그래밍시킨다. 이어서, 인슐린 (Ins, 별표 표시)은 글루코스에 대한 반응으로 혈류 내로 분비된다.
도 16A-D는 마우스 상부 장내 박테리아에 의해 분비된 GLP-1을 도시한 것이다. GLP-1(1-37)은, 60일 동안 마우스에게 1일 2회에 걸쳐 공급된 이. 콜라이 니슬 1917 (니슬-GLP-1)로부터 분비되었다. a, 마우스 상부 장 절편의 면역형광을 통해 GLP-1의 장 점막에의 결합이 나타났다. 흰색 화살표 표시가 장내분비 세포로부터의 GLP-1 발현을 나타낸다. 회색 화살표 표시는 상피에 부착된 박테리아에 의해 분비된 GLP-1을 나타낸다. b, 모의 펩티드를 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 (니슬)을 공급받은 마우스는 어떤 점막 GLP-1 염색도 나타내지 않았다. 흰색 화살표 표시가 장내분비 세포를 나타낸다. c, 영상 분석을 통해 GLP-1 결합 (차지하는 범위(%))를 정량화하였다. 값은 3마리 이상의 마우스로부터 입수한 영상의 평균값이고, 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다. GLP-1=니슬-GLP-1; 니슬=모의 펩티드을 발현하는 EcN, p 값은 스튜던트 t 검정 (n=3)으로부터의 것이다. d, 마우스 장 전체 (상부 장 (세척하지 않은 것), 대장 (하부 GI, PBS로 완만하게 세척한 이후의 것) 또는 대변 계수)로부터의 박테리아 계수. *대변 계수는 대변 1 g에 대한 것이다. 값은 3마리의 마우스로부터 얻은 값의 평균값이고, 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다.
도 17A-D는 STZ로 처리된 마우스에서 1형 당뇨병 (T1DM)을 감소시키는 것을 도시한 것이다. a, 연구 종결시 마우스 췌장을 수거하고, 인슐린에 대해 염색된 IHC 절편으로부터 β-세포 질량을 측정하였다. 각 군당 3마리의 마우스로부터 얻은 영상을 분석하고, 각 군에 대한 평균 β-세포 질량을 제시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내고, p 값은 스튜던트 t 검정 (n=3)으로부터의 것이다. 니슬을 공급받은 마우스 (니슬), 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스 (GLP-1), 어떤 박테리아도 공급받지 못한 마우스 (STZ), STZ로 처리되지 않았거나, 어떤 박테리아도 공급받지 못한 마우스 (대조군)를 명세서에 기술되어 있는 바와 같이 처리하였다. b, 60일 후 마우스 혈중 글루코스 수준을 측정하였다. 처리 개시점 (0일째) 및 60일 후의 평균값이 제시되어 있다. 제시된 값은 4마리 이상의 마우스로부터 얻은 값의 평균값이다. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다. p 값은 스튜던트 t 검정 (n=4)으로부터의 것이다. c, STZ로 처리되지 않는 건강한 마우스에게 니슬 (니슬) 및 니슬-GLP-1 (GLP-1)을 92일 동안 1일 2회에 걸쳐 공급하였다. 같은 기간 동안의 비교를 위해 어떤 박테리아도 공급받지 못한 대조군 마우스 (대조군)를 사용하였다. 3개의 시점이 제시되어 있다 (0, 57 및 92 d). p 값은 스튜던트 t 검정 (n=4)으로부터의 것이다. d, STZ 후 60일 동안 박테리아로 처리하고, 마우스의 β-세포 질량의 고갈이 있은 후, 마우스에 대해서 내당능 검사를 실시하였는데, 상기 검사에서는 10 h 동안 마우스를 금식시킨 후, 글루코스 (체중 1 kg당 25 mg)를 주사하였다. 1.5 h 동안 매 30 min마다 혈중 인슐린 (상단 패널) 및 글루코스 (하단 패널) 수준을 측정하였다. ▲ = STZ로 처리되고, 어떤 박테리아도 공급받지 못한 마우스; ■ = STZ로 처리되고, 니슬을 공급받은 마우스; □ = STZ로 처리되고, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스; △ = STZ로 처리되지 않았고, 어떤 박테리아도 공급받지 못한 대조군 마우스. 값은 각 처리군에 대한 평균값이다. 오차 막대는 표준 편차 (n=4)를 나타낸다. 별표 표시는 p<0.05 (*), p<0.01 (**) 및 p<0.001 (***) 수준의, STZ로만 처리된 마우스 (▲)와 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스 (□) 사이의 스튜던트 t 검정 (n=4)에서의 유의 수준을 나타낸다.
도 18A-H는 니슬 및 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서의 β-세포 및 상피 마커를 도시한 것이다. STZ로 처리되고 (a, b, e-f), 니슬 (a, c) 또는 니슬-GLP-1 (b, d, e-f)을 공급받은 건강한 (c, d) 마우스로부터 유래된 장 절편을 인슐린 (a-h)의 존재에 대하여 녹색으로 면역염색하고, 핵산에 대하여 청색으로 (DAPI, a-h), 및 PDX-1 (a-d), ChrA (e, f), 리소자임 (Lys, g) 또는 수크로스 이소말타제 (SI, h) 중 어느 것에 대해 적색으로 공동으로 염색하였다. 영상 e-f에서 우측 화살표 표시는 인슐린을 발현하는 리프로그래밍된 세포를 가리키는 것이다. b에서 좌측 화살표 표시 및 d에서 모든 화살표 표시는 인슐린 발현 세포를 가리키는 것이다. e 및 f에서 좌측 및 하향 화살표 표시는 인슐린이 아닌, ChrA를 발현하는 세포를 가리키는 것이다. g에서 상향 화살표 표시는 Lys 발현 파네트 세포를 가리키는 것이다. h에서 좌측 및 상향 화살표 표시는 SI를 가리키는 것이다. b, e 및 f에서 삽도 패널은 그가 제시하는 영상 내의 인슐린 생산 세포에 대한 고배율 영상이다. a, e 및 h에서 스케일 바 = 25 ㎛; 다른 모든 패널에서 스케일 바 = 100 ㎛. A = 자가형광.
도 19는 조작된 공생 박테리아로부터의 GLP-1 분비를 도시한 것이다. 상단. 염색체 삽입을 통해 이. 콜라이 니슬 1917을 GLP-1 분비 세포주로 형질전환시키는 데 사용된 카세트에 대한 개략도를 나타낸 것이다. 카세트는 fliC에 대한 5' 비번역 영역에 이어서, 6 히스티딘 태그, 엔테로키나제 부위 (EK), 세포-투과 펩티드 (CPP)에 융합된 GLP-1(1-37) 및 염색체 삽입을 위해 사용된 pKD3 절편을 포함하였다. 하단. 웨스턴 블롯팅은 염색체적으로 변형된 니슬로부터의 (염색체) 또는 플라스미드 상에 카세트를 포함하는 니슬로부터의 (플라스미드) 분비된 (M) 또는 세포 펠릿 중의 (C) GLP-1의 양을 보여준다.
도 20A-B는 T1DM 실험에서 마우스의 체중 수준을 도시한 것이다. a, 니슬 (니슬), 니슬-GLP-1 (GLP-1) 공급 60 d 후, 또는 어떤 박테리아도 공급하지 않은 (STZ) 채로 60 d 후, STZ로 처리된 마우스의 체중을 측정하였다. 대조군으로서, 마우스를 STZ로 처리하지 않고, 어떤 박테리아도 공급하지 않았다 (대조군). 처리 개시점 (0일째) 및 60일 후의 평균값이 제시되어 있다. 제시된 값은 4마리 이상의 마우스로부터 얻은 값의 평균값이다. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다. b, C57BL/6 암컷 마우스 (6-8주령된 마우스)에게 1일 2회에 걸쳐 니슬, 니슬-GLP-1을 공급하거나, 어떤 박테리아도 공급하지 않았다. 명시된 바와 같이 체중을 측정하였다. 값은 5마리의 마우스로부터 얻은 값의 평균값이다. 오차 막대는 표준 편차 (n=5)를 나타낸다.
도 21은 NOD 마우스 혈중 글루코스 수준을 도시한 것이다. NOD 마우스에게 46일 동안 매일 2회에 걸쳐 니슬 (니슬), 니슬-GLP-1 (GLP-1)을 공급하거나, 어떤 박테리아도 공급하지 않았다 (대조군). 매일 공급하기 시작한 후 11, 21, 30 및 46일째 공복 혈중 글루코스를 측정하였다. 값은 명시된 경과일에 각 군의 마우스로부터 얻은 값의 평균값이다. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다. p 값은 46일째 데이터의 스튜던트 t 검정 (n=2)으로부터의 것이다.
도 22는 NOD 마우스 체중을 도시한 것이다. NOD 마우스에게 46일 동안 매일 2회에 걸쳐 니슬 (니슬), 니슬-GLP-1 (GLP-1)을 공급하거나, 어떤 박테리아도 공급하지 않았다 (대조군). 매일 공급하기 시작한 후 11, 21, 30 및 46일째 마우스 체중을 측정하였다. 값은 명시된 경과일에 각 군의 마우스로부터 얻은 값의 평균값이다. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타낸다.
5. 본 발명의 상세한 설명
조작된 신호 전달 능력을 가진 유전적으로 조작된 미생물 (예컨대, 박테리아)을 제공한다. 질환 또는 장애를 호전시키는 생체신호 전달 분자 또는 생체화합물을 발현시키기 위해 조작된 미생물 (또는 그로부터 유래된 재조합 세포)을 사용하는 방법을 제공한다. 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)), PDX, GIF 또는 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2)) 또는 그의 단편, 유사체 또는 조합을 분비하도록 조작된 공생 박테리아 균주 또한 제공한다. 상기 조작된 박테리아 균주를 사용하여 고혈당증 및/또는 당뇨병 (DM) 및 다른 질환을 호전시키는 방법 또한 제공한다.
글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1), PDX, GIF, 그의 단편, 그의 유사체 또는 그의 조합을 분비하도록 조작된 공생 박테리아 균주를 사용하여 장 세포를 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포로 리프로그래밍하는 방법을 추가로 제공한다. 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2)를 분비하도록 조작된 공생 박테리아 균주를 사용하여 장 기능을 증진시키는 방법, 손상, 예컨대, 염증성 에피소드, 수술 등 그 이후 장의 상피 표면을 재생시키는 방법, 및 장 내층 치유를 촉진시키는 방법 또한 제공한다.
제한하는 것으로서가 아닌, 본 개시내용을 명확하게 하기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 하기 기술되는 바와 같이 세부 항목으로 나누어진다.
5.1. 용어
본 조성물 및 방법을 기술하기에 앞서, 본 발명은 기술되는 특정의 공정, 조성물, 또는 방법으로 제한되는 것이 아니고, 이들은 달라질 수 있는 것이기 때문에 그러한 것으로 이해하여야 한다. 본 설명에서 사용되는 용어는 단지 특정 버전 또는 실시양태를 기술하기 위한 목적의 것이며, 오직 첨부되는 특허청구범위에 의해서만 제한이 되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계의 숙련가가 통상 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시양태를 실시하거나 시험하는 데 사용될 수는 있기는 하지만, 바람직한 방법, 장치, 및 물질은 이제 기술하고자 한다. 본원에서 언급된 모든 공개 문헌은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다. 본원의 그 어느 것도, 본 발명이 선행 발명의 개시 내용에 우선하는 자격이 없다고 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나"("a," "an"), 및 "그"라는 것은 문맥상 명확하게 달리 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 한 "재조합 세포"에 대해 언급하는 것은 하나 이상의 재조합 세포 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등에 대해 언급하는 것이다.
본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 그의 사용 대상이 된 숫자의 수치의 ±10%를 의미한다. 그러므로, 약 50%라는 것은 45%-55% 범위를 의미한다.
치료제와 함께 사용될 때 "투여하는"이라는 것은 치료제를 표적 조직 내로 또는 그 상에 직접 투여하거나, 또는 치료제를 환자에게 투여함으로써 그의 표적이 되는 조직에 대해 상기 치료제가 긍정적인 영향을 미칠 수 있도록 하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 재조합 세포와 함께 사용될 때 "투여하는"이라는 용어는 경구 투여, 재조합 세포를 표적 조직 내로 또는 그 상에 제공하는 것; 환자에게 재조합 세포를 예컨대, 정맥 주사에 의해 전신으로 제공하여 상기 치료제가 표적 조직에 도달할 수 있도록 하는 것; (예컨대, 소위 유전자-요법 기법이라 일컫는 것에 의해) 재조합 세포를 그의 코딩 서열의 형태로 표적 조직에 제공하는 것을 포함할 수는 있지만, 이에 한정되지 않는다.
조성물을 "투여하는" 것은 경구적으로, 주사에 의해, 국부 투여에 의해, 또는 공지의 다른 기법과 병용되는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "동물" 또는 "환자" 또는 "숙주" 또는 "대상체"라는 용어는 인간 및 비-인간 척추동물. 예컨대, 야생 동물, 가축 및 농장 동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, "동물" 또는 "환자" 또는 "숙주" 또는 "대상체"라는 용어는 포유동물을, 더욱 바람직하게는, 인간을 의미한다.
"개선시키다"라는 용어는, 본 발명이 그를 제공받거나, 적용받거나, 투여받은 조직의 외형, 형태, 특징 및/또는 물리적인 속성을 변화시킨다라는 의미를 전달하는 것으로 사용된다. 형태상의 변화는 하기 중 임의 것을 단독으로 하여 또는 그의 조합으로 입증될 수 있다: 장 상피 세포의 인슐린-분비 세포로의 전환, 치료적 신호 분비, 표적 핵산 발현, 또는 표적화된 장애, 예컨대, 암, 또는 자가면역, 내분비 또는 심혈관 장애의 증상 호전, 예방 또는 감소.
"억제시키다"라는 용어는 본 발명의 재조합 세포를 투여하여 증상 발병을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 또는 질환, 병증 또는 장애를 제거하는 것을 포함한다.
"제약상 허용되는"이란, 담체, 희석제 또는 부형제가 제제의 다른 성분들과 화합성이어야 하며, 그를 받는 수령자에게 해롭지 않아야 한다는 것을 의미하는 것이다.
본원에서 사용되는 바, "치료제"라는 용어는 환자의 원치않는 병증 또는 질환을 치료, 퇴치, 호전, 예방 또는 개선시키는 데 사용되는 작용제를 의미한다. 부분적으로는, 본 발명의 실시양태는 당뇨병 치료, 인슐린 생산 증가, 또는 암 또는 자가면역, 내분비 또는 심혈관 장애 치료에 관한 것이다.
조성물의 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 원하는 효과를 달성할 수 있도록, 즉, 암 또는 자가면역, 내분비, 또는 심혈관 장애의 증상을 예방하거나, 호전시키거나, 또는 감소시킬 수 있도록 계산된 사전결정된 양이다. 본 방법에 의해 주시되는 활성은 적절하게, 의학상 치료적 및/또는 예방적 치료, 둘 모두를 포함한다. 치료적 및/또는 예방적 효과를 얻기 위해 투여되는 본 발명에 따른 재조합 세포의 특정 용량은 물론 예를 들어, 투여되는 코딩되는 단백질, 투여 경로, 및 치료되는 병증을 비롯한, 사례를 둘러싼 특정의 상황에 의해 결정될 것이다. 재조합 세포는 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적일 수 있다. 그러나, 투여되는 유효량은, 치료하고자 하는 병증, 투여하고자 하는 코딩되는 단백질의 선택, 선택된 투여 경로를 비롯한 관련된 상황을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이며, 그러므로, 상기 투여량 범위는 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 재조합 세포의 치료 유효량이란 전형적으로는, 생리학상 용인가능한 부형제 조성물로 투여되었을 때, 조직에서 효과적인 전신 농도 또는 국소 농도를 달성하는 데 충분한 것인 양이다.
본원에서 사용되는 바, "치료하다," "치료되는," 또는 "치료하는"이라는 용어는, 목적이 원하지 않는 생리학적 병증, 장애 또는 질환을 예방하거나 저속화(완화)시키고자 하는 것이거나, 또는 유익한 또는 원하는 임상적 결과를 얻고자 하는 것인, 치료적 치료법 및 예방적 또는 방지적 조치, 둘 모두를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "치료"라는 용어는 또한 원하지 않는 생리학적 병증, 장애 또는 질환의 발병, 확립 및 확산을 예방하는 것을 포함한다. 본 개시의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상적 결과로는 증상 완화; 병증, 장애 또는 질환의 정도 약화; 병증, 장애 또는 질환의 상태 안정화 (즉, 더 이상 악화되지 않게 함); 병증, 장애 또는 질환의 발병 지연 또는 진행 저속화; 병증, 장애 또는 질환 상태 호전; 및 병증, 장애 또는 질환의 관해 (부분 관해든 완전 관해든, 검출가능하든 검출불가능하든 상관없이), 또는 증진 또는 개선을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료는 과도한 수준의 부작용 없이, 임상적으로 유의적인 반응을 유도하는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료받지 못한 경우의 예상 생존 기간과 비교하여, 생존 기간을 연장시키는 것도 포함한다.
일반적으로 말하면, "조직"이라는 용어는 특정 기능 수행시 통합되는, 유사하게 분화된 세포로 이루어진 임의의 응집체를 의미한다.
5.2. GLP -1, PDX -1, GIP 및 GLP -2
3가지 단백질, GLP-1 (글루카곤-유사 펩티드 1), PDX-1 (췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자 1), 및 위 억제 폴리펩티드 (GIP)는 글루코스에 대한 반응으로 (GIP 및 GLP-1), 및 글루코스 수준과 상관없이 (PDX-1) 인슐린을 합성하도록 장 상피 세포를 자극시킬 수 있다. 4번째 단백질인 GLP-2는 위장 (GI)관에서 많은 작용을 하는 것으로 당업계에 알려져 있다.
GLP -1
글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1)은 프로글루카곤 유전자의 전사 생성물로부터 유도된 것이다. 체내에서 GLP-1의 주요 공급원은 장 호르몬으로서 GLP-1을 분비하는 장 L 세포이다. GLP-1의 세포내 전구체인 GLP-1 (1-37)이 프로글루카곤으로부터 절단되고, 이어서, 처음 6개의 아미노산이 N 말단으로부터 제거됨으로써 생체활성 펩티드가 형성된다. GLP-1의 생물학상 활성인 주요 형태는 GLP-1 (7-37) 및 지배적인 순환 활성 형태 GLP-1 (7-36) 아미드이다. GLP-1은 글루코스 및 다른 영양소에 대한 반응으로 원위 소장의 장 상피에 의해 분비된다. 그의 반감기는 매우 짧으며, 디펩티딜펩티다제 IV (DPP-4)에 의한 그의 분해는 장 점막을 드레이닝하는 혈관에서 일어난다. GLP-1은 막 수용체 GLP-1R에의 결합에 의해 췌장 β 세포에 의한 인슐린 합성을 활성화시키고, 이는 1형 및 2형 당뇨병, 둘 모두를 치료하기 위한 치료제가 될 수 있다. 놀랍게도, GLP-1을 주사맞은 장 상피 세포는 글루코스-반응성, 인슐린-분비 세포가 될 수 있고, 이어서, 시험관내에서 GLP-1로 자극을 받은 상피 세포를 숙주 내로 외과적으로 이식하면 숙주에서 당뇨병은 역전될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본원에거 개시된 바와 같이, 생물학상 불활성 형태인, GLP-1 (1-37)이 장 세포를 글루코스 반응성 인슐린 분비 세포로 리프로그래밍할 수 있는 것으로 여겨진다.
GIP
(글루코스-의존성 인슐린자극 펩티드로도 알려져 있는) GIP는 인슐린 분비를 유도하고, 주로 십이지장에서의 글루코스의 고삼투압에 의해 자극을 받을 수 있다. GIP는 또한 지방세포에서 지질단백질 리파제 활성의 자극을 통해 지방산 대사에 대해 유의적으로 영향을 미치는 것으로 여겨진다. GIP는 GIP 유전자에 의해 코딩되는 153개의 아미노산으로 된 프로단백질로부터 유도된 것이고, 이는 생물학상 활성인, 42개의 아미노산으로 된 펩티드로서 순환한다. 이는 위장관의 십이지장 및 공장의 점막에서 발견되는 K 세포에 의해 합성된다. 모든 내분비 호르몬과 같이, 이는 혈액에 의해 수송된다. 위 억제 폴리펩티드 수용체는 췌장의 베타-세포 상에서 발견되는 7-막횡단 단백질이다.
PDX -1
추가로, 전사 활성인자 PDX-1은 β 세포 및 장 상피, 둘 모두에서 인?린 분비를 자극한다. 추가의 장내 박테리아가 "프로바이오틱스"로서 널리 이용될 수 있으며, 이는 일반적으로 식품 의약품국(Food and Drug Administration)에 의해 안전한 것으로 인정받은 것이다. 생체내 재조합 유전자 발현을 위해 공생 균주를 사용하는 것이 가진 잠재적인 이점으로는 숙주 (특히, 숙주의 면역계)와 그의 화합성, 장에서 조절이 가능한 그의 지속성, 및 경구적으로 투여될 수 있는 그의 능력을 포함한다. 동물 모델에서의 다양한 재조합 시토카인 및 항원의 공생 박테리아 발현이 보고된 바 있다.
줄기 세포를 β-세포, 또는 인슐린 분비 잠재능이 있는 세포로 리프로그래밍하는 것은 지난 10년간 여러 연구의 대상이 되어왔다. 이식을 위해 시험관내에서 줄기 세포를 생성하는 것 뿐만 아니라, 췌장 또는 다른 조직-특이 줄기 세포를 생체내에서 β-세포로 전환시키는 것에 주력해 왔다. 이론으로 제한되지 않기를 바라면서, 글루카곤 유사 펩티드 1의 불활성 형태 (GLP-1(1-37))는 Notch 신호 전달 경로를 통해 발생 중인 것 및 성인의 장 줄기 세포가 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포가 되도록 자극시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 시험관내에서 GLP-1과 함께 인큐베이션되고, 당뇨병을 앓는 성체 래트 내로 수술을 통해 이식된 배아 공장 (E14.5)은 STZ-유도성 1형 당뇨병 (T1DM)을 역전시킬 수는 있지만; (장움으로부터 발생되는) 성체의 장세포 분화는 상당수의 인슐린 생산 세포를 만들어 내지 못하고, β-유사 기능성을 가진 세포로의 유의적인 분화를 위해서는 발생 중인 태아 (배아전 시기-E17)의 증식 및 가중층(pseudostratified) 세포가 요구되는 것으로 보인다.
GLP -2
전장의 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2)는, 소장 및 대장에서 장 내분비 세포로부터 GLP-1과 함께 공동으로 분비되는, 33개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. GLP-1과 유사하게, 활성 형태인 GLP-2 (1-33)는 프로테아제 DPPIV에 의해 불활성 형태인 GLP-2 (3-33)로부터 절단된 것이다. GLP-2는 위장 (GI)관에서 많은 작용을 하는 것으로 당업계에 알려져 있는데, 그 예로는 소장 및 대장에서 점막 성장 자극, 장세포 및 움 세포 아포프토시스 억제, 장세포 글루코스 수송 및 GLUT-2 발현 자극, 영양소 흡수 증가, 위 배출 및 위산 분비 억제, 장 투과성 감소, 장 혈류 자극, 및 장 평활근 이완을 포함한다 (www.glucagon.com, 2011년 10월 3일 방문 접속). GLP-2는 또한 GI 관 외부에서도 작용을 하는데, 그 예로는 래트의 성상세포 세포 배양물 중에서의 세포 증식 자극을 포함한다 (문헌 [Glucagon-like peptide-2 stimulates the proliferation of cultured rat astrocytes. Eur J Biochem. 2003 Jul;270(14):3001-9]; www.glucagon.com (2011년 10월 3일 방문 접속) 인용). 비록 혈장 글루코스가 설치류 또는 인간에서 GLP-2 투여 후 변하지는 않지만, (정상 수준보다 ~10배 더 높은) GLP-2의 약리학적 수준은 정상적인 인간 숙주에서 공복 및 식후 상태에서의 글루카곤의 순환 수준 증가와 관련이 있다 (문헌 [Glucagon-like Peptide 2 stimulates glucagon secretion, enhances lipid absorption, and inhibits gastric acid secretion in humans; Gastroenterology. 2006 Jan;130(1):44-54]; www.glucagon.com (2011년 10월 3일 방문 접속) 인용). 이론으로 제한되지 않기를 바라면서, GLP-2는 장에서 장세포의 세포 증식을 자극시키는 것으로 여겨진다.
5.3. 재조합 세포
본원에 기술된 실시양태는 일반적으로 내분비, 심혈관 또는 자가면역 장애를 직접적으로 또는 간접적으로 치료하기 위한 단리된, 조작된 재조합 세포의 용도에 관한 것이다.
실시양태는 신호 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 세포에 관한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 재조합 세포에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 치료적 단백질의, 재조합 세포의 세포질 외부로의 분비를 일으킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열 및 프로모터는 재조합 세포 중 플라스미드 상에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, 신호 서열 및 프로모터는 재조합 세포의 핵산 상에서 코딩된다.
추가의 실시양태에서, 신호 서열은 표적 핵산의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 GIP, GLP-1, PDX-1, 그의 단편, 그의 유사체, 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 신호 서열은 질환-예방 인자의 발현을 자극시킬 수 있거나, 질환 유발 인자의 발현을 억제시킬 수 있다. 실시양태에서, 환경 자극은 글루코스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환-예방 인자는 인슐린을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 건강한 대상체에서는 재조합 세포의 투여로 혈중 인슐린 수준이 증가하지는 않을 것이다.
일부 실시양태에서, 신호 서열은 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 또는 그의 단편 또는 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, GLP-1은 GLP-1 (1-37), GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36) 아미드 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. GLP-1의 유사체는 당업계에 공지되어 있고, 이는 본원 하기에 기술된다. 본원 상기에 개시되어 있는 바와 같이, GLP-1은 프로글루카곤 유전자의 전사 생성물로부터 유도된 것이다. 체내에서 GLP-1의 주요 공급원은 장 호르몬으로서 GLP-1을 분비하는 장 L 세포이다. GLP-1의 생물학상 활성인 형태는 GLP-1-(6-37), GLP-1-(7-37) 및 GLP-1-(7-36)NH2이다. 상기 펩티드는 프로글루카곤 분자의 선택적 절단으로부터 생성된 것이다. 특정 실시양태에서, 길이가 4-7, 7-10, 10-13, 13-16, 16-19, 19-22, 22-25, 25-28, 28-31, 31-34 또는 34-37개의 아미노산인, GLP-1의 단편 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호 서열은 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2) 또는 그의 단편 또는 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, GLP-2는 GLP-2 (1-33), GLP-2 (3-33), 또는 질환-예방 인자의 발현을 자극시킬 수 있거나, 질환 유발 인자의 발현을 억제시킬 수 있는 임의의 다른 단편 또는 유사체를 포함할 수 있다. GLP-2의 유사체는 당업계에 공지되어 있고, 이는 본원 하기에 기술된다. 순환시, GLP-2는 2가지 분자 형태, GLP-2 (1-33) 및 GLP-2 (3-33)로 존재한다. GLP-1과 유사하게, 활성 형태인 GLP-2 (1-33)는 프로테아제 DPPIV에 의해 불활성 형태인 GLP-2 (3-33)로 절단된다. GLP-2는 위장 기능 (소화, 흡수, 운동성, 상피 성장, 및 혈류) 및 골 흡수 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, GLP-2 또는 그의 유사체는 질환, 예컨대, 크론병 및 골다공증 치료를 위한 치료학상의 잠재능을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 길이가 4-7, 7-10, 10-13, 13-16, 16-19, 19-22, 22-25, 25-28, 28-31, 또는 31-33개의 아미노산인, GLP-2의 단편 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 임의의 형질전환가능한 박테리아 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 프로바이오틱 박테리아로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 에스케리키아, 슈도모나스, 박테로이데스, 락토바실러스, 락토코커스, 바실러스, 프로테우스, 비피도박테리움, 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 및 코리네박테리움을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 각종 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 과로부터 선택되는 박테리아일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 재조합 세포는 이. 콜라이 니슬(Nissle) 또는 락토바실러스일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산은 숙주에서 생리학적 과정의 정상적인 작용 촉진시키거나, 또는 숙주에서 비-감염성 질환의 발병, 확립 또는 확산을 예방하는 데 효과적인 포유동물 인자를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주에서의 비-감염성 질환으로는 자가면역 질환, 내분비 질환, 암, 심혈관 질환 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-감염성 질환으로는 당뇨병을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-감염성 질환으로는 1형 당뇨병을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-감염성 질환으로는 2형 당뇨병을 포함할 수 있다.
생체활성 화합물을 상부 장의 관강내 (융모) 부위로 전달하는 방법을 제공한다. 본 방법은 장에 거주하고, 생체활성 화합물을 분비하는 공생 박테리아를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 장에 거주하는 공생 박테리아로부터의 신호 분비에 기인하여, 상기 접근을 통해서 수술 또는 혈류 중 분해라는 잠재적인 위험을 피할 수 있다.
본 방법을 통해 연속하여 또는 국소 자극에 대한 반응으로 신호를 발현시킬 수 있으며, 이어서 혈액이 아닌 장 점막을 통해 수송이 이루어질 수 있다.
실시양태는 신호 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 세포에 관한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 재조합 세포에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 신호 서열은 치료적 단백질의, 재조합 세포의 세포질 외부로의 분비를 일으킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열 및 프로모터는 재조합 세포 중 플라스미드 상에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, 신호 서열 및 프로모터는 재조합 세포의 핵산 상에서 코딩된다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 임의의 형질전환가능한 박테리아 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 프로바이오틱 박테리아일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 에스케리키아, 슈도모나스, 박테로이데스, 락토바실러스, 락토코커스, 바실러스, 프로테우스, 비피도박테리움, 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 및 코리네박테리움으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 에스케리키아 콜라이의 균주일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 이. 콜라이 니슬일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 숙주에서 생리학적 과정의 정상적인 작용 촉진시키거나, 또는 숙주에서 비-감염성 질환의 발병, 확립 또는 확산을 예방하는 데 효과적인 포유동물 인자를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주에서의 비-감염성 질환으로는 암 또는 자가면역 질환, 내분비 질환, 심혈관 질환 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-감염성 질환으로는 당뇨병을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-감염성 질환으로는 1형 당뇨병을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-감염성 질환으로는 2형 당뇨병을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 프로모터 및 신호 서열을 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 구성적 프로모터일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 프로모터는 글루코스-반응성 프로모터이다.
한 실시양태에서, 신호 서열은 GLP-1 또는 그의 단편 또는 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, GLP-1의 유사체는 타스포글루티드, 엑세나티드, 엑센딘-4, 리라글루티드, 알비글루티드, (Val8)GLP-1, NN9924, CJC-1131, AVE010, LY548806, 미국 특허 번호 5,545,618에 기술되어 있는 유사체 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시양태에서, 신호 서열은 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2) 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다. GLP-2는 소장 및 대장에서 장 내분비 세포로부터 GLP-1과 함께 공동으로 분비되는, 33개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 비록 혈장 글루코스가 설치류 또는 인간에서 GLP-2 투여 후 변하지는 않지만, (정상 수준보다 ~10배 더 높은) GLP-2의 약리학적 수준은 정상적인 인간 대상체에서 공복 및 식후 상태에서의 글루카곤의 순환 수준 증가와 관련이 있다. GLP-2는 또한 소장 및 결장에 대한 성장 인자로서도 중요한 역할을 할 수 있다. 신호 서열이 GLP-2이 것인 본원에 개시된 방법은 예를 들어, 질환, 예컨대, 1형 및 2형 당뇨병, 비만 관련 당뇨병, 화학요법-유도성 설사; 염증성 장 질환, 심실 및 심방 세동, 수술 후 기관 기능상실, 과민성 장 증후군, 간질성 방광염/방광 통증 증후군, 단장 증후군, 궤양성 대장염, 대사 증후군, 크론병, 골다공증을 치료하는 데 사용될 수 있거나, 또는 임의 유형의 장 수술 후 숙주를 치료하는 데 사용될 수 있다.
GLP-2 유사체가 당업계에 주지되어 있다. 일부 실시양태에서, GLP-2의 유사체는 척추동물에서 천연적으로 발생된 GLP-2, 및 장친화적(intestinotrophic) 효과를 유도하고, 1 이상의 아미노산 부가, 결실, 치환에 의해, 또는 차단기를 포함하는 아미노산(들)의 혼입에 의해, 주어진 척추동물의 GLP-2와 비교하여 구조상 변경되어 있는 것인, 천연적으로 발생된 형태의 GLP-2의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 GLP-2의 유사체는 미국 특허 번호 5,834,428; 5,994,500; (이들 각각은 본원에서 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
다양한 형태의 척추동물의 GLP-2로는 예를 들어, 래트의 GLP-2 및 그의 동족체 (ox GLP-2 포함), 돼지 GLP-2, 데구 GLP-2, 소 GLP-2, 기니아 피그 GLP-2, 햄스터 GLP-2, 인간 GLP-2, 무지개 송어 GLP-2, 및 닭 GLP-2를 포함하는데, 그의 서열들은 문헌 [Buhl et al. in J. Biol. Chem., 1988, 263(18):8621], [Nishi and Steiner, Mol. Endocrinol., 1990, 4: 1192-8], 및 [Irwin and Wong, Mol. Endocrinol., 1995, 9(3):267-77]을 비롯한 저자들에 의해 보고된 바 있다. 척추동물의 GLP-2의 유사체는 펩티드 화학의 표준 기법을 사용하여 생성될 수 있고, 이는 모두 본원에서 제공된 가이던스에 따라 장친화적 활성에 대하여 평가될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 유사체는 하기와 같은, 인간 GLP-2의 서열에 기초한 것이다:
Figure pct00001
여기서, 유사체가 여전히 척추동물에서 장친화적 활성, 예컨대, 소장 성장, 췌도 성장, 및/또는 움/융모 높이 증가를 계속해서 유지시킬 수 있는 한, 하나 이상의 아미노산 잔기는 또 다른 아미노산 잔기로 보존적으로 치환된다.
임의의 천연적으로 발생된 GLP-2, 바람직하게, 인간 GLP-2 서열에서 보존적 치환은 하기의 5가지 군 중 임의의 것에 포함되는 교환으로서 정의된다:
I. Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
II. Asn, Asp, Glu, Gln
III. His, Arg, Lys
IV. Met, Leu, Ile, Val, Cys
V. Phe, Tyr, Trp.
임의의 척추동물의 GLP-2 서열 중 아미노산의 비-보존적 치환도 포함하는데, 단, 비-보존적 치환이 다른 종으로부터 단리된 GLP-2에서는 달라지는 것으로 알려져 있는 아미노산 위치에서 일어나는 경우에 그러하다. 비-보존되는 잔기 위치는 공지된 모든 척추동물의 GLP-2 서열을 정렬함으로써 쉽게 결정된다. (예컨대, [Buhl et al., J. Biol. Chem., 1988, 263(18):8621], [Nishi and Steiner, Mol. Endocrinol., 1990, 4: 1192-8] 참조). 일부 실시양태에서, 포유동물에 따라 다르고, 비-보존적 잔기로 치환될 수 있는 아미노산 위치는 13, 16, 19, 20, 27, 및 28번 위치일 수 있다. 척추동물에 따라 다르고, 또한 비-보존되는 잔기로 치환될 수 있는 추가의 아미노산 잔기는 2, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 17, 21, 22, 23, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 및 33번 위치에 존재한다.
별법으로, 비-보존적 치환은, 알라닌-스캐닝 돌연변이유발법을 통해 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환하여 모든 장친화적 활성은 파괴되지 않는다는 점에서 돌연변이가 일부 허용되는 것으로 밝혀진 임의의 위치에서 이루어질 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법 기법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 1989, 244: 1081] (상기 문헌의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. 대부분의 GLP-2 서열은 대략 33개의 아미노산으로만 구성되어 있기 때문에 (그리고, 인간 GLP-2에서 알라닌은 이미 4번째 위치에 존재하고 있기 때문에), 당업자는 하기 실시예에 교시되어 있는 바와 같이, 각 나머지 위치에 존재하는 알라닌 유사체를 장친화적 효과에 대해서 쉽게 시험할 수 있다.
척추동물의 GLP-2의 공지된 서열을 정렬함으로써, 상기 GLP-2 종 간의 유의적인 서열 상동성 뿐만 아니라, 종에 따라 다른 것으로 알려져 있는 잔기를 고려한, 일반식을 구성하였다. 아미노산 차단기 부가에 의해 치환, 부가, 결실, 또는 변형에 대해 특히 바람직한 비-보존되는 잔기를 선택하는 것에 관한 가이던스를 제공하는 데 상기 식이 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 측면들 중 한 측면에 따라, 본 발명에 포함되는 척추동물의 GLP-2의 특정 유사체는 하기 서열 번호 2로 제시되어 있는 일반식에 따른 척추동물의 GLP-2의 및 GLP-2 유사체이다:
Figure pct00002
여기서, aa는 임의의 아미노산 잔기를 의미하고, aa1부터 aa6까지는 상이한 종으로부터 수득되는 GLP-2 서열 간에는 차이가 있는 것으로 알려져 있는 것인 장기 위치이고:
X는 III군, 예컨대, Arg, Lys 또는 Arg-Arg로부터 선택되는 1 또는 2개의 아미노산 잔기이고,
Y는 III군, 예컨대, Arg, Lys 또는 Arg-Arg로부터 선택되는 1 또는 2개의 아미노산 잔기이고,
m은 0 또는 1이고;
n은 0 또는 1이고;
R1은 H 또는 N-말단 차단기이고;
R2는 OH 또는 C-말단 차단기이다.
본 발명의 수개의 실시양태에서, aa1부터 aa6까지는 하기 정의되는 바와 같으며:
aa1은 IV군으로부터 선택되고;
aa2는 I 또는 II군으로부터 선택되고;
aa3은 I군으로부터 선택되고;
aa4는 III군으로부터 선택되고;
aa5는 IV군으로부터 선택되고;
aa6은 II 또는 III군으로부터 선택된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, aa1부터 aa6까지는 하기와 같이, 다른 종으로부터 단리된 GLP-2의 상기 위치에 존재하는 것으로 알려져 있는 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
aa1은 Ile 또는 Val이고;
aa2는 Asn 또는 Ser이고;
aa3은 Ala 또는 Thr이고;
aa4는 Lys 또는 Arg이고;
aa5는 Ile 또는 Leu이고;
aa6은 Gln 또는 His이다.
인간 및 래트의 GLP-2는 오직 아미노산 잔기 19번 위치에서만 서로 차이가 난다. 인간 서열에서, 상기 잔기는 알라닌이고; 래트의 GLP-2에서, 19번 위치는 트레오닌이다. 따라서, 본 발명에 포함되는 특정 GLP-2 또는 GLP-2 유사체는 19번 위치에 가변 잔기를 포함한다. 이러한 본 발명의 실시양태에서, GLP-2 펩티드는 하기 제시된 서열 번호 3에 따른다:
Figure pct00003
여기서, aa3, Y, m, X, n, R1 및 R2는 상기 정의된 바와 같다.
다른 실시양태에서, 신호 서열은 GLP-1, PDX-1, GIP, GLP-2, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관작용성 장 폴리펩티드, 트레포일 인자, 세포 및 조직 복구 인자, 형질전환 성장 인자 β, 각질세포 성장 인자, 역평행 4α 나선형 다발 구조를 취하는 구조상 1군 시토카인 예컨대, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EP0, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL 또는 IFNα/β, 대개는 세포 표면에 결합되어 있는 것인 구조상 2군 시토카인, 대칭형 동종삼량체 및 특정 바이러스 외피 단백질에 대해 기술되어 있는 β 젤리 롤의 형태를 차지하는 서브유닛, 예컨대, TNF 패밀리 시토카인, 예컨대, TNFα, TNFβ, CD40, CD27 또는 FAS 리간드, IL-1 패밀리 시토카인, 섬유모세포 성장 인자 패밀리, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 p 및 신경 성장 인자, 각각 세포외 영역 중 1 이상의 EGF 도메인을 포함하는 것인 거대 막횡단 전구체 분자로서 제조된, 단쇄 α/β 분자를 포함하는 구조상 3군 시토카인, 예컨대, 표피 성장 인자 패밀리 시토카인, 보존되는 시스테인 잔기 주변으로 무리화된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 케모카인 (C-C 또는 C-X-C 케모카인 서브군) 또는 인슐린 관련 시토카인, 모자이크 구조를 나타내는 구조상 4군 시토카인, 예컨대, 상이한 도메인으로 구성된 헤레귤린, 뉴레귤린, 예컨대, EGF, 면역글로불린-유사 및 크링글 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 분비된 펩티드 또는 그의 유사체, 단편 또는 일부를 포함할 수 있다. 상기 분비된 펩티드의 생물학상 활성인 유사체, 단편 및 일부는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 글루코스-반응성 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 fliC 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 분비 태그를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분비 태그는 fliC 분비 태그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분비 태그는 알파-헤몰리신 (HlyA) 분비 태그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 세포-투과 펩티드 (CPP) 서열를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포가 신호 서열을 융합 단백질로서 발현할 수 있는데, 여기서, 융합 단백질은 신호 서열에 의해 코딩되는 신호 및 세포 투과 펩티드 서열에 의해 코딩되는 세포-투과 펩티드를 포함한다.
5.4. 치료 방법
질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 질환-예방 인자의 발현을 자극시키거나, 질환 유발 인자의 발현을 억제시키는 데 효과적인 조건하에서 세포를 숙주에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환은 자가면역 질환, 암, 내분비 질환, 대사 질환, 심혈관 질환 또는 그의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 당뇨병 (1형 및 2형 당뇨병 및 비만 관련 당뇨병을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 비만, 대사 증후군, 크론병, 페닐케톤뇨증, 단풍당뇨병증, 히스티딘혈증, 고혈당증, 당뇨병성 망막병증, 관상 동맥 심장 질환, 모세관간 사구체경화증, 신장병증, 신경병증, 사지 궤양 또는 괴저, 아테롬성동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 고단백혈증, 단백뇨증, 골다공증, 빈혈, 과지질단백질혈증, 케톤산증, 고트리글리세리드혈증, 락트산혈증, 심근병증, 윌슨병, 백질이영양증, 푸코시드축적증, 및 암, 예컨대, 위장관 암, 위암, 담낭암, 위장관 기질 종양, 간암, 췌장암, 결장암, 화학요법-유도성 설사; 염증성 장 질환, 심실 및 심방 세동, 수술 후 기관 기능상실, 과민성 장 증후군, 간질성 방광염/방광 통증 증후군, 단장 증후군, 궤양성 대장염, 또는 골다공증일 수 있다 (또는 포함할 수 있다).
본원에 개시된 방법은 또한 임의 유형의 장 수술 후 숙주를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 따라 투여되는 세포의 유효량 (또는 "치료 유효량")은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 유효량은 원하지 않는 생리학적 병증 또는 질환의 병기, 투여 경로 및/또는 당업자에게 공지된 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 세포의 유효량은 약 104 CFU/kg 이상, 약 105 CFU/kg 이상, 약 106 CFU/kg, 또는 약 107 CFU/kg 이상일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포의 유효량은 숙주 체중 1 kg당 약 104 - 1014 CFU/kg, 109 - 1012 CFU/kg, 또는 1010 - 1011 CFU이다. 또 다른 실시양태에서, 세포의 유효량은 숙주 체중 1 kg당 약 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010 또는 10 x 1010 CFU이다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 유효량은 하기와 같이 계산될 수 있다. 8 x 1010 CFU/kg을 원하는 양으로 하여 대략 4.0 x 1011 CFU/g의 (상업적으로 이용가능한) 프로바이오틱 보충제로 투여하고자 한다고 가정하였을 때, 인간 체중 범위를 소아 경우의 25 kg 내지 성인 경우의 75 kg인 것으로 하면, 이는 5-15 g/d의 1일 용량을 의미할 것이다. 그러나, (보고되어 있는 바와 같이 (문헌 [Rao, S. et al. Toward a live microbial microbicide for HIV: Commensal bacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide;Proc Natl Acad Sci USA 102, 11993-11998 (2005)] 참조) 콜로니 형성율이 100배 더 높기 때문에, 이때 용량은 50-150 mg/d가 될 것이다. 다른 실시양태에서, 용량은 10-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1,000 또는 1,000-2,000 mg/d이다.
장 상피 세포를 글루코스-반응성 인슐린 분비 세포로 리프로그래밍하는 방법 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 프로모터 및 신호 서열을 포함하는 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 실시양태는 프로모터 및 신호 서열을 포함하는 재조합 세포를 투여함으로써 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 신호 서열은 표적 핵산의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 GIP, GLP-1, GLP-2, PDX-1, 그의 단편, 그의 유사체, 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 신호 서열은 질환-예방 인자의 발현을 자극시킬 수 있거나, 질환 또는 장애 유발 인자의 발현을 억제시킬 수 있다. 실시양태에서, 환경 자극은 글루코스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환-예방 인자는 인슐린을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 건강한 숙주에서는 재조합 세포의 투여로 혈중 인슐린 수준이 증가하지는 않을 것이다.
혈중 글루코스 수준을 감소시키는 방법 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 혈중 글루코스 수준 감소를 필요로 하는 숙주에게 유효량의 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 숙주가 정상혈당 수준을 가지도록 혈중 글루코스 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 치료 후 30일 경과시 혈중 글루코스 수준을 약 20% 내지 약 80%, 약 30 내지 약 70%, 또는 약 40% 내지 약 60% 만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 숙주가 고혈당일 경우, 재조합 세포를 투여하면, 외인성 인슐린을 숙주에게 치료적으로 투여해야 할 필요가 감소되거나, 그럴 필요가 없어진다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 숙주에서의 글루코스 수준에 대하여 반응성을 띤다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 숙주의 글루코스 수준이 단지 약간 상승한 경우에도, 재조합 세포는 단지 글루코스 수준이 정상혈당 수준에 도달하고, 글루코스 결핍증을 유발하지 않을 정도로 글루코스 수준을 감소시키는 작용을 한다.
혈중 인슐린 수준을 증가시키는 방법 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 혈중 인슐린 수준 증가를 필요로 하는 숙주에게 유효량의 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈중 인슐린 수준을 증가시키는 방법을 통해 숙주는 정상 혈당 수준을 가지게 된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 글루코스에 대한 반응으로 혈중 인슐린 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 치료 후 30일 경과시 혈중 인슐린 수준을 약 20% 내지 약 80%, 약 30 내지 약 70%, 또는 약 40% 내지 약 60% 만큼 증가시킨다.
장 세포를 리프로그래밍 (또는 분화)시키는 방법 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 장 세포는 장 상피 세포, 예컨대, 장내분비, 파네트, 흡수성 장세포 또는 배상 세포이다. 한 실시양태에서, 본 방법은 장 세포에 유효량의 재조합 세포를 투여하거나, 국소화시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 본 방법은 그를 필요로 하는 숙주 또는 환자에게 상기 리프로그래밍된, 분화된, 또는 전처리된 장 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 그를 필요로 하는 숙주 또는 환자에게 상기 리프로그래밍된, 분화된, 또는 전처리된 장 세포를 이식시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
장 상피 세포를 리프로그래밍시키는 방법 또한 제공한다. 상기 방법은 더 전통적인 바이러스 매개 접근법에 비하여 여러 가지 이점을 가질 수 있다. 이론으로 제한되지 않기를 바라면서, 공생 박테리아를 사용하여 GLP-1을 전달하면, 예를 들어, 장 점막을 드레이닝하는 혈관계 중에서의 GLP-1의 효소적 분해를 피할 수 있다. GLP-1은 혈액에 노출되지 않고, 관강내 부위로부터 장움으로 직접 침투할 수 있다. 장움에서, 장 줄기 세포는 4가지 유형의 장세포로 발생하게 된다. 장세포 중의 한 유형인 장내분비 세포는 호르몬을 혈관계 내로 분비된다. 이론으로 제한되지 않기를 바라면서, 장내분비 세포는 박테리아에 의해 분비된 GLP-1의 존재하에서 인슐린을 분비하는 것이 된다고 여겨진다. 상기 박테리아 세포주는 본질적으로는 아마도 신체 다른 부위에서는 실종되어 있을 기능을 대체하면서, 장 줄기 세포를 수개의 다른 유형의 세포로 분화시킬 수 있도록 발생될 수 있다. 일례로 β 세포 (예컨대, α 세포) 외부에서의 다른 췌장 기능, 및 심지어는 아마도 갑상선, 간세포 또는 면역반응성 기능을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 세포를 리프로그래밍시키는 방법은 시험관내에서 세포를 리프로그래밍하고 증식시키는 데 사용될 수 있다. 이어서, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 상기 리프로그래밍된 세포를 수거하고, 숙주에 투여 (또는 숙주 내로 이식)할 수 있다.
5.5. 진단 방법 및 용도
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 또 다른 치료적 화합물과 함께 조합되어 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 세포는 시너지 효과를 가지는 화합물과 함께 조합되어 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합 세포는 DPP-4 억제제, GLP-2, GLP-1 효능제, 디메틸 술폭시드, 인슐린, 알파-글루코시다제 억제제, 프람린티드, 메글리티니드, 레파글리니드, 나테글리니드, 클로르프로파미드, 메트포르민, 술포닐우레아, 글리피지드, 글리부리드, 글리메피리드, 티아졸리딘디온, 그의 단편, 그의 유사체 또는 그의 조합과 함께 투여될 수 있다. DPP-4 억제제의 예로는 시타글립틴, 빌다글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 듀토글립틴, 제미글립틴, 알로글립틴, 베르베린 등을 포함한다.
예를 들어, 일부 측면에서, 상기 정의된 바와 같은 재조합 세포, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물, 또는 상기 정의된 바와 같은 재조합 세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함할 수 있다.
공생 박테리아가 사용되는 본원에 개시된 방법의 실시양태에서, 추가의 이점은, 프로바이오틱스로서 근 100여 년간 사용되어 옴으로써 바이러스 매개 접근법에는 부족한 것인 그의 안전성이 확립되어 있다는 점이다. 추가로, 공생 박테리아는 필요할 경우, 일반 항생제를 사용하면 쉽게 파괴될 수 있다. 공생 박테리아를 사용하면 얻게 되는 또 다른 이점은 피드백 루프가 구비되어 있고, 이로써 특이적인 관강내 신호 (예를 들어, 글루코스 또는 IL-8)에 맞게 GLP-1 분비를 정확히 조절할 수 있도록 할 수 있다는 점이다. 추가로, GLP-1을 사용하면, 장세포는 글루코스-반응성이 되어 건강한 개체에서 인슐린 조절이 β 세포에 의해 매개되는 것과 같은 방식으로 장세포로의 인슐린 용량이 조절되는 것으로 나타났다. 끝으로, 공생 박테리아를 사용하여 장세포를 리프로그래밍하면 결국에는 1형, 2형 당뇨병, 및 대사 증후군을 경구적으로 투여되는 간단한 방식으로 효과적으로 치료할 수 있게 된다.
5.6. 투여 경로 및 제제화
본 발명의 재조합 세포는 그가 활성인 상태로 유지되는 임의의 경로에 의해 종래 방식으로 투여될 수 있다. 재조합 세포가 활성인 상태로 유지되는 효과적인 경로는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 재조합 세포 투여는 전신, 국부, 또는 경구 투여일 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 경구, 협측, 또는 안구 경로, 또는 질내로, 흡입에 의해, 데포 주사에 의해, 또는 임플란트에 의해 이루어질 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, (단독으로 또는 다른 제약과 함께 조합되는) 본원에 개시된 재조합 세포에 대한 투여 모드는 설하, 주사 (피하로 또는 근육내로 주사되는 단기 작용 데포, 임플란트, 비드 또는 펠릿 형태 포함), 또는 질 크림제, 좌제, 페서리, 질 고리, 직장용 좌제, 자궁내 장치, 및 경피용 제형, 예컨대, 패치, 및 크림제의 사용에 의한 것일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
구체적인 투여 모드는 적응증에 따라 달라질 것이다. 구체적인 투여 경로 및 투약 요법의 선택은 최적인 임상 반응을 얻기 위해 임상의에게 공지되어 있는 방법에 따라 임상의에 의해 조정되거나 적정되도록 한다. 투여되는 재조합 세포의 양은 치료학상 효과적인 양이다. 투여되는 투여량은 치료받는 숙주의 특징, 예컨대, 치료받는 특정 동물, 연령, 체중, 건강 상태, 현 치료법의 유형, 그리고, 만약 있다면, 치료 빈도에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에 의해 (예컨대, 임상의에 의해) 쉽게 결정될 수 있다.
재조합 세포 및 적합한 담체를 포함하는 제약 제제는, 유효량의 재조합 세포를 포함하는 것인, 정제, 캡슐제, 카세제, 펠릿, 환제, 분제 및 과립제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 고체 제형; 액제, 분제, 유체 에멀젼, 유체 현탁제, 반고형제, 연고제, 페이스트, 크림제, 겔제 및 젤리, 및 폼을 포함하나, 이에 한정되지 않는 국부용 제형; 및 액제, 현탁제, 에멀젼, 및 건식 분제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 비경구 제형일 수 있다. 활성 성분은 제약상 허용되는 희석제, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 계면활성제, 소수성 비히클, 수용성 비히클, 유화제, 완충제, 습윤제, 보습제, 가용화제, 방부제 등과 함께 상기 제제 중에 함유되어 있을 수 있다는 것 또한 당업계에 공지되어 있다. 투여 수단 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 가이던스를 위해 다양한 약리학에 관한 참조 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Modern Pharmaceutics, Banker & Rhodes, Marcel Dekker, Inc. (1979)]; 및 [Goodman & G ilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 6th Edition, MacMillan Publishing Co., New York (1980)], 및 [Remington's: The Science and Practice of Pharmacy , 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2006)]을 참고할 수 있다.
재조합 세포는 주사에 의한, 예컨대, 볼루스 주사, 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 재조합 세포는 약 15분 내지 약 24시간이라는 기간 동안에 걸쳐 피하로의 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 주사용 제제는 첨부된 방부제와 함께 단위 투여 제형으로, 예컨대, 앰플로 또는 다중 투약 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제 또는 에멀젼과 같은 제형을 취할 수 있고, 제제화 작용제(formulatory agent), 예컨대, 현탁화제, 안정화제, 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
경구 투여를 위해, 재조합 세포는 상기 재조합 세포를, 당업계에 주지되어 있는 제약상 허용되는 담체와 함께 조합함으로써 쉽게 제제화될 수 있다. 상기 담체를 통해 본 발명의 재조합 세포는 치료하고자 하는 환자가 경구적으로 섭취할 수 있도록 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액상 제제, 겔제, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로서 제제화될 수 있다. 고체 부형제를 첨가하고, 임의적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우, 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립제의 혼합물을 프로세싱하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 경구용 제약 제제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제로는 충전제, 예컨대, 당 (락토스, 수크로스, 만니톨, 및 소르비톨을 포함하나, 이에 한정되지 않음); 셀룰로스 제제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 옥수수 전분, 소맥 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 가교 결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대, 알긴산 나트륨이 첨가될 수 있다.
당의정 코어는 적합한 코팅제를 구비할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 임의적으로 아라비아 검, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는, 당 농축액이 사용될 수 있다. 식별을 위해, 또는 활성 재조합 세포 용량의 상이한 조합을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅제에 염료 또는 색소를 첨가할 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 제약 제제로는 젤라틴으로 제조된 압입형(push-fit) 캡슐제 뿐만 아니라, 젤라틴 및 가소화제, 예컨대, 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 압입형 캡슐제는 충전제, 예컨대, 예컨대, 락토스, 결합제, 예컨대, 전분, 및/또는 윤활제, 예컨대, 활석 또는 스테아린산 마그네슘, 및 임의적으로, 안정제와 함께 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐제에서, 활성 재조합 세포는 적합한 액체, 예컨대, 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해되거나 현탁화될 수 있다. 추가로, 안정제가 첨가될 수 있다. 모든 경구 투여용 제제는 상기 투여에 적합한 제형 형태를 띠어야 한다.
협측 투여를 위해, 조성물은 예컨대, 종래 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
한 실시양태에서, 제제는 방출 조절형 제제이다. 미국 특허 번호 8,007,777 (보렉 등(Borek et al.) 2011년 8월 30일)에는 프로바이오틱용 방출 조절형 제제에 관한, 당업계에 공지된 일례가 개시되어 있다. 제제는 친수성 제제, 전해질제 및 다당류를 함유할 수 있고, 이는 장 시스템으로의 경구 전달을 위해 모놀리식 정제 형태를 취할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 재조합 세포를 분무 건조시키고, 건조된 세포를 캡슐화시킨다. 캡슐화시키기 전에 세포를 완전하게 건조시키는 것이 바람직하다.
당업자는 가이던스를 위해 약리학에 관한 표준 참조 문헌을 참조함으로써 다른 바람직한 투여 경로와 제제화를 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2006), Chapters 45-47]에는, 본원에 개시된 재조합 세포 및 방법과 함께 사용될 수 있는 적합한 경구용 고체 제형, 제약 제형 코팅 및 지연-방출형 및 표적화된 약물 전달 시스템이 개시되어 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 적합한 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용함으로써, 본 발명에 따라 사용하기 위한 재조합 세포는 가압형 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무식으로 제시되는 형태로 용이하게 전달된다. 가압형 에어로졸인 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한, 예컨대, 젤라틴으로 이루어진, 재조합 세포 및 적합한 분말 베이스, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하는 캡슐제 및 카트리지로 제제화될 수 있다.
본 발명의 재조합 세포는 또한 예컨대, 통상의 좌제용 베이스, 예컨대, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는, 직장용 조성물로, 예컨대, 좌제 또는 정체 관장제로 제제화될 수 있다.
앞서 기술된 제제 이외에도, 재조합 세포는 또한 데포 제제로 제제화될 수 있다. 상기와 같이 장기간 작용하는 제제는 (예를 들어, 피하로 또는 근육내로의) 이식에 의해, 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.
데포 주사제는 약 1 내지 약 6개월 간격으로 또는 그보다 장기간의 간격을 두고 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 적합한 중합체 또는 소수성 물질과 함께 (예컨대, 허용되는 오일 중 에멀젼으로서), 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제제화될 수 있다.
경피 투여에서, 본 발명의 제조합 세포는 예를 들어, 플라스터에 적용될 수 있거나, 또는 경피용 치료적 시스템에 의해 적용되어, 결과적으로는 유기체에게로 공급될 수 있다.
재조합 세포의 제약 조성물은 또한 적합한 고체상 또는 겔상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기와 같은 담체 또는 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
재조합 세포는 또한 다른 활성 성분, 예컨대, 애주번트, 프로테아제 억제제, 또는 다른 화합성 약물 또는 재조합 세포와 함께 조합되어 투여될 수 있는데, 그러한 조합은 본원에 기술된 방법의 원하는 효과를 달성하는 데 있어 바람직할 수 있거나, 이익이 되는 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 붕해제 성분으로는 크로스카르멜로스 나트륨, 카르멜로스 칼슘, 크로스포비돈, 알긴산, 알긴산 나트륨, 알긴산 칼슘, 알긴산 칼슘, 이온 교환 수지, 식품산 및 알칼리성 카르보네이트 성분에 기초한 발포성 시스템, 점토, 활석, 전분, 전호화 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 셀룰로스 플로우, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 규산칼슘, 금속 카르보네이트, 중탄산나트륨, 시트르산칼슘, 또는 인산칼슘 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 희석제 성분으로는 만니톨, 락토스, 수크로스, 말토덱스트린, 소르비톨, 크실리톨, 분말형 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 메틸히드록시에틸셀룰로스, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 전호화 전분, 인산칼슘, 금속 카르보네이트, 금속 옥시드, 또는 금속 알루미노실리케이트 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 존재할 경우, 임의적 윤활제 성분으로는 스테아린산, 금속 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 지방산, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 글리세릴 베헤네이트, 광유, 식물성 오일, 파라핀, 류신, 실리카, 규산, 활석, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 폴리에톡실화된 피마자유, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌-글리세롤 지방 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 폴리에톡실화된 스테롤, 폴리에톡실화된 피마자유, 폴리에톡실화된 식물성 오일, 또는 염화나트륨 중 하나 이상을 포함한다.
하기 실시예는 제한하는 것이 아닌, 예시로서 제공되는 것이다.
6. 실시예
6.1. 실시예 1: 에스케리키아 콜라이 니슬에서 GLP -1의 구성적 발현
본 실시예는 에스케리키아 콜라이 니슬에서의 GLP-1의 구성적 발현을 입증한다.
플라스미드 구축: 모든 클로닝은 앞서 기술된 기법을 이용하여 수행하였다 (문헌 [Sambrook, J. & Russell. D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. Edn. 3rd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 2001]). 도 1은 본 연구에서 사용된 플라스미드를 도식으로 나타낸 것이다. 이. 콜라이 DH5α로부터의 P0/P1 프로모터를 연구하기 위해, 두 플라스미드 (pFD1 및 pFD2)를 제조하였는데, pFD1은 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 발현을 유도하는 전체 P0/P1 영역을 코딩하였고, pFD2는 EGFP로부터 상류쪽의 프로모터 중 P0 영역만을 코딩하였다. Caco-2 세포에서의 인슐린 분비 자극을 위한 재조합 박테리아로부터의 인슐린자극 단백질 분비율을 시험하기 위해, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 플라스미드 pFD-PDX, pFD-GLP, 및 pFD-20을 구축하였다. 도 2는 글루코스에 대한 P0 및 P0/P1 반응을 보여주는 것이다. 상이한 배지 조건에 대한 P0 및/또는 P1 프로모터의 반응을 측정하기 위하여 EGFP 발현을 사용하였다. P0=P0만; P0+P1=P0 플러스 P1 측면 영역; DH5α=lac 오페론 대조군. 글루코스에 대한 반응으로 재조합 단백질을 제조하는 글루코스-반응성 프로모터 시스템의 효율을 시험하기 위해, 이. 콜라이 DH5α로부터의 2가지 길이의 글루코스-반응성 프로모터 영역을 pGlow-GFP 상류로 및 GFP와 함께 프레임내로 TA 클로닝하였다 (도 2의 결과). 두 구축물은 P0 프로모터, 또는 프레임내 및 GFP 출발점으로부터 상류쪽의 P0 및 P1 프로모터, 둘 모두에 걸친 영역으로 구성되었다 (문헌 [Ryu, S. & Garges, S. Promoter Switch in the Escherichia coli Pts Operon. Journal of Biological Chemistry 269, 4767-4772 (1994)]). 간략하면, P0 영역을 이. 콜라이 DH5α의 게놈 DNA로부터 pGLOW-GFP (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))로 클로닝하여 (pFD2)를 제조하였다. P0/P1 영역을 pGLOW-GFP로 클로닝하여 pFD1을 제조하였다. 니슬에서 포유동물 PDX-I 유전자를 발현시키기 위해, 하기와 같이 플라스미드 pFD-PDX를 구축하였다. 고충실도 PCR (스트라테이진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야))을 2차 사용하여 발현 카세트 6XHis-Xpress-EK-PDX-1-CPP를 수득하였다. 고충실도 PCR을 통해 DH5α로부터 전장의 FLIC를 수득하였다. 상기 두 단편을 pBluescript-KS로 클로닝하여 6XHiS-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLIC를 수득하였다. 이어서, 6XHiS-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLIC 단편을 pGLOW-P0-GFP로 클로닝함으로써 6XHiS-Xpress-EK-PDX-1-CPP-FLIC의 발현을 유도하기 위해 이. 콜라이의 P0 프로모터를 사용하는 벡터 (pFD-PDX)를 수득하였다.
에스케리키아 콜라이 니슬에서 단백질 GLP-I를 구성적으로 발현하기 위해, 하기와 같이 플라스미드 pFD-GLP를 구축하였다. 서열 6XHiS-Xpress-EK-GLP-1 (1 -37)을 합성적으로 제조하였다 (IDT: 미국 아이오와주 코랄빌). 고충실도 PCR을 통해 상기 단편을 pBluescript-KS 내로 삽입하여 pBluescript-GLP를 제조하였다. 고충실도 PCR을 사용하여 pKS104로부터 pBluescript-GLP로 5'UTR-FLIC20서열을 클로닝하여 pBluescipt-20-GLP를 제조하였다. 생성된 벡터는 서열: 5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK-GLP-1 (1-37)을 함유하였다. 고충실도 PCR에 의해 상기 서열을 (FLIC의 3'UTR을 함유하는) pKS121로 클로닝하여 구축물: 5'UTR-FLIC20-6XHis-Xprcss-EK-GLP-1 (1-37)-3'UTR을 수득하였다.
pFD-20을 수득하기 위해, 고충실도 PCR을 사용하여 pFD-GLP로부터 5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK 서열을 클로닝하였다. PCR 단편을 pKS121로 클로닝하여 구축물: 5'UTR-FLIC20-6XHis-Xpress-EK를 수득하였다. pKS104 및 pKS121을 핀란드 유니버시티 오브 헬싱키, 래버러토리 오브 베니타 베스터룬트-윅스트롬(University of Helsinki, Finland, Laboratory of Benita Westerlund-Wikstrom)으로부터 입수하였다. 그러나, pKS104 및 pKS121 서열은 또한 상업적 공급업체로부터 입수할 수 있거나, 또는 종래 방법을 사용하여 게놈으로부터 직접 유도할 수 있고 (예컨대, 진뱅크(GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)로부터 다운로드된 서열), 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 구축하였다.
6.2. 실시예 2: GLP -1 또는 PDX -1- CPP 를 분비하도록 이. 콜라이 니슬 조작
fliC 프로모터의 제어하에 GLP-1 (아미노산 1부터 37)을, 또는 글루코스-반응성 요소의 제어하에 PDX-1-CPP를 분비하도록 에스케리키아 콜라이 니슬 1917 (처방없이 살 수 있는 프로바이오틱 균주, 이하 니슬로 지칭함)을 조작하였다. PDX-1은 분비 후에 상피 내로 원활하게 신속히 진입할 수 있도록 세포-투과 펩티드 (CPP)와의 융합물로서 분비시켰다. 글루코스-반응성 프로모터 요소의 제어하에 PDX-1이 분비되었고, 누출 발현은 거의 관찰되지 않았다. 세포를 6 내지 8 h 동안 성장시키고, 600 nm에서의 광학 밀도를 1로 정규화하고, 원심분리시켰다. 니슬 상청액 중 및 니슬 세포 펠릿 중의 분비된 단백질 GLP-1 (상단 블롯) 및 PDX-1-CPP (하단 블롯)에 대한 웨스턴 블롯은 도 3에 제시되어 있다. 도 3과 관련하여, 펠릿을 용해시키고, 각 단백질의 양을 측전하였다 (분획 "C"). 상청액을 보존시키고, 유사하게 분석하였다 (분획 "M"). PDX-1-CPP를 발현하는 세포에 대해서 글루코스 (0.4%) 또는 글리세롤 (0.4%)을 함유하는 배지 중에서 성장시킨 세포들간 비교를 실시하였다. 빈 플라스미드 (20)를 발현하는 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 본 데이터로부터 두 단백질 모두 분비되었다는 것이 명백해졌다.
6.3. 실시예 3: GLP -1 또는 PDX -1- CPP 를 분비하도록 조작된 이. 콜라이 니슬 에 의한 인슐린 분비 유도
본 실시예는 GLP-1 또는 PDX-1-CPP를 분비하도록 조작된 이. 콜라이 니슬에 의한 인슐린 분비 유도를 입증한다.
조작된 니슬 균주가 인간 상피 세포에서 인슐린 분비를 유도할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, Caco-2 세포를 PDX-1-CPP, GLP-1, 또는 음성 대조군으로서의 20-아미노산 서열을 발현하는 니슬 균주의 밤새도록 배양된 배양물로부터의 무세포 배지 (CFM)와 함께 배양하였다. (PDX-1 생산을 위해서는 글루코스를 필요로 한 것인 PDX-1 균주는 예외로 하고) 글루코스를 포함하지 않는 F-12K 배지 (미디어테크(Mediatech: 미국 버지니아주 매너서스)) 중에서 밤새도록 배양된 배양물을 성장시켰다. 글루코스를 포함하지 않는 신선한 F-12K 배지 및 PDX-1-CPP ("P"), GLP-1 ("G"), 20-아미노산 서열 태그 ("20")를 분비하는 니슬의 밤새도록 배양된 배양물로부터의 무세포 배지로 이루어진 1:1 혼합물, 또는 PDX-1-CPP CFM 및 GLP-1 CFM ("GP")의 1:1 조합물 중에서의 Caco-2 세포 배양을, 배지를 제거하기 전에 16 h 동안 수행하고, 글루코스 (0.4%) 또는 글리세롤 (0.4%)을 포함하는 배지 중에서 2 h 동안 Caco-2 세포를 배양하였다. 글루코스 유발 후, 각 샘플을 인슐린 분비 및 전사에 대하여 분석하였다. 양성 대조군으로서, Caco-2 세포를 (글루코스를 포함하지 않는) 신선한 F-12K 배지 중에서 인큐베이션시키고, 2 h 동안 글루코스 (0.4%) 또는 글리세롤 (0.4%)와 함께 배양하기 전에 같은 16 h 기간 동안 GLP-1 (아미노산 1 내지 37)을 구입하였다.
전사 및 효소-결합 면역흡착 검정법 데이터, 둘 모두는 함께 또는 따로따로 GLP-1 및 PDX-1-CPP로부터의 CFM과 함께 인큐베이션된 인간 상피는 자극을 받은 인슐린을 생산하였다는 것을 나타내었다 (도 4A-B). 가장 많은 인슐린 생산은 일관되게 GLP-1 (아미노산 1 내지 37) CFM과 함께 인큐베이션된 경우에 관찰되었다. PDX-1-CPP CFM은 그 자체인든 또는 GLP-1이 함께 첨가되든 간에 글루코스-반응성 인슐린 분비를 자극하였다. GLP-1- 및 PDX-1-매개 인슐린 분비, 둘 모두는 글루코스에 대한 반응으로 일어났다. 20 아미노산 서열 태그로부터의 CFM과 함께 밤새도록 배양된 음성 대조군 상피는 글루코스-반응성 인슐린을 생산하지 않은 것으로 나타났다 (도 4A-B). PDX-1-CPP 처리가 Caco-2 세포에서 글루코스-반응성 인슐린 분비를 유발하였다는 것은 (도 4A-B) 예측치 못했던 것이다.
니슬 생존 가능성 수준 범위가 106 내지 109 CFU mL일 경우, 혈중 인슐린 수준은 각각 164 fmol/ℓ 내지 164 pmol/ℓ가 될 것으로 예측되었다. 당뇨병이 아닌 성인의 경우, 식후 혈청 인슐린 농도는 400 pmol/ℓ 정도에 달할 수 있다고 가정할 때, 비최적화된 조작된 박테리아는 적어도 정상적인 대사에 필요한 것과 같은 크기 정도의 범위 이내로 인슐린 방출을 자극시킬 수 있을 것이다.
6.4. 실시예 4: 장 세포의 글루코스 -반응성 인슐린-분비 세포로의 리프로그래밍
본 실시예는 장 세포의 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포로의 리프로그래밍을 입증한다.
니슬을 앞서 기술된 바와 같이 fliC 프로모터 및 분비 태그를 이용하여 GLP-1(1-37)을 분비하도록 조작하였다. 니슬 내로 삽입된 카세트는 도 5에 제시되어 있다. GLP-1 분비를 상기 균주에 대한 배양물 중에서 확인하고, 같은 서열을 포함하나, pKD3 염색체 삽입 카세트는 없는 플라스미드 포함 균주로부터의 분비와 비교하였다 (도 5). 니슬-GLP-1의 분비량은 플라스미드 포함 균주의 분비량의 대략 절반 정도였고, 생체내 시험을 통해 균주들 중 어느 하나의 것으로 처리된 마우스들 간에는 글루코스 수준에 있어서 어떤 유의적인 차이도 없는 것으로 밝혀졌다 (도 6). 따라서, 본 연구를 수행하는 동안 내내 플라스미드 상에 GLP-1을 포함하는 균주 대신 니슬-GLP-1을 사용하였다. 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스를 통해 (히스티딘 태그 염색에 의해 측정된) 생체내에서의 재조합 단백질의 유의적인 발현이 입증되었다 (도 5).
GLP-1을 분비하도록 조작된 인간 공생 박테리아 균주를 간단하게 경구 투여하는 것이 장 세포를 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포로 리프로그래밍함으로써 1형 당뇨병 마우스 모델에서 고혈당증을 호전시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 스트렙토조토신 (스트렙토조신, 자노사르(Zanosar)®) (STZ)으로 처리된 마우스에게 GLP-1 (1-37)을 분비하도록 조작된 공생 박테리아 (니슬-GLP-1)를 매일 공급하였다. 내당능 검사에서 니슬-GLP-1은 마우스 혈중 글루코스 수준을 유의적으로 감소시켰고, 인슐린 수준을 유의적으로 증가시켰다. 건강한 (비-당뇨병) 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스는 혈중 글루코스 수준 또는 체중에 있어서 어떤 변화도 보이지 않았다. 니슬-GLP-1로 처리된 마우스에서는 상부 장의 융모 내에서 인슐린-분비 세포가 발생되었다. 크로모그래닌 A (Chr-A)와 함께 공동으로 수행된 인슐린 분비 세포의 면역염색을 통해 장내분비 세포의 "β-유사" 세포로의 박테리아 매개성 리프로그래밍이 제안되었다. 이러한 결과는, GLP-1을 분비하도록 조작된 인간 공생 박테리아 균주를 투여하는 단계를 포함하는, 1형 당뇨병을 치료 또는 호전시키는 방법은 아주 낮은 비용으로 경구적으로 시행될 수 있다는 것을 입증한다.
6.5. 실시예 5: GLP -1을 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 박테리아를 이용한 스트렙토조토신 ( STZ )-유도성 당뇨병을 앓는 마우스 치료
본 실시예는 GLP-1을 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 박테리아를 이용하여 스트렙토조토신 (STZ)-유도성 당뇨병을 앓는 마우스를 치료하는 예시적인 방법을 기술한다.
스트렙토조토신 (STZ)-유도성 당뇨병을 앓는, 6-8주령된 수컷 마우스 (C57B6)에게 세포-투과 펩티드와 함께 GLP-1 (STZ+GLP)을 발현하거나, 무작위 20 아미노산 서열 (STZ-벡터)을 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 박테리아를 공급하였다. "대조군" 마우스는 STZ로 처리하지 않았다. 도 7을 참조해 보면, "니슬 공급 이전"에는 니슬 박테리아를 STZ로 처리된 마우스에게 공급하기 전, STZ 처리 후 혈중 글루코스 수준이 유의적으로 상승한 것으로 측정되었다. 30일 후에는 모든 박테리아 공급을 중단하였다. 박테리아 공급을 시작한 후 다시 60일째에 혈중 글루코스를 측정하였다 ("60일째"). 값은 4마리의 마우스로부터 얻은 값의 평균값을 나타낸다. 오차 막대는 1 표준 편차를 나타내고, p 값은 스튜던트 t 검정 (n=4)으로부터의 것이다. 본 결과를 통해 GLP-1 분비 박테리아를 공급받은 당뇨병 마우스는 30일 동안의 처리 후 정상혈당 수준으로 회복된 것으로 나타났다. 놀랍게도, 상기 마우스에서는 추가의 30일 동안 어떤 처리 없이도 혈중 글루코스 수준이 정상으로 유지되었다.
상기 마우스에 대한 해부 및 면역조직화학법을 실시한 결과, 그의 장 조직 중의 인슐린 수준은, 무작위 펩티드 서열을 분비하는 공생 박테리아만을 공급받은 대조군에 비하여 높은 것으로 나타났다 (도 8A-B). 도 8A을 참조해 보면, 고농도의 인슐린은 화살표로 표시되어 있다.
6.6. 실시예 6: GLP -1을 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 박테리아를 이용한 1형 당뇨병 마우스 치료
본 실시예는 GLP-1을 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 박테리아를 이용하여 1형 당뇨병 마우스를 치료하는 예시적인 방법을 기술한다.
니슬-GLP-1이 1형 당뇨병 (T1DM)에 미치는 효과를 측정하기 위해, T1DM인 STZ 마우스 모델을 제작하였다. C57BL/6J (B6) 수컷 마우스를 고용량의 STZ로 처리하고, 고혈당증 발병시 (무작위 글루코스 수준 >350 mg/dL), 마우스에게 니슬-GLP-1, 니슬을 공급하거나, 또는 어떤 처리도 하지 않았다. 1일 2회에 걸쳐 대략 8 h 간격을 두고 공생 박테리아를 공급하였다. 정상혈당 대조군으로서, 한 군의 마우스에는 어떤 STZ 처리도 하지 않고, 공생 박테리아도 공급하지 않았다 (대조군). 마우스 무작위 글루코스 수준 (도 9B) 및 체중 (도 9C)을 80일 동안에 걸쳐 모니터링하고, β 세포 질량을 측정하였다 (도 9A). 니슬만을 단독으로 공급한 것은 어떤 공생 박테리아도 받지 않은 STZ로 처리된 마우스와 비교하여 무작위 혈중 글루코스 수준에 대해 어떤 유의적인 효과도 미치지 못한 것으로 나타났다 (도 9B). 그러나, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스는 공급 개시 후 16일 이내에 유의적으로 더 낮은 무작위 혈중 글루코스 수준을 나타내었다. 본 연구에서 마우스 중 어느 것의 체중에 있어서 유의적인 차이는 없었고, 80일이라는 기간 동안에 걸쳐 마우스 중 어느 것의 유의적인 체중 증가도 없었다.
89일 동안의 공생 박테리아 처리 후, 마우스에 대해서 내당능 검사를 실시하였다. 글루코스를 i.p.로 주사하기 전 10 h 동안 마우스를 금식시켰다. 글루코스 주사 후 1.5 h 동안 매 30분마다 혈중 인슐린 및 글루코스 수준을 측정하였다 (각각 도 9D 및 9E). 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스와 STZ로만 처리된 마우스 사이에는 0.5 및 1.5 h째에 인슐린 수준에 있어서 유의적인 차이가 있는 것으로 관찰되었다. 니슬 GLP-1을 공급받은 마우스와 어떤 처리도 받지 못한 대조군 마우스 사이에는 어느 시점에서도 인슐린 수준에 있어서 어떤 유의적인 차이도 없었다 (도 9D). 본 실험을 수행하는 동안 내내 4개의 군 모두의 마우스 간에는 혈중 글루코스 수준에 있어서 유의적인 차이가 있었다. 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스는 내당능 검사를 수행하는 동안 STZ로만 처리된 마우스의 혈중 글루코스 수준의 50%보다 더 낮게 나타났지만; STZ를 받지 않은 대조군 마우스의 혈중 글루코스 수준의 2배나 높게 나타났다 (도 9E). 흥미롭게도, 비록 니슬로 처리된 마우스는 글루코스 주사 전 시점 (시점=0)에서 STZ로 처리된 마우스로부터의 혈중 글루코스에 있어서는 유의적인 차이를 보이지는 않았지만, 글루코스 주사 후 1 h 경과하였을 때, 니슬로 처리된 마우스에서는 STZ로 처리된 마우스보다 33% 더 낮은 혈중 글루코스 수준에 가깝게 나타났다.
인슐린 존재에 대하여 마우스 장을 면역염색시켰다 (도 10A-F). 니슬-GLP-1로 처리된 마우스에서는 인슐린 함유 세포의 포켓이 관찰되었지만, 본 연구에서 사용된 임의의 마우스에서는 관찰되지 않았다. 상기 포켓의 상대적인 빈도가 제시되어 있다 (도 10A-B). 상피 세포의 전체 질량에 대한 비율(%)로서, 포켓은 1% 미만을 포함하는 것으로 예측되었다 (도 10B). 예측된 바와 같이, STZ는 T1DM 반응을 유도하는 데 효과적이었고, β-세포 질량은 STZ로 처리된 마우스의 경우에 유의적으로 더 낮았고 (도 9A), 그의 혈중 글루코스 및 인슐린 수준 또한 T1DM과 일치하였다 (도 9B, D, E). STZ로 처리된 모든 마우스에서 β-세포 질량이 동등하게 감소하였다는 것은, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서 췌장 β-세포 재생이 인슐린을 증가시키거나, 또는 혈중 글루코스를 강하시키는 기전이 아니라는 것을 시사하는 것이었다.
어떤 유형의 장세포 (파네트, 흡수성, 배상 또는 장내분비)가 리프로그래밍되어 인슐린 함유 세포가 될 수 있는지를 측정하기 위해, 세포를 4가지 유형의 세포 각각으로부터의 대표적인 단백질: 파네트 세포의 경우, NOD-2, 배상 세포의 경우, 뮤신-2 (MUC-2), 흡수성 세포의 경우, 수크로스 이소말타제 (SI), 및 장내분비 세포의 경우, 크로모그래닌 A (Chr-A)인 것에 대한 항체와 함께 청색으로 공동으로 염색하였다. NOD-2, MUC-2, 또는 SI에 대한 중복 염색은 관찰되지 않았다 (각각 도 10C, D 및 E). 그러나, Chr-A에 대해서는 인슐린과의 중복 염색이 관찰되었다 (도 10F). 마우스 장의 면역염색을 통해 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서는 인슐린 함유 세포가 나타났지만 (도 10A), 니슬을 공급받은 마우스 또는 대조군 마우스에서는 나타나지 않았다 (도 10B). 4가지 유형의 장 세포 각각으로부터의 대표적인 단백질에 대한 항체와 함께 공동으로 염색함으로써 상기 세포 계통이 장내분비 세포와 관련이 있다는 것이 제안되었다 (도 10F). 혈액 내로의 호르몬 분비는 정상적으로 장내분비 세포의 기능이지, 다른 나머지 3가지 유형의 세포의 기능이 아닌 바, 상기와 같은 결과가 예측되었다.
건강한 마우스 (STZ로 처리되지 않음)에게도 또한 니슬 및 니슬-GLP-1을 공급하였고, 그의 혈중 글루코스 수준은 어떤 공생 박테리아도 공급받지 않은 건강한 마우스의 것과 유의적인 차이는 없었다 (도 11A-B). 이러한 결과는 처리군들 중 어느 것과, 비처리된 건강한 마우스 (대조군) 사이에는 92일 동안에 걸쳐 무작위 마우스 혈중 글루코스 수준에 있어서 유의적인 변화는 없었다는 것을 나타낸다 (도 11 A). 상기 기간 동안에 걸쳐 마우스 체중 변화에 있어서는 어떤 차이도 없었다 (도 11B). 니슬-GLP-1이 혈중 글루코스 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있다는 것을 나타내는 데이터와 함께, 건강한 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스의 경우, 혈중 글루코스 또는 체중에 있어 어떤 변화도 없었음을 나타내는 데이터 (도 11)를 고려해 볼 때, 전반적인 상황은 상기의 것이 효과적이고 안전한 잠재성을 지닌 당뇨병 치료법 중 하나: 비-당뇨병계와 유사한 인슐린 동력학적 성질을 가지며 글루코스 반응성인 것 (도 9D)이다. 즉, 비록 그 정도는 덜 하기는 하지만, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서는 건강한 마우스에서와 같은 타이밍으로 인슐린 수준 변화가 일어난다.
상기 데이터는 니슬-GLP-1을 당뇨병 마우스에게 공급하는 것인 글루코스-반응성 인슐린 생산을 유발할 수 있고, 이로써 혈중 글루코스 수준을 현저히 감소시킬 수 있다는 것을 제안한다. 이론으로 제한되지 않기를 바라면서, 인슐린 분비 기전은 리프로그래밍된 장 세포의 포켓으로부터 기인하는 것으로 보인다. 이러한 포켓은 인슐린 이외에도 Chr-A를 발현하며, 이는 상기 포켓이 장내분비 세포로부터 유래된 것임을 제안한다. 니슬-GLP-1을 공급받은 건강한 마우스로부터 얻은 결과에 비추어 고려해 볼 때, 상기 증거는 본 치료법이 비록 비-당뇨병에 사용될지라도, 안전할 것이라는 것을 제안한다.
6.7. 실시예 7: 염색체적으로 변형된 것 대 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 니슬에서의 GLP -1의 발현
본 실시예는 염색체적으로 변형된 것 대 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 니슬에서의 GLP-1의 발현 비교를 기술한다.
박테리아를 조작하여 GLP-1 발현 유지를 위해 선택압을 필요로 하지 않도록 하였다. 균주를 비교한 결과, 염색체적으로 변형된 니슬로부터의 배양 배지로 분비된 GLP-1의 상대 농도가 플라스미드로부터 GLP-1을 발현하는 니슬로부터 분비된 것보다 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 그러나, 염색체로부터 GLP-1을 발현하는 니슬이 플라스미드로부터 GLP-1을 발현하는 니슬만큼 생체내에서 효과적인 것으로 나타났다 (도 5). 박테리아 배양물 중에 분비된 GLP-1의 양과 생체내의 더 낮은 혈중 글루코스 수준 사이의 상관관계가 부족한 이유에는 여러 가지가 있을 수 있다. 마우스 장에서의 니슬의 생존 가능성을 측정한 결과, 니슬, 플라스미드로부터 GLP-1을 발현하는 니슬 또는 니슬-GLP-1을 공급받은 계통 사이에서는 어떤 차이도 없는 것으로 밝혀졌다 (도 12). 장 점막에서의 GLP-1의 안정성은 점막 프로테아제에 의해 손상될 수 있고, 이로 인해 효과적인 수송은 분비율보다 훨씬 더 낮아질 수 있다. 이는 또한 마우스 장 내의, 이상적인 것과는 거리가 먼 성장 조건 (pH, 영양분 등) (니슬은 인간 프로바이오틱임)으로 인해 어느 계통이든 최적의 유전자 발현에 미치지 못하는 결과를 초래할 수 있는 경우일 수도 있다.
비록 STZ로 처리된 모든 마우스에서 혈중 글루코스 강하가 지연되기는 하였지만 (도 9E), 글루코스 반응 검사에서 인슐린 분비의 동력학적 성질은 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스 및 대조군 마우스에 대한 것과 유사한 것으로 나타났다(도 9D). 그러나, 니슬을 공급받은 마우스는 대조군 마우스와 동일한 동력학적 성질을 보였다. 이러한 결과는 예상 밖의 결과이며, 이는 또 다른 기전에 의해 설명이 가능할 수도 있다. 또한 예상 밖으로, 글루코스 반응 검사에서는 STZ로만 처리된 마우스와 비교하였을 때, 니슬을 공급받은 마우스에서 혈중 글루코스 강하가 더욱 빠르게 일어났다 (도 9E). 이는 니슬 단독의 것으로부터의 보호 수준을 암시한다. 이러한 보호는 무작위 글루코스 수준에서는 뚜렷하지는 않았지만, 혈중 글루코스의 급등의 효과를 감소시킬 수 있는 것으로 보인다. 글루코스를 i.p.로 주사한 것을 고려해 볼 때, 박테리아가 장 글루코스를 소비하는 것은 가능한 기전으로서 배제시킬 수 있었다.
6.8. 실시예 8: 니슬 공급이 혈중 글루코스 수준에 미치는 효과
본 실시예는 마우스에서 니슬 공급이 혈중 글루코스 수준에 미치는 효과를 입증한다.
실험 시작시에 마우스에게 5일 동안 STZ (체중 1 kg당 40 mg)를 공급하였다 ("STZ 중단"시 STZ 처리 종결). 무작위 혈중 글루코스 수준이 지속적으로 300 mg/dL를 넘기 시작한 후, 그 자체로 모의 플라스미드만을 발현하는 니슬 (STZ+벡터), 같은 플라스미드로부터 GLP-1(1-37)을 발현하는 니슬 (STZ+GLP) 또는 어떤 처리도 어떤 STZ도 공급받지 않은 것 (대조군)을 포함하는 니슬 처리를 마우스에 대하여 시작하였다. 공급은 시간선 상에 "니슬 개시"로서 마킹되어 있다. 시간 경계가 "니슬 중단"이라고 표시될 때까지 니슬을 1일 2회에 걸쳐 공급하였다. 시간 경계가 "니슬 1회"라고 표시할 때까지, 상기 시점에는 (일상적인 보살핌 이외에는) 마우스를 본질적으로는 혼자 남겨 두었다. 상기 시점에 혈중 글루코스를 측정하고, 니슬을 마우스에게 1회 공급하였다. 이어서, 혈중 글루코스를 측정하는 최종 시점때까지 마우스를 혼자 남겨 두었다. 도 13을 참조할 수 있다. 1 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 평균이 제시되어 있다 (n=3).
비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스에게 니슬 그 자체, 염색체에 의해 GLP-1(1-37)을 발현하는 니슬 또는 어떤 처리도 되지 않은 것을 1일 2회에 걸쳐 공급하였다. 혈중 글루코스를 측정하기 바로 전 4시간 동안 마우스를 금식시켰다. 도 14를 참조하면, 시간은 처리 시작 후 경과일을 나타낸다. 1 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 평균이 제시되어 있다 (n=3 이상). p 값은 스튜던트 t 검정으로부터의 것이다.
도 15은 가능성이 있는, 재조합 세포의 작동 방법을 도시한 것이다. 좌측: 점막 (M) 내부 및 그 상부의 관내강 (B) 중 박테리아를 포함하는 정상적인 장 움. 장내분비 세포 (E)는 고유판 (LP) 및 혈관계 (V) 내로 호르몬을 분비한다. 우측: 본원의 실시양태의 재조합 세포 (EB)는 GLP-1 (EB로부터 출현한 도트로 표시됨)을 움으로 분비하여 조기에 장내분비 세포를 인슐린-분비 세포 (RE)로 리프로그래밍시킨다. 이어서, 인슐린 (Ins, 별표 표시)은 글루코스에 대한 반응으로 혈류 내로 분비된다.
이론으로 제한되지 않기를 바라면서, 재조합 공생 균주를 사용하는 것은, 간단하게 경구적으로 투여될 수 있고, 유의적인 배경 발현은 없으며, 글루코스 반응성이며, 인슐린을 주사할 필요를 유의적으로 감소시키거나, 또는 심지어는 제거할 수 있고, 숙주 인슐린 합성을 대체시킴으로써 당뇨병으로 인해 나타나는 장기간의 합병증을 감소시키는 데에도 도움을 줄 수 있는 것으로 여겨진다.
6.9. 실시예 9: GLP -1 연구를 위한 원( original ) 구축물 및 새 구축물의 서열
본원에 개시된 방법에 따라 하기 구축물을 사용할 수 있다.
실시예 1-11에서 사용된 원 니슬- GLP -1 구축물
( FliC 프로모터)- Flic20 -6 xhis - xpress - EK 부위- glp -1(1-37)- cpp
Figure pct00004
여기서,
FliC20 :
Figure pct00005
6 XHis:
Figure pct00006
Xpress: GATCTGTAC
EK 부위:
Figure pct00007
GLP1 (1-37):
Figure pct00008
CPP:
Figure pct00009
이다.
사용될 수 있는 또 다른 프로모터 니슬- GLP -1 구축물
LPP 프로모터--5' UTR - Flic20 -6 xhis - xpress - EK 부위- GLP -1(1-37)- CPP -3' UTR
Figure pct00010
여기서,
LPP 프로모터:
Figure pct00011
5' UTR:
Figure pct00012
FliC20:
Figure pct00013
6 XHis:
Figure pct00014
Xpress: GATCTGTAC
EK 부위:
Figure pct00015
GLP1 (1-37):
Figure pct00016
CPP:
Figure pct00017
3' UTR:
Figure pct00018
이다.
락토바실러스 구축물
TAA - SLPAP - RBS - ATG -- USP45 - LEISS -6 XHIS -- EK - GLP (1-37)- CPP - TAA - TAA - TERM667
Figure pct00019
여기서,
TAA - SLPAP - RBS:
Figure pct00020
ATG - USP45:
Figure pct00021
LEISS:
Figure pct00022
6 XHIS:
Figure pct00023
EK 부위:
Figure pct00024
GLP -1(1-37):
Figure pct00025
CPP:
Figure pct00026
TERM667:
Figure pct00027
이다.
6.10. 실시예 10: 공생 박테리아에 의해 분비된 GLP -1이 당뇨병 마우스에서 고 혈당증을 감소시키도록 장 세포를 리프로그래밍한다 .
박테리아에 의해 분비된 GLP-1을 당뇨병 마우스에게 장으로 공급하면 글루코스-반응성 인슐린 생산을 유발할 수 있고, 이로써 혈중 글루코스 수준을 현저히 감소시킬 수 있다. 인슐린 분비 기전은 리프로그래밍된 장 세포로부터 유도되는 것으로 보인다. 이러한 세포는 PDX-1을 거의 발현하지 않고, 단지 일부는 인슐린 이외에 ChrA를 발현한다는 점에서 대다수의 췌장 β-세포와는 완전히 다르다.
도입
글루카곤 유사 펩티드 1 (GLP-1)은 마우스의 장 상피 세포의 인슐린 분비 세포로의 전환을 자극시킨다. 본 발명자들은 GLP-1을 분비하도록 조작된 인간 공생 박테리아 균주를 간단히 경구 투여하는 것이 장 세포를 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포로 리프로그래밍함으로써 1형 당뇨병 (T1DM)의 마우스 모델에서 고혈당증을 호전시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. GLP-1 (니슬-GLP-1)을 분비하도록 조작된 공생 박테리아를 매일 당뇨병 마우스에게 공급하였다. 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서 인슐린 수준은 현저하게 증가한 것으로 나타났고, 내당능이 유의적으로 더 큰 컸다. 상기 마우스는 상부 장 내의 인슐린 생산 세포를 수적으로 건강한 마우스에서 발견되는 췌장 β-세포 중 대략 82%를 대체할 정도로 충분할 정도로 발생시켰다. 놀랍게도, PDX-1의 발현은 주변 상피보다 리프로그래밍된 세포에서 양적으로 더 낮았다. 추가로, 리프로그래밍된 세포의 서브세트를 크로모그래닌 A (ChrA, 장내분비 및 β 세포에 대한 마커)에 대해서 공동으로 염색하였다. 니슬-GLP-1을 공급받은 건강한 (비-당뇨병) 마우스는 유사하게 리프로그래밍된 세포를 나타내었지만, 혈중 글루코스 수준에서는 어떤 변화도 없었고, 심지어 처리 후 90일이 넘는 시간이 경과한 후에도 대조군 마우스로부터 구별이 되지 않는 방식으로 체중이 증가하였다. 이러한 결과는 T1DM에 대해 잠재적인 경구 치료법을 암시하며, 장 세포 운면을 매개하는 박테리아 신호 전달의 개념을 도입한다.
비-β 세포를 β-세포 또는 인슐린 분비능이 있는 세포로 리프로그래밍하는 것이 지난 10년간 여러 연구의 대상이 되어왔다. 이식을 위해 췌장 (샘꽈리 세포 등) 및 간 세포 계통으로부터 β-세포를 시험관내에서 생성하는 것 뿐만 아니라, 췌장 또는 다른 조직-특이 세포를 생체내에서 β-세포로 전환시키는 것을 비롯한 여러 분야에 주력해 왔다. 앞서 불활성인 것으로 여겨진 글루카곤 유사 펩티드 1의 형태 (GLP-1(1-37))는 Notch 신호 전달 경로를 통해 래트 장 상피 세포가 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포가 되도록 자극시킬 수 있다는 발견 (문헌 [Suzuki, A., Nakauchi, H. & Taniguchi, H. Glucagon-like peptide 1 (1-37) converts intestinal epithelial cells into insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci USA 100, 5034-5039 (2003)])이 상기 후자의 접근법의 가능성을 입증하였다. 그의 모체가 배아일 10.5일째 (E10.5) GLP-1을 복강내로 (i.p.) 주사맞은 것인 래트 배아를 발생시켰을 때, 그의 상부 장에서 수개의 인슐린 생산 세포가 나타나는 것으로 스즈끼(Suzuki)는 보고하였다. 성체 래트 (10주)는 9일 동안 매일 GLP-1을 주사맞았을 때, (비록 훨씬 더 적기는 하지만) 약간의 장 인슐린 생산 세포를 가졌다. 이는 비분화돈 장 사피를 가지는 래트 (래트에서 분화는 E15 후에 일어남)가 장 상피를 "β-유사" 세포로 분화시킬 수 있을 것이라고 제안하였다. 상기 연구를 통해서 또한, 시험관내에서 GLP-1과 함께 인큐베이션되고, 당뇨병을 앓는 성체 래트 내로 수술을 통해 이식된 배아 공장 (E14.5)은 STZ-유도성 T1DM을 역전시킬 수 있다는 것이 입증되었다. 저자는 (장움으로부터 발생되는) 성체의 장세포 분화는 상당수의 인슐린 생산 세포를 만들어 내지 못하고, β-유사 기능성을 가진 세포로의 유의적인 분화를 위해서는 발생 중인 태아 (배아전 시기-E17)의 증식 및 가중층 세포가 요구되는 것으로 보인다고 결론지었다.
스즈끼의 연구를 통해 수술하지 않고, 장 세포의 리프로그래밍을 매개할 수 있는 생체활성 화합물을 전달하는 것은 어렵다는 것이 입증되었다. GLP-1, 그 자체의 혈중 반감기는 단지 몇 분 정도밖에 되지 않는다. GLP-1은 순환하여 장움에 도달할 수 있을 정도로 충분히 장기간 동안 생존하여야 하는 바, 이같이 짧은 반감기가 성체 래트에서의 보다 낮은 리프로그래밍율에 대한 이유가 될 수 있다. 수술 또는 혈류 중 분해라는 잠재적인 위험을 피하면서, 생체활성 화합물을 상부 장의 관강내 (융모) 부위로 전달하는 방법은 장에 거주하는 공생 박테리아로부터의 신호 분비이다. 본 방법을 통해 연속하여 또는 국소 자극에 대한 반응으로 신호를 발현시킬 수 있으며, 이어서 혈액이 아닌 장 점막을 통해 수송이 이루어질 수 있다.
조작된 공생 박테리아는 GLP-1(1-37)을 인간 장 세포로 전달할 수 있고, 시험관내에서 글루코스-반응성 인슐린 분비를 자극시킬 수 있다 (문헌 [Duan, F., Curtis, K. L. & March, J. C. Secretion of insulinotropic proteins by commensal bacteria: rewiring the gut to treat diabetes. Appl Environ Microbiol 74, 7437-7438 (2008)]). 상기 연구에서는, 외인성 유도제에 대한 반응으로 플라스미드로부터 GLP-1(1-37)을 분비하도록 이. 콜라이 니슬 1917 (EcN)을 형질전환시켰다. 상기 연구에서 본 발명자들은 구성적으로 GLP-1(1-37)을 분비하도록 염색체상 변형이 이루어진 EcN (니슬-GLP-1)이 T1DM 마우스 모델에서 정상혈당을 회복시킬 수 있는지 여부를 시험하였다. 본 발명자들의 목적은 니슬-GLP-1을 매일 공급함으로써 마우스 장 세포를 글루코스-반응성 인슐린- 분비 세포로 리프로그래밍시키는 것이었다. 본 발명자들은 또한 β-세포 및 장내분비 마커의 공-발현을 측정하여 리프로그래밍 정도 뿐만 아니라, 리프로그래밍된 세포의 계통 또한 측정하였다.
fliC 프로모터, 세포 투과 펩티드 (CPP) 및 분비 태그를 이용하여 GLP-1(1-37)을 분비하도록 EcN을 조작하였다 (도 19, 상단). 상기 균주에 대한 배양물 중에서 GLP-1 분비가 입증되었고, 같은 서열이지만, pKD3 염색체 삽입 카세트를 포함하지 않는 것인 서열을 함유한, 플라스미드 보유 균주로부터의 분비와 비교하였다 (도 19, 하단). 니슬-GLP-1 분비량은 플라스미드 보유 균주의 것의 대략 50% 정도였다. 따라서, 수율 차이가 유의적인 것으로 간주되지 않았고, 본 발명자들은 본 실험에서 플라스미드 유지를 위해 선택압을 포함하는 것을 원치 않았기 때문에, 생체내 연구에서는 플라스미드 보유 균주보다는 니슬-GLP-1을 사용하였다. 면역형광 (IF)에 의해 밝혀진 바와 같이 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스는 그의 상부 장의 GLP-1에 대해 양성으로 염색된 반면, "모의" 펩티드 (니슬)를 발현하는 EcN을 공급받은 마우스는 유사하게 염색되지 않은 것으로 나타났다 (도 16a, b). 점막층을 보존하기 위해, 장 절편을 파라포름알데히드에 고정시키기 보다는 냉동시켰다. 영상 분석을 통해, GLP-1 염색은 니슬을 공급받은 마우스에서보다 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서 유의적으로 더 높았다는 것으로 나타났다 (도 16c).
본 발명자들은 니슬-GLP-1 또는 니슬을 공급받은 마우스의 장 및 대변 중의 박테리아 계수를 측정하였다. 니슬-GLP-1 및 니슬을 공급받은 마우스의 장 및 대변 중의 박테리아 계수는 동일하였는데 (도 16d), 이는 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스의 절편에서 GLP-1이 증가된 것으로 관찰된 것은 내인성 GLP-1의 생산으로부터가 아닌, EcN 유래 균주의 균주에 의해 그로부터 초래된 재조합 GLP-1 발현에 기인하는 것일 수 있다는 것을 시사한다. 대변 중이 아닌 대장 중의 콜로니 측정을 위해, 하부 GI 관 절편을 살살 스크랩핑하고, 세척하여 대변을 제거하였다. 남아있는 박테리아에 대해 계수하였다. 본 발명자들이 측정한 소장 및 대변 중의 박테리아 계수는 다른 곳에서 보고된 것만큼 높지는 않았지만, 이는 다른 마우스 품종 및 대안적인 항생제 전처리 때문일 수도 있었다.
본 발명자들은 니슬-GLP-1이 약물 유도성 T1DM 마우스 모델 및 유전적 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스 모델에서 정상혈당을 회복시킬 수 있는지 여부를 시험하였다 (NOD 모델로부터의 결과는 섹션 6.11 (실시예 11)에 요약되어 있다). 약물 유도성 T1DM 모델의 경우, C57BL/6J (B6) 수컷 마우스에 스트렙토조토신 (STZ)을 고용량 (체중 1 kg당 40 또는 50 mg)으로 연이어 5일 동안 주사하였다. 고혈당증 (공복 글루코스 수준 >250 mg/dL) 발병된 마우스에게 니슬-GLP-1, 니슬을 공급하거나, 또는 어떤 처리도 하지 않았다. 1일 2회에 걸쳐 대략 8 h 간격을 두고 공생 박테리아를 공급하였다. 정상혈당 대조군으로서, 한 군의 마우스에는 어떤 STZ 처리도 하지 않고, 공생 박테리아도 공급하지 않았다 (대조군). 혈중 글루코스 수준 및 체중을 60일 동안에 걸쳐 모니터링하였다.
췌장의 형태를 분석한 결과, 대조군 마우스와 비교하여 STZ로 처리된 마우스에서는 β-세포 질량이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (도 17a). 니슬만을 단독으로 공급한 것은 어떤 공생 박테리아도 받지 않은 STZ로 처리된 마우스와 비교하여 혈중 글루코스 수준에 대해 어떤 유의적인 효과도 미치지 못한 것으로 나타났다 (도 17b). 그러나, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스는 공급 개시 후 60일이 경과하였을 때 유의적으로 더 낮은 (p=0.000017) 혈중 글루코스 수준을 나타내었다 (도 17b). 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스의 혈중 글루코스 수준은 정상혈당 대조군과 유의적인 차이는 없었다 (p=0.46). 추가로, 60일이라는 기간 동안에 걸쳐 진행된 연구에서 마우스 중 어느 것의 체중에 있어서 유의적인 변화는 없었다 (도 20A-B). STZ를 공급받은 모든 마우스에서 β-세포 질량이 동등하게 감소하였다는 것은 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스의 더 낮은 혈중 글루코스 수준이 β-세포 재생의 결과일 수 있다는 가능성을 배제한 것이었다.
건강한, STZ로 처리되지 않은 마우스에게도 또한 니슬 및 니슬-GLP-1을 공급하였고, 그의 혈중 글루코스 수준은 어떤 공생 박테리아도 공급받지 않은 건강한 마우스의 것과 유의적인 차이는 없었다 (도 17c). 처리군들 중 어느 것과, 비처리된 건강한 마우스 (대조군) 사이에는 92일 동안에 걸쳐 마우스 혈중 글루코스 수준에 있어서 유의적인 변화는 없었다 (도 17c). 같은 기간 동안에 걸쳐 마우스 체중 변화에 있어서는 어떤 차이도 없었다 (도 20A-B).
60일 동안의 공생 박테리아 처리 후, 모든 군의 마우스에 대해서 내당능 검사를 실시하였다. 글루코스 (체중 1 kg당 25 g)를 i.p.로 주사하기 전 10 h 동안 마우스를 금식시켰다. 글루코스 주사 후 1.5 h 동안 매 30분마다 혈중 인슐린 및 글루코스 수준을 측정하였다 (도 17d). 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스와 STZ로만 처리된 군 사이에는 0.5 및 1.5 h째에 인슐린 수준에 있어서 유의적인 차이가 있는 것으로 관찰된 반면, 니슬 GLP-1을 공급받은 마우스와 어떤 처리도 받지 못한 대조군 마우스 사이에는 어느 시점에서도 인슐린 수준에 있어서 어떤 유의적인 차이도 검출되지 않았다 (도 17d). 내당능 검사를 수행하는 동안 내내 4개의 군 모두의 마우스 간에는 혈중 글루코스 수준에 있어서 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다. 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스는 내당능 검사를 수행하는 동안 STZ로만 처리된 마우스의 혈중 글루코스 수준의 50%보다 더 낮게 나타났지만; STZ를 받지 않은 대조군 마우스의 혈중 글루코스 수준의 2배나 높게 나타났다 (도 17d). 비록 정상혈당 대조군보다는 높았지만, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스의 혈중 글루코스 수준은 내당능 검사를 수행하는 동안 (STZ로만 처리된 마우스의 경우, 600 mg/dL인 것과 비교하여) 275 mg/dL를 초과하지 않았다. 흥미롭게도, 비록 니슬로 처리된 마우스는 기준 수준 (시점=0)에서 STZ로 처리된 마우스로부터의 혈중 글루코스에 있어서는 유의적인 차이를 보이지는 않았지만, 글루코스 주사 후 1 h 경과하였을 때, 니슬로 처리된 마우스에서는 STZ로 처리된 마우스보다 33% 더 낮은 혈중 글루코스 수준에 가깝게 나타났다. 이러한 보호가 고수준의 글루코스를 주사맞지 않은 마우스에서는 뚜렷하게 나타나지는 않았지만, 니슬이 혈중 글루코스 급등의 효과를 어느 정도는 호전시킬 수 있는 것으로 보인다. 글루코스를 i.p.로 주사한 것을 고려해 볼 때, 박테리아가 관강내 글루코스를 소비하는 것은 가능한 기전으로서 배제시킬 수 있었다. 상기 관찰 결과를 설명하기 위해서는 추가 연구가 필요하였다.
60일 동안의 처리 후 (및 내당능 검사 후), 마우스 소장 절편을 고정시키고, 다양한 마커에 대하여 면역형광법으로 프로빙하였다. 니슬-GLP-1로 처리된 마우스의 소장에서는 인슐린 함유 세포의 포켓이 관찰되었지만, 본 연구에서 사용된 임의의 다른 군에서는 관찰되지 않았다 (도 18a-d). 영상 분석으로부터 인슐린 생산 세포의 상대적인 빈도는 전체 소장 세포 질량의 대략 0.013% (±0.002%) (또는 10,000개의 상피 세포 중 1개)인 것으로 추정되었다. 모든 마우스에 대하여 예측되는 바와 같이, 상부 장에서 PDX-1 생산이 관찰되었다 (도 18a-d에서 적색 염색). 그러나, 니슬-GLP-1로 처리된 마우스에서의 인슐린 생산 세포는 고수준의 PDX-1에 대해 염색되지 않았고, 심지어는 주변 세포보다 (도 18b 및 d) 또는 대조군 마우스로부터의 췌장 베타 세포보다 (데이터를 나타내지 않음) 더 적은 PDX-1 발현을 나타내었다. 이는 흥미로운 결과이기는 하지만, β-세포 집단내에는 PDX-1/인슐린 분비의 이질성이 존재하는 것으로 알려져 있는 바, 상기 세포가 β-세포-유사 기능성를 가질 수 있는 가능성의 여지는 여전히 남아있다.
건강한 (비-당뇨병) 마우스에게 니슬 및 니슬-GLP-1을 공급한 장기간 대조군 실험에서, 장은 또한 리프로그래밍된 세포의 존재에 대해 염색되었다. 건강한 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서 인슐린 염색이 관찰되었고, PDX-1 발현은 주변 세포에서보다 인슐린 생산 세포에서 더 낮았다 (도 18d). 니슬을 공급받은 건강한 마우스에서는 리프로그래밍된 세포가 보이지 않았다 (도 18c).
리프로그래밍된 세포의 생리를 보다 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 마우스 장 절편에서 크로모그래닌 A (ChrA) 및 인슐린에 대해 공동으로 염색시켰다. ChrA는 보통 신경내분비 세포, 장내분비 세포에 의해 및 분비 과립 중 섬 β-세포에서 발현된다. 일부 경우에, 인슐린 염색은 ChrA 염색 (적색)과 중복되어 나타났고 (도 18e), 관찰된 인슐린 생산 세포 중 대략 80%에서 ChrA는 같은 세포로 국소화되지 않았다 (도 18f). 도 18e 및 f는 정상적인 장내분비 세포 (어떤 인슐린 염색도 나타내지 않는 ChrA 양성인 것), 인슐린 생산 (인슐린 염색) 세포를 나타낸다. 인슐린 생산 세포에 아주 가깝게 일반 장내분비 세포가 존재한다는 것은, 장내분비 세포가 인슐린 생산 세포로 일부 전환된다는 것에도 불구하고 장내분비 기능성은 전체 동물에 보존된다는 것을 제안하는 것이다. 본 발명자들은 리소자임이 인슐린과 함께 공존한다는 것을 관찰하지 못했는데 (도 18g), 이는 리프로그래밍된 세포가 파네트 세포가 아니라는 것을 제안하는 것이다. 인슐린 및 수크라제 이소말타제의 공발현 (SI, 도 18h)은 리프로그래밍된 세포가 그의 흡수 능력을 유지한다는 것을 나타낸다.
니슬-GLP-1이 2마리의 T1DM 설치류 모델에서 혈중 글루코스 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있었다는 것을 나타내는 데이터 (도 17b 및 21)와 함께, 건강한 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스의 혈중 글루코스 (도 17c) 또는 체중 (도 20A-B)에 있어서 어떤 변화도 없음을 나타내는 데이터는 상기 접근법이 효과적이고 안전한 당뇨병 치료법 (비-당뇨병계와 유사한 인슐린 동력학적 성질을 가지며 글루코스 반응성인 것 (도 17d))일 수 있다는 것을 제안하고, 즉, 비록 혈청 인슐린 수준을 강하시키는 하지만, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서는 건강한 마우스에서와 같은 타이밍으로 인슐린 수준 변화가 일어난다. 본 연구에서 달성된 리프로그래밍율 예측 (이는 하기 "리프로그래밍된 세포의 개수 계산 및 예측"에서 상세히 설명)은 리프로그래밍된 세포 개수가 건강한 마우스 췌장 중 β-세포 개수의 대략 82% 정도가 될 것이라는 것을 나타낸다. 이러한 수치는 잠재적으로는 마우스가 일일 조건하에서는 정규화된 혈중 글루코스 수준을 보일 수 있지만, 유발성이 더 큰 내당능 검사 조건하에서는 건강한 마우스 혈당 대조군보다 약간 더 적은 수준을 보일 수 있는 이유를 설명한다. 본원에서 마우스에 대하여 제시된 것과 같은 결과를 얻기 위해서 인간 환자가 매일 섭취해야 하는 박테리아 양의 예측치는, 현재 시판되고 있는 처방없이 살 수 있는 프로바이오틱 제제 중에 존재하는 박테리아의 양을 고려해 볼 때, 1일 대략 5-15 g 정도가 되었다. 그러나, 콜로니 형성 개수가 더 많을 경우, 1일 섭취량을 50 mg 정도로 줄일 수 있다.
상기 접근법과 함께 고려해야 할 사항은 장에서 새롭게 생성된 β-유사 세포에 대한 면역 반응이 유도될 가능성이 있다는 점이 될 것이다. 다른 재생 접근법에서 그러하였듯, 상기와 같은 경우가 발생될 가능성은 현저히 높다. 그러나, 상기 세포의 생리 (ChrA를 거의 발현하지 못하며, PDX-1 발현은 상대적으로 낮음)는 β-세포와 완전히 다르고, 따라서, 상기 세포는 면역계에 의해 검출되지 못할 수도 있다. 추가로, 본 연구에서 마우스를 처리했던 것과 같이 매일 GLP-1을 분비하는 박테리아로 환자를 처리하고자 한다면, 새로 형성된 β-유사 세포의 면역학적 파괴에도 불구하고, 아마도 인슐린-분비 세포의 영구적인 재생을 통해서 혈중 글루코스는 연속적으로 감소될 수 있을 것이다. 심지어 46일 후에도 (췌장 β 세포의 면역 파괴를 제시하는) NOD 마우스에서의 보호 효과를 시사하는 본 발명자들의 데이터에 비추어 인간 상피 세포를 대략 매 2일마다 대체한다고 감안해 볼 때, 상부 장에서 리프로그래밍된 세포에 대한 면역계의 유의적인 반응은 없을 수도 있다. 그러나, 그러한 공격이 존재한다면, 점막 표면에서는 염증이 영구적으로 발생될 수 있다. 상기 접근법의 면역학적 효과를 측정하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
본 발명자들은 본원에 제시된 데이터로부터, 당뇨병 마우스에게 니슬-GLP-1을 공급하는 것이 글루코스-반응성 인슐린 생산을 유발할 수 있고, 이로써 혈중 글루코스 수준을 현저히 감소시킬 수 있다라고 결론지었다. 비록 더 많은 특징 규명이 요구되기는 하지만, 인슐린 분비 기전은 리프로그래밍된 장 세포로부터 유도되는 것으로 보인다. 이러한 세포는 PDX-1을 거의 발현하지 않고, 단지 그 중 일부는 인슐린 이외에 ChrA를 발현한다는 점에서 대다수의 췌장 β-세포와는 완전히 다르다. 마우스에게 β-세포 인슐린 분비를 자극시키지 못하는 불활성 형태의 GLP-1을 공급하고, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스가 니슬만을 공급받은 마우스 또는 어떤 박테리아도 공급받지 못한 마우스와 동일한 수준으로 췌장 인슐린을 생산한다고 가정해 볼 때, 상기 접근법이 남은 β-세포로부터 인슐린 생산을 증가시킬 수 있는 가능성은 없다. 니슬-GLP-1을 공급받은 건강한 마우스로부터 얻은 결과에 비추어 고려해 볼 때, 상기 증거는 본 치료법이 비록 비-당뇨병에 사용될지라도, 안전할 것이라는 것을 제안한다. 추가 연구를 통해 인슐린 생산 세포의 생리와, 본 치료법의 상세한 장기간의 약동학적 성질이 보다 면밀하게 조사될 것이다.
물질 및 방법
플라스미드 구축
달리 언급되지 않는 한, 모든 화학 물질과 시약은 VWR 인터내셔널(VWR International: 미국 펜실베이니아주)로부터 구입하였다. 모든 클로닝은 표준 기법을 사용하여 수행하였다 (문헌 [Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular cloning:a laboratory manual. 3rd edn, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)]). 앞서 기술된 바와 같이 fliC 프로모터의 제어하에 세포-투과 펩티드 (CPP)에 융합된 glp -1(1-37)을 발현하도록 플라스미드를 구축하여 pFD-GLP를 제조하였다 (문헌 [Duan, F. & March, J. C. Interrupting Vibrio cholerae infection of human epithelial cells with engineered commensal bacterial signaling. Biotechnol Bioeng 101(1): 128-34. (2008)]). 서열 6XHis-EK-glp -1(1-37)-CPP를 합성적으로 제조하였다 (IDT: 미국 아이오와주 코랄빌). 고충실도 PCR (스트라테이진)을 통해 상기 단편을 pBluescript-KS로 삽입함으로써 pBluescript-GLP를 제조하였다. 생성된 벡터는 서열: 5'UTR-Flic20-6XHis-EK-glp -1(1-37)-CVV를 포함하였다. 고충실도 PCR에 의해 상기 서열을 (fliC의 3'UTR을 포함하는) pKS121로 클로닝하여 구축물: 5'UTR-Flic20-6XHis-EK-glp -1(1-37)-CPP-3'UTR을 수득하였다. pFD-벡터를 수득하기 위해, 고충실도 PCR을 사용하여 pFD-GLP로부터 5'UTR-FLIC20-6XHis-EK 서열을 클로닝하였다. PCR 단편을 pKS121로 클로닝하여 구축물: 5'UTR-Flic20-6XHis-EK-3'UTR을 수득하였다. pKS104 및 pKS121은 핀란드 유니버시티 오브 헬싱키의 베니타 베스터룬트-윅스트롬으로부터 흥쾌히 기증받았다.
확립된 방법을 사용하여 천연 fliC 프로모터의 제어하에 glp -1(1-37)-CPP 염색체 삽입을 하기 위해 구축물 pFD-GLPC를 제조하였다 (문헌 [Datsenko, K. A. & Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645 (2000)]). 사용된 클로닝 단계 및 프라이머에 관한 상세한 설명에 따라 구축물 지도를 본원 하기와 같이 작성하였다. 간략하면, 1단계 불활성화를 사용하여 니슬 염색체 중 fliC 프로모터 영역의 하류에 fliC 대신 Flic20-6XHis-EK-glp -1(1-37)-CPP 유전자를 삽입하였다. 본 발명자들은 니슬 염색체 중 fliD 유전자를 넉 아웃시켰다. 상기 기법을 3가지 플라스미드, (클로람페니콜 내성을 부여하는) pKD3, (카나마이신 내성을 부여하는) pKD4, 및 (암피실린 내성을 부여하는) pKD46을 사용하였다 (문헌 [Datsenko, K. A. & Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645 (2000)]). 염색체 삽입 후 생성된 균주를 니슬-GLP-1이라고 명명하였다.
웨스턴 블롯
앞서 기술된 바와 같이 현재 시판되는 프로바이오틱 뮤타플로르(Mutaflor)™로부터 이. 콜라이 니슬 1917 (EcN)을 수득하였다 (문헌 [Duan, F. & March, J. C. Interrupting Vibrio cholerae infection of human epithelial cells with engineered commensal bacterial signaling. Biotechnol Bioeng 101(1): 128-34. (2008)]). pFD-벡터, pFD-GLP를 포함하는 EcN 및 pFD-GLPC로부터의 염색체 삽입물을 포함하는 니슬을 24 h 동안 225 rpm으로 진탕시키면서, 37℃하에 LB 중에서 성장시켰다. 24 h 후, 박테리아 모두를 원심분리하였다. 상청액을 여과하였다 (0.2 ㎛, PALL 라이프 사이언시즈(PALL Life Sciences)). LB를 이용하여 무세포 배양 배지 (CFM)를 동일하게 OD600으로 희석시키고, 10 ng/mL 류펩틴, 0.04 mM PMSF 및 5 ng/mL 아프로티닌을 첨가하여 프로테아제를 억제시켰다. 얼음상에서 30 min 동안 10% 트리클로로아세트산정 (TCA, VWR)을 이용하여 정화된 상청액 (14 mL)을 침전시키고, 빙냉 에탄올/에테르 (1:1) 중에서 펠릿을 세척하였다. 상청액 펠릿을 진공하에서 건조시키고, 50 ㎕ 샘플 완충제 (2% SDS, 50 mM 트리스 (pH 6.8), 20% 글리세롤, 10% 머캅토에탄올, 브로모페놀 블루) 중에 용해시키고, 95℃에서 5 min 동안 끓였다. 프로테아제 억제제 (10 ng/mL 류펩틴, 200 μM PMSF 및 5 ng/mL 아프로티닌)를 포함하는 500 ㎕ 버그버스터 마스터 믹스(BugBuster Master Mix)를 사용하여 완만하게 와동시킴으로써 세포 펠릿을 실온에서 버그버스터 마스터 믹스 중에 (14 mL 배양물로부터) 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 실온에서 10-20 min 동안 저속 설정하에 진탕 플랫폼 (VWR: 미국 캘리포니아주 브리스틀) 상에서 인큐베이션시켰다. 125 ㎕ 5X 샘플 완충제를 각 샘플에 첨가한 후, 95℃에서 10 min 동안 끓였다.
GLP-1 발현량 및 분비량을 예측하기 위해, 표준 웨스턴 블롯팅 기법을 사용하였다. 간략하면, 50 ㎕ 샘플을 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 이모빌론-P(Immobilon-P)SQ 전달 막 (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌러리카)) 상에 블롯팅하였다. 막을 마우스 항-his (GE 헬쓰(GE health: 미국 뉴저지주 피스카타웨이))에 대하여 1:1,000으로 프로빙하였다. 막을 HRP-컨쥬게이트된 항-마우스 IgG (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences: 미국 펜실베이니아주 피츠버그))와 함께 인큐베이션시키고, 증강 화학발광 (피어스(Pierce: 미국 일리노이주 록퍼드))에 의해 현상시키고, X선 필름 (피닉스(Phoenix: 미국 노스캐롤라이나주 캔들러)) 상에 노출시켰다.
마우스 콜로니 형성 실험
본 연구에서 사용되는 마우스는 모두 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory: 미국 메인주 바 하버)로부터 구입하고, 코넬 유니버시티 베터러너리 스쿨(Cornell University Veterinary School)에 있는 이스트 캠퍼스 리서치 퍼실리티(ECRF: East Campus Research Facility)에서 하우징하였다. 연구는 코넬 유니버시티 IACUC(Cornell University IACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.
STZ -모델
스트렙토조토신 (STZ) (시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스))은 가하기 직전에 얼음 냉각된 0.1 M 시트르산 나트륨 완충제 (pH 4.2)에 용해시켰다. 베타-세포 아포프토시스를 유도하기 위해 4개 군을 이루는 6-8주령된 C57BL/6J (B6) 수컷 마우스에 체중 1 kg당 40 또는 50 mg STZ를 연이어 5일 동안 매일 복강내 주사하여 투여였다. 시트르산 나트륨 주사를 맞은 마우스로 이루어진 또 다른 군을 대조군으로서 사용하였다. 최종 주사 후 3일 경과하였을 때, 바이엘 브리즈 혈중 글루코스 측정용 스트립 (바이엘 헬쓰케어 LLC(Bayer Healthcare LLC: 미국 인디아나주 미셔워커))이 장착된 브리즈(Breeze)® 2 혈중 글루코스 모니터링 시스템 (바이엘 헬쓰케어 LLC: 미국 인디아나주 미셔워커)에 의해 동물의 혈중 글루코스 수준을 측정하였다. 당뇨병 글루코스 수준 (>250 mg/dL)에 도달할 때까지 매 3마다 혈중 글루코스 수준을 모니터링하였다. 당뇨병 혈중 글루코스 수준에 도달하지 못한, STZ로 처리된 마우스는 본 연구에서 사용하지 않았다.
고혈당증이 확립된 후, 18 h 동안 마우스에게 클로람페니콜로 처리된 (1 g/ℓ) 음용수를 제공하여 상재성 통성 박테리아를 제거하였다. LB 배지 중 1:500으로 희석된 밤새도록 배양된 배양물의 희석액으로부터 pFD-GLPC (니슬-GLP-1)로 염색체적으로 변형된 니슬 균주를 클로람페니콜 존재하에 OD600=1까지 성장시켰다. 1,000xg로 3 min 동안 원심분리하여 박테리아를 수집하였다. 생성된 펠릿을 1% 수크로스를 포함하는 200 ㎕ 멸균 LB에 재용해시켰다. 클로람페니콜 처리 후, 1% 수크로스를 포함하며, 109 CFU (OD600=20)의, 따로따로 루리아 브로쓰(Luria broth)에서 성장시킨 니슬 균주 (니슬 또는 니슬-GLP-1)를 함유하는 LB를 체중 25 g당 50 ㎕로 하여 마우스에 공급하였다. 공급된 박테리아 부피를 마우스 체중에 의해 정규화하였다. 모든 니슬 균주를 공급받는 마우스에 실험을 수행하는 동안 내내 1일 2회에 걸쳐 니슬을 공급하였다. 매 7 내지 10일마다 모든 마우스의 체중 및 글루코스 수준을 측정하였다. 대부분의 경우에서, 공복 글루코스 수준을 측정하였다. 마우스의 스트레스 수준을 최소화시키기 위해 상기 측정은 간격을 두고 수행하였다.
내당능 검사 및 ELISA
마우스를 10 h 동안 금식시키고, 체중을 측정하고, 헤파린 처리된 마이크로-헤마토크릿 커필러리 튜브스(Micro-Hematocrit Capillary Tubes) (피셔(Fisher: 미국 펜실베이니아주))를 사용하여 꼬리 정맥으로 혈액 샘플을 수집하였다. 이어서, 체중 1 kg당 25 mg 글루코스를 복강내로 주사하고, 0.5, 1, 1.5 h째에 혈액 샘플을 채취하였다. 브리즈® 2 혈중 글루코스 모니터링 시스템을 이용하여 혈장 글루코스를 측정하였다. 제조사의 설명서에 따라 래트/마우스 인슐린 ELISA 키트 (밀리포어: 미국 매사추세츠주)를 이용하여 혈장 인슐린을 측정하였다.
박테리아 계수
18 h 동안 6 내지 8주령된 C57BL/6J (B6) 수컷 마우스에게 음용수 중 클로람페니콜 (1 g/ℓ)을 제공하여 상재성 통성 박테리아를 제거하였다. 니슬 균주 (니슬 및 니슬-GLP-1)의 밤새도록 배양된 배양물을 LB 배지 중에 1:500으로 희석시키고, OD600=1까지 성장시켰다. 1,000xg로 3 min 동안 원심분리하여 박테리아를 수집하였다. 생성된 펠릿을 1% 수크로스를 포함하는 멸균 LB에 OD600=20까지 재현탁시켰다. 클로람페니콜 처리 후, 1% 수크로스를 포함하며, (1일 2회에 걸친 동물 1마리당 109 CFU의 생성물 용량을 위해) 농축된 재현탁액을 함유하는 LB를 체중 25 g당 50 ㎕로 하여 경구 위관 영양법에 의해 마우스에 공급하였다. 20일 동안 공급한 후, 마우스를 3일 동안 새 케이지로 옮겨 놓았다. 새 케이지로부터 대변을 수집하고, 마우스를 안락시켰다. 각 처리군으로부터 3마리 이상의 마우스를 절개하고, 그의 GI 관을 제거하였다. GI 관을 2조각 (상부 GI-소장 및 하부 GI-대장)으로 절단하였다. 한쪽을 따라 하부 GI를 개봉하고, 살살 스크랩핑하고, 1XPBS로 세척하여 대변을 제거하였다. 중량을 측정하기 전에는 상부 GI를 세척하거나 스크래핍하지는 않았다. 상부 및 하부 GI의 중량을 각각 측정하고, 4 mL의 신선한 LB 배지 중에 균질화시켰다. 일련으로 희석하여 상응하는 항생제를 포함하는 맥콘키 아가(MacConkey Agar) 플레이트 상에 균질화된 조직을 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고, 그의 콜로니를 계수하였다.
면역조직화학법
표준 프로토콜에 따라 CO2를 사용하여 본 연구에서 사용되는 처리된 마우스 모두를 안락사시켰다. 내당능 검사 후 희생된 마우스의 장 및 췌장 조직을 밤새도록 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고, 1xPBS를 이용하여 3회에 걸쳐 세척하고, 70% 에탄올 중에 침지시켰다. 이어서, 고정된 조직을 절개하였다.
파라핀을 제거한 후, 고정된 조직 슬라이드를 IHC-테크(IHC-Tek)™ 에피토프 복구용 용액 (IHC 월드(IHC World: 미국 메릴랜드주 우드스탁)) 중에서 증기처리하고, 10 min 동안 메탄올 중 0.5% 과산화수소 (피셔: 미국 펜실베이니아주 피츠버그) 중에 침지시켜 내인성 퍼옥시다제를 차단시켰다. 0.01 M PBS (pH 7.2) 중에서 세척한 후, 10% 표준 차단용 염소 혈청 (인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)을 습윤 챔버에서 실온하에 30 min 동안 가하였다. 1x 카제인을 포함하는 PBS (벡터(Vector: 미국 캘리포니아주 벌링게임)) 중에서 1:50으로 희석된 토끼 항-인슐린 (H-86, 산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology))을 차단된 샘플에 가한 후, 습윤 챔버에서 37℃하에 1.5 h 동안 인큐베이션시켰다. PBS 중에서 4x 세척한 후, PBS 중 1:200으로 희석된 비오티닐화된 2차 항체 염소 항-토끼 (벡터)를 습윤 챔버에서 실온하에 20 min 동안 샘플에 가하였다. 샘플을 습윤 챔버에서 실온하에 20 min 동안 스트렙트아비딘 퍼옥시다제 (인비트로겐)와 함께 인큐베이션시키고, PBS로 3x 세척하였다. 샘플을 실온에서 AEC 색원체/기질 용액 (인비트로겐)과 함께 인큐베이션시켰다. 대략 5-15 min 동안 일반 광현미경하에서 발색을 모니터링하였다. 증류된 H2O 세정제를 사용하여 반응을 종결시켰다.
5 min 동안 수돗물로 세정하기 전 30초 동안 일부 장 조직 및 췌장을 헤마톡실린 (피셔)으로 대조염색시켰다. 수성 봉입제 플루오로마운트(Fluoromount) (피셔)를 사용하여 샘플을 봉입시켰다. 일반 광현미경 (라이카(Leica: 미국 일리노이주 밴녹번))하에서 컬러 카메라로 사진 촬영하였다. 이미지 J 소프트웨어(NIH-NCBI)에 의해 염색된 췌장 조직 사진을 분석함으로써 적색 착색으로부터 추정되는 바에 따른 β-세포가 차지하는 범위(%)를 구하였다.
면역형광
파라핀 면역형광 -인슐린, PDX -1, ChrA , 리소자임 및 SI
60일 동안 니슬 균주 (니슬 및 니슬-GLP-1)를 공급한 희생된 마우스의 장 및 췌장 조직을 밤새도록 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고, 1xPBS를 이용하여 1xPBS로 3회에 걸쳐 세척하고, 70% 에탄올 중에 침지시켰다. 이어서, 고정된 조직을 절개하였다.
파라핀을 제거한 후, 고정된 조직 슬라이드를 0.01 M 시트레이트 완충제 중에서 증기처리하였다. 0.01 M PBS (pH 7.2) 중에서 세척한 후, 10% 표준 차단용 당나귀 혈청 (산타 크루즈 바이오테크놀러지: 미국 캘리포니아주)을 습윤 챔버에서 실온하에 1 h 동안 가하였다. 1x 카제인을 포함하는 PBS (벡터: 미국 캘리포니아주 벌링게임) 중에서 1:50으로 희석된 토끼 항-인슐린 (산타 크루즈 바이오테크놀러지: 미국 캘리포니아주) 및 1:500으로 희석된 염소 항-PDX-1 (어빔(Abeam: 미국 매사추세츠주 케임브리지)), 1:50으로 희석된 항-염소 ChrA, 항-염소 리소자임, 또는 항-염소 수크라제 이소말타제 (SI) (산타 크루즈 바이오테크놀러지: 미국 캘리포니아주)를 차단된 샘플에 가한 후, 습윤 챔버에서 4℃하에 밤새도록 인큐베이션시켰다. PBS 중에서 4x 세척한 후, PBS 중에 1:200으로 희석된 형광 색소-컨쥬게이트된 2차 항체 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 488 당나귀 항-토끼 IgG 및 알렉사 플루오르® 555 당나귀 항-염소 IgG (인비트로겐)를 습윤 챔버에서 실온하에 1.5 h 동안 샘플에 가하였다. PBS 중에서 3x 세척한 후, 300 nM DAPI 염색용 용액 (인비트로겐)을 3분 동안 샘플과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 프로롱® 골드(ProLong® Gold) 안티페이드 시약(antifade reagent) (인비트로겐)으로 봉입시켰다. 각 형광발색단에 대해 적절한 여기 파장을 이용하여 표본을 즉시 조사하였다. 자이스(Zeiss) 710 공초점 현미경 (자이스: 독일 예나)을 사용하여 영상을 촬영하였다.
동결절편 면역형광 -- Glp -1
10일 동안 니슬 균주를 공급받은 마우스의 장 및 췌장을 수거하고, OCT 화합물 중에서 급속 냉동시키고, 동결절편화 (8 μM)시켰다. 슬라이드를 1 h 동안 대기 건조시키고, 5 min 동안 빙냉 아세톤 중에서 고정시켰다. 밤새도록 대기 건조시킨 후, 슬라이드를 PBST (0.05% 트윈(Tween)) 중에서 3x세척으로 세척하였다. 하기 플로트콜은 M.O.M.™ 키트 염색 방법 (벡터)으로부터 변형된 것이었다. 15 min 동안 0.1% 트리톤(Triton) X-100이 세포에 투과되도록 한 후, PBS 중에서 2x 세척하였다. M.O.M.™ Ig 차단용 시약의 작동 용액 중 10% 표준 당나귀 혈청(산타 크루즈 바이오테크놀러지: 미국 캘리포니아주)을 습윤 챔버에서 실온하에 1 h 동안 가하였다. 절편을 PBS 중에서 각각 2 min 동안 2X 세척하였다. 조직 절편을 M.O.M.™ 희석제의 작동 용액 중에서 5 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 M.O.M.™ 희석제 중 1:100으로 된 토끼 항-GLP-1(1-19) (어빔)와 함께 37℃에서 30 min 동안, 이어서, RT에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. PBST 중에서 2X 세척하고, 이어서, PBS 중에서 4X 세척한 후, PBS 중에서 1:200으로 희석된 형광 색소-컨쥬게이트된 2차 항체 알렉사 플루오르® 488 당나귀 항-토끼 IgG 및 알렉사 플루오르® 555 당나귀 항-염소 IgG (인비트로겐)를 습윤 챔버에서 실온하에 1 h 동안 가하였다. 이어서, PBST 중에서 3X 세척한 후, 샘플을 3분 동안 300 nM DAPI 염색용 용액 (인비트로겐) 중에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 PBS 중에서 3X 세정하고, 프로롱® 골드 안티페이드 시약 (인비트로겐)으로 봉입시켰다. 각 형광발색단에 대해 적절한 여기 파장을 이용하여 표본을 즉시 조사하였다. 자이스 710 공초점 현미경을 사용하여 사진 촬영하였다.
리프로그래밍된 세포의 개수 계산 및 예측
니슬- GLP -1을 공급받은 마우스 중의 리프로그래밍된 세포 개수 측정을 위한 계산
마우스 1마리당 1 x 106개의 베타 세포 (문헌 [Bock, T., Svenstrup, K., Pakkenberg, B. & Buschard, K. Unbiased estimation of total beta-cell number and mean beta-cell volume in rodent pancreas. Apmis 107, 791-799 (1999)]) 및 상부 장 중 1.9 x 107개의 세포/㎠ (문헌 [Cheng, H. & Bjerknes, M. Cell production in mouse intestinal epithelium measured by stathmokinetic flow cytometry and Coulter particle counting. Anat Rec 207, 427-434, doi: 10.1002/ar.1092070305 (1983)])라고 가정하고, 본 발명자들은 마우스 상부 장의 예측 표면적 (십이지장 + 공장, 332.4 ㎠, 문헌 [Casteleyn, C, Rekecki, A., Van der Aa, A., Simoens, P. & Van den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Anim 44, 176-183, doi:10.1258/la.2009.009112 (2010)])에 리프로그래밍된 세포의 예측 비율(%) (0.00013)을 곱하고, 여기에 세포/㎠를 곱하여 건강한 마우스에서 베타 세포 개수 중 대략 82%가 리프로그래밍된 세포임을 예측할 수 있었다.
마우스 실험에 기초한 용량 예측을 위한 계산
본 발명자들은 본 실시예에 기록된 실험에서 1일 2회에 걸쳐 109 cfu/mL로 마우스에 공급하였다. 이는 마우스 체중 1 kg당 8 x 1010 CFU와 같았다. 상업적으로 이용가능한 바, 프로바이오틱 보충제는 4.0 x 1011 CFU/g인 것으로 하고, 인간 체중 범위를 소아 경우의 25 kg 내지 성인 경우의 75 kg인 것으로 하면, 이는 5-15 g/d의 1일 용량을 의미할 것이다. 그러나, (보고되어 있는 바와 같이 (문헌 [Rao, S. et al. Toward a live microbial microbicide for HIV: Commensal bacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide. Proc Natl Acad Sci USA 102, 11993-11998 (2005)] 참조) 콜로니 형성율이 100배 더 높기 때문에, 이때 용량은 50-150 mg/d가 될 것이다.
6.11. 실시예 11: GLP -1을 분비하는 공생 박테리아를 비-비만 당뇨병 ( NOD ) 마 우스에게 공급함으로써 얻게 되는 효과
본 실시예는 GLP-1 (1-37)을 분비하는 공생 박테리아를 유전적으로-실현된 당뇨병 마우스 (비-비만 당뇨병, NOD)에게 공급함으로써 얻게 되는 효과를 입증한다. 본 발명자들은 NOD 마우스에게, 모의 펩티드를 발현하는 이. 콜라이 니슬 1917 (니슬), GLP-1(1-37)을 분비하는 니슬 (니슬-GLP-1), 또는 박테리아를 함유하지 않는 배지를 46일 동안 공급하였다. 그 결과, 오직 배지만을 공급받은 대조군 NOD 마우스 (p=0.0003), 또는 니슬을 공급받은 마우스 (p=0.0008)와 비교하였을 때, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서 혈중 글루코스 수준은 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 추가로, 니슬-GLP-1 마우스의 소변 배설량은 훨씬 더 낮은 것으로 관찰되었다. 니슬을 공급받은 마우스 또한 오직 배지만을 공급받은 마우스보다 유의적으로 더 낮은 혈중 글루코스 수준을 보였다 (p=0.01). 본 연구에서 니슬을 공급받은 마우스 및 대조군 마우스는 외양상 건강하지 않았고, 통상 혈중 글루코스 수준은 400 mg/dL가 넘는 반면, 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스 (이 또한 외양상으로는 건강해 보이지는 않았음)의 혈중 글루코스 수준은 46일 동안에 걸쳐 160-250 mg/dL 범위였다.
도입
1형 당뇨병 (T1DM) 연구를 위한 표준 모델 유기체 중 하나를 고려해 볼 때, NOD 마우스는 췌장 베타 세포 뿐만 아니라, 신체 전역의 다른 내분비계를 파괴시키는 유전적 결함을 보유한다. T1DM과 유사한 병적 이상 이외에도 다른 전신성 병적 이상을 보유하기 때문에, 표적에서 벗어난 효과로 인해 T1DM 연구에 대해서는 결코 이상적일 수 없다. 이러한 한계에도 불구하고, 이는 여전히 당업계에서는 조기 단계에 개념 작업을 증명하는 데 충분한 모델로서 간주되고 있다.
본 실시예의 경우, 펩티드 GLP-1(1-37)을 장 상피 세포로 전달하기 위해 공생 박테리아를 사용하는 것이 NOD 마우스에서 혈중 글루코스 수준에 대하여 미치는 효과에 관하여 조사하였다.
실험 방법
코넬 유니버시티 IACUC에 의해 승인된 프로토콜에 따라 본 실험에서 사용된 NOD 암컷 마우스 (NOD/ShiLtJ 마우스)를 처리하였다. 코넬 유니버시티 베터러너리 스쿨에 있는 이스트 캠퍼스 리서치 퍼실리티 (ECRF)에서 모든 마우스를 하우징하였다. 모든 마우스를 잭슨 래버러토리(미국 메인주 바 하버)로부터 구입하였다. 바이엘 브리즈® 혈중 글루코스 측정용 스트립 (바이엘 헬쓰케어)이 장착된 브리즈® 2 혈중 글루코스 모니터링 시스템 (바이엘 헬쓰케어 LLC: 미국 인디아나주 미셔워커)을 통해 6주령된 NOD/ShiLtJ 암컷 마우스 (n=5)로 된 3개의 군의 혈중 글루코스 수준을 모니터링하였다. 당뇨병 글루코스 수준 (>250 mg/dL)에 도달할 때까지 매 5 내지 7일마다 혈중 글루코스 수준을 측정하였다. 당뇨병 혈중 글루코스 수준에 도달하는 데에는 12 내지 14주가 소요되었다. 고혈당 혈중 글루코스 수준에 도달하지 못한 마우스는 안락사시켰다.
고혈당증이 확립된 후, 18 h 동안 모든 마우스에게 클로람페니콜 (1 g/ℓ) 음용수를 제공하여 상재성 공생 박테리아를 제거하였다. 밤새도록 배양된 배양물로부터 니슬 균주 (니슬, 니슬-GFP-1)를 OD600=1까지 성장시키고, LB 배지 중에서 1:500으로 희석시켰다. 1,000xg로 3 min 동안 원심분리하여 박테리아를 수집하였다. 생성된 펠릿을 1% 수크로스를 포함하는 200 ㎕ 멸균 LB에 재용해시켰다. 클로람페니콜 처리 후, 1% 수크로스를 포함하며, 109 CFU (OD600=20)의 니슬, 니슬-GLP-1을 함유하거나, 어떤 박테리아도 함유하지 않는 (단지 수크로스만을 함유하는 멸균 배지) LB를 체중 25 g당 50 ㎕로 하여 경구 위관 영양법에 의해 마우스에 공급하였다. 첨가제 없이 균주만을 마우스에 단독으로 공급하였다. 일단 위단 영양법을 시작하고 나면, 마우스 케이지로부터 클로람페니콜 처리수를 제거하였다. 수크로스를 포함하는, 니슬 균주 또는 멸균 배지를 46일 동안 1일 2회에 걸쳐 경구 위관 영양법을 통해 공급하였다. 박테리아 공급을 개시한 지 11, 21, 30 및 46일째에 마우스 체중 및 혈중 글루코스를 측정하였다.
결과
NOD 마우스에게 니슬-GLP-1, 니슬 또는 박테리아를 함유하지 않는 것을 46일 동안 경구적으로 1일 2회에 걸쳐 공급하였다. 하기 표 1에는 본 실험에서 얻은 마우스의 생존 및 당뇨병 발병에 관한 데이터가 제시되어 있다. 모든 처리는 각각 5마리의 마우스로 출발하였다. 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스를 제외한 모든 마우스는 실험 전체 기간 동안에 걸쳐 고 수준의 소변을 배설하는 것으로 관찰되었다. 니슬-GLP-1을 공급받은 마우스에서도 소변 배설량의 수준이 상승한 것으로 나타나기는 하였지만, 다른 마우스의 정도까지는 아니었다.
니슬 균주 공급을 개시하기 전, 모든 마우스는 500 mg/dL를 넘는 혈중 글루코스 수준을 보이며, 고혈당증에 대하여 양성인 것으로 간주되었다. 도 21에는 처리군당 마우스의 공복 (6 h) 평균 혈중 글루코스 수준이 제시되어 있다. 니슬 및 니슬-GLP-1을 공급받은 두 마우스와 대조군 마우스 사이에는 유의적인 혈중 글루코스 강하가 있었다. 46일 경과 후, 니슬 공급은 대조군에 비하여 유의적인 효과가 있었고 (p=0.01), 니슬-GLP-1은 한층 더 현저한 효과가 있었다 (p=0.0003). 니슬-GLP-1과 니슬 사이의 차이 또한 유의적이었다 (p=0.0008). 모든 비교는, 등분산이라고 가정하고, 스튜던트 양측 t 검정을 사용하여 수행하였다 (n=4, 3 또는 2, 표 1 참조).
실험이 진행되는 동안 처리군 사이에서 또는 처리군 내에서도 마우스의 체중에 있어서는 어떤 유의적인 차이도 없었다. 모든 마우스의 체중은 일반적으로 시간이 경과함에 따라 감소하였다 (도 22).
결론
본 데이터를 통해 니슬 및 니슬-GLP-1, 둘 모두가 NOD 마우스의 혈중 글루코스 수준을 유의적으로 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, 상기 데이터는 매우 극소수의 마우스로부터 얻은 것이다. 46일째까지 각 군당 마우스는 오직 2마리씩만이 남아있었다. 그러나, 니슬-GLP-1 군 중의 마우스의 혈중 글루코스 수준은 다른 두 군보다 여전히 훨씬 더 낮았는데, 이는 NOD 마우스에서 증가할 수도 있는 임의의 리프로그래임된 세포에 대한 임의의 면역 반응이 이 시간 프레임 내에는 어떤 효과도 발휘하지 않았다는 것을 나타낸다.
본 실시예에서의 마우스 생존
표 1: 마우스 생존
처리군
 군당 마우스
마리수
 혈중 글루코스가 상승된 마우스의 마리수
 생존한 마우스의 마리수
11d 21d 30d 46d
니슬 5 4 4 3 3 2
니슬-GLP-1 5 4 4 3 3 2
대조군 5 3 3 3 3 2
본 발명은 본원에 기술된 구체적인 실시양태에 의해 그 범주로 제한하고자 하는 것은 아니다. 실제로, 본원에 기술된 것 이외에도, 상기 설명으로부터의 본 발명의 다양한 수정 및 변형이 당업자에게는 자명할 것이며. 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 수정 및 변형이 첨부된 특허청구범위 및 그의 등가물의 범주 내에 포함된다면, 본 발명은 이를 포함하는 것으로 한다.
각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 명시되어 있는 것과 같은 정도로 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
임의의 공개 문헌을 인용하는 것은 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대한 것이며, 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 공개 문헌에 우선하는 자격이 없다고 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> Cornell University March, John C. Duan, Faping <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING ENDOCRINE, GASTROINTESTINAL OR AUTOIMMUNE DISORDERS <130> 1258_5208PCT <150> US 61/393,618 <151> 2010-10-15 <150> US 61/539,121 <151> 2011-09-26 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Xaa Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa 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Claims (47)

  1. 신호 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 세포이며, 여기서
    a. 신호 서열은 숙주에서의 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하고,
    b. 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것이고,
    c. 신호 서열은 GLP-2, 그의 단편, 또는 그의 유사체, 또는 그의 조합인,
    재조합 세포.
  2. 신호 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 세포이며, 여기서
    a. 신호 서열은 숙주에서의 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하고,
    b. 재조합 세포는 장내 박테리아 또는 공생 박테리아로부터 유래된 것이고,
    c. 표적 핵산은 숙주의 제1 세포를 제2 세포로 리프로그래밍할 수 있는 포유동물 인자를 코딩하는 것인,
    재조합 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 숙주가 포유동물인 재조합 세포.
  4. 제2항에 있어서, 제2 세포가 β-유사 세포, 갑상선 세포, 간세포 또는 면역반응성 세포인 재조합 세포.
  5. 제2항에 있어서, 숙주의 제1 세포가 장 상피 세포인 재조합 세포.
  6. 제2항에 있어서, 제2 세포가 글루코스 반응성 인슐린 분비 세포인 재조합 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신호 서열이 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하는 것인 재조합 세포.
  8. 제7항에 있어서, 프로모터가 글루코스-반응성 프로모터인 재조합 세포.
  9. 제2항에 있어서, 신호 서열이 GLP-1, GIP, PDX-1, 하나 이상의 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 세포.
  10. 제2항에 있어서, 신호 서열이 GLP-1, PDX-1, GIP, GLP-2, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관작용성 장 폴리펩티드, 트레포일 인자, 세포 및 조직 복구 인자, 형질전환 성장 인자 β, 각질세포 성장 인자, 역평행 4α 나선형 다발 구조를 취하는 구조상 1군 시토카인, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EP0, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, IFNα/β, 구조상 2군 시토카인, TNF-패밀리 시토카인, TNFα, TNFβ, CD40, CD27, FAS 리간드, IL-1-패밀리 시토카인, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 p, 신경 성장 인자, 단쇄 α/β 분자를 포함하는 구조상 3군 시토카인, 표피 성장 인자-패밀리 시토카인, C-C 또는 C-X-C 케모카인, 인슐린-관련 시토카인, 구조상 4군 시토카인, 헤레귤린, 뉴레귤린, EGF, 면역글로불린-유사 도메인, 크링글 도메인, 하나 이상의 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 세포.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신호 서열 및 프로모터가 재조합 세포 중 플라스미드 상에서 코딩되는 것인 재조합 세포.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 프로바이오틱 박테리아로부터 유래된 것인 재조합 세포.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 박테로이데스(Bacteroides), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 프로테우스(Proteus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 및 코리네박테리움(Corynebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아인 재조합 세포.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 핵산이 숙주에서 생리학적 과정의 원하는 작용을 촉진시킬 수 있거나 또는 숙주에서 비-감염성 질환을 치료할 수 있는 포유동물 인자를 코딩하는 것인 재조합 세포.
  15. 제14항에 있어서, 비-감염성 질환이 자가면역 질환, 암, 내분비 질환, 위장관 질환, 암 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 세포.
  16. 제14항에 있어서, 비-감염성 질환이 당뇨병인 재조합 세포.
  17. 제16항에 있어서, 당뇨병이 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 또는 대사 증후군인 재조합 세포.
  18. 제14항에 있어서, 비-감염성 질환이 크론병, 비만, 페닐케톤뇨증, 단풍당뇨병증, 히스티딘혈증, 고혈당증, 당뇨병성 망막병증, 관상 동맥 심장 질환, 모세관간 사구체경화증, 신장병증, 신경병증, 사지 궤양 또는 괴저, 아테롬성동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 고단백혈증, 단백뇨증, 골다공증, 빈혈, 과지질단백질혈증, 케톤산증, 고트리글리세리드혈증, 락트산혈증, 심근병증, 윌슨병, 백질이영양증, 푸코시드축적증, 암, 화학요법-유도성 설사, 염증성 장 질환, 심실 및 심방 세동, 수술 후 기관 기능상실, 과민성 장 증후군, 간질성 방광염/방광 통증 증후군, 단장 증후군, 궤양성 대장염, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 세포.
  19. 제18항에 있어서, 암이 위장관 암, 위암, 담낭암, 위장관 기질 종양, 간암, 췌장암, 또는 결장암인 재조합 세포.
  20. 제14항에 있어서, 포유동물 인자가 장 손상 또는 수술 후 생리학적 과정의 원하는 작용을 촉진시키는 것인 재조합 세포.
  21. 제2항에 있어서, 숙주의 체순환 내로 흡수되지 않고 장 융모에 도달할 수 있는 재조합 세포.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터가 유도성 또는 구성적 프로모터인 재조합 세포.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터가 fliC 프로모터인 재조합 세포.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분비 태그를 추가로 포함하는 재조합 세포.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분비 태그가 fliC 분비 태그인 재조합 세포.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분비 태그가 알파-헤몰리신 (HlyA) 분비 태그인 재조합 세포.
  27. 제1항에 있어서, 세포-투과 펩티드 (CPP) 서열을 추가로 포함하는 재조합 세포.
  28. 제26항에 있어서, 신호 서열을 융합 단백질로서 발현하며, 여기서 융합 단백질은 신호 서열에 의해 코딩되는 신호 및 세포 투과 펩티드 서열에 의해 코딩되는 세포-투과 펩티드를 포함하는 것인 재조합 세포.
  29. 숙주에게 제2항의 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 숙주에서 당뇨병을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 표적 신호 서열이 질환-예방 인자의 발현을 자극시키거나 또는 당뇨병 유발 인자의 발현을 억제시키는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 당뇨병이 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 또는 대사 증후군인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 신호 서열이 환경 자극에 대한 반응으로 표적 핵산의 신호-의존성 발현을 조절하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 환경 자극이 글루코스인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 질환-예방 인자가 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  35. 제29항에 있어서, 표적 핵산이 숙주에서 혈중 글루코스 수준 감소를 촉진시키는 포유동물 인자를 코딩하는 것인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 표적 핵산이 숙주에서 혈중 인슐린 수준 증가를 촉진시키는 포유동물 인자를 코딩하는 것인 방법.
  37. 포유동물 숙주에게 제2항의 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주에서 장 세포를 또 다른 세포 유형으로 분화시키는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 또 다른 세포 유형이 β-유사 세포, 갑상선 세포, 간세포 또는 면역반응성 세포인 방법.
  39. 제38항에 있어서, β-유사 세포가 글루코스-반응성 세포인 방법.
  40. 제29항 또는 제37항에 있어서, 유효량의 재조합 세포를 투여하는 것인 방법.
  41. 제29항 또는 제37항에 있어서, 재조합 세포의 유효량이 약 104 CFU/kg 이상인 방법.
  42. 제29항 또는 제37항에 있어서, 재조합 세포를, 시너지 효과를 가지는 화합물과 함께 조합하여 투여하는 것인 방법.
  43. 제29항 또는 제37항에 있어서, 시너지 효과를 가지는 화합물이 DPP-4 억제제, GLP-2, GLP-1 효능제, 디메틸 술폭시드, 인슐린, 알파-글루코시다제 억제제, 프람린티드, 메글리티니드, 레파글리니드, 나테글리니드, 클로르프로파미드, 메트포르민, 술포닐우레아, 글리피지드, 글리부리드, 글리메피리드, 티아졸리딘디온, 그의 유사체, 그의 단편, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제29항 또는 제37항에 있어서, 신호 서열이 GLP-1, PDX-1, GIP, GLP-2, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관작용성 장 폴리펩티드, 트레포일 인자, 세포 및 조직 복구 인자, 형질전환 성장 인자 β, 각질세포 성장 인자, 역평행 4α 나선형 다발 구조를 취하는 구조상 1군 시토카인, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, EP0, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, IFNα/β, 구조상 2군 시토카인, TNF- 패밀리 시토카인, TNFα, TNFβ, CD40, CD27, FAS 리간드, IL-1-패밀리 시토카인, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 p, 신경 성장 인자, 단쇄 α/β 분자를 포함하는 구조상 3군 시토카인, 표피 성장 인자-패밀리 시토카인, C-C 또는 C-X-C 케모카인, 인슐린-관련 시토카인, 구조상 4군 시토카인, 헤레귤린, 뉴레귤린, EGF, 면역글로불린-유사 도메인, 크링글 도메인, 하나 이상의 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 제29항 또는 제37항에 있어서, 신호 서열이 GIP, GLP-1, GLP-2, PDX-1, 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합인 방법.
  46. 신호 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 세포를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 신호 서열은 GLP-1, GIP, PDX-1, 그의 단편, 그의 유사체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 숙주에서 장 세포를 글루코스-반응성 인슐린 분비 세포로 리프로그래밍하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 숙주가 고혈당이고, 그에 의해 재조합 세포를 고혈당 숙주에게 투여하는 것이 외인성 인슐린을 숙주 내로 치료적 투여하여야 하는 필요성을 감소시키거나 제거하는 것인 방법.
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