KR20130080917A

KR20130080917A - 진세노사이드 Ｒｇ３을 유효성분으로 함유하는 Ｃ형 간염 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130080917A
Application number: KR1020120001800A
Authority: KR
Inventors: 장재영
Original assignee: 장재영
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2013-07-16
Also published as: KR101355320B1; US20130178430A1; US8865659B2

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rg3을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 진세노사이드 Rg3은 C형 간염 바이러스에 감염된 HuH 7.5.1 세포에서 용량의존적으로 현저한 항바이러스 효과 및 세포사멸 억제효과를 나타내므로 인체에 안전하고 부작용이 없는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강식품용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

진세노사이드 Ｒｇ３을 유효성분으로 함유하는 Ｃ형 간염 예방 및 치료용 조성물{Compositions for prevention or treatment of hepatitis C virus containing ginsenoside Rg3 as an active ingredient}

본 발명은 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(hepatitis C virus; HCV)는 플라비바이러스(flavivirus)에 속하는 바이러스로서 1989년 그 유전자의 일부가 동정되기 까지 비 A형, 비 B형 간염의 주요 병원균으로 알려졌다. HCV는 만성간염, 간경변과 간암을 일으킨다. 최근의 보고에 의하면, 전 세계적으로 약 2억 명 이상이 HCV에 감염 되어 있는 것으로 알려져 있다.

HCV에 의한 감염은 수혈 및 지역 특이적 전염(community-acquired)에 의해 일어나고, 신장 투석에 의해 약 70% 정도가 감염이 된다는 보고가 있다. HCV에 감염이 되면 약 20% 정도가 5년 내에 간경화를 수반한 급성 간염을 일으키게 되고 간암으로 전이되는 것으로 알려져 있다(참고문헌: Davis et al, New. Engl. J. Med., 321, 1501, 1989; Alter et al, in Current Pespective in Hepatology, p83, 1989). 이러한 높은 만성 감염율은 RNA 바이러스에서 보기 드문 일로서 HCV가 높은 비율의 간암을 일으키는 매개체임을 보여주고 있다. 최근에는 모든 혈액에 대해서 HCV 검사가 잘 이루어지고 있어 수혈로 인한 감염은 현저히 줄어들었지만 지역 특이적 감염은 아직 조절할 수가 없어 전 세계적으로 중요한 문제점으로 대두되고 있다.

역학적으로 볼 때 HCV는 HBV와 달리 전 세계에 골고루 분포되어 있고 전 세계 인구의 1.5 ~ 2%가 감염된 것으로 보고되고 있다. HCV에 감염되면 만성 간염으로 진행되는 것이 특징인데 간경화 및 간암으로 전이되는 확률이 B형보다 상당히 높다. C형은 분류학적으로도 B형과는 전혀 다른 바이러스과에 속하기 때문에 B형 백신으로는 예방이 불가능하며 알파-인터페론(α-IFN)으로 치료를 시도하고 있으나 유전형에 따라 반응이 현저히 다르고 효과가 극히 미약하다. 특히 많은 수가 감염되어 있는 유전형 1b(genotype 1b)의 경우 알파-인터페론 치료 효과가 가장 미약하다.

HCV는 1989년 처음으로 클로닝에 의해 RNA 게놈(genome)이 분리된 이후 많은 연구가 수행되었지만 아직까지 효과적인 치료제는 개발되지 못하고 있다. 현재 HCV 간염에 대한 치료제로, 인터페론과 항바이러스제인 리바비린(ribavirin) 병용요법이 사용되고 있지만, 치료율이 낮고 부작용이 나타나므로 그 효과가 미약한 실정이다. 따라서, HCV 간염의 치료 및 예방을 위한 추가의 화합물들이 요구되고 있다.

JFH-1 바이러스(Japanese Fulminant Hepatitis-1 Virus)는 2005년 Wakita 등에 의해 첫 보고가 되었으며, 급성 간부전으로 내원한 32세 남자 일본인 환자에서 분리한 것으로 염기서열 분석에 의하면 유전자형(genotype) 2a의 C형 간염 바이러스 유전체를 가지고 있는데, Huh7.5.1 간세포에 감염된 JFH-1 균주는 감염성 바이러스를 복제하게 되어 HCV의 병태 생리에 관한 연구나 항바이러스제의 효과를 평가하는데 적합할 수 있는 것으로 보고되고 있다.

인삼은 동양의학에서 강장제로 수명연장 등을 위해 널리 이용되어 왔다(Yun, 2001). 더욱이 중추신경계 질환, 심혈관계 질환, 내분비기능, 면역기능, 대사촉진, 생물학적 조절 및 노화 등에 약리학적 효과가 폭넓게 제시되었다(Liu and Xiao, 1992; Seong et al., 1995; Kitts et al., 2000; Bae et al., 2006). 또한 최근에는 다양한 항암효과도 보고되고 있는바, 장관 선암 및 B16 흑색종 (Mochizuki et al., 1995; Iishi et al., 1997; Liu et al., 2004), 전립선암 세포의 증식(Keum et al., 2003; Kim et al., 2004), 그리고 난소암의 성장(Nakataet al., 1998)의 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

인삼의 주요 약리활성 성분은 사포닌의 일종인 진세노사이드로 알려져 있다(Attele et al., 1999; Yuan and Wu, 2002). 일반적으로 인삼은 30종 이상의 진세노사이드를 함유하며, 이들은 각기 다른 약리활성을 나타낸다(Tanaka et al., 1986; Banthorpe, 1994; Yue et al., 2007). 이런 다양한 종류의 진세노사이드 중에서도 진세노사이드 Rg3는 강한 항암 및 전이억제 효과를 지니는 것으로 보고되었다(Mochizuki et al., 1995; Shinkai et al., 1996; Iishi et al., 1997; Liu et al., 2000; Pan et al., 2002; Chen et al., 2003, 2008; Keum et 공개특허 10-2011-0106006 al., 2003; Kim et al., 2004; Panwar et al., 2005; Wang et al., 2006, 2007; Zhang et al., 2006; Xu et al., 2007; Kwon et al., 2008; Lu et al., 2008; Luo et al., 2008).

특히 홍삼(red ginseng, Ginseng Radix Rubro)은 다양한 종류의 수삼을 98 ~ 100℃에서 2 ~ 3시간 정도 증기 처리하여 만들어지는데, 이 과정에서 진세노사이드의 함량이 크게 증가하며(Kim et al., 2000; Wang et al., 2006), 이렇게 강화된 진세노사이드는 수삼 또는 백삼보다 우수한 약리활성을 갖는 것으로 잘 알려져 있다(Jung and Jin, 1996; Wang et al., 2006).

이에, 본 발명자들은 부작용 및 독성이 적고, C형 간염에 대해 우수한 항바이러스 활성을 나타내는 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 홍삼에서 분리한 진세노사이드 Rg3은 C형 간염 바이러스 간염 세포에서 현저한 항바이러스 효과 및 세포사멸 억제효과를 나타내므로, C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강식품용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강식품용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.

본 발명의 진세노사이드 Rg3은 C형 간염 바이러스에 감염된 HuH 7.5.1 세포에서 용량의존적으로 현저한 항바이러스 효과 및 세포사멸 억제효과를 나타내므로 인체에 안전하고 부작용이 적은 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드를 처리한 다음 24시간 후 현미경사진을 나타낸 도이다.
도 2는 Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드를 처리한 다음 72시간 후 현미경사진을 나타낸 도이다.
도 3은 Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드 처리한 다음 JFH-1 mRNA에 대한 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드 처리한 다음 HCV CORE와 세포사멸에 관하여 쪼개진(cleaved) PARP에 대한 웨스턴 블러팅 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 Rg3 10 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM 농도에서의 HCV CORE와 쪼개진 PARP에 대한 웨스턴 블러팅을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 Rh2 10 μM, 25 μM 및 50 μM농도에서의 HCV CORE와 쪼개진 PARP에 대한 웨스턴 블러팅을 수행한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 진세노사이드 Rg3은 하기 [화학식 1]로 표시되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

[화학식 1]

;

여기서, R₁은 Glc₂ _-Glc이며; 및

R₂는 H이다.

상기 진세노사이드 Rg3은 인산, 수삼, 백삼 또는 홍삼에서 분리된 것이 바람직하고, 홍삼에서 분리된 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 진세노사이드 Rg3은 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 알칼리부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 처리 대상에 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 진세노사이드 Rg3은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 염기를 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매를 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 C형 간염 바이러스 실험 모델에서 C형 간염 바이러스(JFH-1)에 감염이 가장 잘 되는 세포로 알려져 있는 Huh 7.5.1 세포를 배양하고 분주한 다음, JFH-1 바이러스에 감염시켜 본 발명에 이용하였다.

또한, 본 발명자들은 Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드(Ro, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 각각을 100μM 농도로 처리한 후, 24시간 및 72시간 후에 각각 현미경을 통해 Huh 7.5.1 세포의 모양을 관찰한 결과, Rg3 처리군은 대조군 및 JFH-1 바이러스 처리군의 세포와 다르게 세포들이 융합하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 진세노사이드 Rg3의 바이러스 억제 효과를 확인하기 위하여, Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드(Ro, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 각각을 100μM 농도로 처리 72시간 후에 JFH-1 mRNA에 대한 실시간 PCR을 수행한 결과, Rg3 100μM 처리군의 세포에서 JFH-1 mRNA가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 진세노사이드 Rg3의 바이러스 억제 효과를 확인하기 위하여 Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드(Ro, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 각각을 100μM 농도로 처리 72시간 후 HCV CORE와 세포사멸에 관하여 쪼개진(cleaved) PARP에 대한 웨스턴 블러팅 분석을 수행한 결과, Rg3 100μM 처리군의 세포에서 HCV CORE가 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 쪼개진 PARP 또한 감소된 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 Rg3의 용량에 따른 항바이러스 효과를 알아보기 위하여, Rg3 10 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM에서의 HCV CORE와 쪼개진 PARP에 대한 웨스턴 블러팅을 수행한 결과, Rg3는 용량 의존적으로 바이러스를 억제하였으며 세포사멸도 용량의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 5 참조).

아울러, 본 발명자들은 Rh2의 용량 의존적 항바이러스 효과를 확인한 결과, Rh2는 50μM 미만에서 용량 의존적으로 바이러스를 억제하였으며 세포사멸은 용량 의존적 관계를 보이지 않는 것을 확인하였다(도 6 참조).

따라서, 본 발명의 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 C형 간염 바이러스에 감염된 HuH 7.5.1 세포에서 용량의존적으로 현저한 항바이러스 효과 및 세포사멸 억제효과를 나타내므로 인체에 안전하고 부작용이 없는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 0.1 내지 100mg, 0.1 내지 90mg, 0.1 내지 80mg, 0.1 내지 70mg, 0.1 내지 60mg, 0.1 내지 50mg, 0.1 내지 40mg, 0.1 내지 30mg, 0.1 내지 20mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 0.1 내지 1mg을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 주사제, 액제, 현탁제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1 ~ 1,000 ㎎/일이며, 구체적으로 1 ~ 500 ㎎/일, 보다 구체적으로 1 ~ 400mg, 1 ~ 300mg, 1 ~ 200mg, 1 ~ 100mg, 이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

[화학식 1]

;

여기서, R₁은 Glc₂ _-Glc이며; 및

R₂는 H이다.

상기 진세노사이드 Rg3은 인삼, 수삼, 백삼 또는 홍삼에서 분리된 것이 바람직하고, 홍삼에서 분리된 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 C형 간염 바이러스에 감염된 HuH 7.5.1 세포에서 용량의존적으로 현저한 항바이러스 효과 및 세포사멸 억제효과를 나타내므로 인체에 안전한 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 0.1 내지 100mg, 0.1 내지 90mg, 0.1 내지 80mg, 0.1 내지 70mg, 0.1 내지 60mg, 0.1 내지 50mg, 0.1 내지 40mg, 0.1 내지 30mg, 0.1 내지 20mg, 0.1 내지 10mg, 0.1 내지 5mg, 0.1 내지 1mg을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 진세노사이드의 분리

본 발명에서 사용한 진세노사이드는 앰보연구소(대한민국, 대전)에서 구입하여 사용하였다.

< 실시예 2> 간암세포주( Hepatoma cell line )의 배양 및 분주

Huh 7.5.1 세포는 간암 세포주로서 현재 C형 간염 바이러스 실험 모델에서 C형 간염 바이러스(JFH-1)에 감염이 가장 잘 되는 세포로 알려져 있어서 본 발명의 실험에 이용하였다.

<2-1> Huh 7.5.1 세포의 배양

LN₂(nitrogen) 탱크에 보관중인 Huh 7.5.1 세포 보관 병(cell stock vial)을 꺼낸 후, 37℃ 온열 수조(water bath)에서 1분 30초 ~ 2 분 동안 녹였다. 그런 다음, 녹인 Huh 7.5.1 세포를 튜브(cornical tube)에 옮긴 후 세포배양액(complete media(CM)) 10 ml와 혼합한 후, 1000 RPM으로 5분간 원심분리기를 돌린 다음, 상층액(supernatant)을 채취하였다. 그런 다음, 펠리트(pellet)와 세포배양액 1 ml를 잘 혼합한 후, 100 × 20 mm 세포배양용기(cell culture dish)에 옮겨 담은 다음, 세포배양액 10 ml를 추가하였다. 그런 다음, 십자 모양으로 세포배양용기를 잘 흔들어서 Huh 7.5.1 세포를 골고루 퍼트려준 후, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어서 Huh 7.5.1 세포를 배양하였다.

<2-2> Huh 7.5.1 세포의 분주

37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양 중인 세포배양용기를 꺼내어 배양액을 채취한 후, 1 × PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 다음, 채취하였다. 그런 다음, 100 × 20 mm 세포배양용기 한 개당 트립신-EDTA 3 ml를 넣은 후, 표면이 충분히 덮이도록 흔들어준 다음, 1분 30초 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어두었다. 그런 다음, 세포배양용기에서 긁어 모은 Huh 7.5.1 세포를 튜브(cornical tube)에 넣은 후, 세포배양액 10 ml와 혼합하였다. 그런 다음, 1000 RPM으로 5분간 원심분리기를 돌린 후, 상층액(supernatant)을 채취하였다. 그런 다음, 펠리트(pellet)와 세포배양액 1 ml를 잘 혼합한 후, 100 × 20 mm 세포배양용기(cell culture dish)에 옮겨 담은 다음, 세포배양액 10 ml를 추가하였다. 그런 다음, 십자 모양으로 세포배양용기를 잘 흔들어서 Huh 7.5.1 세포를 골고루 퍼트려준 후, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어서 Huh 7.5.1 세포를 배양하였다.

< 실시예 3> 바이러스 간염 및 진세노사이드(Ginsenoside)의 처리

60 × 15 mm 세포배양용기에 200000개의 Huh 7.5.1 세포를 넣어주며 7가지 성분의 진세노사이드(Ro, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 각각을 100μM 농도로 처리하였다. 진세노사이드는 파우더로서 용액으로 만들어 주는 것이 실험을 위하여 필요하기 때문에, 7가지 각각의 진세노사이드를 50 mM 농도로 기본 용액을 만든 후 실험에 사용할 때까지 4℃ 냉장 보관하였다.

구체적으로, 실험 디자인은 다음과 같이 설계하였다. 무처리 대조군(Control), 대조군과 DMSO 10㎕ 처리군(Control + DMSO 10㎕), JFH-1 바이러스 처리군(Only JFH-1), JFH-1 바이러스와 DMSO 10㎕ 처리군(JFH-1 + DMSO 10㎕), JFH-1 바이러스와 Ro 100 uM 처리군(JFH-1 + Ro 100uM), JFH-1 바이러스와 Re 100 uM 처리군(JFH-1 + Re 100 uM), JFH-1 바이러스와 Rg1 100 uM 처리군(JFH-1 + Rg1 100 uM), JFH-1 바이러스와 Rg2 100 uM 처리군(JFH-1 + Rg2 100 uM), JFH-1 바이러스와 Rg3 100 uM 처리군(JFH-1 + Rg3 100 uM), JFH-1 바이러스와 Rh1 100 uM 처리군(JFH-1 + Rh1 100 uM), 및 JFH-1 바이러스와 Rh2 100 uM 처리군(JFH-1 + Rh2 100 uM).

실험은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 60 × 15 mm 세포배양용기(cell culture dish)에 200000개의 Huh 7.5.1 세포를 넣었다. 다음날, -70℃ 냉동고에 보관중인 JFH-1 바이러스(Japanese Fulminant Hepatitis-1 Virus) 보관 병(JFH-1 stock vial)을 꺼내서 얼음에 넣고 이동 후, 찬물을 담은 용기에 바이러스 보관 병을 넣고 녹였다. 배양중인 60 × 15 mm 세포배양용기(cell culture dish)의 배양액을 뽑아낸 후 1 × PBS로 1회 세척한 다음, 채취하였다. 60 × 15 mm 세포배양용기 한 개당 JFH-1 바이러스 용액 1.5 ml씩 넣은 후, 표면이 충분히 덮이도록 흔들어주고 6시간 동안 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어두고 6시간 후 상층액(supernatant)을 채취하였다. 최대한 천천히 1 × PBS를 세포 표면에 뿌려준 후, 1회 세척한 다음, 채취하였다. 대조군과 JFH-1 처리군에는 세포배양액 5 ml을 넣어주고 50 mM 농도로 만들어진 각각의 진세노사이드를 바이러스 감염의 마지막 단계에서 Complete-Media 5 ml과 50 mM 진세노사이드 10 μM를 세포배양액으로 넣어주었다. 그런 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 72시간 후 연구를 수행하였다.

< 실시예 4> 진세노사이드의 간암 세포주에 대한 바이러스 억제 효과 확인

진세노사이드를 바이러스에 감염된 Huh 7.5.1 세포에 처리한 후, 바이러스 억제 효과가 있는지를 확인하였다.

<4-1> 현미경을 이용한 바이러스 억제 효과 확인

상기 <실시예 3>에서 기재된 바와 같이, Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드(Ro, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 각각을 100μM 농도로 처리한 후, 24시간 및 72시간 후에 각각 위상차현미경(ECLIPSE TE300, NICON사)을 이용하여 400배의 배율로 Huh 7.5.1 세포의 모양을 관찰하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 처리 24시간 후, Rg3 처리군은 대조군 및 JFH-1 바이러스 처리군의 세포와 다르게 세포들이 융합하는 양상으로 관찰되었으며 Rh2 처리군은 세포들이 모두 사멸하여 남아있는 세포가 관찰되지 않았으며, 그 외 다른 진세노사이드 처리군은 대조군 및 JFH-1 바이러스 처리군의 세포와 모양이 같았다(도 1). 한편, 진세노사이드 처리 72시간 후, Rg3 처리군은 대조군 및 JFH-1 바이러스 처리군의 세포와 다르게 세포들이 융합하는 양상으로 관찰되었고, 24시간 보다 더 융합하는 것으로 관찰되었으며 Rh2는 세포들이 모두 사멸하여 남아있는 세포가 관찰되지 않았다. 아울러, 그 외 다른 진세노사이드 처리군은 대조군 및 JFH-1 바이러스 처리군의 세포와 모양이 같은 것을 확인하였다(도 2).

<4-2> 실시간( real - time ) PCR 을 이용한 바이러스 억제 효과 확인

상기 <실시예 3>에서 기재된 바와 같이, Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드(Ro, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 각각을 100μM 농도로 처리 72시간 후에 JFH-1 mRNA에 대한 실시간 PCR을 수행하였다. 이때, hGNB2L1은 하우스 키핑 유전자(house-keeping gene)이다.

구체적으로 실시간 PCR은 먼저 24 웰(well)에 50000개의 Huh 7.5.1 세포를 배양 후 상기 방법으로 처리된 세포를 Rneasy mini kit(QIAGEN사)를 이용하여 전체(total) RNA를 추출한 다음, Nanodrop 1000(Thermo Scientific사)을 이용하여 전체 RNA를 정량한 후, i cycler(BIO-RAD사)를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)을 시행하여 cDNA를 제작하였다. 또한, RT(real-time)-PCR은 StepOne Plus(ABI사)를 이용하여 시행하였으며 이때 사용한 프라이머(primer)는 다음과 같다:

Human JFH-1(Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey)

정방향 프라이머(Forward primer): 5'-TCTGCGGAACCGGTGAGTA-3'(서열번호: 1); 및

역방향 프라이머(Reverse primer): 5'-TCAGGCAGTACCACAAGGC-3'(서열번호: 2).

Human GNB2L1 (Macrogen) (House keeping gene)

정방향 프라이머: 5'-GACCATCATCATGTGGAAACTGA-3'(서열번호: 3); 및

역방향 프라이머: 5'-CCGTTGTGAGATCCCAGAGG-3'(서열번호: 4).

그 결과, Rg3 100μM 처리군의 세포에서 JFH-1 mRNA가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 3).

<4-3> 웨스턴 블러팅(western blotting)을 이용한 바이러스 억제 효과 확인

<4-3-1> 진세노사이드의 종류에 따른 바이러스 억제 효과 확인

상기 <실시예 3>에서 기재된 바와 같이, Huh 7.5.1 세포에 7가지 성분의 진세노사이드(Ro, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2) 각각을 100μM 농도로 처리 72시간 후 바이러스에 대한 효과를 분석하기 위하여 HCV CORE와 세포사멸에 관하여 쪼개진(cleaved) PARP에 대한 웨스턴 블러팅 분석을 수행하였다.

구체적으로 웨스턴 블러팅 분석은 상기 시료를 준비한 후, 이를 시료 버퍼(Sample buffer)와 튜브에서 혼합한 후, 100℃에서 10분 동안 끊인 다음, 상기 튜브를 꺼내어 얼음에서 식힌 후 원심분리 하였다. 상기 준비한 시료와 크기 표시자를 넣어준 다음, 전기영동한 후, PVDF 멤브레인(Hydrophobic)으로 트렌스퍼(transfer)하였다. 5% Skim milk로 1시간 동안 블로킹한 후, 각각의 1차 항체 (Primary Antibody)를 넣어준 다음, 4도시에서 하룻밤 동안 둔 후, 10분간 3회 세척(washing)하고, 5% Skim milk로 상온에서 1시간 동안 차단하였다. 그런 다음, 각각의 이차 항체(Secondary Antibody)를 넣어준 후, 1시간 동안 반응시키고, 10분간 3회 세척하였다. 그런 다음, Detection Reagent A(Luminol Enhancer solution)와 B(Peroxide solution)를 1 : 1 비율로 혼합 후 membrane 을 발색 후, X선 필름으로 현상하였다.

그 결과, Rg3 100μM 처리군의 세포에서 HCV CORE가 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 쪼개진 PARP 또한 감소된 것으로 나타났다. 따라서, Rg3가 현저한 바이러스 억제 효과가 있고 세포사멸도 C형 간염 바이러스를 감염 시키지 않은 세포와 유사하게 나타나 세포에 안전하게 바이러스를 억제할 수 있음을 확인하였다(도 4).

<4-3-2> Rg3 의 용량 의존적 항바이러스 효과 확인

Rg3의 용량에 따른 바이러스 효과를 알아보기 위하여, Rg3 10 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM에서의 HCV CORE와 쪼개진 PARP에 대한 웨스턴 블러팅을 수행하였다.

그 결과, Rg3는 용량 의존적으로 바이러스를 억제하였으며 세포사멸도 용량의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 5).

<4-3-3> Rh2 의 용량 의존적 항바이러스 효과

Rh2의 용량에 따른 바이러스 효과를 알아보기 위하여, Rh2 10 μM, 25 μM 및 50 μM에서의 HCV CORE와 쪼개진 PARP에 대한 웨스턴 블러팅을 수행하였다. 참고로, Rh2는 100 μM에서 세포가 모두 사멸하였으므로 100 μM에 대한 실험은 하지 않았다.

그 결과, Rh2는 50μM 미만에서 용량 의존적으로 바이러스를 억제하였으며 세포사멸은 용량 의존적 관계를 보이지 않았다(도 6).

< 제조예 1> 약제의 제조

<1-1> 정제의 제조

본 발명에 따른 <실시예 1>에서 분리된 진세노사이드 Rg3 200 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<1-2> 주사액제의 제조

본 발명에 따른 <실시예 1>에서 분리된 진세노사이드 Rg3 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

< 제조예 2> 식품의 제조

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 <실시예 1>에서 분리된 진세노사이드 Rg3을 0.1 ~ 5.0 중량%로 하여 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 유제품의 제조

본 발명에 따른 <실시예 1>에서 분리된 진세노사이드 Rg3을 0.1 ~ 1.0 중량%로 하여 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-3> 음료의 제조

본 발명에 따른 <실시예 1>에서 분리된 진세노사이드 Rg3을 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강증진용 야채쥬스를 제조하였다.

<110> JANG, Jae Young <120> Compositions for prevention or treatment of hepatitis C virus containing ginsenoside Rg3 as an active ingredient <130> DP2011-0079KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human JFH-1 Forward primer <400> 1 tctgcggaac cggtgagta 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human JFH-1 Reverse primer <400> 2 tcaggcagta ccacaaggc 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GNB2L1 Forward primer <400> 3 gaccatcatc atgtggaaac tga 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GNB2L1 Reverse primer <400> 4 ccgttgtgag atcccagagg 20

Claims

진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

;
여기서, R₁은 Glc₂ _-Glc이며; 및
R₂는 H이다.
제 1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 인삼, 수삼, 백삼 및 홍삼으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에서 분리된 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 홍삼에서 분리된 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 경질 캅셀제, 연질 캅셀제, 주사제, 액제, 현탁제, 시럽제 및 과립제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
진세노사이드 Rg3 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물:
[화학식 1]

;
여기서, R₁은 Glc₂ _-Glc이며; 및
R₂는 H이다.
제 6항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 인삼, 수삼, 백삼 및 홍삼으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에서 분리된 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 홍삼에서 분리된 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 건강식품용 조성물은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 건강식품용 조성물.
진세노사이드(Ginsenoside) Rg3 0.1 내지 100 mg을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

;
여기서, R₁은 Glc₂ _-Glc이며; 및
R₂는 H이다.
제 11항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 홍삼에서 분리된 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
진세노사이드 Rg3 0.1 내지 100 mg을 유효성분으로 함유하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
제 14항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물:
[화학식 1]

;
여기서, R₁은 Glc₂ _-Glc이며; 및
R₂는 H이다.
제 14항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3은 홍삼에서 분리된 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.