KR20230031895A - 면역 신호 전달 및/또는 장관 장벽 기능 및/또는 대사 상태 조절용 Amuc-1100 폴리펩타이드 변이체(polypeptide variants) - Google Patents
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Abstract
포유류에서 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 증가시킬 수 있고 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 조절 및/또는 촉진 및/또는 대사 상태를 유지 및/또는 복원시킬 수 있는 아케르만시아 무니시필라(Akkermansia municiphila)의 세포외(extracellular) 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 변이체가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 변이체 또는 이러한 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 숙주 세포는 장 점막 장벽의 향상된 물리적 온전성(physical integrity) 및/또는 개선된 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능 및 대사 상태로부터 이익을 얻는 다양한 증상(condition)을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 포유류(예: 인간)에서 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 조절 및/또는 촉진 및/또는 장 점막의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지 및/또는 복원 및/또는 증가 및/또는 포도당 및/또는 콜레스테롤(cholesterol) 및/또는 중성지방(triglyceride) 항상성을 유지, 복원 또는 개선시킬 수 있는 폴리펩타이드 및/또는 숙주 세포를 포함하는 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system), 장 점막 장벽, 의약품, 식품 또는 사료 조성물 분야에 관한 것이다.
장 점막 장벽의 투과성 또는 과투과성(hyperpermeability) 증가는 장과 관련된 질병, 자가면역질환, 알레르기, 암, 제2형 당뇨병, 비만, 우울증, 불안 등과 같은 여러 질환(disorder)과 증상(condition)에서 역할을 하는 것으로 생각된다. 상기 이유로, 포유류에서 위장관(GI, gastrointestinal tract)을 대상으로 하는 많은 증상(condition)의 병인에서 장 점막 장벽 기능 장애의 역할을 이해하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다.
정상적인 증상(condition)에서 장 점막 장벽은 영양분, 전해질 및 물의 흡수를 허용하고 유해 고분자, 미생물(micro-organism), 식이 및 미생물 항원(예: 식품 알레르기)에 노출되는 것을 방지하는 선택적 장벽 역할을 한다. 장 점막 장벽은 본질적으로 점액층과 기저층 상피 세포(여기서 '장 상피 세포(gut epithelial cells)'라 함)로 구성된다. 장 상피 세포는 기본적으로 두개의 장 상피 세포의 막 사이의 '물리적 접합(physical joints)'인 이른바 '밀착 연접(tight junctions)'에 의해 서로 밀접하게 연결되어 있다. 장 점막 장벽의 유지, 특히 장 상피 세포층의 물리적 온전성(physical integrity)의 유지(즉, 세포 사이의 밀착 연접 유지)는 병원성 미생물, 항원 및 기타 바람직하지 않은 물질(agents)이 장에서 혈류로 이동하는 것으로부터 숙주를 보호하는 데 중요하다.
장 점막 장벽은 또한 약1012 -1014개의 공생 미생물, 주로 혐기성 또는 약호기성 박테리아(microaerophilic bacteria)에 의해 심하게 집락형성(colonized)되어 있으며, 대부분은 숙주와 공생하며 산다. 상기 박테리아들은 여러 면에서 숙주에게 유익하다. 그들은 병원성 박테리아에 대한 보호를 제공하고 비타민 K와 비타민 B 복합체의 일부 성분을 합성함으로써 숙주에서 영양적인 역할(nutritional role)을 한다. 또한, 장 점막 장벽은 공생성(commensal) (즉, 유익한 박테리아)과 병원성 박테리아 및 기타 유해한 물질(agents)을 구별하기 위한 복잡한 '장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system)'을 발전시켰다. 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system )는 장 점막 장벽의 필수적인 부분이며, 장 점막 장벽 전체에 넓게 흩어져 있는 림프 조직 및 특수 면역 세포(즉, 림프구 및 형질 세포(plasma cells))로 구성된다. 건강한 피험자의 점막에서 자연적으로 집락형성하는 뮤신-분해성(mucin-degrading) 미생물 중 하나는 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)로서, 장관 장벽 기능(intestinal barrier function)을 증가시키는 것으로 나타났고(Everard et al., PNAS 110 (2013) 9066-71; Reunanen et al., Appl Environ Microbiol March 20 2015), 따라서 장 장벽 기능 저하와 관련된 질병에 영향을 미칠 수 있다.
특정 상황에서, 일반적으로 장 점막 장벽을 넘을 수는 없지만, 가까스로 통과할 수 있는 매우 다양한 감염성 유기체 또는 물질(agents)에 장 점막 장벽은 취약할 수 있다(예: 장 상피 세포 사이의 밀착 연접(tight junctions)으로 인한 틈을 통해). 장 점막 장벽을 통과하는 유기체 또는 기타 물질(agents)은 숙주의 질병 또는 기타 바람직하지 않은 증상(condition)(예: 알레르기)를 유발할 수 있다. 상기 질병의 예로는 비만, 대사증후군, 인슐린 결핍 또는 인슐린 저항성 관련 질환(disorder), 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 염증성 장 질병(IBD), 과민성 장 증후군(IBS), 포도당 불내성(glucose intolerance), 비정상적인 지질대사, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 심장 병리(cardiac pathology), 뇌졸중, 비알코올성 지방간 질환, 알코올성 지방간 질환, 고혈당증, 지방간, 이상지질혈증, 비만과 관련된 면역 시스템의 기능 장애(체중 증가), 알레르기, 천식, 자폐증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 신경 퇴행성 질환, 우울증, 기타 장벽 기능 저하와 관련된 질병, 세포 상처치유(wound healing), 행동 장애(behavioural disorders), 알코올 의존증, 심혈관 질환, 고콜레스테롤, 중성지방(triglycerides) 상승, 죽상동맥경화증, 수면무호흡증, 골관절염, 담낭질환, 암 등이 있다.
반대로, 위에서 언급한 질병뿐 만 아니라 음식 알레르기, 미숙아로인한 장의 미성숙, 방사선 노출, 화학 요법 및/또는 독소에 노출, 자가 면역 장애, 영양 실조, 패혈증 등과 같은 다른 증상(condition)은 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)(즉, 장 상피 세포 사이의 밀착 연접(tight junctions)을 야기함)을 변화시킬 수 있고, 결국 바람직하지 않은 미생물 또는 다른 물질(agents)이 숙주의 장 점막 장벽을 통과할 수 있게 한다.
지난 수년동안 상기 미생물 또는 물질(agents)를 표적으로 하는 여러 백신 및/또는 항체가 수년에 걸쳐 개발되었다. 그러나, 이러한 접근법은 이들 백신이나 항체가 몇몇 미생물 또는 물질(agents)들을 효과적으로 표적화하지 못하거나 근절시킬 수 없어 성공적이지 못하였다.
유해 미생물 및 기타 물질(agents)이 숙주의 장 점막 장벽을 통과하는 것을 방지 및/또는 장 점막 장벽의 과투과성을 방지하는 것을 목표로 하는 다른 접근법도 연구되었다. 예를 들어, 글루탐산(glutamic acid)을 포함하는 조성물은 장 점막 장벽의 과투과성과 관련된 증상(condition)을 예방 및/또는 관련 증상을 치료하기 위해 개발되었다(WO 01/58283). 스펠민(spermine), 스펠미딘(spermidine) 및 그 전구체(precursors)를 포함한 다른 물질들도 동일한 목적으로 사용되었다(Dorhout et al (1997). British J. Nutrition, pages 639-654). 장 점막 장벽 근처에 서식하는 GI 박테리아에 대한 유익한 효과를 촉진하기 위한 아라비녹실란(arabinoxylan)을 포함하는 제제 또한 장 점막 장벽을 조절하기 위한 목적으로 개발되었다(US2012/0230955).
WO2016177797은 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)으로부터 유도된 폴리펩타이드는, 즉, 폴리펩타이드 Amuc-1100, 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지, 복원 또는 증가시킬 수 있고, 포유류에서 포도당(glucose) 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성을 복원 또는 개선하거나, 특히 톨 유사 수용체 2(TLR2, toll-like receptor 2)와 상호작용 및/또는 TLR2 및/또는 NFK-B 의존 신호전달 경로를 조절함으로써, 포유류(예: 인간)의 장 점막 장벽 근처에 위치한 면역세포로부터 사이토카인(cytokine) 방출(예: IL-6, IL-8, IL-10)을 촉진함으로써 포유류의 대사 또는 면역 상태를 개선한다.
본 발명의 목적은 포유류(예: 인간)에서 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지 및/또는 복원 및/또는 향상시키고/또는 장 점막 장벽의 과투과성을 방지 및/ 또는 신규 또는 개선된 물질(agents) 및/또는 이러한 물질(agents)을 포함하는 조성물을 제공하는 것이고, 바람직하게는 이들을 이용하여 포유류에서 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성을 복원 및/또는 개선시키는 장 점막 장벽 및/또는 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성 불균형의 차선의 투과성과 관련된 질병 또는 증상(condition)을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 선택적 또는 추가적 목적은 포유류에서 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 조절 및/또는 촉진하는 데 적합한 추가 또는 개선된 물질(agents) 및/또는 상기의 물질(agents)을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)에서 장 면역 시스템 기능을 조절 및/또는 촉진 및/또는 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지 및/또는 복원 및/또는 향상시킬 수 있는, 포유류(예: 인간)에서 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성을 유지 및/또는 복원 및/또는 개선하는 폴리펩타이드 Amuc-1100의 먼 변이체(a distant variant)를 확인하였다. 상기는 이전 연구에서 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)는 Amuc-1100의 상동체를 가지고 있지 않다고 보고했기 때문에 놀라운 일이다(Xing et al. 2019; Genes & Genomics 41:1253-1264 참조).
임의의 이론에 구애됨이 없이, 본 발명의 폴리펩타이드의 유익한 효과는 포유류의 장 점막 장벽 근처에 위치한 면역 세포의 표면에 존재하는 TLR2 신호 전달 경로와 상호 작용하는 능력에서 기인하는 것으로 여겨진다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드가 면역세포의 표면에 존재하는 TLR2와 상호작용하고/또는 장 점막 장벽 근처에 위치한 면역세포에서 TLR2-신호전달 경로(signaling pathway)를 조절 및/또는 자극하여 상기 면역세포로부터 사이토카인(예: IL-6, IL-8 및 IL-10)의 분비를 자극할 수 있음을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드가 포유류 장 점막 장벽의 상피 투과 저항성(transepithelial resistance)을 조절 및/또는 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 증가된 상피 투과 저항 측정은 장 점막 장벽의 투과성 감소 지표로 작용하기 때문에, 본 명세서에 기재된 바와 같이 그들의 변이체(variants)을 포함하는 폴리펩타이드는 특히 상피 세포(epithelial cells)사이의 밀착 연접(tight junctions)에서 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 조절할 수 있는 것으로 생각된다.
이러한 효과들을 종합하면, 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능이 개선되거나 향상될 뿐만 아니라(예: 장 점막 장벽에서 사이토카인의 더 큰 방출), 특히 장 상피 세포 간의 연결 수준에서(즉, 세포 간의 밀착 연접(tight junctions)을 통해) 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 개선하거나 향상시키는 것으로 여겨진다.
또한, 본 발명에 따른 HFD를 먹인 마우스(HFD-fed mice)를 폴리펩타이드로 치료하면 음식물 섭취에 영향을 미치지 않으면서 체중 및 지방량(fat mass) 증가가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 폴리펩타이드를 사용한 치료는 또한 혈청 HDL-콜레스테롤의 현저한 감소와 LDL-콜레스테롤의 유사한 경향으로 HFD에 의해 유발되는 고콜레스테롤혈증을 교정할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드의 투여는 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila)의 Amuc-1100 폴리펩타이드와 동일하거나 더 나은 효능으로 포도당 불내성을 감소시킬 수 있다.
마지막으로, 메트포르민(metformin)은 아커만시아(Akkermansia)의 성장을 자극하는 것으로 알려져 있으므로(Lee H and Ko G,A ppl Environ Microbiol. 2014 Oct;80(19):5935-43), 따라서 본 폴리펩타이드와 유사한 기능을 가진 아커만시아(Akkermansia) 및 그 세포 외 펩타이드(extracellular peptides)는 임신성 당뇨병(gestational diabetes) 및 임신중독증(preeclampsia)에 대한 메트포르민과 유사한 효과를 가질 수 있다.
폴리펩타이드
본 발명은 상기 단리된 폴리펩타이드를 특징으로 하는 단리된 폴리펩타이드를 제공한다.
a) SEQ ID NO:9와 최소 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 서열 동일성을 가지며, (전체 길이에 걸쳐)
b) 적어도 다음과 같은 아미노산 잔기 세트 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7을 포함한다.
i. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 1, 2, 8, 20, 23 및/또는 27에 해당하는 위치의 R, S, I, S, A 및/또는 P(또는 이들의 보존적 치환);
ii. SEQ ID NO:9에서 각각 92, 93, 95, 97 및/또는 100에 해당하는 위치의 C, K, K, I 및/또는 T(또는 이들의 보존적 치환)
iii. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 105, 106, 107 및/또는 108에 해당하는 위치의 W, L, G 및/또는 F(또는 이들의 보존적 치환);
iv. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 126 및/또는 127에 해당하는 위치의 F 및/또는 E(또는 이들의 보존적 치환);
v. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 149, 150 및/또는 151에 해당하는 위치의 V, Y 및/또는 R(또는 이들의 보존적 치환);
vi. SEQ ID NO:9에서 각각 179, 181, 182, 184, 185, 188, 190 및/또는 191에 해당하는 위치의 P, E, I, F, Q, R, S 및/또는 V(또는 이들의 보존적 치환)
vii. SEQ ID: 9에서 각각 220, 222, 229, 230, 231, 234, 248, 258, 260, 262, 264, 172, 175, 279, 283, 및/또는 286 에 해당하는 위치의 P, P, P, A, A, P, G, T, A, E, A, P, Q, K, G 및/또는 E(또는 이들의 보존적 치환).
상기 정의 된 폴리펩타이드는 면역 신호 전달 및/또는 장관 장벽 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성에 영향을 미칠 수 있다. 바람직하게, 상기 鱉 
폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1의 서열 동일성이 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상인 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 본 명세서에 기재 된 바와 같이 폴리펩타이드는 톨 유사 수용체 2(TLR2)에 결합할 수 있다.
하나의 실시 예에서, 상기 정의된 폴리펩타이드는, 바람직하게는, 담체(carrier), 예를 들어, 생리학적으로 허용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 영양학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 조성물로 구성된다. 담체는 임의의 불활성 담체일 수 있다. 예를 들어, 적합한 생리학적 또는 약제학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는 잘 알려진 생리학적 또는 약제학적 담체, 완충제, 희석제 및 첨가제 등이 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재 된 폴리펩타이드 및 이의 변이체는 세포 내의 TLR2 신호 전달 경로를 자극하고, 세포로부터의 사이토카인(예: IL-6, IL-8, IL-10 등) 방출을 자극하며/또는 포유류, 예를 들어, 인간 세포의 상피 투과 저항성(TER)을 증가시키고/또는 예를 들어 마우스 또는 인간의 대사 또는 면역 상태 개선시킬 수 있다.
a)에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 또한 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 변이체의 아미노산 서열은 SEQID NO:9의 아미노산 서열과 25% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 폴리펩타이드의 변이체는 또한 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 삭제 또는 삽입을 통해 유도된 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 비해, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 내지 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 25, 20, 15 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9와 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% 서열 동일성을 가질 수 있으며, 예를 들어 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:9와 적어도 50% 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 선도 서열(leader sequence)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
하나의 실시 예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 다음을 포함한다.
- i)에 정의된 바와 같이 적어도 5개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- ii)에 정의된 바와 같이 적어도 4개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- iii)에 정의된 바와 같이 적어도 3개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- iv)에 정의된 바와 같이 적어도 1개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- v)에 정의된 바와 같이 적어도 2개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- vi)에 정의된 바와 같이 적어도 7개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환); 및/또는vii)에 정의된 바와 같이 적어도 15개(또는 적어도 12개)의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환)를 포함한다. 대안적으로 또는 동시에, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 폴리펩타이드는 구체적으로 상기 정의된 바와 같은 아미노산 잔기의 하기 세트를 포함할 수 있다.
-
i);
-
i) 및 vii);
-
i), ii), vi) 및 vii);
-
i), iii), iv), 및 vii);
-
i), ii), iii), iv), v), vi), vii).
대안적으로 또는 동시에, 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드는 예를 들어 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:9와 적어도 75%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
바람직한 실시 예에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9에서 28, 29, 35, 37, (40,) 71, 78, 81 및/또는 88에 해당하는 위치에 아미노산 잔기 S, N, E, N, (A,) P, Q, L 및/또는 L(또는 이들의 보존적 치환)을 더 포함한다. 바람직하게는 이들 인용된 아미노산 잔기 중 적어도 8개를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 예에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9에서 116, 124, 136, 148, 198, 204, 212, 213, 289, 295, 298, 및/또는 301에 해당하는 위치에 아미노산 잔기 P, L, N, G, K, W, I, Y, R, I, V, L, F, 및/또는 P(또는 이들의 보존적 치환)를 더 포함한다. 바람직하게는 이들 인용된 아미노산 잔기 중 적어도 13개(또는 적어도 11개)를 포함한다.
본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9에 따른 폴리펩타이드의 자연 변이체(natural variant)일 수 있으며, 예를 들어, 동일한 기능을 갖는 자연 발생 폴리펩타이드 또는 동일한 기능을 갖는 합성 폴리펩타이드, 즉 면역 신호 전달 및/또는 장관 장벽 기능에 영향을 미치거나 및/또는 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성에 영향을 미칠 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 톨 유사 수용체 2(TLR2)에 결합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드는 세포로부터 폴리펩타이드의 분비를 자극하는 N-말단 신호 서열(signal sequence)에 의해 선행될 수 있다. 하나의 실시 예에서, 상기 N-말단 신호 서열은 Amuc-1100 폴리펩타이드의 예측된 자연발생 N-말단 신호 서열인 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 그러나, Amuc-1100 이 세포로부터 분비될 수 있도록 할 수 있는 다른 N 말단 신호 서열도 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 N 말단 신호 서열이 세포로부터 Amuc-1100이 분비될 수 있도록 할 수 있는 한, Amuc-1100 폴리펩타이드의 예측된 자연발생 N 말단 신호 서열의 절단된 버전 또는 확장된 버전이 사용될 수 있다. 대안으로, 자연적으로 발생하지 않는 N 말단 신호 서열이 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명에서 사용하기에 적합한 N 말단 신호 서열을 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 그 아미노산 서열로부터 SEQID NO:3 N 말단의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 동일성은 당업계에서 이용 가능한 임의의 적절한 수단에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 동일성은 위에서 정의된 바와 같이 니들만-브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘과 GAP 기본 매개변수(default parameters)를 사용하여 쌍정렬(pairwise alignment)에 의해 결정될 수 있다. 또한, 웨스턴 블랏(western blot), 면역 조직 화학(immunohistochemistry), ELISA, 아미노산 합성 등과 같이 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드의 변이체를 식별, 합성 또는 단리하는 데 많은 방법이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
또한 폴리펩타이드의 임의의 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드와 동일한 기능을 발휘 및/또는 동일한 활성을 갖는 것으로 이해된다. 임의의 변형체의 기능 또는 활성은 당업자가 상기 목적에 적합하다고 간주할 당 업계에서 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명은또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 예를 들어 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:33 에 나타난 바와 같은 핵산 서열 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:33와 적어도 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 단리된, 합성된, 또는 재조합 핵산 분자와 같은 핵산 분자를 개시한다
상기 고립 된 핵산 분자(예: cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA)는 자연적으로 존재하는 인공 또는 합성 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 임의의 폴리펩타이드를 부호화할 수 있다. 상기 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 유전 암호의 퇴화로 인해 다양한 핵산 분자가 동일한 폴리펩타이드(예: SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)를 암호화할 수 있다.
또한, 핵산 혼성화, PCR 기술, 인실리코(in silico) 분석 및 핵산 합성 등과 같이 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 식별, 합성 또는 단리하기 위해 많은 방법이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
상기 핵산 분자는 숙주 세포로부터 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드의 분비를 자극하는데 적합한 N 말단 신호 서열을 부호화(encoding)하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자를 부호화하는 N 말단 신호 서열은 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자는 키메라 유전자로 구성될 수 있으며, 여기서 상기 핵산 분자는 프로모터(promoters)에 작동 가능하게 연결된다. 따라서 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자를 포함하는 키메라 유전자에 관한 것이다.
당업계에 알려진 모든 촉진제가 사용될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자와의 연결에 적합하다. 적합한 촉진제의 비제한적인 예로는 구성적 및/또는 조절된 발현, 약한 발현 및 강한 발현을 허용하는 프로모터(promoters) 등이 있다. 당업계에서 공지된 임의의 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 키메라 유전자에 핵산 분자를 포함하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자를 소위 '구성적 프로모터(constitutive promoter)'에 작동 가능하게 연결하는 것이 유리할 수 있다.
대안적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리뉴클레오타이드 및 그 변이체를 소위 '유도성 프로모터(inducible promoter)'에 작동 가능하게 연결하는 것이 유리할 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 생리적(physiologically)으로(예: 특정 화합물의 외부 적용에 의한) 조절되는 프로모터일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 키메라 유전자는 '벡터(vector)' 또는 '핵산 구조(nucleic acid construct)'로 구성될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 키메라 유전자 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자, 명세서에 기재된 바와 같이 키메라 유전자 또는, 명세서에 기재된 바와 같이 벡터에 관한 것을 포함하도록 유전자 변형된 숙주 세포에 관한 것이다.
상기 유전자 변형 숙주 세포(genetically modified host cell)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포 세포질 내에서 또는 임의의 방법으로 세포로부터 방출 된 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 탈체(ex vivo) 및/또는 시험관 내(in vitro)에서 생산하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 상기 폴리펩타이드는 특히 가용성 또는 분비된 분자로 표현될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 유전자 변형 숙주 세포는 형질전환 절차(transformation procedures) 또는 유전 공학 절차에 적합한 임의의 숙주 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포의 비제한적인 예로는 모든 원핵 세포 또는 진핵 세포와 같은 배양 가능한 세포가 있다. 하나의 실시 예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 대장균(Escherichia coli.)과 같은 박테리아에서 발현된다.
하나의 실시 예에서, 숙주 세포(host cell)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 자연스럽게 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 상기의 경우, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 그 변이체를 과발현할 수 있다.
또 다른 하나의 실시 예에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 자연스럽게 발현하지 않는 임의의 세포일 수 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포는 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아커만시아 글리카니필라(Akermansia glycaniphila) 종에 속하지 않는다.
다른 실시예에서, 숙주 세포는 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아커만시아 글리카니필라(Akermansia glycaniphila) 종에 속할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자의 추가 복사본을 포함하도록 유전적으로 변형 및/또는 명세서에 기재된 바와 같이 키메라 유전자 또는 벡터를 포함하도록 변형된다. 상기 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아커만시아 글리카니필라(Akermansia glycaniphila) 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 과발현할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포는 당 업계에서 공지된 임의의 방법을 사용하여 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포 또는 유기체는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.
a) 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 부호화할 수 있는 핵산 서열과 같은, 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자로 숙주 세포를 형질전환 시키는 단계;
b) 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산 분자의 발현 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 생산을 허용하는 조건 하에서 해당 숙주 세포를 배양하는 단계;
c) 임의로, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 핵산 분자를 발현 및/또는 본 명세서에 기재바와 같이 같이 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제조 할 수 있는 숙주 세포의 스크리닝(screening)하는 단계.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 유전자 변형 숙주 세포는 포유류의 장 점막 장벽 근처 또는 그 내부에서 자연적으로 발생 및/또는 그 내부에 사는 박테리아의 종에 속할 수 있다. 상기 박테리아의 종들은 종종 '장 점막 관련 박테리아 종(gut mucosal-associated bacteria species)'으로 지칭된다. '장 점막 관련 박테리아 종'의 비제한적인 예로는 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila) (ATC BAA-835), 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)(A2-165), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)(ATCC 53103), 비피도박테리움 브레브(Bipidobacterium breve)(DSM-20213) 등이 있다.
특정 실시 예들에서, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 같이 폴리뉴클레오타이드를 발현 또는 과발현하거나, 폴리펩타이드를 포유류(예: 인간)의 장 점막 장벽 근처 또는 내부에서 직접 생산하거나 과잉 생산하기 위해 본 명세서에서 기재된 바와 같이 폴리뉴클레오타이드 및 이의 변이체들 중 임의의 장 점막 관련 박테리아를 유전적으로 변형시키는 것이 유리할 수 있다.바람직한 실시 예에서, 상기 장 점막 관련 박테리아는 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아커만시아 글리카니필라(Akermansia glycaniphila) 종의 임의의 박테리아에 의해 형성될 수 있다. 상기 과잉 생산은 재조합 DNA 기술, CRISPR/cas 유사 시스템을 기반으로 하는 도구를 사용하는 것과 같은 게놈 편집 또는 고전적인 돌연변이 선택 시스템과 관련된 유전자 변형 도구에 의해 실현될 수 있다.
하나의 실시 예에서, 상기 유전자 변형 숙주 세포는 임의의 박테리아일 수 있으며, 특히 포유류 장 점막 장벽 근처 또는 그 내부에서 자연적으로 발생하거나 서식하는 박테리아의 종으로부터 유래하지 않은 것일 수 있다. 상기 박테리아의 비제한적인 예로는 임의의 유익한 격리된 장관 박데리아 균주, 예를 들어, 프로바이오틱스 박테리아, 특히 락토코커스속(Lactococcus), 락토바실러스속(Lactobacillus) 또는 비피도박테리움속(Bifidobacterium)에서 선택된 균주가 사용될 수 있다. 또한, 엄격한 혐기성 장관 박테리아(anaerobic intestinal bacteria)가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 사람의 장관에 발생하는 것으로 알려진 속에 속하는 박테리아가 사용될 수 있다. (Rajilic-Stojanovic & de Vos, The first 1000 cultured species of the human GI microbiota. FEMS Microbiol Rev. 38: 996-1047).
폴리펩타이드의 제조 방법
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 다음 단계를 포함하는 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 생산을 허용하는 조건 하에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 선택적으로, 단계 (a) 에서 생성된 폴리펩타이드를 단리하는 단계.
단계 (a)에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포는 임의의 공지된 배양 방법 및 임의의 공지된 배양 배지에 따라 배양될 수 있다. 당업자는 적절한 숙주 세포를 선택할 수 있고 폴리펩타이드의 생산을 허용하는 적절한 조건을 확립할 수 있을 것이다.
대안적으로, 상기 폴리펩타이드는 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:
(a) 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아커만시아 글리카니필라(Akermansia glycaniphila) 종의 박테리아를 적절한 배양 배지로 배양하는 단계; 및
(b) 선택적으로, 단계 (a) 에서 생성된 폴리펩타이드를 단리하는 단계.
상기 방법들의 단계(a)에서 제조된 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 단리될 수 있다. 당업자는 상기 배지로부터 생성된 폴리펩타이드를 단리할 수 있을 것이다.
적합한 배양 배지는 예를 들어, Derrien 등 저자들이 기제한다. (2004, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1469-76). Derrien 등 저자들은 아커만시아 뮤니필라(A. muciniphila) 균주 MucT 가 유일한 탄소 및 질소 공급원으로서 돼지 위 점액(hog gastric mucin)을 포함하는 기초 혐기성 배지에서 분리 및 성장되었다고 기제한다. 저자들은 또한 아커만시아 뮤니필라(A. muciniphila)가 풍부한 배지, 예를 들어 CB (Columbia Broth) 및 BHI (Brain Heart Infusion)와 같은 배지 또는 포도당과 고농도의 카시톤(casitone)과 효모 추출물을 가진 기초 배지에서 자랄 수 있다고 기제한다. 마찬가지로, Lukovac 등 저자들은 mBio에서 포도당과 푸코스(fucose)를 포함하는 기초 배지에서 아커만시아 뮤니필라(A. muciniphila)의 성장과 다량의 카시톤의 성장을 기제한다(2014, mBio 01438-14). 유사한 방법이 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)에 사용될 수 있다.
조성물
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 적어도 약 104 내지 약 1015 콜로니 형성 단위(CFU)의 양으로 존재할 수 있다. 숙주 세포의 유효량은, 예를 들어, 적어도 약 105 CFU 내지 약 1014 CFU, 바람직하게는 약 106 CFU 내지 약 1013 CFU, 바람직하게는 약 107 CFU 내지 약 1012 CFU, 더욱 바람직하게는 약 108 CFU 내지 약 1012 CFU일 수 있다. 숙주 세포가 살아 있거나 죽었을 수 있습니다. 숙주 세포의 효과는 본 명세서에 설명된 바와 같이 폴리펩타이드의 존재와 상관관계가 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 담체, 예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 소화학적(alimentarily)으로 허용 가능한 담체 또는 영양학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 담체는 임의의 불활성 담체일 수 있다. 예를 들어, 적합한 생리학적 또는 약제학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는 잘 알려진 생리학적 또는 약제학적 담체, 완충제, 희석제 및 첨가제 등이 포함되어 있다. 적합한 생리학적 또는 약제학적 담체 또는 소화학적 담체 또는 영양적 담체에 대한 선택은 본 명세서에 기재된 바와 같이 조성물의 의도된 투여 모드(예: 경구) 및 조성물의 의도된 형태(예: 음료, 요구르트, 분말, 캡슐 등)에 따라 결정된다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조성물에 적합하거나 호환 가능한 적절한 담체, 예를 들어 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 영양학적으로 허용 가능한 담체 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 선택하는 방법을 알고 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에서 기재된 조성물은 영양학적 또는 소화학적 조성물일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 조성물은 식품, 식품 보충제, 사료 또는 유제품류와 같은 사료 보충제, 예를 들어 요구르트 또는 요구르트 음료와 같은 발효 유제품일 수 있다. 상기의 경우, 조성물은 영양학적으로 허용 가능한 또는 소화학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 이는 적절한 푸드 베이스(food base)일 수 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에서 기재된 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 약제학적 조성물은 보충제(예: 식품 보충제)로 사용될 수도 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 및/또는 본 명세서에 기재된 숙주 세포 외에, 약제학적, 영양학적 또는 소화학적 또는 생리학적으로 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식과 (치료적) 적용 방식에 따라 달라질 것이다. 상기 담체는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 폴리펩타이드를 전달하기에 적합한 임의의 호환성, 생리학적으로 수용 가능한 무독성 물질일 수 있으며/또는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 숙주 세포를 포유류(예를 들어, 인간)의 GI 기관에 바람직하게는 의 포유류의 장 점막 장벽(결장 점막 장벽(colon mucosal barrier)) 근처 또는 내부에 이식한다. 예를 들어, 통상, 약제학적으로 허용 가능한 보조제, 완충 물질(buffering agent), 분산 물질(dispersing agent) 등을 보충한 멸균수, 또는 불활성 고체를 담체로 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물은 액체 형태일 수 있으며, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 안정화 현탁액 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포의 고체 형태 예를 들어, 동결 건조된 숙주 세포의 분말일 수 있다. 본 명세서에 기제된 바와 같이 숙주 세포가 동결건조된 경우, 락토오스(lactose), 트레할로오스(trehalose) 또는 글리코겐(glycogen)과 같은 동결방지제(cryoprotectant)가 사용될 수 있다. 경구 투여를 위해, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 기재된 동결 건조된 숙주 세포는 캡슐, 정제 및 분말과 같은 고체 제형(solid dosage forms)으로 투여될 수 있고, 또는 약, 시럽 및 현탁액과 같은 액체 제형으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 기재된 숙주 세포는 활성이 없는 성분 및 분말 담체, 예를 들어 포도당(glucose), 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 전분(starch), 셀룰로오스(cellulose) 또는 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산(stearic acid), 사카린나트륨(sodium saccharin), 탈쿰(talcum), 탄산마그네슘(magnesium carbonate) 등을 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐에 캡슐화될 수 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 생존(survival) 및/또는 생존력(viability) 및/또는 유지를 촉진 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 온전성(integrity)을 유지하는 데 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포 저장 되는 동안 및/또는 포유류(예를 들어, 인간)의 GI 기관을 통과하는 동안 적합한 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 상기 성분의 비제한적인 예로는 장 코팅(enteric coating), 위를 통과할 수 있는 조절된 이형제(release agents) 등이 있다. 당업자는 활성 성분(폴리펩타이드 또는 숙주 세포)이 작용을 발휘하는 의도된 목적지에 도달하도록 보장하기 위해 적절한 성분을 선택하는 방법을 알고 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 점막 결합 물질(mucosal binding agent) 또는 점막 결합 폴리펩타이드(mucosal binding polypeptide)를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '점막 결합 물질(mucosal binding agent)' 또는 '점막 결합 폴리펩타이드(mucosal binding polypeptide)'는 포유류(예를 들어, 인간)의 장 점막 장벽의 장 점막 표면에 스스로 부착할 수 있는 작용 물질(agents) 또는 폴리펩타이드를 의미한다.
대안적으로, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 폴리펩타이드를 부착하기 위한 특정 도킹 시스템(docking systems) 또는 살아 있거나 죽은 비생산적인 세포를 생성하는 세포를 사용할 수 있다. 상기 결합은 가장 효율적으로 보이는 것은 무엇이든 C 말단 또는 N 말단에 있을 수 있으며, 스페이서 펩타이드(spacer peptides)의 사용도 설명한다. LysM 기반 펩티도글리칸 결합 시스템(LysM-based peptidoglycan binding systems)의 사용을 예로 들 수 있다 (Visweswaran GR et al. 2014, Appl Microbiol Biotechnol. 98:4331-45.). 또한, 다양한 점막 결합 폴리펩타이드(mucosal binding polypeptides)가 당업계에 개시되어 있다. 점막 결합 폴리펩타이드의 비제한적인 예로는 콜레라 독소의 B 소단위(subunit), 대장균 열불안정 장독소(heat-labile enterotoxin)의 B 소단위, 보르데텔라 페르시스(Bordetella pertussis) 독소 소단위 S2, S3, S4 및/또는 S5, 디프테리아(Diphtheria) 독소의 B 단편 및 시가 독소(Shiga toxin) 또는 시가-유사 독소(Shiga-like toxins)의 막 결합 소단위 등이 있다.
다른 적절한 점막 결합 폴리펩타이드로는 대장균 핌브리아(fimbriae) K88, K99, 987P, F41, FAIL, CFAIIII ICES1, CS2 및/또는 CS3, CFAIIV ICS4, CS5 및/또는 CS6, P 핌프리아 등을 포함하는 박테리아 핌브리아 단백질이 있다. 다른 비제한적인 예로는 보르데텔라 페르시스(Bordetella pertussis) 사상 혈구응집소(filamentous hemagglutinin), 비브리오 콜레라 독소-상호조절 필러스(toxin-coregulated pilus) (TCP), 만노오스 감수성 헤마글루티닌(Mannose-sensitive hemagglutinin)(MSHA), 푸코오스 감수성 헤마글루티닌(PSHA, fucose-sensitive hemagglutinin) 등이 있다. 또 다른 점막 결합 물질(agents)는 인플루엔자 및 센다이 바이러스(sendai virus) 헤마글루티닌을 포함한 바이러스 부착 단백질 및 동물 렉틴 또는 면역글로불린 분자 또는 그 단편을 포함하는 렉틴 유사 분자, 칼슘 의존성(C형) 렉틴, 셀렉틴(selectins), 콜렉틴(collectins) 또는 헬릭스 포마티스 헤마글루티닌(helix pomatis hemagglutinin), 점막 결합 소단위를 포함하는 식물 렉틴은 콘카나발린 A, 밀배아 응집소(wheat-germ agglutinin), 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin), 아브린, 리신 등을 포함한다. 상기 전달의 장점은 살아있는 재조합 유기체 사용을 피할 수 있다는 것이다.
필수적인 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 숙주 세포를 장 점막 장벽에 표적화 하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 조성물에 하나 이상의 점막 결합 물질(agents) 또는 점막 결합 폴리펩타이드를 첨가하는 것이 유리할 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물은 프리바이오틱스, 프로바이오틱스, 탄수화물, 폴리펩타이드, 지질, 비타민, 미네랄, 의약품, 보존 물질(agents), 항생 물질(agents) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 더 포함할 수 있다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 조성물의 영양적 가치 및/또는 치료적 가치를 더욱 향상시킨다. 예를 들어, 단백질, 아미노산, 효소, 미네랄 염, 비타민(예: 티아민 HCl, 리보플라빈(riboflavin), 피리독신 HCl, 니아신, 이노시톨, 콜린 클로라이드, 판토텐산칼슘, 비오틴, 엽산, 아스코르브산, 비타민 B12, p-아미노벤조산, 비타민 A 아세테이트, 비타민 K, 비타민 D, 비타민 E 등), 당 및 복합 탄수화물(예: 수용성 및 수용성 단당류, 이당류 및 다당류), 의약 화합물(예: 항생제), 항산화제, 미량 원소 성분(예: 코발트, 구리, 망간, 철, 아연, 주석, 니켈, 크롬, 몰리브덴, 요오드, 염소 , 규소, 바나듐, 셀레늄, 칼슘, 마그네슘, 나트륨 및 칼륨 등 의 화합물) 중에서 선택된 하나 이상의 성분(예: 영약학적 성분, 수의학적 또는 약학적 물질(agents) 등)을 추가하는 것이 유리할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조성물의 영양적 및/또는 치료적/의학적 가치를 향상시키는 데 적합한 방법 및 성분에 익숙하다.
하나의 실시 예에서, 상기 숙주 세포는 동결건조된 형태, 또는 마이크로 캡슐화된 형태(예를 들어, Solanki 등에 의해 검토됨), 또는 숙주 세포의 활성 및/또는 생존 가능성을 보존하는 다른 형태(예: 박테리아 균주)가 포함될 수 있다..
치료 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 비만, 대사증후군, 인슐린-결핍 또는 인슐린-저항성 관련 질환(disorder), 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 임신중독증(preeclampsia), 염증성 장질병(IBD), 과민성 장 증후군(IBS), 포도당 불내성, 비정상적인 지질대사, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 심장 병리(cardiac pathology), 뇌졸중, 비알코올성 지방간 질환, 알코올성 지방간 질환, 고혈당증, 지방간, 이상지질혈증, 비만과 관련된 면역 시스템의 기능 장애(체중 증가), 알레르기, 천식, 자폐증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 신경 퇴행성 질환, 우울증, 기타 장벽 기능 저하와 관련된 질병, 세포 상처치유(wound healing), 행동 장애(behavioural disorders), 알코올 의존증, 심혈관 질환, 고콜레스테롤, 중성지방(triglycerides) 상승, 죽상동맥경화증, 수면무호흡증, 골관절염, 담낭질환, 암 및 미숙아로 태어난 아기, 방사선 노출, 화학 요법 및/또는 독소에 노출, 자가 면역 장애, 영양 실조, 패혈증 등과 같은 증상(condition)으로 인한 음식 알레르기, 장의 미성숙 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 변경하는 증상(condition)으로 구성된 그룹에서 포유류의 질환(disorder) 또는 증상의 예방 및/또는 치료에 사용하는 방법; 포유류의 체중 감소를 촉진하는 방법; 포유류의 장(gut)에서 항염증 활성을 촉진하는 방법; 포유류에서 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 촉진하는 방법; 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성을 유지, 복원 및/또는 개선하는 방법; 및 포유류에서 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지, 복원 및/또는 향상시키는 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 질환(disorder) 또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 명세서에 기제된 것과 같은 유효량의 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 것과 같은 숙주 세포 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 임의의 공지된 투여 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물은 경구, 정맥 내, 국소적으로, 경장 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 투여 방식이나 경로는 조성물의 의도된 형태(예: 알약, 액체, 분말 등)뿐만 아니라 당면한 경우(예: 피험자의 나이, 원하는 효과 위치, 질병 증상(condition) 등)에 따라 달라질 것으로 이해된다.
바람직한 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물이 경구 투여된다.
용도
추가적인 측면에서, 본 발명은본 명세서에 기재된 핵산 분자, 본 명세서에 기재된 키메라 유전자 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 생산하기 위한 본 명세서에 기재된 벡터의 사용 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 생성하기 위한 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포는 세포 상에서 TLR2 수용체와 상호작용하는 능력이 향상될 수 있으며/또는 세포 내에서 TLR2 신호 전달 경로를 자극하는 능력이 향상될 수 있으며 및/또는 세포로부터 사이토카인, 특히 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 및 TNF-α 의 생산을 자극 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드, 키메라 유전자 또는 벡터로 유전적으로 변형되지 않은 숙주 세포(예를 들어 박테리아)와 비교하여 포유류, 예를 들어 인간 세포의 TER을 증가시키는 향상된 능력을 가질 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위해 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 숙주 세포 또는 본 명세서에 기재된 조성물에 관한 것이다; 특히 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 촉진하거나 포유류에서 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지, 복원 및/또는 향상시키기 위한 용도로 사용된다; 포유류의 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성을 유지, 복원 및/또는 향상하기 위한 용도; 비만, 대사증후군, 인슐린-결핍 또는 인슐린-저항성 관련 질환(disorder), 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 임신중독증(preeclampsia), 염증성 장질병(IBD), 과민성 장 증후군(IBS), 포도당 불내성, 비정상적인 지질대사, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 심장 병리(cardiac pathology), 뇌졸중, 비알코올성 지방간 질환, 알코올성 지방간 질환, 고혈당증, 지방간, 이상지질혈증, 비만과 관련된 면역 시스템의 기능 장애(체중 증가), 알레르기, 천식, 자폐증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 신경 퇴행성 질환, 우울증, 기타 장벽 기능 저하와 관련된 질병, 세포 상처치유(wound healing), 행동 장애(behavioural disorders), 알코올 의존증, 심혈관 질환, 고콜레스테롤, 중성지방(triglycerides) 상승, 죽상동맥경화증, 수면무호흡증, 골관절염, 담낭질환, 암 및 미숙아로 태어난 아기, 방사선 노출, 화학 요법 및/또는 독소에 노출, 자가 면역 장애, 영양 실조, 패혈증 등과 같은 증상(condition)으로 인한 음식 알레르기, 장의 미성숙과 같은 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 변경하는 증상(condition)으로 구성된 그룹에서 포유류의 질환(disorder) 또는 증상의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해; 포유류의 장(gut)에서 항염증 활성을 촉진하는 데 사용되거나 포유류의 체중 감소를 촉진하는 데 사용된다.
하나의 실시 예에서, 포유류, 예를 들어 인간은 임의의 연령 그룹(예: 유아, 성인, 노인) 및 임의의 성별(남성 및 여성)일 수 있다. 하나의 실시 예에서, 포유류는 신생아(예: 신생아, 아기, 유아 등), 특히 조산아일 수 있다.
상기 포유류는 예를 들어 인간, 인간이 아닌 영장류, 설치류, 고양이, 개, 소, 말 등 모든 포유류가 될 수 있다. 바람직한 실시 예에서, 포유류는 인간이다.
본 발명의 단리된 폴리펩타이드는 대안적으로 상기 폴리펩타이드를 특징으로 할 수 있다.
a) SEQ ID NO:5 와 최소 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%의 서열 동일성(전체 길이에 걸쳐)을 갖는다;
b) 적어도 다음과 같은 아미노산 잔기 세트 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7을 포함한다.
i. SEQ ID NO:5에서 각각 위치 6, 7, 13, 22, 25 및/또는 30에 해당하는 위치의 R, S, I, S, A 및/또는 P(또는 이들의 보존적 치환);
ii. SEQ ID NO:5에서 각각 88, 89, 91, 93 및/또는 96에 해당하는 위치의 C, K, K, I 및/또는 T(또는 이들의 보존적 치환)
iii. SEQ ID NO:5에서 각각 101, 102, 103 및/또는 104에 해당하는 위치의 W, L, G 및/또는 F(또는 이들의 보존적 치환);
iv. SEQ ID NO:5에서 각각 122 및/또는 123에 해당하는 위치의 F 및/또는 E(또는 이들의 보존적 치환);
v. SEQ ID NO:5에서 각각 145, 146 및/또는 147에 해당하는 위치의 V, Y 및/또는 R(또는 이들의 보존적 치환);
vi. SEQ ID NO:5에서 각각 174, 176, 177, 179, 180, 183, 185 및/또는 186에 해당하는 위치의 P, E, I, F, Q, R, S 및/또는 V(또는 이들의 보존적 치환);
vii. SEQ ID: 5에서 각각 215, 217, 221, 222, 223, 226, 234, 239, 241, 243, 245, 150, 153, 257, A, A, A, P, P, G, A, P, Q, K, G 및/또는 E(또는 이들의 보존적 치환).
상기 정의된 폴리펩타이드는 면역 신호 전달 및/또는 장관 장벽 기능에 영향을 미칠 수 있으며/또는 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성에 영향을 미칠 수 있다. 바람직하게, 상기 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1의 서열 동일성이 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상인 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 폴리펩타이드는 톨 유사 수용체 2(TLR2)에 결합할 수 있다.
하나의 실시 예에서, 상기 정의된 폴리펩타이드는, 바람직하게는, 담체, 예를 들어, 생리학적으로 허용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 소화학적으로 허용되는 담체 또는 영양학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 조성물로 구성된다. 담체는 임의의 불활성 담체일 수 있다. 예를 들어, 적합한 생리학적 또는 약제학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는 잘 알려진 생리학적 또는 약제학적 담체, 완충제, 희석제 및 첨가제가 있다.
a)에 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드는 또한 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있으며, 갖는 상기 변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열과 25% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 폴리펩타이드의 변형은 또한 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 통해 유도된 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상에서 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 전술한 바와 같이, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:5와 서열 동일성이 적어도 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%일 수 있으며, 예를 들어 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:5와 서열 동일성이 적어도 50% 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 선도 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
하나의 실시 예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 다음을 포함한다.
- 1)에 정의된 바와 같이 최소 5개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- 2)에 정의된 바와 같이 최소 4개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- 3)에 정의된 바와 같이 최소 3개의 아미노산 잔기(또는 이들의 보존적 치환기);
- 4)에 정의된 바와 같이 최소 1개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환);
- 5)에 정의된 바와 같이 최소 2개의 아미노산 잔기(또는 이들의 보존적 치환기;
- 6)에 정의된 바와 같이 최소 7개의 아미노산 잔기(또는 이의 보존적 치환) 및/또는
-7)에 정의된 바와 같이 최소 15개(또는 최소 12개)의 아미노산 잔기(또는 이들의 보존적 치환)
대안적으로 또는 동시에, 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드는 구체적으로 위에서 정의된 바와 같이 다음 아미노산 잔기 세트를 포함할 수 있다.
-
- i);
-
- i) 및 vii);
-
- i), ii), vi) 및 vii);
-
- i), iii), iv) 및 vii);
-
- i) i) ii) ii) ii) iv) vi) vi) vi)
대안적으로 또는 동시에, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 폴리펩타이드는 예를 들어 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:5와 적어도 75%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
바람직한 실시 예에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5에서 각각 34, 35, 41, 43, (46,) 67, 74, 77, 및/또는 84에 해당하는 위치에 아미노산 잔기S, N, E, N, (A,) P, Q, L 및/또는 L(또는 이들의 보존적 치환)을 추가로 포함한다. 바람직하게는 이 기재된 아미노산 잔기 중 적어도 8개를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 예에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:5에서 각각 112, 120, 132, 138, 170, 193, 193, 208, 297, 273, 276 및/또는 279에 해당하는 위치에 아미노산 잔기 P, L, N, G, K, W, I, Y, R, V, L, F 및/또는 P(또는 이들의 보존적 치환)를 추가로 포함한다. 바람직하게는 이 기재된 아미노산 잔기 중 적어도 13개(또는 적어도 11개)를 포함한다.
본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:5에 따른 폴리펩타이드의 자연 변이체일 수 있으며, 예를 들어, 동일한 기능을 갖는 자연 발생 폴리펩타이드 또는 동일한 기능을 갖는 합성 폴리펩타이드, 즉 면역 신호 전달 및/또는 장관 장벽 기능에 영향을 미치거나 및/또는 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성에 영향을 미칠 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 톨 유사 수용체 2(TLR2)에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드는 다음 중에서 선택될 수 있다.
- 최소 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%의 SEQ ID NO:5 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩타이드(전체 길이에 걸쳐);
- 최소 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%의 SEQ ID NO:6의 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩타이드(전체 길이에 걸쳐);
- 최소 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%의 SEQ ID NO:7의 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩타이드(전체 길이에 걸쳐);
- 최소 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%의 SEQ ID NO:8의 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩타이드(전체 길이에 걸쳐); 및
- 최소 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%의 SEQ ID NO:9의 서열 동일성을 갖는 단리된 폴리펩타이드(전체 길이에 걸쳐), 바람직하게는 상기에 기재된 (보존된) 아미노산 잔기의 (세트)를 포함한다.
일반 용어 정의
본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 용어 "단백질(protein)"과 동등하다. 상기 폴리펩타이드는 특정 아미노산 서열을 가지고 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 "변이체(variant)"는 참조 폴리펩타이드에 대해 적어도 25%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 더 이상 자연 환경에 존재하지 않을 때, 즉, 더 이상 핌브리아의 맥락(the context of fimbriae)에 존재하지 않을 때 및/또는 아커만시아 뮤니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아커만시아 글리카니필라(Akermansia glycaniphila) 세포와 같은 세포 컨텍스트(context)에 존재하지 않을 때 단리된다. 선도 서열은 프로모터(promoter)와 코딩 영역(coding region) 사이의 영역(암호화(encoded))이며 발현 조절에 관여한다. 선도 서열(또는 그 일부)은 선도 펩타이드로 번역될 수 있지만, 신호 펩타이드와 달리 선도 펩타이드는 구조 단백질의 일부가 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '보존적 치환(conserved substitutions)'은 실질적인 기능성의 손실 없이 폴리펩타이드에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 의미할 수 있다. 폴리펩타이드의 활성 손실 없이 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것이 가능하다는 것은 일반적인 상식이다. 예를 들어, 다음과 같은 아미노산은 일반적으로 서로 교환될 수 있다:
Ala, Ser, Thr, Gly(작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기)
As, Asn, Glu, Gln(극성, 음전하 잔기 및 그 아미드)
His, Arg, Lys(극성, 양전하 잔기)
Met, Leu, Ile, Val(Cys)(대규모 지방족, 비극성 잔기)
Phe, Ty, Trp(대규모 방향족 잔기)
(예를 들어, Schulz, G. E. et al, Principles of Protein Structure, Springer- Verlag, New York, 1979, and Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1984)
선호되는 "치환(substitutions)"은 보존적(conservative)인 것으로, 즉 잔기가 동일한 일반 유형의 다른 것으로 대체된다. 변화를 만들 때, 아미노산의 소수성 척도(hydropathic index)를 고려할 수 있다 (예를 들어, Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)). 특정 아미노산은 유사한 소수성 척도 또는 측정값을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 생성할 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다. 이러한 변화를 할 때, 소수성 척도가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 선호되고, ±1 이내인 것이 더 선호되며, ±0.5 이내인 것이 더욱 선호된다. 마찬가지로, 필수 아미노산(select amino acids)은 미국 특허청에 U.S. Pat. No. 4,554,101로 명시된 것과 같이 유사하게 친수성을 갖는 다른 아미노산으로 대체될 수 있고, 친수성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 친수성 지수가 ±1 이내인 것이 더 바람직하며, ±0.5 이내인 것이 더욱 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '서열 동일성(sequence identity)' 또는 '서열 유사성(sequence similarity)'은 아미노산 또는 핵산 서열이 다른 비필수 아미노산(reference amino acid) 또는 핵산 서열과 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 상황을 의미한다. '서열 동일성' 또는 '서열 유사성'은 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘을 사용하여 2 개의 폴리펩타이드 또는 2 개의 뉴클레오타이드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. (예를 들어, 기본 매개 변수를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬한 경우) 서열들이 최소한 일정한 비율의 서열 동일성(아래 정의됨)을 공유할 때, 서열들은 "실질적으로 동일"하거나 "본질적으로 유사"하다고 언급될 수 있다. GAP는 Needleman과 Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘을 사용하여 2 개의 서열을 전체 길이에 걸쳐 정렬하여 일치하는 수를 최대화하고 간격 수를 최소화합니다. 일반적으로 GAP 기본 매개 변수가 사용되며, 간격 생성 패널티(gap creation penalty) = 50(뉴클레오타이드) / 8(단백질) 및 간격 확장 패널티(gap extension penalty) = 3(뉴클레오타이드)/2(단백질)입니다. 뉴클레오타이드의 경우 사용되는 기본 스코어링 매개 변수(default scoring matrix)는 nwsgapdna.cmp이고 단백질의 경우 기본 스코어링 매개 변수는 블로썸62(Blosum62)이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). 백분율 서열 동일성(percentage sequence identity)에 대한 서열 정렬 및 측정값은 Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA에서 제공하는 GCG Wisconsin Package, 버전 10.3, 또는 EmbossWin 버전 2.10.0과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다(프로그램 "needle"을 사용). 또는 FASTA, BLAST 등의 알고리즘을 사용하여 데이터베이스에 대해 검색함으로써 유사성 또는 정체성을 퍼센트로 결정할 수 있다. 바람직하게, 서열 동일성은 서열의 전체 길이에 걸친 서열 동일성을 의미한다.
'상피 투과 저항성'(Transephilial resistance) (TER로 약칭) 는 시험관 내(in vitro) 상피 세포층의 투과성을 측정하는 단위이다. 상피 투과성의 증가는 밀착 연접(tight junctions)의 약화 및 TER의 감소와 관련이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '키메라 유전자(chimeric gene)'는 임의의 자연적으로 발생하지 않는 유전자, 즉 종에서 일반적으로 자연에서 발견되지 않는 유전자, 특히 핵산 서열의 하나 이상의 부분이 자연에서 서로 연관되지 않는 유전자를 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 본질적으로 전사된 지역의 일부 또는 전부 또는 다른 조절 영역(regulatory region)과 관련이 없다. '키메라 유전자'라는 용어는 이종 프로모터 또는 전사 조절 서열이 하나 이상의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 발현 구조를 포함하는 것으로 이해되고 있으며, 3'-번역되지 않은 영역(3'-UTR)을 포함한다. 대안적으로, 키메라 유전자는 프로모터, 코딩 서열 및 선택적으로 동일한 종에서 파생된 3'-UTR을 포함할 수 있지만, 상기 조합에서 자연적으로 발생하지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '유전자 변형 숙주 세포(genetically modified host cell)'는 예를 들어, 외인성 핵산 서열의 도입 또는 내인성 유전자 서열의 특정 변형에 의해 유전자 변형된 세포를 의미한다. 이러한 세포들은 예를 들어, 내인성 유전자에 하나 이상의 돌연변이, 삽입 및/또는 결실의 도입 및/또는 게놈에 유전자 구조(예: 벡터 또는 키메라 유전자)의 삽입에 의해 유전적으로 변형되었을 수 있다. 유전자 변형 숙주 세포는 단리 또는 배양된 세포를 지칭할 수 있다.
유전자 변형 세포는 '형질도입 된 세포(transduced cells)'일 수 있으며, 예를 들어 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 변형된 바이러스에 감염된 세포일 수 있지만 렌티바이러스(lentiviruses)와 같은 다른 적합한 바이러스도 고려될 수 있다. 형질감염(transfections, 형질주입)과 같은 비바이러스성 방법을 사용할 수도 있다. 따라서 유전자 변형 숙주 세포는 '안정적으로 형질감염 된 세포(stably transfected cells)' 또는 '일시적으로 형질감염 된 세포(transiently transfected cells')'일 수 있다. 형질감염은 유전자가 발현되도록 DNA(또는 RNA)를 세포로 전달하는 비바이러스적 방법을 의미한다. 형질감염(transfection) 방법은 칼슘-인산 형질감염, PEG 형질감염, 핵산 리포좀(liposomal nucleic acids) 또는 리포플렉스 형질감염(lipoplex transfection of nucleic acids) 등과 같이 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 형질감염은 일시적일 수도 있지만, 유전자를 게놈에 통합한 세포가 선택될 수 있는 안정적인 형질감염일 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '유효량(effective amount)'은 본 명세서에 개재된 효과를 달성하기 위해 필요한 양을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 유전 공학적 숙주 세포의 유효량은 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 조절 및/또는 촉진하고, 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지 및/또는 복원 및/또는 향상시키는 데 효과적으로 유용한 양이고(예: 장 상피 세포 사이의 밀착 연접(tighter junction) 형성 촉진) 및/또는 면역 세포 내 톨 유사 수용체 신호 전달 경로(즉, TLR2 경로)를 조절 및/또는 자극 및/또는 면역 세포 내 사이토카인 생성을 증가(예: IL-6, IL-8, IL-10), 및/또는 비만, 대사증후군, 인슐린-결핍 또는 인슐린-저항성 관련 질환(disorder), 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 임신중독증, 염증성 장질병(IBD), 과민성 장 증후군(IBS), 포도당 불내성, 비정상적인 지질대사, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 심장 병리(cardiac pathology), 뇌졸중, 비알코올성 지방간 질환, 알코올성 지방간 질환, 고혈당증, 지방간, 이상지질혈증, 비만과 관련된 면역 시스템의 기능 장애(체중 증가), 알레르기, 천식, 자폐증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 신경 퇴행성 질환, 우울증, 기타 장벽 기능 저하와 관련된 질병, 세포 상처치유(wound healing), 행동 장애(behavioural disorders), 알코올 의존증, 심혈관 질환, 고콜레스테롤, 중성지방(triglycerides) 상승, 죽상동맥경화증, 수면무호흡증, 골관절염, 담낭질환, 암 및 미숙아로 태어난 아기, 방사선 노출, 화학 요법 및/또는 독소에 노출, 자가 면역 장애, 영양 실조, 패혈증 등과 같은 증상(condition)으로 인한 음식 알레르기, 장의 미성숙과 같은 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 변경하는 증상(condition)으로 구성된 그룹에서 질환(disorder) 또는 증상의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '생리학적으로 허용 가능한 담체(physiologically-acceptable carrier)' 또는 '소화학적으로 허용 가능한 담체(alimentarily acceptable carrier')', '영양학적으로 허용 가능한 담체(nutritionally acceptable carrier)' 또는 '약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically-acceptable carrier)'는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 숙주 세포의 투여 형태를 제공하는 것에 관여하며, 예를들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 첨가제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 소화학적으로 허용 가능한 담체 물질을 의미한다. 각 담체는 조성물의 다른 성분과 양립할 수 있고, 피험자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서, 즉 소비에 적합하거나 영양적으로 허용되는 것을 의미하는 "수용 가능한" 것이어야 한다. '소비에 적합한(suitable for consumption)' 또는 '영양학적으로 허용되는(nutritionally acceptable)'이라는 용어는 일반적으로 인간(다른 포유류뿐만 아니라)의 소비에 안전한 것으로 간주되는 성분 또는 물질을 의미한다. 생리학적으로 허용되는 담체 또는 영양학적으로 허용되는 담체 또는 약제학적으로 허용되는 담체로 작용할 수 있는 물질의 비제한적인 예로는: (1) 유당(lactose), 포도당(glucose) 및 수크로오스(sucrose)와 같은 당류(sugars); (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분류(starches); (3) 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose) 및 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate)와 같은 셀룰로오스(cellulose) 및 그 유도체(derivatives); (4) 분말화 된 트라가칸트(powdered tragacanth); (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴(gelatin); (7) 탈크(talc); (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스(suppository waxes)와 같은 첨가제; (9) 땅콩 오일, 면화 씨유, 홍화유, 참기름, 올리브 오일, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일류; (10) 프로필렌 글라이콜(propylene glycol)과 같은 글라이콜류(glycols); (11) 글리세린(glycerin), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol) 및 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리올류(polyols); (12) 에틸 올레산(ethyl oleate) 및 에틸 라우레이트(ethyl laurate)와 같은 에스터류(esters); (13) 한천(agar); (14) 수산화마그네슘(magnesium hydroxide) 및 수산화알루미늄(aluminium hydroxide)과 같은 완충 물질(buffering agents); (15) 알긴산(alginic acid); (16) 발열이 없는 물(pyrogen-free water); (17) 등장성 식염수(isotonic saline); (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올(ethyl alcohol); (20) 인산 완충 용액(phosphate buffer solutions); (21) 기타 독성이 없는 상용성 물질과 같은 제약 제제 등에 사용되는 물질등이 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 '영양학적으로 허용 가능한(nutritionally-acceptable)' 및 '약제학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)' 용어는 적절한 유익성/위해성 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 의학적 판단의 범위 내에 있는 속하는 조성물 또는 약제, 조성물의 조합 및/ 또는 그 투여 형태를 의미한다.
"항상성"이란 내부 조건이 안정적이고 상대적으로 일정하게 유지되도록 변수를 조절하는 시스템의 특성을 의미한다. 모든 동물들은 혈당 농도를 조절한다. 체내의 포도당 조절은 신체의 "포도당 항상성(glucose homeostasis)"을 유지하는 과정이다. 포유류는 다른 호르몬(예: 인슐린, 글루카곤(glucagon), 글루카곤 유사 펩타이드 1, 카테콜아민(catecholamine)과 같은 많은 다른 것들 등)과 다른 신경 경로(예: 신경 릴레이(nervous relay), 뇌에서부터 장까지 말초 장기 축(peripheral organ axis)으로)로 혈당을 조절한다. 인체는 24시간 금식 후에도 하루의 대부분의 시간 동안 포도당 수치를 일정하게 유지한다. 오랜 단식 기간 동안에도 포도당 수치는 아주 약간만 감소합니다. 췌장의 베타 세포에 의해 분비되는 인슐린은 그 세포들이 그들 자신의 사용을 위해 더 많은 포도당을 보유하도록 지시함으로써 효과적으로 신체의 세포로 포도당을 운반한다. 만약 세포 내의 포도당이 높으면, 세포는 가용성 포도당이 세포의 신진대사를 방해하는 것을 막기 위해 불용성 글리코겐으로 전환한다. 궁극적으로 상기는 혈당 수치를 낮추고 인슐린은 고혈당증을 예방하는 데 도움이 된다. 인슐린이 부족하거나 세포가 인슐린에 내성을 갖게 되면 당뇨병이 발생한다. 췌장의 알파 세포에서 분비되는 글루카곤은 세포가 저장된 글리코겐을 분해하거나 포도당신생합성을 통해 비탄수화물 탄소원을 포도당으로 전환하도록 유도하여 저혈당을 예방한다. 수많은 다른 인자들과 호르몬들이 포도당 대사의 조절에 관여한다(예를 들어, 글루카곤 유사 펩타이드 1, 카테콜아민과 같은 많은 다른 인자들). 신경 경로와 관련된 다양한 메커니즘도 이러한 복잡한 조절에 기여하고 있다.
"콜레스테롤 항상성"은 살아있는 유기체 내에서 콜레스테롤의 균형 잡힌 내부 상태를 유지하는 과정에 기여하는 메커니즘이다. 인체 시스템에서 필수적인 생물학적 분자인 콜레스테롤은 담즙산, 비타민 D, 스테로이드 호르몬의 생성을 위한 전구체 역할을 하는 등 다양한 생리적 기능을 수행한다. 그것은 또한 신체에 존재하는 모든 세포의 세포막에서 중요한 구조적 요소로 기능한다. 콜레스테롤의 유익하고 필요한 기능에도 불구하고, 콜레스테롤 항상성의 이상은 콜레스테롤 대사와 관련된 다른 항상성 피드백 시스템을 혼란시킬 뿐만 아니라 심장병(heart disease) 위험을 증가시킬 수 있다. 콜레스테롤 항상성을 조절하는 가장 눈에 띄는 기관은 순환계로 방출되는 콜레스테롤을 생합성할 뿐만 아니라 혈류로부터 잠재적으로 해롭고 자유롭게 떠다니는 콜레스테롤을 분해하는 간이다. 고밀도 지질단백질(HDLs)은 잠재적으로 위험한 콜레스테롤을 간으로 직접 운반하여 소화기관에서 사용하는 무해한 담즙산으로 합성하기 때문에 콜레스테롤 항상성을 유지하는 데 도움이 된다. 저밀도 지질단백질(LDLs)은 콜레스테롤을 체세포와 동맥벽에 축적하는 경향이 있기 때문에 덜 유익하게 작동한다. LDL의 과도한 수치는 심혈관 질환의 위험을 증가시키는 것으로 나타난다. 건강한 피험자에서 콜레스테롤 항상성은 복잡한 피드백 루프(feedback loops)에 의해 엄격하게 조절된다. 상기의 경우 건강한 피험자가 다량의 식이 콜레스테롤을 섭취하면 간의 생합성이 크게 감소해 균형을 유지하게 된다. 수년간의 잘못된 식습관이나 다른 유전적 또는 의학적 증상(condition)으로부터 높은 기준선 LDL 수준을 가진 건강한 피험자에서 피드백 루프와 체계적 대처 메커니즘(systemic coping mechanism)은 동일한 다량의 섭취에 의해 압도되어 위험한 항상성 불균형을 일으킬 수 있다.
"중성지방 항상성"은 살아있는 유기체 내에서 중성지방의 균형 잡힌 내부 상태를 유지하는 과정에 기여하는 메커니즘이다. 중성지방 대사는 임상적으로 매우 중요하다. 고중성지방혈증은 가장 풍부한 지방 분자인 중성지방의 높은(hyper-) 혈액 또는 혈청 수치 (-emia) 을 의미한다. 중성지방의 증가는 고콜레스테롤혈증(고콜레스테롤 수치)이 없는 경우에도 죽상동맥경화증과 관련이 있으며 심혈관계 질환에 걸리기 쉽다. 중성지방 수치가 높으면 급성 췌장염의 위험도 높아진다. 또한 시간이 지남에 따라 TG 수치가 상승 및 증가하면 당뇨병 발병 위험이 증가한다. 인슐린 저항성은 높은 수준의 중성지방(TG)과 관련이 있는 것으로 나타났다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '약(about)'은 당업계에서, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내의 정상 허용 범위를 나타낸다. '약'은 표시된 값의 최대 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01%까지 편차가 있는 값을 포함하는 것으로 이해할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '포함하는(comprising)' 또는 '포함하도록(to comprise)' 및 이들의 활용은 단어 뒤에 오는 항목을 포함하되, 구체적으로 언급되지 않은 항목을 제외하는 것을 의미하는 비제한적인 의미로 사용되는 상황을 의미한다. 그것은 또한 '본질적으로 구성될 것'과 '구성될 것'이라는 보다 제한적인 동사를 포함한다.
문맥상 요소가 하나만 있어야 한다는 것을 명확하게 요구하지 않는 한, 부정관사 'a' 또는 'an'에 의한 요소에 대한 언급은 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 'a' 또는 'an'은 보통 '적어도 하나(at least one)'를 의미한다.
도 1a. 총 체중 증가 (g) (n = 8-10)를 도시한다;
도 1b. 시간 영역-핵 자기 공명(Time domain-Nuclear magnetic resonance, TD-NMR)(n = 8-10) 에 의해 측정된 총 지방 질량 증가(g)를 도시한다;
도 1c. 일일 음식 섭취량을 도시한다;
도 1d. 혈장 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 수치(n = 8-10)를 도시한다;
도 1e. 혈장 포도당(mgdl-1) 프로파일을 도시한다; 및
도 1f. 포도당 로딩 후 -30분에서 120분 사이에 측정된 곡선하 면적(AUC)을 도시한다(mg.dl-1.min-1; n = 8-10);
도 1g. 밀도 측정법(n = 3-5)으로 측정한 로딩 대조군(loading control)에 대한 대조군과 인슐린 자극 p-IRβ의 비율을 도시한다;
도 1h. 및 1i. 밀도 측정법(n = 3-5)으로 측정한 로딩 대조군에 대한 대조군과 인슐린 자극 p-Aktthr308 및 p-Aktser473 의 비를 도시한다
도 2. Amuc-1100(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9)의 자연 변이체에서 변환된 잔기를 도시한다. 위에서 아래로, 및 왼쪽에서 오른쪽으로, 볼 때 제 1 상자는 상호 작용에서 잠재적인 역할인 외부를 가리키는 보존된 잔기를 도시한다. 제 2, 제 3 및 제 4 상자는 구조적 온전성(integrity)에 잠재적으로 관여하는 소수성 잔기를 도시한다. 제 5 상자는 상호작용에서 잠재적인 역할인 외부를 가리키는 보존된 잔기를 도시한다. 제 6 상자는 루프(loop)를 나타냅니다.
도 3. Amuc-1100(SEQ ID NO:1)의 서열을 도시한다. 보존된 잔기는 동그라미로 표시되고 삭제된 부분은 회색으로 표시된다.
도 4. 발현 플라스미드에 사용된 바이시트로닉 디자인(bicistronic design)을 도시한다. RBS1에 의해 구동되는 짧은 펩타이드의 번역은 관심 단백질의 번역을 구동하는 RBS2의 접근성을 보장한다. RBS2의 선형화는 5'UTR에서 잠재적 억제 2차 구조가 제거되어 번역 효율성이 향상된다(Mutalik et al., 2013; Nieuwkoop et al., 2019).
도 5. 양성(Pam3CSK4, 1ug/ml) 및 음성 대조군(PBS 및 DMEM)뿐만 아니라 TEV 절단 후 정제된 다양한 Amuc_1100 변이체(모두 50ug/ml)의 SEAP 활성(AU 단위)을 도시한다. 자연 변이체(상단)의 경우, pTH00x ID는 각각의 단백질을 정제하기 위해 사용되는 플라스미드 이름을 의미한다.
도 1b. 시간 영역-핵 자기 공명(Time domain-Nuclear magnetic resonance, TD-NMR)(n = 8-10) 에 의해 측정된 총 지방 질량 증가(g)를 도시한다;
도 1c. 일일 음식 섭취량을 도시한다;
도 1d. 혈장 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 수치(n = 8-10)를 도시한다;
도 1e. 혈장 포도당(mgdl-1) 프로파일을 도시한다; 및
도 1f. 포도당 로딩 후 -30분에서 120분 사이에 측정된 곡선하 면적(AUC)을 도시한다(mg.dl-1.min-1; n = 8-10);
도 1g. 밀도 측정법(n = 3-5)으로 측정한 로딩 대조군(loading control)에 대한 대조군과 인슐린 자극 p-IRβ의 비율을 도시한다;
도 1h. 및 1i. 밀도 측정법(n = 3-5)으로 측정한 로딩 대조군에 대한 대조군과 인슐린 자극 p-Aktthr308 및 p-Aktser473 의 비를 도시한다
도 2. Amuc-1100(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9)의 자연 변이체에서 변환된 잔기를 도시한다. 위에서 아래로, 및 왼쪽에서 오른쪽으로, 볼 때 제 1 상자는 상호 작용에서 잠재적인 역할인 외부를 가리키는 보존된 잔기를 도시한다. 제 2, 제 3 및 제 4 상자는 구조적 온전성(integrity)에 잠재적으로 관여하는 소수성 잔기를 도시한다. 제 5 상자는 상호작용에서 잠재적인 역할인 외부를 가리키는 보존된 잔기를 도시한다. 제 6 상자는 루프(loop)를 나타냅니다.
도 3. Amuc-1100(SEQ ID NO:1)의 서열을 도시한다. 보존된 잔기는 동그라미로 표시되고 삭제된 부분은 회색으로 표시된다.
도 4. 발현 플라스미드에 사용된 바이시트로닉 디자인(bicistronic design)을 도시한다. RBS1에 의해 구동되는 짧은 펩타이드의 번역은 관심 단백질의 번역을 구동하는 RBS2의 접근성을 보장한다. RBS2의 선형화는 5'UTR에서 잠재적 억제 2차 구조가 제거되어 번역 효율성이 향상된다(Mutalik et al., 2013; Nieuwkoop et al., 2019).
도 5. 양성(Pam3CSK4, 1ug/ml) 및 음성 대조군(PBS 및 DMEM)뿐만 아니라 TEV 절단 후 정제된 다양한 Amuc_1100 변이체(모두 50ug/ml)의 SEAP 활성(AU 단위)을 도시한다. 자연 변이체(상단)의 경우, pTH00x ID는 각각의 단백질을 정제하기 위해 사용되는 플라스미드 이름을 의미한다.
실시 예1: Amuc-1100 단백질을 생산하기 위해 유전자 변형된 박테리아의 생성
방법:
성숙한 Amuc-1100(SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 pET28 유도체의 유도성 T7 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 C-말단 His-Tag를 가진 대장균 TOP10에 복제되었고 과잉 생산을 위해 대장균 BL21(DE3)에 도입되었다. 상기 목적을 위해 ATG 시작 코돈이 SEQ ID NO;2의 뉴클레오타이드 서열에 추가되어 생성된 폴리펩타이드는 아미노산 서열 MIVNS로 시작된다. 모든 구조는 생어(Sanger) 서열 분석을 통해 확인된다. 과발현된 Amuc-1100을 운반하는 구조물은 Ni-컬럼 친화성 크로마토그래피에 의해 명백한 이질성으로 정제되고 100-300 ug/ml의 농도로 사용된 가용성 Amuc-1100 단백질의 과잉 생산을 초래했다. 정제된 Amuc-1100은 앞서 당업자에 의해 알려진 바와 같이 토끼에서 항체를 생성하기 위해 사용되었다(Reunanen J et al. 2012, Appl Environment Microbol 78:2337-44).
결과:
상기 결과 폴리뉴클레오타이드(SEQ ID NO:2)로 형질전환 된 대장균은 설명된 바와 같이 Ni-컬럼 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 단리될 수 있는 가용성 형태의 Amuc-1100 단백질을 생산할 수 있었다(Tailford LE et al. 2015, Nat Communication. 6:7624). 폴리뉴클레오타이드 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:33에서도 유사한 결과를 얻을 수 있다.
실시 예 2: TLR2 신호전달 경로의 상호작용 및 자극
방법:
TLR2 및 다른 TLR 수용체에 결합하고 이어서 TLR2 및 다른 TLR 신호전달 경로를 자극하는 Amuc-1100의 능력을 시험하기 위해, TLR2 및 TLR4 수용체를 발현하는 리포터 세포주(reporter cell lines)를 준비한다. TLR2 또는 TLR4를 발현하는 세포주에 결합하고 그 후에 상기 세포에서 TLR2 및/또는 TLR4 신호전달 경로를 자극하는 Amuc-1100의 능력을 리포터 세포로부터 NK- kB 의 생산을 측정함으로써 시험관 내(in vitro)에서 검사한다.
간략히는, hTLR2 및 hTLR4 세포주 (Invivogen, CA, USA)를 사용한다. 상응하는 리간드를 가진 수용체의 자극은 NF-
B 및 AP-1을 활성화시키고, 이는 분광광도계 (spectrophotometer, Spectramax)로 측정할 수 있는 분비 배아 알칼라인산가수분해효소 (SEAP)의 생산을 유도한다. 모든 세포주를 4.5 g/l D-포도당, 50 U/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신, 100 μg/ml 노르모신 (Normocin), 2 mM L-글루타민, 및 10% (v/v) 의 열-불활성화 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 유지 배지인 둘베코 최소 필수 배양배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)를 사용하여 성장시키고 최대 70-80% 융합성으로 계대배양한다. 각 세포주에 대해, 20 μl의 Amuc1100 현탁액을 추가함으로써 면역 반응 실험을 수행한다. 리포터 세포를 Amuc-1100과 함께 20-24시간 동안 37℃로 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 수용체 리간드 Pam3CSK4 (hTLR2의 경우 10 ng/ml) 및 LPS-EB (hTLR4의 경우 50 ng/ml)를 양성 대조군으로 사용한 반면 어떠한 선택적 항생제도 함유하지 않는 유지 배지를 음성 대조군으로 사용한다. 180 μl의 QUANTI-Blue (Invivogen, CA, USA)를 20 μl의 유도된 hTLR2 및 hTLR4 상청액에 첨가하고 15분, 1시간, 2시간, 및 3시간 후 SEAP 분비를 OD600에서 측정함으로써 검출한다. 실험은 3회 반복 실시한다.
결과:
결과는 Amuc-1100이 TLR2와 상호작용할 수 있었다는 것을 보여준다. 또한, 상기 결과는 Amuc-1100이 TLR2를 발현하는 리포터 세포, 즉, 면역 자극 효과를 발휘했음을 보여준다. Amuc-1100은 리포터 세포에서 NF- kB 의 방출을 자극할 수 있다. SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:9의 폴리펩타이드에서도 유사한 결과를 얻을 수 있다.
실시 예 3: 말초 혈액 단핵세포로부터 사이토카인 방출의 자극
방법:
말초 혈액 단핵세포 (PBMC)로부터 사이토카인 생산 또는 방출을 자극하는 Amuc-1100의 능력을 시험관 내(in vitro)에서 검사한다. 간략히는, 3명의 건강한 공여자의 말초 혈액을 Sanquin Blood Bank (Nijmegen, The Netherlands)로 부터 기증 받는다. 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)를 제조사의 프로토콜에 따라서 Ficoll-Paque Plus 구배 농도 (Amersham biosciences, Uppsala, Sweden)를 이용하여 건강한 공여자의 혈액으로부터 분리한다. 원심분리 후, 단핵세포를 수집하고, 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM) + 글루 타맥스 (Glutamax) (Invitrogen, Breda, The Netherlands)로 세척하고 페니실린 (100 U/ml) (Invitrogen), 스 트렙토마이신 (100 μg/ml) (Invitrogen), 및 10% 열-불활성화된 FBS (Lonza, Basel, Switzerland)가 보충된 IMDM + 글루타맥스 중에서 0.5Х106 세포/ml로 조절한다. PBMC (0.5Х106 세포/웰)를 48-웰 조직 배양 플레이 트에 접종한다. 각 공여자에 대해, 음성 대조군 (배지 단독)을 사용한다.
PBMC를 살아 있거나 99℃에서 10분간 가열된 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila) 세포 (PBMC 대비 1:10 비율) 또는 Amuc-1100으로 1 일간 자극시키고, 이어서 사이토카인 IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, IL-1β 및 IL-12p70의 생산을 FACS CantoII (Becton Dickinson)에 대한 제조사의 프로토콜에 따라서 다중 분석 (Human inflammation CBA kit, Becton and Dickinson)을 이용해 배양 상청액 중에서 측정하고 BD FCAP 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 이용하여 분석하한다. 제조사에 따른 검출 한계는 다음과 같다: 3.6 pg/ml IL-8, 7.2 pg/ml IL-1β, 2.5 pg/ml IL-6, 3.3 pg/ml IL-10, 3.7 pg/ml TNF-α, 1.9 pg/ml IL-12p70.
결과:
결과는 대조군 상황(배지만)과 비교하여 즉, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 및 TNF-α의 수치 향상으로 Amuc-1100이 사이토카인의 생성을 자극할 수 있었다는 것을 보여준다. 4.5 μg/ml Amuc-1100에 의해 유도된 사이토카인의 수준은 살아 있거나 열에 의해 살해된 형태의 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila)의 5 X106 세포와 유사한 수준이었다(아래 표 1 참조).
| 사이토카인 (pg/ml) | 살아 있는 아커만시아 무시니필라 | 열-사멸된 아커만시아 무시니필라에 | Amuc-1100 (4.5 μg/ml) |
| IL-1β | 894 ± 298 | 392 ± 71 | 504 ± 227 |
| IL-6 | 18029 ± 309 | 13477 ± 2014 | 12508 ± 2362 |
| IL-8 | 60018 ± 18229 | 54230 ± 9030 | 45432 ± 12507 |
| IL-10 | 823 ± 310 | 638 ± 118 | 526 ± 180 |
| TNF-α | 1920 ± 349 | 957 ± 568 | 1317 ± 885 |
| IL-12p70 | < 2 | < 2 | < 2 |
SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:9의 폴리펩타이드에서도 유사한 결과를 얻을 수 있다.
실시예 4: 상피 투과 저항성 (TER)의 조절
방법:
장 상피세포층의 온전성(integrity)을 촉진하는 Amuc-1100의 능력을 시험관 내(in vitro)에서 Caco-2 세포의 TER을 자극 또는 증가시키는 Amuc-1100의 능력을 측정함으로써 평가한다. 간략히는, Caco-2 세포 (5Х10 4 세포/인서트)를 Millicell 세포 배양 인서트 (3 μm 기공 크기; Millipore)에 접종하고 8일간 성장시킨다. 박테리아 세포를 RPMI 1640으로 1 회 세척하고, RPMI 1640 중에서 0.25 (대략 108 세포)의 OD600 nm으로 삽입물에 적용한다. 정제된 Amuc-1100 을 0.05, 0.5 및 5 μg/ml의 농도로 십입물에 적용한다. 상피통과 저항성을 Amuc-1100의 첨가 후 0시간, 및 24시간 시점에서 세포 배양물로부터 Millicell ERS-2 TER 미터 (Millipore)를 이용해 결정한다.
결과:
상기 결과는 이미 0.05μg/ml의 Amuc-1100이 약 108 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila)세포와 유사한 수준에서 Caco-2 세포와 24시간 공동 재배 후 TER를 크게 증가시킬 수 있음을 보여준다. SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:9의 폴리펩타이드에서도 유사한 결과를 얻을 수 있다.
실시예 5: 식이-유도성 대사 기능 장애의 조절
10-11주령의 C57BL/6J 마우스의 코호트(cohort) (소집단당 n= 10)를 이전에 문헌 Everard et al. (2013. PNAS. Vol. 110 (22): 9066-9071)에 기술된 바와 같이 대조군 식이 (ND) 또는 HF 식이 (HFD; 60% 지방 및 20% 탄수화물 (kcal/100 g) D12492i, Research Diet, New Brunswick, NJ, USA)로 먹이를 공급한다. 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila) MucT를 문헌 Lucovac et al., (2014, mBio 01438-14)에 기술된 바와 같은 합성 배지 (탈이온수 1리터당 함유: 0.4 g KH2PO4, 0.669 g Na2HPO4.2H2O, 0.3 g NH4Cl, 0.3 g NaCl, 0.1 g MgCl2.6H2O, 10 g 카시톤, 1 mM L-트레오닌, 1 ml 미량 미네랄 용액, 5 mM L-푸코스 및 5 mM D-포도당) 상에서 성장시키고 농축한 후, 25% 글리세롤 함유 PBS에 제제화하고, 문헌 Everard et al., 상동(supra)에 기술된 바와 같이 -80℃에서 보관한다. HFD를 제공 받은 마우스의 소집단은 매일 경구 위관 투여에 의해 무균 혐기성 PBS (HFD Akk) 중에 현탁된 2Х108 cfu/0.15 ml 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila)를 추가로 제공 받았는데, 이는 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila)의 적어도 10배 희석을 유도하기 때문에, 2.5 % 글리세롤의 최종 농도가 수득된다. ND 및 HFD 그룹을 이전에 문헌 [Everard et al., 상동]에 기술된 바와 같이, 2.5% 글리세롤 함유 무균 혐기성 PBS의 동일 부피의 경구 위관 투여로 매일 치료한다. HFD를 제공 받은 마우스의 다른 소집단은 2.5% 글리세롤 함유 무균 PBS의 동일 부피로 3.1 μg의 단백질 Amuc-1100의 매일 위관 투여에 의해 전달되는 Amuc-1100을 추가적으로 제공 받는다. Amuc-1100을 이용한 HFD-식이 마우스의 Amuc-1100치료는 살아 있는 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila) 박테리아(도 1a 및 1b)에 비해, 체중 및 지방 중량 증가의 유사하거나 심지어 더 두드러진 감소를 초래한다(도 1c),. 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila) 또는 Amuc-1100으로의 치료는 또한 혈청 HDL-콜레스테롤의 유의미한 감소 및 LDL-콜레스테롤에 대한 유사한 경향으로 HFD-유도성 고콜레스테롤혈증을 교정한다 (도 1d).
놀랍게도, Amuc-1100을 이용한 치료는 비 치료된 HFD-식이 마우스에 비해 혈청 중성지방의 유의미한 감소를 초래한다. 더욱이, Amuc-1100 치료는 또한 HFD-식이 마우스에서 지방 세포 평균 직경을 38 마이크로미터(micrometer)에서 비 처리된 마우스에서 발견되는 바와같이 유사한 직경 (27 마이크로미터(micrometer))인, 29 마이크로미터(micrometer)로 감소시킨다. 흥미롭게도, Amuc-1100의 투여는 살아 있는 박테리아와 동일한 효능으로 포도당 불내증을 유도하였다 (도 1e -1f).
포도당 대사를 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 간문맥에 인슐린을 주입하여 인슐린 감수성을 조사한다. 본 발명자들은 트레오닌 (Aktthr) 및 세린 (Aktser) 부위에서 간 내 인슐린 수용체 (IR) 및 그의 하류 매개체 Akt의 인슐린-유도성 인산화를 분석한다 (도 1g). HFD의 투여는 대조군 사료를 공급한 마우스에 비해 모든 단백질의 감소된 인산화를 초래하였고, 이는 Aktthr 의 경우에 유의미한 수준에 도달한다 (도 1h). 살아 있는 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila) 또는 Amuc-1100의 처리는, 이러한 효과를 상쇄시켰으며, 비 처리된 HFD-식이 마우스에 비해, Amuc-1100으로 처리된 마우스에서 유의미하게 더 높은 수준의 p-IR 및 p- Aktthr (도 1g, 1h) 및 살아 있는 박테리아로 처리된 마우스에서 유의미하게 더 높은 수준의 p- Aktser (도 1i)를 나타낸다.
실시 예6: Amuc-1100 자연 변이체 및 돌연변이체의 비교분석
목적 및 접근법
본 연구의 목적은 구조 활성 관점(structure-activity perspective)에서 Amuc-1100의 톨 유사 수용체 2(TLR2)에 대한 신호 전달 능력을 이해하는 것이다(Derrien et al., 2004; Plovier et al 2007). 이는 아커만시아 무시니필라 (Akkermansia muciniphila) AmucT 의 유형 균주의 Amuc-1100 단백질과 Amuc-1100 결실 돌연변이의 TLR2 신호 전달 능력과 비교하여 가변 서열 동일성을 갖는 자연 변이체의 TLR2 신호 전달 능력을 결정함으로써 접근된다. 발현 숙주인 대장균의 세포질에 대한 용해도를 보장하기 위해, Amuc-1100과 자연 및 구조 변이체 모두를 포함하는 모든 단백질은 신호 펩타이드(ΔSP, signal peptide) 서열을포함하는 N 말단 막 앵커(N-terminal membrane-anchor) 없이 발현되었다.
자연 변이체
AmucT (pTH008, SEQ ID NO:5, pTH009, SEQ ID NO:6, pTH010, SEQ ID NO:7, PTH011, SEQ ID NO:8)의 Amuc_1100 단백질에 대해 아미노산 동일성이 80% 이상인 관련 아커만시아 무시니필라(A. muciniphila) 균주에서 4개의 단백질이 확인된다. 또한 서열 동일성이 28%에 불과한 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)와 더 먼 변이체가 확인된다(pTH012, SEQ ID NO:9).
본 발명자들은 상기 5가지 단백질을 Amuc_1100의 자연 변이체라고 부른다. 표 2와 도 2는 연구된 자연 변이체에서 보존된 잔기를 보여준다.
| 서열 위치 | 아미노산 3자리 코드 |
아미노산 1자리 코드 |
|
| N-말단 |
6 | Arg | R |
| 7 | Ser | S | |
| 13 | Ile | I | |
| 22 | Ser | S | |
| 25 | Ala | A | |
| 30 | Pro | P | |
| 34 | Ser | S | |
| 35 | Asn | N | |
| 41 | Glu | E | |
| 43 | Asn | N | |
| 67 | Pro | P | |
| 74 | Gln | Q | |
| 77 | Leu | L | |
| 84 | Leu | L | |
| 결합과 관련된 표면 잔기 | 88 | Cys | C |
| 89 | Lys | K | |
| 91 | Lys | K | |
| 93 | Ile | I | |
| 96 | Thr | T | |
| 구조적 온전성(integrity)에 관련된 소수성 잔기 | 101 | Trp | W |
| 102 | Leu | L | |
| 103 | Gly | G | |
| 104 | Phe | F | |
| 112 | Pro | P | |
| 120 | Leu | L | |
| 구조적 온전성(integrity)에 관련된 소수성 잔기 | 122 | Phe | F |
| 123 | Glu | E | |
| 132 | Asn | N | |
| 138 | Gly | G | |
| 144 | Lys | K | |
| 구조적 온전성(integrity)에 관련된 소수성 잔기 | 145 | Val | V |
| 146 | Tyr | Y | |
| 147 | Arg | R | |
| 170 | Trp | W | |
| 결합과 관련된 표면 잔기 |
174 | Pro | P |
| 176 | Glu | E | |
| 177 | Ile | I | |
| 179 | Phe | F | |
| 180 | Gln | Q | |
| 183 | Arg | R | |
| 185 | Ser | S | |
| 186 | Val | V | |
| 193 | Ile | I | |
| 199 | Tyr | Y | |
| 207 | Arg | R | |
| 208 | Ile | I | |
| 루프(Loop) |
215 | Pro | P |
| 217 | Pro | P | |
| 221 | Pro | P | |
| 222 | Ala | A | |
| 223 | Ala | A | |
| 226 | Pro | P | |
| 234 | Gly | G | |
| 239 | Thr | T | |
| 241 | Ala | A | |
| 243 | Glu | E | |
| 245 | Ala | A | |
| 250 | Pro | P | |
| 253 | Gln | Q | |
| 257 | Lys | K | |
| 261 | Gly | G | |
| 263 | Glu | E | |
| 267 | Val | V | |
| 273 | Leu | L | |
| 276 | Phe | F | |
| 279 | Pro | P |
유전자 합성 및 클로닝(cloning)
다음으로, 본 발명자들은 SignalP 5.0(Almagro Armenteros et al., 2019)을 사용하여 검출된 예측 신호 펩타이드를 pTN0003으로 배재하여 자연 변이체의 단백질 서열에 대한 DNA 코딩 서열을 설계하여 궁극적으로 pTN0005를 생성한다. 이 플라스미드(pTN0005)에서는 AmucT 의 Amuc-1100의 정확한 코딩 서열이 사용되어 이전에 나타낸 바와 같이 대장균에서 유의미한 과발현을 일으키는 것으로 나타난다(Plovier et al., 2017).
모든 발현 구조의 골격으로 사용되는 pTN0003 벡터는 p15A 기원, 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자, T7 프로모터 및 바이시트로닉 설계를 포함하고 있으며, 이어서 터미네이터 서열(terminator sequence)(Mutalik et al., 2013; Nieuwkoop et al., 2019)을 포함한다(개요는 도 4 참조). pTN0003 발현 플라스미드 골격(backbone)의 요소에 대한 개요는 표 3에 나와 있다.
표 3. 발현 플라스미드에 위치한 유전자 요소. 굵은 글씨 또는 기울임꼴로 표시된 서열의 일부를 식별합니다.
본 발명자들은 5가지 자연 변이체(pTH008, pTH009, pTH010, pTH011, pTH012)에 대해 Benchling의 코돈 최적화 툴(Benchling's Codon Optimization Tool)(DNAChisel 기반)을 사용하여 단백질 서열을 역번역하고 대장균의 발현을 위한 DNA 코딩 서열을 최적화한다(Benchling, 2018). 이러한 자연 변이체와 pTN0005의 Amuc-1100 서열의 경우, DNA는 gBlocks(통합 DNA 기술; https://eu.idtdna.com/ DT)로 정렬된다. DNA 조각은 이후 깁슨 어셈블리(Gibson assembly)(표 4의 프라이머)를 통해 PCR 증폭 선형(PCR-amplified linear) pTN0003 벡터로 복제된다. 발현 플라스미드의 각 변이체에 대해 궁극적으로 도입된 단백질 코딩 서열은 표 5에 제공된다.
모든 발현 플라스미드는 BL21(DE3) 적합한 대장균 세포(뉴잉글랜드 바이오랩스)로 형질전환된다. 복제 후 발현 구조는 서열 검증한다.
단백질 발현 및 정제
단백질 발현
플라스미드 발현을 갖는 균주는 카나마이신(kanamycin)(50 ug/mL)이 보충된 LB 배지에서 전처리된다. 카나마이신(50ug/mL)이 보충된 1.5 LB 배지를 포함하는 삼각 플라스크(Erlenmeyers)(5 L)에 10 mL의 예비 배양액을 접종하고 배양액이 OD600-0.8에 도달할 때까지 37°C, 120 rpm에서 배양한다. 유도하기 전에 플라스크를 30분 동안 얼음 위에 올려놓는다. 0.4 mM IPTG(최종 농도)로 유도한 후 배양액을 20°C 및 120 rpm에서 18시간 동안 더 배양한다. 세포는 원심분리를 통해 수확하고 펠릿은 25 mL 세척 완충액(50 mM NaH2PO4,, 300 mM NaCl, 20 m 이미다졸, pH 8.0)로 세척한다. 세포 펠릿은 -80°C에서 저장된다.
단백질 정제
단백질분해효소 억제제 정제(RocheComplete™)가 보충된 25 mL 세척 완충액에서 세포 펠릿을 해동시킨다. 다시 현탁된 세포들은 초음파 처리한다(Bandelin Sonopuls, VS 70/T probe, 25% 강도, 적어도 총 10분간 1초 간 켜짐 2초 간 꺼짐 반복). 용해된 세포는 원심분리(15분, 30,000 x g, 4°C)하여 여과(0.45 μm)하여 세포 파편을 제거한다.
단백질은 Akta FPLC 시스템을 사용하여 5 mL HisTrap HP 컬럼(GE Healthcare)의 N 말단 His-tag를 이용하여 추가로 정제한다. 단백질은 50mM NaH2PO4,, 300mM NaCl, 500m 이미다졸, pH 8.0에서 용출된다. His-tag는 세척 완충액에 대해 4°C의 야간 투석(14k MWCO) 중 0.7mg His-tagged TEV 단백질 분해효소를 사용하여 적어도 1:500 비율로 절단된다. Amuc_1100 단백질에서 TEV 단백질 분해효소를 제거하기 위해 HisTrap 컬럼에서 적어도 제 2 로 실행되었다. 이번에는 관심 단백질을 포함하는 관류(flowthrough)가 수집되었고, His 태그가 달린 TEV 단백질 분해효소는 HisTrap 컬럼에 결합되어 있다.
인간 HEK-Blue hTLR2 세포주의 시험관 내(
In vitro
) 배양 및 자극
HEK-Blue hTLR2 세포(Invivogen, CA, USA)는 TLR2 활성화를 위한 선별에 사용된다. 이 세포주에서 TLR2의 자극과 NF-kB 및 AP-1의 후속 활성화는 분광광도학적으로 정량화될 수 있는 분비 배아 알칼라인산가수분해효소(SEAP)의 생성을 유도한다.
GlutaMAXTM, 4.5 g/L D-포도당, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 μg/mL 노르모신, 10%(v/v)의 열-불활성화된 FBS 및 HEK-BlueTM 선별(HEK-BlueTM Selection)(Invivogen)
FTMONS(InvlueOne)를 보충한 덜베코의 최소 필수 배양배지(DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 세포주를 성장시키고 계대배양한다. 세포는 25번까지 최대한 계대배양한다. TLR2 활성화는 HEK-BlueTM 선별(HEK-BlueTM Selection)이 없는 유지관리 배지의 평평한 바닥 96웰 플레이트에 HEK-Blue 세포를 첨가하고 24시간 후 관심 단백질(50ug/mL 농도)을 3배로 20μL 추가하여 세포를 자극함으로써 테스트한다. 96개의 웰 플레이트는 37°C에서 5%의 CO2인큐베이터에서 20-24시간 동안 배양된다. 수용체 리간드 Pam3CSK4는 양성 대조군으로 사용되고, PBS(관심 단백질의 희석 물질(agents))는 음성 대조군으로 사용된다. 흡광도를 600nm(SynergyTM Mx, BioTek Instruments, Inc., VT, USA)로 측정하여 검출된 분비 배아 알칼라인산가수분해효소(SEAP, Secreted Enembryonary Alcaline Phosphatase) 활성은 180 μL 퀀티 블루(QUANTI-Blue)(Invivogen)에 상등액 20 μL의 유도 HEK-Blue hTLR2를 추가한 후 1시간에 임의의 단위(AU)로 표현한다.
결과 및 결론
AmucT 로부터 정제된 Amuc-1100 단백질의 TLR2 및 자연 변이체의 활성화 용량은 위에서 설명한 바와 같이 결정된다. 결과는 도 5에 나와 있다.
1ug/ml Pam3CSK4의 양성 대조군의 TLR2 세포에서의 활성은 약 4.0 AU인 반면 음성 대조군 PBS와 DMEM의 활성은 1.0 AU보다 낮다. AmucT (1100)의 Amuc 1100 단백질은 약 2.0 AU의 배경 위에서 TLR2 세포에서 유의한 활성을 보인다.
도 5에서 볼 수 있듯이, 여기서 테스트된 모든 자연 변이체는 TLR2 수용체를 활성화할 수 있다. Amuc-1100 자연 변이체의 TLR2 활성화 용량(도 5)은 양성 대조군보다 놀라울 정도로 높았고 약 4.5 AU에 달한다.
3D 모델링의 결과(표시되지 않은 데이터)는 각 영역을 삭제하면 단백질이 TLR2 수용체와 상호작용하는 능력이 저하될 수 있음을 나타난다. 이러한 결과는 이합체화(dimerization)의 중요성과 TLR 신호 활동을 개선하는 구조적 특징으로서 Amuc-1100의 길고 순서가 없는 루프의 존재를 지적한다.
따라서, 특정 보존 영역의 결실과 TLR2 활성화 용량에 미치는 영향 사이의 관계는 표 6에서 평가된다.
특히 이합체화를 위한 베타 가닥을 가진 N 말단과 길고 순서가 없는 루프의 존재는 (개선된) TLR 신호 전달 활동에 중요하다.
<110> Wageningen University
<120> AMUC-1100 polypeptide variants for effecting immune signalling
and/or affecting intestinal barrier function and/or modulating
metabolic status
<130> P34552
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 287
<212> PRT
<213> Akkermansia muciniphila
<400> 1
Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala
35 40 45
Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala
50 55 60
Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe
65 70 75 80
Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro
100 105 110
Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn
115 120 125
Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys
130 135 140
Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu
145 150 155 160
Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu
165 170 175
Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala
180 185 190
Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile
195 200 205
Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala
210 215 220
Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro
225 230 235 240
Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile
245 250 255
Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn
260 265 270
Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp
275 280 285
<210> 2
<211> 864
<212> DNA
<213> Akkermansia muciniphila
<400> 2
atcgtcaatt ccaaacgcag tgaactggac aaaaaaatca gcatcgccgc caaggaaatc 60
aagtccgcca atgctgcgga aatcactccg agccgatcat ccaacgaaga gctggaaaaa 120
gaactgaacc gctatgccaa ggccgtgggc agcctggaaa cggcctacaa gcccttcctt 180
gcctcctccg cgctggtccc caccacgccc acggcattcc agaatgaact gaaaacattc 240
agggattccc tgatctcctc ctgcaagaaa aagaacattc tcataacgga cacatcctcc 300
tggctcggtt tccaggttta cagcacccag gctccctctg ttcaggcggc ctccacgctg 360
ggttttgaat tgaaagccat caacagcctg gtcaacaaac tggcggaatg cggcctgtcc 420
aaattcatca aggtgtaccg cccccagctc cccattgaaa ccccggcgaa caatccggaa 480
gaatcggacg aagccgacca ggccccatgg actcccatgc ctctggaaat agccttccag 540
ggcgaccggg aaagtgtatt gaaagccatg aacgccataa ccggcatgca ggactatctg 600
ttcacggtca actccatccg tatccgcaac gaacggatga tgccccctcc catcgccaat 660
ccggcagccg ccaaacctgc cgcggcccaa cccgccacgg gtgcggcttc cctgactccg 720
gcggatgagg cggctgcacc tgcagccccg gccatccagc aagtcatcaa gccttacatg 780
ggcaaggagc aggtctttgt ccaggtctcc ctgaatctgg tccacttcaa ccagcccaag 840
gctcaggaac cgtctgaaga ttaa 864
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Akkermansia muciniphila
<400> 3
Met Ser Asn Trp Ile Thr Asp Asn Lys Pro Ala Ala Met Val Ala Gly
1 5 10 15
Val Gly Leu Leu Leu Phe Leu Gly Leu Ser Ala Thr Gly Tyr
20 25 30
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> Akkermansia muciniphila
<400> 4
atgagcaatt ggattacaga caacaagccc gccgccatgg tcgcgggcgt gggacttctc 60
ttattcctgg ggttatccgc gacagggtac 90
<210> 5
<211> 287
<212> PRT
<213> Akkermansia muciniphila
<400> 5
Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Cys Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Glu Asp Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala
35 40 45
Val Asn Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala
50 55 60
Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe
65 70 75 80
Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr
85 90 95
Asp Thr Ser Asn Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro
100 105 110
Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn
115 120 125
Ser Leu Val Asn Lys Leu Thr Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys
130 135 140
Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu
145 150 155 160
Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ser Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu
165 170 175
Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Asn Ala Ile Asn Ala
180 185 190
Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Ile Asn Ser Ile Arg Ile
195 200 205
Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala
210 215 220
Lys Pro Ala Ala Asp Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro
225 230 235 240
Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile
245 250 255
Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Ile Phe Val Gln Val Ser Leu Asn
260 265 270
Leu Ile His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp
275 280 285
<210> 6
<211> 288
<212> PRT
<213> Akkermansia muciniphila
<400> 6
Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Val Ala
1 5 10 15
Ser Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg
20 25 30
Ala Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala
35 40 45
Val Thr Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala
50 55 60
Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe
65 70 75 80
Arg Asp Ala Leu Ile Ala Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro
100 105 110
Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Val Asn
115 120 125
Ser Leu Val Asn Lys Leu Thr Asp Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys
130 135 140
Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Asn Pro Ala Asn Asn Pro Glu
145 150 155 160
Glu Asp Ala Asp Glu Pro Asn Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu
165 170 175
Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asn Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn
180 185 190
Ala Ile Thr Asp Ser Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg
195 200 205
Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala
210 215 220
Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Ala Gly Ala Ala Ser Leu Thr
225 230 235 240
Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Leu
245 250 255
Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Ile Phe Val Gln Val Ser Leu
260 265 270
Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp
275 280 285
<210> 7
<211> 289
<212> PRT
<213> Akkermansia muciniphila
<400> 7
Met Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Val Ala
1 5 10 15
Ser Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg
20 25 30
Thr Ser Asn Asn Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala
35 40 45
Val Thr Asn Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala
50 55 60
Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe
65 70 75 80
Arg Asp Ala Leu Ile Ala Ala Cys Lys Lys Lys Asn Ile Gln Ile Thr
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro
100 105 110
Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Val Asn
115 120 125
Ser Leu Ala Asn Lys Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Lys Phe Ile Lys
130 135 140
Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Asn Pro Ala Asn Asn Pro Glu
145 150 155 160
Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asn Gln Ala Pro Trp Ser Pro Met Pro Leu
165 170 175
Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn
180 185 190
Ala Ile Thr Asp Ser Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg
195 200 205
Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Gly Pro Ala Ala
210 215 220
Pro Lys Pro Ala Ala Ala Gln Ser Ala Ala Gly Ala Ala Asp Leu Arg
225 230 235 240
Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Gln Ser Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln
245 250 255
Val Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Ile Phe Val Gln Val Ser
260 265 270
Leu Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu
275 280 285
Asp
<210> 8
<211> 288
<212> PRT
<213> Akkermansia sp. KLE1797
<400> 8
Met Ala Asn Ser Glu Arg Ser Asp Leu Asp Lys Lys Ile Lys Ser Ala
1 5 10 15
Ser Gln Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Ala Ile Thr Pro Ser His
20 25 30
Thr Ser Asn Lys Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala
35 40 45
Ile Gly Asn Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Met Ala Ser Ser Val
50 55 60
Leu Ala Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Ala Phe
65 70 75 80
Arg Glu Ser Leu Ile Ala Ser Cys Lys Glu Lys Asn Ile Gln Ile Thr
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Leu Tyr Ser Thr Gln Ala Pro
100 105 110
Ser Val Gln Ala Thr Pro Thr Leu Thr Phe Glu Met Lys Ala Ile Asn
115 120 125
Ser Leu Val Asn Lys Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Lys Phe Ile Lys
130 135 140
Val Tyr Arg Ser Gln Leu Pro Ile Glu Asn Pro Ala Arg Asn Thr Glu
145 150 155 160
Asp Glu Glu Asp Ser Asp Gln Lys Ala Pro Trp Thr Gly Met Pro Leu
165 170 175
Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Gly Ser Val Leu Lys Ala Met Asn
180 185 190
Ala Ile Thr Asp Ser Gln Glu Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg
195 200 205
Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Thr Asn Pro Ala Ala
210 215 220
Ala Gln Pro Ala Ser Ala Gln Pro Gln Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr
225 230 235 240
Pro Ala Gly Glu Ala Ala Ala Pro Ala Glu Pro Pro Ile Gln Gln Ile
245 250 255
Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Met Val Gln Val Ser Leu
260 265 270
Asn Leu Val His Phe Ala Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp
275 280 285
<210> 9
<211> 301
<212> PRT
<213> Akkermansia glycaniphila
<400> 9
Arg Ser Ala Ser Gln Asp Asn Ile Ala Ser Ile Glu Glu Gly Gln Ser
1 5 10 15
Thr Leu Asp Ser Asp Arg Ala Lys Arg Phe Pro Ser Asn Glu Gln Ser
20 25 30
Leu Pro Glu Val Asn Ala Ala Ala Thr Arg Ala Ala Ala Ile Lys Glu
35 40 45
Gln Ile Leu Ala Ser Thr Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Glu Thr Ala
50 55 60
Thr Thr Val Asp Gly Arg Pro Ile Asn Gly Lys Glu Leu Gln Asp Lys
65 70 75 80
Leu Asn Thr Leu His Asn Lys Leu Glu Gln Leu Cys Lys Glu Lys Asp
85 90 95
Ile Lys Leu Thr Pro Glu Ala Ser Trp Leu Gly Phe Ser Ala Phe Arg
100 105 110
Ser Val Thr Pro Asn Glu Ser Asp Ala Pro Asp Leu Ser Phe Glu Leu
115 120 125
Ser Gly Ile Asp His Phe Val Asn Thr Val Ala Ala Asn Gly Ala Val
130 135 140
Ser Ile Thr Lys Val Tyr Arg Pro Thr Val Ser Glu Pro Ala Asp Lys
145 150 155 160
Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Ala Lys Lys Asn Thr Gly Asp Trp Asn
165 170 175
Thr Leu Pro Phe Glu Ile Ser Phe Gln Ala Lys Arg Gly Ser Val Gly
180 185 190
Ser Ile Leu Glu Ser Ile Ala Gln Asp Lys Glu Tyr Cys Tyr Tyr Ile
195 200 205
Thr Gly Met Arg Ile Ala Ser Asp Leu Thr Thr Pro Val Pro Leu Asp
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Pro Ala Ala Pro Gln Pro Glu Glu Thr Ala Thr Ala
225 230 235 240
Val Ser Asp Ile Ile Asp Asp Gly Leu Gly Gly Gly Asp Pro Leu Gly
245 250 255
Gly Thr Pro Ala Ala Glu Pro Ala Pro Ala Pro Glu Glu Val Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gln Thr Val Ala Lys Gln Ile Leu Gly Asn Glu Thr Ile Arg
275 280 285
Val Tyr Ile Ala Cys Glu Leu Val Arg Phe Asn Thr Pro
290 295 300
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 10
Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 11
Pro Gly
1
<210> 12
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 12
Gly Pro
1
<210> 13
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 13
taatacgact cactataggg gcccaagttc acttaaaaag gagatcaaca atgaaagcaa 60
ttttcgtact gaaacatctt aatcatgcag gggagggttt cta 103
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 14
atgcatcatc atcatcatca tcatgaaaac ctgtacttcc aatcc 45
<210> 15
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 15
tgccgactca gttgctgctt ctactgggcg ccccgcttcg gcggggtttt ttt 53
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 16
gccgactcag ttgctgc 17
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 17
ggattggaag tacaggtttt catgatg 27
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 18
agccgatcat ccaacgaaga gc 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 19
ggattggaag tacaggtttt catg 24
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 20
aacggtggtt ccggtggttc ccaggtcttt gtccaggtct ccc 43
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 21
ggtccgtttg tccaggtctc cctgaatctg 30
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 22
gtccgtttgt ccaggtctcc ctgaatctg 29
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 23
cctggctttg tccaggtctc cctgaatctg 30
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 24
gcggatacgg atggagttga cc 22
<210> 25
<211> 774
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 25
agccgatcat ccaacgaaga gctggaaaaa gaactgaacc gctatgccaa ggccgtgggc 60
agcctggaaa cggcctacaa gcccttcctt gcctcctccg cgctggtccc caccacgccc 120
acggcattcc agaatgaact gaaaacattc agggattccc tgatctcctc ctgcaagaaa 180
aagaacattc tcataacgga cacatcctcc tggctcggtt tccaggttta cagcacccag 240
gctccctctg ttcaggcggc ctccacgctg ggttttgaat tgaaagccat caacagcctg 300
gtcaacaaac tggcggaatg cggcctgtcc aaattcatca aggtgtaccg cccccagctc 360
cccattgaaa ccccggcgaa caatccggaa gaatcggacg aagccgacca ggccccatgg 420
actcccatgc ctctggaaat agccttccag ggcgaccggg aaagtgtatt gaaagccatg 480
aacgccataa ccggcatgca ggactatctg ttcacggtca actccatccg tatccgcaac 540
gaacggatga tgccccctcc catcgccaat ccggcagccg ccaaacctgc cgcggcccaa 600
cccgccacgg gtgcggcttc cctgactccg gcggatgagg cggctgcacc tgcagccccg 660
gccatccagc aagtcatcaa gccttacatg ggcaaggagc aggtctttgt ccaggtctcc 720
ctgaatctgg tccacttcaa ccagcccaag gctcaggaac cgtctgaaga ttaa 774
<210> 26
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 26
atcgtcaatt ccaaacgcag tgaactggac aaaaaaatca gcatcgccgc caaggaaatc 60
aagtccgcca atgctgcgga aatcactccg agccgatcat ccaacgaaga gctggaaaaa 120
gaactgaacc gctatgccaa ggccgtgggc agcctggaaa cggcctacaa gcccttcctt 180
gcctcctccg cgctggtccc caccacgccc acggcattcc agaatgaact gaaaacattc 240
agggattccc tgatctcctc ctgcaagaaa aagaacattc tcataacgga cacatcctcc 300
tggctcggtt tccaggttta cagcacccag gctccctctg ttcaggcggc ctccacgctg 360
ggttttgaat tgaaagccat caacagcctg gtcaacaaac tggcggaatg cggcctgtcc 420
aaattcatca aggtgtaccg cccccagctc cccattgaaa ccccggcgaa caatccggaa 480
gaatcggacg aagccgacca ggccccatgg actcccatgc ctctggaaat agccttccag 540
ggcgaccggg aaagtgtatt gaaagccatg aacgccataa ccggcatgca ggactatctg 600
ttcacggtca actccatccg tatccgcaac ggtggttccg gtggttccca ggtctttgtc 660
caggtctccc tgaatctggt ccacttcaac cagcccaagg ctcaggaacc gtctgaagat 720
taa 723
<210> 27
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 27
atcgtcaatt ccaaacgcag tgaactggac aaaaaaatca gcatcgccgc caaggaaatc 60
aagtccgcca atgctgcgga aatcactccg agccgatcat ccaacgaaga gctggaaaaa 120
gaactgaacc gctatgccaa ggccgtgggc agcctggaaa cggcctacaa gcccttcctt 180
gcctcctccg cgctggtccc caccacgccc acggcattcc agaatgaact gaaaacattc 240
agggattccc tgatctcctc ctgcaagaaa aagaacattc tcataacgga cacatcctcc 300
tggctcggtt tccaggttta cagcacccag gctccctctg ttcaggcggc ctccacgctg 360
ggttttgaat tgaaagccat caacagcctg gtcaacaaac tggcggaatg cggcctgtcc 420
aaattcatca aggtgtaccg cccccagctc cccattgaaa ccccggcgaa caatccggaa 480
gaatcggacg aagccgacca ggccccatgg actcccatgc ctctggaaat agccttccag 540
ggcgaccggg aaagtgtatt gaaagccatg aacgccataa ccggcatgca ggactatctg 600
ttcacggtca actccatccg tatccgcggt ccgtttgtcc aggtctccct gaatctggtc 660
cacttcaacc agcccaaggc tcaggaaccg tctgaagatt aa 702
<210> 28
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> -
<400> 28
atcgtcaatt ccaaacgcag tgaactggac aaaaaaatca gcatcgccgc caaggaaatc 60
aagtccgcca atgctgcgga aatcactccg agccgatcat ccaacgaaga gctggaaaaa 120
gaactgaacc gctatgccaa ggccgtgggc agcctggaaa cggcctacaa gcccttcctt 180
gcctcctccg cgctggtccc caccacgccc acggcattcc agaatgaact gaaaacattc 240
agggattccc tgatctcctc ctgcaagaaa aagaacattc tcataacgga cacatcctcc 300
tggctcggtt tccaggttta cagcacccag gctccctctg ttcaggcggc ctccacgctg 360
ggttttgaat tgaaagccat caacagcctg gtcaacaaac tggcggaatg cggcctgtcc 420
aaattcatca aggtgtaccg cccccagctc cccattgaaa ccccggcgaa caatccggaa 480
gaatcggacg aagccgacca ggccccatgg actcccatgc ctctggaaat agccttccag 540
ggcgaccggg aaagtgtatt gaaagccatg aacgccataa ccggcatgca ggactatctg 600
ttcacggtca actccatccg tatccgcggt ccgtttgtcc aggtctccct gaatctggtc 660
cacttcaacc agcccaaggc tcaggaaccg tctgaagatt aa 702
<210> 29
<211> 864
<212> DNA
<213> Akkermansia municiphila
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tggctaggat tccaagtata cagcacacaa gcaccaagcg tacaagcagc aagcacacta 360
ggattcgaac taaaagcaat aaacagccta gtaaacaaac taacagaatg cggactaagc 420
aaattcataa aagtatacag accacaacta ccaatagaaa caccagcaaa caacccagaa 480
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ggagacagag aaagcgtact aaacgcaata aacgcaataa caggaatgca agactaccta 600
ttcacaataa acagcataag aataagaaac gaaagaatga tgccaccacc aatagcaaac 660
ccagcagcag caaaaccagc agcagaccaa ccagcaacag gagcagcaag cctaacacca 720
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ggaaaagaac aaatattcgt acaagtaagc ctaaacctaa tacacttcaa ccaaccaaaa 840
gcacaagaac caagcgaaga ctaa 864
<210> 30
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<212> DNA
<213> Akkermansia municiphila
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gaacttaatc gctatgccaa agccgttacc agtctggaga ccgcctataa gccctttctg 180
gcctcttctg ccctggtccc caccactcct accgcctttc agaatgagct gaaaacattc 240
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caaggaaaca gagaaagcgt actaaaagca atgaacgcaa taacagacag ccaagactac 600
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aaagcacaag aaccaagcga agactaa 867
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<212> DNA
<213> Akkermansia municiphila
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<213> Akkermansia sp. KLE1797
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agagaaagcc taatagcaag ctgcaaagaa aaaaacatac aaataacaga cacaagcagc 300
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aaattcataa aagtatacag aagccaacta ccaatagaaa acccagcaag aaacacagaa 480
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aaagcacaag aaccaagcga agactaa 867
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<212> DNA
<213> Akkermansia glycaniphila
<400> 33
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aaagcacaag aaccaagcga agactaa 867
Claims (18)
- 단리된 폴리펩타이드 및 약제학적 또는 소화학적 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물로서 상기 단리된 폴리펩타이드는
a) SEQ ID NO:9와 적어도 30%의 서열 동일성을 가지고;
b) 다음 아미노산 잔기 세트 중 적어도 하나를 포함하고.
i. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 1, 2, 8, 20, 23, 27에 해당하는 위치의 R, S, I, S, A 및 P 또는 이들의 보존적 치환;
ii. SEQ ID NO:9에서 각각 92, 93, 95, 97, 100에 해당하는 위치의 C, K, K, I 및 T 또는 이들의 보존적 치환;
iii. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 105, 106, 107, 108에 해당하는 위치의 W, L, G 및 F 또는 이들의 보존적 치환;
iv. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 126, 127에 해당하는 위치의 F 및 E 또는 이들의 보존적 치환;
v. SEQ ID NO:9에서 각각 위치 149, 150, 151에 해당하는 위치의 V, Y 및 R 또는 이들의 보존적 치환;
vi. SEQ ID NO:9에서 각각 179, 181, 182, 184, 185, 188, 190, 191에 해당하는 위치의 P, E, I, F, Q, R, S 및 V 또는 이들의 보존적 치환
vii. SEQ ID: 9에서 각각 220, 222, 229, 230, 231, 234, 248, 258, 260, 262, 264, 172, 175, 279, 283, 285 에 해당하는 위치의 P, P, P, A, A, P, G, T, A, E, A, P, Q, K, G 및 E 또는 이들의 보존적 치환이고,
상기 폴리펩타이드(polypeptide)는 면역 신호에 영향 및/또는 장관 장벽 기능에 영향을 미치고 및/또는 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성에 영향을 미치는 것을 특징으로 하는, 조성물(Composition).
- 제1항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 상기 아미노산 잔기들의 세트 i 내지 vii 을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9에서 각각 28, 29, 35, 37, 71, 78, 81, 88위치에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기 S, N, E, N, P, Q, L, L, 또는 이의 보존적 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9에서 각각116, 124, 136, 142, 148, 175, 198, 204, 212, 213, 289, 295, 298, 301 위치에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기 P, L, N, G, K, W, I, Y, R, I, V, L, F, P, 또는 이의 보존적 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9의 자연 변이체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9의 합성 변이체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 영약학적 조성물 또는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 변형 숙주 세포.
- 제 8항에 있어서, 상기 숙주세포는 아케르만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아케르만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila.) 종에 속하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 변형 숙주세포.
- 제 8항에 있어서, 상기 숙주세포는 아케르만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아케르만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila.) 종에 속하는 것을 특징으로 하는, 유전자 변형 숙주세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의, 폴리펩타이드의 제조 방법으로써,
(a) 상기 폴리펩타이드의 제조를 허용하는 조건하에서 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 선택적으로, (a) 단계에서 생성된 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 의한 숙주 세포를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의, 제8 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 숙주세포를 유효성분으로 포함하고, 포유류에서 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 촉진시키고, 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성을 유지, 복원 또는 개선하거나, 또는 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지, 복원 및/또는 향상시키기 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의, 비만(obesity), 대사증후군(metabolic syndrome), 인슐린-결핍(insulin-deficiency) 또는 인슐린-저항성 관련 질환(insulin-resistance related disorders), 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병(gestational diabetes), 임신중독증(preeclampsia), 염증성 장질병(IBD, inflammatory bowel disease), 과민성 장 증후군(IBS, irritable bowel syndrome), 포도당 불내성(glucose intolerance), 비정상적인 지질대사, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 심장 병리(cardiac pathology), 뇌졸중(stroke), 비알코올성 지방간 질환, 알코올성 지방간 질환, 고혈당증(hyperglycemia), 지방간(hepatic steatosis), 이상지질혈증(dyslipidaemias), 비만과 관련된 면역 시스템의 기능 장애(체중 증가), 알레르기, 천식, 자폐증(autism), 파킨슨병, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 신경 퇴행성 질환, 우울증, 기타 장벽 기능 저하와 관련된 질병, 세포 상처치유(wound healing), 행동 장애(behavioural disorders), 알코올 의존증, 심혈관 질환(cardiovascular diseases), 고콜레스테롤, 중성지방(triglycerides) 상승, 죽상동맥경화증, 수면무호흡증(sleep apnoea), 골관절염(osteoarthritis), 담낭질환(gallbladder disease), 암 및 미숙아로 태어난 아기, 방사선 노출, 화학 요법 및/또는 독소에 노출, 자가 면역 장애, 영양 실조, 패혈증 등으로 인한 음식 알레르기, 장의 미성숙과 같은 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 변경하는 증상(condition)으로 구성된 그룹에서 선택된 포유류의 질환(disorder) 또는 증상의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제8 내지 제10항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의, 포유류의 장(gut)에서 항염증 활성을 촉진하기 위한 제8 내지 제10항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 1항 내지 제7항 중 어느 한 항의, 포유류의 체중 감소를 촉진하기 위한 제8 내지 제10항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 포유류의 체중 감소를 촉진하기 위해; 포유류의 장(gut)에서 항염증 활성을 촉진하기 위해; 포유류에서 장 점막 면역 시스템(gut mucosal immune system) 기능을 촉진하기 위해; 포도당 및/또는 콜레스테롤 및/또는 중성지방 항상성을 유지, 복원 및/또는 개선하기 위해; 및 포유류에서 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 유지, 복원 및/또는 향상시키기 위해 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 특징으로 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어 정의된 폴리펩타이드의 유효량, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포 또는 제7항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하고, 비만, 대사증후군, 인슐린-결핍 또는 인슐린-저항성 관련 질환(disorder), 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 임신중독증(preeclampsia), 염증성 장질병(IBD), 과민성 장 증후군(IBS), 포도당 불내성, 비정상적인 지질대사, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 심장 병리(cardiac pathology), 뇌졸중, 비알코올성 지방간 질환, 알코올성 지방간 질환, 고혈당증, 지방간, 이상지질혈증, 비만과 관련된 면역 시스템의 기능 장애(체중 증가), 알레르기, 천식, 자폐증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 신경 퇴행성 질환, 우울증, 기타 장벽 기능 저하와 관련된 질병, 세포 상처치유(wound healing), 행동 장애(behavioural disorders), 알코올 의존증, 심혈관 질환, 고콜레스테롤, 중성지방(triglycerides) 상승, 죽상동맥경화증, 수면무호흡증, 골관절염, 담낭질환, 암 및 미숙아로 태어난 아기, 방사선 노출, 화학 요법 및/또는 독소에 노출, 자가 면역 장애, 영양 실조, 패혈증 등으로 인한 음식 알레르기, 장의 미성숙과 같은 장 점막 장벽의 물리적 온전성(physical integrity)을 변경하는 증상(condition)으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 질환(disorder) 또는 증상의 예방 및/또는 치료에 사용하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 의한 폴리펩타이드의 제조방법으로써,
(a) 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 또는 아커만시아 글리카니필라(Akermansia glycaniphila) 종의 박테리아를 적절한 배양 배지로 배양하는 단계; 및
(b) 선택적으로, 단계 (a) 에서 생성된 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드의 제조 방법.
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